通过核酸扩增检测1型和2型单纯疱珍病毒转让专利
申请号 : CN200480014977.3
文献号 : CN1798851B
文献日 : 2010-04-28
发明人 : D·M·沃尔夫 , C·A·马丁奈蒂斯 , D·A·尤尔西斯
申请人 : 贝克顿·迪金森公司
摘要 :
本发明涉及基于扩增一部分单纯疱疹病毒(HSV)的糖蛋白G(US4)基因检测样品中存在或不存在HSV和使用如本文所述的引物和检测引物检测扩增的核酸的方法。本发明的方法进一步鉴定了样品中的HSV类型，HSV-1或者HSV-2。本发明还包括试剂盒，该试剂盒包括可以用于本文所述扩增方法的引物和检测引物。
权利要求 :
1.扩增1型单纯疱疹病毒(HSV-1)靶序列的方法，包括：
使多核苷酸杂交，该多核苷酸包括主要由SEQ ID NOs：5-25中任意一个的靶结合序列组成的序列。
2.扩增1型单纯疱疹病毒(HSV-1)靶序列的方法，包括：
(a)使用第一种扩增引物扩增HSV-1靶序列，所述的第一扩增引物包括主要由SEQ ID NOs：7-8中任意一个的靶结合序列组成的序列；
(b)使用第二种扩增引物扩增HSV-1靶序列，所述的第二扩增引物包括主要由SEQ ID NOs：9-18中任意一个的靶结合序列组成的序列。
3.扩增1型单纯疱疹病毒(HSV-1)靶序列的方法，包括：
(d)使用第一种扩增引物扩增HSV-1靶序列，所述的第一种扩增引物包括主要由SEQ ID NOs：7-8中任意一个的靶结合序列组成的序列；
(e)使用第二种扩增引物扩增HSV-1靶序列，所述的第二种扩增引物包括主要由SRQ ID NOs：9-18中任意一个的靶结合序列组成的序列。
4.权利要求2所述的方法，其中所述的扩增反应是链置换扩增(SDA)反应。
5.权利要求2所述的方法，其中所述的扩增方法选自由下列方法组成的组：直接检测、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、原位杂交、转录介导的扩增(TMA)、自动维持序列扩增(3SR)、滚环扩增(RCA)、Qβ复制酶系统和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
6.权利要求2所述的方法，其中所述的第一种扩增引物进一步包括选自由发夹、g-四集体、限制酶识别序列和结合检测探针的序列组成的组的序列。
7.权利要求2所述的方法，其中所述的第一种扩增引物进一步包括可检测标记。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的标记为荧光部分。
9.权利要求2所述的方法，其中所述的第一种扩增引物包括选自由限制酶识别位点和RNA聚合酶启动子组成的组的序列。
10.权利要求2所述的方法，进一步包括扩增内部扩增对照(IAC)。
11.权利要求10所述的方法，其中IAC选自SEQ ID NOs：26-27组成的组。
12.扩增1型单纯疱疹病毒(HSV-1)靶序列的方法，包括：
使一种或多种多核苷酸杂交，它们包括主要由SEQ ID NOs：7-18中任意一个的靶结合序列组成的序列。
13.权利要求12所述的方法，其中所述的一种或多种多核苷酸进一步包括可检测标记。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的可检测标记为荧光部分。
15.多核苷酸，包括主要由SEQ ID NOs：5-25中任意一个的靶结合序列组成的序列。
16.权利要求15所述的多核苷酸，进一步包括主要由SEQ ID NOs：7-18中任意一个的靶结合序列组成的序列。
17.权利要求15所述的多核苷酸，进一步包括选自由发夹、g-四集体、限制酶识别位点和结合检测探针的序列组成的组的序列。
18.权利要求16所述的多核苷酸，其中用可检测标记标记该多核苷酸。
19.权利要求18所述的多核苷酸，其中所述的标记为荧光部分。
20.用于检测序列的试剂盒，包括一种或多种含有主要由SEQ IDNOs：7-18中任意一个的靶结合序列组成的序列的引物。
21.权利要求20所述的试剂盒，进一步包括缓冲引物。
22.权利要求21所述的试剂盒，其中所述的缓冲引物选自由SEQ IDNOs：23-25组成的组。
23.权利要求20所述的试剂盒，进一步包括连接引物。
24.权利要求23所述的试剂盒，其中所述的连接引物选自由SEQ IDNOs：19-22组成的组。
25.权利要求20所述的试剂盒，进一步包括检测引物。
26.权利要求25所述的试剂盒，其中所述的检测引物选自由SEQ IDNOs：30-35组成的组。
27.组合物，包括一种或多种主要由SEQ ID NOs：5-25中任意一个的靶结合序列组成的引物。
28.权利要求27所述的组合物，包括一种或多种主要由SEQ ID NOs：5-18和23-25中任意一个的靶结合序列组成的引物。
29.权利要求28所述的组合物，进一步包括：
(g)能够通过位于连接引物3′末端上的靶结合序列与靶序列杂交的连接引物序列，其中所述的连接引物包括5′通用尾且该连接引物选自由SEQ ID NOs：19-22组成的组；和(h)能够通过检测引物的3′部分与连接引物5′尾的补体杂交的检测引物序列，其中所述的检测引物序列包括5′限制酶识别位点和可检测标记，所述的可检测标记选自由荧光部分、放射性同位素、化学发光剂、能够显现可见反应产物的酶底物和配体-可检测标记的配体结合配偶体组成的组。
30.权利要求29所述的组合物，其中所述的检测引物序列包括选自由发夹和g-四集体组成的组的结构部分。
31.权利要求29所述的组合物，其中所述的可检测标记为荧光部分。
32.权利要求31所述的组合物，其中所述的荧光部分包括供体和猝灭剂染料对，所述的猝灭剂染料对选自由下列物质组成的组：荧光素(FAM)/罗丹明(ROX)；FAM/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；ROX/DABCYL；异硫氰酸荧光素(FITC)/异硫氰酸四甲基罗丹明酯(TRITC)；FITC/Texas RedTM；FITC/N-羟基琥珀酰亚氨基1-芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊红异硫氰酸酯(EITC)；N-羟基琥珀酰亚氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC；FITC/罗丹明X；和FITC/四甲基罗丹明(TAMRA)。
33.权利要求32所述的组合物，其中所述的检测引物选自由SEQ IDNOs：30-35组成的组。
34.组合物，包括一种或多种主要由SEQ ID NOs：5-18和23-25中任意一个的HSV-1靶结合序列组成的引物。
35.权利要求34所述的组合物，进一步包括：
(i)能够通过位于连接引物3′末端上的靶结合序列与靶序列杂交的连接引物序列，其中所述的连接引物包括5′通用尾且该连接引物选自由SEQ ID NOs：19-22组成的组；和(j)能够通过检测引物的3′部分与连接引物5′尾的补体杂交的检测引物序列，其中所述的检测引物序列包括5′限制酶识别位点和可检测标记，所述的可检测标记选自由荧光部分、放射性同位素、化学发光剂、能够显现可见反应产物的酶底物和配体-可检测标记的配体结合配偶体组成的组。
36.权利要求35所述的组合物，其中所述的检测引物序列包括选自由发夹和g-四集体组成的组的结构部分。
37.权利要求35所述的组合物，其中所述的可检测标记为荧光部分。
38.权利要求37所述的组合物，其中所述的荧光部分包括供体和猝灭剂染料对，所述的猝灭剂染料对选自由下列物质组成的组：荧光素(FAM)/罗丹明(ROX)；FAM/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；ROX/DABCYL；异硫氰酸荧光素(FITC)/异硫氰酸四甲基罗丹明酯(TRITC)；FITC/Texas RedTM；FITC/N-羟基琥珀酰亚氨基1-芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊红异硫氰酸酯(EITC)；N-羟基琥珀酰亚氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC；FITC/罗丹明X；和FITC/四甲基罗丹明(TAMRA)。
39.权利要求35所述的组合物，其中所述的检测引物选自由SEQ IDNOs：30-35组成的组。
40.扩增样品中存在HSV-1靶序列的方法，所述的方法包括：
将样品加入选自由SEQ ID NOs：7-8组成的组的第一种扩增引物和选自由SEQ ID NOs：9-18组成的组的第二种扩增引物中；产生扩增的HSV-1核酸产物。
41.权利要求40所述的方法，进一步包括：
(c)将样品加入SEQ ID NO：46的第一种缓冲引物和SEQ ID NO：47的第二种缓冲引物中。
42.包含用于通过扩增反应检测样品中HSV-1靶序列的引物的组合物，包括：(a)能够与HSV-1靶序列杂交的第一种扩增引物，其中所述的第一种扩增引物选自由SEQ ID NO：7-8组成的组；
(b)能够与HSV-1靶序列的补体杂交的第二种扩增引物，其中所述的第二种扩增引物选自由SEQ ID NO：9-18组成的组；
(c)能够在第一种扩增引物的上游与HSV-1靶序列杂交的第一种缓冲引物序列，其中所述的第一种缓冲引物为SEQ ID NO：23；和(d)能够在第二种扩增引物的上游与HSV-1靶序列的补体杂交的第二种缓冲引物序列，其中所述的第二种缓冲引物选自由SEQ ID NO：24-25组成的组。
43.用于扩增样品中HSV-1靶序列的方法，包括：
(a)使含有选自由SEQ ID NO：7-8组成的组的序列的第一种扩增引物与HSV-1靶序列杂交；
(b)使SEQ ID NO：23的第一种缓冲引物与HSV-1靶序列杂交，其中所述的第一种缓冲引物在第一种扩增引物的上游与HSV-1靶序列杂交，且所述的第二种缓冲引物在第二种扩增引物的上游与补体HSV-1靶序列杂交；
(c)使第一种缓冲引物和第一种扩增引物的3’末端延伸，产生第一种扩增引物延伸产物，其中第一种缓冲引物的延伸取代了第一种扩增引物延伸产物；
(d)使含有选自由SEQ ID NO：9-18组成的组的序列的第二种扩增引物与第一种扩增引物延伸产物杂交；
(e)使含有选自由SEQ ID NO：24-25组成的组的序列的第二种缓冲引物与第一种扩增引物延伸产物杂交；
(f)使第二种缓冲引物和第二种扩增引物的3’末端延伸，产生第二种扩增引物延伸产物，其中第二种缓冲引物的延伸取代了第二种扩增引物延伸产物；
(g)使第一种扩增引物与第二种扩增引物延伸产物杂交；
(h)使步骤(g)的第一种扩增引物3′末端延伸，产生包括第二种扩增引物延伸产物及其补体的双链分子，其中各链包括可产生切口的限制酶位点；
(i)使所述的双链分子产生切口，生成5′部分和3′部分，其中5′部分包括产生切口的尾且3′部分包括产生切口的第二种扩增引物延伸产物及其补体；
(j)使产生切口尾的3′末端延伸，取代产生切口的第二种扩增引物延伸产物，其中产生切口的补体第二种扩增引物延伸产物为单链；
(k)使产生切口尾的3′末端延伸，取代产生切口的补体第二种扩增引物延伸产物，其中产生切口的补体第二种扩增引物延伸产物为单链；
(l)通过使第一种扩增引物和第二种扩增引物分别与各单链分子杂交并重复步骤(h)-(k)使两种单链分子以指数方式扩增，由此扩增HSV-1靶序列。
44.用于检测HSV-1靶序列的试剂盒，包括一种或多种选自由SEQID NOs：7-18组成的组的扩增引物和选自由SEQ ID NOs：23-25组成的组的缓冲引物。
45.权利要求44所述的试剂盒，进一步包括一种或多种选自由SEQID NOs：19-22组成的组的连接引物和一种或多种选自由SEQ ID NOs：SEQ ID NOs：30-35组成的组的检测引物。
46.权利要求45所述的试剂盒，进一步包括一种或多种选自由SEQID NOs：26-27组成的组的IAC靶序列和一种或多种选自由SEQ ID NOs：28-29组成的组的IAC连接引物。
说明书 :
技术领域
本发明涉及通过核酸扩增法鉴定单纯疱疹病毒(HSV)的诊断方法和核酸序列。
背景技术
单纯疱疹是有包膜的双链DNA病毒，它导致人原发性和复发性感染且与导致传染性单核细胞增多(EB病毒)、水痘和带状疱疹(水痘-带状疱疹病毒)的病毒有关。单纯疱疹病毒(HSV)感染的症状包括皮肤或粘膜上长出小水疱。在长出的水疱消退后，病毒在对感染区提供神经纤维的神经细胞群(神经节)内保持静止(潜伏)状态。病毒定期再活化，开始再生长并通过神经纤维传递回皮肤，由此使与早期感染相同的皮肤区上长出水疱。有时病毒甚至可以在没有明显水疱出现时存在于皮肤或粘膜上。将单纯疱疹病毒(HSV)分类成两种类型：HSV-1和HSV-2。已经对人HSV-1和HSV-2的完整基因组进行了测序(例如，分别参见NCBI登记号X14112和Z86099)。
已经证实HSV造成或导致各种疾病，包括失明和脑炎。除导致局部发作外，HSV-1和HSV-2还与脑炎相关。这种脑炎的病理生理学在人中难以理解。动物模型提示该病毒通过外周神经进入中枢神经系统并使大脑产生炎症。HSV-1是成年人脑炎的更为常见的原因。HSV-2是新生儿脑炎的更为常见的原因，它与母体生殖器感染有关。HSV-2是社会中最常见的性传播疾病之一。与HSV相关的脑炎在所有类型的脑炎中具有最高致死率，为100万分之1-4的年发病率。HSV脑炎影响所有年龄的人且可以在全年的任意时间出现。在成年人中，认为与HSV相关的脑炎因潜伏病毒再活化所致。症状可以包括发热、头痛、癫痫发作、意识水平改变和人格改变。这些症状与其它疾病的相似性使得临床诊断变得困难。如果不进行治疗，那么单纯性疱疹脑炎(HSE)的死亡率可以高达70％，与之相比，接受治疗的人中的死亡率低至19％。据报导，在接受治疗的患者中，约38％最终可以恢复正常功能。因此，能够在早期诊断HSV感染是极为重要的。
通常对合适的临床样本使用细胞培养物进行HSV感染的诊断。然而，在有宿主免疫反应和再活化发作存在下，分离细胞培养物中的HSV的能力在旧损害中降低。血清学诊断，特别是在脑脊髓液(CSP)中HSV的诊断不够灵敏或具有特异性且需要花费很多时间做出决定，包括选择早期的脑炎治疗干预手段。难以使用细胞培养物在脑脊髓液中检测到HSV，其中仅4％的病例培养物呈阳性。血清学方法也因在开始感染后出现2-3周抗体反应延迟而不足以诊断HSE。包括脑活检在内的诊断的″金标准″法是侵害性的且因具有长期发病的显著风险而存在争议。可选技术，诸如计算机辅助断层摄影术和磁共振影像学不具有特异性且缺乏作为诊断工具的灵敏性。
目前，用于检测HSV的免疫学方法并不可靠且难以进行。分子检测方法比可能使用常规方式提供了增强的灵敏性和快速产生结果的可能性。存在必须快速、灵敏和特异性诊断HSV疾病的情况。因此，存在研发有助于诊断HSV的快速和灵敏工具的临床需求。还存在对对HSV感染分型的工具的需求。快速鉴定病毒感染中所涉及的特异性病原体提供了可以用于在短期内确定合适疗法的信息。
已经证实HSV造成或导致各种疾病，包括失明和脑炎。除导致局部发作外，HSV-1和HSV-2还与脑炎相关。这种脑炎的病理生理学在人中难以理解。动物模型提示该病毒通过外周神经进入中枢神经系统并使大脑产生炎症。HSV-1是成年人脑炎的更为常见的原因。HSV-2是新生儿脑炎的更为常见的原因，它与母体生殖器感染有关。HSV-2是社会中最常见的性传播疾病之一。与HSV相关的脑炎在所有类型的脑炎中具有最高致死率，为100万分之1-4的年发病率。HSV脑炎影响所有年龄的人且可以在全年的任意时间出现。在成年人中，认为与HSV相关的脑炎因潜伏病毒再活化所致。症状可以包括发热、头痛、癫痫发作、意识水平改变和人格改变。这些症状与其它疾病的相似性使得临床诊断变得困难。如果不进行治疗，那么单纯性疱疹脑炎(HSE)的死亡率可以高达70％，与之相比，接受治疗的人中的死亡率低至19％。据报导，在接受治疗的患者中，约38％最终可以恢复正常功能。因此，能够在早期诊断HSV感染是极为重要的。
通常对合适的临床样本使用细胞培养物进行HSV感染的诊断。然而，在有宿主免疫反应和再活化发作存在下，分离细胞培养物中的HSV的能力在旧损害中降低。血清学诊断，特别是在脑脊髓液(CSP)中HSV的诊断不够灵敏或具有特异性且需要花费很多时间做出决定，包括选择早期的脑炎治疗干预手段。难以使用细胞培养物在脑脊髓液中检测到HSV，其中仅4％的病例培养物呈阳性。血清学方法也因在开始感染后出现2-3周抗体反应延迟而不足以诊断HSE。包括脑活检在内的诊断的″金标准″法是侵害性的且因具有长期发病的显著风险而存在争议。可选技术，诸如计算机辅助断层摄影术和磁共振影像学不具有特异性且缺乏作为诊断工具的灵敏性。
目前，用于检测HSV的免疫学方法并不可靠且难以进行。分子检测方法比可能使用常规方式提供了增强的灵敏性和快速产生结果的可能性。存在必须快速、灵敏和特异性诊断HSV疾病的情况。因此，存在研发有助于诊断HSV的快速和灵敏工具的临床需求。还存在对对HSV感染分型的工具的需求。快速鉴定病毒感染中所涉及的特异性病原体提供了可以用于在短期内确定合适疗法的信息。
发明内容
本发明涉及用于测定哺乳动物中存在单纯疱疹病毒(HSV)，特别是1型(HSV-1)或2型(HSV-2)单纯疱疹病毒的方法和组合。该方法包括使用扩增和检测单纯疱疹病毒靶序列的引物。一个实施方案使用链置换扩增(SDA)的扩增技术。
本发明的核酸引物可以独特地扩增HSV-1或HSV-2中的靶序列，由此能够对HSV进行灵敏性检测和类型鉴定。本发明还涉及基于链置换扩增(SDA)的用于检测HSV的方法，该方法包括使用通用荧光能量传递探针进行实时检测。本发明的探针和引物提供了对HSV核酸的直接、快速和灵敏性检测且由此为免疫学测定提供了有吸引力的选择。
本发明的探针和引物可以在样品培养后用作证实培养的生物体的特性的工具。另一方面，可以在培养前使用它们或将它们用于代替培养物使用公知的扩增方法检测和鉴定HSV核酸。本发明的探针、引物和组合物以及使用所述探针、引物和组合物的测定方法为在HSV-1和HSV-2的核酸靶序列之间快速识别提供了工具，从而使专业人员能够鉴定、诊断和治疗HSV类型，而不需要借助于一般所依赖的耗时的免疫学和生物化学方法。
本发明的核酸引物可以独特地扩增HSV-1或HSV-2中的靶序列，由此能够对HSV进行灵敏性检测和类型鉴定。本发明还涉及基于链置换扩增(SDA)的用于检测HSV的方法，该方法包括使用通用荧光能量传递探针进行实时检测。本发明的探针和引物提供了对HSV核酸的直接、快速和灵敏性检测且由此为免疫学测定提供了有吸引力的选择。
