降低玉米基食物中丙烯酰胺的方法、含减量丙烯酰胺的玉米基食物以及商品转让专利
申请号 : CN200480017748.7
文献号 : CN1812726B
文献日 : 2010-06-09
发明人 : L·M·特拉斯 , S·P·金莫曼 , D·V·齐扎克 , P·Y·T·林 , M·斯托加诺维克 , R·A·桑德斯 , M·D·M-S·韦尔里戈兰 , J·K·霍伊 , R·G·夏弗梅尔
申请人 : 宝洁公司
摘要 :
一种降低玉米基食品中丙烯酰胺的方法、含减量丙烯酰胺的玉米基食品以及商品。在一个方面，所述方法包括在最终加热(例如烹制)前，降低玉米基食品物料中的天冬酰胺含量。在另一个方面，所述方法包括向玉米基食品物料中加入能够水解游离天冬酰胺的酰胺基的酶。在另一个方面，商品还告知消费者玉米基食品含有减量或低含量的丙烯酰胺或天冬酰胺。
权利要求 :
1.一种降低玉米基食品物料中天冬酰胺含量的方法，所述方法包括在加热前将谷氨酰胺酶加入所述食品物料中。
2.如权利要求1所述的方法，其中天冬酰胺的含量降低了至少10％。
3.一种降低玉米基食品物料中天冬酰胺含量的方法，所述方法包括：(1)将谷氨酰胺酶加入食品物料中，其中所述食品物料包含天冬酰胺；
(2)任选地将所述酶和所述食品物料混合；
(3)给予充分的时间，使所述酶与所述天冬酰胺反应；和(4)任选地使所述酶失活或任选地将所述酶除去。
4.一种降低玉米基食品物料中丙烯酰胺含量的方法，所述方法包括在加热前通过将谷氨酰胺酶加入所述玉米基食品物料中降低所述玉米基食品物料中的天冬酰胺含量。
5.一种降低玉米基食品中丙烯酰胺含量的方法，所述方法包括：(1)将谷氨酰胺酶加入玉米基食品物料中，其中所述玉米基食品物料包含天冬酰胺；
(2)任选地将所述酶与所述玉米基食品物料混合；
(3)给予充分的时间，使所述酶与所述天冬酰胺反应；
(4)任选地使所述酶失活或任选地将所述酶除去；和(5)加热所述玉米基食品物料以形成最终玉米基食品。
说明书 :
发明领域
本发明涉及减少玉米基食品中的丙烯酰胺以及含减量丙烯酰胺的玉米基食品。本发明进一步涉及一种商品。
发明背景
自出现文明以来，含碳水化合物的食物已成为人们饮食中的主要部分。如今，含碳水化合物的食物(如面包、早餐谷类食物、饼干、脆饼、曲奇、炸薯条、熟淀粉质蔬菜、塔可饼饼皮以及点心)被普遍地食用。许多这些含碳水化合物食物为玉米基或包含玉米基的成分。虽然无数年来这些玉米基食品已成为人们饮食的一部分，但研究人员近来才发现，许多这些食物包含丙烯酰胺。
2002年4月，Swedish National Food Administration和Stockholm University的研究人员宣布了他们的发现：在许多种烹制的食物中产生了丙烯酰胺，一种可能致癌的化学物质。丙烯酰胺在老鼠体内具有与食物中其它致癌物类似的致癌能力，但对于人类，其在食物中的相对致癌能力还是未知的。对于丙烯酰胺，只有有限的人口资料，并且这些资料不能证明职业性接触丙烯酰胺有致癌的危险。(FAO/WHO Consultation on the Health Implications of Acrylamidein Food：Summary Report；Geneva，Switze rland，2002年6月25至27日。)
虽然需要进一步研究来确定人们以通常存在于上述食物中的含量食用丙烯酰胺可产生怎样的健康影响(若存在的话)，但许多消费者对此表示关注。因此，本发明的一个目的是提供一种降低玉米基食物中丙烯酰胺含量的方法。本发明还有一个目的是提供含减量丙烯酰胺的玉米基食品。此外，本发明还有一个目的是提供一种商品，该商品告知消费者该玉米基食品含有减量或低含量的丙烯酰胺。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种降低玉米基食品中丙烯酰胺含量的方法。在一个实施方案中，该方法包括在加热前将降低天冬酰胺的酶加入玉米基食品物料中。
在另一个方面，本发明提供了一种降低玉米基食品物料中天冬酰胺含量的方法。在一个实施方案中，该方法包括在加热前将降低天冬酰胺的酶加入玉米基食品物料中。
在另一个方面，本发明提供了具有减量丙烯酰胺的玉米基食品。
在另一个方面，本发明还提供了一种商品，该商品告知消费者该玉米基食品含有减量或低含量的丙烯酰胺或天冬酰胺。
本文所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
附图简述
图1列出了所提出的反应机理，根据该机理，丙烯酰胺形成于天冬酰胺和羰基源(如葡萄糖)。R1和R2可以是H、CH3、CH2OH、CH2(CH2)nCH3，或任何其它组成还原糖的组分；n可以是任何小于10的整数。
图2列出了所提出的反应机理，根据该机理，天冬酰胺酶与天冬酰胺反应以阻止丙烯酰胺的形成。
图3列出了天冬酰胺和天冬氨酸LC分析的样本色谱图。x轴表示保留时间，而y轴表示响应。
发明详述
申请者已发现，加热时，天冬酰胺(存在于几乎所有生物系统中的天然存在的氨基酸)可产生丙烯酰胺。从而加热时，含天冬酰胺越多的食物趋于包含越高含量的丙烯酰胺；当在存在还原糖的情况下加热含天冬酰胺食物时尤其如此。还已发现，当食物被烹制到较低的最终含水量时，生成的丙烯酰胺较多。
不受理论的约束，据信通过图1中所列的反应机理，在玉米基食品中产生丙烯酰胺。据信，游离天冬酰胺的α-氨基与羰基源反应形成席夫(Schiff)碱。加热条件下，该席夫碱加合物脱去羧基形成产物，该产物可以：(1)水解形成β-丙氨酸酰胺(加热条件下该化合物可进一步降解形成丙烯酰胺)，或(2)分解形成丙烯酰胺和相应的亚胺。(申请者已发现，环状前体的原子包含丙烯酰胺中的碳原子和氮原子。)
