酰胺化合物在制备用于修复角膜敏感性的药剂中的应用

摘要

式(I)的酰胺化合物(每个符号如说明书中所定义)具有促进三叉神经细胞神经突发生的作用，并且该化合物有效用作角膜神经突发生促进剂、通过促进角膜神经突发生来恢复角膜敏感性的药剂及治疗干眼的药剂

权利要求

1.(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐在制备促进角膜神经突发生的药剂中的应用。

2.(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐在制备恢复角膜敏感性的药剂中的应用。

3.(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐在制备治疗干眼的药剂中的应用。

说明书

酰胺化合物在制备用于修复角膜敏感性的药剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种促进角膜神经突发生的药剂，一种基于促进角膜神经突发生的修复角膜敏感性的药剂和用于干眼的治疗药剂。

[0002] 背景领域

[0003] 由于角膜神经被角膜外科手术诸如屈光性激光角膜切除术(PRK)，激光辅助原位角膜磨削术(LASIK)，角膜成形术等所切断，据说角膜敏感性的功能减少通常发生约3周到一年的时间。例如，已经报道了在LASIK后，角膜神经明显被切断(Tuuli U.Linna等.，Experimental Eye Research66：755-763，1998)，并且在角膜区域中角膜敏感性降低，其中在LASIK后，没有观察到神经纤维分布图或神经束太短而不能产生连接(Tuuli U.Linna等，Investigative Ophthalmology&Visual Sciences，41：393-397，2000)。

[0004] 已经证实了PRK和LASIK后的角膜低敏感性导致了较低的泪腺反应并减少了泪液(Ang，Robert T.等，Current Opinion in Ophthalmology 12：318-322，2001)。作为角膜敏感性功能降低的结果，做过角膜外科手术的患者眨眼次数减少，有问题地显示干眼症的症状。在患有干眼症的患者中，泪腺机能减退引起了角膜的低敏感性，其与另外的泪腺机能减退结合后，有问题地加剧了角膜表面的疾病状况。

[0005] 然而，目前角膜外科手术后角膜低敏感性的恢复依赖于自发恢复，并且在干眼症的治疗中，没有提供积极治疗以恢复角膜敏感性。此外，尽管由伴随角膜神经变性，诸如神经麻痹性角膜病变、角膜溃疡、糖尿病性角膜病变等的疾病导致角膜低敏感性，目前没有获得合适的治疗方法(cure)。

[0006] Rho-激酶是连同Rho的活化一起被活化的丝氨酸/苏氨酸激酶，所述Rho-激酶是一种低分子量G蛋白质，并且已知其通过各种底物的磷酸化控制多样化的生理功能诸如平滑肌收缩，神经突退缩等。预期具有这种Rho-激酶抑制活性的化合物提供各种药物应用，并且已建议将其用作用于例如高血压、心绞痛、脑血管收缩、哮喘、外周循环疾病、动脉硬化、骨质疏松、视网膜病等的治疗药物，以及抗癌药，消炎药，免疫抑制剂等(例如，WO98/06433)。此外，已知Rho-激酶抑制剂对于改善视觉功能疾病是有用的，因为它们具有视黄醛神经节细胞的轴突延伸作用(WO 02/083175)。由于这种作用，认为Rho-激酶抑制剂促进视神经细胞的再生，并且对于治疗与各种由视网膜和视神经的损伤、缺陷、变性等导致的眼疾关联的视觉功能疾病是有用的。然而，该参考文献根本没有描述Rho-激酶抑制剂对角膜疾病诸如角膜低敏感性等的影响。

[0007] 角膜敏感性由三叉神经(角膜神经)所控制，所述三叉神经是分布在角膜上的敏感神经。关于介于Rho和三叉神经之间的关系，已经报道了在大鼠三叉神经组织培养(在整个测定(mount)培养物中的三叉神经束)系统中，神经营养蛋白(例如，神经生长因子(NGF)等)-诱导的神经轴突的延伸由Rho激活剂(溶血磷脂酸)所抑制并通过将显性负调控的Rho引入细胞而被促进(Ozdinler，P.Hande et al.，The Journal of Comparative Neurology，438：377-387，2001)。然而，有描述指出在缺乏神经营养蛋白的情况下，Rho对于三叉神经轴突的延伸是否有效尚不清楚(Ozdinler，P.Hande et al.，TheJournal of Comparative Neurology，438：377-387，2001)，并且Rho-激酶抑制剂对三叉神经的影响尚未阐明。

[0008] 有参考文献教导促进神经元再生或神经突突起(outgrowth)的化合物可以用于治疗外科手术诸如LASIK等后的角膜神经损伤，并且显示了作为这些化合物的实例的益智药(Neotrofin)等，所述益智药是神经营养因子刺激物(WO03/020281)。然而，WO03/020281根本没有描述Rho-激酶或其抑制剂，或其任何提示性的描述。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供一种用于有效恢复在角膜外科手术诸如激光光折射角膜切除术(PRK)，激光角膜磨削术(LASIK)，LASEK；激光上皮角膜磨削术；Jutta Horwath-Winter et al.J Cataract Refract Surg 30：2316-2321，2004)；角膜成形术等后的角膜敏感性的机能减退，和角膜神经变性疾病诸如糖尿病性角膜病变等，与干眼相关的角膜敏感性的机能减退的药剂，以及有效恢复具有角膜低敏感性的患者的干眼的药剂。

[0010] 本发明人已经尝试研究提供一种新的药剂，所述药剂改善角膜外科手术后的角膜敏感性的恢复和与角膜低敏感性有关的干眼，并且发现具有特定结构的酰胺化合物作用于三叉神经并有效促进三叉神经细胞的神经突发生。而且，基于这些发现，他们已经发现酰胺化合物作为促进角膜神经突发生，恢复角膜敏感性和治疗的干眼的药剂是有用的，这些导致了本发明的完成。

[0011] 因此，本发明涉及

[0012] (1)一种促进角膜神经突发生的药剂，所述药剂包括由式(I)所代表的酰胺化合物，和其异构体和/或其药用酸式加成盐，或其前药：

[0013]

[0014] 其中

[0015] Ra是式：

[0016]

[0017] 其中

[0018] 在式(a)和(b)中，

[0019] R是氢，烷基，或每个任选地在环上具有取代基的环烷基，环烷基烷基，苯基或芳烷基，或式：

[0020]