本发明的探针和引物可以在样品培养后用作证实培养的生物体的特性的工具。另一方面，可以在培养前使用它们或将它们用于代替培养物使用公知的扩增方法检测和鉴定HSV核酸。本发明的探针、引物和组合物以及使用所述探针、引物和组合物的测定方法为在HSV-1和HSV-2的核酸靶序列之间快速识别提供了工具，从而使专业人员能够鉴定、诊断和治疗HSV类型，而不需要借助于一般所依赖的耗时的免疫学和生物化学方法。
附图说明
本发明的各种目的、优点和新特征易于在结合附图阅读时从下列详细描述中得到理解，其中；
图1表示1型单纯疱疹病毒(HSV-1)的糖蛋白G(US4)基因的共有序列(SEQ ID NO：1)。
图2是表示HSV-1靶区(SEQ ID NO：2)基因组序列的一部分和用于对HSV-1DNA的特异性检测的引物、缓冲物和连接物的位置的图。
图3是表示结果的″MOTA″表达的示意图。
图4是表示用于BD ProbeTecTMET系统的″PAT″算法的示意图。
图5描绘了SDA法对各种HSV-1株稀释液的分析灵敏度。
图6是2型单纯疱疹病毒(HSV-2)的糖蛋白G(US4)基因片段的共有序列(SEQ ID NO：3)。
图7是表示HSV-2靶区(SEQ ID NO：4)的基因组序列和用于对HSV-2DNA的特异性检测的引物、缓冲物和连接物的位置的图。
发明详述
本发明提供了分离和纯化的核酸、多核苷酸、扩增引物和在核酸扩增反应中表现出单纯疱疹病毒(HSV)类型特异性的测定探针。本发明还提供了使用本发明的探针和引物检测和鉴定HSV核酸的方法。
本发明的一个实施方案涉及检测靶核酸序列存在的扩增方法，其中使用含有靶结合序列的一种或多种扩增引物、产生扩增的靶序列和检测该靶序列。扩增方法的非限制性实例包括：聚合酶链反应(PCR；参见Saiki等1985《科学》(Science)230：1350-1354，引入本文作为参考)；连接酶链反应(LCR；参见Wu等1989《基因组》(Genomics)4：560-569；Barringer等1990《基因》(Gene)89：117-122；Barany，1991《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：189-193，将所有这些文献引入本文作为参考)；原位杂交；转录介导的扩增(TMA；参见Kwoh等1989《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：1173-1177，引入本文作为参考)；自动维持序列扩增(3SR；参见Guatelli等1990《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：1874-1878，引入本文作为参考)；滚环扩增(RCA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；Qβ复制酶系统(Lizardi等1988《生物技术》(BioTechnology)6：1197-1202，引入本文作为参考)和链置换扩增(SDA；参见Walker等1992《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：392-396；Walker等1992《核酸研究》(Nuc.Acids.Res.)20：1691-1696；和EP 0497272，将所有这些文献引入本文作为参考))，包括耐热SDA(tSDA)。
本发明的另一个实施方案涉及通过使HSV靶序列以指数式扩增检测样品中存在的HSV核酸序列的等温链置换扩增(SDA)法。在另一个实施方案中，如美国专利US 5,648,211中所述在约52℃下，使用如US5,919,630、US5,928,869、US5,958,700和US6,261,785所述为在扩增过程中检测靶物而选择的检测引物进行SDA，将所有这些文献的内容引入本文作为参考。作为用于SDA的典型，将试剂、引物、诸如限制酶和聚合酶这类酶和其它成分加入到反应微孔、容器或贮器中。SDA扩增来自样品的特异性DNA序列，其中一旦所有成分彼此混合，则反应持续至关键成分耗尽。与聚合酶链反应(PCR)相反，SDA是一种等温反应过程，使得一旦反应开始，则在反应进程中没有外部控制。
本发明的SDA法需要至少两种HSV扩增引物和两种缓冲引物以启动扩增法。将所述的扩增引物设计成对HSV-1或HSV-2具有高度特异性。SDA法包括在混合物中同时进行的扩增反应且不需要用于循环变温的作为PCR扩增法中必不可少的单独的期或循环。本发明SDA的另一个优点在于指数式扩增。DNA聚合酶延伸、产生切口、置换和切口位点再生的步骤产生了取代的单链分子，这些分子在末端上带有循环且被扩增引物俘获的部分限制酶位点(例如BsoBI位点)，由此使HSV靶序列以指数方式扩增。SDA法还提供了改善的工作流程，尤其用于高流通量法。可以将SDA引入基于微阵列的应用，其中可以将小量体积(纳升)的样品和试剂用于扩增HSV靶DNA并通过在单一平台上进行多次SDA测定检测微嵌片阵列上的扩增产物。用于检测样品中的HSV的SDA法的主要优点在于最低的劳动需求量和高流通量的可能性，因为等温扩增法在所述平台设计和维护方面提供了显著少的技术挑战。
本文所用的术语“靶物”或“靶序列”指的是有待扩增和检测的HSV核酸序列、HSV-1或HSV-2。它们包括有待扩增的原始HSV核酸序列、有待扩增的原始HSV核酸序列的互补第二条链和通过扩增反应产生的原始HSV序列的拷贝链。这些拷贝用作可扩增靶物，因为它们含有扩增引物退火至的序列拷贝。扩增反应过程中产生的靶序列拷贝被称作扩增产物、扩增引物或扩增子。HSV-1和HSV-2靶序列位于HSV-1和HSV-2基因组序列的糖蛋白G(US4)基因内。HSV-1靶序列位于附图1的共有序列的555位-680位碱基之间。HSV-2靶序列位于附图6的共有序列的867位-990位碱基之间。糖蛋白G(US4)基因分别位于附图2和7的HSV-1基因组序列的136744-137460位之间和HSV-2基因组序列的137878-139977位之间。
本文所用的“扩增引物”是退火至靶序列且可以通过扩增延伸的引物。结合靶序列的扩增引物区为靶结合序列。扩增技术包括，但不限于：链置换扩增(SDA)，包括耐热SDA(tSDA)；聚合酶链反应(PCR)；连接酶链反应(LCR)；原位杂交；自动维持序列扩增(3SR)；滚环扩增(RCA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；和转录介导的扩增(TMA)。
在一个实施方案中，扩增引物可以用于链置换扩增(SDA)法。扩增引物包括3′末端上结合HSV靶序列的靶结合序列部分和5′末端上不结合或退火至靶序列的部分。不结合靶序列的SDA扩增引物的部分还如美国专利US 5,455,166和US 5,270,184中所述包括尾和靶结合序列上游的限制酶的识别位点，将所述文献引入本文作为参考。当该识别位点如Walker等(1992《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：392-396和1992《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)20：1691-1696)中所述被半修饰时，这一识别位点对使DNA双链体的一条链产生切口的限制酶具有特异性。所述的尾是限制酶识别位点序列的上游且在扩增引物剩余部分在SDA过程中产生切口并被取代时起聚合酶再引发位点的作用。尾的再引发功能维持SDA反应并从单一靶分子合成多扩增子。尾的长度和序列一般并不关键且可以常规地选择和修饰。
本发明的一个实施方案基于给扩增引物赋予靶特异性的靶结合序列，其中应理解本发明中举例说明的靶结合序列还可以在各种其它方式中用于检测HSV。例如，本文公开的靶结合序列可选地在不进行预先扩增或在扩增后测定中用作直接检测HSV的杂交探针。这类杂交方法是本领域中众所周知的且一般使用与靶结合序列结合或连接的可检测标记以便有利于检测杂交。此外，表1和2中列出了含有通过大写和加下划线表示的靶结合序列的引物序列(分别为SEQ ID NOs：5-25和36-47)。这些靶结合序列可以用作不需要其它特异性序列的扩增反应(诸如PCR)中的引物或附加到用于NASBA、原位杂交、TMA、3SR、需要与引物的靶结合序列连接的RNA聚合酶启动子的其它基于转录的扩增引物合适的特异性序列上；或这些靶结合序列可以用作任意其它引物延伸扩增反应中的引物。这些在引物中需要特异性非靶结合序列的扩增方法对进行扩增反应而言是必不可少的且一般用于给靶物附加特异性序列。例如，限制酶识别位点对SDA中发生指数式扩增而言是必不可少的(参见美国专利US5,455,166和US5,270,184)。相反，用于自主序列复制(3SR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)的扩增引物包括接近5′末端的RNA聚合酶启动子(如Guatelli等，1990，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：1874-1878中所述的3SR测定)。该启动子附加在靶结合序列上且通过指导模板的多RNA拷贝的转录用于驱动扩增反应。用于选择的扩增反应的这类特异性序列与靶结合序列的连接是常规的且对本领域技术人员而言众所周知。
相反，诸如PCR这类在靶物末端上不需要特异性序列的扩增法一般使用仅由靶结合序列组成的扩增引物。为了在这些其它扩增方法中的检测目的，可以如本领域技术人员所理解的以检测方式标记引物。
因为核酸不需要完全的互补性以便退火，所以本领域技术人员理解可以在某种程度上修饰本文公开的探针和引物序列，而不会丧失作为HSV-1-和HSV-2-特异性引物和探针的用途。术语“同源性”指的是互补性程度。可以存在部分同源性或完全同源性，其中完全同源性等同于同一性。至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列被称作“基本上同源的”。可以使用杂交试验(例如DNA印迹或RNA印迹、溶液杂交等)在低严格条件下检验对完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上同源的序列或探针竞争和抑制完全同源序列或探针在低严格条件下与靶序列结合(即，杂交)。尽管如此，低严格条件还是不允许非特异性结合；低严格条件要求两种序列彼此的结合为特异性(即，选择性)相互作用。
正如本领域技术人员理解的，可以改变退火的严格性以便鉴定或检测相同或相关的多核苷酸序列。正如本领域技术人员进一步意识到的，可以根据本领域中公知的公式估计解链温度Tm，这取决于许多参数，诸如核苷酸编号中的引物或探针长度或退火缓冲液组分和条件(例如，参见T.Maniatis等《分子克隆：实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSnring Harbor，NY，1982和J.Sambrook等《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989；《最新分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Eds.F.M.Ausubel等第1卷，“DNA的制备与分析”(″Preparation and Analysis ofDNA″)，John Wiley和Sons，Inc.，1994-1995，增刊26，29，35和42；2.10.7-2.10.16页；G.M.Wahl和S.L.Berger(1987；《酶学方法》(Methods Enzymol.)152：399-407)；和A.R.Kimmel，1987；《酶学方法》(Methods of Enzymol.)152：507-511)。作为一般性指导，序列同源性每减少1％，则Tm降低大约1℃-1.5℃。温度范围可以在约50℃-62℃之间改变，但可以将扩增引物设计为在52℃下最佳。然而，低于50℃的温度可以导致引物缺乏特异性，而温度高于62℃则可能无法产生杂交。在设计扩增引物时，进一步考虑的是鸟嘌呤和胞嘧啶含量。一般来说，引物的GC含量可以约为60-70％，还可以低于该范围且可以由本领域技术人员适当调整。靶结合序列的杂交区可以具有约42℃-48℃的Tm。可以通过改变退火条件以提高或降低严格性(即，调整退火温度或缓冲液的盐含量)获得退火互补和部分互补的核酸序列。对公开序列的这类次要的修饰和维持HSV-1和HSV-2特异性的退火条件的任何必要调整仅需要进行常规实验且属于本领域普通技能的范围。
表1和2中分别将设计用于检测HSV-1和HSV-2靶序列的扩增引物标示为SEQ ID NOs：7-18和38-43。设计这些扩增引物，使得靶结合序列退火至高度同源共有糖蛋白G(US4)基因区的片段(参见图1-2和6-7)。给退火至HSV靶DNA序列或与之互补的扩增引物内的HSV靶结合序列区加下划线并以大写字母表示(参见表1和2)。SDA检测引物序列的剩余5′部分包括进行SDA反应所需的BsoBI限制酶识别位点(RERS)(如以小写字母斜体字表示)以及一般非靶特异性5′尾端序列。SEQ ID NOs：7-8和38的HSV-1和HSV-2扩增引物分别为左手(“第一种”)S1扩增引物且SEQ ID NOs：9-18和39-43分别为右手(“第二种”)S2扩增引物。为了扩增目的，可以单独(即，一个HSV-1左扩增引物和一个HSV-1右扩增引物)或以组合方式(即，一个HSV-1SDA左引物和两个HSV-1SDA右引物)使用HSV特异性类型的扩增引物对，使得在反应中至少存在一个左手与右手引物对。可以将多个扩增引物用于扩增靶序列的几个区。可以适当调整引物的浓度，使得当将HSV-1第一种扩增引物以500nM的浓度用作唯一的第一种扩增引物时，可以以结合方式使用两个HSV-1右扩增引物，它们各自具有的浓度为250nM。
术语“延伸产物”一般指的是通过使用酶，诸如聚合酶使引物或靶序列延伸产生的序列。在一个实施方案中，通过聚合酶，使用HSV靶序列作为模板使扩增引物杂交并使扩增引物延伸产生扩增引物延伸产物。
“缓冲引物”或“外部引物”是退火至扩增引物上游的靶序列的引物，使得缓冲引物的延伸取代了下游扩增引物及其延伸产物。本文所用的术语“缓冲引物”指的是包括HSV靶结合序列的多核苷酸。表1和2中分别将有用的缓冲引物标示为SEQ ID NOs：23-25和46-47。左或第一种HSV-1和HSV-2缓冲引物分别为SEQ ID NOs：23和46，而右或第二种HSV-1和HSV-2缓冲引物分别为SEQ ID NOs：24-25和47。缓冲引物来源于位于扩增引物侧翼的序列的保守区，所述的扩增引物位于充分接近该扩增引物靶结合位点的扩增引物上游位置，以便在缓冲引物延伸后取代扩增引物延伸产物。例如，SEQ ID NO：23(HSV1GGLB 1.0)的HSV-1第一种缓冲引物的5′末端位于HSV-1基因组序列的137，256位碱基上(图2)。SEQ ID NO：25(HSV1GGRB1.1)的HSV-1第二种缓冲引物的5′末端位于HSV-1基因组序列的137，382位碱基上(图2)。在SDA的初始循环过程中，缓冲引物与HSV靶序列杂交并通过聚合酶延伸取代下游扩增引物延伸产物，从而产生单链DNA，它可以进行进一步的复制和/或指数式扩增循环。
术语“测定探针”指的是用于有利于检测或鉴定核酸的任意核酸。例如，在本发明的一个实施方案中，测定探针用于检测或鉴定HSV核酸。如下所述的检测探针、检测引物、俘获探针和引物为测定探针的实例。
特别地，标记(labeled)或标记(tagged)用于检测和鉴定特异性HSV-类型的“检测探针”。检测探针的可检测标记为可以直接或间接检测的部分，表明存在靶核酸序列。为了直接检测，可以用放射性同位素标记测定或检测探针并通过放射自显影术检测或用荧光部分标记且通过如本领域中公知的荧光检测。另一方面，可以通过用能够进行检测的其它试剂标记间接检测测定探针。间接可检测标记包括：例如化学发光剂；产生可见或显色反应产物的酶；和配体-可检测标记的配体结合配偶体，其中可以通过与标记的配体特异性结合配偶体结合来检测配体(例如半抗原、抗体或抗原)。
为了检测扩增产物，可以如本领域公知的方式标记包括本文公开的靶结合序列的扩增引物，或可以将包括公开的靶结合序列的标记的检测引物与如美国专利US 5,547,861、US 5,928,869、US 5,593,867、US 5,550,025、US 5,935,791、US 5,888,739、US5,846,726中所述的扩增引物联合使用，以便对扩增进行实时均匀检测。这类检测引物可以包括直接或间接可检测序列，该序列开始不会与靶物杂交，而一旦与靶物杂交且得到延伸，则有利于检测引物的检测。例如，这类可检测序列可以为含有限制位点的序列或形成促使荧光团与猝灭剂部分彼此极接近的二级结构的序列，诸如，但不限于发夹和g-四集体序列或如本领域中公知的通过使其补体与标记的寡核苷酸(有时被称作报道探针)杂交而检测的直链序列。另一方面，可以实时或在扩增后通过使用嵌入染料或在扩增后通过使选自本文公开的任意靶结合序列的探针杂交来检测扩增产物，其中上述的任意靶结合序列属于选择的一组扩增引物。
末端和内部标记法是本领域中公知的且可以用于连接检测引物中相应位点上的供体和受体染料。5′-末端标记法的实例包括：a)5′-5′偶联核苷酸的高碘酸盐氧化作用，随后与含有胺的标记反应；b)乙二胺与5′-磷酸化多核苷酸缩合，随后与胺反应性标记反应；和c)在固相DNA合成中使用亚磷酸氨基己酯试剂引入脂族胺取代基，随后与胺反应性标记反应。还可以使用含特定的脂族胺的核苷酸亚磷酰胺试剂在特异性位置上将标记与合成的DNA寡核苷酸连接在一起。用于使选择的标记与检测引物连接并进行连接反应的合适方法的选择是本领域中常规的。
另一个实施方案使用与特异性靶序列杂交的检测引物，从而随检测的靶序列的不同导致多检测引物的必要性。然而，用于检测和鉴定具特异性HSV-类型的实施方案使用通用的检测系统，对其根据Nadeau等(1999)所述的实时SDA检测方法进行改变。通用的检测系统允许对众多测定使用同一对荧光检测引物，从而提供了诸如成本、时间和技术复杂性降低这样的几个优点。
“信号”或“连接”引物含有与HSV靶序列杂交的靶结合部分和一般的且不与HSV靶序列结合的尾部分。将连接引物与检测引物联合用于通用检测。检测引物与补体连接引物的尾部分(即，非靶结合序列)杂交。将信号或连接引物设计成与至少部分在第一种与第二种扩增引物之间的间插区内的靶序列区杂交，使得所述的信号或连接引物在扩增反应过程中被取代。具有SEQ ID NOs：19-22和44-45的HSV-1和HSV-2信号或连接引物分别如表1和2中所示。
检测探针可以为“通用检测引物”或带有以可检测方式标记的5′尾端部分和与补体连接引物尾序列结合的3′末端部分的“检测引物”。一般来说，检测引物的3′末端不含与HSV或内部扩增对照(IAC)靶序列具有任何显著互补性的序列。检测引物还带有5′末端上的限制酶识别位点。