因此，申请者已进一步发现，通过在烹制前将食物中的天冬酰胺除去或转变为别的物质，可减少加热食品中丙烯酰胺的形成。因此，当加热含有减量天冬酰胺的玉米基食物时，形成的丙烯酰胺量被减少。
申请者已发现，在加热(例如烹制)食物前，加入可水解天冬酰胺侧链上酰胺基的酶，减少存在于最终食品中丙烯酰胺的含量。不受理论的约束，据信加入上述酶可使天冬酰胺的侧链降解，从而阻止天冬酰胺形成丙烯酰胺。在这种情况下，酰胺键被水解，并且天冬酰胺被转变为天冬氨酸。该反应机理列于图2中。
在玉米基食品加工中使用酶的优点是许多的。这些优点包括：(a)它们是天然、无毒的物质；(b)它们通常催化指定的反应，而不会产生无需的副反应；(c)在非常温和的温度和pH值条件下，它们具有活性；(d)在低浓度下，它们具有活性；(e)通过调节温度、pH值和所用酶的量，可控制反应速率；以及(f)在反应进行到所需程度后，它们可被失活。(“Food Chemistry”，第4版，Owen R.Fennema编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1985年，第427、433页。)
A.降低玉米基食品中丙烯酰胺的方法
在一个方面，本发明提供了一种降低玉米基食品中丙烯酰胺的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在最终加热(例如烹制)前，降低玉米基食品物料中的天冬酰胺含量。在另一个方面，所述方法包括向玉米基食品物料中加入能够水解游离天冬酰胺的酰胺基的酶。优选的酶是天冬酰胺酶。
在另一个方面，本发明提供了一种降低玉米基食品中天冬酰胺的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向玉米基食品物料中加入能够水解游离天冬酰胺的酰胺基的酶。优选的酶是天冬酰胺酶。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种降低玉米基食品中丙烯酰胺含量的方法，所述方法包括：
(1)将降低天冬酰胺的酶加入玉米基食品物料中，其中所述玉米基食品物料包含天冬酰胺；
(2)非必需地将所述酶与所述玉米基食品物料混合；
(3)给予充分的时间，使酶与天冬酰胺反应；
(4)非必需地将酶失活或非必需地将酶除去；和
(5)加热所述玉米基食品物料以形成最终的玉米基食品。
1.将降低天冬酰胺的酶加入玉米基食品物料中，其中所述玉米基食品物料包含天冬酰胺
本文所用的“降低天冬酰胺的酶”包括任何能够降低玉米基食品物料中天冬酰胺含量的酶。在一个实施方案中，该降低天冬酰胺的酶是能够水解游离天冬酰胺的酰胺基的酶。可用于本文的优选酶是天冬酰胺酶。天冬酰胺酶的优选来源是Sigma-Aldrich，目录号为#A2925。可用于本文的另一个优选酶是谷氨酰胺酶。
本文所用术语“降低天冬酰胺的酶”和“酶”包括一种或多种酶；例如，该术语包括两种或多种酶的混合物。例如，具有天冬酰胺还原功能的脱酰氨基酶包括于该术语中。
本文所用的“玉米基”是指包含50％至100％的玉米。
本文所用的“玉米基食品物料”包括，但不限于任何类型含天冬酰胺的玉米基食物、玉米基食品、玉米基食物成分或它们的混合物。
玉米基食品物料可以是任何合适的形式，包括未加工的、干燥的、加工过的或预处理的。预处理玉米食品物料的合适方法可包括，但不限于，热烫、蒸、煮、切碎、浸渍、粉碎、减小粒径、加热干燥以及它们的组合。例如，玉米基食品物料可包括整颗玉米粒、粉碎的、玉米穗上或离开玉米穗的、部分玉米粒、颗粒结合体、粉末结合体(例如，粗粉或面粉)、已用任何方式(如，用碱例如石灰处理进行化学加工，例如在制作面团或浸渍粉糊)预处理过的烹制玉米粒以及它们的组合。在一个实施方案中，玉米基食品物料可以是用于制作其它食物的玉米基食物。
本文可使用任何合适的玉米。玉米类型可包括，但不限于，臼齿玉米、硬质玉米、粉玉米、甜玉米、爆玉米、荚玉米、蜡质品种以及它们的组合。玉米的颜色可包括，但不限于黄色、白色、蓝色以及它们的组合。玉米可来源自自然选择、杂交、基因改性以及它们的组合。
本文所用的向玉米基食品物料中“加入”酶包括，但不限于，任何将天冬酰胺和酶放在一起的方法。
可将酶以任何合适的形式加入到玉米基食品物料中。例如，酶可以粉末或溶液状(如，溶解在水中)加入。此外，还可将酶以任何合适的方式加入到玉米基食品物料中，如直接(例如，淋洒、倾倒或喷洒在玉米基食品物料上)或间接加入。在一个实施方案中，将酶与另一种不含天冬酰胺的食品物料混合，然后将所得混合物加入含天冬酰胺的玉米基食品物料中。
在另一个实施方案中，将酶加入基质(如，淀粉、二氧化硅)中；这有利于将酶均匀地加入玉米基食品物料中。所加酶的量与该酶所加入的玉米基食品物料的量相比相对较小。因此，通过加入酶作为稀释基质体系的一部分，可将更大量的酶/基质共混物加入玉米基物料中以获得相同的酶含量。
在另一个实施方案中，将至少一部分天冬酰胺从玉米食品物料中提取出来，所得提取物用酶处理，然后将至少一部分提取物加回到至少一部分玉米基食品物料中；例如，可将该酶加入到流液中，或将流液经由固定酶床或固定酶柱(在柱中，酶被吸附或化学键合在基质上，优选为惰性基质，如塑料片或小珠)吸出。
此外，可将酶在任何合适的加工阶段、或在不止一个加工阶段加入玉米基食品物料中。例如，酶可在玉米基食品物料加工或制作之前、之中或之后加入；酶可在将玉米基食品物料加入其它食品成分之前、之中或之后加入食品中；酶可在食品制作之后但最终加热之前加入食品中；以及它们的变化和组合。例如，可在混合用于制造加工玉米点心的玉米面团时将酶与面团成分混合。
