突变的水泡性口炎病毒及其用途

摘要

本发明提供突变病毒，该病毒阻断受感染细胞中mRNA和蛋白的核转运的能力下降并且在体内是减毒的。本发明的突变病毒还能够引发正常宿主细胞的抗病毒系统，同时还保留对这种系统作用的敏感性。本发明进一步提供所述突变病毒在一系列应用中的用途，所述的应用包括但不限于：作为治疗癌症和感染的治疗剂、作为疫苗和佐剂、作为病毒载体，以及作为用于对恶性细胞或被感染细胞进行选择性裂解的溶瘤剂和溶细胞剂。

权利要求

1.一种突变的水泡性口炎病毒，该突变的水泡性口炎病毒在编码基质蛋白的基因中具有ΔM51或者ΔM51-54突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的基质蛋白。

2.一种病毒载体，该病毒载体包含权利要求1所述的突变的水泡性口炎病毒。

3.如权利要求2所述的病毒载体，该病毒载体还包含异源核酸。

4.一种疫苗载体，该疫苗载体包含权利要求1所述的突变的水泡性口炎病毒和编码一个或一个以上抗原的异源核酸。

5.一种疫苗佐剂，该疫苗佐剂包含权利要求1所述的突变的水泡性口炎病毒和药学上可接受的载体。

6.一种选择性溶瘤剂，该选择性溶瘤剂包含权利要求1所述的水泡性口炎病毒和药学上可接受的载体。

7.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1所述的突变的水泡性口炎病毒和药学上可接受的载体。

8.一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含权利要求1所述的突变的水泡性口炎病毒和药学上可接受的载体。

9.如权利要求1所述的突变的水泡性口炎病毒在制备病毒药物制剂中的用途，其中所述的突变的水泡性口炎病毒作为添加剂以防止所述制剂中产生烈性回复体。

10.如权利要求1所述的突变的水泡性口炎病毒在制备用于治疗疾病或异常的药物中的用途，所述的疾病或异常是癌症、细菌感染、病毒感染或真菌感染。

11.如权利要求3所述的病毒载体在制备将所述的异源核酸递送到需要其的受试对象的药物中的用途。

12.一种试剂盒，该试剂盒包含一个或一个以上容器和权利要求1所述的突变的水泡性口炎病毒。

说明书

突变的水泡性口炎病毒及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒领域，尤其是涉及对作为病毒载体和疫苗有用的突变病毒。

背景技术

[0002] 减毒病毒或复制能力下降的那些病毒已被广泛用于多种治疗应用，例如，作为疫苗或疫苗载体，或作为基因治疗载体。减毒病毒的生产通常涉及将野生型病毒重复通过非天然宿主而对机会突变进行分离。重组DNA技术和遗传工程技术的发展为更好地将病毒开发为治疗剂和预防剂提供了工具。重组技术允许将特定的突变导入到病毒基因组的选定区域，还可以减少突变病毒回复为野生型病毒的可能性。

[0003] 许多病毒具有刺激体液免疫和细胞介导的免疫的能力，这使得它们成为理想的疫苗载体，因此许多病毒已被开发为针对很多疾病的疫苗载体，所述疾病包括HIV、HCV和癌症。病毒还非常适合于用作基因治疗载体。基因治疗，即通过将功能性基因瞬时或永久地转移到体细胞中而改变基因表达，正在被广泛地开发为预防和治疗疾病的新手段。尽管已知各种物理和化学方法可以将外源核酸导入真核细胞，但已普遍证明病毒对于这种目的要有效得多。诸如微小病毒、腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、弹状病毒和痘病毒等数种病毒已被开发为可能的基因治疗载体(例如见专利号为6,440,422、6,531,123和6,451,323的美国专利)。

[0004] 已记载有对大量病毒的改造以产生具有特殊性质的重组病毒。例如，专利号为6,497,873的美国专利记载了表达副粘病毒SV5株的F蛋白的重组弹状病毒。在该重组病毒中，所述的F蛋白与弹状病毒G蛋白的一部分一起作为融合蛋白进行表达。专利号为
6,022,726和6,468,544的美国专利描述了改造后的减毒病毒，该减毒病毒包括病毒非结构(NS)基因的非编码序列或编码序列中的突变。还记载了表达改变后的或嵌合的病毒蛋白的嵌合减毒病毒。专利号为6,468,544的美国专利进一步记载了能够在受感染细胞中诱导产生干扰素的活的减毒的流感病毒。

[0005] 还记载了将工程病毒作为溶瘤剂，其利用瘤细胞特有的遗传缺陷以在瘤细胞中进行复制和裂解瘤细胞，但在非瘤细胞则不能进行复制和裂解。例如，国际专利申请WO97/26904和WO 96/03997披露了抑制肿瘤细胞生长的突变的单纯疱疹病毒(HSV-1716)，专利号为6,296,845的美国专利记载了据信可以优先在p53阴性肿瘤细胞中复制的突变的腺病毒，专利号为6,110,461的美国专利教导了使用呼肠孤病毒治疗Ras介导的肿瘤，以及专利号为6,531,456的美国专利记载了携带药物易感性基因和另外的能够产生辅助作用的基因(例如干扰素或肿瘤抑制基因)的重组腺相关病毒载体以用于癌症治疗。

[0006] 作为遗传工程病毒的替换方案，可以使用非病原性病毒，例如，WO01/19380记载了使用弹状病毒，尤其是水泡性口炎病毒(VSV)，作为肿瘤细胞的选择性溶瘤剂，所述病毒的特征是具有低水平或不具有PKR(双链RNA依赖性激酶)活性。WO 01/19380还记载了对干扰素具有易感性的4种突变VSV的鉴定及其作为溶瘤剂的用途。

[0007] 提供这些背景信息的目的是使人们了解申请人认为可能与本发明有关的信息。并不是必然意欲承认任何前述信息构成破坏本发明的现有技术，也不能进行这样的解释。

发明内容

[0008] 本发明的一个目的是提供突变的病毒及其用途。根据本发明的一个方面，提供突变的弹状病毒，该突变的弹状病毒的基因中具有一个或一个以上突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白，其中，当与野生型病毒进行比较时，所述的突变导致突变的弹状病毒具有降低的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力。

[0009] 根据本发明的另一个方面，提供一种病毒载体，该病毒载体包含突变的弹状病毒的，该突变的弹状病毒的基因中具有一个或一个以上突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白，其中，当与野生型病毒进行比较时，所述的突变导致突变的弹状病毒具有降低的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力。

[0010] 根据本发明的另一个方面，提供一种疫苗载体，该疫苗载体包含突变的弹状病毒和编码一个或一个以上抗原的异源核酸，所述突变的弹状病毒的基因中具有一个或一个以上突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白，其中，当与野生型病毒进行比较时，所述的突变导致突变的弹状病毒具有降低的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力。

[0011] 根据本发明的另一个方面，提供一种疫苗佐剂，该疫苗佐剂包含突变的弹状病毒和选择性地包含药学上可接受的载体，所述突变的弹状病毒的基因中具有一个或一个以上突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白，所述的突变的弹状病毒能够在受感染细胞中引发一种或一种以上的细胞因子的产生，其中，当与野生型病毒进行比较时，所述的突变导致突变的弹状病毒具有降低的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力。

[0012] 根据本发明的另一个方面，提供一种选择性溶瘤剂，该选择性溶瘤剂包含突变的弹状病毒和选择性地包含药学上可接受的载体，所述突变的弹状病毒的基因中具有一个或一个以上突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白，其中，当与野生型病毒进行比较时，所述的突变导致突变的弹状病毒具有降低的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力。

[0013] 根据本发明的另一个方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包含突变的弹状病毒和药学上可接受的载体，所述突变的弹状病毒的基因中具有一个或一个以上突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白，其中，当与野生型病毒进行比较时，所述的突变导致突变的弹状病毒具有降低的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力。

[0014] 根据本发明的另一个方面，提供一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含突变的弹状病毒和药学上可接受的载体，所述突变的弹状病毒的基因中具有一个或一个以上突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白，所述的突变的弹状病毒能够在受感染细胞中引发一种或一种以上的细胞因子的产生，其中，当与野生型病毒进行比较时，所述的突变导致突变的弹状病毒具有降低的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力。

[0015] 根据本发明的另一个方面，提供如上所述的突变的弹状病毒作为病毒药物制剂的添加剂的用途，以防止所述制剂中产生烈性回复体。

[0016] 根据本发明的另一个方面，提供如上所述的突变的弹状病毒在治疗疾病或异常中的用途，所述的疾病或异常可由于细胞因子的释放而得以减轻。

[0017] 根据本发明的另一个方面，提供如上所述的突变的弹状病毒作为病毒载体以将所述的异源核酸递送到需要其的受试对象的用途。

[0018] 根据本发明的另一个方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包含一个或一个以上容器和突变的弹状病毒，该突变的弹状病毒的基因中具有一个或一个以上突变，所述基因编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白，其中，当与野生型病毒进行比较时，所述的突变导致突变的弹状病毒具有降低的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力。

附图说明

[0019] 图1描述突变VSV病毒AV1和AV2的降低的体内毒性是由干扰素介导的。(A)人前列腺癌细胞(PC3)和人肾脏癌细胞(CAKI-1)受到模拟感染或受到VSV的野生型(WT)、AV1或AV2株的感染。用ELISA(酶联免疫吸附测定法)对培养基进行测定，以检测在感染后18小时人α-干扰素的产生。(B)通过常规方法和小鼠品系测定野生型病毒和突变VSV株的体内毒性。IN＝鼻内；IV＝静脉内；nd＝未测定。(C)AV2可以通过反式作用使小鼠免-/-受致命的WT(野生型)VSV的感染。用各种剂量的WT、AV2或这两个株系的组合对PKR 小鼠进行鼻内感染，并监测致病率或死亡率。数值表示每组小鼠表现感染征兆的数目(致病率)和每组小鼠死于感染的数目(死亡率)。(D)用WT VSV、AV1或AV2病毒对Balb/C和-/-
Balb/C IFNR 小鼠进行鼻内感染，并监测致病率。

[0020] 图2描述次级转录应答受到WT VSV的抑制，但没有受到AV1或AV2的抑制。(A)对病毒感染的初级应答由IRF-3、cJUN/ATF-2和NFκB(此处显示的是在IFN-β启动子中的增强体(enhansosome)复合物的形成部分)介导。微矩阵数据显示，初级转录应答基因在WT感染的细胞和突变病毒感染的细胞中明显上调(a：已知ISG15的完全诱导需要ISGF3)。数值代表相对于模拟感染的诱导倍数。(B)然后IFN-β被翻译和分泌从而以自分泌方式刺激JAK/STAT的信号转导，以在细胞核中形成ISGF3复合物，该ISGF3复合物介导次级转录应答基因的诱导。尽管受到AV1或AV2感染的细胞显示这些基因明显上调，但是WT感染的细胞根本不显示表达(A＝缺乏)。(C)如果在WT VSV感染的细胞中没有随之发生IRF-7的表达，则包括几乎所有的IFN-α基因的三级转录波就不会发生(b：通过矩阵检测发现在WT样品中有少量的IFN-α7)。相反地，AV1和AV2感染的细胞有效地诱导IFN-α基因的表达。(D)A549细胞感染后4小时RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)的数据显示，初级应答基因RANTES和IFN-β在WT和突变VSV感染细胞中被诱导到类似水平，但在WT感染的细胞中MX1(次级应答)的上调受到破坏。(E)Western印迹分析显示，在WT和突变VSVs之间的IRF-3激活的动力学是相似的，但是ISG56(初级应答)蛋白的表达在WT感染的细胞中受到严重破坏。只有在AV1和AV2感染的细胞中检测到IRF-7蛋白。IRF-7Δ似乎能够诱导内源IRF-7的表达。

[0021] 图3显示通过定量RT-PCR测定，IFN-βmRNAs在来自WT VSV感染细胞的细胞质组分中显著减少。(A)对来自WT、AV1或AV2VSV感染的细胞的细胞核(N)和细胞质(C)中*的总RNA组分进行IFN-βmRNA分析；根据来自同一个样品的HPRT mRNA进行校正。 表示没有检测到IFN-βmRNA。(B)通过ELISA对WT或突变VSV株感染的细胞进行IFN-β产量的分析。AV1和AV2感染的细胞显示可检测到的分泌的IFN-β，但WT VSV感染的细胞没有显示可检测到的分泌的IFN-β。

