磷酸化酶的制造方法

摘要

本发明提供一种以高纯度，且简便地从磷酸化酶生产菌制造磷酸化酶的方法。即，本发明的磷酸化酶制造方法是在磷酸类或其盐浓度为50mM以上的培养基中培养磷酸化酶生产菌，提取培养基中生成的磷酸化酶的制造方法。

权利要求

1.一种磷酸化酶的制造方法，其特征在于：在磷酸类或其盐浓度为400mM～1.2M的培养基中，培养明串珠菌(Leuconostoc)属的细菌，提取培养基中生成的蔗糖磷酸化酶。

2.一种磷酸化酶的制造方法，其特征在于：在磷酸类或其盐浓度为100mM～600mM的培养基中，培养棒杆菌(Corynebacterium)属的细菌，提取培养基中生成的麦芽糊精磷酸化酶。

说明书

磷酸化酶的制造方法

技术领域

[0001] 本发明是关于由磷酸化酶生产菌制造磷酸化酶的方法。

背景技术

[0002] 磷酸化酶是在无机磷酸的存在下对基质糖类加磷酸分解进行催化的酶，根据基质糖的种类，已知有麦芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、麦芽糖磷酸化酶，纤维二糖磷酸化酶，海藻糖类磷酸化酶等。 各种磷酸化酶类，可作为反应基质的无机磷酸和糖类的定量用酶试剂使用，或者利用反应的可逆性，作为在基质中利用磷酸化糖进行各种配糖物合成等的酶使用。

[0003] 已知磷酸化酶在明串珠菌(Leuconostoc)属等许多微生物的菌体内或细胞内被作为酶含有。

[0004] 为了将磷酸化酶用于上述目的，最好是将酶调制物的纯度提高到某种程度，为了得到这样的酶调制物，培养磷酸化酶生产菌后，需要经过菌体(细胞)回收，菌体洗净、菌体破碎、酶分回收、精制等复杂的工序(例如，参照专利文献1～5)。 此时，为了破碎菌体，需要添加溶菌酶和螯合剂等，此外，由于绝大部分的菌体成分被溶出，所以加大了为提高磷酸化酶纯度的精制工序的负荷。

[0005] 作为降低这种负荷的方法，已知有利用培养基组成最佳化等，提高磷酸化酶水平的方法(例如，参照专利文献6～7)。 通过使用遗传重组体，生成高纯度的目的磷酸化酶的方法，(例如，参照非专利文献1，专利文献3～5)、和简单的精制方法(例如，参照专利文献8)等。 然而，并没有变更工序的实质，未必就能满足要求， [0006] 专利文献1：日本特开平1-91778号公报

[0007] 专利文献2：日本特开平8-280382号公报

[0008] 专利文献3：日本特开平10-14580号公报

[0009] 专利文献4：日本特开平10-276785号公报

[0010] 专利文献5：日本特开平10-327887号公报

[0011] 专利文献6：日本特开平2-154686号公报

[0012] 专利文献7：日本特开平3-4785号公报

[0013] 专利文献8：日本特开平2002-345458号公报

[0014] 非专利文献1：Kitao等，J.Ferment.Bioeng.，73，179-184(1992) 发明内容

[0015] 本发明涉及提供一种既简单又有效地从磷酸化酶生产菌制造磷酸化酶的方法。 [0016] 本发明者发现在高浓度磷酸培养基上培养磷酸化酶生产菌时，在培养上清液中以高效率生产磷酸化酶，不进行从菌体内回收酶等操作，就能有效地制造磷酸化酶。 [0017] 即，本发明提供的磷酸化酶制造方法，其特征在于，在磷酸类或其盐浓度为50mM以上的培养基中，培养磷酸化酶生产菌，提取培养基中生成的磷酸化酶。 [0018] 本发明提供一种磷酸化酶类或其盐浓度为50mM以上的磷酸产生用培养基。 [0019] 根据本发明，培养磷酸化酶生产菌后，回收培养上清液(去除细胞)、精制，以极简单的工序既简单又有效地制造磷酸化酶。

