纳豆激酶口服液及其制造方法转让专利
申请号 : CN200510000158.X
文献号 : CN1799627B
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 王涛 , 张振中 , 张锋 , 金兆祥 , 谭振波 , 翟长宝 , 薛峰 , 尚青
申请人 : 张振中 , 王涛
摘要 :
本发明涉及一种纳豆激酶口服液，由产纳豆激酶的枯草杆菌的发酵液制备而成，其中含有0.5-3％的环状糊精或环糊精衍生物，每毫升口服液中的纳豆激酶纤溶活性为100-400IU。本发明同时还提供了一种纳豆激酶口服液的制造方法，包括以下步骤：(1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液；(2)离心，去除发酵液中的菌体和杂质；(3)离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理；(4)浓缩，并加入0.5-3％的环状糊精或环糊精衍生物，搅拌，进行调配；(5)灌装灭菌。本发明的纳豆激酶口服液口感好，服用方便，对心脑血管具有很好的保健作用。
权利要求 :
1.一种纳豆激酶口服液，由产纳豆激酶的枯草杆菌的发酵液制备而成，其中含有0.5-3％的β-环糊精或羟丙基-β-环糊精，每毫升口服液中的纳豆激酶纤溶活性为100-400IU；其中所述发酵液为以3000-5000rpm的转速离心去除其中的菌体后的发酵液。
2.权利要求1所述的纳豆激酶口服液，其中，所述产纳豆激酶的枯草杆菌为纳豆杆菌。
3.权利要求1所述的纳豆激酶口服液，其中还含有15-30％山楂水提物，其中，所述山楂水提物是将山楂果研磨后加5倍水，50℃、150-240rpm搅拌浸提12-24小时，滤去果渣后离心分离，收取上清液即为山楂水提物。
4.权利要求1-3任一项所述纳豆激酶口服液的制造方法，该制造方法包括以下步骤：(1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液；
(2)以3000-5000rpm的转速离心，去除发酵液中的菌体和杂质；
(3)离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理；
(4)在低于60℃的温度下进行浓缩至预定浓度，然后加入β-环糊精或羟丙基-β-环糊精，其含量为口服液的0.5-3％，在低于60℃搅拌1-2小时，并进行调配；和(5)低于60℃下对浓缩液实施微滤灭菌或辐照灭菌。
5.权利要求4所述的纳豆激酶口服液的制造方法，其中，所述产纳豆激酶的枯草杆菌为纳豆杆菌，使用纳豆杆菌进行发酵制备种子液，发酵至0D＝0.3-1.0，以1.0-2.0％的接种量进行液体深层发酵，发酵温度25-40℃，发酵周期12-35小时，pH为6-8。
6.权利要求4所述的纳豆激酶口服液的制造方法，其中，所述浓缩为常温超滤浓缩，超滤膜截留分子量为50000-200000，超滤压力0.1-0.3Mpa。
7.权利要求4所述的纳豆激酶口服液的制造方法，其中，所述灭菌采用微滤除菌，微滤膜孔径0.05-0.45μm，之后无菌灌装。
8.权利要求4所述的纳豆激酶口服液的制造方法，其中，所述灭菌采用辐照灭菌，辐照剂量为1-12Kgy。
9.权利要求8所述的纳豆激酶口服液的制造方法，其中，所述辐照灭菌的放射源为Co60，辐照剂量为3-8Kgy。
10.权利要求4所述的纳豆激酶口服液的制造方法，其中，在加入β-环糊精或羟丙基-β-环糊精并调配好的浓缩液中加入山楂水提物，所述山楂水提物的制备方法包括将山楂果研磨后加5倍水，50℃、150-240rpm搅拌浸提12-24小时，离心分离收取上清液，制成的口服液中该山楂水提取物占该口服液重量的15-30％。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种保健食品，具体地说，涉及一种具有心脑血管保健作用的纳豆激酶口服液及其制造方法。
背景技术
心脑血管疾病是严重危害人类健康的主要疾病之一，据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年大约有1500万人死于心脑血管疾病。我国每年死于心脑血管疾病的人数也超过全部死亡人数的50％，且在大城市发病率尤高。血栓性疾病(例如急性心肌梗塞等)作为中老年人的高发病，是死亡威胁最大的疾病之一，目前60岁以上的老人已达到1亿以上，占人口比例的8.7％，今后20年我国将进入老龄化社会，心脑血管疾病的防治必须引起足够的重视。
全世界现有血栓塞病人约1500万，所需的溶栓药的潜在市场约20亿美元。而现在国内市场上使用的溶栓药物链激酶(SK)、尿激酶(UK)、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)等都存在几个明显的不足：抗再灌注、产生再栓塞和出血性副作用，且价格昂贵。
纳豆激酶(Nattokinase，NK)是1987年由日本生理学教授须见洋行博士等从200多种食品中首先发现并命名的一种分子量远远小于UK、SK、tPA的蛋白质，是纳豆菌发酵过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶，等电点是8.7，分子量是25000，具有很强的纤维蛋白溶解能力，并具有活化弹性酶和尿酸酶的活性，在此之后的相关研究表明，纳豆激酶能够有效的清除人体血液内的血栓，是目前溶栓活力最高的蛋白酶(也有报道认为食品中唯有纳豆激酶能够溶解已经形成的血栓)，而且对高血压，衰老，中风，肌肉痉挛和心脑血管疾病也有很好的疗效，已被用作溶栓药物。并且，由于纳豆激酶来源于日本传统的食物(纳豆)，安全性好，同时并可由肠道吸收，在体内作用持续时间长，最重要的一点是它还能激活人体内重组组织型纤溶酶原激活剂(RtPA)，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性，因此近年来，以纳豆激酶为主要成分作为药品、功能性食品、食品添加剂或者保健品的研发工作进展的非常迅速。日本大和制药有限公司生产的纳豆激酶产品“NKCP”(45美元/盒)作为药用，有软胶囊、硬胶囊和片剂3种形态；温翠普-圣特公司生产的“纳豆精”有软胶囊、硬胶囊两种形态，作为食品添加剂和功能性食品在日本和世界各地销售；过敏症研究集团公司生产的含纳豆激酶产品，为复方制剂，产品名称为纳豆激酶(65美元/盒)，作为食品补剂和功能食品在国内外销售；韩国维寿酶公司生产的以纳豆激酶为主要成分的维寿酶是药用肠溶胶囊，每日服用量为2000IU/日。