[0022] 图4描述突变VSV株在各种肿瘤模型中证明具有体内效力。(A)突变VSV在通过腹膜内治疗进行异种移植物人卵巢腹水肿瘤的治疗中是有效的。将人ES-2卵巢癌细胞注6
入CD-1裸鼠的腹膜腔中，以形成腹水肿瘤。注射1×10 的ES-2细胞后12天，用AV2VSV或
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UV(紫外线)灭活的AV2VSV隔天(共3剂量)处理该动物。将各剂量(1×10pfu)施入腹膜腔内。评定该动物的致病率和死亡率，并在出现中度腹水形成后对该动物实施安乐死。“n”
6
表示每组动物的数目。(B)对免疫活性动物中的皮下肿瘤的全身治疗。通过将1×10CT26
3
结肠癌细胞注射到后胁腹区域，在Balb/C小鼠中形成皮下肿瘤。当肿瘤达到约10mm 时，
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通过静脉内注射5×10pfu的所示病毒，在10天的时间内隔天(共6剂量)治疗小鼠。“特
5
洛伊(Trojan)”是指注射20MOI(感染复数)的AV1VSV感染的3×10CT26细胞。对照小
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鼠接受6剂量的5×10pfu的UV灭活的AV2VSV。每天测量肿瘤以计算肿瘤的体积。当认
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为肿瘤负荷过大时(约750mm)对该动物实施安乐死。(C)显示每天测定的每组小鼠体重的变化，从治疗前3天到治疗后11天。误差条表示SEM(标准方差)。(D)对免疫活性小
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鼠模型中的已扩散的肺部肿瘤的治疗。通过将3×10CT26细胞注射到Balb/C小鼠的尾静脉中形成肺部肿瘤。在第12天，按以下方法对小鼠进行治疗：UV AV2IV＝1剂量，静脉内
8 8
(5×10pfu)，AV2IV＝1剂量的突变3VSV，静脉内(5×10pfu)，AV2 IN＝1剂量的AV2VSV，
7 8
鼻内(5×10pfu)，AV2IV&IN＝1剂量的AV2VSV，静脉内(5×10pfu)和1剂量的AV2VSV，
7
鼻内(5×10pfu)。治疗后4天，将所有小鼠杀死，并将它们的肺取出(为了便于测量，使心脏可以看到)。箭头表示剩余的肿瘤。(E)按以上方式形成肺部肿瘤。在第12天，按所示
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的那样通过鼻滴方式递送5×10pfu而对小鼠进行治疗，在2周的时间内隔天进行递送(共
6剂量)。每天监测致病率和死亡率，对出现呼吸窘迫的小鼠实施安乐死，并对它们的肿瘤负荷进行检测。“n”表示治疗组小鼠的数目。

[0023] 图5表示描述突变的VSV株系是如何能够防止烈性WT株系从混杂的群体中出现的模型。(A)WT VSV能够阻断IFN从感染的细胞中分泌，使得邻近的细胞没有受到保护而对新生的病毒体表现出易感性，由此导致病毒传播。(B)用编码在阻断核/质转运中具有缺陷的M蛋白的VSV株系感染后，诱导了IFNs和可能的其它细胞因子的“细胞因子云”。邻近的细胞免于受到企图在群体中出现的突变VSV和任何推测回复株的感染。

[0024] 图6描述突变的实施例，该突变可以按照本发明在编码VSV的M蛋白的基因中进行。

[0025] 图7描述用于拯救突变体XNDG M4和M5的VSV的M蛋白的相关部分的序列。

[0026] 图8描述经拯救的突变体VSVs XNDG M4和M5具有与Mut2突变VSV类似的噬菌斑大小。

[0027] 图9A、B和C描述用与GFP融合的VSV的氨基末端72个氨基酸(WT+72-GFP-N1，绿色)和OCT-DsRed2(线粒体标记，红色)转染的细胞的图。C.合并图显示M-GFP和OCT-DsRed2的共定位。D、E和F显示用WT+72-GFP-N1转染并用Mitotraker Red(线粒体示踪红)染色的细胞。箭头表示典型的显示断开的(punctuate)线粒体和的线粒体示踪红染色降低的转染细胞。星号表示具有网状(正常)线粒体的转染细胞，该线粒体显示WT+72-GFP-N1和线粒体示踪红染色的共定位(合并图F)。G和H显示用WT+72-GFP-N1转染并用线粒体示踪红染色的细胞。转染细胞具有断开的线粒体和降低的线粒体示踪染色(箭头)。

[0028] 图10A、B和C描述用与GFP融合的VSV M的氨基末端72个氨基酸(WT+72-GFP-N1，绿色)和OCT-DsRed2(线粒体标记，红色)共转染的活细胞的图。合并图显示原来在该细胞中为网状的线粒体随着该细胞被这种毒性蛋白杀死而出现的共定位和渐进性片段化。D是按上述方法进行共转染的活细胞。这再一次显示WT+72-GFP-N1和与该VSVM-GFP融合蛋白具有相对浓度的OCT-DsRed2的共定位，以及在该线粒体中的突出部分和交叉部分(绿色)。

[0029] 图11描述VSV突变体AV1的基因组的核酸序列(SEQ ID NO：1)。

[0030] 图12描述VSV突变体AV1的突变的M蛋白基因的核酸序列(SEQID NO：2)。

[0031] 图13描述VSV突变体AV1的突变的M蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：3)。

[0032] 图14描述VSV突变体AV2的基因组的核酸序列(SEQ ID NO：4)。

[0033] 图15描述VSV突变体AV2的突变的M蛋白基因的核酸序列(SEQID NO：5)。

[0034] 图16描述VSV突变体AV2的突变的M蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：6)。

[0035] 图17A和B图示性地显示了根据本发明的一个实施方案的突变VSV的保护性作用，其中，图17A描述在施用致命的颅内剂量的VSV后，小鼠的存活百分比；图17B描述在施用致命的颅内剂量的VSV后，小鼠体重随着时间的变化。

[0036] 图18图示性地描述在用WT VSV或突变VSV(AV1或AV2)感染的OVCAR4、CAKI-1和HOP62细胞中的IFN-β相对产量。

[0037] 图19A和B图示性地描述来自WT VSV和ΔM51 VSV处理的小鼠的脾细胞的抗CT-26细胞毒性T淋巴细胞活性，所述小鼠具有确定的CT26肿瘤(图19A)和由来自WT VSV和ΔM51 VSV处理的小鼠的脾细胞引起的NK依赖性和非依赖性的CT26细胞裂解(图19B)。

[0038] 图20描述来自携带皮下CT26肿瘤的ΔM51 VSV GFP处理的小鼠的CT26肿瘤的免疫组织化学染色切片。

具体实施方式

[0039] 本发明提供在基因中携带一个或一个以上突变的突变病毒，所述基因编码在受感染细胞中负责阻断mRNA或蛋白的核转运的蛋白。因此当与野生型病毒进行比较时，该突变病毒具有降低的阻断核转运的能力，并且在体内是减毒的。该突变病毒能够引发正常宿主细胞的抗病毒系统，同时还保持对这些系统作用的敏感性。该突变病毒在广大范围内应用，包括但不限于治疗癌症和慢性感染的治疗剂、该治疗剂为疫苗和佐剂、病毒载体，以及用于选择性裂解恶性细胞或受感染细胞的溶瘤剂和溶细胞剂。

[0040] 定义

[0041] 除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的一般理解相同的含义。在本文，互换使用氨基酸的标准的三字母和单字母符号。

[0042] 本文使用的涉及具体病毒的术语“异源核酸序列”是指源自所述具体病毒之外的来源的核酸序列。

[0043] 本文使用的术语“突变”是指缺失、异源核酸的插入、倒位或置换。

[0044] 本文使用的术语“基因”是指编码单独的蛋白或RNA(也称为“编码序列”或“编码区”)以及诸如启动子、操纵子、终止子等有关的调节区的核酸片段，所述的调节区可以定位在编码序列的上游或下游。

[0045] 本文使用的术语“突变病毒”是指在其基因组中含有一个或一个以上突变的病毒，所述突变包括但不限于缺失、异源核酸的插入、倒位、置换，或者它们的组合。

[0046] 本文使用的术语“天然存在的”，涉及病毒时是指该病毒可以在自然界中找到，即可以从自然界来源中分离到该病毒并且没有经过实验室人为的特意修饰。

[0047] 本文使用的术语“野生型病毒”是指在自然界中发现的具有最常见基因型的病毒，突变体是相对于野生型病毒来进行定义的。

[0048] 本文使用的术语“抗病毒系统”是指针对病毒感染进行细胞应答的组分，包括例如干扰素和其它的细胞因子、一氧化氮合成酶、双链RNA依赖性激酶(PKR)、寡聚腺苷酸合成酶(OAS)、Mx A和Mx B GTP酶等。

[0049] 本文使用的术语“抗病毒应答”是指针对病毒感染进行的细胞应答，包括例如干扰素的产生、细胞因子的释放、趋化因子的产生、淋巴因子的产生，或者它们的组合。

[0050] 本文使用的术语“正常宿主细胞”是指具有完全的抗病毒应答的非癌非感染细胞。

[0051] 本文使用的术语“疫苗”是指在动物中能够刺激免疫应答而不引起疾病的物质的制剂。

[0052] 本文使用的术语“溶瘤剂”是指能够抑制肿瘤细胞的生长和/或能够杀死肿瘤细胞的试剂。

[0053] 本文使用的术语“佐剂”是指当将其添加到疫苗中时能够促进该疫苗在受试对象中刺激引起的免疫应答增强的物质。

[0054] 突变病毒

[0055] 本发明提供包含在其基因中具有一个或一个以上突变的突变病毒，所述基因编码涉及在感染宿主细胞中阻断mRNA或蛋白的核转运的蛋白。结果，该突变病毒具有降低的阻断核转运的能力，并且该病毒在体内是减毒的。对mRNA或蛋白的核转运的阻断削弱了受感染细胞中的抗病毒系统以及消弱了受感染细胞能够保护邻近细胞不受到感染(即早期预警系统)的机制，并最终导致细胞溶解。因此在本发明的一个实施方案中，所述的突变病毒与它们的野生型对应病毒相比具有降低的溶细胞性质。

[0056] 由于突变病毒不能够阻断mRNA或蛋白的核转运，该突变病毒对正常宿主细胞的感染能够导致该细胞的抗病毒系统的引发，而野生型病毒通常阻断或者避开该抗病毒系统。因此根据本发明另一个实施方案，突变病毒能够引发正常宿主细胞的抗病毒系统，并且对该抗病毒系统敏感。

[0057] 由于许多能够阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运(作为其复制周期的一部分)的病毒是已知的，因此适合于进行突变以产生如本发明所述的突变病毒。该病毒可以是DNA病毒，正链RNA病毒或负链RNA病毒。适宜的DNA病毒的例子包括疱疹病毒、腺病毒、微小病毒、乳多空病毒、虹色病毒、嗜肝DNA病毒(hepadenavirus)、痘病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒、麻疹病毒或风疹病毒。适宜的正义RNA病毒的例子包括披膜病毒、黄病毒、小核糖核酸病毒或冠状病毒。适宜的负义RNA病毒的例子包括来自正粘病毒科、弹状病毒科和副粘病毒科的病毒。

[0058] 在本发明的一个实施方案中，所述病毒为选自痘病毒科、小核糖核酸病毒、正粘病毒科或弹状病毒科，例如，该病毒可以是牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、流感病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒或水泡病毒。

[0059] 在本发明的另一个实施方案中，所述病毒是弹状病毒科的成员。弹状病毒尤其适合于治疗用途，因为它们不是与人共有的病原体。预先存在的对与用作治疗剂的病毒株类似的病毒株的免疫应答会减弱该突变病毒作为治疗剂的效果，因而是不希望得到的。而且，弹状病毒是RNA病毒，其在细胞质中完成它们的全部生命周期，因而降低了不需要的整合到该患者的基因组中的危险性。