简单地说，可以同时且在与用于扩增的SDA法相同的反应容器中使用这种通用检测系统。该通用检测系统包括靶物依赖性的延伸未标记的连接引物。连接引物包括HSV-1或HSV-2靶特异性3′序列和5′通用尾且分别以SEQ ID NOs：19-22和SEQ ID NOs：44-45及其补体为典型。连接引物与S1扩增引物下游的扩增HSV靶序列杂交。DNA聚合酶从连接引物和S1扩增引物的3′末端延伸，其中扩增引物的延伸取代了连接引物延伸产物。S2扩增引物退火至连接引物延伸产物。DNA聚合酶使S2扩增引物的3′末端延伸，产生包括连接引物延伸产物及其补体的双链分子，且该DNA聚合酶带有可产生切口的限制酶识别位点。产生切口指的是使DNA双链体中的两条链中仅一条的磷酸二酯键断裂。相应的限制酶使所述的双链分子在限制酶识别位点上产生切口，生成包括短的产生切口尾的5′部分和包括带长切口的补体连接引物延伸产物的3′部分。使用相应的限制酶，诸如BsoBI酶使限制酶位点产生切口并使链从产生切口的位点延伸取代了连接引物补体的单链拷贝。DNA聚合酶使产生切口尾的3′末端延伸，由此取代单链产生切口的补体连接引物延伸产物。可以通过SDA使S1扩增引物延伸产物和延伸的HSV靶序列进一步以指数方式扩增。然后由检测引物俘获取代的补体连接引物延伸产物，其中检测引物的3′末端退火至补体连接引物延伸产物的5′部分。检测引物包括可检测标记且检测靶序列。DNA聚合酶从检测引物和补体连接引物延伸产物的3′末端延伸导致发夹开放(如果存在)，产生包括检测引物延伸产物及其补体的双链检测分子。各链含有可切割的限制酶识别位点，它在被切割时使供体和猝灭剂染料分离，从而分离荧光团和猝灭剂部分并产生靶特异性荧光。由于分离而使猝灭剂不再能够抑制由荧光团发射的荧光。完全切割双链检测引物限制酶识别位点通过分离荧光团和猝灭剂而增加了荧光信号。
在本发明的实施方案中，可以标记检测引物以便使用荧光供体部分(或荧光团)和猝灭剂部分进行荧光检测，其中各部分位于限制酶识别位点侧翼。表1和2表示了具有SEQ ID NOs：30-35的检测引物序列。在通用检测中，用于检测靶序列的检测引物一般与连接引物结合使用。用供体染料罗丹明(ROX)和猝灭剂染料P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)标记的具有SEQ ID NOs：30-33的检测引物用于在本发明的实施方案中的HSV靶序列检测。本领域技术人员易于选择其它用于SDA的供体和猝灭剂染料对，使得猝灭剂染料足以吸收由供体染料发射的荧光。例如，易于通过在不同波长处的吸收检测和区分供体和猝灭剂染料。随供体和猝灭剂染料的不同，猝灭剂染料可以在一种情况中起猝灭剂的作用，而在另一种情况中起供体染料的作用。
在该实施方案中，SEQ ID NOs：30-35的检测引物带有由位于该检测引物5′末端上的限制酶识别位点分离的供体和猝灭剂对。此外，SEQ ID NO：30的检测引物带有包括位于供体与猝灭剂部分之间的发夹结构序列的序列，在供体与猝灭剂部分中，限制酶识别位点位于其中。发夹结构使两种染料彼此极接近，使得猝灭剂染料抑制供体染料发射的荧光。然而，SEQ ID NOs：31-35的检测引物带有两种染料之间的直链序列，它的长度足够短以便猝灭剂吸收由荧光团发射的任何荧光。
本领域中公知的许多供体/猝灭剂染料对可用于本发明的实施方案。它们包括，但不限于：荧光素(FAM；Glen Research；Sterling，VA)/罗丹明(ROXTM；Molecular Probes；Eugene，OR)；ROX/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYLTM；Glen Research)；FAM/DABCYL；异硫氰酸荧光素(FITC)/异硫氰酸四甲基罗丹明酯(TRITC)；FITC/Texas RedTM(Molecular Probes)；FITC/N-羟基琥珀酰亚氨基1-芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊红异硫氰酸酯(EITC)；N-羟基琥珀酰亚氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC；FITC/罗丹明X；和FITC/四甲基罗丹明(TAMRA)。对具体供体/猝灭剂对的选择并不关键。
然而，就能量传递猝灭机理而言，唯一必要的是供体荧光团的发射波长与猝灭剂的激发波长重叠，即，在两种染料之间必须有足够的光谱重叠以便进行有效的能量传递、电荷传递或荧光猝灭。ROX具有的EMmax＝608nm且FAM具有的EMmax为520nm。本领域技术人员有能力选择合适的供体和猝灭剂染料对。P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)是非荧光的猝灭剂染料，它可以有效地使来自相邻荧光团，例如FAM或5-(2′-氨乙基)氨基萘(EDANS)的荧光猝灭。某些供体/猝灭剂对以本说明书公开的为典型；不过，其它供体/猝灭剂对对于本领域技术人员而言显而易见且也可以用于本发明。在本发明检测引物中产生荧光猝灭的任意染料对适用于本发明的方法，而与猝灭发生的机理无关。其它猝灭剂的非限制性实例包括Black Hole QuencherTM(Biosearch Technologies，Inc.；Novato，CA)和IowaBlackTM(Integrated DNA Technologies，Inc.；Corralville，IA)。
在核酸扩增反应过程中测定荧光以监测特异性扩增产物的蓄积。荧光信号与产生的特异性扩增子的量成正比。在有HSV靶核酸序列存在下，荧光增加。在没有靶物存在下，荧光在整个反应中持续保持低水平。荧光增加或基本改变的荧光衰减分别表明存在或不存在HSV靶序列。
一般在一段时间内测定样品的荧光以确定样品是否含有HSV DNA。在一个实施方案中，可以经过1小时的时间监测通过60次的荧光。简单地说，约每分钟采集一次有关在样品容器内测定的荧光量、校正值(如果必要)和每栏的校准值的数据。可以使用根据图曲线下的面积表示结果的″MOTA″(非加速度量(Metric Other Than Acceleration))法分析数据。该图测定了通过次数(X-轴)与相对荧光单位(Y-轴)(参见图3)。MOTA面积越大，则产生的荧光越多且对扩增产物的检测越有效。
另一个实施方案使用如图4中所示的阈值后通过次数(PassesAfter Threshold)(PAT)算法且特别研发用于BD ProbeTecTM ET系统。与MOTA类似，PAT得分越高，表明SDA反应越有效。当使用PAT算法时，将荧光强度的背景校正的信号通过预定的阈值时的时间定为T3(“时间-阈值”)。该图还测定了通过次数与相对荧光单位的关系。相同的T3阈值用于每份样品。PAT得分等于60减去T3值。阴性样品没有这到荧光的最低阈值且由此将PAT值定为0。阳性样品具有的PAT值大于0，优选在1-60，更优选在40-55，这取决于测定和靶物水平。较低的T 3得分和相应较高的PAT的值与更有效的SDA相关。PAT算法仅使用最能够再现的扩增曲线的区。作为结果，PAT算法使孔或样品之间可辨别的差异减小到最低限度且比其它检测物之间的比较法更为精确。PAT可以通过BD ProbeTecTM ET系统自动进行。BDProbeTecTM ET打印输出提供了PAT得分和可报告的结果。
在另一个实施方案中，可以将“内部扩增对照”(″IAC″)引入本发明的方法以验证阴性结果并鉴定可能抑制的样本或有利于样品中生物体载荷，诸如，但不限于病毒、细菌和真菌的定量。就诊断应用而言，同时扩增和检测两种不同的DNA序列，即，HSV靶序列和IAC靶序列能够利用IAC。“IAC靶序列”或“IAC序列”与HSV靶序列相似，但SEQ ID NOs：26-27和SEQ ID NOs：48-49的IAC靶序列与HSV-1和HSV-2靶序列相比错配了约5-10个碱基。这些修饰的碱基足以使IAC连接引物特异性退火。
“IAC连接引物”与信号或连接引物所起的作用类似，但IAC连接引物与“IAC靶序列”或“IAC序列”通过IAC靶结合序列杂交。IAC连接引物还带有含有不与IAC靶序列杂交的一般序列的5′尾部分。而检测引物可以与IAC连接引物补体的尾部分杂交。用于HSV-1和HSV-2SDA测定的IAC连接引物可以分别选自SEQ ID NOs：28-29和50-51且可用于IAC靶序列的扩增。位于IAC连接引物3′末端的IAC靶结合序列与HSV靶序列非常不同，从而使HSV-1或HSV-2连接引物不杂交或不干扰IAC靶序列的扩增。在表1和2中，用加下划线的小写字母表示位于IAC连接引物3′末端上的IAC靶结合序列。IAC连接引物可用于验证阴性结果和监测抑制反应的样本。就定量SDA而言，在IAC与天然靶序列之间竞争限速试剂也可能是有用的(Nadeau等，1999《生物化学分析》(Anal.Biochem.)276：177-187).
本发明的检测引物可以用于检测HSV靶序列或I AC靶序列。然而，在本发明的一个实施方案中，用于检测HSV-1或HSV-2靶序列的检测引物为SEQ ID NOs：30-33的那些序列。用于检测IAC靶序列的检测引物为选自SEQ ID NOs：34-35的那些序列，其中供体和猝灭剂染料对分别为荧光素(FAM)和DABCYL且在本文中被称作“IAC检测引物”。本领域技术人员有能力选择带有标记的合适的检测引物，使得对IAC靶序列的鉴定不同于对HSV-1或HSV-2靶序列的鉴定。因此，可以交换用于检测HSV靶序列和IAC靶序列的检测引物，从而使SEQ ID NOs：30-33的检测引物可以用于检测IAC靶序列且SEQ ID NOs：34-35的检测引物可以用于检测HSV靶序列。
本发明的另一个实施方案涉及在高流通量过程中同时测定多个样品。样品包括，但不限于那些采集自脑脊髓液(CSF)、生殖器损害、口腔损害、粘膜损害、眼部样本、皮肤样本、直肠拭子、阴道拭子、阴道分泌物、尿、外周血白细胞和组织(诸如来自脑活检)的样品。可以在平板、载玻片、孔、平皿、珠、颗粒、杯、束、小片和条带中检测样品。在一个实施方案中，在96微孔平板中按照与用于BD ProbeTecTMET CT/GC扩增的DNA测定一致的形式实施方法。该方法在干燥的微孔中进行，其中干燥的组合物包括所有的引物和探针，这些引物和探针对进行用于同时测定多个样品的HSV-1或HSV-2的SDA检测而言必不可少。
可以在溶液中或在固相上按照本发明方法实施检测存在的选择的靶序列的测定。一般在溶液中进行实时或终点均匀测定，其中检测核酸起引物的作用。还可以在溶液中进行使用本发明检测引物的杂交测定(例如，作为均匀实时测定)，而且特别适合于用于靶物的实时或终点检测的固相测定。在固相测定中，可以使用本领域中公知的方法通过内部或末端标记将检测寡核苷酸固定在固相(例如珠、膜或反应容器)上。例如，可以将生物素标记的检测寡核苷酸固定在抗生物素蛋白修饰的固相上，其中它在合适的杂交条件下接触靶物时将产生荧光改变。按照这种方式俘获靶物有利于从样品中分离靶物并能够除去样品中可能干扰测定信号或其它方面的物质。
将用于检测和鉴定HSV-1靶序列的引物和探针列在表1中。给特异性HSV靶结合序列加下划线并用大写字母表示，而用小写的斜体字表示限制酶内切核酸酶位点。就IAC连接引物而言，用加下划线的小写字母表示IAC靶结合序列。以5′→3′方向列出所有引物。
表1
表1
将用于检测和鉴定HSV-2靶序列的引物和探针列在表2中。
表2
表2
基于通过分析各种菌株的HSV基因的糖蛋白G(US4)序列区产生的共有序列设计本发明的核酸引物(参见附图1和6；表1和2)。还显示了用于SDA和通用检测方法的缓冲引物、连接引物和检测引物。设计的HSV-1引物特异性扩增在如表4中举例说明的所有菌株中识别的HSV-1靶序列。设计HSV-2引物以便特异性扩增在如表7中举例说明的所有菌株中识别的HSV-2靶序列。由于HSV-1与HSV-2靶序列之间的同源性约为90％，谨慎设计所述引物以便在HSV-1与HSV-2之间进行特异性区分。本发明还关注基本上与靶结合序列同源的序列和含有这类表1和2中所列的基本上同源的靶结合序列的引物。
在本发明的一个实施方案中，HSV-1靶区首先选自具有152,261个碱基长度的人HSV-1菌株17的完整HSV-1基因组序列(NCBI登记号X14112)。糖蛋白“US4”基因位于136,744-137,460位碱基之间。HSV-1左缓冲引物(HSV1LB1.0)(5′末端)位于137,256位核酸上。HSV-1右缓冲引物(HSV1RB1.1)(5′末端)位于137,382位核酸上。用于所有HSV-1SDA系统的引物均位于这些缓冲引物坐标内。
本发明的另一个实施方案涉及具有154,746个碱基长度的人HSV-2菌株HG52HSV-1的完整HSV-2基因组序列(NCBI登记号Z86099)。糖蛋白“US4”基因位于137,878-139,977位碱基之间。HSV-2左缓冲引物(HSV2LB1.0)(5′末端)位于139,773位上。HSV-2右缓冲引物(HSV2RB1.0)(5′末端)位于139896位上。用于所有HSV-2SDA系统的引物均位于这些缓冲引物坐标内。
设计PCR扩增引物用于将HSV靶DNA克隆入质粒载体。SEQ ID NOs：5-6和SEQ ID NOs：36-37的HSV-1和HSV-2PCR扩增引物分别与HSV基因组的高度保守的靶序列区互补。PCR扩增引物扩增包括HSV糖蛋白G(US4)基因的DNA片段的HSV靶序列区。将含有HSV靶区的单纯疱疹病毒(HSV)基因组的扩增片段定向克隆入含有便利限制酶位点的质粒载体。尽管可以如本领域技术人员所理解的将HSV片段克隆入任意质粒载体，但是在本发明的一个实施方案中，使用对选择的HSV靶区具有特异性的PCR扩增引物将扩增的HSV-1和HSV-2片段分别克隆入大肠杆菌质粒载体pUC 19(Genbank/EMBL登记号L09137)和pUC18(Genbank/EMBL登记号L09136)。HSV片段被称作HSV靶贮备物。可以使用双链DNA定量测定(Molecular Probes，Inc.)对靶HSV DNA进行定量。在用于扩增反应时，表1和2中所列引物名称中存在的“L”或“R”分别表示“左”或“右”引物。
在本发明的一个实施方案中，PCR扩增引物SEQ ID NOs：5-6和36-37最初分别扩增HSV-1和HSV-2基因的糖蛋白G基因的152和254个碱基对片段。各自分别设计带有EcoRI限制酶位点的SEQ ID NOs：5和36的HSV-1和HSV-2左PCR引物。SEQ ID NOs：6和37的HSV-1和HSV-2右PCR引物各自分别带有BamHI限制酶位点。然后将该片段定位克隆入pUC质粒载体。典型的质粒载体分别为带有限制酶位点EcoRI和BamHI的HSV-1和HSV-2的pUC19和pUC18。在通过限制酶消化进行纯化和线性化后，使用HSV扩增引物和缓冲引物以指数方式扩增HSV靶片段。
本发明的靶结合序列和引物可用于核酸扩增。在一个实施方案中，所述引物特别可用于链置换扩增(SDA)。这是一种等温核酸扩增法，其中引物的延伸、半修饰的限制酶识别/切割位点的产生切口、单链延伸产物的取代、引物退火至延伸产物(或原始靶序列)和随后的引物延伸在反应混合物中同时发生。此外，SDA使得靶序列复制在15分钟以内超过了1010倍。而在PCR中，反应步骤在单独期或循环中出现作为反应中循环变温的结果。主要如本文和Walker等(1992，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci USA.)USA 89：392-396和1992，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)20：1691-1696)所述的常规SDA法进行耐热链置换扩增(tSDA)，其中取代了热稳定性聚合酶和热稳定性限制酶。可以将温度调节至适合于取代的酶的较高温度。
检测HSV扩增产物或扩增的靶序列的可选方法可以通过用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳检测特征大小来进行，其中用溴化乙锭染色琼脂糖。还可以通过定量杂交或分子生物学领域普通技术人员公知的用于核酸检测的等同技术(Sambrook等《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring，NY(1989))检测使用HSV-1或HSV-2扩增引物产生的扩增产物。
表1和2中所列引物可用于检测和鉴定样品中的HSV-1和HSV-2。本文所用的S1和S2扩增引物分别代表了第一种和第二种扩增引物，而B1和B2缓冲引物分别代表了第一种和第二种缓冲引物。简单地说，在SDA法中，S1扩增引物与单链HSV靶序列杂交。恰在S1扩增引物的上游或5′，第一种缓冲引物B1与单链HSV靶序列杂交。DNA聚合酶使B1缓冲引物和S1扩增引物的3′末端延伸，其中B1缓冲引物的延伸最终取代了S1SDA延伸产物。S1SDA延伸产物被S2扩增引物和在S2扩增引物上游退火的B2缓冲引物俘获。DNA聚合酶使S2SDA和B2缓冲引物的3′末端延伸，其中B2缓冲引物的延伸取代了下游S2SDA延伸产物。S1扩增引物退火至取代的S 2扩增引物延伸产物且DNA聚合酶使杂交的S1扩增引物的3′末端延伸，产生带有S 2扩增引物延伸产物及其补体链的双链分子。各链在任一端上带有可产生切口的限制酶识别位点。在添加相应的限制酶时，使含有硫醇化胞嘧啶的修饰的DNA链产生切口，形成短的带切口尾和切口位点的长延伸产物3′。DNA聚合酶使短的带切口尾从该短的带切口尾的3′末端以5′→3′方向延伸，从而取代单链长延伸产物。简单地说，S2扩增引物延伸产物的带切口的尾及其补体的带切口的尾分别取代单链带切口的S2扩增引物延伸产物和单链带切口的补体S2扩增引物延伸产物。在一个实施方案中，BsoBI酶用于使分别带有SEQ ID NOs：52-53和54-55序列的各链产生切口并切割或切断它们。将如下所示的切口位点引入扩增引物序列且需要半-硫代磷酸化识别序列(dCsTP，硫醇化胞嘧啶)。尽管具有切口位点，SEQ ID NO：53甚至在有dCsTP存在下也易于进行双链切割且并非设计可产生切口的扩增引物中的优选序列。
切口位点：5′-CTCGGG-3′(SEQ ID NO：52)和5′-CCCGGG-3′(SEQ
ID NO：53)
切断位点：5′-CTCGAG-3′(SEQ ID NO：54)和5′-CCCGAG-3′(SEQ
ID NO：55)