[0021] 其中

[0022] R6是氢，烷基或式：-NR8R9

[0023] 其中R8和R9是相同的或不同的并且每个是氢，烷基，芳烷基或苯基，

[0024] 和R7是氢，烷基，芳烷基，苯基，硝基或氰基，

[0025] 或R6和R7组合形成杂环基团，所述杂环基团还任选地在环中包含氧原子，硫原子或任选地具有取代基的氮原子，

[0026] R1是氢，烷基或每个任选地在环上具有取代基的环烷基，环烷基烷基，苯基或芳烷基，

[0027] 或R和R1组合与邻近的氮原子一起形成杂环基团，所述杂环基团还任选地在环中包含氧原子，硫原子，或任选地具有取代基的氮原子，

[0028] R2是氢或烷基，

[0029] R3和R4是相同的或不同的并且每个是氢，烷基，芳烷基，卤素，硝基，氨基，烷基氨基，酰氨基，羟基，烷氧基，芳烷氧基(aralkyloxy)，氰基，酰基，巯基，烷硫基，芳烷硫基，羧基，烷氧基羰基，氨基甲酰基，单-或二-烷基氨基甲酰基或叠氮基，并且

[0030] A是式：

[0031]

[0032] 其中

[0033] R10和R11是相同的或不同的并且每个是氢，烷基，卤烷基，芳烷基，羟基烷基，羧基10 11
或烷氧基羰基，或R 和R 组合形成环烷基，并且

[0034] l，m，n每个是0或1-3之间的整数，并且

[0035] 在式(c)中，

[0036] L是氢，烷基，氨基烷基，单-或二-烷基氨基烷基，四氢糠基，氨基甲酰基烷基，苯二甲酰亚氨基烷基，脒基，或式：

[0037]

[0038] 其中

[0039] B是氢，烷基，烷氧基，芳烷基，芳烷氧基，氨基烷基，羟基烷基，烷酰基氧基烷基，烷氧基羰基烷基，α-氨基苄基，呋喃基，吡啶基，苯基，苯基氨基，苯乙烯基或咪唑并吡啶基，[0040] Q1是氢，卤素，羟基基团，芳烷氧基或噻吩基甲基，

[0041] W是亚烷基，

[0042] Q2是氢，卤素，羟基基团或芳烷氧基，

[0043] X是亚烷基，

[0044] Q3是氢，卤素，羟基基团，烷氧基，硝基，氨基，2，3-二氢呋喃基或5-甲基-3-氧代-2，3，4，5-四氢哒嗪-6-基，和

[0045] Y是单键，亚烷基或亚链烯基(alkenylene)，

[0046] 式(c)中的虚线和实线表示的键是单键或双键，和

[0047] R5是氢，羟基基团，烷氧基，烷氧基羰基氧基，烷酰基氧基或芳烷氧基羰基氧基，[0048] Rb是氢，烷基，芳烷基，氨基烷基或单-或二-烷基氨基烷基，和

[0049] Rc是任选地具有取代基的含氮的杂环。

[0050] (2)上述(1)的药剂，其中Ra是式：

[0051]

[0052] 其中每个符号如上述(1)所限定；

[0053] (3)上述(1)的药剂，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0054] (4)一种恢复角膜敏感性的药剂，其包括由上述式(I)代表的酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐，或其前药；

[0055] (5)上述(4)的药剂，其中Ra是式：

[0056]

[0057] 其中每个符号如上述(1)中所定义；

[0058] (6)上述(4)的药剂，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0059] (7)一种治疗干眼的药剂，其包含由上述式(I)所代表的酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐，或其前药；

[0060] (8)上述(7)的药剂，其中Ra是式：

[0061]

[0062] 其中每个符号如上述(1)所定义；

[0063] (9)上述(7)的药剂，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0064] (10)由上述式(I)所代表的酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐，或其前药在制备促进角膜神经突发生的药剂中的应用；

[0065] (11)上述(10)的应用，其中Ra是式：

[0066]

[0067] 其中每个符号如上述(1)所定义；

[0068] (12)上述(10)的应用，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0069] (13)由上述式(I)所代表的酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐或其前药在制备恢复角膜敏感性的药剂中的应用；

[0070] (14)上述(13)的应用，其中Ra是式：

[0071]

[0072] 其中每个符号如上述(1)所定义；

[0073] (15)上述(13)的应用，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0074] (16)由上述式(I)所代表的酰胺化合物，其异构体和/或药用酸式加成盐，或其前药在制备治疗干眼的药剂中的应用；

[0075] (17)上述(16)的应用，其中Ra是式：

[0076]

[0077] 其中每个符号如上述(1)所定义；

[0078] (18)上述(16)的应用，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0079] (19)一种促进角膜神经突发生的方法，其包括向需要促进角膜神经突发生的受试者施用有效量的由上述式(I)所代表的酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐，或其前药；

[0080] (20)上述(19)的方法，其中Ra是式：

[0081]

[0082] 其中每个符号如上述(1)所定义；

[0083] (21)上述(19)的方法，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0084] (22)一种恢复角膜敏感性的方法，其包括向需要恢复角膜敏感性的受试者施用有效量的由上述式(I)所代表的酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐，或其前药；

[0085] (23)上述(22)的方法，其中Ra是式：

[0086]

[0087] 其中每个符号如上述(1)所代表；

[0088] (24)上述(22)的方法，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0089] (25)一种治疗干眼的方法，其包括向需要治疗干眼的受试者施用有效量的由上述式(I)所代表的酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐，或其前药；

[0090] (26)上述(25)的方法，其中Ra是式：

[0091]

[0092] 其中每个符号如上述(1)所定义；

[0093] (27)上述(25)的方法，其中酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐是(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐；

[0094] (28)一种商业包装，其包括一种药剂和与此关联的说明书(written matter)，所述药剂包括由上述式(I)所代表的酰胺化合物，其异构体和/或其药用酸式加成盐，或其前药，所述说明书说明该药剂可以或应该用于促进角膜神经突发生，恢复角膜敏感性，或治疗干眼。

[0095] 在本发明中，还将每个都包括由式(I)所代表的酰胺化合物的促进角膜神经突发生的药剂，恢复角膜敏感性的药剂，治疗干眼的药剂统称为“本发明的药剂”。

[0096] 附图简述

[0097] 图1是在实验例1中的培养的兔三叉神经细胞的荧光显微镜图象，其中A是在无化合物1的培养基中培养的细胞的荧光显微镜图象，B是在添加了化合物1的培养基中培养的细胞的荧光显微镜图象。

[0098] 图2是显示实验例1中的三叉神经神经突发生的(neuritogenetic)细胞的比例的图表，其中垂直轴显示神经突发生的细胞与总细胞的百分比(％)，每个值是3例的平均值±标准偏差，并且*显示相对于对照组的显著性(p＜0.001)。