[0060] 在本发明的另一个实施方案中，弹状病毒是水泡病毒。适宜的水泡病毒的例子包括但不限于，Piry、金迪普拉病毒、水泡性口炎病毒(VSV)。

[0061] VSV是已证明具有治疗潜能的水泡病毒科成员。VSV在人中的感染是没有症状或出现轻微“流感”症状。至今还没有在VSV感染的人中出现严重疾病或死亡的病例的报道。VSV的其它有用特性包括以下事实：该病毒繁殖快的事实和可以容易地浓缩成高滴度，该病毒非常简单，只有5个基因，因此很容易进行遗传操作，并且该病毒的宿主范围广并能够感染大多数类型的人类细胞。在本发明的一个实施方案中，所述的突变病毒是突变的VSV。
在本领域中已知有很多不同的VSV株系，并且该VSV株系适合于本发明的用途。例子包括但不限于，印第安纳株和新泽西株。本领域技术人员应该理解将来会出现和/或发现VSV新株系，该新株系也适合于本发明的用途。该株系也被认为落在本发明的范围之内。

[0062] 1.突变病毒的制备

[0063] 根据本发明，所述突变病毒可以是天然存在的突变体或它们可以是遗传工程突变体。因此，所述突变病毒可以使用限定的生长条件或选择压进行选择而获得，或它们可以是使用本领域已知的遗传工程技术进行了特定改造的重组病毒。

[0064] 例如，为了选择那些在受感染细胞中引发抗病毒系统并且保持对抗病毒系统敏感的突变病毒，可以将大量的病毒置于细胞上培养，所述细胞通常对野生型病毒是易感的；并分离在这些细胞上生长欠佳(即形成较小的噬菌斑)病毒。这些分离的病毒就是候选的突变病毒。一种用于病毒(例如通常在受感染细胞中阻断干扰素应答的VSV)选择的技术的例子就是在干扰素应答细胞(例如上皮细胞系)上对与野生型病毒相比时生长欠佳的VSV进行选择。当所述的候选突变体在干扰素非应答细胞(例如肿瘤细胞)上生长时形成大噬菌斑，即可以确定原先生长欠佳是因为干扰素应答的缘故(参见，例如，国际专利申请WO01/19380)。

[0065] 一旦天然存在的突变病毒得到鉴定和分离，就可以用标准技术(例如测序技术、限制性分析、杂交技术、微矩阵分析或者它们的组合)测定突变在病毒基因组中的位置。然后使用标准技术(见下文)对重组的突变病毒进行遗传改造，以在该基因组的相同区域中含有相同的一个或多个突变或含有类似的一个或多个突变。对于通过遗传改造(即重组病毒)而含有缺失突变或插入突变的病毒，其回复率通常比天然存在的突变体低，因此尤其适合于治疗目的。

[0066] 可选择地，如果病毒中的候选基因已经确定，可以使用本领域熟知的技术对重组的突变病毒进行遗传改造(参见，例如，Sambrook等，1989，实验室手册(A Laboratory Manual)，纽约：冷泉港实验室出版社)。猜想在这一点上的候选基因将会是这样的基因，其编码涉及阻断受感染细胞中mRNA或蛋白的核转运的蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述的突变病毒是重组的突变病毒。

[0067] 例如，可以使用例如那些在专利号为4,769,330和4,215,051的美国专利中和由Racaniello等(1981，科学(Science)214：916～919)记载的重组DNA技术，对DNA病毒(例如牛痘病毒、腺病毒、杆状病毒)和正链RNA病毒(例如脊髓灰质炎病毒)进行改造。可以使用已建立完善的“反向遗传学”技术(例如针对VSV而建立的反向遗传学系统(RobertsA和J.K.Rose，Virology，1998，247：1～6))对负链RNA病毒(例如流感病毒和VSV)进行遗传改造。

[0068] 可以使用例如以上所述的遗传学技术对候选基因中的一个或一个以上的突变进行遗传工程化。本领域熟练技术人员应该理解，该基因可以是编码结构蛋白或者非结构蛋白的基因，这取决于所使用的特定病毒。所述的突变可以是一个或一个以上核苷酸的核苷酸缺失、插入、倒位或置换，或是外源核酸的插入，或者是它们的组合。正如本领域已知的那样，通过对引入的突变进行修正，有时突变病毒能够回复为野生型。因此可以使用诸如缺失和/或多个核苷酸突变等难以修正的突变，来产生突变病毒，以使回复可能性最小。在本发明的一个实施方案中，引入的突变是缺失突变。在另一个实施方案中，引入的突变是涉及两个、三个或者更多核苷酸的突变。本领域中已熟知，可以通过在基因的编码区或与其相关的调控区中引入突变，从而影响蛋白的表达。在本发明中包括了在候选基因的非编码区或编码区或者其组合中的突变。在一个实施方案中，通过遗传改造将一个或一个以上的突变引入基因的编码区。在另一个实施方案中，通过遗传改造将一个或一个以上的突变引入编码非结构蛋白的基因的编码区。

[0069] 一个适宜的编码非结构蛋白的基因的例子是编码弹状病毒的基质蛋白(或M蛋白)的基因。已广泛研究了来自VSV的M蛋白，并且显示出其是数种关键的病毒功能所需的多功能蛋白，所述功能包括出芽(Jayakar等，2000，J Virol，74(21)：9818～9827)、病毒体装配(Newcomb等，1982，J Virol，41(3)：1055～1062)、细胞病理效应(Blondel等，1990，J Virol，64(4)：1716～1725)以及抑制宿主基因表达(Lyles等，1996，Virology 225(1)：172～180)。在本文中也显示了后一种性质是由于抑制了蛋白和mRNA进出宿主细胞核的核转运。可在编码VSV的M蛋白的基因中进行的适宜突变的例子包括但不限于，在编码区中插入异源核酸、在编码区中缺失一个或一个以上的核苷酸、或在M蛋白的33、51、52、53、
54、221、226位点产生导致一个或一个以上的氨基酸残基发生置换或缺失的突变，或者它们的组合。

[0070] 已显示VSV的M蛋白的氨基末端使该蛋白靶向线粒体，这可能有助于该蛋白的细胞毒性。因此，在该蛋白的该区域引入突变可以导致病毒毒性的加强或减弱。在编码该蛋白N-端的M蛋白基因区域中产生适宜突变的例子包括但不限于，导致在该蛋白的前(N-末端)72个氨基酸中产生一个或一个以上缺失、插入或置换的那些突变。

[0071] 以上提到的氨基酸数字描述了在VSV的印第安纳株的M蛋白中的位置。来自其它VSV株系和弹状病毒科的M蛋白的氨基酸序列与印第安纳VSV的M蛋白的氨基酸序列可能会由于导致相应氨基酸编号产生微小差别的数个氨基酸的存在或缺失而稍有不同，这一点对本领域技术人员来说是显而易见的。使用标准技术和软件(例如在国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information)的网站上可获得的BLASTX程序)，将相关蛋白的序列与印第安纳VSV的M蛋白的序列进行比对，以确定与本文描述的那些突变相对应的适当突变氨基酸，这些工作对于本领域技术人员来说是很容易进行的。由此确定的氨基酸是根据本发明的突变的候选氨基酸。

[0072] 在本发明的一个实施方案中，所述的突变病毒是在编码M蛋白的基因中引入了以下一个或一个以上突变的VSV(标记方法是：野生型氨基酸/氨基酸位置/突变的氨基酸，符号Δ表示缺失，而X表示任何氨基酸)：M51R、M51A、M51-54A、ΔM51、ΔM51-54、ΔM51-57、V221F、S226R、ΔV221-S226、M51X、V221X、S226X，或者它们的组合。在另一个实施方案中，所述的突变病毒是在编码M蛋白的基因中引入了以下突变组合之一的VSV：双突变：M51R和V221F、M51A和V221F、M51-54A和V221F、ΔM51和V221F、ΔM51-54和V221F、ΔM51-57和 V221F、M51R和 S226R、M51A和 S226R、M51-54A和 S226R、ΔM51和 S226R、ΔM51-54和S226R、ΔM51-57和S226R；三重突变：M51R、V221F和S226R，M51A、V221F和S226R，M51-54A、V221F和S226R，ΔM51、V221F和S226R，ΔM51-54、V221F和S226R，ΔM51-57、V221F和S226R。突变的M蛋白的例子在图6中描述。

[0073] 本发明还涉及分离的核酸分子(DNA或RNA)，该核酸分子具有所述突变病毒的序列或其片段以及与其互补的序列。这些序列在产生重组的突变病毒中是有用的，或作为引物或探针。在一个实施方案中，提供分离的核酸分子，该核酸分子具有突变VSV的序列或其片段以及与其互补的序列。在另一个实施方案中，提供分离的核酸分子，该核酸分子具有在M蛋白中具有一个或一个以上突变的VSV序列或其片段以及与其互补的序列。

[0074] 2.测试突变病毒

[0075] 根据本发明，所述的突变病毒的特征为当与野生型病毒相比时，其阻断mRNA或蛋白的核转运的能力下降。该能力的缺失可以导致该突变病毒表现出降低的溶细胞活性和/或导致该突变病毒引发细胞的抗病毒系统，而所述的溶细胞活性和/或引发抗病毒系统通常是被野生型病毒阻断的。

[0076] 2.1体外测试

[0077] 可以体外筛选降低的或丧失的阻断mRNA或蛋白的核转运的能力的候选突变病毒。例如，可用候选突变病毒感染适当的细胞系，可收集该细胞，并分离细胞核和细胞质组分。从这些各组分中分离mRNA，并通过诸如RT-PCR、Northern印迹或微矩阵分析等本领域熟知的技术进行测定。然后可以将所述的细胞核和细胞质组分的mRNA含量与适宜的对照进行比较，所述对照例如用野生型病毒感染的细胞和/或模拟感染的细胞的类似细胞组分的mRNA含量。

[0078] 选择性地，可用用原位杂交分析方法来测试候选突变病毒。可以使用本身具有或通过遗传改造而具有短半寿期的一种或一种以上的靶mRNA来建立该分析方法。然后采用原位杂交在此前用候选突变病毒感染的细胞中检测所述的靶mRNA。在感染后的细胞质中检测到所述靶mRNA表明，当与未感染对照和/或用野生型病毒感染的对照相比时，候选病毒阻断mRNA由细胞核运出的能力下降了。本领域技术人员可以很容易对这种类型的分析方法进行修改以适应高通量筛选。

[0079] 类似地，使用通过标准技术进行遗传改造以表达由具有短半寿期的mRNA编码的荧光蛋白的细胞系，可以建立测试突变病毒的分析方法。然后用野生型病毒和候选突变病毒单独感染来自所述经遗传改造的细胞系的细胞，并用公认的技术监测荧光。在被野生型病毒感染的细胞中，由于新产生的编码荧光蛋白的mRNA的核质转运被该病毒阻断，其荧光将丧失。另一方面，具有降低的阻断mRNA转运能力的突变病毒将在较长的时间内发出荧光。本领域技术人员可以很容易对这种类型的分析方法进行修改以适应高通量筛选。

[0080] 在用突变病毒感染的细胞中，在其细胞质中将检测到比用野生型病毒感染的细胞的细胞质更多的特定的参考mRNA。根据本发明，用突变病毒感染细胞将导致在该细胞的细胞质中的参考mRNA的量比用野生型病毒感染的细胞的细胞质中的量至少增加20倍。在一个实施方案中，用突变病毒感染细胞将导致在该细胞的细胞质中的参考mRNA的量至少增加50倍。在其它实施方案中，所述的增加是100倍、250倍、500倍或至少1000倍。

[0081] 如上所述，所述的突变病毒可以在受感染细胞中引发通常被野生型病毒阻断或避开的抗病毒系统。因此，可以基于与野生型病毒相比，候选突变病毒在具有完整的抗病毒系统的细胞上生长欠佳而对它们进行筛选。突变病毒应该能够在抗病毒系统的一个或多个成分中存在缺陷的细胞上生长得与野生型病毒一样好。例如，引发干扰素系统的突变病毒在干扰素应答细胞上生长不良，但在诸如肿瘤细胞等干扰素应答丧失的细胞上，该突变病毒应该与野生型病毒生长得一样好。还可以通过用例如Western印迹分析、Northern分析或微矩阵分析等标准技术，分析受感染细胞中编码抗病毒应答的成分的那些基因的表达，并将表达水平与适当的对照进行比较，测定突变病毒在细胞中引发抗病毒系统的能力。