在本发明的另一个实施方案中，检测探针可用于检测HSV靶序列。可以使用对HSV靶序列具有特异性的S1扩增引物和检测引物，其中所述的检测引物带有HSV靶结合序列。DNA聚合酶从S1引物和检测引物的3′末端延伸。S1引物的延伸取代下游检测引物延伸产物进入溶液，它在其中被俘获并与互补S2扩增引物杂交。DNA聚合酶使S2扩增引物的3′末端延伸并打开检测引物的二级结构，形成双链限制酶位点并使两种染料(荧光团和猝灭剂对)分离至使猝灭剂失去猝灭能力并产生荧光的距离。通过切割限制酶识别位点并进一步分离荧光团和猝灭剂产生附加荧光。
可用于SDA法的酶为在半-硫代磷酸硫代化识别序列内产生单链切口的那些酶，其中引入硫代磷酸化核苷酸不会防止产生切口和修复的进一步循环。具有这些特征的酶的非限制性实例包括：HincII、BsoBI、Aval、NciI和Fnu4HI。有用的DNA聚合酶为这类聚合酶，它们在单链切口位点上启动DNA合成、将硫代磷酸化核苷酸引入延伸的核酸链并取代没有5′→3′外切核酸酶活性的链。切割指的是打断双链或单链DNA的磷酸二酯键。表现出这些特征的DNA聚合酶的非限制性实例包括外切核酸酶缺损克列诺片段和Bst聚合酶和Bca聚合酶的外切核酸酶缺损片段。尽管其它DNA聚合酶和限制酶适合于SDA(Walker等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，第89卷，392-396页，1992年1月，Applied Biological Sciences)，但是因它们的热特性和彼此的相容性而选择exo-Bst聚合酶和BsoBI。在本发明的一个实施方案中，使用BsoBI限制性内切核酸酶识别位点并以斜体字标明(参见，表1和2)。显而易见的是，可以单独使用HSV靶结合序列以扩增不需要特异性序列或结构的反应(例如，PCR)中的HSV靶物，且非SDA的扩增反应所要求的其它特异性序列(例如，RNA聚合酶启动子)可以在系统中例如取代本文所述的含RERS的序列。
然后在有单独或与缓冲引物组合形式的扩增引物、用于通用检测的信号/连接引物和通用检测引物存在下可以扩增靶贮备物。为了进行扩增反应，选择包括一个“左”扩增引物的至少一对且选择一个“右”扩增引物来扩增HSV靶贮备序列的各链。在SDA反应中，除左和右扩增引物外，开始还使用一个左和右缓冲引物对。此外，为了进行检测，选择信号/连接引物和检测引物并用于检测和鉴定HSV靶序列。
特异性扩增和检测HSV-1或HSV-2DNA的几种HSV系统包括在本发明中。例如，HSV-1系统可以包括下列引物：HSV1GGLP1.1、HSV1GGRP5.2、HSVIGGAD2.1、HSV1GGLB1.0、HSV1GGRB1.1和TBD16(D/R)；或可以选择HSV1GGLP1.1、HSV1GGRP5.2、HSV1GGAD3.0或HSVIGGAD3.1、HSV1GGLB1.0、HSV1GGRB1.1、MPC.DR、HSV1IAC AD8.1或HSV1IACAD8.7、MPC2.FD。在另一个实施方案中，将使用引物的各种组合的HSV-2系统列在表3中。关注引物的其它组合，不过，本领域技术人员有能力将所述引物组合以检测样品中的HSV-1或HSV-2。所述的引物可以选自表1和2中所列的那些且在按照统计学设计的实验中测试以便鉴定样品中的HSV-1或HSV-2。另一方面，对HSV-1或HSV-2具有特异性且基本上与表1和2中所列的那些同源的引物也可以用于检测HSV-1或HSV-2靶序列。
为了商业上的便利性，可以以试剂盒的形式包装用于特异性检测和鉴定核酸的扩增引物。一般来说，这类试剂盒含有至少一个HSV扩增引物对。用于进行核酸扩增反应的试剂也可以包括在靶特异性扩增引物中，例如，缓冲剂、其它引物、核苷酸三磷酸、酶等。可以将试剂盒的成分共同包装在普通容器内，其中任选包括用于实施本发明方法的具体实施方案的技术说明书。试剂盒中还可以包括其它任选的成分，例如用适合于用作测定探针的标记标记的引物和/或用于检测所述标记的试剂或用具。
在本发明的一个实施方案中，提供了包括第一种扩增引物或S1SDA扩增引物和第二种扩增引物或S2SDA扩增引物的试剂盒。该试剂盒可以进一步包括：第一种B1缓冲引物和第二种B2缓冲引物；连接引物；检测引物；和任选用于同时检测内部扩增对照(IAC)靶序列，包括IAC连接引物和IAC靶序列的试剂。该试剂盒可以由对HSV-1或HSV-2具有特异性的引物组成或该试剂盒可以由定向于HSV-1和HSV-2的引物组成，其中本领域技术人员能够理解检测和鉴定HSV-1的扩增反应使用了HSV-1引物且检测和鉴定HSV-2的扩增反应使用了HSV-2引物。为了鉴定样品中是否含有HSV-1或HSV-2DNA，不应将用于HSV-1和HSV-2的引物混合。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒和引物可以用于检测和诊断临床样品是否含有HSV-1或HSV-2DNA。可以使用SDA扩增引物扩增和检测临床样品或可以将该临床样品用于进一步包括缓冲引物、连接引物和检测引物的SDA反应。在本发明的一个实施方案中，除用于HSV-1或HSV-2的阳性对照和阴性对照外，还可以将I AC连接引物用作反应的内部扩增对照。本领域技术人员能够从阅读本文的描述和从本领域中的一般方法和技术中理解如何制备和使用所述引物检测和鉴定样品中的HSV-1和HSV-2。
此外，在一个商业化实施方案中，可以将包括本发明引物和用于SDA的试剂的组合物制成干燥或液体形式。该组合物在于燥形式下更为稳定和易于操作。可以将干燥的组合物加入或预处理至固相中，诸如微量滴定板、微阵列或其它合适的贮器，其中仅需要加入样品和SDA缓冲液。这种方式有利于同时测定多个样品并用于高流通量方法。在本发明的一个实施方案中，可以使用BD ProbeTecTM ET仪。
可以理解由靶结合序列和任选选择的扩增反应所需的序列或选择的检测反应所需的序列组成的本发明核酸还可以包括用作间隔区、接头、用于标记或结合酶或其它应用的序列的某些其它序列。一般已知这类其它序列对在选择的反应中获得核酸的最佳功能是必不可少的。
将本文引述的所有专利、专利申请、公开的PCT申请和文章、书籍、参考文献、参考手册和摘要的全部内容引入本文作为参考，以便更完整地描述本发明涉及的科学发展动态。
因为可以在不脱离本发明范围和实质的情况下对上述主题做出各种改变，所以将上述描述中包含或在所附权利要求中定义的所有主题解释为对本发明的描述和说明。能够根据上述教导对本发明做出许多修改和改变。
图1表示1型单纯疱疹病毒(HSV-1)的糖蛋白G(US4)基因的共有序列(SEQ ID NO：1)。
图2是表示HSV-1靶区(SEQ ID NO：2)基因组序列的一部分和用于对HSV-1DNA的特异性检测的引物、缓冲物和连接物的位置的图。
图3是表示结果的″MOTA″表达的示意图。
图4是表示用于BD ProbeTecTMET系统的″PAT″算法的示意图。
图5描绘了SDA法对各种HSV-1株稀释液的分析灵敏度。
图6是2型单纯疱疹病毒(HSV-2)的糖蛋白G(US4)基因片段的共有序列(SEQ ID NO：3)。
图7是表示HSV-2靶区(SEQ ID NO：4)的基因组序列和用于对HSV-2DNA的特异性检测的引物、缓冲物和连接物的位置的图。
发明详述
本发明提供了分离和纯化的核酸、多核苷酸、扩增引物和在核酸扩增反应中表现出单纯疱疹病毒(HSV)类型特异性的测定探针。本发明还提供了使用本发明的探针和引物检测和鉴定HSV核酸的方法。
本发明的一个实施方案涉及检测靶核酸序列存在的扩增方法，其中使用含有靶结合序列的一种或多种扩增引物、产生扩增的靶序列和检测该靶序列。扩增方法的非限制性实例包括：聚合酶链反应(PCR；参见Saiki等1985《科学》(Science)230：1350-1354，引入本文作为参考)；连接酶链反应(LCR；参见Wu等1989《基因组》(Genomics)4：560-569；Barringer等1990《基因》(Gene)89：117-122；Barany，1991《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：189-193，将所有这些文献引入本文作为参考)；原位杂交；转录介导的扩增(TMA；参见Kwoh等1989《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：1173-1177，引入本文作为参考)；自动维持序列扩增(3SR；参见Guatelli等1990《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：1874-1878，引入本文作为参考)；滚环扩增(RCA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；Qβ复制酶系统(Lizardi等1988《生物技术》(BioTechnology)6：1197-1202，引入本文作为参考)和链置换扩增(SDA；参见Walker等1992《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：392-396；Walker等1992《核酸研究》(Nuc.Acids.Res.)20：1691-1696；和EP 0497272，将所有这些文献引入本文作为参考))，包括耐热SDA(tSDA)。
本发明的另一个实施方案涉及通过使HSV靶序列以指数式扩增检测样品中存在的HSV核酸序列的等温链置换扩增(SDA)法。在另一个实施方案中，如美国专利US 5,648,211中所述在约52℃下，使用如US5,919,630、US5,928,869、US5,958,700和US6,261,785所述为在扩增过程中检测靶物而选择的检测引物进行SDA，将所有这些文献的内容引入本文作为参考。作为用于SDA的典型，将试剂、引物、诸如限制酶和聚合酶这类酶和其它成分加入到反应微孔、容器或贮器中。SDA扩增来自样品的特异性DNA序列，其中一旦所有成分彼此混合，则反应持续至关键成分耗尽。与聚合酶链反应(PCR)相反，SDA是一种等温反应过程，使得一旦反应开始，则在反应进程中没有外部控制。
本发明的SDA法需要至少两种HSV扩增引物和两种缓冲引物以启动扩增法。将所述的扩增引物设计成对HSV-1或HSV-2具有高度特异性。SDA法包括在混合物中同时进行的扩增反应且不需要用于循环变温的作为PCR扩增法中必不可少的单独的期或循环。本发明SDA的另一个优点在于指数式扩增。DNA聚合酶延伸、产生切口、置换和切口位点再生的步骤产生了取代的单链分子，这些分子在末端上带有循环且被扩增引物俘获的部分限制酶位点(例如BsoBI位点)，由此使HSV靶序列以指数方式扩增。SDA法还提供了改善的工作流程，尤其用于高流通量法。可以将SDA引入基于微阵列的应用，其中可以将小量体积(纳升)的样品和试剂用于扩增HSV靶DNA并通过在单一平台上进行多次SDA测定检测微嵌片阵列上的扩增产物。用于检测样品中的HSV的SDA法的主要优点在于最低的劳动需求量和高流通量的可能性，因为等温扩增法在所述平台设计和维护方面提供了显著少的技术挑战。
本文所用的术语“靶物”或“靶序列”指的是有待扩增和检测的HSV核酸序列、HSV-1或HSV-2。它们包括有待扩增的原始HSV核酸序列、有待扩增的原始HSV核酸序列的互补第二条链和通过扩增反应产生的原始HSV序列的拷贝链。这些拷贝用作可扩增靶物，因为它们含有扩增引物退火至的序列拷贝。扩增反应过程中产生的靶序列拷贝被称作扩增产物、扩增引物或扩增子。HSV-1和HSV-2靶序列位于HSV-1和HSV-2基因组序列的糖蛋白G(US4)基因内。HSV-1靶序列位于附图1的共有序列的555位-680位碱基之间。HSV-2靶序列位于附图6的共有序列的867位-990位碱基之间。糖蛋白G(US4)基因分别位于附图2和7的HSV-1基因组序列的136744-137460位之间和HSV-2基因组序列的137878-139977位之间。
本文所用的“扩增引物”是退火至靶序列且可以通过扩增延伸的引物。结合靶序列的扩增引物区为靶结合序列。扩增技术包括，但不限于：链置换扩增(SDA)，包括耐热SDA(tSDA)；聚合酶链反应(PCR)；连接酶链反应(LCR)；原位杂交；自动维持序列扩增(3SR)；滚环扩增(RCA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；和转录介导的扩增(TMA)。
在一个实施方案中，扩增引物可以用于链置换扩增(SDA)法。扩增引物包括3′末端上结合HSV靶序列的靶结合序列部分和5′末端上不结合或退火至靶序列的部分。不结合靶序列的SDA扩增引物的部分还如美国专利US 5,455,166和US 5,270,184中所述包括尾和靶结合序列上游的限制酶的识别位点，将所述文献引入本文作为参考。当该识别位点如Walker等(1992《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：392-396和1992《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)20：1691-1696)中所述被半修饰时，这一识别位点对使DNA双链体的一条链产生切口的限制酶具有特异性。所述的尾是限制酶识别位点序列的上游且在扩增引物剩余部分在SDA过程中产生切口并被取代时起聚合酶再引发位点的作用。尾的再引发功能维持SDA反应并从单一靶分子合成多扩增子。尾的长度和序列一般并不关键且可以常规地选择和修饰。
本发明的一个实施方案基于给扩增引物赋予靶特异性的靶结合序列，其中应理解本发明中举例说明的靶结合序列还可以在各种其它方式中用于检测HSV。例如，本文公开的靶结合序列可选地在不进行预先扩增或在扩增后测定中用作直接检测HSV的杂交探针。这类杂交方法是本领域中众所周知的且一般使用与靶结合序列结合或连接的可检测标记以便有利于检测杂交。此外，表1和2中列出了含有通过大写和加下划线表示的靶结合序列的引物序列(分别为SEQ ID NOs：5-25和36-47)。这些靶结合序列可以用作不需要其它特异性序列的扩增反应(诸如PCR)中的引物或附加到用于NASBA、原位杂交、TMA、3SR、需要与引物的靶结合序列连接的RNA聚合酶启动子的其它基于转录的扩增引物合适的特异性序列上；或这些靶结合序列可以用作任意其它引物延伸扩增反应中的引物。这些在引物中需要特异性非靶结合序列的扩增方法对进行扩增反应而言是必不可少的且一般用于给靶物附加特异性序列。例如，限制酶识别位点对SDA中发生指数式扩增而言是必不可少的(参见美国专利US5,455,166和US5,270,184)。相反，用于自主序列复制(3SR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)的扩增引物包括接近5′末端的RNA聚合酶启动子(如Guatelli等，1990，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：1874-1878中所述的3SR测定)。该启动子附加在靶结合序列上且通过指导模板的多RNA拷贝的转录用于驱动扩增反应。用于选择的扩增反应的这类特异性序列与靶结合序列的连接是常规的且对本领域技术人员而言众所周知。
相反，诸如PCR这类在靶物末端上不需要特异性序列的扩增法一般使用仅由靶结合序列组成的扩增引物。为了在这些其它扩增方法中的检测目的，可以如本领域技术人员所理解的以检测方式标记引物。
因为核酸不需要完全的互补性以便退火，所以本领域技术人员理解可以在某种程度上修饰本文公开的探针和引物序列，而不会丧失作为HSV-1-和HSV-2-特异性引物和探针的用途。术语“同源性”指的是互补性程度。可以存在部分同源性或完全同源性，其中完全同源性等同于同一性。至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列被称作“基本上同源的”。可以使用杂交试验(例如DNA印迹或RNA印迹、溶液杂交等)在低严格条件下检验对完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上同源的序列或探针竞争和抑制完全同源序列或探针在低严格条件下与靶序列结合(即，杂交)。尽管如此，低严格条件还是不允许非特异性结合；低严格条件要求两种序列彼此的结合为特异性(即，选择性)相互作用。
正如本领域技术人员理解的，可以改变退火的严格性以便鉴定或检测相同或相关的多核苷酸序列。正如本领域技术人员进一步意识到的，可以根据本领域中公知的公式估计解链温度Tm，这取决于许多参数，诸如核苷酸编号中的引物或探针长度或退火缓冲液组分和条件(例如，参见T.Maniatis等《分子克隆：实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSnring Harbor，NY，1982和J.Sambrook等《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989；《最新分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Eds.F.M.Ausubel等第1卷，“DNA的制备与分析”(″Preparation and Analysis ofDNA″)，John Wiley和Sons，Inc.，1994-1995，增刊26，29，35和42；2.10.7-2.10.16页；G.M.Wahl和S.L.Berger(1987；《酶学方法》(Methods Enzymol.)152：399-407)；和A.R.Kimmel，1987；《酶学方法》(Methods of Enzymol.)152：507-511)。作为一般性指导，序列同源性每减少1％，则Tm降低大约1℃-1.5℃。温度范围可以在约50℃-62℃之间改变，但可以将扩增引物设计为在52℃下最佳。然而，低于50℃的温度可以导致引物缺乏特异性，而温度高于62℃则可能无法产生杂交。在设计扩增引物时，进一步考虑的是鸟嘌呤和胞嘧啶含量。一般来说，引物的GC含量可以约为60-70％，还可以低于该范围且可以由本领域技术人员适当调整。靶结合序列的杂交区可以具有约42℃-48℃的Tm。可以通过改变退火条件以提高或降低严格性(即，调整退火温度或缓冲液的盐含量)获得退火互补和部分互补的核酸序列。对公开序列的这类次要的修饰和维持HSV-1和HSV-2特异性的退火条件的任何必要调整仅需要进行常规实验且属于本领域普通技能的范围。