从以上介绍可以看出，目前的纳豆激酶产品在形式上都为胶囊或片剂，或者被加工成含有纳豆激酶的保健食品，其原因主要是因为纳豆或纳豆激酶本身具有一种独特的气味，对于很多人而言是一种不适的微臭气味，所以，目前的生产多是加工成浓缩剂型供吞服.但是，纳豆激酶是一种热敏性的蛋白酶，在加热(高于60℃)的条件下，很容易变性失活，导致其溶纤活性降低甚至消失，因此，在纳豆激酶产品生产中，欲保留较高的纳豆激酶纤溶活性，又要实现产品的高度浓缩，对于生产工艺提出了很高的要求，例如目前大多采用的G-sphendex Gel过滤纯化和冷冻干燥得到干品的方法，生产成本高，生产周期长，生产规模小，这也是导致这类产品高价格的主要原因。
全世界现有血栓塞病人约1500万，所需的溶栓药的潜在市场约20亿美元。而现在国内市场上使用的溶栓药物链激酶(SK)、尿激酶(UK)、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)等都存在几个明显的不足：抗再灌注、产生再栓塞和出血性副作用，且价格昂贵。
纳豆激酶(Nattokinase，NK)是1987年由日本生理学教授须见洋行博士等从200多种食品中首先发现并命名的一种分子量远远小于UK、SK、tPA的蛋白质，是纳豆菌发酵过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶，等电点是8.7，分子量是25000，具有很强的纤维蛋白溶解能力，并具有活化弹性酶和尿酸酶的活性，在此之后的相关研究表明，纳豆激酶能够有效的清除人体血液内的血栓，是目前溶栓活力最高的蛋白酶(也有报道认为食品中唯有纳豆激酶能够溶解已经形成的血栓)，而且对高血压，衰老，中风，肌肉痉挛和心脑血管疾病也有很好的疗效，已被用作溶栓药物。并且，由于纳豆激酶来源于日本传统的食物(纳豆)，安全性好，同时并可由肠道吸收，在体内作用持续时间长，最重要的一点是它还能激活人体内重组组织型纤溶酶原激活剂(RtPA)，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性，因此近年来，以纳豆激酶为主要成分作为药品、功能性食品、食品添加剂或者保健品的研发工作进展的非常迅速。日本大和制药有限公司生产的纳豆激酶产品“NKCP”(45美元/盒)作为药用，有软胶囊、硬胶囊和片剂3种形态；温翠普-圣特公司生产的“纳豆精”有软胶囊、硬胶囊两种形态，作为食品添加剂和功能性食品在日本和世界各地销售；过敏症研究集团公司生产的含纳豆激酶产品，为复方制剂，产品名称为纳豆激酶(65美元/盒)，作为食品补剂和功能食品在国内外销售；韩国维寿酶公司生产的以纳豆激酶为主要成分的维寿酶是药用肠溶胶囊，每日服用量为2000IU/日。
从以上介绍可以看出，目前的纳豆激酶产品在形式上都为胶囊或片剂，或者被加工成含有纳豆激酶的保健食品，其原因主要是因为纳豆或纳豆激酶本身具有一种独特的气味，对于很多人而言是一种不适的微臭气味，所以，目前的生产多是加工成浓缩剂型供吞服.但是，纳豆激酶是一种热敏性的蛋白酶，在加热(高于60℃)的条件下，很容易变性失活，导致其溶纤活性降低甚至消失，因此，在纳豆激酶产品生产中，欲保留较高的纳豆激酶纤溶活性，又要实现产品的高度浓缩，对于生产工艺提出了很高的要求，例如目前大多采用的G-sphendex Gel过滤纯化和冷冻干燥得到干品的方法，生产成本高，生产周期长，生产规模小，这也是导致这类产品高价格的主要原因。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种纳豆激酶口服液，可以作为预防心脑血管的保健品或辅助治疗药，通过适当的配方设计，既保证了口服液的纤溶活性，还具有能被消费者接受的口感。
本发明还提供了该纳豆激酶口服液的制造方法。
本发明提供的纳豆激酶口服液，其来自产纳豆激酶的枯草杆菌的发酵产物，并含有0.5-3％的环糊精或环糊精衍生物，每毫升口服液中的纳豆激酶纤溶活性为100-400IU。
本案发明人对现有纳豆激酶保健品市场进行了大量分析研究后发现，截止到目前，世界范围内并没有纳豆激酶口服液的相关报道，也没有相关产品问世。发明人经过反复实验摸索，认为纳豆激酶纤溶活性在100-400IU/ml范围内的发酵液，其口感比较好接受，而且这个浓度范围的产品作为口服制剂基本可以满足日常的保健摄入量，尤其是通过环糊精的调节作用，可以直接作为口服液而不必再制备成高纯度的干品。由于不需借助各种化学试剂进行沉淀等精制处理，也提高了产品的安全性，并且可以保全发酵产物的营养成分。基于这样的结论，本发明提供的口服液形式的纳豆激酶保健品，填补了该类产品的市场空白。
为使口服液具有更好的口感及更全面的保健治疗效果，本发明的纳豆激酶口服液组成中可以含有适当的调味剂和其它功能性添加剂，包括甜味剂，例如蔗糖、甜菊苷、蜂蜜、蛋白糖、果葡糖浆等；酸味剂，例如柠檬酸或柠檬酸钠等；功能性添加剂，例如异黄酮、卵磷脂、低聚木糖醇、VE、VC等；防腐剂，可以是苯甲酸钠或山梨酸钾等。所述添加剂均应满足食品添加剂的有关标准，它们的含量也应该是在规定限度内，经适当调配而使口服液具有更加理想的口感和全面的营养保健功效。一般情况下，以口服液产品的总重量为基准，其中还可包含6-8％的蔗糖、0.15-0.25％的酸味剂、适量的功能添加剂及0.005-0.01％的防腐剂，也可采用其他甜味剂替代蔗糖，以方便糖尿病人服用。
本案发明人在探索试验中发现，向上述浓缩液中加入山楂水提物将更显著地改善口服液的口感，同时借助山楂中保健成分的加入，也可辅佐纳豆激酶的功效。所以本发明优选还提供了一种复合型的纳豆激酶口服液，在上述口服液中还添加了口服液总重量15-30％的山楂水提物，该山楂水提物可以是直接使用山楂果研磨后得到的果浆加水浸提后的上清液，目的在于利用山楂中的山萜和黄酮等保健成分，更提高了纳豆激酶的功效。当然该添加了山楂水提物的口服液中的纳豆激酶纤溶活性仍应为100-400IU/ml。
对于纳豆激酶产品的应用，营养专家建议每日服用的预防量为1500-2000IU，所以每天服用本发明的纳豆激酶口服液10-20毫升，就完全可以达到预防治疗、增进健康的目的。可见本发明的纳豆激酶口服液在服用和携带上都是很方便的，而由于剂型的改变降低了生产成本，更符合普通消费者的需求，可使消费人群从特殊化转向大众化，具有极大的经济效益和社会效益。
另一方面，在不降低所述纳豆激酶口服液产品的保健功能的前提下，本发明还提供了一种纳豆激酶口服液的生产方法，能够有效的降低成本，缩短生产周期，增加产量，从而解决当前纳豆激酶保健品生产工艺复杂生产成本高的问题.