[0082] 引发抗病毒系统应答的突变病毒还能够防止野生型病毒对邻近细胞的感染。这种能力可以通过使用该突变体和野生型病毒以及通常容易受到所述野生型病毒感染的细胞进行共感染实验并测定野生型病毒在所述共感染细胞中的生长来测试。本领域已知实施共感染实验的方法。

[0083] 2.2体内测试

[0084] 一旦确定适当的突变病毒，可以使用适宜的动物模型通过本领域已知的标准技术来评价该突变病毒的效力和毒性。

[0085] 例如，可以通过进行LD50测试来测定毒性。在本发明的一个实施方案中，所述突变病毒具有比野生型病毒高约10倍～10,000倍的LD50。可选择地，可以用不同浓度的突变病毒处理适宜的动物模型，然后在适当的时期内，可以通过监测该动物的总体健康状况和体重来对该病毒的毒效进行评价。评价期过后，可以将动物杀死，并测定相关器官的外观和重量。适宜的动物模型的例子包括但不限于，Balb/C小鼠和CD-1小鼠。其它适宜的动物模型的例子包括那些尤其是容易受到野生型病毒感染的动物模型，例如那些在抗病毒应答-/-的成分中存在缺陷的动物模型。PKR 小鼠是一个例子，该小鼠已被证明对VSV感染极度敏感。

[0086] 突变病毒引发抗病毒应答的能力可以通过使用标准技术进行体内测试。例如，可以使用该突变病毒处理动物，然后用野生型病毒或第二病毒进行攻击。可以将这些动物中的存活情况与以前没有接受突变病毒处理的对照组进行比较。

[0087] 如上所述，引发免疫应答的突变病毒还能够保护受试对象不受到野生型病毒的同时共感染。为了评价突变病毒的这种保护效果，可以针对被野生型病毒和突变病毒共感染的动物进行抗病毒应答和毒性概况测试，并可以将其与被野生型病毒单独感染的动物进行比较。

[0088] 用途

[0089] 本发明的突变病毒对大范围的应用是有用的，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。以下提供的是非限制性实施例。

[0090] 1.病毒载体

[0091] 本发明提供本发明的突变病毒作为病毒载体的用途。当用作病毒载体时，对突变病毒进行改造，以加入至少一个编码治疗活性分子的异源核酸序列。可以将该病毒载体用于受感染细胞，然后使该细胞表达由所述异源核酸序列编码的治疗活性分子。因此病毒载体可以用于将异源核酸递送到受试对象的细胞中，以在体内表达该治疗活性分子。

[0092] 加入到病毒载体中的异源核酸序列可以通过例如使用标准的克隆和/或核酸扩增技术取自基因组DNA、cDNA或RNA，或者其可以通过本领域已知方法进行化学合成。可以使用本领域已知的和在本文或其它地方描述的方法，将所述核酸序列插入到病毒基因组中的非必需区域或基因，或插入到编码涉及阻断细胞核mRNA或蛋白转运的蛋白的基因中。

[0093] 为了本发明目的，由异源核酸序列编码的治疗活性分子可以是诸如当在细胞中得以表达时对该细胞补充或提供其缺乏的活性的蛋白，从而使细胞能够对抗病理学病症。这样的蛋白包括但不限于，酶、血液衍生物、激素、淋巴因子、生长因子、神经递质、营养因子、载脂蛋白和肿瘤抑制基因、病毒或肿瘤特异性抗原或抗原表位、免疫调节剂、干扰素调控因子、细胞因子和自杀基因。那些本领域技术人员应该理解，插入的异源DNA/RNA可以进一步包括启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸信号、内部核糖体进入位点和其它由该DNA或RNA编码的基因的有效表达所需的调控元件。可选择地，异源核酸的表达可以完全或部分地依赖于该病毒载体的内源调控序列。

[0094] 本发明还考虑编码反义寡核苷酸、核糖酶或siRNAs(小分子干扰RNA)的异源核酸。这些序列在靶细胞的表达使得细胞基因的表达和/或细胞mRNA的转录受到控制。

[0095] 在本发明的一个实施方案中，用作病毒载体的突变病毒是突变的弹状病毒。在另一个实施方案中，该突变病毒是在其M蛋白中含有一个或一个以上突变的弹状病毒。在另一个实施方案中，该突变病毒是在其M蛋白中包含一个或一个以上突变的VSV。

[0096] 当被用作病毒载体时，本发明的突变病毒可以用以对离体(ex vivo)的供体细胞进行改造，然后再将经改造的细胞返回到该供体或另一个患者中，或者本发明的突变病毒可以用以对患者细胞进行体外改造。这种方法在本领域是众所周知的。

[0097] 在本发明的一个实施方案中，将病毒载体作为“基因治疗性载体”，用以将编码蛋白的异源核酸递送到受试对象中，当所述蛋白在该受试对象的细胞中得以表达时，补充或提供否则在该细胞会缺乏的活性。

[0098] 在本发明的另一个实施方案中，将所述病毒载体用作疫苗载体，该疫苗载体携带有编码一个或一个以上抗原的异源核酸序列，并被用于对个体进行免疫以抗疾病和/或感染。所述抗原可以是例如肿瘤、病毒或细菌抗原。也可以考虑将该病毒载体作为“多价”疫苗载体的用途，其中，该载体包含抗不同生物体的抗原，因而提供抗一种以上疾病或抗一种以上生物体的感染的免疫。

[0099] 将引发宿主细胞诸如产生各种细胞因子等抗病毒系统的突变病毒作为疫苗病毒尤其有用。细胞因子的诱导可以导致刺激体液免疫应答和细胞免疫应答，从而提高病毒载体的效力。

[0100] 当将本发明的突变病毒用作疫苗载体时，施用给受试对象的有效量将因编码的抗原，受试对象的年龄、体重和性别，以及施用方式而变化。本领域技术人员可以使用本领域熟知的标准技术确定用于免疫特定受试对象所需的剂量。

[0101] 为了评价本发明的突变病毒作为疫苗载体的效力，可以进行攻击研究。该攻击研究通常使用实验动物进行，并包括通过诸如鼻内方式和肌肉内方式等各种技术用突变病毒对各组动物进行接种。应该平行建立用于对突变病毒效力进行比较的对照组。对照组可以包括没有接种的动物和接种有例如商购的可供选择的疫苗的动物。接种后经过适当的时期，用病原物(即微生物、病毒或肿瘤细胞)攻击该动物。然后从接种前的动物和接种后的动物以及攻击后的动物收集血样，并分析对病原物的抗体应答。用于抗体应答的适宜的测试包括但不限于，Western印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)。可选择地，当用肿瘤细胞对动物进行攻击时，例如通过监测肿瘤尺寸或重量的增加来监测肿瘤细胞的生长。

[0102] 也可以通过诸如淋巴细胞母细胞形成技术监测细胞免疫(T淋巴细胞)的诱导和通过干扰素释放技术监测细胞因子的诱导，来对细胞免疫应答进行评价。

[0103] 2.溶瘤剂

[0104] 如本领域所已知的那样，一些病毒能够充当选择性溶瘤剂。例子包括VSV、新城疫病毒、微小病毒H-1和一些改造的病毒如ONYX-015人腺病毒(参见，例如国际PCT申请WO01/19380和WO 00/62735和Bell，JC，Lichty BD和Stojdl D.，2003Cancer Cell 4：7～
11)。溶瘤病毒抑制肿瘤细胞生长的效果部分在于肿瘤细胞对病毒感染具有与正常细胞不同的易感性。癌细胞在生长抑制或凋亡途径中获得突变，从而与它们的正常对应细胞相比具有存活优势。在肿瘤进化过程中，经常选择的一个缺陷是干扰素(IFN)应答的缺失。干扰素也是个体细胞的抗病毒应答的一个重要介质，因而获得突变而使得它们逃避干扰素介导的生长控制程序的肿瘤细胞将同时损害它们的先天性抗病毒应答。

[0105] 在先天性抗病毒应答受到损害的这种细胞中，阻断mRNA或蛋白核输出的能力的缺失将不影响突变病毒在该细胞中的复制能力。本发明的突变病毒能够在受感染细胞中引发抗病毒系统，同时保持对这些抗病毒系统的敏感，因而将能够在肿瘤细胞中进行选择性复制，并且抑制肿瘤细胞的生长或杀死肿瘤细胞，但是不能在正常细胞中复制。因此，本发明提供突变病毒作为改善的溶瘤剂的用途。

[0106] 应该理解，涉及阻断核mRNA或蛋白的转运的病毒蛋白还可以对受感染细胞具有其它作用。例如，已经证明VSV的M蛋白对于将蛋白靶向受感染细胞的线粒体而引起细胞毒性作用是重要的。还有，已证明M蛋白与宿主的蛋白TSG101相互作用，以提高后代病毒体从受感染细胞中出芽。

[0107] 因此，本发明提供在其M蛋白中具有一个或一个以上突变的重组的突变的弹状病毒，所述的突变不但降低突变病毒阻断核转运的能力，还改变M蛋白与宿主细胞的线粒体的相互作用。已经证明，VSV的M蛋白的N末端对该蛋白靶向受感染细胞的线粒体是重要的。在该蛋白的这个区域的突变增强或废除这种定位，因此将调节病毒载体的细胞毒性特性。突变病毒的细胞毒性可以被增强或降低，这取决于所引入的突变。通过改造而在M蛋白中具有一个或一个以上的突变从而导致细胞毒性得以增强的那些突变病毒将是特别有效的溶瘤剂。

[0108] 本发明进一步考虑在M蛋白中具有一个或一个以上突变的重组的弹状病毒的用途，所述突变改变了病毒与宿主蛋白TSG101的相互作用。TSG101是肿瘤抑制蛋白，该蛋白的表达和功能在恶性细胞中经常被改变。将干扰这种相互作用的突变引入M蛋白中，可以产生在肿瘤细胞中更有效地进行复制的重组病毒，导致更有效的溶瘤剂的产生。

[0109] 使用标准的异种移植肿瘤模型，可以测定本发明的突变病毒的溶瘤活性，在该模型中，人类肿瘤已经被植入免疫受损的动物中。人类癌症的异种移植模型的例子包括但不限于，通过皮下注射到小鼠中的人实体瘤异种移植体，其被用于肿瘤生长测定；通过脂垫注射到小鼠中的人实体瘤同基因移植体，其被用于肿瘤生长测定；小鼠中的淋巴瘤和白血病的实验模型，其被用于存活测定中；以及小鼠中的肺转移癌的实验模型。

[0110] 可以通过比较用突变病毒处理和未处理对照的异种移植动物中的肿瘤生长情况，测试突变病毒的溶瘤活性。也可以使用用野生型溶瘤病毒感染的对照动物。可以将突变病毒直接施用于肿瘤或进行全身施用，或将其用以感染离体细胞，然后将该细胞施用到动物中。还可以将通过皮下注射或静脉内注射(以形成肺肿瘤)形成肿瘤的同基因小鼠模型系统用于测试突变病毒的溶瘤活性。

[0111] 3.疫苗佐剂

[0112] 能够在宿主细胞中引发抗病毒系统的本发明突变病毒是疫苗佐剂的理想候选者。如本领域已知的那样，许多抗原的免疫原性不强，并且，当其被用作疫苗时，为了刺激受试对象产生强的免疫应答，需要加入佐剂。本发明考虑突变病毒作为疫苗佐剂的用途，以通过引发宿主的抗病毒应答从而增强该疫苗的免疫原性。在本发明的一个实施方案中，突变病毒通过刺激产生干扰素和其它细胞因子而充当疫苗佐剂。

[0113] 4.药学制剂中的保护剂

[0114] 如上所述，引发其感染的细胞的抗病毒系统的本发明突变病毒，可以限制野生型病毒和企图感染邻近细胞的其它病毒的复制。因此，用这些突变病毒对细胞进行的感染不仅可以自我限制，而且还防止回复体的出现。因此，该突变病毒可以用作药物病毒制剂的添加剂，其可以防止烈性回复体在该制剂的生产过程中或将该制剂施用于受试对象后在该制剂中出现。