具体实施方式

[0020] 作为本发明中使用的磷酸化酶生产菌，是菌体内或细胞内具有磷酸化酶的菌，只要是在一定浓度的磷酸类或其盐存在下，在培养上清液中产生磷酸化酶就可以，例如有属于以下属的细菌，即埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、链球菌(Streptococcus)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、栖热菌(Thermus)属、热球菌(Thermococcus)属、栖热孢菌(Thermotoga)属、明串珠菌(Leuconostoc)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、梭菌(Clostridium)属、醋杆菌(Acetobacter)属、芽霉菌(Pullularia)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、Synecoccus属、曲菌(Aspergillus)属、念珠菌(Monilia)属、Sclerotinea属、Chlamydomonas属、乳杆菌(Lactobacillus)属、Neiserria属、肠球菌(Enterococcus)属、乳球菌 (Lactococcus)属、邻单胞菌(Plesiomonas)属、链孢菌(Catellatospora)属、动孢囊菌(Kineosporia)属、微球菌(Micrococcus)属、节杆菌(Arthrobacter)属、短状杆菌(Brevibacterium)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、沙雷氏菌(Seratia)属、链霉菌(Streptomyces)属、黄单胞菌(Xanthomonas)属、热厌氧菌(Thermoanaerobium)属、Rhizopus属、毛壳菌(Chaetomium)属、Acreomonium属、Byssochilamys属、Cercospora属、Glomerella属、Humicola属、Myceliophthora属、Rhizomucor属、Rosellinia属、Sclerotinia 属、Sporidiobolus属、Sterigmatomyces属、Thermoascus属、Thielavia属、Tyromyces属、欧文氏菌(Erwinia)属、瘤胃球菌(Ruminococcus)属、纤维弧菌(Cellvibrio)属。 [0021] 此类磷酸化酶生产菌，也可以是天然的或通过实施UV照射和化学突变剂，例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG))和甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate(EMS))(C.Guhrie & G.R.Fink，Methods inEnzymology vol.194，pp273-281 Academic Press Inc.等的处理，提高产生磷酸化酶能力的突变株。 [0022] 其中，优选明串珠菌(Leuconostoc)属、棒杆菌(Corynebacterium)属的细菌、在明串珠菌(Leuconostoc)属中更优选肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、谲诈明串珠菌(Leuconostoc fallax)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、阿根廷明串珠菌(Leuconostocargetinum)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)，在棒杆菌(Corynebacterium)属中更优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、霍氏棒杆菌(Corynebacterium hoagii)、Corynebacterium vitaeruminis、多毛棒杆菌(Corynebacterium pilosum)。 其中，特别优选肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)KSM-SP1(FERM P-19737)及肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)KSM-SP78(FERM AP-20037(独立行政法人产业技术总合研究所 专利生物寄托中心( 305-8566日本国茨城县つくば市东1 丁目1番地1中央第6)、平成16年4月28日受领))、Corynebacteriumvitaeruminis、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KSM-MP669(FERM AP-20036(独立行政法人产业技术总合研究所 专利生物寄托中心( 305-8566日本国茨城县つくば市东1丁目
1番地1中央第6)、平成16年4月28日受领)

[0023] 磷酸化酶的制造，是通过将上述磷酸化酶生产菌，在磷酸类或其盐浓度50mM以上的培养基(磷酸化酶产生用培养基)中培养进行。

[0024] 作为培养基中添加的磷酸类或其盐，例如有磷酸、偏磷酸、三聚磷酸、聚磷酸、二磷酸、聚偏磷酸及它们的盐。作为磷酸类的盐，优选钠盐、钾盐。 作为特别优选的磷酸类盐，例如有磷酸一钾、磷酸二钾、磷酸一钠、磷酸二钠等。 更优选将磷酸类和其盐或多种磷酸类的盐混合使用

[0025] 培养基中磷酸类或其盐的浓度，一般从效果考虑，必须在50mM以上，优选50mM～1.5M，更优选50mM～1M，特别优选100mM～1M。在明串珠菌(Leuconostoc)属的细菌中，优选为400mM～1.2M，在棒杆菌(Corynebacterium)属中，优选100mM～
600mM。

[0026] 本发明中使用的培养基，只要是能产生磷酸化酶生产菌的就可以，除了上述磷酸和其盐外，还可使用含有碳源、氮源、金属矿物类、维生素等的液体培养基等。 [0027] 作为培养基中添加的糖，有单糖，二糖，低聚糖，多糖。 也可以混合这些的两种以上使用。