表1和2中分别将设计用于检测HSV-1和HSV-2靶序列的扩增引物标示为SEQ ID NOs：7-18和38-43。设计这些扩增引物，使得靶结合序列退火至高度同源共有糖蛋白G(US4)基因区的片段(参见图1-2和6-7)。给退火至HSV靶DNA序列或与之互补的扩增引物内的HSV靶结合序列区加下划线并以大写字母表示(参见表1和2)。SDA检测引物序列的剩余5′部分包括进行SDA反应所需的BsoBI限制酶识别位点(RERS)(如以小写字母斜体字表示)以及一般非靶特异性5′尾端序列。SEQ ID NOs：7-8和38的HSV-1和HSV-2扩增引物分别为左手(“第一种”)S1扩增引物且SEQ ID NOs：9-18和39-43分别为右手(“第二种”)S2扩增引物。为了扩增目的，可以单独(即，一个HSV-1左扩增引物和一个HSV-1右扩增引物)或以组合方式(即，一个HSV-1SDA左引物和两个HSV-1SDA右引物)使用HSV特异性类型的扩增引物对，使得在反应中至少存在一个左手与右手引物对。可以将多个扩增引物用于扩增靶序列的几个区。可以适当调整引物的浓度，使得当将HSV-1第一种扩增引物以500nM的浓度用作唯一的第一种扩增引物时，可以以结合方式使用两个HSV-1右扩增引物，它们各自具有的浓度为250nM。
术语“延伸产物”一般指的是通过使用酶，诸如聚合酶使引物或靶序列延伸产生的序列。在一个实施方案中，通过聚合酶，使用HSV靶序列作为模板使扩增引物杂交并使扩增引物延伸产生扩增引物延伸产物。
“缓冲引物”或“外部引物”是退火至扩增引物上游的靶序列的引物，使得缓冲引物的延伸取代了下游扩增引物及其延伸产物。本文所用的术语“缓冲引物”指的是包括HSV靶结合序列的多核苷酸。表1和2中分别将有用的缓冲引物标示为SEQ ID NOs：23-25和46-47。左或第一种HSV-1和HSV-2缓冲引物分别为SEQ ID NOs：23和46，而右或第二种HSV-1和HSV-2缓冲引物分别为SEQ ID NOs：24-25和47。缓冲引物来源于位于扩增引物侧翼的序列的保守区，所述的扩增引物位于充分接近该扩增引物靶结合位点的扩增引物上游位置，以便在缓冲引物延伸后取代扩增引物延伸产物。例如，SEQ ID NO：23(HSV1GGLB 1.0)的HSV-1第一种缓冲引物的5′末端位于HSV-1基因组序列的137，256位碱基上(图2)。SEQ ID NO：25(HSV1GGRB1.1)的HSV-1第二种缓冲引物的5′末端位于HSV-1基因组序列的137，382位碱基上(图2)。在SDA的初始循环过程中，缓冲引物与HSV靶序列杂交并通过聚合酶延伸取代下游扩增引物延伸产物，从而产生单链DNA，它可以进行进一步的复制和/或指数式扩增循环。
术语“测定探针”指的是用于有利于检测或鉴定核酸的任意核酸。例如，在本发明的一个实施方案中，测定探针用于检测或鉴定HSV核酸。如下所述的检测探针、检测引物、俘获探针和引物为测定探针的实例。
特别地，标记(labeled)或标记(tagged)用于检测和鉴定特异性HSV-类型的“检测探针”。检测探针的可检测标记为可以直接或间接检测的部分，表明存在靶核酸序列。为了直接检测，可以用放射性同位素标记测定或检测探针并通过放射自显影术检测或用荧光部分标记且通过如本领域中公知的荧光检测。另一方面，可以通过用能够进行检测的其它试剂标记间接检测测定探针。间接可检测标记包括：例如化学发光剂；产生可见或显色反应产物的酶；和配体-可检测标记的配体结合配偶体，其中可以通过与标记的配体特异性结合配偶体结合来检测配体(例如半抗原、抗体或抗原)。
为了检测扩增产物，可以如本领域公知的方式标记包括本文公开的靶结合序列的扩增引物，或可以将包括公开的靶结合序列的标记的检测引物与如美国专利US 5,547,861、US 5,928,869、US 5,593,867、US 5,550,025、US 5,935,791、US 5,888,739、US5,846,726中所述的扩增引物联合使用，以便对扩增进行实时均匀检测。这类检测引物可以包括直接或间接可检测序列，该序列开始不会与靶物杂交，而一旦与靶物杂交且得到延伸，则有利于检测引物的检测。例如，这类可检测序列可以为含有限制位点的序列或形成促使荧光团与猝灭剂部分彼此极接近的二级结构的序列，诸如，但不限于发夹和g-四集体序列或如本领域中公知的通过使其补体与标记的寡核苷酸(有时被称作报道探针)杂交而检测的直链序列。另一方面，可以实时或在扩增后通过使用嵌入染料或在扩增后通过使选自本文公开的任意靶结合序列的探针杂交来检测扩增产物，其中上述的任意靶结合序列属于选择的一组扩增引物。
末端和内部标记法是本领域中公知的且可以用于连接检测引物中相应位点上的供体和受体染料。5′-末端标记法的实例包括：a)5′-5′偶联核苷酸的高碘酸盐氧化作用，随后与含有胺的标记反应；b)乙二胺与5′-磷酸化多核苷酸缩合，随后与胺反应性标记反应；和c)在固相DNA合成中使用亚磷酸氨基己酯试剂引入脂族胺取代基，随后与胺反应性标记反应。还可以使用含特定的脂族胺的核苷酸亚磷酰胺试剂在特异性位置上将标记与合成的DNA寡核苷酸连接在一起。用于使选择的标记与检测引物连接并进行连接反应的合适方法的选择是本领域中常规的。
另一个实施方案使用与特异性靶序列杂交的检测引物，从而随检测的靶序列的不同导致多检测引物的必要性。然而，用于检测和鉴定具特异性HSV-类型的实施方案使用通用的检测系统，对其根据Nadeau等(1999)所述的实时SDA检测方法进行改变。通用的检测系统允许对众多测定使用同一对荧光检测引物，从而提供了诸如成本、时间和技术复杂性降低这样的几个优点。
“信号”或“连接”引物含有与HSV靶序列杂交的靶结合部分和一般的且不与HSV靶序列结合的尾部分。将连接引物与检测引物联合用于通用检测。检测引物与补体连接引物的尾部分(即，非靶结合序列)杂交。将信号或连接引物设计成与至少部分在第一种与第二种扩增引物之间的间插区内的靶序列区杂交，使得所述的信号或连接引物在扩增反应过程中被取代。具有SEQ ID NOs：19-22和44-45的HSV-1和HSV-2信号或连接引物分别如表1和2中所示。
检测探针可以为“通用检测引物”或带有以可检测方式标记的5′尾端部分和与补体连接引物尾序列结合的3′末端部分的“检测引物”。一般来说，检测引物的3′末端不含与HSV或内部扩增对照(IAC)靶序列具有任何显著互补性的序列。检测引物还带有5′末端上的限制酶识别位点。
简单地说，可以同时且在与用于扩增的SDA法相同的反应容器中使用这种通用检测系统。该通用检测系统包括靶物依赖性的延伸未标记的连接引物。连接引物包括HSV-1或HSV-2靶特异性3′序列和5′通用尾且分别以SEQ ID NOs：19-22和SEQ ID NOs：44-45及其补体为典型。连接引物与S1扩增引物下游的扩增HSV靶序列杂交。DNA聚合酶从连接引物和S1扩增引物的3′末端延伸，其中扩增引物的延伸取代了连接引物延伸产物。S2扩增引物退火至连接引物延伸产物。DNA聚合酶使S2扩增引物的3′末端延伸，产生包括连接引物延伸产物及其补体的双链分子，且该DNA聚合酶带有可产生切口的限制酶识别位点。产生切口指的是使DNA双链体中的两条链中仅一条的磷酸二酯键断裂。相应的限制酶使所述的双链分子在限制酶识别位点上产生切口，生成包括短的产生切口尾的5′部分和包括带长切口的补体连接引物延伸产物的3′部分。使用相应的限制酶，诸如BsoBI酶使限制酶位点产生切口并使链从产生切口的位点延伸取代了连接引物补体的单链拷贝。DNA聚合酶使产生切口尾的3′末端延伸，由此取代单链产生切口的补体连接引物延伸产物。可以通过SDA使S1扩增引物延伸产物和延伸的HSV靶序列进一步以指数方式扩增。然后由检测引物俘获取代的补体连接引物延伸产物，其中检测引物的3′末端退火至补体连接引物延伸产物的5′部分。检测引物包括可检测标记且检测靶序列。DNA聚合酶从检测引物和补体连接引物延伸产物的3′末端延伸导致发夹开放(如果存在)，产生包括检测引物延伸产物及其补体的双链检测分子。各链含有可切割的限制酶识别位点，它在被切割时使供体和猝灭剂染料分离，从而分离荧光团和猝灭剂部分并产生靶特异性荧光。由于分离而使猝灭剂不再能够抑制由荧光团发射的荧光。完全切割双链检测引物限制酶识别位点通过分离荧光团和猝灭剂而增加了荧光信号。
在本发明的实施方案中，可以标记检测引物以便使用荧光供体部分(或荧光团)和猝灭剂部分进行荧光检测，其中各部分位于限制酶识别位点侧翼。表1和2表示了具有SEQ ID NOs：30-35的检测引物序列。在通用检测中，用于检测靶序列的检测引物一般与连接引物结合使用。用供体染料罗丹明(ROX)和猝灭剂染料P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)标记的具有SEQ ID NOs：30-33的检测引物用于在本发明的实施方案中的HSV靶序列检测。本领域技术人员易于选择其它用于SDA的供体和猝灭剂染料对，使得猝灭剂染料足以吸收由供体染料发射的荧光。例如，易于通过在不同波长处的吸收检测和区分供体和猝灭剂染料。随供体和猝灭剂染料的不同，猝灭剂染料可以在一种情况中起猝灭剂的作用，而在另一种情况中起供体染料的作用。
在该实施方案中，SEQ ID NOs：30-35的检测引物带有由位于该检测引物5′末端上的限制酶识别位点分离的供体和猝灭剂对。此外，SEQ ID NO：30的检测引物带有包括位于供体与猝灭剂部分之间的发夹结构序列的序列，在供体与猝灭剂部分中，限制酶识别位点位于其中。发夹结构使两种染料彼此极接近，使得猝灭剂染料抑制供体染料发射的荧光。然而，SEQ ID NOs：31-35的检测引物带有两种染料之间的直链序列，它的长度足够短以便猝灭剂吸收由荧光团发射的任何荧光。
本领域中公知的许多供体/猝灭剂染料对可用于本发明的实施方案。它们包括，但不限于：荧光素(FAM；Glen Research；Sterling，VA)/罗丹明(ROXTM；Molecular Probes；Eugene，OR)；ROX/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYLTM；Glen Research)；FAM/DABCYL；异硫氰酸荧光素(FITC)/异硫氰酸四甲基罗丹明酯(TRITC)；FITC/Texas RedTM(Molecular Probes)；FITC/N-羟基琥珀酰亚氨基1-芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊红异硫氰酸酯(EITC)；N-羟基琥珀酰亚氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC；FITC/罗丹明X；和FITC/四甲基罗丹明(TAMRA)。对具体供体/猝灭剂对的选择并不关键。
然而，就能量传递猝灭机理而言，唯一必要的是供体荧光团的发射波长与猝灭剂的激发波长重叠，即，在两种染料之间必须有足够的光谱重叠以便进行有效的能量传递、电荷传递或荧光猝灭。ROX具有的EMmax＝608nm且FAM具有的EMmax为520nm。本领域技术人员有能力选择合适的供体和猝灭剂染料对。P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)是非荧光的猝灭剂染料，它可以有效地使来自相邻荧光团，例如FAM或5-(2′-氨乙基)氨基萘(EDANS)的荧光猝灭。某些供体/猝灭剂对以本说明书公开的为典型；不过，其它供体/猝灭剂对对于本领域技术人员而言显而易见且也可以用于本发明。在本发明检测引物中产生荧光猝灭的任意染料对适用于本发明的方法，而与猝灭发生的机理无关。其它猝灭剂的非限制性实例包括Black Hole QuencherTM(Biosearch Technologies，Inc.；Novato，CA)和IowaBlackTM(Integrated DNA Technologies，Inc.；Corralville，IA)。
在核酸扩增反应过程中测定荧光以监测特异性扩增产物的蓄积。荧光信号与产生的特异性扩增子的量成正比。在有HSV靶核酸序列存在下，荧光增加。在没有靶物存在下，荧光在整个反应中持续保持低水平。荧光增加或基本改变的荧光衰减分别表明存在或不存在HSV靶序列。
一般在一段时间内测定样品的荧光以确定样品是否含有HSV DNA。在一个实施方案中，可以经过1小时的时间监测通过60次的荧光。简单地说，约每分钟采集一次有关在样品容器内测定的荧光量、校正值(如果必要)和每栏的校准值的数据。可以使用根据图曲线下的面积表示结果的″MOTA″(非加速度量(Metric Other Than Acceleration))法分析数据。该图测定了通过次数(X-轴)与相对荧光单位(Y-轴)(参见图3)。MOTA面积越大，则产生的荧光越多且对扩增产物的检测越有效。
另一个实施方案使用如图4中所示的阈值后通过次数(PassesAfter Threshold)(PAT)算法且特别研发用于BD ProbeTecTM ET系统。与MOTA类似，PAT得分越高，表明SDA反应越有效。当使用PAT算法时，将荧光强度的背景校正的信号通过预定的阈值时的时间定为T3(“时间-阈值”)。该图还测定了通过次数与相对荧光单位的关系。相同的T3阈值用于每份样品。PAT得分等于60减去T3值。阴性样品没有这到荧光的最低阈值且由此将PAT值定为0。阳性样品具有的PAT值大于0，优选在1-60，更优选在40-55，这取决于测定和靶物水平。较低的T 3得分和相应较高的PAT的值与更有效的SDA相关。PAT算法仅使用最能够再现的扩增曲线的区。作为结果，PAT算法使孔或样品之间可辨别的差异减小到最低限度且比其它检测物之间的比较法更为精确。PAT可以通过BD ProbeTecTM ET系统自动进行。BDProbeTecTM ET打印输出提供了PAT得分和可报告的结果。
在另一个实施方案中，可以将“内部扩增对照”(″IAC″)引入本发明的方法以验证阴性结果并鉴定可能抑制的样本或有利于样品中生物体载荷，诸如，但不限于病毒、细菌和真菌的定量。就诊断应用而言，同时扩增和检测两种不同的DNA序列，即，HSV靶序列和IAC靶序列能够利用IAC。“IAC靶序列”或“IAC序列”与HSV靶序列相似，但SEQ ID NOs：26-27和SEQ ID NOs：48-49的IAC靶序列与HSV-1和HSV-2靶序列相比错配了约5-10个碱基。这些修饰的碱基足以使IAC连接引物特异性退火。
“IAC连接引物”与信号或连接引物所起的作用类似，但IAC连接引物与“IAC靶序列”或“IAC序列”通过IAC靶结合序列杂交。IAC连接引物还带有含有不与IAC靶序列杂交的一般序列的5′尾部分。而检测引物可以与IAC连接引物补体的尾部分杂交。用于HSV-1和HSV-2SDA测定的IAC连接引物可以分别选自SEQ ID NOs：28-29和50-51且可用于IAC靶序列的扩增。位于IAC连接引物3′末端的IAC靶结合序列与HSV靶序列非常不同，从而使HSV-1或HSV-2连接引物不杂交或不干扰IAC靶序列的扩增。在表1和2中，用加下划线的小写字母表示位于IAC连接引物3′末端上的IAC靶结合序列。IAC连接引物可用于验证阴性结果和监测抑制反应的样本。就定量SDA而言，在IAC与天然靶序列之间竞争限速试剂也可能是有用的(Nadeau等，1999《生物化学分析》(Anal.Biochem.)276：177-187).
本发明的检测引物可以用于检测HSV靶序列或I AC靶序列。然而，在本发明的一个实施方案中，用于检测HSV-1或HSV-2靶序列的检测引物为SEQ ID NOs：30-33的那些序列。用于检测IAC靶序列的检测引物为选自SEQ ID NOs：34-35的那些序列，其中供体和猝灭剂染料对分别为荧光素(FAM)和DABCYL且在本文中被称作“IAC检测引物”。本领域技术人员有能力选择带有标记的合适的检测引物，使得对IAC靶序列的鉴定不同于对HSV-1或HSV-2靶序列的鉴定。因此，可以交换用于检测HSV靶序列和IAC靶序列的检测引物，从而使SEQ ID NOs：30-33的检测引物可以用于检测IAC靶序列且SEQ ID NOs：34-35的检测引物可以用于检测HSV靶序列。
本发明的另一个实施方案涉及在高流通量过程中同时测定多个样品。样品包括，但不限于那些采集自脑脊髓液(CSF)、生殖器损害、口腔损害、粘膜损害、眼部样本、皮肤样本、直肠拭子、阴道拭子、阴道分泌物、尿、外周血白细胞和组织(诸如来自脑活检)的样品。可以在平板、载玻片、孔、平皿、珠、颗粒、杯、束、小片和条带中检测样品。在一个实施方案中，在96微孔平板中按照与用于BD ProbeTecTMET CT/GC扩增的DNA测定一致的形式实施方法。该方法在干燥的微孔中进行，其中干燥的组合物包括所有的引物和探针，这些引物和探针对进行用于同时测定多个样品的HSV-1或HSV-2的SDA检测而言必不可少。
可以在溶液中或在固相上按照本发明方法实施检测存在的选择的靶序列的测定。一般在溶液中进行实时或终点均匀测定，其中检测核酸起引物的作用。还可以在溶液中进行使用本发明检测引物的杂交测定(例如，作为均匀实时测定)，而且特别适合于用于靶物的实时或终点检测的固相测定。在固相测定中，可以使用本领域中公知的方法通过内部或末端标记将检测寡核苷酸固定在固相(例如珠、膜或反应容器)上。例如，可以将生物素标记的检测寡核苷酸固定在抗生物素蛋白修饰的固相上，其中它在合适的杂交条件下接触靶物时将产生荧光改变。按照这种方式俘获靶物有利于从样品中分离靶物并能够除去样品中可能干扰测定信号或其它方面的物质。
将用于检测和鉴定HSV-1靶序列的引物和探针列在表1中。给特异性HSV靶结合序列加下划线并用大写字母表示，而用小写的斜体字表示限制酶内切核酸酶位点。就IAC连接引物而言，用加下划线的小写字母表示IAC靶结合序列。以5′→3′方向列出所有引物。
表1
表1
将用于检测和鉴定HSV-2靶序列的引物和探针列在表2中。
表2
表2
基于通过分析各种菌株的HSV基因的糖蛋白G(US4)序列区产生的共有序列设计本发明的核酸引物(参见附图1和6；表1和2)。还显示了用于SDA和通用检测方法的缓冲引物、连接引物和检测引物。设计的HSV-1引物特异性扩增在如表4中举例说明的所有菌株中识别的HSV-1靶序列。设计HSV-2引物以便特异性扩增在如表7中举例说明的所有菌株中识别的HSV-2靶序列。由于HSV-1与HSV-2靶序列之间的同源性约为90％，谨慎设计所述引物以便在HSV-1与HSV-2之间进行特异性区分。本发明还关注基本上与靶结合序列同源的序列和含有这类表1和2中所列的基本上同源的靶结合序列的引物。
在本发明的一个实施方案中，HSV-1靶区首先选自具有152,261个碱基长度的人HSV-1菌株17的完整HSV-1基因组序列(NCBI登记号X14112)。糖蛋白“US4”基因位于136,744-137,460位碱基之间。HSV-1左缓冲引物(HSV1LB1.0)(5′末端)位于137,256位核酸上。HSV-1右缓冲引物(HSV1RB1.1)(5′末端)位于137,382位核酸上。用于所有HSV-1SDA系统的引物均位于这些缓冲引物坐标内。
本发明的另一个实施方案涉及具有154,746个碱基长度的人HSV-2菌株HG52HSV-1的完整HSV-2基因组序列(NCBI登记号Z86099)。糖蛋白“US4”基因位于137,878-139,977位碱基之间。HSV-2左缓冲引物(HSV2LB1.0)(5′末端)位于139,773位上。HSV-2右缓冲引物(HSV2RB1.0)(5′末端)位于139896位上。用于所有HSV-2SDA系统的引物均位于这些缓冲引物坐标内。