加入酶的量可取决于天冬酰胺的减少量，以及由此所期望的丙烯酰胺的减少量。加入酶的量还可取决于玉米基食品原料中存在的天冬酰胺量；天冬酰胺含量较高的玉米基食品原料一般需要增加酶的量或增加反应时间，以达到相同的丙烯酰胺的减少量。加入酶的量还取决于所用的具体酶(例如，酶降解天冬酰胺的具体能力)和所处理的具体玉米基食品物料。
酶是按照活性单位来销售的，而不是按照重量或体积。因此，获得期望的最终玉米基食品丙烯酰胺减少量所需酶的有效量将取决于所用具体酶产品的活性。
本领域的技术人员将能够依据具体的玉米基食品物料、具体的酶、酶的具体活性和期望的结果，决定酶的有效量。
2.非必需地将酶与玉米基食品物料混合
非必需地但优选地将酶与玉米基食品物料充分混合。可使用任何合适的混合方法。在一个实施方案中，混合与玉米基食品物料的浸渍和酶的加入同时进行。
3.给予充分的时间，使酶与天冬酰胺反应
酶与天冬酰胺反应所需的时间取决于以下因素，包括，但不限于，所期望的丙烯酰胺减少量、具体玉米基食品物料的性质(如化学组成、天冬酰胺的含量、粒径)以及加入的具体酶。优选使酶反应充分的时间以得到一种玉米基食品物料，其中天冬酰胺的含量已降低至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，还更优选至少约70％，甚至更优选至少约90％。通常，让酶反应的时间越长，天冬酰胺减少的量就越大，因此丙烯酰胺减少的量也就越大。给予充分的时间使酶反应的步骤可以任何合适的方式进行；例如，该步骤可与将酶加入到玉米基食品物料中、酶与玉米基食品物料混合，或它们的组合同时进行。
如本领域所知，pH值和温度是影响酶活性的因素。本领域的技术人员应易于确定这些和其它参数(如含水量)的最佳条件。此外，具体酶的最佳pH值和温度条件典型地在文献中和/或酶供应商处获得。
4.非必需地将酶失活或非必需地将酶除去
在酶已反应至所需程度后，可非必需地使其失活，或从玉米基食品原料中除去。当使用可安全食用的酶(如天然存在和存在于普通玉米基食物中)时，可选择不将酶失活或除去。可供选择地，可使用任何合适的失活酶方法使酶失活。例如，通过利用热、pH调节、用蛋白酶处理或它们的组合可使酶失活。此外，可使用任何合适的方法将酶从玉米基食品物料中除去，该方法包括但不限于提取。酶可被失活、除去，或联合进行失活和除去。
酶失活可与其它加工步骤同时进行。例如，酶失活步骤可以是玉米干燥或湿磨加工步骤的一部分。在一个实施方案中，在浸渍粉糊产生过程中加入高pH的石灰水使酶改性。在另一个实施方案中，酶在浸渍粉糊加工的加热干燥过程中失活。
5.加热玉米基食品物料形成最终的玉米基食品
然后可以通常的方式加热玉米基食品物料，如烘烤、油炸、挤压、烘干(如，借助真空烘箱或滚筒式干燥机)、膨化或微波。在加热步骤中，可将至少一部分酶加入到玉米基食品物料中。可通过加热使酶失活，从而非必需的失活步骤和烹制步骤可同时进行。经烹制的加热处理可使酶变性和失活，使得玉米基食品物料不再具有持续的酶活性。并且在加热步骤中，给予至少一部分时间使酶进行反应。
本文所用术语“最终玉米基食品”或“玉米基食品”包括，但不限于，准备食用的玉米基食物和用作制作其它玉米食品成分的玉米基食物。
优选最终玉米基食品中丙烯酰胺的含量降低了至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，还更优选至少约70％，甚至更优选至少约90％。
B.实施方法的方式
可以任何合适的方式来实施本发明。例如，可以分批、半分批或连续的方式来实施本发明的方法。
C.含减量丙烯酰胺的玉米基食品
依照本文方法制作的玉米基食品可具有的丙烯酰胺减少量为至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，还更优选至少约70％，甚至更优选至少约90％。
本文的方法可被应用于生产任何合适的玉米基食品，包括，但不限于，制作时加热的含碳水化合物玉米基食物，尤其是低水分玉米基食物(如，少于约10％的水分)。例如，该方法可用于降低存在于加工点心、早餐谷类食物、面包、饼干、脆饼、烤油酥饼、比萨硬壳、椒盐卷饼、玉米饼、玉米面豆卷外壳、粗玉米糊、玉米粥、玉粉糊、油炸玉米球、爆米花、爆米花产品、玉米热狗、面粉、面团、淀粉、混合物、面糊、饮料(如，酒精饮料如威士忌)、饼馅、汤、肉汁、炖肉、炖牛肉、动物食物(如，狗食、猫食、雪貂食、豚鼠食、兔子食、大鼠食、小鼠食、鸡食、火鸡食、猪食、马食、山羊食、绵羊食、猴子食、鱼食)，和任何其他含玉米的食品中的丙烯酰胺含量。
在一个实施方案中，未经发酵的玉米片的丙烯酰胺含量小于约75ppb，优选小于约50ppb，更优选小于约10ppb。
在另一个实施方案中，玉米片的丙烯酰胺含量小于约75ppb，优选小于约50ppb，更优选小于约10ppb。
在另一个实施方案中，玉米基早餐谷类食物，优选玉米片含小于约60ppb丙烯酰胺，优选小于约40ppb丙烯酰胺，更优选小于约20ppb丙烯酰胺，最优选小于约10ppb丙烯酰胺。
在一个优选实施方案中，未经发酵的玉米片由处理过的干面团粉制成。在一个优选实施方案中，可用水将干面团粉再水化制成面团，然后用该面团制作未经发酵的玉米片，如Zimmerman等人在2001年12月6日公布的WO 01/91581中所描述的。
虽然本文的方法通常是用优选的玉米基食品来描述，但本领域的技术人员应该知道，本文的方法可应用于任何合适的玉米基食品。
1.干磨的玉米基食品物料
本文的方法可用于制作干磨玉米产品。用干磨制成的这类产品可包括，但不限于，粗磨玉米粉、玉米粗粉和玉米面。这些干磨产品可用于制作食品，如早餐谷类食物、混合物(如，薄烤饼、甜面包、松饼)、焙烤品、点心、包衣(如，面包屑或面糊)、面包块或比萨的抗粘剂以及婴儿食物。