本发明的纳豆激酶口服液的制造方法，主要包括以下步骤：
(1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液；
(2)以3000-5000rpm的转速离心，去除发酵液中的菌体和杂质；
(3)离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理；
(4)在低于60℃的温度下进行浓缩至预定浓度，然后加入环状糊精或环糊精衍生物，其含量为口服液的0.5-3％(在实际操作中，换算成以浓缩液量的质量为基准添加比较方便)，在低于60℃的温度下搅拌1-2小时，并进行调配；和
(5)低于60℃下对浓缩液实施微滤灭菌或辐照灭菌。
本发明的口服液中的主要活性成分纳豆激酶，来自能够生产纳豆激酶的枯草杆菌的发酵产物。枯草杆菌作为一种益生菌，在国内外公开的专利和文献中有大量报道，市场上也能够商购得到，例如Bacillus Subtilis AK(PN2003-210136，FERM P-18291 JP)，Bacillus Subtilis MR141(PN 08-154616，FERM P-14692 JP)，Bacillus Subtilis IAM1026(PN 5486467，FERM BP-6713US)，Yunnan SL-001(PN 6420145，FERM BP-4844 US)，Bacillus SubtilisAS2(PN 99/28441，FERM BP-6139 PCT)，Bacillus natto KA145(PN2001-238667，FERM P-17659 JP)，Bacillus natto T0-9(PN 06-261744 FERMP-13164JP)，Bacillus Subtilis M2-4(PN 6767729，FERM BP-7155 US)Bacillus Subtilis TOYO-11 TO 13(PN 2003/013565，FERM BP-8011 TO 8013PCT)，Bacillus natto NLSse(申请号02121352.6，CGMCC NO.0724 CN)，Bacillus Subtilis natto HW4-1(申请号02116667.6，CGMCC NO.0718 CN)，Bacillus natto X-501(申请号00107589.6，CGMCC NO.0449CN)，BacillusSubtilis natto(ASI.1086)，Bacillus SP.CK 11-4(Wonkeuk kim.etl.AmericanSociety for Microbiology，VOL 62.NO.7)等，这些菌种在发酵过程中除能够产生纳豆激酶外，它们各级代谢产物均含有对人体有益的成分，因此都可作为本发明的原料菌种，本发明优选采用纳豆杆菌，其能够通过固体或液体基质发酵产生高效纤溶活性的纳豆激酶或者类似的溶栓酶。
根据选定的菌种，选择其适当的培养条件进行发酵培养，其中，可以选用固体发酵法，把菌种制成菌悬液，接种到固体培养基中，在适宜的条件下进行培养。但是，由于本发明最终需要制成一种口服液，而当采用固体发酵时，需要将发酵产生的纳豆激酶溶解提取出来，反而会使生产工艺复杂、增加生产成本。因此，本发明优选采用液态发酵法，其具体工艺如下：
试管菌种→平板活化→接种→种子液发酵→生产液发酵。
选用纳豆激酶高产菌株，直接在平板上进行分离筛选，分离平板优选为LB-琼脂糖-纤维蛋白平板：LB培养基配制时用0.01M磷酸钾缓冲液(PB pH7.4)溶解，制作平板时，将人血纤维蛋白原和凝血酶溶解于其中，其制作方法同琼脂糖-纤维蛋白平板。
之后进行纳豆激酶的液体发酵培养基的优化，本发明中，根据所选用的不同菌种的最佳培养条件，所用到的发酵培养基中的氮源、碳源和无机盐可以进行选择，例如，氮源可以选择大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、酪蛋白酸水解物以及干大豆粉末等中的一种或多种混合使用，使用的质量浓度优选在0.5-4.0％左右；碳源可以是葡萄糖、木糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖和蔗糖中的一种或多种，使用的质量浓度优选在1.0％-10.0％左右；无机盐可以选择KH2PO4约0.2％、K2HPO4约0.4％、MgSO4约0.05％、和CaCl2约0.02％等。
根据本发明优选的方法，使用纳豆杆菌进行发酵制备种子液，发酵至OD＝0.3-1.0，以1.0-2.0％左右的接种量进行液体深层发酵，发酵温度25-40℃，发酵周期12-35小时，pH为6-8。
发酵后的液体，首先需要进行低速离心，以除去发酵液中的大部分菌体和杂质。离心的转速优选为3000-5000rpm；然后，对离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理，以脱除其中的苦涩味；之后，再进行浓缩，由于本发明中的生产纳豆激酶的菌株在发酵过程中产生的一些有益产物是热敏性的，因此，本发明不适宜采用加热浓缩，适用于本发明的浓缩方法优选为常温超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为50000-200000，超滤压力0.1-0.3MPa，截留率≥90％，浓缩倍数视发酵液中纳豆激酶的纤溶活性而确定，一般在10-30倍左右，较适宜的为20倍左右，以得到所要求浓度的浓缩液。
直接口服该浓缩液会感觉到纳豆特有的成、苦味，对于多数人还是感到不好接受，所以再加入1-3％的环糊精或其衍生物，适当加热(不高于60℃，优选30-60℃)搅拌1-2小时，可达到改善风味的目的，所使用的环糊精或其衍生物是指食品加工中通常使用的，例如β-环糊精(β-CD)、羟丙基-β-环糊精(hp-β-CD)等。当然也可同时加入适合的调味剂适当调配，例如，以最终得到的纳豆激酶口服液的总重量为基准，添加6-8％的蔗糖、0.15-0.25％的酸味剂、适量的功能添加剂和0.005-0.01％的防腐剂，并搅拌均匀。
根据本发明更优选的方案，在加入环状糊精或其衍生物并调配好的浓缩液中加入山楂水提物，所述山楂水提物的制备方法包括将山楂果研磨后加蒸馏水搅拌浸提12-24小时，离心分离收取上清液，制成的口服液中该山楂水提取物占口服液重量的15-30％。
接下来，为延长最终产品的保质期，需要对所制得的口服液进行灭菌及灌装。同样由于纳豆激酶及其它一些热敏性物质的存在，本发明不能采用热压灭菌，必须采用一种“冷杀菌”，即，要求灭菌的温度不能超过60℃，优选在更低的温度下达到有效灭菌。本发明优选可以采用微滤除菌或辐照灭菌。微滤膜孔径0.05-0.45μm，可有效滤去绝大部分的细菌和病毒，之后进行无菌灌装。或者，采用辐照灭菌(采用该处理方法应该先灌装再连同包装一起进行灭菌)，放射源可以为Co60，辐照剂量为1-12Kgy，优选为3-8Kgy。