[0115] 5.其它治疗性应用

[0116] 如上所述，本发明的突变病毒引发宿主细胞的抗病毒系统，从而导致各种细胞因子的产生。因此，这些病毒可以用于诸如癌症、自体免疫疾病以及细菌、病毒和真菌感染等疾病或异常的治疗中，所述的疾病或异常可以由细胞因子的释放而得到缓解。

[0117] 6.其它溶细胞应用

[0118] 如本领域已知的那样，诸如HIV和HCV的许多病毒，将受感染细胞的抗病毒系统下调。诸如痘病毒、BVDV(牛病毒性腹泻病毒)、布尼亚病毒科、轮状病毒、流感病毒和HPV(单纯疱疹病毒)等其它病毒，作为它们的复制周期的一部分而阻断宿主细胞的抗病毒应答。结果，被这些病毒中的一种感染的细胞对本发明突变病毒的感染可以具有增强的易感性。
如上所述，在抗病毒应答受到损害的细胞中，突变病毒仍可以复制。因此，本发明的突变病毒可以被用作，该溶细胞剂可以在受感染细胞中进行选择性复制，并杀死该受感染细胞。

[0119] 药物组合物

[0120] 本发明进一步提供包含本发明病毒和药学上可接受的载体的药物组合物。

[0121] 所述药物组合物可以以水性悬浮液的形式存在，该水性悬浮液含有与适当的赋形剂混合的突变病毒，所述赋形剂包括但不限于，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶等悬浮剂，诸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)等的分散剂或润湿剂，所述水性悬浮液还可以含有一种和一种以上的防腐剂，例如乙基(ethyl)、正丙基对羟基苯甲酸酯。所述的药物组合物可以以无菌的可注射悬浮液形式存在。该悬浮液可以用适宜的分散剂或润湿剂和诸如上述的那些悬浮剂，根据本领域已知方法进行配制。所述无菌的可注射制剂还可以是无毒的相互(parentally)可接受的稀释剂或溶剂的无菌的可注射的溶液或悬浮液。可以使用的可接受的载体和溶剂包括但不限于，水、林格氏溶液、乳酸化的林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。

[0122] 其它的药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域已知的和记载于，例如，“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”(更正式的名称为“Remingtons Pharmaceutical Sciences”)；Gennaro，A.，Lippincott，Williams & Wilkins，Philidephia，PA(2000)。

[0123] 试剂盒

[0124] 本发明提供含有本发明突变病毒的试剂盒以用于免疫接种；和含有本发明的突变病毒的试剂盒，所述的病毒携带有一个或一个以上的异源基因，以用作载体而将一个或一个以上的异源基因递送到受到对象中。所述的突变病毒可以以药物组合物的形式提供在试剂盒中。试剂盒中的各个组分可以包装在不同或相同的容器中，并且与该容器放在一起的可以是政府机构规定的形式的通知，所述政府机构管理药物或生物产品的生产、使用或销售，所述通知可以反映该机构对用于动物或人施用的生产、使用或销售的许可。

[0125] 所述的试剂盒的组分还可以以干燥的或冻干的形式来提供，而且该试剂盒可以另外含有用于冻干组分的恢复的适宜溶剂。不管容器的数量或类型怎样，本发明的试剂盒还可以包括帮助将该组合物施用于受试对象的器械。该器械可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼器或类似的药学上允许的递送工具。

[0126] 实施例

[0127] 实施例1：在INF-β信号转导的关闭中具有缺陷的溶瘤VSV株

[0128] 材料和方法

[0129] 病毒

[0130] 在本研究的整个过程中使用印第安纳血清型的VSV，并将该病毒培养在L929细胞中。在本研究中显示的T1026R(Desforges等，2001，VirusResearch 76(1)：87～102)和TP3(Desforges等，2001，同上)分别指AV1(或Mut2)和AV2(或Mut3)。其它地方是野生型的印第安纳VSV的HR株的IFN诱导型突变体(Francoeur等，1987，Virology 160(1)：236～245)。

[0131] IFN产生的ELISA

[0132] 使用人α干扰素ELISA试剂盒(PBL Biomedical)，按照生产商的说明，测定细胞培养基中α干扰素的水平。简言之，在感染后48小时收集100μl的培养基，将其与生产商提供的空白和标准一起培养在96孔的微滴定板中。按照生产商的说明书对样品进行处TM理，然后在450nm于DYNEX 读板器上读数。

[0133] VSV突变病毒的体内毒性的测定

[0134] 将8～10周龄的雌性小鼠(如上所述的品系)分成每组5个，并按照所示方法10 2
用1对数和1/2对数稀释的1×10 Pfu～1×10Pfu病毒(取决于病毒的株系和小鼠的品系)进行感染。对动物的体重下降、脱水、毛发的竖起、蜷缩行为、呼吸窘迫和后肢瘫痪进行监测。按照CCAS规定的优良的实验操作，对出现中度到重度发病的小时实施安乐死。用Karber-Spearman方法计算致死剂量50的值。

[0135] 用104Pfu的WT VSV、AV1或AV2对4周龄的Balb/C小鼠或α干扰素受体敲除的-/-Balb/C小鼠(IFNAR )(Steinhoff等，1995，J.Virol.，69：2153～2158)进行鼻内感染。
对小鼠的发病症状进行监测，并对出现严重呼吸窘迫症状的小鼠实施安乐死。

[0136] 测定野生型和突变VSV株的混合样品的体内毒性

[0137] 事先已确定Balb/C PKR-/-小鼠对LD100为约10pfu的WT VSV的鼻内感染高度敏感(Stojdl等，2000，J.Virol.，79：9580～9585)。用WT、AV2、或这些株系的混合物通过鼻内滴注来感染各组小鼠，每组3只。监测小鼠的发病症状，并且当出现严重呼吸窘迫或后肢瘫痪症状时，对小鼠实施安乐死。

[0138] 无胸腺小鼠中的卵巢异种移植癌模型

[0139] 将约1×106的ES-2人卵巢癌细胞注入CD-1无胸腺小鼠的腹膜腔内。在细胞注射9 9
后15天逐渐看到腹水的形成。在第12天、14天和16天，用1×10 的AV2病毒或1×10pfu的UV灭活的AV2VSV病毒通过腹膜内注射对小鼠进行处理。监测小鼠的发病率，并对形成腹水的小鼠实施安乐死。

[0140] 皮下肿瘤模型

[0141] 为了形成皮下肿瘤，将8～10周龄的Balb/C的雌性小鼠的右胁腹的毛剃掉，并注6
射1×10 的与Balb/C小鼠同基因的CT26结肠癌细胞(Kashtan等，1992，Surg Oncol 1(3)：
3
251～256)。使这些肿瘤发展到约10mm，此时开始用病毒进行处理。隔天让各组动物接受
8
1、6或12剂量的所示病毒。通过尾静脉注射施用5×10pfu的各剂量。每天对肿瘤进行测量，用公式1/2(L×W×H)计算其体积。每天对小鼠进行称重，并对体重下降、脱水、毛发的
3
竖起、蜷缩行为、呼吸窘迫和后肢瘫痪进行监测。当动物的肿瘤负荷达到终点(750mm)时，对动物实施安乐死。

[0142] 肺模型

[0143] 在8～10周龄的雌性Balb/C小鼠中，通过尾静脉注射3×105的CT26细胞(Specht等，1997，J Exp Med 186(8)：1213～1221)来形成肺肿瘤。在第10天、12天、14天、17天、19天和21天，按其他地方所记载的方法(Stojdl等，2000，Journal of Virology 74(20)：
7
9580～9585)通过鼻内滴注使各组小鼠接受5×10pfu的所示病毒。每天对小鼠进行称重，并对体重下降、脱水、毛发的竖起、蜷缩行为、呼吸窘迫和后肢瘫痪进行监测。当动物出现呼吸窘迫并确认它们的肺有肿瘤形成时，对它们实施安乐死。

[0144] MTS测试

[0145] 在各实验中，将各待测细胞系接种入96孔板的生长培养基(DMEM-F12-HAM+10％4
FBS)中，每孔3×10 个细胞。过夜培养(37℃，5％CO2)后，通过抽吸将培养基移出，将20μl
6
的含有从3×10pfu/孔到3pfu/孔以10倍递增的病毒的培养基(α-MEM，不含血清)或不含病毒的阴性对照培养基加到各板孔中。测试的各病毒剂量进行6个重复。培养60分钟以使病毒附着后，在各板孔中加入80μl的生长培养基，并将孔板再培养48小时。用TM
CellTitre 96 AQueous试剂(Promega公司)测试细胞的生存力，所述试剂使用四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑，内盐；
MTS)和电子偶联试剂(吩嗪硫酸甲酯，PMS)。MTS被细胞生物还原为溶于组织培养基的甲臢产物。甲臢产物在490nm的吸光值可以直接从96孔测试板进行测定。在490nm的吸光值测定的甲臢产物的量直接与培养物中活细胞的数量成比例。

[0146] 微矩阵分析

[0147] 在PBS中收获模拟处理的或用野生型(WT)和突变VSV株感染的OVCAR4细胞，将其沉淀并悬浮在250μl的重悬浮缓冲液(10mM的TrispH 7.4，15mM的NaCl，12.5mM的MgCl2)中。加入600μl的裂解缓冲液(25mM的Tris pH 7.4，15mM的NaCl，12.5mM的MgCl2，5％的蔗糖和1％的NP-40)，在4℃培养裂解物10分钟，并不时地进行涡旋振荡。在1000×g离心3分钟，收集细胞核。收集上清液(细胞质组分)，并在-80℃冷冻，而用250μl的裂解缓冲TM
液洗涤沉淀(细胞核组分)一次，并将其进行冷冻。用Qiagen RNeasy 试剂盒(按照生产商的说明书，Qiagen，Mississauga，加拿大)从细胞核组分和细胞质组分中提取总RNA，然后通过LiCl沉淀来浓缩各样品。按照生产商的标准程序(Affymetrix，Santa Clara CA，美TM
国)对20μg的各RNA样品进行处理，并与AffymetrixGeneChip 人类基因组U133A矩阵(HG U133A芯片)杂交。将各芯片标到1500，以存在于各HG U133A芯片中的100个标准化对照基因进行标准化，然后再在各基因的基础上按照模拟的细胞核样品对所有的细胞核样品TM
进行标准化，并且将细胞质组分按照相应的模拟的细胞质样品进行标准化。用Genespring软件(Silicon Genetics，Redwood City CA，美国)分析数据。

[0148] Western印迹

[0149] 使OVCAR4细胞生长在添加有10％胎牛血清(Wisent)的RPMI(Wisent)中。在感7
染的前一天，将1.0×10 的细胞铺到10cm的培养皿中。感染结束时，移出培养基，仅用RPMI
7
替换，然后加入5×10pfu的VSV病毒株。加入病毒后1小时，移出培养基，并在后续的实验持续时间中用添加有10％的FBS的RPMI替换。在标准的NP-40裂解缓冲液中裂解细胞，将75μl的全细胞提取物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上跑电泳。并用以下所示抗体进行印迹分析：IRF-7(sc-9083)、IRF-3(sc-9082)、ISG56(Gene Sen的赠品)、VSV-N(定向抗印第安纳N蛋白全长的多克隆抗体)和肌动蛋白(sc-8432)。

[0150] 构建体和病毒拯救

[0151] 以前已在其它地方(Lin等，2000，J.Biol.Chem.，275：34320～34327)记载了具有组成型活性的IRF-7Δ(IRF-7Δ247-467)的产生。用针对标记(Flag)表位的具有额外的5’VSV帽信号和Xho1连接序列的正向引物：

[0152] 5’-ATCGCTCGAGAACAGATGACTACAAAGACGATGACGACAAG-3(SEQ ID NO：7)[0153] 和含有VSV多聚A信号和Nhe1连接序列的特异的IRF-7反向引物：

[0154] 5’-ATCGGCTAGCAGTTTTTTTCAGGGATCCAGCTCTAGGTGGGCTGC-3’(SEQ ID NO：8)[0155] 通过PCR扩增RF-7Δ247-467。

[0156] 然后将PCR片段克隆到rVSV复制子载体pVSV-XN2(由John Rose提供)的Xho1和Nhel位点中。以前已有rVSV回收的记载(Lawson等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：4477～4481)。