在典型的干磨过程中，清洁玉米粒然后使用本领域熟知的方法除菌。然后研磨干燥的玉米制成干磨玉米产品。根据本发明，酶可在研磨之前、之中或之后或其组合加入玉米中。
例如，酶可在干磨之前的洗涤步骤中加入，其中水量和接触时间的长度都增加以得到充分的酶反应时间。在一个实施方案中，在高压和/或高温(如酶未失活或变性的压力和温度)下将酶加入水合玉米中。如本领域的技术人员可容易确定的，可使用任何合适的水-玉米比率。玉米粒接触水的时间长度应当足够长，以使水透过果皮传送至谷粒内部的柔软胚乳。优选玉米接触水的时间长度是不会发生谷粒的过度膨胀。理想的是，当在用显微镜在偏振光下观察时，谷粒内的玉米淀粉颗粒将保持双折射特性。如本领域的技术人员可容易确定的，可使用任何合适的水-玉米接触时间以得到所需的天冬酰胺的减少量。水温可稍微升高以使水能够更快地扩散透过果皮。优选该温度可使玉米淀粉颗粒保持双折射(未胶凝化)。优选搅拌水和玉米粒混合物。
然后玉米优选在灭菌之前干燥。玉米可用许多方法来干燥，这些方法包括，但不限于，烘箱、流化床、干燥塔或填料床单元操作中所使用的传导、对流空气、或辐射热传递模式。优选将干燥条件设成可提供包含约1％至约50％水分，优选约5％至约35％水分，更优选约10％至约30％水分，最优选约15％至约25％水分的玉米粒。然后，将玉米干磨。可使用本领域已知的技术来干燥和研磨玉米，如存在于Corn Chemistry and Technology，Watson，S.A.和Ramstad，P.E.，AACC Monograph Series，1987年(下文“Corn Chemistry andTechnology”)，351至376页中的那些。
在另一个实施方案中，将玉米粒灭菌，然后浸泡在酶的水溶液中。
在另一个实施方案中，洗涤过程中酶处理过的玉米用来制作干磨产品，然后该干磨产品再用酶处理。优选搅拌总混合物。合适的混合方法可包括但不限于带叶轮式搅拌器的间歇储罐、持续搅拌式的罐式反应器、活塞流搅拌器反应器、使用分散气相作为提供运动的方式的流化床搅拌器、或可以是单或多螺杆构型的挤出式搅拌器。混合和搅拌的程度可以不同以改善酶与玉米之间的接触从而缩短所需的接触时间，同时还保持玉米产品的其它所需性质。然后将干磨的玉米产品干燥。合适的干燥方法可包括，但不限于滚筒干燥、喷雾干燥、喷雾冷却、流化床炉或塔或喷射区型烘干机，如本领域已知的那些。
本新工艺的优选实施方案包括直接使用润湿状态的处理过的干磨产品来制作最终用途的产品；这避免了额外的步骤和干燥此物料所消耗的能量。湿的处理物料可以与其它干原料组分的混合物形式使用以形成部分或完全水合的面团组合物，所述组合物可非必需接收更多添加的水。
在另一个实施方案中，将酶粉末加入研磨过的干玉米产品中。说明书包含在此干玉米产品的包装上，它指导产品的使用者将适量的水加入产品中，以使在加工成食品时酶将天冬酰胺转变成天冬氨酸。此外，此含干燥酶的玉米研磨产品的生产者可提供说明书，详细说明可获得所需的减少量的适当温度、水、pH和培育时间。
在另一个实施方案中，酶可在加工或制作成品如早餐谷类食物或点心时加入。酶处理可在制作成品的任何生产步骤中进行，这些步骤包括但不限于将研磨的玉米产品与水或其它润湿成分混合、挤压、研磨面团、或将面团制成片，所述面团包含所述的研磨玉米产品和非必需地其它成分。可用任何可行的方法将酶加入研磨的玉米产品中，这些方法包括但不限于将酶加入水或另一种随后与研磨的玉米产品混合的液体中、在与其它干或湿成分混合之前或之中将酶加入至研磨的玉米产品、在挤出研磨的玉米产品时注入酶溶液、混合、挤出或研磨成片后将酶溶液喷、抹或滴在研磨的玉米产品上。在加工最终用途产品时处理研磨的玉米是优选的，因为如果干磨玉米产品在制作最终用途产品之前单独酶处理，可避免加入干燥步骤。
在另一个实施方案中，处理的物料与其它已预先水合的成分混合以形成颗粒状、附聚的颗粒或面团结合体。
在另一个实施方案中，干磨玉米产品与组成最终食品的其它原料同时一起用酶处理。干物料可首先共混成单独、均一化的干混合物或在与水和酶混合物混合过程中混合。
2.湿磨的玉米基食品物料
对湿磨操作而言，用酶处理玉米的优选方法是在原有的浸泡、烹制或浸渍过程中加入酶。使用此现有步骤避免了引入额外的加工复杂性。这些水接触过程的目的是软化玉米粒以使得能够增加处理化学药品的扩散、玉米粒组分的分离或通过研磨的粒径减小。水接触过程应当保持在通常用于递送所需的玉米产品属性的条件下，前提条件是温度保持在对酶的稳定性有害的水平以下。这些条件典型地包括水-玉米的比率、接触时间、压力和温度。为了确保酶的功能性，优选任何可能影响酶功效的成分(如改变pH的组分)在酶培育期之后加入。
在一个实施方案中，用于淀粉生产的玉米浸渍的水体积为每907kg(2000磅)玉米粒约1.2m3至1.4m3。优选浸渍玉米约22小时至约50小时以使果皮和胚乳能够软化，并使玉米在浸渍过程中的水分增加为约16％至约45％。浸渍水优选加热至约29℃(85°F)至约65℃(150°F)，更优选约38℃(100°F)至约57℃(135°F)，最优选约49℃(120°F)至约54℃(130°F)的温度。加工助剂如二氧化硫可非必需加入水中，通过帮助破坏蛋白质淀粉基质，使水能够更快地扩散到谷粒基质中。浸渍可用间歇或优选连续方法进行。典型地，该方法包括一系列浸渍槽，其中浸渍水逆流从一个槽流向另一个槽。湿磨玉米的方法可见于Corn Chemistry and Technology，第377至397页。
特定的湿磨方法包括面团的生产，如本领域所已知的，其为具有与众不同纹理和风味的研磨石灰烹制玉米。参见，例如，CornChemistry and Technology，第410至411页。以这种方法处理的玉米最经常用于制作诸如未经发酵的玉米片、玉米粉圆饼和玉米片这类的制品。面团可被加工来直接制造玉米基食品如未经发酵的玉米片，或者它可被研磨并干燥制成面团粉用于以后的加工。