通过上述步骤得到的纳豆激酶口服液产品，外观基本为近乎无色(采用LB培养基为黄色，若采用优化的培养基则为无色，如果加入山楂水提物则微红色)透明，调配后略有纳豆的气味，加入山楂提取物的口服液则带有山楂的酸甜口味，基本没有纳豆的苦成口味。该口服液产品可在常温下至少保存6个月。
同时，为验证本发明的口服液产品中具有良好的纤溶活性，本发明还对得到的纳豆激酶口服液产品的纤溶活性进行了定性和定量鉴定，具体方法如下：
1、对纳豆激酶口服液的纤溶活性的定性鉴定
参照文献Acta Nutrimenta Sinica，2003，01(25)，1：46-51中的方法，用凝固血块溶解法对纳豆激酶口服液的纤溶活性进行定性鉴定。即，从上述包装好的纳豆激酶口服液成品中吸取1ml用pH＝7.4的PB缓冲液作适当稀释，加到1滴人血形成的血液凝块的试管内。加入了上述纳豆激酶口服液样品的血液凝块在1-2小时内全部溶解，而相应的加入了作为对照的生理盐水的血液凝块没有溶解。
2、对纳豆激酶口服液的纤溶活性的定量鉴定
参照文献Arch Biochem Biophys，1952，40：346-351中的方法，用纤维蛋白平板法对纳豆激酶口服液的纤溶活性进行定量鉴定。制作方法如下：将0.1g琼脂糖溶于10ml PB缓冲液中，加热溶解后，置于45℃保温45分钟。将10mg人血纤维蛋白原纯品溶于10ml PB缓冲液中，45℃水浴10分钟。取1 IU的凝血酶加入琼脂糖溶液中混匀，同时把纤维蛋白原溶液倒入上述混合液中，立即混匀倒入9cm×9cm的培养皿中，室温放置至少一小时，使其充分凝固。将平皿打孔，上样10μl，室温下放置10分钟，再放入37℃恒温培养箱中培养18小时。用游标卡尺测量其溶图直径Φ，根据圆面积公式S＝π×Φ2/4计算出溶圈面积，表示酶活力，或计算出相当尿激酶活力的单位数(定义为IU)。
3、尿激酶标准曲线的测定
取不同的国际单位数(IU)的尿激酶，将其点样于纤维蛋白平板上，37℃培养18小时，用游标卡尺测量其溶圈直径，计算出溶圈面积。以溶圈面积为横坐标(X轴)，以log10IU+2为纵坐标(Y轴)，用Microsoft Excel作出尿激酶标准曲线图，并得出计算公式y＝0.0071x-0.2354。
经测定，本发明的口服液中纳豆激酶的纤溶活性单位在100-400IU/ml，如果每天服用10-20毫升左右，完全可以达到预防和治疗心脑血管疾病、增进健康的目的。
由上述本发明的纳豆激酶口服液及其生产方法可知，本发明具有以下优点：
1.目前世界范围内并没有纳豆激酶口服液的相关报道，因此，本发明在纳豆激酶保健品开发领域内是一项开创性的成果，扩大了纳豆激酶作为保健品的应用领域。
2.本发明的口服液中，含有生物发酵所产生的高活性的纳豆激酶，作为保健品长期饮用，能有效降解人体血栓的骨架成分-纤维蛋白，从而溶解血栓，起到预防和治疗心脑血管疾病的保健作用。
3.由于加工方法的简化，并采用合理的灭菌手段，产品营养成分损失少，最大限度的保留了口服液中纳豆激酶的生物活性和其它热敏性生物活性物质，即，产品中的纳豆激酶纤溶活性较通常的液体发酵产物高。例如，定性检测中加样1ml，在90min内血块全部溶解，而在纤维蛋白平板定量检测中上样50μl，纳豆激酶的纤溶活性可达到150-400个尿激酶单位/ml纳豆激酶发酵浓缩样。
4.本发明通过适当的手段和添加进行调配，有效掩盖了纳豆激酶及其它有益发酵产物特殊的气味，口感有很大改善，适合更广泛的人群。同时利用山楂中的山萜和黄酮等保健成分，制备出的含有山楂水提物的口服液产品更提高了纳豆激酶的功效。
5.本发明选用的液体发酵培养基原料和食品添加剂来源广泛，价格便宜，安全可靠。
6.在筛选高产菌株的过程中，传统的筛选方法一般为生长平板进行菌株的生长培养，而后采用分离平板进行筛选，而本发明经过研究实验，采用了一步分离法进行菌株的生长、分离和筛选，不仅分离效果好，而且大大简化了菌株筛选的步骤，节约了生产时间。
7.在生产的过程中省略了传统的葡聚糖凝胶(G-sphendex Gel)或者柱层析过滤纯化和冷冻干燥得到干品的步骤，因而生产工艺简单，生产成本低廉，生产周期短，产品质量稳定，并且易于实现工业化生产，具有极大的经济效益和社会效益。
本发明还提供了该纳豆激酶口服液的制造方法。
本发明提供的纳豆激酶口服液，其来自产纳豆激酶的枯草杆菌的发酵产物，并含有0.5-3％的环糊精或环糊精衍生物，每毫升口服液中的纳豆激酶纤溶活性为100-400IU。
本案发明人对现有纳豆激酶保健品市场进行了大量分析研究后发现，截止到目前，世界范围内并没有纳豆激酶口服液的相关报道，也没有相关产品问世。发明人经过反复实验摸索，认为纳豆激酶纤溶活性在100-400IU/ml范围内的发酵液，其口感比较好接受，而且这个浓度范围的产品作为口服制剂基本可以满足日常的保健摄入量，尤其是通过环糊精的调节作用，可以直接作为口服液而不必再制备成高纯度的干品。由于不需借助各种化学试剂进行沉淀等精制处理，也提高了产品的安全性，并且可以保全发酵产物的营养成分。基于这样的结论，本发明提供的口服液形式的纳豆激酶保健品，填补了该类产品的市场空白。
为使口服液具有更好的口感及更全面的保健治疗效果，本发明的纳豆激酶口服液组成中可以含有适当的调味剂和其它功能性添加剂，包括甜味剂，例如蔗糖、甜菊苷、蜂蜜、蛋白糖、果葡糖浆等；酸味剂，例如柠檬酸或柠檬酸钠等；功能性添加剂，例如异黄酮、卵磷脂、低聚木糖醇、VE、VC等；防腐剂，可以是苯甲酸钠或山梨酸钾等。所述添加剂均应满足食品添加剂的有关标准，它们的含量也应该是在规定限度内，经适当调配而使口服液具有更加理想的口感和全面的营养保健功效。一般情况下，以口服液产品的总重量为基准，其中还可包含6-8％的蔗糖、0.15-0.25％的酸味剂、适量的功能添加剂及0.005-0.01％的防腐剂，也可采用其他甜味剂替代蔗糖，以方便糖尿病人服用。
本案发明人在探索试验中发现，向上述浓缩液中加入山楂水提物将更显著地改善口服液的口感，同时借助山楂中保健成分的加入，也可辅佐纳豆激酶的功效。所以本发明优选还提供了一种复合型的纳豆激酶口服液，在上述口服液中还添加了口服液总重量15-30％的山楂水提物，该山楂水提物可以是直接使用山楂果研磨后得到的果浆加水浸提后的上清液，目的在于利用山楂中的山萜和黄酮等保健成分，更提高了纳豆激酶的功效。当然该添加了山楂水提物的口服液中的纳豆激酶纤溶活性仍应为100-400IU/ml。
对于纳豆激酶产品的应用，营养专家建议每日服用的预防量为1500-2000IU，所以每天服用本发明的纳豆激酶口服液10-20毫升，就完全可以达到预防治疗、增进健康的目的。可见本发明的纳豆激酶口服液在服用和携带上都是很方便的，而由于剂型的改变降低了生产成本，更符合普通消费者的需求，可使消费人群从特殊化转向大众化，具有极大的经济效益和社会效益。
另一方面，在不降低所述纳豆激酶口服液产品的保健功能的前提下，本发明还提供了一种纳豆激酶口服液的生产方法，能够有效的降低成本，缩短生产周期，增加产量，从而解决当前纳豆激酶保健品生产工艺复杂生产成本高的问题.