[0028] 作为糖以外的碳源，例如有乙酸盐等有机盐。作为氮源。 例如有氨、氯化铵、硫酸铵，硝酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵等无机和有机铵盐、尿素、胨，肉膏、酵母提取液，酪蛋白水分解物等含有氮有机物，甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸等氨基酸等。 作为金属矿物制类，例如有氯化钠、硫酸亚铁、硫酸镁，硫酸锰，硫酸锌、硫酸钙等，它们可单独使用，或根据需要混合使用。

[0029] 培养方法是适当调整pH和温度，形成能能充分培育微生物的条件。培养方式，除了振荡培养，厌氧培养，静置培养，利用发酵槽的培养之外，还可使用休止菌体反应和固定化菌体反应。

[0030] 这样，在高浓度磷酸培养基中，培养磷酸化酶生产菌，以高收效 在培养上清液中生产蓄积磷酸化酶，只要对其提取，就能很容易地获得目的磷酸化酶。 [0031] 从培养基中提取磷酸化酶的方法，按照公知的方法进行即可，例如通过以下组合进行，即，分离去除菌体、超滤、盐折、离子交换、疏水色谱分析、凝胶过滤、干燥等。 制作固定化酶时，利用向菌体外产生，可以不需要烦杂的作业。 [0032] 对于所得的磷酸化酶的活性测定，可使用通常的磷酸化酶活性测定法，例如有Weinhausel(Enzyme Microb.Technol.，17，140-146(1995)的方法。

[0033] 根据本发明，可直接在菌体外产生磷酸化酶，不必进行菌体破碎等烦杂的作业，就可以得到的酶。 进而，向培养基中只添加低分子化合物的磷酸类，所以大大降低了精制工序的负荷，可以很容易地调制出高纯度的磷酸化酶制品。

[0034] 通过向培养液中直接加入二糖、低聚糖、多糖和磷酸类或其盐等基质，不需要特殊作业就可以产生糖磷酸，进而，利用糖苷配基形成的化合物及糖磷酸与培养液直接作用，不用特别操作也可以得到配糖物。

[0035] 实施例

[0036] 实施例1利用链球菌属细菌产生磷酸化酶。

[0037] 将利用MNNG处理(C.Guhrie & G.R.Fink，Methods in EnzymologyVol 194，pp273-281Academic Press Inc.)对肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、JCM9693肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)JCM9695、阿根廷明串珠菌(Leuconostoc argetinum)JCMll052、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)JCMl1045和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)JCM9693株进行处理，得到的磷酸化酶高生产突变株肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)KSM-SPl(FERM P-19737)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)KSM-SP78(FERM AP-20037)，涂抹在MR琼脂培养基(Oxoid社制)上，在厌氧条件下，以30℃培养。 将一白金线圈的该菌接种到液体培养基上(1％酵母提取液(Difco社制)、1％聚胨(日本制药制)、0.04％硫酸镁七水合物、0.02％氯化锰四水合物、0.0002％硫酸铁四水合物、 400、800、1000mM的磷酸缓冲液，
5％、10％ 15％的蔗糖)，在30℃静置培养2天，利用离心分离除去菌体，测定培养上清液的蔗糖磷酸化酶活性。

[0038] 上清液的蔗糖磷酸化酶活性，将Weinhausel(Enzyme Microb.Technol.，17，140-146(1995)的方法作了部分改变进行的，向96穴微型板上适宜稀释的20μL培养上清液样品中，加入180μL酶反应液(200mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、90mM蔗糖、100mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.8)、2mM EDTA、10mM硫酸镁、2mM NAD、10μM葡萄糖-1，
6-二磷酸、1.2unit/ml磷酸葡糖变位酶(来自兔肌肉，Rochediagnostics社制)、1.2unit/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，Rochediagnostics社制))，在37℃下测定引起340nm的G1P生成的吸光度上升。 1个单位(U)的酶，作为1分钟内生成1μmol葡萄糖-1-磷酸(G1P)的量，结果如表1所示。

[0039] 表1

[0040] 菌体外蔗糖磷酸化酶活性(U/L)

[0041]

[0042] 由表1可以确认，通过提高培养基中的磷酸浓度，提高了菌体外产生磷酸化酶的量。

[0043] 实施例2利用棒状杆菌属细菌生产磷酸化酶

[0044] 利 用MNNG处 理， 对Corynebacterium vitaeruminis JCM1323、 美 棒 杆 菌(Corynebacterium callunae)IFO15359、 谷 氨 酸 棒 杆 菌(Corynebacterium glutamicum)JCM1321和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)JCM1321进行处理，将得到的