[0099] 图3是实验例2中的兔角膜敏感性的时间过程变化的测试结果，其中-O-是对照组，-▲-是测试物质一周施用组，-◆-是测试物质两周施用组，并且*显示相对于对照组的显著性(n＝7-8，平均值±标准误差，*：p＜0.05)。

[0100] 发明详述

[0101] 在本发明中，“角膜神经”指在作为感觉神经元的三叉神经的控制下，在周围角膜中形成的环状神经丛，在角膜基质中网状分布的基质神经丛，紧接着Bowman’s膜下面形成的上皮下神经丛，和在穿过Bowman’s膜后立即形成的基细胞神经丛和神经纤维。“神经突”指来自神经元(神经细胞)的细胞体的突出(树突和轴突)，并且“发生”指来自细胞体的上述神经突的突起和/或延伸。清楚的是那些本领域普通技术人员将何种水平的神经突发生认为是促进。可以通过，例如荧光染色神经细胞并用荧光显微镜观察细胞形状来证实神经突发生的水平。此外，使用图象分析软件可以分析用荧光显微镜观察到的图象。而且，使用识别组成神经细胞体和神经突的物质诸如神经丝的抗体，和使其形成颜色的试剂，通过测量吸光度并将其作为神经突发生的指数可以确定神经丝的量。

[0102] 在本发明中，式(I)中的每个符号如下定义。

[0103] 关于R或R1，烷基是具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，它的例子有甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，已基，庚基，辛基，壬基，癸基等，优选具有1-4个碳原子的烷基。

[0104] 关于R或R1，环烷基是具有3-7个碳原子的环烷基，诸如环丙基，环丁基，环戊基，环已基，环庚基等。

[0105] 关于R或R1，环烷基烷基是环烷基烷基，在所述环烷基烷基中，环烷基部分是前述的具有3-7个碳原子的环烷基，并且烷基部分是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基(甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，戊基，已基等)。其实例包括环丙基甲基，环丁基甲基，环戊基甲基，环已基甲基，环庚基甲基，环丙基乙基，环丁基乙基，环戊基乙基，环已基乙基，环庚基乙基，环丙基丙基，环丁基丙基，环戊基丙基，环已基丙基，环庚基丙基，环丙基丁基，环丁基丁基，环戊基丁基，环已基丁基，环庚基丁基，环丙基已基，环丁基已基，环戊基已基，环已基已基，环庚基已基等。

[0106] 关于R或R1，芳烷基是其中烷基部分是具有1-4个碳原子的烷基的芳烷基，其例子是苯基烷基诸如苄基，1-苯基乙基，2-苯基乙基，3-苯基丙基，4-苯基丁基等。

[0107] 关于R或R1，作为每个任选地在环上具有取代基的环烷基、环烷基烷基、苯基、芳烷1
基的取代基，可以提及的有卤素(氯，溴，氟，碘)，烷基(如R和R 的烷基所定义的)，烷氧基(具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，诸如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧
1
基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，已氧基(hexyloxy)等)，芳烷基(如R和R 的
1
芳烷基所定义)，卤烷基(R和R 的烷基，其由1-5个卤素所取代，诸如氟甲基，二氟甲基，三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，2，2，3，3，3-五氟丙基等)，硝基，氨基，氰基，叠氮基等。

[0108] 作为由R和R1组合并与邻近的氮原子一起形成的杂环基团，所述杂环基团还任选地在环中包含氧原子，硫原子或任选地具有取代基的氮原子，优选其5-或6-元环和稠环。其实例包括1-吡咯烷基，哌啶子基，1-哌嗪基，吗啉代，硫代吗啉代，1-咪唑基，2，3-二氢噻唑3-基等。作为任选地具有取代基的氮原子的取代基，可以提及的有烷基，芳烷基，卤烷基
1
等。在这里，烷基，芳烷基和卤烷基是如对于R和R 所定义的。

[0109] R2的烷基是如对于R和R1的烷基所定义的。

[0110] R3或R4的卤素，烷基，烷氧基和芳烷基是如R和R1所定义的。

[0111] R3或R4的酰基是具有2-6个碳原子的烷酰基(乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，新戊酰基等)，苯甲酰或苯基烷酰基，其中所述烷酰基部分具有2-4个碳原子(苯基乙酰基，苯基丙酰基，苯基丁酰基等)。

[0112] R3或R4的烷基氨基是其中烷基部分是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基的烷基氨基，其例子是甲基氨基，乙基氨基，丙基氨基，异丙基氨基，丁基氨基，异丁基氨基，仲丁基氨基，叔丁基氨基，戊基氨基，已基氨基等。

[0113] R3或R4的酰氨基是其中酰基部分是具有2-6个碳原子的烷酰基，苯甲酰基，或其中烷酰基部分具有2-4个碳原子的苯基烷酰基等，其例子是乙酰氨基，丙酰氨基，丁酰氨基，戊酰氨基，新戊酰氨基，苯甲酰基氨基，苯基乙酰氨基，苯基丙酰氨基，苯基丁酰氨基等。

[0114] R3或R4的烷硫基是其中烷基部分是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基的烷硫基，其例子是甲硫基，乙硫基，丙硫基，异丙硫基，丁硫基，异丁硫基，仲丁硫基，叔丁硫基，戊硫基，已硫基等。

[0115] R3或R4的芳烷氧基是具有芳烷基的芳烷氧基，其中烷基部分是具有1-4个碳原子的烷基，其例子是苄氧基，1-苯基乙氧基，2-苯基乙氧基，3-苯基丙氧基，4-苯基丁氧基等。

[0116] R3或R4的芳烷硫基是具有芳烷基的芳烷硫基，其中烷基部分是具有1-4个碳原子的烷基，其例子是苄硫基，1-苯基乙硫基，2-苯基乙硫基，3-苯基丙硫基，4-苯基丁硫基等。

[0117] R3或R4的烷氧基羰基是其中烷氧基部分是具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基的烷氧基羰基，其例子是甲氧基羰基，乙氧基羰基，丙氧基羰基，异丙氧基羰基，丁氧基羰基，异丁氧基羰基，仲丁氧基羰基，叔丁氧基羰基，戊氧基羰基，已氧基羰基等。

[0118] R3或R4的单或二烷基氨基甲酰基是由具有1-4个碳原子的烷基所单或二取代的氨基甲酰基，其例子是甲基氨基甲酰基，二甲基氨基甲酰基，乙基氨基甲酰基，二乙基氨基甲酰基，丙基氨基甲酰基，二丙基氨基甲酰基，丁基氨基甲酰基，二丁基氨基甲酰基等。