设计PCR扩增引物用于将HSV靶DNA克隆入质粒载体。SEQ ID NOs：5-6和SEQ ID NOs：36-37的HSV-1和HSV-2PCR扩增引物分别与HSV基因组的高度保守的靶序列区互补。PCR扩增引物扩增包括HSV糖蛋白G(US4)基因的DNA片段的HSV靶序列区。将含有HSV靶区的单纯疱疹病毒(HSV)基因组的扩增片段定向克隆入含有便利限制酶位点的质粒载体。尽管可以如本领域技术人员所理解的将HSV片段克隆入任意质粒载体，但是在本发明的一个实施方案中，使用对选择的HSV靶区具有特异性的PCR扩增引物将扩增的HSV-1和HSV-2片段分别克隆入大肠杆菌质粒载体pUC 19(Genbank/EMBL登记号L09137)和pUC18(Genbank/EMBL登记号L09136)。HSV片段被称作HSV靶贮备物。可以使用双链DNA定量测定(Molecular Probes，Inc.)对靶HSV DNA进行定量。在用于扩增反应时，表1和2中所列引物名称中存在的“L”或“R”分别表示“左”或“右”引物。
在本发明的一个实施方案中，PCR扩增引物SEQ ID NOs：5-6和36-37最初分别扩增HSV-1和HSV-2基因的糖蛋白G基因的152和254个碱基对片段。各自分别设计带有EcoRI限制酶位点的SEQ ID NOs：5和36的HSV-1和HSV-2左PCR引物。SEQ ID NOs：6和37的HSV-1和HSV-2右PCR引物各自分别带有BamHI限制酶位点。然后将该片段定位克隆入pUC质粒载体。典型的质粒载体分别为带有限制酶位点EcoRI和BamHI的HSV-1和HSV-2的pUC19和pUC18。在通过限制酶消化进行纯化和线性化后，使用HSV扩增引物和缓冲引物以指数方式扩增HSV靶片段。
本发明的靶结合序列和引物可用于核酸扩增。在一个实施方案中，所述引物特别可用于链置换扩增(SDA)。这是一种等温核酸扩增法，其中引物的延伸、半修饰的限制酶识别/切割位点的产生切口、单链延伸产物的取代、引物退火至延伸产物(或原始靶序列)和随后的引物延伸在反应混合物中同时发生。此外，SDA使得靶序列复制在15分钟以内超过了1010倍。而在PCR中，反应步骤在单独期或循环中出现作为反应中循环变温的结果。主要如本文和Walker等(1992，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci USA.)USA 89：392-396和1992，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)20：1691-1696)所述的常规SDA法进行耐热链置换扩增(tSDA)，其中取代了热稳定性聚合酶和热稳定性限制酶。可以将温度调节至适合于取代的酶的较高温度。
检测HSV扩增产物或扩增的靶序列的可选方法可以通过用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳检测特征大小来进行，其中用溴化乙锭染色琼脂糖。还可以通过定量杂交或分子生物学领域普通技术人员公知的用于核酸检测的等同技术(Sambrook等《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring，NY(1989))检测使用HSV-1或HSV-2扩增引物产生的扩增产物。
表1和2中所列引物可用于检测和鉴定样品中的HSV-1和HSV-2。本文所用的S1和S2扩增引物分别代表了第一种和第二种扩增引物，而B1和B2缓冲引物分别代表了第一种和第二种缓冲引物。简单地说，在SDA法中，S1扩增引物与单链HSV靶序列杂交。恰在S1扩增引物的上游或5′，第一种缓冲引物B1与单链HSV靶序列杂交。DNA聚合酶使B1缓冲引物和S1扩增引物的3′末端延伸，其中B1缓冲引物的延伸最终取代了S1SDA延伸产物。S1SDA延伸产物被S2扩增引物和在S2扩增引物上游退火的B2缓冲引物俘获。DNA聚合酶使S2SDA和B2缓冲引物的3′末端延伸，其中B2缓冲引物的延伸取代了下游S2SDA延伸产物。S1扩增引物退火至取代的S 2扩增引物延伸产物且DNA聚合酶使杂交的S1扩增引物的3′末端延伸，产生带有S 2扩增引物延伸产物及其补体链的双链分子。各链在任一端上带有可产生切口的限制酶识别位点。在添加相应的限制酶时，使含有硫醇化胞嘧啶的修饰的DNA链产生切口，形成短的带切口尾和切口位点的长延伸产物3′。DNA聚合酶使短的带切口尾从该短的带切口尾的3′末端以5′→3′方向延伸，从而取代单链长延伸产物。简单地说，S2扩增引物延伸产物的带切口的尾及其补体的带切口的尾分别取代单链带切口的S2扩增引物延伸产物和单链带切口的补体S2扩增引物延伸产物。在一个实施方案中，BsoBI酶用于使分别带有SEQ ID NOs：52-53和54-55序列的各链产生切口并切割或切断它们。将如下所示的切口位点引入扩增引物序列且需要半-硫代磷酸化识别序列(dCsTP，硫醇化胞嘧啶)。尽管具有切口位点，SEQ ID NO：53甚至在有dCsTP存在下也易于进行双链切割且并非设计可产生切口的扩增引物中的优选序列。
切口位点：5′-CTCGGG-3′(SEQ ID NO：52)和5′-CCCGGG-3′(SEQ
ID NO：53)
切断位点：5′-CTCGAG-3′(SEQ ID NO：54)和5′-CCCGAG-3′(SEQ
ID NO：55)
在本发明的另一个实施方案中，检测探针可用于检测HSV靶序列。可以使用对HSV靶序列具有特异性的S1扩增引物和检测引物，其中所述的检测引物带有HSV靶结合序列。DNA聚合酶从S1引物和检测引物的3′末端延伸。S1引物的延伸取代下游检测引物延伸产物进入溶液，它在其中被俘获并与互补S2扩增引物杂交。DNA聚合酶使S2扩增引物的3′末端延伸并打开检测引物的二级结构，形成双链限制酶位点并使两种染料(荧光团和猝灭剂对)分离至使猝灭剂失去猝灭能力并产生荧光的距离。通过切割限制酶识别位点并进一步分离荧光团和猝灭剂产生附加荧光。
可用于SDA法的酶为在半-硫代磷酸硫代化识别序列内产生单链切口的那些酶，其中引入硫代磷酸化核苷酸不会防止产生切口和修复的进一步循环。具有这些特征的酶的非限制性实例包括：HincII、BsoBI、Aval、NciI和Fnu4HI。有用的DNA聚合酶为这类聚合酶，它们在单链切口位点上启动DNA合成、将硫代磷酸化核苷酸引入延伸的核酸链并取代没有5′→3′外切核酸酶活性的链。切割指的是打断双链或单链DNA的磷酸二酯键。表现出这些特征的DNA聚合酶的非限制性实例包括外切核酸酶缺损克列诺片段和Bst聚合酶和Bca聚合酶的外切核酸酶缺损片段。尽管其它DNA聚合酶和限制酶适合于SDA(Walker等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，第89卷，392-396页，1992年1月，Applied Biological Sciences)，但是因它们的热特性和彼此的相容性而选择exo-Bst聚合酶和BsoBI。在本发明的一个实施方案中，使用BsoBI限制性内切核酸酶识别位点并以斜体字标明(参见，表1和2)。显而易见的是，可以单独使用HSV靶结合序列以扩增不需要特异性序列或结构的反应(例如，PCR)中的HSV靶物，且非SDA的扩增反应所要求的其它特异性序列(例如，RNA聚合酶启动子)可以在系统中例如取代本文所述的含RERS的序列。
然后在有单独或与缓冲引物组合形式的扩增引物、用于通用检测的信号/连接引物和通用检测引物存在下可以扩增靶贮备物。为了进行扩增反应，选择包括一个“左”扩增引物的至少一对且选择一个“右”扩增引物来扩增HSV靶贮备序列的各链。在SDA反应中，除左和右扩增引物外，开始还使用一个左和右缓冲引物对。此外，为了进行检测，选择信号/连接引物和检测引物并用于检测和鉴定HSV靶序列。
特异性扩增和检测HSV-1或HSV-2DNA的几种HSV系统包括在本发明中。例如，HSV-1系统可以包括下列引物：HSV1GGLP1.1、HSV1GGRP5.2、HSVIGGAD2.1、HSV1GGLB1.0、HSV1GGRB1.1和TBD16(D/R)；或可以选择HSV1GGLP1.1、HSV1GGRP5.2、HSV1GGAD3.0或HSVIGGAD3.1、HSV1GGLB1.0、HSV1GGRB1.1、MPC.DR、HSV1IAC AD8.1或HSV1IACAD8.7、MPC2.FD。在另一个实施方案中，将使用引物的各种组合的HSV-2系统列在表3中。关注引物的其它组合，不过，本领域技术人员有能力将所述引物组合以检测样品中的HSV-1或HSV-2。所述的引物可以选自表1和2中所列的那些且在按照统计学设计的实验中测试以便鉴定样品中的HSV-1或HSV-2。另一方面，对HSV-1或HSV-2具有特异性且基本上与表1和2中所列的那些同源的引物也可以用于检测HSV-1或HSV-2靶序列。
为了商业上的便利性，可以以试剂盒的形式包装用于特异性检测和鉴定核酸的扩增引物。一般来说，这类试剂盒含有至少一个HSV扩增引物对。用于进行核酸扩增反应的试剂也可以包括在靶特异性扩增引物中，例如，缓冲剂、其它引物、核苷酸三磷酸、酶等。可以将试剂盒的成分共同包装在普通容器内，其中任选包括用于实施本发明方法的具体实施方案的技术说明书。试剂盒中还可以包括其它任选的成分，例如用适合于用作测定探针的标记标记的引物和/或用于检测所述标记的试剂或用具。
在本发明的一个实施方案中，提供了包括第一种扩增引物或S1SDA扩增引物和第二种扩增引物或S2SDA扩增引物的试剂盒。该试剂盒可以进一步包括：第一种B1缓冲引物和第二种B2缓冲引物；连接引物；检测引物；和任选用于同时检测内部扩增对照(IAC)靶序列，包括IAC连接引物和IAC靶序列的试剂。该试剂盒可以由对HSV-1或HSV-2具有特异性的引物组成或该试剂盒可以由定向于HSV-1和HSV-2的引物组成，其中本领域技术人员能够理解检测和鉴定HSV-1的扩增反应使用了HSV-1引物且检测和鉴定HSV-2的扩增反应使用了HSV-2引物。为了鉴定样品中是否含有HSV-1或HSV-2DNA，不应将用于HSV-1和HSV-2的引物混合。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒和引物可以用于检测和诊断临床样品是否含有HSV-1或HSV-2DNA。可以使用SDA扩增引物扩增和检测临床样品或可以将该临床样品用于进一步包括缓冲引物、连接引物和检测引物的SDA反应。在本发明的一个实施方案中，除用于HSV-1或HSV-2的阳性对照和阴性对照外，还可以将I AC连接引物用作反应的内部扩增对照。本领域技术人员能够从阅读本文的描述和从本领域中的一般方法和技术中理解如何制备和使用所述引物检测和鉴定样品中的HSV-1和HSV-2。
此外，在一个商业化实施方案中，可以将包括本发明引物和用于SDA的试剂的组合物制成干燥或液体形式。该组合物在于燥形式下更为稳定和易于操作。可以将干燥的组合物加入或预处理至固相中，诸如微量滴定板、微阵列或其它合适的贮器，其中仅需要加入样品和SDA缓冲液。这种方式有利于同时测定多个样品并用于高流通量方法。在本发明的一个实施方案中，可以使用BD ProbeTecTM ET仪。
可以理解由靶结合序列和任选选择的扩增反应所需的序列或选择的检测反应所需的序列组成的本发明核酸还可以包括用作间隔区、接头、用于标记或结合酶或其它应用的序列的某些其它序列。一般已知这类其它序列对在选择的反应中获得核酸的最佳功能是必不可少的。
将本文引述的所有专利、专利申请、公开的PCT申请和文章、书籍、参考文献、参考手册和摘要的全部内容引入本文作为参考，以便更完整地描述本发明涉及的科学发展动态。
因为可以在不脱离本发明范围和实质的情况下对上述主题做出各种改变，所以将上述描述中包含或在所附权利要求中定义的所有主题解释为对本发明的描述和说明。能够根据上述教导对本发明做出许多修改和改变。
具体实施方式
本文的实施例旨在以典型实例说明实施本发明的不同方面且不以任何方式来限定本发明的范围。这些实施例不包括对所用常规方法的详细描述，诸如构建载体或将cDNA插入这类载体的常规方法。这类方法对本领域技术人员而言是众所周知的且描述在大量出版物中，例如J.Sambrook和D.W.Russell《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：a Laboratory Manual)第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，USA，(2001)。
实施例1
HSV-1糖蛋白-G链置换扩增靶区的克隆
使用表1中鉴定的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的PCR扩增引物对来自HSV-1(菌株ATCC：VR-539)的DNA进行PCR。
设计这些引物以便扩增HSV-1的糖蛋白G(US4)基因内的152个碱基对片段。将PCR扩增的DNA插入pUC 19质粒载体(Gibco BRL；GrandIsland，NY)。将该重组克隆命名为HSVIGG质粒#1。纯化质粒#1DNA并通过用BamHI限制酶消化使其线性化。然后使用QIAquick(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)自旋柱纯化DNA并通过用荧光试剂分析进行定量。在含有10ng/μl人DNA的水中制备用于将要进行的实验的靶HSV-1DNA稀释液。特异性HSV-1菌株稀释液和在每种稀释液中的HSV-1检测结果如图5中所示。“+”号表示样品中存在HSV-1；“-”号表示样品中不存在HSV-1；且问号表示样品中可疑的污染物。所有菌株在1∶10的储备溶液稀释液下呈阳性，但不包括样品O-2526。在1∶1,000的储备溶液稀释液下，23种菌株中的20种呈阳性。在1∶100,000的储备溶液稀释液下，23种菌株中的15种呈阳性。
实施例2
克隆的HSV-1DNA的扩增
作为用于检测HSV-1DNA的测定中的起始步骤，使用实施例1中所述的靶核酸法研发用于扩增HSV-1DNA的SDA系统。使用克隆的质粒稀释液评价DNA扩增测定中的分析灵敏度。在每一靶水平下进行8次重复的SDA反应。这8次反应等同于每次反应中双链DNA的100、50、25、12.5、6.25和0个拷贝。如下进行扩增：在52℃下，使用BD ProbeTecTM ET仪(BD Diagnostic Systems；Sparks，MD)与各50nM的HSV1GGLB1.0和HSV1GGRB1.0缓冲引物、100nM的HSV1GGLP1.0左扩增引物、500nM HSV1GGRP1.0右扩增引物、250nM HSV1GGAD1.0连接引物、500nM TBD10.2D/R检测引物。将这些引物的序列列在表1中。最终缓冲液条件如下：143mM N-二(羟乙基)甘氨酸；82mM KOH；25mM KiPO4；12.5％DMSO；5mM乙酸镁；500mM 2′-脱氧胞嘧啶-5-o-(1-硫代三磷酸)(dCsTP)；各100nM的dATP、dGTP和dTTP；100ng/μl BSA；约12个单位的Bst聚合酶；和约30个单位的BsoBI限制性内切核酸酶。
监测1小时内通过60次的荧光。根据曲线下的面积或“MOTA”得分表示结果。易于通过常规实验测定阳性MOTA得分。就本发明的目的而言，将MOTA得分大于或等于3500视为“阳性”。测定产生100％阳性结果时的HSV 1GG靶DNA的最低水平为100个拷贝/反应。在50个拷贝的靶DNA/反应下，8次重复申有7次(87.5％)也呈阳性。
实施例3
通过SDA检测1型单纯疱疹病毒粒子
为了验证本发明引物和探针检测HSV-1的能力，对获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)的4株HSV-1、获自QuestDiagnostic(Baltimore，MD)的10株和来自俄亥俄州立大学(OSU)的14份未分型的HSV样品进行SDA。
HSV的未分型株的特征在于通过PCR扩增了DNA聚合酶基因的区。设计一组扩增HSV-1和HSV-2中相同区的扩增引物。两种类型的病毒可通过在HSV-2PCR片段中存在Apal限制性内切核酸酶识别位点，而HSV-2PCR片段在由HSV-1株产生的PCR产物中不存在加以区分。当与Apal限制酶一起保温时，将HSV-2-衍生的扩增产物切割成两个较短的片段，而获自HSV-1的那些扩增产物保持完整。使用琼脂糖凝胶电泳与合适的对照品分离限制酶切片段。
用于评价SDA系统中存在或不存在HSV的病毒储备液的浓度是未知的。按1∶10在磷酸盐缓冲盐水中稀释病毒储备液并通过SDA测试10μL该混悬液。结果如表4中所示。使用HSV-1扩增引物检测所有HSV-1株，证实了所公开的引物和探针检测来自各种不同来源的HSV-1株的能力。在通过Apal限制酶切消化分型的HSV中的预先未分型的14株中，经测定9株为HSV-1，4株为HSV-2且1株未通过PCR扩增(参见表4和5)。
实施例4
SDA法的分析灵敏度
为了使用本发明公开的引物和探针测定HSV-1测定法的检测极限，对克隆的靶核酸的稀释液和病毒粒子的连续稀释液进行SDA反应。通过电子显微镜检查法(Electron Microscopy Bioservices)对病毒粒子储备液进行计数。在每一靶水平下重复测试16份样品。
为了验证本测定法的灵敏度和特异性，在1∶10、1∶1,000和1∶100,000的生物体储备溶液稀释液下测试来自不同地域位置的23株HSV-1。来自预先未分型株的和来自Quest Diagnostics的样品滴度是未知的。来自ATCC的两种HSV-1储备溶液的滴度近似如下：VR260，1.5×104TCID/μL；和VR-539，2.0×105TCID/μl。结果如图5中所示。所有菌株在1∶10的储备混悬液稀释液下呈阳性，但不包括菌株#0-2526。在23株中，20株在1∶1000储备溶液稀释液下测试呈阳性，且15株在1∶100,000稀释液下测试呈阳性。
实施例5
用于HSV-1DNA的SDA特异性
用HSV1GG SDA系统测试HSV-2中的16株。每次反应各加入10微升HSV-2稀释液混悬液。使用HSV1GG系统测试17种储备溶液之一呈阳性。结果如表5中所示。此外，使用本发明公开方法的引物和探针测试23种其它微生物。这些微生物包括临床样本中可能遇到的细菌、酵母和其它病毒。经测试，这些生物体中没有一种呈HSV-1的阳性。结果如表6中所示。
*临床19通过Quest被分型为HSV-2而通过ApaI分析被分型为HSV-1。
ATCC-美国典型培养物保藏中心；ABi-Advanced Biotechnologies，Inc.