[0157] β干扰素的mRNA的定量PCR

[0158] 按照生产商的说明(RNeasy，Qiagen，Mississauga，加拿大)，从感染的或模拟感染的OVCAR4细胞中分离细胞核和细胞质的总RNA。对4μg的总RNA进行DNase处理，并进TM行反转录。用Roche Lightcycler 技术(Roche Diagnostics，Laval，加拿大)进行三次定量PCR以从各样品中扩增出IFN-β和次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)目标。
基于针对各目标复制子所产生的标准曲线，将交叉点转换为绝对数值。然后根据HPRT对IFN-β信号进行标准化，因为在这些感染的过程中，HPRT水平没有发生变化，数据未示出。
用于扩增IFN-β的引物如下：

[0159] 正义：5’-TTGTGCTTCTCCACTACAGC-3’(SEQ ID NO：9)；

[0160] 反义：5’-CTGTAAGTCTGTTAATGAAG-3’(SEQ ID NO：10)

[0161] 和HPRT引物：

[0162] 正义：5’-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’(SEQ ID NO：11)；

[0163] 反义：5’-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3’(SEQ ID NO：12)

[0164] α干扰素和干扰素刺激的基因的RT-PCR

[0165] 用WT或突变的VSV株(MOI 10，其中，MOI是指感染复数，其为感染性病毒颗粒与细胞的比率)感染培养在添加有10％FBS的F12K培养基中的A549细胞。在感染后4小时，按照生产商的说明书，使用Trizol(Invitrogen)提取RNA。用寡聚的dT引物对1μg的RNA进行反转录，在Taq PCR中使用5％的RT作为模板。所使用的引物如下：

[0166] Mx正向引物：5’-ATG GTT GTT TCC GAA GTG GAC-3’(SEQ IDNO：13)；

[0167] Mx反向引物：5’-TTT CTT CAG TTT CAG CAC CAG-3’(SEQ IDNO：14)；

[0168] VSV N正向引物：5’-ATG TCT GTT ACA GTC AAG AGA ATC-3’(SEQ ID NO：15)；

[0169] VSV N反向引物：5’-TCA TTT GTC AAA TTC TGA CTT AGCATA-3’(SEQ ID NO：16)；

[0170] RANTES正向引物：5’-TAC ACC AGT GGC AAG TGC TCC AACCCA G-3’(SEQ ID NO：17)；

[0171] RANTES反向引物：5’-GTC TCG AAC TCC TGA CCT CAA GTGATC C-3’(SEQ ID NO：18)；

[0172] β肌动蛋白正向引物：5’-ACA ATG AGC TGC TGG TGG CT-3’(SEQ ID NO：19)；和[0173] β肌动蛋白反向引物：5’-GAT GGG CAC AGT GTG GGT GA-3’(SEQ ID NO：20)。

[0174] 结果

[0175] 体内VSV的减毒取决于完整的干扰素途径

[0176] 发现在干扰素应答细胞(在此指AV1和AV2)上产生小噬菌斑的两个VSV变体，在感染上皮细胞系后，诱导的α干扰素(INF-α)比野生型(WT)VSV多20倍～50倍(图1A)。通过对这些变体的全部基因组进行测序发现，它们与野生型株系的区别在于M蛋白：
AV1的M蛋白中只有一个氨基酸置换(M51R)，而在AV2的M蛋白中有两个氨基酸置换(V221F和S226R)。当将AV1和AV2通过鼻内递送到Balb/C小鼠中时，所测得的LD50比用同样方法进行递送的WT VSV的LD50高10000倍(图1B)。在CD-1小鼠中看到类似的结果(WT＝
6 8
1×10，AV1＝2×10pfu)。重要的是，当被用于感染干扰素受体敲除动物时，AV1和AV2的毒性与野生型病毒的毒性一样，表明AV1和AV2体内生长的减毒依赖于完整的干扰素系统-/-
(图1C)。而且，当与WT VSV组合使用时，发现突变株AV2防止高度易感小鼠(PKR )免受WT VSV的感染(图1D)。实际上，即使用比WT VSV的LD100高100倍的剂量，当小鼠受到AV2和WT VSV的同时攻击时，也没有发现明显的发病症状(脱水、毛发的竖起、萎靡不振、行动减少、呼吸窘迫和后肢瘫痪)。结合这些突变体允许干扰素在感染后产生的观察数据，这些数据与以下模型是一致的：用VSV的AV1或AV2突变株进行的感染在宿主中诱导干扰素的产生，据此建立保护宿主免受病理感染的抗病毒状态。

[0177] 野生型和减毒的VSV突变体均引发先天性抗病毒应答

[0178] 为了测定野生型和减毒病毒诱导或宿主细胞抗病毒应答或使宿主细胞抗病毒应答失活的能力在感染过程中的哪一点发生差异，首先需要建立宿主细胞的VSV感染过程中发生的早期信号转导事件。在病毒感染过程中使用微矩阵分析，应该可以检测到由VSV感染引发的直接或间接导致抗病毒基因转录激活的早期信号转导事件。从微矩阵数据显然可以发现，VSV感染导致大量基因按特定的次序发生上调。因此，可以按以下方面对基因进行分组：即(1)它们随着时间而上调的动力学和(2)它们应答WT和突变VSV感染的诱导模式。这些基因群似乎对应于3次分开的转录波(表1和图2A、B和C)。与此相一致的是，IFN-β、IFN-7和IFN-α亚型彼此分开，属于不同的基因群。其他组已经确定，在针对许多刺激的应答中，潜在的转录因子IRF-3、NFκB和c-JUN/ATF-2被激活，并在IFN-β的启动子上与CBP/p300组装在一起，以诱导IFN-β的表达(Wathelet等，1998，Mol.Cell 1：507～518)。还有，已发现IFN-β以自分泌的方式发挥作用，以诱导ISGF3转录复合物的激活，而导致IRF-7和其他在其启动子中含有ISRE元件的基因的诱导(Lu等，2000，J.Biol.Chem.275：31805～31812；Zhang和Pagano，1997，Mol.Cell Biol.，17：5748～5757；Zhang和Pagano，2001，J.Virol.，75：341～350)。而且，已证明IFR-7的异位表达对IFN-α在不能形成ISGF3复合物的细胞中的表达是关键的(Sato等，1998，FEBS Lett.，441：106～
110)。这种IFN-α诱导对IRF-7的依赖和IRF-7对IFN-β的依赖让人想起所述矩阵中的基因的动力学概况。根据这些观察资料，推测IFN-β、IRF-7和IFN-α为整体模型中的原型基因，这些基因群似乎与3个分开的转录波对应，各自依赖于前面的转录波并由前面的转录波所引发(表1和图2A、B和C)。

[0179] 表1.随着时间推移对针对VSV感染的转录应答进行的微矩阵分析

[0180]

[0181] 数据表示相对于模拟感染样品的倍数变化，所有样品都来自受感染细胞的细胞核组分。

[0182] A＝缺乏(没有可检测到的mRNA)；nd＝没有数据；用线框起来的基因代表“原型基因”，见文中解释。

[0183] WT VSV的M蛋白阻断β干扰素的信号转导，而来自AV1和AV2的M蛋白则不能。

[0184] 为了更好地理解VSV感染的早期转录应答，所以寻求对这些WT和“INF诱导株”应答的区别的理解。通过Western印迹，WT、AV1和AV2病毒引发IRF-3磷酸化的动力学似乎相似(图2E)。而且，在WT、AV1和AV2感染的细胞中，已发现直接受转录因子IRF-3、NFκB和c-JUN/ATF-2调节的一些基因被上调到同一水平(图2A)。例如，在所有三种病毒感染后3～6小时，初级应答基因明显受到诱导(图2A、D和E)。另一方面，需要IFN-β产生和JAK/STAT途径的自分泌激活的次级应答基因受到野生型和减毒病毒的诱导是不同的(见图2B&2E中的IRF-7)。由于WT VSV感染细胞中IRF-7的产生受到损害，如IFN-α转录体等三级应答基因产物在野生型VSV感染的细胞中没有受到诱导(图2C)，而在AV1和AV2感染的细胞中强烈表达。总而言之，这些结果提示，野生型VSV通过其M蛋白，影响图2中所示的对初级和次级抗病毒转录应答之间的阻断。在先前的转染实验中，已提示VSV的M蛋白阻断IFN-β的转录(Ferran和Lucas-Lenard，1997，J.Virol.，71：371～377)，抑制mRNA的核输出(Her等，1997，Science，276：1845～1848；von Kobbe等，2000，Mol.Cell，6：1243～1252)，或干扰Jak/Stat信号转导(Terstegen等，2001，J.Immunol.，167：5209～5216)。本文记载的转录模型研究与后两者机制之一一致，但是，在受感染细胞中，没有观察到外源干扰素对Jak/Stat途径的诱导受到损害(数据未示出)。另一方面，当用微矩阵或RT-PCR分析来比较和对比细胞核和细胞质组分中的转录体时，发现野生型病毒和减毒病毒感染的细胞有明显区别(图3)。重要的是，虽然在所有三种病毒感染的细胞的细胞核组分中IFN-βmRNA都受到诱导，但是在野生型病毒感染的细胞的细胞质mRNA库中没有发现IFN-βmRNA的显著水平。

[0185] 总之，这些结果与以下观点是一致的，即感染后，野生型病毒引发初级抗病毒应答，但是通过阻断关键的抗病毒mRNA的核输出，其与病毒基因产物的协同表达钝化了次级和三级应答。为支持该模型，构建了表达组成型活性形式的IRF-7的野生型VSV。如所预期的那样，该病毒具有减毒的表型，甚至在野生型VSV的M蛋白存在的条件下，于感染后4小时之内能够诱导IFN-α基因的表达(图2D；在AV1和AV2感染的情况中，IFN-α在感染后12小时才表达：表1)。

[0186] 减毒病毒AV1和AV2保持它们杀死肿瘤细胞的能力

[0187] 为了评价减毒的VSV株系的溶瘤特性，用WT、AV1或AV2病毒攻击NCI人肿瘤细胞试验组(panel)(来自恶性谱的60个细胞系)，并按照材料与方法中的描述，测试48小时后代谢细胞的死亡。从表2A中明显可以看出，WT VSV能够生产性感染并杀死大范围的不同的癌细胞类型。而且，如发明人早期所证明的(Stojdl DF，Lichty B，Knowles S，Marius R，Atkins H，Sonenberg N，Bell JC，2000，Nature Medicine 6：821～825)，所测试的大部分癌细胞系(约80％)显示对INF-α或IFN-β的应答受损。因此，并不奇怪AV1和AV2和WT VSV一样，能够有效地杀死这些肿瘤细胞系，推测可能是因为在这些细胞中的IFN信号转导存在缺陷(表2A&B)。

[0188] 表2A：突变的VSV株对癌细胞系的NCI 60实验组的各成员是高度裂解的。

[0189]

[0190] *被认为对病毒感染高度敏感的NCI 60实验组细胞系(根据肿瘤类型)的百分比。()表示所测试的细胞系数目中高度易感细胞系数目。如果感染48小时后EC50≤1MOI，该细胞系被认为是高度易感的。MOI代表易感细胞系的平均EC50(MOI)。nd＝未确定。

[0191] 表2B：NCI 60细胞实验组中的大多数细胞系显示IFN缺陷

[0192]I型IFN缺陷
白血病 100％(6/6)*
NSC肺癌 71％(5/7)
结肠癌 100％(7/7)
CNS 75％(3/4)
黑素瘤 85％(6/7)
卵巢癌 67％(4/6)
肾癌 75％(6/8)
前列腺癌 100％(2/2)
乳腺癌 60％(3/5)
测试的所有细胞系 81％(42/52)

[0193] *表示各组中对IFN-α或IFN-β的预处理为非应答的细胞系的数量。如果IFN预处理不能显著影响(＜10倍)WT VSV感染48小时的细胞的EC50，则认为该细胞系为非应答。