制作面团的方法涉及在石灰水溶液中烹制整粒玉米，然后在无额外热量的情况下浸渍。然后用水洗涤该软化的石灰处理的玉米，脱水，然后研磨成所需的颗粒状。面团有几种用法。它可直接喂入成型挤出机中制成点心产品或送至片成型体系中，然后被烹制(如，烘焙、烧烤)制成传统的玉米粉圆饼。此外，未经发酵的玉米片可通过直接油炸最终的玉米粉圆饼或面团而制成。非必需面团可干燥并筛分制成面团粉。
酶可在面团或食品制作过程的多个加工步骤中加入。优选处理在面团制作过程的早期进行，以使得有足够的停留时间来完成天冬酰胺的酶转化，并且在面团粉制作过程的干燥步骤之前，或制作玉米粉圆饼或面团基点心食物的烹制步骤之前，因为一定量的丙烯酰胺可能会在此干燥步骤中形成。优选酶处理在pH调节(如，加入石灰)之前进行，以得到天冬酰胺减少的最大功效。
在面团制作方法的一个实施方案中，使用传统的间歇烹制或浸渍方法将玉米加工成面团或面团粉。用于烹制或浸渍玉米的水量可表示成无量纲的水重量与玉米重量的重量比。优选此比率为约0.6至约3.0，更优选约1.0至约2.0，更优选约1.0至约1.5，最优选约1.2至约1.5。石灰可于任何时候加入水中，在烹制过程之前或之中以获得所需的最终产品特性。在传统的方法中，石灰优选先于玉米加入烹制水中以使玉米与石灰水溶液的接触时间最大。
优选在本方法中，将石灰加入已用酶预先处理过的玉米中。在一个实施方案中，石灰是含水或无水形式的氢氧化钙。加入水中的石灰量可表示为无量纲的石灰重量与玉米重量的重量比。石灰与玉米的重量比率优选为约0.01至约5.0，更优选约0.10至约2.0，更优选约0.20至约1.0，最优选约0.20至约0.75。烹制时间优选为约1至约120分钟，更优选约4至约60分钟，更优选约4至约45分钟，最优选约20至约45分钟。烹制水的温度优选为约54℃(130°F)至约100℃(212°F)，更优选约65℃(150°F)至约93℃(200°F)，最优选约71℃(160°F)至约90℃(195°F)。烹制后玉米浸渍或浸泡在石灰水中的时间优选为约0.1至约48小时，更优选约2至约24小时，更优选约2至约16小时，最优选约4至约12小时。在浸渍过程中在无额外热量的情况下使石灰水冷却。制作面团的可供选择的方法可包括，但不限于，在无石灰的水中烹制，然后在浸渍过程中加入石灰，在烹制步骤后将水换成无石灰的新鲜水，或在烹制后将水换成新的石灰水溶液。使用石灰水可能与加入的酶不相容，尤其是如果pH非常高，如大于10。在pH很高的情况下，优选酶在石灰水处理之前或之后加入。然而，可在面团加工中的任何合适的时间使用酶。
面团加工的一个实施方案是传统的面团制作方法，其包括以下步骤：
(1)将玉米与水和石灰混合形成混合物；
(2)烹制该混合物；
(3)浸渍该混合物形成浸渍粉糊；
(4)非必需地洗涤和/或中和浸渍粉糊，优选用酸溶液；
(5)研磨浸渍粉糊形成面团；
(6)非必需地将面团与其它成分混合；
(7)非必需地将面团输送至加工设备如挤出机或压片机-切割机；
(8)非必需地将面团经过制作加工如挤压、压片、切割或它们的组合。
(9)烹制面团，优选使用焙烤和/或油炸，制成最终的食品；和
(10)在上述步骤1至8中的任何一个之前、之中和/或之后加入酶。
对于制作面团粉的过程，可在将浸渍粉糊研磨成面团之后使用以下步骤。用以下步骤处理未预先处理或预先处理的面团。通常，该方法包括：
(1)干燥面团；
(2)非必需地筛分该面团；和
(3)非必需地将酶加入面团中。
在一个实施方案中，预先处理的面团进一步用酶处理以获得更多的天冬酰胺、从而丙烯酰胺的减少。
同样，可使用可供选择的面团和面团粉制作方法，包括但不限于有或无石灰的挤出，如美国专利5,558,886和4,985,269中所述，持续烹制-浸渍方法，使用谷粒的分离组分的持续生产，如美国专利6,068,873中所述，或本领域的技术人员所已知的其它方法。减少天冬酰胺的酶处理可在上述方法的任何合适步骤中或任何可供选择方法的任何合适步骤中进行，非必需地在多个步骤中或与多个处理一起进行。将酶加入玉米产品中进行处理的方法包括但不限于将干燥酶加入玉米中，在烹制之前、之中或之后将酶加入烹制水中，在浸渍之前、之中或之后加入酶，在洗涤之前、之中或之后加入酶；在洗涤步骤中加入酶非必需地使玉米浸泡在酶溶液中，在研磨之前或之中加入干燥酶或非必需地水溶液中的酶，在混合时加入干燥或含水的酶，在挤出或压片时加入干燥或含水的酶，或在研磨、混合、挤出或压片之前、之中或之后将酶水溶液喷、抹或滴在面团上。在面团制作过程中这些可供选择的处理玉米方法必需不影响降低天冬酰胺含量的功效，前提条件是在不显著降解酶的温度下使降低天冬酰胺的酶保持充足的停留时间。最适宜的条件可从具体酶的制造商处获得，或者本领域的技术人员可容易确定酶处理的适宜条件。
干面团粉酶处理的非必需方法是以干粉形式将酶加入面团粉中。例如，当作为干粉加入时，最终使用者可加入水使酶能够在面团粉加工成制成食品时将天冬酰胺转化成天冬氨酸。酶可非必需地被除去或失活。水可在培育期后非必需地被除去。这种含干燥酶的面团粉的生产者可提供说明书，详细说明获得所需减少量的适当温度、水、pH、和培育时间。
面团粉和预先胶凝化或预先烹制的玉米粉可以可供选择用挤出型方法制作，其中玉米用单或多螺杆输送通过精密公差的机罩如筒或轴。保持挤出物的温度以避免酶组合物降解是重要的。优选将酶体系引入挤出机的第一区中，其中设置温度和停留时间以有利于酶的最佳活性。更优选两个挤出机串联使用，其中第一个挤出机用作引入酶体系的搅拌器以使所述酶体系在有利于酶最大转换的条件下与玉米完全接触。最优选玉米与预混机中的酶体系在引入挤出过程之前预处理。混合体系可包括，但不限于间歇釜、连续釜、活塞流反应器、S形搅拌器、带状或桨状搅拌器、行星状搅拌器、粉碎搅拌器、流化床、或喷雾冷却操作或它们的组合。