实施例6
HSV-2糖蛋白-G SDA靶区的克隆
使用引物HSV2PCRR和HSV2PCRL与69℃的退火温度对来自HSV-2株ATCC VR-540的DNA进行PCR。这些引物扩增了HSV-2的糖蛋白G(US4)基因内的254个碱基对片段。将扩增的DNA插入pUC18质粒载体(Invitrogen)。该重组克隆称作pHSV2-NT#9-1。纯化质粒DNA并通过用BamHI限制酶消化使其线性化。使用QIAGEN QIAquick自旋柱纯化DNA并通过使用荧光试剂分析进行定量。在含有7ng/μL鲑精DNA的水中制备用于即将进行的实验的靶DNA稀释液。
实施例7
克隆的HSV-2DNA的扩增
使用克隆的质粒稀释液评价DNA扩增测定法的分析灵敏度。使用2.0和5.2系统在各自的靶水平下进行8次重复的SDA反应。这8次反应等同于每次反应中双链DNA的500、250、100、50、25、10和0个拷贝。如下进行扩增：在52℃下，使用BD ProbeTecTM ET仪与各50nM的HSV2GGLB1.0和HSV2GGRB 1.0、100nM的HSV2GGLP 1.0、500nM HSV2GGRP2.0或5.2、250nM HSV2GGAD1.0、500nM MPC.D/R。将这些引物的序列列在表2中。最终缓冲液条件如下：71mM N-二(羟乙基)甘氨酸；56.6mM KOH；23.9mM KPO4；15.4％DMSO；5mM乙酸镁；500mM 2′-脱氧胞嘧啶-5-o-(1-硫代三磷酸)(dCsTP)；各100nM的dATP、dGTP和dTTP；100μg/μL BSA；约3.515个单位的Bst聚合酶；和约30个单位的BsoBI限制性内切核酸酶。
监测1小时内通过60次的荧光。根据曲线下的面积或“MOTA”得分表示结果并表示为PAT得分(阈值后通过次数)。就本发明的目的而言，将MOTA得分大于或等于3500和PAT得分大于0视为“阳性”。测定产生100％阳性结果时的HSV2GG靶DNA的最低水平对系统2.0和5.2而言为50个拷贝/反应。对系统2.0而言，在25个拷贝下，8次重复中有7次呈阳性，而对系统5.2而言，在25个拷贝下，8次重复中有6次呈阳性。
实施例8
用SDA检测HSV-2病毒粒子
为了验证本发明引物和探针检测HSV-2的能力，对获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的2株HSV-2、获自Quest Diagnostic(Baltimore，MD)的9株和来自俄亥俄州立大学(OSU)的通过ApaI分析被分型为HSV-2的5株进行SDA。
来自OSU的株的特征在于通过PCR扩增了DNA聚合酶基因的区。设计一组扩增HSV-1和HSV-2中相同区的PCR引物。两种类型的病毒可通过在HSV-2PCR片段中存在ApaI限制性内切核酸酶识别位点，而HSV-2PCR片段在由HSV-1株产生的PCR产物中不存在加以区分。当与Apa I限制酶一起保温时，将HSV-2衍生的PCR产物切割成两个较短的片段，而获自HSV-1的那些PCR产物保持完整。使用琼脂糖凝胶电泳与合适的对照品分离限制酶切片段。
用于评价SDA系统的病毒储备液的浓度是未知的。按1∶10在磷酸盐缓冲盐水中稀释病毒储备液并在SDA中测试10μL该混悬液。结果如表7中所示。使用来自系统1.0、2.0和5.2的扩增引物检测所有HSV-2株，证实了所公开的引物和探针检测来自各种不同来源的HSV-1株的能力。
OSU＝俄亥俄州立大学；ATCC＝美国典型培养物保藏中心；Quest＝Quest Diagnostics
实施例9
用于HSV-2DNA的SDA的特异性
用HSV2GG SDA系统1.0、2.0和5.2测试25株HSV-1。每次反应各加入10微升HSV-1稀释液混悬液。使用HSV-2系统没有检测出25株中的任何一种。结果如表8中所示。此外，使用本发明公开方法的引物和探针测试了一组其它微生物。这些微生物包括临床样本中可能遇到的细菌、酵母和其它病毒。经测试，这些生物体中没有一种呈HSV-2的阳性。结果如表9中所示。
OSU＝俄亥俄州立大学；ATCC＝美国典型培养物保藏中心；Quest＝Quest Diagnostics
序列表
<110>Becton，Dickinson and Company
<120>通过核酸扩增检测1型和2型单纯疱疹病毒
<130>2728-4001PC
<150>US 60/465,458
<151>2003-04-25
<160>55
<170>PatentIn 3.2版
<210>1
<211>756
<212>DNA
<213>人疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>糖蛋白G(US4)基因
<220>
<221>misc_特征
<222>(284)..(285)
<223>插入片段XXX，其中X＝无碱基
<400>1
aaaaagaccc cgacccgcgt ctgtggtgtt tttggcatca tgtcgccggg cgccatgcgt 60
gccgttgttc ccattatccc attccttttg gttcttgtcg gtgtatcggg ggttcccacc 120
aacgtctcct ccaccaccca accccaactc cagaccaccg gtcgtccctc gcatgaagcc 180
cccaacatga cccagaccgg caccaccgac tctcccaccg ccatcagcct taccacgccc 240
gaccacacac cccccatgcc aagtatcgga ctggaggagg aggaagagga ggagggggcc 300
ggggacggcg aacatcttga ggggggagat gggacccgtg acaccctacc ccagtccccg 360
ggcccagcct tcccgttggc tgaggacgtc gagaaggaca aacccaaccg tcccgtagtc 420
ccatcccccg atcccaacaa ctcccccgcg cgccccgaga ccagtcgccc gaagacaccc 480
cccaccatta tcgggccgct ggcaactcgc cccacgaccc gactcacctc aaagggacga 540
cccttggttc cgacgcctca acataccccg ctgttctcgt tcctcactgc ctcccccgcc 600
ctggacaccc tcttcgtcgt cagcaccgtc atccacacct tatcgttttt gtgtattggt 660
gcgatggcga cacacctgtg tggcggttgg tccagacgcg ggcgacgcac acaccctagc 720
gtgcgttacg tgtgcctgcc gtccgaacgc gggtag 756
<210>2
<211>717
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<400>2
atgtcgcagg gcgccatgcg tgccgttgtt cccattatcc cattcctttt ggttcttgtc 60
ggtgtatcgg gggttcccac caacgtctcc tccaccaccc aaccccaact ccagaccacc 120
ggtcgtccct cgcatgaagc ccccaacatg acccagaccg gcaccaccga ctctcccacc 180
gccatcagcc ttaccacgcc cgaccacaca ccccccatgc caagtattgg actggaggag 240
gaggaagagg aggagggggc cggggacggc gaacatcttg aggggggaga tgggacccgt 300
gacaccctac cccagtcccc gggcccagcc ttcccgttgg ctgaggacgt cgagaaggac 360
aaacccaacc gtcccgtagt cccatccccc gatcccaaca actcccccgc gcgccccgag 420
accagtcgcc cgaagacacc ccccaccatt atcgggccgc tggcaactcg ccccacgacc 480
cgactcacct caaagggacg acccttggtt ccgacgcctc aacatacccc gctgttctcg 540
ttcctcactg cctcccccgc cctggacacc ctcttcgtcg tcagcaccgt catccacacc 600
ttatcgtttt tgtgtattgg tgcgatggcg acacacctgt gtggcggttg gtccagacgc 660
gggcgacgca cacaccctag cgtgcgttac gtgtgcctgc cgtccgaacg cgggtag 717
<210>3
<211>1071
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>糖蛋白(US4)基因片段
<400>3
ctcatggcct tgaccgagga cgcgtcctcc gattcgccta cgtccgctcc ggagaagacg 60
cccctccctg tgtcggccac cgccatggcg ccctcagtcg acccaagcgc ggaaccgacc 120
gcccccgcaa ccactactcc ccccgacgag atggccacac aagccgcaac ggtcgccgtt 180
acgccggagg aaacggcagt cgcctccccg cccgcgactg catccgtgga gtcgtcgcca 240
ccccccgccg cggcggcaac gcccggggcc gggcacacga acaccagcag cgcctccgca 300
gcgaaaacgc cccccaccac accagccccc acgacccccc cgcccacgtc tacccacgcg 360
accccccgcc ccacgactcc ggggccccaa acaacccctc ccggacccgc aaccccgggt 420
ccggtgggcg cctccgccgc gcccacggcc gattcccccc tcaccgcctc gccccccgct 480
accgcgccgg ggccctcggc cgccaacgtt tcggtcgccg cgaccaccgc cacgcccgga 540
acccggggca ccgcccgtac ccccccaacg gacccaaaga cgcacccaca cggacccgcg 600
gacgctcccc ccggctcgcc agccccccca ccccccgaac atcgcggcgg acccgaggag 660
tttgagggcg ccggggacgg cgaacccccc gaggacgacg acagcgccac cggcctcgcc 720
ttccgaactc cgaaccccaa caaaccaccc cccgcgcgcc ccgggcccat ccgccccacg 780
ctcccgccag gaattcttgg gccgctcgcc cccaacacgc ctcgcccccc cgcccaagct 840
cccgctaagg acatgccctc gggccccaca ccccaacaca tccccctgtt ctggttccta 900
acggcctccc ctgctctaga tatcctcttt atcatcagca ccaccatcca cacggcggcg 960
ttcgtttgtc tggtcgcctt ggcagcacaa ctttggcgcg gccgggcggg gcgcaggcga 1020
tacgcgcacc cgagcgtgcg ttacgtatgt ctgccacccg agcgggatta g 1071
<210>4
<211>390
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<400>4
accacccccc gcgcgccccg ggcccatccg ccccacgctc ccgccaggaa ttcttgggcc 60
gctcgccccc aacacgcctc gcccccccgc ccaagctccc gctaaggaca tgccctcggg 120
ccccacaccc caacacatcc ccctgttctg gttcctaacg gcctcccctg ctctagatat 180
cctctttatc atcagcacca ccatccacac ggcggcgttc gtttgtctgg tcgccttggc 240
agcacaactt tggcgcggcc gggcggggcg caggcgatac gcgcacccga gcgtgcgtta 300
cgtatgtctg ccacccgagc gggattaggg ggtgggggtg gggggcgaga aacgatgaag 360
gacgggaaag ggaacagcga ccaaatgtca 390
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>PCRL1.0
<400>5
gcggaattcg acccttggtt cc 22
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>PCRR1.0
<400>6
gcgggatccc caaccaccac ac 22
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGLP1.0-SDA引物
<400>7
accgcatcga atgactgtct cgggctgttc tcgttcctc 39
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGLP1.1-SDA引物
<400>8
accgcatcga atgactgtct cgggctgttc tcgttcct 38
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP1.0-SDA引物
<400>9
cgattccgct ccagacttct cgggcaccaa tacacaaaaa 40
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP1.0-SDA引物
<400>10
cgattccgct ccagacttct cgggcaacaa tacacacaaa 40
<210>11
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP2.0-SDA引物
<400>11
cgattccgct ccagacttct cgggcaccaa tacacaaaaa c 41
<210>12
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP2.1-SDA引物
<400>12
cgattccgct ccagacttct cgggcaacaa tacacacaaa c 41
<210>13
<211>42
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP3.0-SDA引物
<400>13
cgattccgct ccagacttct cgggcaccaa tacacaaaaa cg 42
<210>14
<211>42
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP3.1-SDA引物
<400>14
cgattccgct ccagacttct cgggcaacaa tacacacaaa cg 42
<210>15
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP4.0-SDA引物
<400>15
cgattccgct ccagacttct cgggcaatac acaaaaacga t 41
<210>16
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP4.1-SDA引物
<400>16
cgattccgct ccagacttct cgggcaatac acacaaacga t 41
<210>17
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP4.2-SDA引物
<400>17
cgattccgct ccagacttct cgggcaatac acacaaatga t 41
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP5.2-SDA引物
<400>18
cgattccgct ccagacttct cgggaaggtg tggatgac 38
<210>19
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGAD1.0-连接引物
<400>19
acgttagcca ccatacggat ccgtcatcca caccttatc 39
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGAD2.1-连接引物
<400>20
acgttagcca ccatacggat ggacaccctc ttcgtcgtc 39
<210>21
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGAD3.0-连接引物
<400>21
acgttagcca ccatacttga ggacaccctc ttcgtcgtc 39
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGAD3.1-连接引物
<400>22
acgttagcca ccatacttga ggacaccctc ttcgtcg 37
<210>23
<211>15
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGLB1.0-缓冲引物
<400>23
gacgcctcaa catac 15
<210>24
<211>14
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRB1.0-缓冲引物
<400>24
gtgtgtcgcc atcg 14
<210>25
<211>14
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGLB1.1-缓冲引物
<400>25
aggtgtgtcg ccat 14
<210>26
<211>71
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1IAC8.1-IAC靶序列
<400>26
ctgttctcgt tcctcactgc ctcccccgcc ctggacaccc tcttgctgct gagcaccgtc 60
atccacacct t 71
<210>27
<211>71
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1IAC8.7-IAC靶序列
<400>27
ctgttctcgt tcctcactgc ctcccccgcc ctggacaccc tctgttcatc tagcaccgtc 60
atccacacct t 71
<210>28
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1IACAD8.1-IAC连接引物
<400>28
actgatccgc actaacgact ggacaccctc ttgctgctg 39
<210>29
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1IACAD8.7-IAC连接引物
<400>29
actgatccgc actaacgact ggacaccctc tgttcatct 39
<210>30
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>TBD10.2D/R-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>DABCYL
<220>
<221>misc_特征
<222>(6)..(11)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(15)..(15)
<223>ROX
<400>30
tagcgcccga gcgctacgtt agccaccata cggat 35
<210>31
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>TBD15D/R-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>DABCYL
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(8)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)..(9)
<223>ROX
<400>31
tgcccgagta cgttagccac catacggat 29
<210>32
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>TBD16(D/R)-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>DABCYL
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(7)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(8)..(8)
<223>ROX
<400>32
tcccgagtac gttagccacc atacggat 28
<210>33
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>MPC.DR-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>DABCYL
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(8)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)..(9)
<223>ROX
<400>33
tccccgagta cgttagccac catacttga 29
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>MPC2.FD-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>FAM
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(8)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)..(9)
<223>DABCYL染料
<400>34
tccccgagta ctgatccgca ctaacgact 29
<210>35
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>AltD8(F/D)-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>FAM
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>FAM
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(7)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>35
acccgagtag ctatccgcca taagccat 28
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2PCRL-PCR引物
<400>36
gcggaattca ttcttgggcc gct 23
<210>37
<211>23
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2PCRR-PCR引物
<400>37
gcgggatcca cgtaacgcac gct 23
<210>38
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGLP1.0-SDA引物
<400>38
accgcatcga atgactgtct cgggctgttc tggttccta 39
<210>39
<211>40
<2i2>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP1.0-SDA引物
<400>39
cgattccgct ccagacttct cgggcgacca gacaaacgaa 40
<210>40
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP1.1-SDA引物
<400>40
cgattccgct ccagacttct cgggaccaga caaacgaac 39
<210>41
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP1.2-SDA引物
<400>41
cgattccgct ccagacttct cgggcgacca gacaaacgaa c 41
<210>42
<211>37
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP2.0-SDA引物
<400>42
cgattccgct ccagacttct cgggaacgcc gccgtgt 37
<210>43
<211>37
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP5.2-SDA引物
<400>43
cgattccgct ccagacttct cgggccgtgt ggatggt 37
<210>44
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGAD1.0-连接引物
<400>44
acgttagcca ccatacggat ccaccatcca cacggcggc 39
<210>45
<211>44
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGAD2.0-连接引物
<400>45
acgttagcca ccatacttga tgctctagat atcctcttta tcat 44
<210>46
<211>15
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGLB1.0-缓冲引物
<400>46
cacaccccaa cacat 15
<210>47
<211>14
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRB1.0-缓冲引物
<400>47
ttgtgctgcc aagg 14
<210>48
<211>70
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2-IAC 5.2A1-IAC靶序列
<400>48
ctgttctggt tcctaacggc ctcccctgct ctagatatcc tctttactac cagcaccacc 60
atccacacgg 70
<210>49
<211>70
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2-IAC 5.2A2-IAC靶序列
<400>49
ctgttctggt tcctaacggc ctcccctgct ctagatatcc tcttaactac cagcaccacc 60
atccacacgg 70
<210>50
<211>44
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GG IAC ADA1.0-IAC连接引物
<400>50
actgatccgc actaacgact tgctctagat atcctcttta ctac 44
<210>51
<211>43
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GG IAC ADA2.0-IAC连接引物
<400>51
actgatccgc actaacgact tgctctagat atcctcttaa cta 43
<210>52
<211>6
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221>misc_特征
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>52
ctcggg 6
<210>53
<211>6
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221>misc_特征
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>53
cccggg 6
<210>54
<211>6
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221>misc_特征
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>54
ctcgag 6
<210>55
<211>6
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221>misc_特征
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>55
cccgag 6
实施例1
HSV-1糖蛋白-G链置换扩增靶区的克隆
使用表1中鉴定的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的PCR扩增引物对来自HSV-1(菌株ATCC：VR-539)的DNA进行PCR。
设计这些引物以便扩增HSV-1的糖蛋白G(US4)基因内的152个碱基对片段。将PCR扩增的DNA插入pUC 19质粒载体(Gibco BRL；GrandIsland，NY)。将该重组克隆命名为HSVIGG质粒#1。纯化质粒#1DNA并通过用BamHI限制酶消化使其线性化。然后使用QIAquick(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)自旋柱纯化DNA并通过用荧光试剂分析进行定量。在含有10ng/μl人DNA的水中制备用于将要进行的实验的靶HSV-1DNA稀释液。特异性HSV-1菌株稀释液和在每种稀释液中的HSV-1检测结果如图5中所示。“+”号表示样品中存在HSV-1；“-”号表示样品中不存在HSV-1；且问号表示样品中可疑的污染物。所有菌株在1∶10的储备溶液稀释液下呈阳性，但不包括样品O-2526。在1∶1,000的储备溶液稀释液下，23种菌株中的20种呈阳性。在1∶100,000的储备溶液稀释液下，23种菌株中的15种呈阳性。
实施例2
克隆的HSV-1DNA的扩增
作为用于检测HSV-1DNA的测定中的起始步骤，使用实施例1中所述的靶核酸法研发用于扩增HSV-1DNA的SDA系统。使用克隆的质粒稀释液评价DNA扩增测定中的分析灵敏度。在每一靶水平下进行8次重复的SDA反应。这8次反应等同于每次反应中双链DNA的100、50、25、12.5、6.25和0个拷贝。如下进行扩增：在52℃下，使用BD ProbeTecTM ET仪(BD Diagnostic Systems；Sparks，MD)与各50nM的HSV1GGLB1.0和HSV1GGRB1.0缓冲引物、100nM的HSV1GGLP1.0左扩增引物、500nM HSV1GGRP1.0右扩增引物、250nM HSV1GGAD1.0连接引物、500nM TBD10.2D/R检测引物。将这些引物的序列列在表1中。最终缓冲液条件如下：143mM N-二(羟乙基)甘氨酸；82mM KOH；25mM KiPO4；12.5％DMSO；5mM乙酸镁；500mM 2′-脱氧胞嘧啶-5-o-(1-硫代三磷酸)(dCsTP)；各100nM的dATP、dGTP和dTTP；100ng/μl BSA；约12个单位的Bst聚合酶；和约30个单位的BsoBI限制性内切核酸酶。
监测1小时内通过60次的荧光。根据曲线下的面积或“MOTA”得分表示结果。易于通过常规实验测定阳性MOTA得分。就本发明的目的而言，将MOTA得分大于或等于3500视为“阳性”。测定产生100％阳性结果时的HSV 1GG靶DNA的最低水平为100个拷贝/反应。在50个拷贝的靶DNA/反应下，8次重复申有7次(87.5％)也呈阳性。
实施例3
通过SDA检测1型单纯疱疹病毒粒子
为了验证本发明引物和探针检测HSV-1的能力，对获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)的4株HSV-1、获自QuestDiagnostic(Baltimore，MD)的10株和来自俄亥俄州立大学(OSU)的14份未分型的HSV样品进行SDA。
HSV的未分型株的特征在于通过PCR扩增了DNA聚合酶基因的区。设计一组扩增HSV-1和HSV-2中相同区的扩增引物。两种类型的病毒可通过在HSV-2PCR片段中存在Apal限制性内切核酸酶识别位点，而HSV-2PCR片段在由HSV-1株产生的PCR产物中不存在加以区分。当与Apal限制酶一起保温时，将HSV-2-衍生的扩增产物切割成两个较短的片段，而获自HSV-1的那些扩增产物保持完整。使用琼脂糖凝胶电泳与合适的对照品分离限制酶切片段。
用于评价SDA系统中存在或不存在HSV的病毒储备液的浓度是未知的。按1∶10在磷酸盐缓冲盐水中稀释病毒储备液并通过SDA测试10μL该混悬液。结果如表4中所示。使用HSV-1扩增引物检测所有HSV-1株，证实了所公开的引物和探针检测来自各种不同来源的HSV-1株的能力。在通过Apal限制酶切消化分型的HSV中的预先未分型的14株中，经测定9株为HSV-1，4株为HSV-2且1株未通过PCR扩增(参见表4和5)。
实施例4
SDA法的分析灵敏度
为了使用本发明公开的引物和探针测定HSV-1测定法的检测极限，对克隆的靶核酸的稀释液和病毒粒子的连续稀释液进行SDA反应。通过电子显微镜检查法(Electron Microscopy Bioservices)对病毒粒子储备液进行计数。在每一靶水平下重复测试16份样品。
为了验证本测定法的灵敏度和特异性，在1∶10、1∶1,000和1∶100,000的生物体储备溶液稀释液下测试来自不同地域位置的23株HSV-1。来自预先未分型株的和来自Quest Diagnostics的样品滴度是未知的。来自ATCC的两种HSV-1储备溶液的滴度近似如下：VR260，1.5×104TCID/μL；和VR-539，2.0×105TCID/μl。结果如图5中所示。所有菌株在1∶10的储备混悬液稀释液下呈阳性，但不包括菌株#0-2526。在23株中，20株在1∶1000储备溶液稀释液下测试呈阳性，且15株在1∶100,000稀释液下测试呈阳性。
实施例5
用于HSV-1DNA的SDA特异性
用HSV1GG SDA系统测试HSV-2中的16株。每次反应各加入10微升HSV-2稀释液混悬液。使用HSV1GG系统测试17种储备溶液之一呈阳性。结果如表5中所示。此外，使用本发明公开方法的引物和探针测试23种其它微生物。这些微生物包括临床样本中可能遇到的细菌、酵母和其它病毒。经测试，这些生物体中没有一种呈HSV-1的阳性。结果如表6中所示。
*临床19通过Quest被分型为HSV-2而通过ApaI分析被分型为HSV-1。
ATCC-美国典型培养物保藏中心；ABi-Advanced Biotechnologies，Inc.