[0119] R5的烷氧基是如R和R1的烷氧基所定义的。

[0120] R5的烷氧基羰基氧基是其中烷氧基部分是具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基的烷氧基羰基氧基，其例子是甲氧基羰基氧基，乙氧基羰基氧基，丙氧基羰基氧基，异丙氧基羰基氧基，丁氧基羰基氧基，异丁氧基羰基氧基，仲丁氧基羰基氧基，叔丁氧基羰基氧基，戊氧基羰基氧基，已氧基羰基氧基等。

[0121] R5的烷酰基氧基是其中烷酰基部分是具有2-6个碳原子的烷酰基的烷酰基氧基，其例子是乙酰基氧基，丙酰氧基，丁酰氧基(butyryloxy)，戊酰氧基(valeryloxy)，新戊酰氧基(pivaloyloxy)等。

[0122] R5的芳烷氧基羰基氧基是其中烷基部分具有芳烷基的芳烷氧基羰基氧基，所述芳烷基具有带1-4个碳原子的烷基，其例子是苄氧基羰基氧基，1-苯基乙氧基羰基氧基，2-苯基乙氧基羰基氧基，3-苯基丙氧基羰基氧基，4-苯基丁氧基羰基氧基等。

[0123] R6的烷基如R和R1的烷基所定义，R8或R9的烷基如R和R1的烷基所定义，并且R89 1
或R 的芳烷基如R和R 的芳烷基所定义。

[0124] R7的烷基如R和R1的烷基所定义，并且R7的芳烷基如R和R1的芳烷基所定义。

[0125] 作为由R6和R7组合形成的杂环基团，所述杂环基团在环中还任选地包括氧原子，硫原子或任选具有取代基的氮原子，可以提及的是每个都任选地具有取代基诸如卤素，烷基，烷氧基，卤烷基，硝基，氨基，苯基，芳烷基等的咪唑-2-基，噻唑-2-基，噁唑-2-基，咪唑啉-2-基，3，4，5，6-四氢吡啶-2-基，3，4，5，6-四氢嘧啶-2-基，1，3-噁唑啉-2-基，1，3-噻唑啉-2-基，和苯并咪唑-2-基，苯并噻唑-2-基和苯并噁唑-2-基等。在这里，卤素、
1
烷基、烷氧基、卤烷基和芳烷基如R和R 所定义。

[0126] 作为任选地具有取代基的上述氮原子的取代基，可以提及烷基，芳烷基，卤烷基1
等。在这里，烷基，芳烷基和卤烷基如R和R 所定义。

[0127] R10或R11的羟基烷基是由1-3羟基取代的具有1-6个碳原子的直链或支链烷基。例如，可以提及羟基甲基，2-羟基乙基，1-羟基乙基，3-羟基丙基，4-羟基丁基等。

[0128] R10或R11的烷基如R和R1的烷基所定义，R10或R11的卤烷基和烷氧基羰基如R和1 10 11 1
R 所定义，并且R 或R 的芳烷基如R和R 的芳烷基所定义。

[0129] R10和R11组合形成的环烷基也如R或R1的环烷基所定义。

[0130] L的烷基如R和R1的烷基所定义。

[0131] L的氨基烷基是由氨基所取代的具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，并且，例如，可以提及氨基甲基，2-氨基乙基，1-氨基乙基，3-氨基丙基，4-氨基丁基，5-氨基戊基，6-氨基已基等。

[0132] L的单或二烷基氨基烷基是由具有1-4个碳原子的烷基所单或二取代的氨基烷基，其例子是甲基氨基甲基，二甲基氨基甲基，乙基氨基甲基，二乙基氨基甲基，丙基氨基甲基，二丙基氨基甲基，丁基氨基甲基，二丁基氨基甲基，2-二甲基氨基乙基，2-二乙基氨基乙基等。

[0133] L的氨基甲酰基烷基是由氨基甲酰基取代的具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，可以提及例如，氨基甲酰基甲基，2-氨基甲酰基乙基，1-氨基甲酰基乙基，3-氨基甲酰基丙基，4-氨基甲酰基丁基，5-氨基甲酰基戊基，6-氨基甲酰基已基等。

[0134] L的苯二甲酰亚氨基烷基是由苯邻二甲酰亚胺取代的具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，可以提及例如苯二甲酰亚氨基甲基，2-苯二甲酰亚氨基乙基，1-苯二甲酰亚氨基乙基，3-苯二甲酰亚氨基丙基，4-苯二甲酰亚氨基丁基，5-苯二甲酰亚氨基戊基，6-苯二甲酰亚氨基已基等。

[0135] B的烷基如R和R1的烷基所定义。

[0136] B的烷氧基如R和R1的烷氧基所定义。

[0137] B的芳烷基如R和R1的芳烷基所定义。

[0138] B的芳烷氧基如R3和R4的芳烷氧基所定义。

[0139] B的氨基烷基如L的氨基烷基所定义。

[0140] B的羟基烷基如R10和R11的羟基烷基所定义。

[0141] B的烷酰基氧基烷基是被烷酰基氧基取代的具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，在所述烷酰基氧基中，烷酰基部分具有2-6个碳原子，可以提及例如乙酰氧基甲基，丙酰氧基甲基，丁酰氧基甲基，戊酰氧基甲基，新戊酰氧基甲基，乙酰氧基乙基，丙酰氧基乙基，丁酰氧基乙基，戊酰氧基乙基，新戊酰氧基乙基等。

[0142] B的烷氧基羰基烷基是被烷氧基羰基取代的具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，在所述烷氧基羰基中，烷氧基部分具有1-6个碳原子，可以提及，例如甲氧基羰基甲基，乙氧基羰基甲基，丙氧基羰基甲基，异丙氧基羰基甲基，丁氧基羰基甲基，异丁氧基羰基甲基，仲丁氧基羰基甲基，叔丁氧基羰基甲基，戊氧基羰基甲基，已氧基羰基甲基，甲氧基羰基乙基，乙氧基羰基乙基，丙氧基羰基乙基，异丙氧基羰基乙基，丁氧基羰基乙基，异丁氧基羰基乙基，仲丁氧基羰基乙基，叔丁氧基羰基乙基，戊氧基羰基乙基，已氧基羰基乙基等。