相应地，用于湿磨操作的玉米可首先进行酶预处理以获得低的天冬酰胺含量，然后以润湿状态向前进行后续的加工或可供选择干燥并保存以便以后使用。
可供选择地，从玉米湿磨操作中得到的包括但不限于玉米粥、粗玉米糊、浸渍粉糊、面团和淀粉物的最终产品在湿磨制造后可用酶处理。
3.由脱水玉米产品制成的玉米基食物
脱水玉米产品可按原样使用或可非必需再水合并用以制造玉米基食品如玉米糊、玉米粥、玉米面包、玉米松饼、玉米粉圆饼、粗玉米糊和其它玉米点心如玉米片和挤出的玉米糕饼。脱水玉米产品也可用于面包、肉汁、沙司、婴儿食物或任何其它合适的玉米基食品。在一个实施方案中，玉米基食品用作油炸食物如鱼、夏南瓜、蘑菇和奶酪棒的包衣。在另一个实施方案中，所述产品用作隔离剂，例如喷洒在比萨底部或比萨盘上以有利于将比萨从盘中取出。所述产品也可用作面包条的隔离剂。
酶处理的脱水玉米产品可用于制作加工玉米点心，优选未经发酵的玉米片或玉米片。在优选的实施方案中，在点心制作过程中使用附加酶(除了用于制作加工脱水玉米产品的酶以外)以便进一步增加丙烯酰胺的减少量。
在一个实施方案中，制作的玉米点心可用以下方法制作，该方法包括：
(1)将降低天冬酰胺的酶加入包含玉米面团的玉米基面团中；
(2)由生面团制成点心坯；和
(3)烹制点心坯，制成加工点心。
在另一个实施方案中，可用以下方法制作加工点心，该方法包括：
(1)混合包含面团粉和非必需其它成分的干成分；
(2)加入水；
(3)制成面团；
(4)非必需地制成面片；
(5)制成点心坯；和
(6)烹制点心坯，制成加工点心；
(7)在上述步骤(1)至(5)中任何一个之前、之中或之后加入降低天冬酰胺的酶。
在本发明的一个实施方案中，由面团制成的未经发酵的玉米片用以下方法制作，该方法包括：
(1)将酶加入包含面团和非必需地其它成分的面团中；
(2)由生面团制成点心坯；和
(3)烹制点心坯，制成未经发酵的玉米片。
在另一个实施方案中，由面团粉制成的未经发酵的玉米片用以下方法制作，该方法包括：
(1)混合包含面团粉和非必需地其它成分的干成分；
(2)可非必需地向干成分中加入乳化剂；
(3)加水；
(4)混合形成生面团；
(5)制成面片；
(6)由面片制成点心坯；
(7)烹制点心坯，制成加工点心；和
(8)在上述步骤(1)至(6)中任何一个之前、之中或之后加入降低天冬酰胺的酶。
可在该方法的任何合适步骤中加入酶，例如，可在混合、可非必需地，加入乳化剂、加入水、混合和/或成形步骤中加入酶。可供选择地，可将酶(优选以溶液的形式)涂抹到面团表面；这可在由面片制成点心坯之前或之后进行。在一个实施方案中，将酶溶液加到面片的表面上。
可用任何合适的方法进行烹制，例如油炸、烘烤，或油炸或烘烤的组合。此外，成形和烹制步骤可同时进行，例如通过挤压。
在一个实施方案中，未经发酵的玉米片的丙烯酰胺含量小于约75ppb，优选小于约50ppb，更优选小于约10ppb。
在另一个实施方案中，玉米片的丙烯酰胺含量小于约75ppb，优选小于约50ppb，更优选小于约10ppb。
D.商品
本发明的另一个实施方案是商品，其包括：
(a)玉米基食品，其中所述玉米基食品含有减量的丙烯酰胺；
(b)用于装盛所述玉米基食品的容器；和
(c)与容器有关的提示信息。
该提示信息告诉使用者，该玉米基食品包含减量的丙烯酰胺。该提示信息可以是直接或间接附在容器上、直接或间接附在容器附近的印刷物，或可供选择地，可以是与玉米基食品或与容器相结合的印刷、电子或广播提示信息。
在本发明的一个实施方案中，含减量丙烯酰胺的玉米基食品提供在具有与此有关提示信息的容器中。可配发、呈现、展示或储存玉米基食品的任何容器均是合适的。合适的容器包括，但不限于，袋、罐、盒、碗、盘、盆和筒。
该提示信息告诉消费者，该玉米基食品包含减量的丙烯酰胺。该提示信息可以是直接或间接附在容器上、直接或间接附在容器附近的印刷物，或可供选择地，可以是与玉米基食品或与容器相结合的印刷、电子或广播提示信息。合适的提示信息包括，但不限于，告知“减量”或“少量”丙烯酰胺的提示信息，告知含有小于规定量丙烯酰胺(如小于5ppb)的提示信息，以及告知该玉米基食品达到或超过建议量或强制量(如规定的阈值或正常含量)的提示信息。
在另一个实施方案中，该提示信息告知消费者该玉米基食品由具有减量或少量天冬酰胺的一种或多于一种的成分制成。
分析方法
用特定的分析方法量化用于表征本发明元素的参数。这些方法详细描述如下。
1.丙烯酰胺
测定食品中丙烯酰胺(AA)的方法
概述
将1-13C-丙烯酰胺(13C-AA)掺入到食品中，然后用热水萃取。用乙酸乙酯萃取含水上清液三次，然后合并乙酸乙酯萃取物，并浓缩，然后用带有特别检测AA和13C-AA的选择性离子监测的LC/MS分析。
样品的萃取
1.称量6.00±0.01g样品，放于125mL锥形瓶中。注意：将样品放到食品加工机中，并脉动30秒，使粒径达约0.32cm(1/8英寸)或更小。如果样品太小以致不能在食品加工机中被有效地粉碎，则将样品置于一个新塑料袋中(如Whirl-PakTM或等效物)，然后用橡皮锤粉碎，直至粒径达约0.32cm(1/8英寸)或更小。
2.使用可调节的1000-μL移液管(已校准)将120μL的100ng/μL 13C-AA去离子蒸馏水溶液(ISTD 2)直接加在样品上。
3.使用分配器，将40mL去离子蒸馏水加入到烧瓶中，并以箔覆盖。
4.于65℃的水浴中放置30分钟。