[0194] AV1和AV2的体内溶细胞特性

[0195] 以前报道了用WT VSV对裸鼠中的皮下异种移植肿瘤进行的成功治疗(Stojdl等，2000，Nature Medicine 6(7)：821～825)，但是，在这些实验中，需要用外源干扰素来保护免疫缺陷的动物免于受到病毒处理。上述描述的结果提示，即便是在没有外源施用的干扰素存在下，AV1和AV2在裸鼠模型中应该能够有效地杀死肿瘤细胞并且毒性低。将人卵巢癌细胞注射到CD-1裸鼠的腹膜腔内，并使其生长12天，接受UV灭活的病毒的大部分小鼠(14/15)在处理后15天形成腹水(在该群体中剩下的小鼠在第39天达到终点)。相反地，将3剂AV2递送到腹膜腔内，为70％的小鼠提供了持久的治愈(图4A)。显著地，尽管腹膜内单剂WT VSV无一例外地导致裸鼠的死亡，但是接受3剂AV2治疗的动物均没有表现出甚至病毒感染的症状(例如，萎靡不振、体重下降、脱水)。

[0196] 用AV1和AV2对皮下肿瘤进行全身治疗

[0197] 虽然当被注射到原来接种肿瘤的位置时，AV1和AV2株系是有效的，但是还需要测定全身递送的减毒株的治疗效力。为了这个目的，通过将CT26结肠癌细胞注射到同基因的3
Balb/C小鼠的后胁腹中而形成皮下肿瘤。当肿瘤变得可触知(约10mm)时，通过尾静脉注
3
射施用病毒。处理后12天，接受UV灭活VSV的小鼠达到终点，其肿瘤平均尺寸为750mm。
相反地，单一AV2治疗显示出显著效力，到终点的时间几乎推迟了3倍(34天)。在该治疗组的8只动物中，7只被认为产生了部分应答，而只有一只没有对治疗产生应答(表3)。当用多剂量的AV1或AV2进行静脉内施用时，治疗效果显著提高(图4B&表3)。除了一只动物外，肿瘤对AV1治疗均产生了应答，6只小鼠有3只其肿瘤显示出完全消退。这些小鼠中有2只分别早在感染后8天和9天肿瘤即完全消退。剩下的两只动物显示部分消退，与对照相比，肿瘤的进程推迟了几乎2倍。所有8只AV2感染的小鼠都对治疗反应良好，8只中的5只产生持久的肿瘤消退。实际上，甚至在治疗后7个月都没有明显的肿瘤再生长的迹象。而且，治疗后7个月用CT26细胞进行再攻击时，这些小鼠也不再产生肿瘤，没有可检测到的病毒痕迹(数据未示出)，可能表明宿主介导的对肿瘤的免疫已经形成。

[0198] 对携带有肿瘤的动物施用双倍数量的病毒剂量，没有提高肿瘤持久消退的数量(表3)，表明在治疗过程中形成的抗病毒免疫可以影响结果。还有，在以前描述的采用溶瘤HSV的方法中(Lambright等，1999，Ann.Thorac.Surg.，68：1756～1760和1761～1772)，采用注射病毒感染的细胞来代替只注射病毒的方式作为治疗方式进行测试。推测受感染细胞可能在血管系统中时发挥“特洛伊马”的作用而掩饰病毒，并且当它们停留在肿瘤的新形成血管系统中时方便进行病毒递送。为了这个目的，将用AV2体外感染2小时的CT-26细胞注射到携带有肿瘤的小鼠的尾静脉中。在这些实验中，感染的CT-26细胞似乎与使用纯化的病毒一样，均是将病毒递送到肿瘤位点的有效方式(三只出现完全消退并且一只出现部分应答，图4B)。

[0199] 小鼠很好地耐受各种形式的静脉内治疗，没有死亡发生，并且病症很小。在最初的治疗后，感染的小鼠出现轻度到中度的毛发竖起、轻度脱水和一些暂时的体重下降(图4C)。这些症状都是在最初的感染后观察到，所有的随后的剂量都没有引发任何感染症状。

[0200] 表3：在皮下肿瘤模型中增加剂量数提高了应答率

[0201]UVAV2 AV2
1个剂量
CR 0％*(0/5) 0％(0/8)
PR 0％(0/5) 88％(7/8)
NR 100％(0/5) 12％(1/8)
6个剂量
CR 0％(0/5) 63％(5/8)
PR 0％(0/5) 37％(3/8)
NR 100％(5/5) 0％(0/8)
12个剂量
CR 0％(0/5) 63％(5/8)
PR 0％(0/5) 37％(5/8)
NR 100％(5/5) 0％(0/8)
*

[0202] 代表每个治疗组中显示完全应答(CR)、部分应答(PR)和没有应答(NR)的小鼠的百分比。完全应答是指小鼠的肿瘤完全消退且直到实验结束(80天)没有任何肿瘤症状。部分应答是指与对照小鼠(UV AV2)相比，肿瘤达到终点尺寸的时间推迟了。()表示组内小鼠总数中阳性小鼠的数目。

[0203] AV1和AV2的全身施用对抗扩散疾病是有效的

[0204] 当将CT-26细胞注射到尾静脉中时，虽然肺内的肿瘤最为显著，但小鼠全身都接种了肿瘤，导致在3周～4周内死亡。肿瘤细胞注射后16天和用UV灭活病毒治疗后4天，对4只小鼠的肺进行检查(图4D)。这些肺比它们正常时的重量要重3倍，这是由于肿瘤负荷，明显的表现是肺表面有节结。相反地，接受静脉内单剂量的AV2的携带有肿瘤的同窝出生的小鼠，在杀死前4天时，其具有正常的肺重量，并且几乎没有具有明显的节结。通过装置进行鼻内施用的AV2也具有显著效果，而将静脉内和鼻内两种施用方式结合则效果看上去最好(图4D)。

[0205] 图4E显示，用肺肿瘤接种然后用UV灭活病毒、AV1或AV2进行治疗的小鼠的存活图。用UV灭活病毒治疗的动物到死亡时的平均时间(MTD)约为20天。但是，用AV1或AV2治疗的小鼠得到完全的保护。该实验表明，AV1和AV2在侵袭性、扩散的、免疫活性肿瘤模型中产生持久治愈的显著能力。

[0206] 讨论

[0207] 这些减毒病毒和以前报道的VSV溶瘤形式的关键区别在于，突变的M蛋白在受感染细胞中阻断干扰素产生的能力丧失。VSV M是几种关键的病毒功能所需的多功能蛋白，这些功能包括：出芽(Jayakar等，2000，J.Virol.，74：9818～9827)、病毒体组装(Newcomb等，1982，J.Virol.，41：1055～1062)、细胞病理效应(Blondel等，1990，J.Virol.，64：1716～1725)以及抑制宿主基因表达(Lyles等，1996，Virology，225：172～180)。后一种性质已被归因于M阻断宿主RNA聚合酶活性(Yuan等，2001，J.Virol，75：4453～4458)或抑制蛋白和mRNAs出入宿主细胞核的核转运(Her等，1997，同上；von Kobbe等，2000，同上)的能力。本文中用病毒感染给出的结果与阻断核转运是野生型VSV株降低宿主抗病毒应答的主要机制的观点一致。目前对受感染细胞转录体的分析几乎没有提供证据来支持M蛋白在抑制宿主细胞转录中的作用，而是表明VSV感染引发抗病毒基因的IRF-3介导的刺激，然后M蛋白介导了阻断初级应答转录体由受感染细胞的细胞核的转运。与本研究关系特别密切的是Dahlberg组的工作(Petersen等，2000，Mol.Cell.Biol.，20：8590～8601)和其他人的工作(von Kobbe等，2000，同上)，这些工作通过转染研究表明，M蛋白能够与核孔蛋白结合并影响对mRNA输出的阻断。

[0208] 虽然不想受到理论的束缚，但是似乎是这样的，即宿主细胞抗病毒程序是由潜在的转录因子NFκB、c-JUN/ATF2和IRF-3的激活而启动的。一旦病毒进入宿主细胞，转录因子c-JUN和IRF-3分别被JNK和一个最近鉴定的病毒激活激酶(John Hiscott，个人交流)磷酸化，而NFκB通过上游的IKK(s)的作用从其抑制物IKB中释放出来(DiDonato等，1997，Nature，388：548～554)。激活的转录因子移位到核内，在IFN-β的启动子上协同形成增强体复合物，导致IFN-β的诱导(Wathelet等，1998，同上)。这里涉及作为对病毒感染的初级转录应答。已有推测，次级转录波被各种干扰素刺激基因的IFN-β依赖性诱导所引发。本文提供的野生型M蛋白的数据有助于描述这些初级和次级转录事件之间的区别，同时有助于鉴定几个新的病毒应答基因(GADD34，PUMA)。用具有突变的M蛋白的病毒感染后，显然，IFN-β对JAK/STAT信号途径的自分泌刺激导致如IRF-7等次级应答基因的产生，而该IRF-7反过来对IFN-α基因的三级诱导非常关键(Morin等，2002，J.Mol.Biol.，316：
1009～1022)。实际上，即使是在野生型M蛋白存在下，M蛋白对次级和三级转录体的阻断可以通过表达组成型活性形式的IRF-7(由病毒启动子)来克服。

[0209] 溶瘤治疗的一个限制因素是人类群体中存在预先存在的抗体的病毒中和作用(Ikeda等，1999，Nature Medicine，5：881～887)。使用溶瘤病毒，例如不是人类群体中特有的VSV，将提供显著的治疗优势。虽然在本研究中，有时发现对溶瘤活性具有剂量依赖性(6次治疗优于1次治疗)，但是，可能是由于形成了中和抗体，另外的剂量没有获得更好的治疗效果。这些结果提示，成功进行病毒治疗的一个关键决定因素将是在抗病毒免疫应答形成之前，进行到达肿瘤位点的有效递送。临床上，在宿主介导的抗病毒应答形成之前，尽可能频繁地递送最大容许病毒剂量似乎是非常重要的。对个体患者所需的确切剂量的确定完全在本领域工作的临床医生的能力之内，因此，没有在此必要讨论具体剂量。

[0210] 包括在病毒治疗之前，对患者进行免疫抑制在内的策略在理论上是有用的，但是，已发现病毒溶瘤治疗的一个重要部分是抗肿瘤应答，而该抗肿瘤应答由病毒蛋白在肿瘤细胞表面上的表达来启动的(数据未示出；和Todo等，1999，Human Gene Therapy，10：2741～2755)。可能其他的策略，如本文所示的对病毒感染细胞进行灌注，或用聚合物对病毒制剂进行包被(Fisher等，2001，Gene Ther.，8：341～348)，将在没有损害有用的宿主免疫应答的条件下为将治疗剂递送到肿瘤位点提供机会。

[0211] 本文提供的数据表明，在肿瘤的发展过程中经常发生干扰素信号转导缺陷，在NCI试验组中的大部分细胞系的应答受到损害。日益增加的数据已显示，干扰素是多功能的细胞因子，可以协同调节细胞的生长、凋亡和抗病毒途径。可能在肿瘤的发展过程中，对持续不断生长和凋亡丧失的选择胜过对抗病毒活性的不时之需。

[0212] 理想地，溶瘤病毒将优先在恶性细胞中复制，具有从原发性肿瘤到转移肿瘤位点的传播能力，并最终被宿主清除。本文提供的证据证明，减毒病毒AV1和AV2具有所有的这些特点，并且，由于它们能够引发正常细胞的抗病毒应答，所以在体内尤其安全。实际上，目前已证明，选择对干扰素的抗病毒作用具有抗性的VSV变体是不可能的(Novella等，1996，J.Virol.，70：6414～6417)，并且这些IFN诱导突变体以反式作用防止宿主受到WT VSV感染的能力已经得以证明(图1D)。因此，可能在大部分病毒颗粒是干扰素的有效诱导物的病毒群体中，野生型变体增长到占绝大多数的可能性是很小的。由IFN诱导病毒的感染所产生“细胞因子云”将防止宿主细胞受到更烈性的WT株的作用(见图5)。但是肿瘤杀死作用将不受到影响，因为已证明这些细胞缺乏对这种“细胞因子云”的应答。因而，增加了治疗指数，进一步加大溶瘤病毒作为癌症治疗剂的潜力。