本发明的纳豆激酶口服液的制造方法，主要包括以下步骤：
(1)利用产纳豆激酶的枯草杆菌制备纳豆激酶发酵液；
(2)以3000-5000rpm的转速离心，去除发酵液中的菌体和杂质；
(3)离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理；
(4)在低于60℃的温度下进行浓缩至预定浓度，然后加入环状糊精或环糊精衍生物，其含量为口服液的0.5-3％(在实际操作中，换算成以浓缩液量的质量为基准添加比较方便)，在低于60℃的温度下搅拌1-2小时，并进行调配；和
(5)低于60℃下对浓缩液实施微滤灭菌或辐照灭菌。
本发明的口服液中的主要活性成分纳豆激酶，来自能够生产纳豆激酶的枯草杆菌的发酵产物。枯草杆菌作为一种益生菌，在国内外公开的专利和文献中有大量报道，市场上也能够商购得到，例如Bacillus Subtilis AK(PN2003-210136，FERM P-18291 JP)，Bacillus Subtilis MR141(PN 08-154616，FERM P-14692 JP)，Bacillus Subtilis IAM1026(PN 5486467，FERM BP-6713US)，Yunnan SL-001(PN 6420145，FERM BP-4844 US)，Bacillus SubtilisAS2(PN 99/28441，FERM BP-6139 PCT)，Bacillus natto KA145(PN2001-238667，FERM P-17659 JP)，Bacillus natto T0-9(PN 06-261744 FERMP-13164JP)，Bacillus Subtilis M2-4(PN 6767729，FERM BP-7155 US)Bacillus Subtilis TOYO-11 TO 13(PN 2003/013565，FERM BP-8011 TO 8013PCT)，Bacillus natto NLSse(申请号02121352.6，CGMCC NO.0724 CN)，Bacillus Subtilis natto HW4-1(申请号02116667.6，CGMCC NO.0718 CN)，Bacillus natto X-501(申请号00107589.6，CGMCC NO.0449CN)，BacillusSubtilis natto(ASI.1086)，Bacillus SP.CK 11-4(Wonkeuk kim.etl.AmericanSociety for Microbiology，VOL 62.NO.7)等，这些菌种在发酵过程中除能够产生纳豆激酶外，它们各级代谢产物均含有对人体有益的成分，因此都可作为本发明的原料菌种，本发明优选采用纳豆杆菌，其能够通过固体或液体基质发酵产生高效纤溶活性的纳豆激酶或者类似的溶栓酶。
根据选定的菌种，选择其适当的培养条件进行发酵培养，其中，可以选用固体发酵法，把菌种制成菌悬液，接种到固体培养基中，在适宜的条件下进行培养。但是，由于本发明最终需要制成一种口服液，而当采用固体发酵时，需要将发酵产生的纳豆激酶溶解提取出来，反而会使生产工艺复杂、增加生产成本。因此，本发明优选采用液态发酵法，其具体工艺如下：
试管菌种→平板活化→接种→种子液发酵→生产液发酵。
选用纳豆激酶高产菌株，直接在平板上进行分离筛选，分离平板优选为LB-琼脂糖-纤维蛋白平板：LB培养基配制时用0.01M磷酸钾缓冲液(PB pH7.4)溶解，制作平板时，将人血纤维蛋白原和凝血酶溶解于其中，其制作方法同琼脂糖-纤维蛋白平板。
之后进行纳豆激酶的液体发酵培养基的优化，本发明中，根据所选用的不同菌种的最佳培养条件，所用到的发酵培养基中的氮源、碳源和无机盐可以进行选择，例如，氮源可以选择大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、酪蛋白酸水解物以及干大豆粉末等中的一种或多种混合使用，使用的质量浓度优选在0.5-4.0％左右；碳源可以是葡萄糖、木糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖和蔗糖中的一种或多种，使用的质量浓度优选在1.0％-10.0％左右；无机盐可以选择KH2PO4约0.2％、K2HPO4约0.4％、MgSO4约0.05％、和CaCl2约0.02％等。
根据本发明优选的方法，使用纳豆杆菌进行发酵制备种子液，发酵至OD＝0.3-1.0，以1.0-2.0％左右的接种量进行液体深层发酵，发酵温度25-40℃，发酵周期12-35小时，pH为6-8。
发酵后的液体，首先需要进行低速离心，以除去发酵液中的大部分菌体和杂质。离心的转速优选为3000-5000rpm；然后，对离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理，以脱除其中的苦涩味；之后，再进行浓缩，由于本发明中的生产纳豆激酶的菌株在发酵过程中产生的一些有益产物是热敏性的，因此，本发明不适宜采用加热浓缩，适用于本发明的浓缩方法优选为常温超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为50000-200000，超滤压力0.1-0.3MPa，截留率≥90％，浓缩倍数视发酵液中纳豆激酶的纤溶活性而确定，一般在10-30倍左右，较适宜的为20倍左右，以得到所要求浓度的浓缩液。
直接口服该浓缩液会感觉到纳豆特有的成、苦味，对于多数人还是感到不好接受，所以再加入1-3％的环糊精或其衍生物，适当加热(不高于60℃，优选30-60℃)搅拌1-2小时，可达到改善风味的目的，所使用的环糊精或其衍生物是指食品加工中通常使用的，例如β-环糊精(β-CD)、羟丙基-β-环糊精(hp-β-CD)等。当然也可同时加入适合的调味剂适当调配，例如，以最终得到的纳豆激酶口服液的总重量为基准，添加6-8％的蔗糖、0.15-0.25％的酸味剂、适量的功能添加剂和0.005-0.01％的防腐剂，并搅拌均匀。
根据本发明更优选的方案，在加入环状糊精或其衍生物并调配好的浓缩液中加入山楂水提物，所述山楂水提物的制备方法包括将山楂果研磨后加蒸馏水搅拌浸提12-24小时，离心分离收取上清液，制成的口服液中该山楂水提取物占口服液重量的15-30％。