5.用分配器将10mL 1，2-二氯乙烷加入到烧瓶中，然后用Tekmar TissumizerTM(SDT-1810)或Ultra-(T18 Basic)匀化30秒，或直至均匀。用去离子蒸馏水冲洗探头，洗液接至该烧瓶中。
6.将25g均匀混合物放入到8打兰的小瓶中。
7.盖紧管口，然后以262至544弧度/秒(2500至5200rpm)的速度离心30分钟。
8.将8g上清液小心地转移到另一个8打兰的小瓶中，注意不要将固体颗粒转移过去。
9.用分配器加入10ml乙酸乙酯，盖上盖，并涡旋10秒。
10.使所有乳液破乳；这可借助于涡旋或振荡一次或两次，然后使各层分开。
11.将尽可能多的上层(乙酸乙酯)转移到闪烁管中，而不要转移界面处的任何液体(水)。每次用5ml乙酸乙酯萃取两次以上，并加入到同一个闪烁管中。然后，加入约2g无水硫酸钠。
12.在60℃至65℃的水浴中，用和缓的氮气流将该萃取物浓缩至约1mL。将该萃取物转移到Pierce REACTI-VIALTM或等效的锥形玻璃瓶中，并进一步浓缩该萃取物，直至最终体积约为100μL至200μL。将该萃取物放入到带锥形套管的自动取样瓶中。
标准物的配制
储备液和内标物
溶液 重量 容量瓶 溶剂 浓度(ppm) 储备液1 0.1000g丙烯酰胺 (AA) 100ml 乙酸乙酯 1000 ISTD 1 0.0100g 13C-丙烯酰胺 100ml 乙酸乙酯 100 储备液2 0.1000g丙烯酰胺 (AA) 100ml 去离子蒸馏水 1000 ISTD 2 0.0100g 13C-丙烯酰胺 100ml 去离子蒸馏水 100
中间标准物
溶液 储备液1AA的体积(μL) 容量瓶 (ml) 溶剂 浓度 (ppm) INT 1 100 10 乙酸乙酯 10 INT 2 1000 10 乙酸乙酯 100
校正标准物
标准物 体积 INT 1 (μL) 体积 INT 2 (μL) ISTD 1 的体积 (μL) 容量瓶 (ml) 溶剂 浓度 AA (ppm) 浓度 ISTD 1 (ppm) 0 0 0 450 10 乙酸乙酯 0 4.50 0.25 250 0 450 10 乙酸乙酯 0.250 4.50 0.75 750 0 450 10 乙酸乙酯 0.750 4.50 1.5 0 150 450 10 乙酸乙酯 1.50 4.50 3.0 0 300 450 10 乙酸乙酯 3.00 4.50 5.0 0 500 450 10 乙酸乙酯 5.00 4.50
匀化器清洁方法
在测定每个样品的间隔，用该清洁方法清洁匀化器。
1.将热自来水注入一个1L的锥形瓶中(≈80％满)，然后加入一滴DawnTM餐具洗涤液(购自Procter & Gamble Co.)或等效物。
2.将分散元件的探头尽可能深地插入到水中。
3.将溶液匀化约10至15秒。
4.将洗涤液从锥形瓶中倒出；用热自来水冲洗并再注入该锥形瓶。
5.再次匀化约10至15秒。
6.将锥形瓶倒空，再注入热自来水；再次匀化约10至15秒。
7.如果水不澄清且有颗粒物，则继续按需要多次匀化干净的热自来水，直至达到这个条件。
8.当热自来水澄清且无颗粒物时，用去离子蒸馏水冲洗探头。
用LC/MS分析
使用连接在Micromass LCZ质谱仪上的Waters 2690LC，对样品进行分析。
流动相 100％H2O，10mM NH4Ac，pH值调节至4.6w/甲酸 色谱柱 2.0mm x 150mm，YMC C18AQ(购自Waters Corp.) 流速 0.2ml/min 界面 直接(无分层) 进样体积 5μL
流动相 100％H2O，10mM NH4Ac，pH值调节至4.6w/甲酸 Ms离子化方式 电喷雾，正离子模式 MS检测方式 选择性离子监测：m/z 72(AA)，m/z 73(13C-AA)；停 留时间：0.5秒
数据分析
对于一系列乙酸乙酯中的五个标准样品，将响应比(AA峰的面积/13C-AA峰的面积)对相应的浓度比作图。所有标准样品包含4.5μg/ml的13C-AA，并且AA的浓度为0μg/ml至5μg/ml。线性回归产生标准曲线，借助该标准曲线，从所测定的响应比中确定萃取物中的浓度比。当该浓度比乘以在萃取方法的步骤二加入到样品中的精确已知的13C-AA含量(标称2ppm)时，就可得到AA的ppm含量。
LC/MS的样品计算：
通过将y轴上的响应比(m/z 72的面积/m/z 73的面积)，对x轴上的浓度比([AA]/[13C-AA])作图，产生标准曲线。对于本实施例，该线的方程是y＝0.899x+0.0123。
4.0分钟时AA峰(m/z 72)的测定面积：100,000
4.0分钟时13C-AA峰(m/z 73)的测定面积：500,000
响应比Rr＝0.200。从标准曲线的斜率和截距，计算浓度比Rc为：Rc＝(0.200-0.0123)/0.899＝0.209
已知样品中13C-AA的掺入量(2ppm)，则AA的测定含量为0.209 x 2ppm＝0.418ppm
质量保证/质量控制(QA/QC)
1.在准备标准物和/或样品时使用的所有天平，必须每周用一系列标准砝码检查它们的校准。这些天平应使用至少三个覆盖待测样品/标准物重量范围的砝码来检查。
2.应每天作出六个点的校准曲线。
3.应使用每一组样品分析工作参考物质(WRM)。该物质浓度的游动平均值应在2σ之内。如果不在该范围内，则该仪器应重新校准，并重新计算WRM。
2.天冬酰胺
测定食物和饮料制品中的天冬酰胺和天冬氨酸
原理
将已称过重量的样品与5％HCl混合，并加热30分钟，然后匀化。将一部分均匀混合物离心，然后将一部分上清液稀释，并用FMOC试剂(9-芴甲基氯甲酸酯)处理，该试剂与天冬酰胺和天冬氨酸反应形成强荧光衍生物。然后用反相HPLC将FMOC-天冬酰胺从其它样品基质组分中分离开来。在260nm处激发，检测313纳米(nm)处的荧光发射。已知浓度的标准物分析可进行定量。