实施例6
HSV-2糖蛋白-G SDA靶区的克隆
使用引物HSV2PCRR和HSV2PCRL与69℃的退火温度对来自HSV-2株ATCC VR-540的DNA进行PCR。这些引物扩增了HSV-2的糖蛋白G(US4)基因内的254个碱基对片段。将扩增的DNA插入pUC18质粒载体(Invitrogen)。该重组克隆称作pHSV2-NT#9-1。纯化质粒DNA并通过用BamHI限制酶消化使其线性化。使用QIAGEN QIAquick自旋柱纯化DNA并通过使用荧光试剂分析进行定量。在含有7ng/μL鲑精DNA的水中制备用于即将进行的实验的靶DNA稀释液。
实施例7
克隆的HSV-2DNA的扩增
使用克隆的质粒稀释液评价DNA扩增测定法的分析灵敏度。使用2.0和5.2系统在各自的靶水平下进行8次重复的SDA反应。这8次反应等同于每次反应中双链DNA的500、250、100、50、25、10和0个拷贝。如下进行扩增：在52℃下，使用BD ProbeTecTM ET仪与各50nM的HSV2GGLB1.0和HSV2GGRB 1.0、100nM的HSV2GGLP 1.0、500nM HSV2GGRP2.0或5.2、250nM HSV2GGAD1.0、500nM MPC.D/R。将这些引物的序列列在表2中。最终缓冲液条件如下：71mM N-二(羟乙基)甘氨酸；56.6mM KOH；23.9mM KPO4；15.4％DMSO；5mM乙酸镁；500mM 2′-脱氧胞嘧啶-5-o-(1-硫代三磷酸)(dCsTP)；各100nM的dATP、dGTP和dTTP；100μg/μL BSA；约3.515个单位的Bst聚合酶；和约30个单位的BsoBI限制性内切核酸酶。
监测1小时内通过60次的荧光。根据曲线下的面积或“MOTA”得分表示结果并表示为PAT得分(阈值后通过次数)。就本发明的目的而言，将MOTA得分大于或等于3500和PAT得分大于0视为“阳性”。测定产生100％阳性结果时的HSV2GG靶DNA的最低水平对系统2.0和5.2而言为50个拷贝/反应。对系统2.0而言，在25个拷贝下，8次重复中有7次呈阳性，而对系统5.2而言，在25个拷贝下，8次重复中有6次呈阳性。
实施例8
用SDA检测HSV-2病毒粒子
为了验证本发明引物和探针检测HSV-2的能力，对获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的2株HSV-2、获自Quest Diagnostic(Baltimore，MD)的9株和来自俄亥俄州立大学(OSU)的通过ApaI分析被分型为HSV-2的5株进行SDA。
来自OSU的株的特征在于通过PCR扩增了DNA聚合酶基因的区。设计一组扩增HSV-1和HSV-2中相同区的PCR引物。两种类型的病毒可通过在HSV-2PCR片段中存在ApaI限制性内切核酸酶识别位点，而HSV-2PCR片段在由HSV-1株产生的PCR产物中不存在加以区分。当与Apa I限制酶一起保温时，将HSV-2衍生的PCR产物切割成两个较短的片段，而获自HSV-1的那些PCR产物保持完整。使用琼脂糖凝胶电泳与合适的对照品分离限制酶切片段。
用于评价SDA系统的病毒储备液的浓度是未知的。按1∶10在磷酸盐缓冲盐水中稀释病毒储备液并在SDA中测试10μL该混悬液。结果如表7中所示。使用来自系统1.0、2.0和5.2的扩增引物检测所有HSV-2株，证实了所公开的引物和探针检测来自各种不同来源的HSV-1株的能力。
OSU＝俄亥俄州立大学；ATCC＝美国典型培养物保藏中心；Quest＝Quest Diagnostics
实施例9
用于HSV-2DNA的SDA的特异性
用HSV2GG SDA系统1.0、2.0和5.2测试25株HSV-1。每次反应各加入10微升HSV-1稀释液混悬液。使用HSV-2系统没有检测出25株中的任何一种。结果如表8中所示。此外，使用本发明公开方法的引物和探针测试了一组其它微生物。这些微生物包括临床样本中可能遇到的细菌、酵母和其它病毒。经测试，这些生物体中没有一种呈HSV-2的阳性。结果如表9中所示。
OSU＝俄亥俄州立大学；ATCC＝美国典型培养物保藏中心；Quest＝Quest Diagnostics
序列表
<110>Becton，Dickinson and Company
<120>通过核酸扩增检测1型和2型单纯疱疹病毒
<130>2728-4001PC
<150>US 60/465,458
<151>2003-04-25
<160>55
<170>PatentIn 3.2版
<210>1
<211>756
<212>DNA
<213>人疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>糖蛋白G(US4)基因
<220>
<221>misc_特征
<222>(284)..(285)
<223>插入片段XXX，其中X＝无碱基
<400>1
aaaaagaccc cgacccgcgt ctgtggtgtt tttggcatca tgtcgccggg cgccatgcgt 60
gccgttgttc ccattatccc attccttttg gttcttgtcg gtgtatcggg ggttcccacc 120
aacgtctcct ccaccaccca accccaactc cagaccaccg gtcgtccctc gcatgaagcc 180
cccaacatga cccagaccgg caccaccgac tctcccaccg ccatcagcct taccacgccc 240
gaccacacac cccccatgcc aagtatcgga ctggaggagg aggaagagga ggagggggcc 300
ggggacggcg aacatcttga ggggggagat gggacccgtg acaccctacc ccagtccccg 360
ggcccagcct tcccgttggc tgaggacgtc gagaaggaca aacccaaccg tcccgtagtc 420
ccatcccccg atcccaacaa ctcccccgcg cgccccgaga ccagtcgccc gaagacaccc 480
cccaccatta tcgggccgct ggcaactcgc cccacgaccc gactcacctc aaagggacga 540
cccttggttc cgacgcctca acataccccg ctgttctcgt tcctcactgc ctcccccgcc 600
ctggacaccc tcttcgtcgt cagcaccgtc atccacacct tatcgttttt gtgtattggt 660
gcgatggcga cacacctgtg tggcggttgg tccagacgcg ggcgacgcac acaccctagc 720
gtgcgttacg tgtgcctgcc gtccgaacgc gggtag 756
<210>2
<211>717
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<400>2
atgtcgcagg gcgccatgcg tgccgttgtt cccattatcc cattcctttt ggttcttgtc 60
ggtgtatcgg gggttcccac caacgtctcc tccaccaccc aaccccaact ccagaccacc 120
ggtcgtccct cgcatgaagc ccccaacatg acccagaccg gcaccaccga ctctcccacc 180
gccatcagcc ttaccacgcc cgaccacaca ccccccatgc caagtattgg actggaggag 240
gaggaagagg aggagggggc cggggacggc gaacatcttg aggggggaga tgggacccgt 300
gacaccctac cccagtcccc gggcccagcc ttcccgttgg ctgaggacgt cgagaaggac 360
aaacccaacc gtcccgtagt cccatccccc gatcccaaca actcccccgc gcgccccgag 420
accagtcgcc cgaagacacc ccccaccatt atcgggccgc tggcaactcg ccccacgacc 480
cgactcacct caaagggacg acccttggtt ccgacgcctc aacatacccc gctgttctcg 540
ttcctcactg cctcccccgc cctggacacc ctcttcgtcg tcagcaccgt catccacacc 600
ttatcgtttt tgtgtattgg tgcgatggcg acacacctgt gtggcggttg gtccagacgc 660
gggcgacgca cacaccctag cgtgcgttac gtgtgcctgc cgtccgaacg cgggtag 717
<210>3
<211>1071
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>糖蛋白(US4)基因片段
<400>3
ctcatggcct tgaccgagga cgcgtcctcc gattcgccta cgtccgctcc ggagaagacg 60
cccctccctg tgtcggccac cgccatggcg ccctcagtcg acccaagcgc ggaaccgacc 120
gcccccgcaa ccactactcc ccccgacgag atggccacac aagccgcaac ggtcgccgtt 180
acgccggagg aaacggcagt cgcctccccg cccgcgactg catccgtgga gtcgtcgcca 240
ccccccgccg cggcggcaac gcccggggcc gggcacacga acaccagcag cgcctccgca 300
gcgaaaacgc cccccaccac accagccccc acgacccccc cgcccacgtc tacccacgcg 360
accccccgcc ccacgactcc ggggccccaa acaacccctc ccggacccgc aaccccgggt 420
ccggtgggcg cctccgccgc gcccacggcc gattcccccc tcaccgcctc gccccccgct 480
accgcgccgg ggccctcggc cgccaacgtt tcggtcgccg cgaccaccgc cacgcccgga 540
acccggggca ccgcccgtac ccccccaacg gacccaaaga cgcacccaca cggacccgcg 600
gacgctcccc ccggctcgcc agccccccca ccccccgaac atcgcggcgg acccgaggag 660
tttgagggcg ccggggacgg cgaacccccc gaggacgacg acagcgccac cggcctcgcc 720
ttccgaactc cgaaccccaa caaaccaccc cccgcgcgcc ccgggcccat ccgccccacg 780
ctcccgccag gaattcttgg gccgctcgcc cccaacacgc ctcgcccccc cgcccaagct 840
cccgctaagg acatgccctc gggccccaca ccccaacaca tccccctgtt ctggttccta 900
acggcctccc ctgctctaga tatcctcttt atcatcagca ccaccatcca cacggcggcg 960
ttcgtttgtc tggtcgcctt ggcagcacaa ctttggcgcg gccgggcggg gcgcaggcga 1020
tacgcgcacc cgagcgtgcg ttacgtatgt ctgccacccg agcgggatta g 1071
<210>4
<211>390
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<400>4
accacccccc gcgcgccccg ggcccatccg ccccacgctc ccgccaggaa ttcttgggcc 60
gctcgccccc aacacgcctc gcccccccgc ccaagctccc gctaaggaca tgccctcggg 120
ccccacaccc caacacatcc ccctgttctg gttcctaacg gcctcccctg ctctagatat 180
cctctttatc atcagcacca ccatccacac ggcggcgttc gtttgtctgg tcgccttggc 240
agcacaactt tggcgcggcc gggcggggcg caggcgatac gcgcacccga gcgtgcgtta 300
cgtatgtctg ccacccgagc gggattaggg ggtgggggtg gggggcgaga aacgatgaag 360
gacgggaaag ggaacagcga ccaaatgtca 390
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>PCRL1.0
<400>5
gcggaattcg acccttggtt cc 22
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>PCRR1.0
<400>6
gcgggatccc caaccaccac ac 22
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGLP1.0-SDA引物
<400>7
accgcatcga atgactgtct cgggctgttc tcgttcctc 39
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGLP1.1-SDA引物
<400>8
accgcatcga atgactgtct cgggctgttc tcgttcct 38
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP1.0-SDA引物
<400>9
cgattccgct ccagacttct cgggcaccaa tacacaaaaa 40
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP1.0-SDA引物
<400>10
cgattccgct ccagacttct cgggcaacaa tacacacaaa 40
<210>11
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP2.0-SDA引物
<400>11
cgattccgct ccagacttct cgggcaccaa tacacaaaaa c 41
<210>12
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP2.1-SDA引物
<400>12
cgattccgct ccagacttct cgggcaacaa tacacacaaa c 41
<210>13
<211>42
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP3.0-SDA引物
<400>13
cgattccgct ccagacttct cgggcaccaa tacacaaaaa cg 42
<210>14
<211>42
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP3.1-SDA引物
<400>14
cgattccgct ccagacttct cgggcaacaa tacacacaaa cg 42
<210>15
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP4.0-SDA引物
<400>15
cgattccgct ccagacttct cgggcaatac acaaaaacga t 41
<210>16
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP4.1-SDA引物
<400>16
cgattccgct ccagacttct cgggcaatac acacaaacga t 41
<210>17
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP4.2-SDA引物
<400>17
cgattccgct ccagacttct cgggcaatac acacaaatga t 41
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRP5.2-SDA引物
<400>18
cgattccgct ccagacttct cgggaaggtg tggatgac 38
<210>19
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGAD1.0-连接引物
<400>19
acgttagcca ccatacggat ccgtcatcca caccttatc 39
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGAD2.1-连接引物
<400>20
acgttagcca ccatacggat ggacaccctc ttcgtcgtc 39
<210>21
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGAD3.0-连接引物
<400>21
acgttagcca ccatacttga ggacaccctc ttcgtcgtc 39
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGAD3.1-连接引物
<400>22
acgttagcca ccatacttga ggacaccctc ttcgtcg 37
<210>23
<211>15
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGLB1.0-缓冲引物
<400>23
gacgcctcaa catac 15
<210>24
<211>14
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGRB1.0-缓冲引物
<400>24
gtgtgtcgcc atcg 14
<210>25
<211>14
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1GGLB1.1-缓冲引物
<400>25
aggtgtgtcg ccat 14
<210>26
<211>71
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1IAC8.1-IAC靶序列
<400>26
ctgttctcgt tcctcactgc ctcccccgcc ctggacaccc tcttgctgct gagcaccgtc 60
atccacacct t 71
<210>27
<211>71
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1IAC8.7-IAC靶序列
<400>27
ctgttctcgt tcctcactgc ctcccccgcc ctggacaccc tctgttcatc tagcaccgtc 60
atccacacct t 71
<210>28
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1IACAD8.1-IAC连接引物
<400>28
actgatccgc actaacgact ggacaccctc ttgctgctg 39
<210>29
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-1
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV1IACAD8.7-IAC连接引物
<400>29
actgatccgc actaacgact ggacaccctc tgttcatct 39
<210>30
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>TBD10.2D/R-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>DABCYL
<220>
<221>misc_特征
<222>(6)..(11)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(15)..(15)
<223>ROX
<400>30
tagcgcccga gcgctacgtt agccaccata cggat 35
<210>31
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>TBD15D/R-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>DABCYL
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(8)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)..(9)
<223>ROX
<400>31
tgcccgagta cgttagccac catacggat 29
<210>32
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>TBD16(D/R)-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>DABCYL
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(7)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(8)..(8)
<223>ROX
<400>32
tcccgagtac gttagccacc atacggat 28
<210>33
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>MPC.DR-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>DABCYL
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(8)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)..(9)
<223>ROX
<400>33
tccccgagta cgttagccac catacttga 29
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>MPC2.FD-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>FAM
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(8)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)..(9)
<223>DABCYL染料
<400>34
tccccgagta ctgatccgca ctaacgact 29
<210>35
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成检测引物
<220>
<221>misc_特征
<223>AltD8(F/D)-检测引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>FAM
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1)
<223>FAM
<220>
<221>misc_特征
<222>(3)..(7)
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>35
acccgagtag ctatccgcca taagccat 28
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2PCRL-PCR引物
<400>36
gcggaattca ttcttgggcc gct 23
<210>37
<211>23
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2PCRR-PCR引物
<400>37
gcgggatcca cgtaacgcac gct 23
<210>38
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGLP1.0-SDA引物
<400>38
accgcatcga atgactgtct cgggctgttc tggttccta 39
<210>39
<211>40
<2i2>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP1.0-SDA引物
<400>39
cgattccgct ccagacttct cgggcgacca gacaaacgaa 40
<210>40
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP1.1-SDA引物
<400>40
cgattccgct ccagacttct cgggaccaga caaacgaac 39
<210>41
<211>41
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP1.2-SDA引物
<400>41
cgattccgct ccagacttct cgggcgacca gacaaacgaa c 41
<210>42
<211>37
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP2.0-SDA引物
<400>42
cgattccgct ccagacttct cgggaacgcc gccgtgt 37
<210>43
<211>37
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRP5.2-SDA引物
<400>43
cgattccgct ccagacttct cgggccgtgt ggatggt 37
<210>44
<211>39
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGAD1.0-连接引物
<400>44
acgttagcca ccatacggat ccaccatcca cacggcggc 39
<210>45
<211>44
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGAD2.0-连接引物
<400>45
acgttagcca ccatacttga tgctctagat atcctcttta tcat 44
<210>46
<211>15
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGLB1.0-缓冲引物
<400>46
cacaccccaa cacat 15
<210>47
<211>14
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GGRB1.0-缓冲引物
<400>47
ttgtgctgcc aagg 14
<210>48
<211>70
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2-IAC 5.2A1-IAC靶序列
<400>48
ctgttctggt tcctaacggc ctcccctgct ctagatatcc tctttactac cagcaccacc 60
atccacacgg 70
<210>49
<211>70
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2-IAC 5.2A2-IAC靶序列
<400>49
ctgttctggt tcctaacggc ctcccctgct ctagatatcc tcttaactac cagcaccacc 60
atccacacgg 70
<210>50
<211>44
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GG IAC ADA1.0-IAC连接引物
<400>50
actgatccgc actaacgact tgctctagat atcctcttta ctac 44
<210>51
<211>43
<212>DNA
<213>人单纯疱疹病毒-2
<220>
<221>misc_特征
<223>HSV2GG IAC ADA2.0-IAC连接引物
<400>51
actgatccgc actaacgact tgctctagat atcctcttaa cta 43
<210>52
<211>6
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221>misc_特征
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>52
ctcggg 6
<210>53
<211>6
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221>misc_特征
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>53
cccggg 6
<210>54
<211>6
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221>misc_特征
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>54
ctcgag 6
<210>55
<211>6
<212>DNA
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<220>
<221>misc_特征
<223>BsoBI限制酶识别位点
<400>55
cccgag 6