接下来，为延长最终产品的保质期，需要对所制得的口服液进行灭菌及灌装。同样由于纳豆激酶及其它一些热敏性物质的存在，本发明不能采用热压灭菌，必须采用一种“冷杀菌”，即，要求灭菌的温度不能超过60℃，优选在更低的温度下达到有效灭菌。本发明优选可以采用微滤除菌或辐照灭菌。微滤膜孔径0.05-0.45μm，可有效滤去绝大部分的细菌和病毒，之后进行无菌灌装。或者，采用辐照灭菌(采用该处理方法应该先灌装再连同包装一起进行灭菌)，放射源可以为Co60，辐照剂量为1-12Kgy，优选为3-8Kgy。
通过上述步骤得到的纳豆激酶口服液产品，外观基本为近乎无色(采用LB培养基为黄色，若采用优化的培养基则为无色，如果加入山楂水提物则微红色)透明，调配后略有纳豆的气味，加入山楂提取物的口服液则带有山楂的酸甜口味，基本没有纳豆的苦成口味。该口服液产品可在常温下至少保存6个月。
同时，为验证本发明的口服液产品中具有良好的纤溶活性，本发明还对得到的纳豆激酶口服液产品的纤溶活性进行了定性和定量鉴定，具体方法如下：
1、对纳豆激酶口服液的纤溶活性的定性鉴定
参照文献Acta Nutrimenta Sinica，2003，01(25)，1：46-51中的方法，用凝固血块溶解法对纳豆激酶口服液的纤溶活性进行定性鉴定。即，从上述包装好的纳豆激酶口服液成品中吸取1ml用pH＝7.4的PB缓冲液作适当稀释，加到1滴人血形成的血液凝块的试管内。加入了上述纳豆激酶口服液样品的血液凝块在1-2小时内全部溶解，而相应的加入了作为对照的生理盐水的血液凝块没有溶解。
2、对纳豆激酶口服液的纤溶活性的定量鉴定
参照文献Arch Biochem Biophys，1952，40：346-351中的方法，用纤维蛋白平板法对纳豆激酶口服液的纤溶活性进行定量鉴定。制作方法如下：将0.1g琼脂糖溶于10ml PB缓冲液中，加热溶解后，置于45℃保温45分钟。将10mg人血纤维蛋白原纯品溶于10ml PB缓冲液中，45℃水浴10分钟。取1 IU的凝血酶加入琼脂糖溶液中混匀，同时把纤维蛋白原溶液倒入上述混合液中，立即混匀倒入9cm×9cm的培养皿中，室温放置至少一小时，使其充分凝固。将平皿打孔，上样10μl，室温下放置10分钟，再放入37℃恒温培养箱中培养18小时。用游标卡尺测量其溶图直径Φ，根据圆面积公式S＝π×Φ2/4计算出溶圈面积，表示酶活力，或计算出相当尿激酶活力的单位数(定义为IU)。
3、尿激酶标准曲线的测定
取不同的国际单位数(IU)的尿激酶，将其点样于纤维蛋白平板上，37℃培养18小时，用游标卡尺测量其溶圈直径，计算出溶圈面积。以溶圈面积为横坐标(X轴)，以log10IU+2为纵坐标(Y轴)，用Microsoft Excel作出尿激酶标准曲线图，并得出计算公式y＝0.0071x-0.2354。
经测定，本发明的口服液中纳豆激酶的纤溶活性单位在100-400IU/ml，如果每天服用10-20毫升左右，完全可以达到预防和治疗心脑血管疾病、增进健康的目的。
由上述本发明的纳豆激酶口服液及其生产方法可知，本发明具有以下优点：
1.目前世界范围内并没有纳豆激酶口服液的相关报道，因此，本发明在纳豆激酶保健品开发领域内是一项开创性的成果，扩大了纳豆激酶作为保健品的应用领域。
2.本发明的口服液中，含有生物发酵所产生的高活性的纳豆激酶，作为保健品长期饮用，能有效降解人体血栓的骨架成分-纤维蛋白，从而溶解血栓，起到预防和治疗心脑血管疾病的保健作用。
3.由于加工方法的简化，并采用合理的灭菌手段，产品营养成分损失少，最大限度的保留了口服液中纳豆激酶的生物活性和其它热敏性生物活性物质，即，产品中的纳豆激酶纤溶活性较通常的液体发酵产物高。例如，定性检测中加样1ml，在90min内血块全部溶解，而在纤维蛋白平板定量检测中上样50μl，纳豆激酶的纤溶活性可达到150-400个尿激酶单位/ml纳豆激酶发酵浓缩样。
4.本发明通过适当的手段和添加进行调配，有效掩盖了纳豆激酶及其它有益发酵产物特殊的气味，口感有很大改善，适合更广泛的人群。同时利用山楂中的山萜和黄酮等保健成分，制备出的含有山楂水提物的口服液产品更提高了纳豆激酶的功效。
5.本发明选用的液体发酵培养基原料和食品添加剂来源广泛，价格便宜，安全可靠。
6.在筛选高产菌株的过程中，传统的筛选方法一般为生长平板进行菌株的生长培养，而后采用分离平板进行筛选，而本发明经过研究实验，采用了一步分离法进行菌株的生长、分离和筛选，不仅分离效果好，而且大大简化了菌株筛选的步骤，节约了生产时间。
7.在生产的过程中省略了传统的葡聚糖凝胶(G-sphendex Gel)或者柱层析过滤纯化和冷冻干燥得到干品的步骤，因而生产工艺简单，生产成本低廉，生产周期短，产品质量稳定，并且易于实现工业化生产，具有极大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面的实施实例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实例，这些实例不以任何方式限制本发明的范围，本领域的技术人员在权利要求的范围内所做的某些改变和调整也应视为属于本发明的范围。
实施例1
1、发酵
试管菌种→平板活化→接种→种子液发酵→生产液发酵
其中的平板培养基和种子发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基，其配方为：细菌培养用胰化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生产发酵培养基为大豆蛋白胨1.5％、蔗糖2％、KH2PO4 0.2％、K2HPO4 0.4％、MgSO4 0.05％、CaCl2 0.02％。
种子液发酵温度为37℃，发酵至OD660＝0.3-1.0时停止；
取1.0％的种子液接种到5L生产发酵液进行发酵产酶，发酵温度35℃，发酵周期12h，pH6，发酵至产生大量白色的粘性丝状物时停止发酵。
2、发酵液处理
发酵完毕后，先进行低速离心，去除发酵液中的菌体和杂质，转速为3000rpm；
离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理，先期去除发酵液的苦涩味。
3、浓缩
发酵液经过脱炭处理后进行超滤浓缩，以在常温下除去过多的溶剂，使发酵液中的纳豆激酶和其他的活性成分得到有效的富集。超滤膜截留分子量为100000，超滤压力0.1MPa，超滤温度为常温，浓缩倍数为15倍，大约得到0.3L浓缩发酵液。
4、调配过滤