[0143] Q1，Q2或Q3的卤素如R和R1的卤素所定义。Q1或Q2的芳烷氧基如R3和R4的芳烷氧基所定义。

[0144] Q3的烷氧基如R和R1的烷氧基所定义。

[0145] W，X或Y的亚烷基是具有1-6个碳原子的直链或支链亚烷基，其例子是亚甲基，1，2-亚乙基，1，3-亚丙基，1，2-亚丙基，四亚甲基，1，5-亚戊基，1，6-亚已基等。

[0146] Y的亚链烯基(alkenylene)是具有2-6个碳原子的直链或支链亚链烯基，其例子是1，2-亚乙烯基，1，3-亚丙烯基，亚丁烯基(butenylene)，亚戊烯基(pentenylene)等。

[0147] Rb的烷基如R和R1的烷基所定义。

[0148] Rb的芳烷基如R和R1的芳烷基所定义。

[0149] Rb的氨基烷基如L的氨基烷基所定义。

[0150] Rb的单或二烷基氨基烷基如L的单或二烷基氨基烷基所定义。

[0151] 当其是单环时，Rc的含氮的杂环的例子是吡啶，嘧啶，哒嗪，三嗪，吡唑和三唑，并且，当其是稠环时，Rc的含氮的杂环的例子是吡咯并吡啶(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶，1H-吡咯并[3，2-b]吡啶，1H-吡咯并[3，4-b]吡啶等)，吡唑并吡啶(1H-吡唑并[3，4-b]吡啶，1H-吡唑并[4，3-b]吡啶等)，咪唑并吡啶(1H-咪唑并[4，5-b]吡啶等)，吡咯并嘧啶(1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，1H-吡咯并[3，2-d]嘧啶，1H-吡咯并[3，4-d]嘧啶等)，吡唑并嘧啶(1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶，吡唑并[1，5-a]嘧啶，1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶等)，咪唑并嘧啶(咪唑并[1，2-a]嘧啶，1H-咪唑并[4，5-d]嘧啶等)，吡咯并三嗪(吡咯并[1，2-a]-1，3，5-三嗪，吡咯并[2，1-f]-1，2，4-三嗪等)，吡唑并三嗪(吡唑并[1，5-a]-1，3，
5-三嗪等)，三唑并吡啶(1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶等)，三唑并嘧啶(1，2，4-三唑并[1，5-a]嘧啶，1，2，4-三唑并[4，3-a]嘧啶，1H-1，2，3-三唑并[4，5-d]嘧啶等)，肉啉，喹唑啉，喹啉，吡啶并哒嗪(吡啶并[2，3-c]哒嗪等)，吡啶并吡嗪(吡啶并[2，3-b]吡嗪等)，吡啶并嘧啶(吡啶并[2，3-d]嘧啶，吡啶并[3，2-d]嘧啶等)，嘧啶并嘧啶(嘧啶并[4，5-d]嘧啶，嘧啶并[5，4-d]嘧啶等)，吡嗪并嘧啶(吡嗪并[2，3-d]嘧啶等)，二氮杂萘(1，8-二氮杂萘等)，四唑并嘧啶(四唑并[1，5-a]嘧啶等)，噻吩并吡啶(噻吩并[2，3-b]吡啶等)，噻吩并嘧啶(噻吩并[2，3-d]嘧啶等)，噻唑并吡啶(噻唑并[4，5-b]吡啶，噻唑并[5，4-b]吡啶等)，噻唑并嘧啶(噻唑并[4，5-d]嘧啶，噻唑并[5，4-d]嘧啶等)，噁唑并吡啶(噁唑并[4，5-b]吡啶，噁唑并[5，4-b]吡啶等)，噁唑并嘧啶(噁唑并[4，5-d]嘧啶，噁唑并[5，4-d]嘧啶等)，呋喃并(furo)吡啶(呋喃并[2，3-b]吡啶，呋喃并[3，2-b]吡啶等)，呋喃并嘧啶(呋喃并[2，3-d]嘧啶，呋喃并[3，2-d]嘧啶等)，2，3-二氢吡咯并吡啶(2，3-二氢-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶，2，3-二氢-1H-吡咯并[3，2-b]吡啶等)，2，3-二氢吡咯并嘧啶(2，3-二氢-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，2，3-二氢-1H-吡咯并[3，2-d]嘧啶等)，5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶，5，6，7，8-四氢-1，8-二氮杂萘，5，6，7，8-四氢喹啉等，并且当这些环是氢化的芳香环时，环中的碳原子可以是羰基并且其实例包括2，3-二氢-2-氧代吡咯并吡啶，2，3-二氢-2，3-二氧代吡咯并吡啶，7，8-二氢-7-氧代-1，8-二氮杂萘，5，6，7，8-四氢-7-氧代-1，8-二氮杂萘等。

[0152] 这些环任选地由取代基诸如卤素，烷基，烷氧基，芳烷基，卤烷基，硝基，氨基，烷基氨基，氰基，甲酰，酰基，氨基烷基，单或二烷基氨基烷基，叠氮基，羧基，烷氧基羰基，氨基甲酰基，单或二-烷基氨基甲酰基，烷氧基烷基(甲氧基甲基，甲氧基乙基，甲氧基丙基，乙氧基甲基，乙氧基乙基，乙氧基丙基等)，任选地具有取代基的肼基等所取代。

[0153] 作为任选地具有取代基的肼基的取代基，可以提及烷基，芳烷基，硝基，氰基等，其1
中烷基和芳烷基如R和R 的烷基和芳烷基所定义。其实例包括甲基肼基，乙基肼基，苄基肼基等。

[0154] 用作由本发明式(I)所代表的酰胺化合物的化合物可以是药用酸式加成盐，其中酸的例子是无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸等，有机酸诸如甲磺酸、富马酸、马来酸、扁桃酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸等。可以将具有羧基基团的化合物转变成具有金属诸如钠、钾、钙、镁、铝等的盐，或具有氨基酸诸如赖氨酸等的盐。此外，将其1水合物，二水合物，1/2水合物，1/3水合物，1/4水合物，2/3水合物，3/2水合物，6/5水合物等也包含在本发明中。

[0155] 可以将用作本发明式(I)的酰胺化合物的化合物作为前药提供。用于本文时，前药是可以在活体内被转变成前述式(I)的酰胺化合物的化合物，并且指，例如，由式(I)所代表的化合物，其中对分子中诸如羧基基团(COOH)，羟基基团(OH)，氨基基团(包括NH2，酰胺基)，巯基基团(SH)等的部分进行修饰(Development Of Pharmaceutical Products，vol.7(Molecule Design)Hirokawa Shoten)。