[0213] 实施例2：拯救的突变VSVs

[0214] 构建了一系列的重组病毒，以测试对产生干扰素诱导突变体有用的突变范围。为了这个目的，建立了嵌合病毒骨架，该骨架含有来自质粒pXN-1的N、G和L基因(Schnell MJ，Buonocore L，Whitt MA和RoseJK(1996)，J.Virology 4，2318～2323)和来自AV1的P和M基因。曾经建立的只在M基因存在差异的一系列病毒由通过在如附图(图6和图7)所示的M基因变体中进行依次置换而产生。例如，XNDG M4含有来自pXN-1的N、G和L基因，来自AV1的P基因和甲硫氨酸51缺失的M基因。XNDG M5含有甲硫氨酸51、天冬氨酸52、苏氨酸53和组氨酸54这四个氨基酸缺失的M基因(图7)。如发明人在表4(下文)中所示，这两个突变体与天然存在的甲硫氨酸51转变为精氨酸(即M51R)的突变体(Mut2或AV1)在杀死3种致瘤细胞的人细胞系方面是等效的。由于XNDG M4和M5是缺失突变体，所以这些重组病毒非常难以回复为原来的甲硫氨酸51的基因型。而且，虽然该改造的病毒还能够有效地杀死肿瘤细胞，但是它们在干扰素应答细胞上形成小的噬菌斑，这表明这些病毒在能够对干扰素产生应答的细胞中的生长是减弱的(图8)。

[0215] 为了进行噬菌斑测试，将Vero细胞接种到60mm直径的组织培养皿上并在含有10％牛血清的aMEM中铺满，并且在正常组织培养条件让其附着至少3小时。在不含血清的-4 -41/2 -5 -51/2
aMEM中以半对数递增方式(例如，10 、10 、10 、10 ……等)制备系列稀释的样品病毒悬浮液。将培养基从60mm皿中吸出，在各皿中加入100μl的病毒悬浮液，并将该皿在正常的组织培养条件下培养45分钟。培养45分钟后，在42℃用3ml的比例为1∶1的1％琼脂糖+(2×aMEM+20％胎牛血清)的混合物将该皿覆盖。然后将该皿过夜培养，在第二天早晨对噬菌斑进行计数。

[0216] 用AV1(Mut2)、XNDG M4和XNDG M5病毒感染OVCAR(人卵巢癌细胞系)、293T(用来自SV40的大T抗原转化的人肾细胞系)和U2OS(人骨肉瘤细胞系)细胞系，经过一段时间后，用如上所述的MTS测试对细胞存活力进行测定。在表4中提供的数据显示，与AV1相比，拯救的突变VSVs具有类似的杀死特性。

[0217] 表4：通过MTS测试测定在48小时内杀死50％细胞所需的MOI

[0218]AV1 XNDG M4 XNDG M5
OVCAR3 0.0096 0.0228 0.0105
293T 0.0096 0.0138 0.04056
U2OS 0.03 0.0186 0.0156

[0219] 实施例3：GFP-M蛋白融合蛋白

[0220] 当与绿色荧光蛋白(GFP)的氨基末端融合后，VSV基质(M)蛋白的氨基末端(氨基M+72-GFP-N1)使该融合蛋白靶向线粒体(图9和图10)。VSV印第安纳M的前72个氨基酸能够使GFP靶向。起始于甲硫氨酸33(M33)的融合蛋白也能够使GFP靶向线粒体，但只有前50个氨基酸则不能。甲硫氨酸51(M51)不是所需的。当与GFP的C末端融合时，这些序列不能使该融合蛋白靶向线粒体，因此，这些序列必须在重组蛋白的氨基末端，以进行所述靶向。

[0221] 如图9和图10所示，将当氨基末端72个氨基酸和GFP(氨基M+72-GFP-N1)之间的融合在培养细胞中瞬时表达时：1)融合蛋白被靶向线粒体，2)该线粒体失去通常的网管状组织，并瓦解为点状的核周结构，所述核周结构3)失去膜电位。这些是正在死亡的细胞的特征。

[0222] 已认识到VSV基质蛋白是一个毒性蛋白，在病毒的细胞毒性中起作用。M蛋白的转录在3个可选择的ATG密码子(M1、M33和M51)处启动，在M33和M51处突变的病毒不能产生较短的同源异型产物，导致其细胞毒性显著下降。对于具有不再靶向线粒体的突变VSV M蛋白的病毒，其细胞毒性将下降。

[0223] 实施例4：防止VSV诱导的发病

[0224] 本研究证明，全身施用突变VSV(ΔM51)可以防止致命的颅内剂量的VSV。

[0225] 用PBS、WT GFP VSV(1×108pfu)或ΔM51GFP(1×108pfu)8周龄的雌性Balb/C小鼠组进行静脉内注射(致敏的)。24小时后，对所有小鼠进行2×107pfu的ΔM51 VSV(在5μl的PBS中)的颅内接种，并监测发病症状和瘫痪情况。

[0226] 结果被提供在图17A和图17B中。图17A提供Kaplan Meyer存活图，该图显示100％的经ΔM51致敏的小鼠全部存活，而所有的经WT和PBS对照致敏的小鼠都出现后肢瘫痪，并被实施安乐死。图17B是静脉内处理后，小鼠体重对时间所作的图，经ΔM51致敏的小鼠没有出现体重下降，而WT和PBS对照小鼠在被实施安乐死之前体重严重下降。

[0227] 实施例5：VSV感染后干扰素的产生

[0228] 本研究提供的数据显示，用突变VSV感染的细胞分泌IFN-α和IFN-β，而用WT VSV感染的细胞不产生IFN-α和IFN-β，或产生的量极低。

[0229] β干扰素

[0230] 用WT或突变VSV株感染(MOI为10pfu)OVCAR4、CAKI-1和HOP62细胞。通过ELISA测定感染后10小时受感染细胞的IFN-β产量。AV1和AV2感染的细胞产生分泌的IFN-β，而WT VSV感染的细胞则不产生分泌的IFN-β。ELISA是使用商购的人IFN-β检测试剂盒(TFB INC，Tokyo，日本)来进行的。本研究的结果图示在图18中。

[0231] 本研究所用的细胞系可商购获得，例如从NCI的新药开发计划(NewDrug Development Program)获得。三种细胞系都是人类癌症，之所以被选择用于本研究是因为它们属于20％的对干扰素产生一定应答的癌症。OVCAR是卵巢癌细胞，HOP62是肺癌细胞，而CAKI-1是肾癌细胞。在各情况中，所述细胞都按照MTS测试所述进行感染(见实施例1)。

[0232] α干扰素

[0233] 用小鼠α干扰素ELISA试剂盒(Interferon-Alpha ELISA kit)(PBLBiomedical)8
测定小鼠的血清IFN-α水平。用PBS或稀释在PBS中的1×10pfu的WT GFP或AV3GFP(其中，AV3是VSV的改造形式，其甲硫氨酸51完全缺失)对Balb/C雌性小鼠(10周龄，Charles River)进行静脉内注射。在感染后指定时间，从各小鼠的隐静脉采集血液到肝素化的试管中，并通过离心获得血清。将每个样本的5μl的血清稀释在95μl的PBS中，并按照生产商的说明书进行测定。在下表5中提供的结果证明，用ΔM51突变体感染的小鼠与WT VSV感染的小鼠相比，其IFN-α产生较早，量较大。未实施感染的小鼠没有产生可检测量的IFN-α。

[0234] 表5：血清的IFN-α(pg/ml)

[0235]时间(h) 未实施感染(n＝2) WT(n＝3) ΔM51(n＝3)
0 neg. neg. neg.
1 neg. neg. 559±116
6 neg. 8197±2726 25,213±322

[0236] neg.＝低于测定的检测水平(＜200pg/ml)；时间是指感染后小时数。

[0237] 实施例6：

[0238] 发现对于用ΔM51-VSV体内处理小鼠，与来自携带有肿瘤的未用VSV处理的小鼠的脾细胞进行的裂解相比，其细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的对CT26肿瘤细胞靶的裂解得到显著加强。

[0239] 用或不用5×108pfu的ΔM51VSV静脉内处理确定具有CT26皮下肿瘤的Balb/c小鼠。7天后，获取脾细胞，并与经辐射的(irradiated)CT26肿瘤细胞按5∶1的比率进行培养。体外刺激7天后，测试脾细胞对CT26的CTL活性。本研究的结果图示性地描述在图19A中，将肿瘤特异性裂解％(相对于没有效应物脾细胞时CT26靶肿瘤细胞的背景自发裂解)对效靶比(靶细胞是肿瘤细胞，脾细胞是效应物或杀伤细胞)进行作图。

[0240] 在由WT或ΔM51病毒引发的免疫应答中可以观察到性质上的差别。用5×108pfu的野生型或ΔM51-VSV静脉内处理Balb/c小鼠，7天后，获取脾细胞，并与经辐射的CT26肿瘤细胞共培养。培养7天后，在有或没有事先用抗体结合磁珠消除NK细胞(杀伤细胞)的条件下，测试脾细胞对CT26细胞的裂解情况。用野生型和ΔM51-VSV致敏的脾细胞处理小鼠以体外产生对CT26肿瘤抗原的有效的初级免疫应答，在病毒的感染过程中以前没有体内接触那些肿瘤抗原。这表明VSV治疗使脾细胞体内致敏以随后在体外产生抗新抗原的初级应答。野生型VSV治疗后的对CT26细胞的裂解活性是NK依赖性的。ΔM51-VSV治疗后的对CT26细胞的裂解活性是CTL介导的，这表明用ΔM51-VSV治疗后和WT VSV治疗后产生性质截然不同的免疫学致敏事件。这些结果描述在图19B中。该数据还提示，ΔM51-VSV具有诱导有效的适应性免疫应答(CD8+T细胞介导的裂解)的优异能力，并具有发展保护性免疫记忆的潜力，相反地，野生型感染产生的主要是对CT26细胞的先天性NK细胞介导的效应物机制。

[0241] 本研究表明，突变病毒与野生型病毒相比，诱导性质不同的应答。在本测试中的CTL细胞的诱导只有使用突变病毒时才发现。CTL应答是长期的保护性应答，而NK应答不具有记忆性。对这种截然不同的应答的诱导似乎归功于突变病毒对细胞因子的诱导。

[0242] 实施例7：突变VSV处理的肿瘤的免疫组织化学染色

[0243] 为了研究突变VSV对肿瘤的作用，用ΔM51 VSV GFP静脉内处理携带有皮下CT26肿瘤的Balb/c小鼠。2、5、8天后，对小鼠实施安乐死，并快速冷冻肿瘤，然后切片(5μm)，并对VSV、活性胱冬酶3和CD45(泛白细胞(pan-leukocyte)标记)进行免疫组织化学染色。在本研究中使用标准技术。染色切片的照片显示在图20中。阳性染色是棕色，而所有的细胞核则用苏木精复染成蓝色。H&E染色显示肿瘤的形态(H&E染色是显示肿瘤整体结构的非特异性染色)。

[0244] 用突变VSV处理的肿瘤的免疫组织化学染色显示大量的细胞凋亡和白细胞积累。本研究说明，突变VSV是优良的溶瘤剂，因为它甚至在肿瘤细胞还未被感染时就能够诱导该肿瘤细胞的死亡(即，胱冬酶3+已经历凋亡的细胞)。虽然不想特意受到理论的束缚，这似乎又是因为突变病毒诱导了细胞毒性细胞因子，该细胞毒性细胞因子在感染病毒之前杀死肿瘤细胞。而且，突变病毒召集能够渗入肿瘤并攻击肿瘤的白细胞(CD45+细胞)。该CD45+细胞紧跟在突变病毒感染的细胞之后，又对该病毒感染的肿瘤细胞所诱导的细胞因子产生应答。

[0245] 在本说明书中提到的所有的出版物、专利和专利申请表明与本发明相关领域的技术人员的技能水平，并且在本文中通过参考的方式引入到本文中，这与如同以参考的方式具体地和单独地将各单独的出版物、专利或专利申请引入到本中达到同样的程度。

[0246] 因此，显然可以以许多方式改变本发明描述的实施方案。该改变不认为与本发明范围和精神有差异，并且意欲将本领域技术人员显而易见的所述修改包括在以下权利要求的范围之内。