浓缩液中加入约3g的β-环糊精，40℃左右维持搅拌1-2小时，使环糊精完全溶解。
再加入60ml山楂提取液，加入量为上述浓缩液质量的20％(约为最终口服液总重量的16％)，同时按照重量配比分别称取24g的蔗糖、0.03g的苯甲酸钠、0.6g的柠檬酸钠、按顺序加入到0.3L的纳豆激酶浓缩液中，于配料罐中搅拌混合均匀后，进行预过滤，以除去混合液中的杂质。
其中的山楂提取液的制取方法为：称取一定量的山楂果(经筛选和清洗)，研磨后加入5倍水，50℃左右搅拌浸提(150-240rpm)约12-15小时，滤去果渣后离心分离，收取上清液即为山楂提取液。由于果胶的存在，提取液冷却后为粘稠状，所以应保持40-50℃尽快加入上述浓缩液中，调配后的口服液具有一定的澄清度，冷却后有粘稠感，颜色微红。
5、灭菌
灭菌采用微滤除菌，微滤膜孔径0.1μm，用来去除混合液中的微生物(包括细菌、霉菌、酵母菌和病毒)和大分子物质(分子量超过50000)，延长产品的保质期。
6、灌装
产品灭菌后，按照无菌操作的要求，将药液灌装到紫外线灭过菌的容量为10ml的安培瓶中，即得到最终产品。
本实施例中的最终产品外观为微红色的透亮液体，酸甜适口，纤溶活力高，达到2300IU/支，能有效的预防和治疗心脑血管疾病。该口服液产品常温可保存6个月以上。
实施例2
1、发酵
试管菌种→平板活化→接种→种子液发酵→生产液发酵
其中的平板培养基，种子发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基，其配方为：细菌培养用胰化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生产发酵培养基为大豆蛋白胨0.5％、蔗糖1.5％、KH2PO4 0.2％、K2HPO40.4％、MgSO4 0.05％、CaCl2 0.02％。
种子液发酵温度为37℃，发酵至OD660＝0.3-1.0时停止；
取2％的种子液接种到5L生产发酵液进行发酵产酶，发酵温度30℃，发酵周期30h，pH8，发酵至产生大量白色的粘性丝状物时停止发酵。
2、发酵液处理
发酵完毕后，先进行低速离心，去除发酵液中的菌体和杂质，转速为5000rpm；
离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理，去除发酵液的苦涩味。
3、浓缩
发酵液经过脱炭处理后进行超滤浓缩，主要是为了在常温下除去过多的溶剂，使发酵液中的纳豆激酶和其他的活性成分得到有效的富集。超滤膜截留分子量为80000，超滤压力0.3MPa，超滤温度为常温，浓缩倍数为25倍，大约得到0.2L浓缩发酵液。
4、调配过滤
浓缩液中加入约4g的β-环糊精(最终产品中β-环糊精的含量在2％左右)，40℃左右维持搅拌1-2小时，使环糊精完全溶解。
按照重量配比分别称取0.6g的蛋白糖、3g的蜂蜜，0.02g的苯甲酸钠、0.3g的柠檬酸钠、4g的木糖醇，0.5g的卵磷脂，加入到纳豆激酶浓缩液中，于配料罐中搅拌混合均匀后，进行预过滤，以除去混合液中的杂质。
5、灌装
按照无菌操作的要求，将药液灌装到紫外线灭过菌的容量为10ml的安培瓶中。
6、灭菌
灭菌采用辐照灭菌，放射源为Co60，辐照剂量为6.5Kgy，以杀死混合液中的微生物，延长产品的保质期。
本品外观为无色透亮液体，酸甜适口，纤溶活性约3200IU/支，营养丰富，添加的卵磷脂能对纳豆激酶起到协同增效的作用，同时本产品加入了功能性低聚多糖，不仅能有效的预防和治疗心脑血管疾病，也是糖尿病患者的良好保健品。本实施例的口服液产品常温下可保存8个月以上。
实施例3
1、发酵
试管菌种→平板活化→接种→种子液发酵→生产液发酵
其中的平板培养基，种子发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基，其配方为：细菌培养用胰化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生产发酵培养基为大豆蛋白胨2.5％、蔗糖6.0％、KH2PO4 0.2％、K2HPO40.4％、MgSO4 0.05％、CaCl2 0.02％。
种子液发酵温度为37℃，发酵至OD660＝0.4-0.8时停止；
取2％的种子液接种到5L生产发酵液进行发酵产酶，发酵温度37-38℃，发酵周期30h，pH7，发酵至产生大量白色的粘性丝状物时停止发酵.
2、发酵液处理
发酵完毕后，先进行低速离心，去除发酵液中的菌体和杂质，转速为4000rpm；
离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理，去除发酵液的苦涩味。
3、浓缩
发酵液经过脱炭处理后进行超滤浓缩，超滤膜截留分子量为200000，超滤压力0.3Mpa，超滤温度为常温，浓缩倍数为10倍，得到大约0.5L发酵浓缩液。
4、调配过滤
浓缩液中加入15g的羟丙基-β-环糊精，40℃左右维持搅拌1-2小时，使环糊精完全溶解。
再加入山楂提取液(提取及加入方法同实施例1)，加入量为上述浓缩液质量的25％，按照重量配比分别称取40g的蔗糖，0.05g的苯甲酸钠，1g的柠檬酸，1g的VE，1g的VC加人到纳豆激酶浓缩液中，于配料罐中搅拌混合均匀后，进行预过滤，以除去混合液中的杂质。
5、灌装
按照无菌操作的要求，将药液灌装到紫外线灭过菌的容量10ml的安培瓶中。
6、灭菌
灭菌采用辐照灭菌，放射源为Co60，辐照剂量为8Kgy，以杀死混合液中的微生物，延长产品的保质期。
本品外观为微红色的透亮液体，营养丰富，酸甜适口，纤溶活性约1800IU/支，能有效的预防和治疗心脑血管疾病，并能清除体内的有害自由基，起到延缓衰老，增进健康的作用。
口感试验
50名试验者(随机挑选)，分别给予不同样品(调味辅料的添加完全相同)品尝，统计他们的反映，结果如下：
可见，加入2％环糊精调配后的发酵液已经能被多数人接受，而再加入山楂提取液后，口感更有显著改善。
山楂水提物的加入对溶栓效果的影响：
用纤维蛋白平板法验证山楂水提物的协同效果：按照下表所示的实验安排，分别从准备好的1#，2#，3#样品中吸取50μl，加到提前制备好的含有凝血酶和纤维蛋白原的纤维蛋白平板内，于37℃下静置18个小时，观察反应，统计相应的溶圈直径，计算出相应的溶圈面积.实验结果发现，2#明显比1#的溶圈面积大22％左右，而作为对照的3#样品的血液凝块没有溶解，说明纳豆激酶和山楂水提物在溶栓作用上存在协同效果.