[0156] 当由式(I)的所代表的酰胺化合物包括其旋光异构体，外消旋物或顺式-反式异构体时，可以将它们全部使用在本发明中。可以通过按照常规方法分离或使用每个异构体的起始物质来产生其异构体。

[0157] 可以通过在WO95/28387等中描述的方法等来合成由式(I)所代表的酰胺化合物。

[0158] 还可以通过常规方法来产生酸式加成盐，水合物和前药。

[0159] 在本发明中，在用作由式(I)所代表的酰胺化合物的化合物中，优选由式(I)所代表的酰胺化合物，其中Ra是式：

[0160]

[0161] 其中每个符号如上述(1)所述，更优选(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐，并且特别优选(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺1盐酸盐。

[0162] 本发明的药剂恢复由于哺乳动物(例如，人，猴，大鼠，小鼠，兔，牛猪，狗，猫等)和鸟(例如，鸡，鸽子，火鸡等)中角膜神经的损伤、切断或丧失而减少的角膜敏感性，并在作为能改善与角膜低敏感性有关的干眼症状的治疗药物上是有用的。例如，其恢复由白内障外科手术或角膜外科手术诸如PRK、LASIK、LASEK、角膜成形外科手术等，或角膜神经变性疾病诸如神经麻痹性角膜病、角膜溃疡、糖尿病性角膜病等减少的角膜敏感性功能，并且在作为与角膜低敏感性有关的干眼的治疗药物上是有用的。而且，所述药剂作为在干眼患者中恢复干眼状况和与干眼有关的角膜低敏感性的治疗药物是有用的。

[0163] 本发明的药剂是全身或局部给药的。全身地，其是口服给药的，并且在肠胃外地，其是作为静脉注射，皮下注射，肌内注射等给药的。局部地，其是给药于眼部。

[0164] 作为本发明的药剂的剂型，可以提及的有固体药剂诸如粉末、颗粒、片剂、胶囊、栓剂等；液体诸如糖浆、注射剂、眼用溶液剂等；等。对于生产成颗粒和片剂，通过使用，例如，赋形剂(乳糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，微晶纤维素等)，润滑剂(硬脂酸镁，滑石，十八酸，硬脂酸钙等)，崩解剂(淀粉，羧甲纤维素钠，碳酸钙等)，粘合剂(淀粉膏溶液，羟丙基纤维素溶液，羧甲纤维素溶液，阿拉伯胶溶液，明胶溶液，藻酸钠溶液等)等可以生产任何剂型。对于颗粒和片剂而言，使用合适的包衣剂(明胶，蔗糖，阿拉伯胶，巴西棕榈蜡等)，肠溶衣(例如，醋酞纤维素，甲基丙烯酸共聚物，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羧甲基乙基等)等可以形成包衣膜。

[0165] 对于生产为胶囊，将提高流动性和滑动性的合适赋形剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、轻硅酸酐等的混合物，提高在压力下流动性的微晶体纤维素、乳糖等，以及适当添加的上述崩解剂等均匀混合或颗粒化，或包以适合的包衣剂以形成薄膜和包装于胶囊内，或用具有增加的塑性的胶囊基质包囊模塑，其包含适合的胶囊基质(明胶等)、甘油、甘露糖醇或山梨糖醇等。这些胶囊可以包含着色剂、防腐剂[二氧化硫，对羟基苯甲酸酯类(对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯)]等作为必需品。所述胶囊可以是常规的胶囊，一种肠包衣胶囊，一种胃包衣胶囊或一种缓释胶囊。当生产肠衣胶囊时，将包以肠包衣剂的化合物或化合物与上述适合的赋形剂的混合物包装于常规胶囊中或者胶囊本身可以用肠包衣剂进行包被，或者可以将肠聚合物用作塑模的基质。

[0166] 对于生产为栓剂，可以适当地选择和使用一种栓剂的基质(例如，可可脂，聚乙二醇等)。

[0167] 对于生产为糖浆，可以适当地选择和使用，例如，稳定剂(依地酸钠等)，混悬剂(阿拉伯胶，羧甲纤维素等)，矫味剂(单糖浆，葡萄糖等)，芳香剂等。

[0168] 对于将本发明的药剂生产为注射液或眼用溶液剂，它可以通过将化合物溶解或分散在溶液中来生产，所述溶液适当地含有药用添加剂诸如等渗剂(氯化钠，氯化钾，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，缓冲剂(磷酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris缓冲液，谷氨酸盐缓冲液，ε-氨基己酸盐缓冲液等)，防腐剂(对氧基苯甲酸酯，氯代丁醇，苯甲醇，苯扎氯铵，脱氢乙酸钠，依地酸钠，硼酸，硼砂等)，混悬剂(羧甲基纤维素钠，聚山梨酯80，藻酸钠)，增稠剂(羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，稳定剂(亚硫酸氢钠，硫代硫酸钠，依地酸钠，柠檬酸钠，抗坏血酸，二丁基羟基甲苯等)，pH调节剂(盐酸，氢氧化钠，磷酸，乙酸等)，等。

[0169] 尽管用于上述糖浆、注射剂和眼用溶液剂的添加剂的量根据所用添加剂的种类、用途等而变化，它们可以以能够实现添加剂的目的的浓度加入，等渗剂通常以约0.5至约5.0w/v％加入以使得渗透压为约229-约343mOsm。此外，缓冲液以约0.01-约2.0w/v％加入，增稠剂以约0.01-约1.0w/v％加入，稳定剂以约0.001-约1.0w/v％加入。适当地加入pH调节剂以通常获得约3至约9，优选约4至约8的pH。

[0170] 对于特别用作眼用溶液剂，将由式(I)所代表的酰胺化合物的浓度下限调整为通常约0.00001w/v％，优选约0.00005w/v％或更加优选为约0.0001w/v％，上限调节为约1w/v％，优选约0.1w/v％，更加优选约0.05w/v％，进一步优选为约0.02w/v％。

[0171] 本发明的药剂具有Rho-激酶抑制作用，并认为其主要通过这种作用来促进角膜神经突发生。在通过NGF(神经生长因子)的神经突延伸中，通过抑制Rho-激酶来使F-激动蛋白解聚，神经突发生启动。然后，通过活化的Rac1，F-肌动蛋白在神经突中再聚合，进一步延伸神经突(Negishi M.andKatoh H.，J.Biochem.，132，157-166，2002)。考虑到这种神经突发生机制，当Rho-激酶抑制作用长时间维持时，可以使神经突发生减速或对其进行抑制以抵抗F-肌动蛋白的再聚合。

[0172] 尽管本发明药剂的剂量和施用时期取决于目标疾病，症状，施用的受试者，施用方法等而变化，由于本发明的药剂的上述作用和机制，施用优选地在不超过3天，不超过5天，不超过1周，不超过2周等的短期施用周期内进行。例如，对于局部应用，作为恢复成人PRK外科手术后的眼的角膜敏感性的药剂的短期施用，包含约0.01w/v％的由式(I)所代表的酰胺化合物的眼用溶液剂优选地一天内滴注数次，进行多至两周，每次滴注约20-约50μL。而且，例如，对于作为恢复成人在LASIK外科手术后的角膜敏感性的药剂的口服短期施用，包含约10mg由式(I)所代表的酰胺化合物的片剂优选地以每天1次或2次进行施用。

[0173] 然而，通过调节单一剂量和在一天内施用的频率，本发明的药剂可以不仅用于短期施用还可以用于长期施用。而且，以日间隔的间歇施用等也是可能的，并且被认为适合于情形的各种治疗计划也是可利用的。

[0174] 例如，作为恢复在LASIK外科手术后成人的角膜敏感性的药剂的长期施用，包含约0.01w/v％的式(I)的酰胺化合物的眼用溶液剂优选地一天施用2-8次，每次施用约20-约50μL，施用1周，其后以1天2-4次持续施用包含其约0.003w/v％或0.001w/v％的眼用溶液剂，施用3-6周。作为间歇治疗方法的实例，对于作为恢复成人在LASIK手术后的角膜敏感性的药剂的施用，将包含约0.01w/v％的式(I)的酰胺化合物的眼用溶液剂一天滴注数次，每次滴注约20-约50μL，连续进行一周，然后停止滴注1或2周。停止后，在相同的条件下恢复施用并持续一周，然后再次停止滴注。优选地，重复这种间歇滴注直到角膜的敏感性恢复到正常水平。

[0175] 注意到将使用上述药剂的一种促进角膜神经突发生的方法，一种恢复角膜敏感性的方法，一种治疗干眼的方法，包括在本发明中，并且还将包含式(I)的酰胺化合物的用于角膜神经突发生，恢复角膜敏感性或治疗干眼的组合物包括在本发明中。实施例

[0176] 通过参考如下实施例更详细的解释本发明，所述实施例不被解释为限制性的。在如下实施例中，化合物1意味着(R)-(+)-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-4-(1-氨基乙基)苯甲酰胺盐酸盐。可以按照WO95/28387的实施例9中所述的方法制备化合物1。

[0177] 实验例1

[0178] 在培养的兔三叉神经细胞中对于神经突发生的促进作用

[0179] 1)所用动物

[0180] 使用购自KITAYAMA LABES Co.，Ltd的日本白兔(2-3天龄)。

[0181] 2)试验物质

[0182] 使用化合物1

[0183] 3)试验方法

[0184] (细胞培养)

[0185] 按照Chan等的报道(Chan，Kuan Y.and Haschke，Richard H.，Exp.EyeRes.，41：687-699，1985)分离三叉神经细胞。具体地，在醚麻醉下，用盐水进行心脏灌注后，移去三叉神经节，使用神经分散溶液(SUMITOMOBAKELITE Co.，Ltd.)进行分散，以得到细胞混悬液。对于细胞培养，使用具有B27添加物(Invitrogen Corp.，终浓度2％v/v)和L-谷氨酰胺(InvitrogenCorp.，终浓度1mM)的神经基培养基(neurobasal medium)
3
(InvitrogenCorp.)，并且培养条件是37℃，5％CO2，95％空气。将细胞以约3×10 细胞/孔接种在用聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片(SUMITOMOBAKELITE)上，将所述盖玻片浸入24孔板中。作为测试物质，加入化合物1(终浓度1μM)，而对照组则不进行添加。

[0186] (免疫染色)

[0187] 培养48小时后，将所述细胞用4％的低聚甲醛于室温固定2小时，使用抗-神经丝200抗体(Sigma)和与其具有反应性的荧光二抗对神经细胞体和神经突进行荧光染色，所述抗神经丝200抗体特异性地识别作为特异于神经细胞的中间体丝的神经丝。

[0188] (免疫分析)

[0189] 将染色的细胞作为荧光显微镜的图像输入计算机并使用图像分析软件(Image-Pro Plus ver.4.0，Planetron.Inc.)对输入的细胞图像的细胞体直径和神经突长度进行测量。对于化合物1添加组和对照组的每个，测量3个孔的细胞。将具有长度不少于细胞体直径2倍的神经突的细胞作为神经突发生的细胞，并且计算测量的神经突发生的细胞在总细胞中的百分比(％)。

[0190] 4)测试结果

[0191] 图1显示培养的兔三叉神经细胞的荧光显微镜图像，其中A显示未添加的对照组的细胞，B显示化合物1添加组的细胞。在非添加组中，许多细胞不具有延伸的神经突，但是在化合物1添加组中，观察到许多具有长-延伸的神经突的细胞。图2是显示所测量的神经突发生细胞数量与总细胞数量的比例的图表。对照组和化合物1添加组的比率分别是24％和54.6％，并且化合物1添加组显示相对于对照组的明显高的神经突发生细胞比例(*：p＜0.001，t-检验，N＝3，平均值±标准差)。

[0192] 从上述结果，已经发现化合物1促进培养的兔三叉神经细胞的神经突发生。

[0193] 实验例2

[0194] 使用microkeratome对兔角膜低敏感性的提高作用

[0195] 1)所用的动物

[0196] 使用购自日本SLC的日本白兔(体重2.5-3.0kg)。试验从始至终，将动物在室内的笼中分别饲养，将室内温度设定为23±3℃，湿度55±10％，12小时光循环(在8am开灯，在8pm关灯)。给动物限定量的固体饲料(LaboR-stock，Nosan Corporation，1天100g)，并允许其自由取用水龙头的水。

[0197] 2)测试物质

[0198] 作为测试物质，使用化合物1。将化合物1溶解在如下碱性溶液中到0.01％并通过滴注施用。通过滴注向对照组施用碱性溶液。碱性溶液制剂：

[0199]

[0200] 3)测试方法

[0201] (选择动物和测量角膜敏感性的起始值)

[0202] 试验开始前，肉眼观察动物的眼的前段并观察通过荧光素染色标记的角膜，并且选择在它们中没有显示异常的兔。使用Cochet-Bonnet角膜敏感计(由LUNEAU生产)，测量角膜敏感性的起始值。