纳豆激酶和山楂水提物协同效果实验
样品 1# 纳豆激酶发酵 液20ml+无 菌水5ml 2# 纳豆激酶发酵 液20ml+山楂 水提物5ml 3# 山楂水提物 1ml 溶圈面积(mm2) 316.45 386.24 不溶解
实施例1
1、发酵
试管菌种→平板活化→接种→种子液发酵→生产液发酵
其中的平板培养基和种子发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基，其配方为：细菌培养用胰化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生产发酵培养基为大豆蛋白胨1.5％、蔗糖2％、KH2PO4 0.2％、K2HPO4 0.4％、MgSO4 0.05％、CaCl2 0.02％。
种子液发酵温度为37℃，发酵至OD660＝0.3-1.0时停止；
取1.0％的种子液接种到5L生产发酵液进行发酵产酶，发酵温度35℃，发酵周期12h，pH6，发酵至产生大量白色的粘性丝状物时停止发酵。
2、发酵液处理
发酵完毕后，先进行低速离心，去除发酵液中的菌体和杂质，转速为3000rpm；
离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理，先期去除发酵液的苦涩味。
3、浓缩
发酵液经过脱炭处理后进行超滤浓缩，以在常温下除去过多的溶剂，使发酵液中的纳豆激酶和其他的活性成分得到有效的富集。超滤膜截留分子量为100000，超滤压力0.1MPa，超滤温度为常温，浓缩倍数为15倍，大约得到0.3L浓缩发酵液。
4、调配过滤
浓缩液中加入约3g的β-环糊精，40℃左右维持搅拌1-2小时，使环糊精完全溶解。
再加入60ml山楂提取液，加入量为上述浓缩液质量的20％(约为最终口服液总重量的16％)，同时按照重量配比分别称取24g的蔗糖、0.03g的苯甲酸钠、0.6g的柠檬酸钠、按顺序加入到0.3L的纳豆激酶浓缩液中，于配料罐中搅拌混合均匀后，进行预过滤，以除去混合液中的杂质。
其中的山楂提取液的制取方法为：称取一定量的山楂果(经筛选和清洗)，研磨后加入5倍水，50℃左右搅拌浸提(150-240rpm)约12-15小时，滤去果渣后离心分离，收取上清液即为山楂提取液。由于果胶的存在，提取液冷却后为粘稠状，所以应保持40-50℃尽快加入上述浓缩液中，调配后的口服液具有一定的澄清度，冷却后有粘稠感，颜色微红。
5、灭菌
灭菌采用微滤除菌，微滤膜孔径0.1μm，用来去除混合液中的微生物(包括细菌、霉菌、酵母菌和病毒)和大分子物质(分子量超过50000)，延长产品的保质期。
6、灌装
产品灭菌后，按照无菌操作的要求，将药液灌装到紫外线灭过菌的容量为10ml的安培瓶中，即得到最终产品。
本实施例中的最终产品外观为微红色的透亮液体，酸甜适口，纤溶活力高，达到2300IU/支，能有效的预防和治疗心脑血管疾病。该口服液产品常温可保存6个月以上。
实施例2
1、发酵
试管菌种→平板活化→接种→种子液发酵→生产液发酵
其中的平板培养基，种子发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基，其配方为：细菌培养用胰化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生产发酵培养基为大豆蛋白胨0.5％、蔗糖1.5％、KH2PO4 0.2％、K2HPO40.4％、MgSO4 0.05％、CaCl2 0.02％。
种子液发酵温度为37℃，发酵至OD660＝0.3-1.0时停止；
取2％的种子液接种到5L生产发酵液进行发酵产酶，发酵温度30℃，发酵周期30h，pH8，发酵至产生大量白色的粘性丝状物时停止发酵。
2、发酵液处理
发酵完毕后，先进行低速离心，去除发酵液中的菌体和杂质，转速为5000rpm；
离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理，去除发酵液的苦涩味。
3、浓缩
发酵液经过脱炭处理后进行超滤浓缩，主要是为了在常温下除去过多的溶剂，使发酵液中的纳豆激酶和其他的活性成分得到有效的富集。超滤膜截留分子量为80000，超滤压力0.3MPa，超滤温度为常温，浓缩倍数为25倍，大约得到0.2L浓缩发酵液。
4、调配过滤
浓缩液中加入约4g的β-环糊精(最终产品中β-环糊精的含量在2％左右)，40℃左右维持搅拌1-2小时，使环糊精完全溶解。
按照重量配比分别称取0.6g的蛋白糖、3g的蜂蜜，0.02g的苯甲酸钠、0.3g的柠檬酸钠、4g的木糖醇，0.5g的卵磷脂，加入到纳豆激酶浓缩液中，于配料罐中搅拌混合均匀后，进行预过滤，以除去混合液中的杂质。
5、灌装
按照无菌操作的要求，将药液灌装到紫外线灭过菌的容量为10ml的安培瓶中。
6、灭菌
灭菌采用辐照灭菌，放射源为Co60，辐照剂量为6.5Kgy，以杀死混合液中的微生物，延长产品的保质期。
本品外观为无色透亮液体，酸甜适口，纤溶活性约3200IU/支，营养丰富，添加的卵磷脂能对纳豆激酶起到协同增效的作用，同时本产品加入了功能性低聚多糖，不仅能有效的预防和治疗心脑血管疾病，也是糖尿病患者的良好保健品。本实施例的口服液产品常温下可保存8个月以上。
实施例3
1、发酵
试管菌种→平板活化→接种→种子液发酵→生产液发酵
其中的平板培养基，种子发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基，其配方为：细菌培养用胰化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生产发酵培养基为大豆蛋白胨2.5％、蔗糖6.0％、KH2PO4 0.2％、K2HPO40.4％、MgSO4 0.05％、CaCl2 0.02％。
种子液发酵温度为37℃，发酵至OD660＝0.4-0.8时停止；
取2％的种子液接种到5L生产发酵液进行发酵产酶，发酵温度37-38℃，发酵周期30h，pH7，发酵至产生大量白色的粘性丝状物时停止发酵.
2、发酵液处理
发酵完毕后，先进行低速离心，去除发酵液中的菌体和杂质，转速为4000rpm；
离心后的上清液，采用砂棒过滤器进行脱炭处理，去除发酵液的苦涩味。
3、浓缩
发酵液经过脱炭处理后进行超滤浓缩，超滤膜截留分子量为200000，超滤压力0.3Mpa，超滤温度为常温，浓缩倍数为10倍，得到大约0.5L发酵浓缩液。
4、调配过滤
浓缩液中加入15g的羟丙基-β-环糊精，40℃左右维持搅拌1-2小时，使环糊精完全溶解。
再加入山楂提取液(提取及加入方法同实施例1)，加入量为上述浓缩液质量的25％，按照重量配比分别称取40g的蔗糖，0.05g的苯甲酸钠，1g的柠檬酸，1g的VE，1g的VC加人到纳豆激酶浓缩液中，于配料罐中搅拌混合均匀后，进行预过滤，以除去混合液中的杂质。
5、灌装
按照无菌操作的要求，将药液灌装到紫外线灭过菌的容量10ml的安培瓶中。
6、灭菌
灭菌采用辐照灭菌，放射源为Co60，辐照剂量为8Kgy，以杀死混合液中的微生物，延长产品的保质期。
本品外观为微红色的透亮液体，营养丰富，酸甜适口，纤溶活性约1800IU/支，能有效的预防和治疗心脑血管疾病，并能清除体内的有害自由基，起到延缓衰老，增进健康的作用。
口感试验
50名试验者(随机挑选)，分别给予不同样品(调味辅料的添加完全相同)品尝，统计他们的反映，结果如下：
可见，加入2％环糊精调配后的发酵液已经能被多数人接受，而再加入山楂提取液后，口感更有显著改善。
山楂水提物的加入对溶栓效果的影响：
用纤维蛋白平板法验证山楂水提物的协同效果：按照下表所示的实验安排，分别从准备好的1#，2#，3#样品中吸取50μl，加到提前制备好的含有凝血酶和纤维蛋白原的纤维蛋白平板内，于37℃下静置18个小时，观察反应，统计相应的溶圈直径，计算出相应的溶圈面积.实验结果发现，2#明显比1#的溶圈面积大22％左右，而作为对照的3#样品的血液凝块没有溶解，说明纳豆激酶和山楂水提物在溶栓作用上存在协同效果.
纳豆激酶和山楂水提物协同效果实验
样品 1# 纳豆激酶发酵 液20ml+无 菌水5ml 2# 纳豆激酶发酵 液20ml+山楂 水提物5ml 3# 山楂水提物 1ml 溶圈面积(mm2) 316.45 386.24 不溶解