[0203] (制备角膜瓣)

[0204] 向动物进行甲苄噻嗪(Celactal)(2％甲苄噻嗪(xylazine))：盐酸氯胺酮(5％氯胺酮)＝0.5∶1的混合物的肌内注射(0.9mL/kg)以进行全身麻醉，并将眼球充分暴露。使用在抽吸环(suction ring)中附着兔眼衔接头的microkeratome(MK2000，Nidek)，用130μm厚的刀片(Arbelaez MC.et al.，J.Refract Surg.，2002May-Jun 18(3Suppl)：S357-60)制备角膜瓣(直径8.5mm)。在显微镜下，将角膜瓣确实放回原处，并使动物从麻醉中苏醒，同时观察到动物阻止瓣的转移。

[0205] (动物的分组)

[0206] 制备角膜瓣的次日，观察动物的状况，选择具有角膜瓣正常定位的动物。使用SAS临床前成套试剂(Version 5.0，SAS Institute Japan)以许多变量通过随机分组设计将动物进行分组，从而使制备角膜瓣前的角膜敏感性的起始值变得均匀。

[0207] (施用)

[0208] 从角膜瓣制备的次日，通过滴注1周或2周施用测试物质溶液和对照碱性溶液。使用微量加液器以2小时间隔以1日4次(50μL/次)将滴注施用在手术眼中。同时，手术后，将测试物质每天滴注4次，进行1周，将0.1％溴芬酸钠眼用溶液剂(Bronuck眼用溶液剂，Senju Pharmaceutical Co.，Ltd.)作为第一次和第三次滴注的消炎药进行滴注，并且将0.3％的盐酸洛美沙星的眼用溶液剂(Lomeflon眼用溶液剂，Senju Pharmaceutical Co.，Ltd.)作为第二和第四次滴注的抗菌药进行滴注。

[0209] (角膜敏感性测量)

[0210] 手术后1周到8周，使用Cochet-Bonnet角膜敏感计测量角膜敏感性，每周1次。进行盲测从而使操作者将不会知道受试兔属于哪个施用组。

[0211] (统计分析)

[0212] 对于统计分析，使用参量Dunnett多重比较检验(一侧)(SAS临床前成套试剂；Version 5.0，SAS Institute Japan)并将少于5％的风险评价为显著。

[0213] (试验结果)

[0214] 图3显示角膜敏感性的时间过程变化。角膜敏感性由Cochet-Bonnet角膜敏感计的尼龙丝(直径0.12mm)的最大长度表示，在尼龙丝尖端与角膜中心接触时所述敏感计感生边缘反射，并且将所述长度显示于图3的垂直轴中。手术一周后，在基础施用组(对照组)和测试物质溶液施用组两者中观察到角膜敏感性迅速减少。其后，对照组显示角膜敏感性的逐渐恢复，而测试物质施用组比对照组显示了角膜敏感性的更好的恢复。手术后2-8周的过程中，以该等级，结果在1周施用组，2周施用组和对照施用组中显示良好。作为统计分析的结果，与对照组相比，1周施用组的角膜敏感性在手术后5周明显地高。

[0215] 在激光角膜磨削术(LASIK)中，使用microkeratome切割的角膜瓣向后折叠以暴露角膜基质，所述角膜基质由受激准分子激光器辐射切割以校正折光并将角膜瓣放回原来的位置。该试验使用用这种microkeratome制备的兔角膜低敏感性模型检查了化合物1促进角膜敏感性的恢复的作用。上述测试结果说明化合物1具有促进恢复由于角膜神经断面引起的角膜低敏感性的作用。还提示当剂量是相同的，用缩短的施用时间可以获得更有效的结果的可能性。

[0216] 制备实施例1片剂

[0217]

[0218] 使用以上成分作为一种片剂的材料，按照常规方法形成片剂。根据需要可以用常规的肠溶包衣(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)，或糖包衣或薄膜(例如乙基纤维素)包衣片剂。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含20mg、5mg、1mg、0.5mg、0.1mg/片剂(成分的量)的化合物1的片剂。

[0219] 制备实施例2胶囊

[0220]

[0221] 使用以上组分作为一种胶囊的材料，将它们均匀混合，按照常规方法成粒，并包装在硬胶囊中。在包装前，根据需要用常规的肠溶包衣(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)，糖包衣或薄膜(例如乙基纤维素)包被颗粒。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含20mg、10mg、5mg、1mg、0.5mg、0.1mg/胶囊的化合物1的胶囊。

[0222] 制备实施例3注射剂

[0223] 化合物1 750mg

[0224] 羧甲基纤维素钠 500mg

[0225] 注射用水 总量100mL

[0226] 按照常规方法将以上组分无菌混合以提供注射剂。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含1000mg、500mg、200mg、100mg/100mL的化合物1的注射剂。

[0227] 制备实施例4眼用溶液剂

[0228]

[0229] 将灭菌的纯水(80mL)加热至约80℃，加入羟甲基纤维素，搅拌混合物直至液体温度达到室温。将化合物1、氯化钠、硼酸、依地酸钠和苯扎氯铵加入该溶液以发生溶解。加入适量硼砂调节pH至7。加入灭菌的纯水以达到100mL。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含0.1w/v％、0.05w/v％、0.03w/v％，0.01w/v％、0.003w/v％和0.001w/v％的化合物1的眼用溶液剂。

[0230] 制备实施例5眼用溶液剂

[0231]

[0232] 将化合物1、D-甘露糖醇和磷酸二氢钠加入灭菌的纯水(80mL)以发生溶解。加入适量氢氧化钠来调节pH至7。加入灭菌的纯水以达到100mL。用膜滤器将制备的眼用溶液剂无菌过滤并装入一次性(单位剂量)容器并密封。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含0.1w/v％、0.05w/v％、0.03w/v％、0.005w/v％、0.003w/v％和0.001w/v％的化合物1的眼用溶液剂。

[0233] 工业应用性

[0234] 由于本发明的药剂具有角膜神经突发生促进作用，因此对于改善由于角膜神经损伤等造成的角膜敏感性的功能降低和改善与角膜敏感性功能降低有关的干眼症状，其是有效的。具体地，可以期望提供对如下的改善效果：白内障外科手术或PRK、LASIK、LASEK或角膜成形术外科手术后角膜敏感性低下，与角膜神经变性诸如神经性麻痹角膜病变、角膜溃疡、糖尿病性角膜病变等有关的角膜敏感性低下和干眼。

[0235] 本申请基于在日本提交的专利申请号2004-166445，其内容特此结合作为参考。