线性度
四个标准样品(50至600ppm)的工作标准曲线给出的相关性为0.998或更高。由2000ppm的样品得出的曲线也给出了0.998的相关性。
精度
马铃薯制品：
马铃薯淀粉中掺入四种含量的天冬酰胺和天冬氨酸(40、200、400和600ppm)。天冬酰胺的回收为100％(相对标准偏差小于4％)，而天冬氨酸的回收为110％(相对标准偏差小于4％)。
参考文献
1.Herbert，P.；Santos，L；Alves，A.Journal of Food Science(2001年)，第66卷(第9期)，第1319至1325页。
2.Heems，Dany；Luck，Geneviewe；Fraudeau，Chrisophe；Verette，Eric.Journal of Chromatography，A(1998年)，第798卷(第1+2期)，第9至17页。
体系可重复性
在五天内一式两份平行测定薯片的工作参考物质。结果如下：
ug/g ug/g
天冬酰胺 天冬氨酸
平均值 7832.07 1440.98
STD 625.59 195.80
％RSTD 7.99 13.59
以下是建议使用的化学药品和仪器；然而，等效物质的替换是可接受的。
化学药品
水，HPLC级或Milli-QTM级(Millipore)
乙腈，HPLC级 Burdick & Jackson#AH015-4
甲醇，HPLC级 Fisher#A452-4
乙酸乙酯 Baker#9280-3
戊烷 Burdick & Jackson#GC312-4
天冬酰胺一水合物 EM Science
天冬氨酸 Sigma#A-8949
氨基异丁酸 Sigma#A-8379
9-芴基氯甲酸酯(FMOC) ICN#150200
硼酸钠 EM Science#SX 0355-1
硼酸 Fisher#A-73
碳酸氢钠 ICN#194847
四甲基氯化铵 Fisher#04640-500
柠檬酸钠 MCB#SX445
无水柠檬酸 Baker#0122-01
丙酮 Burdick & Jackson#010-4
盐酸，0.1N Fisher#SA48-500
二水氯化钙 Aldrich#22,350-6
设备
移液管，聚乙烯(Samco#222)
容量瓶(25、100、250、1000mL)
定容吸移管(10mL)
量筒(100至1000mL)
HPLC贮液器(500ml、1L或2L)
烧杯
磁力搅拌器/搅拌子
分析天平(4位)
闪烁管
离心管，螺帽盖(100x16mm)
自动取样瓶(8x30mm，1mL)，卡口帽
安全性：该方法需要使用通风橱，并且涉及接触化学药品。请查阅关于通风橱使用和化学品溅出的安全规章。
色谱柱
Phenomenex Luna 100 x 4.6mm C-18(2)3微米#00D-4251-EO
配制试剂
稀释剂(pH 8.3至8.5；1000mL)。
1.称量3.0克硼酸钠、3.0克硼酸和8.0克碳酸氢钠于一个已去皮重的干燥烧杯中。
2.在磁力搅拌器上放置一个空的800mL烧杯。加入约500mLMilli-QTM水和搅拌子。剧烈搅拌水，但不要喷溅出来。
3.将步骤1的试剂定量转移到水中；搅拌直至其完全溶解。
4.将步骤3的溶液定量转移到1L的容量瓶中，并用Milli-QTM水稀释至容积；混合均匀。可稳定放置最多六(6)个月。
氯化钙溶液(100克)。
1.称量40克二水合氯化钙于已去皮重的250ml烧杯中。
2.加入60克Milli-QTM水。混和均匀。在环境条件下保存于有盖的玻璃瓶中。可稳定放置最多1年。
萃取溶剂(戊烷∶乙酸乙酯80∶20；500mL)
安全性：戊烷和乙酸乙酯是易挥发和易燃的。在通风橱中进行以下操作。
1.将400mL戊烷转移至500mL HPLC贮液瓶中。
2.加入100mL乙酸乙酯。混和均匀。在通风橱中/下盖上盖保存。
流动相(缓冲剂∶甲醇∶乙腈60∶5∶35，pH 3.2，2L)
1.称量1.35克四甲基氯化铵、3.65克柠檬酸和1.60克柠檬酸钠于已去皮重的干燥烧杯中。
2.在磁力搅拌器上放置一个空的800mL烧杯。加入约500mLMilli-QTM水和搅拌子。剧烈搅拌水，但不要喷溅出来。
3.将步骤1的试剂定量转移到水中；搅拌直至其完全溶解。
4.将步骤3的溶液定量转移到1L量筒中，并用Milli-QTM水稀释至1000ml；混合均匀。
5.将其转移至2升的HPLC流动相贮液器中。
6.加入200mL Milli-QTM水、100mL甲醇和700mL乙腈。在剧烈搅拌下，缓慢地加入后两种溶剂。在通风橱中进行该操作，并穿戴个人防护装备。具体细节请参见相关的物质安全性数据表(MSDS)。
7.搅拌时，用真空抽吸对流动相进行脱气。
FMOC试剂溶液(丙酮中)
1.称量0.10克FMOC试剂于已去皮重的100ml容量瓶中。
2.加入丙酮溶解，同样用它稀释至容积。混和均匀。在通风橱中进行该操作。穿戴上化学药品的MSDS中规定的PPE。
3.冷冻保存不超过六(6)个月。
用于样品萃取的酸溶液(5％HCl)
1.将100mL Milli-QTM水加入200mL容量瓶中。
2.将4mL 1N的HCl加入容量瓶中。
用Milli-QTM水稀释至容积。
配制内标物(氨基异丁酸)
ISTD A-内标物储备液A
1.称量0.5克氨基异丁酸于已去皮重的250ml容量瓶中。
2.加入25mL 1.0N HCl和约100mL Milli-QTM水。涡旋混合，直至溶解。
用Milli-QTM水稀释至容积，并混合均匀。冷冻保存不超过六(6)个月。
ISTD B-工作内标物溶液B(将此溶液加入到校准标准物中)
1.吸移1mL内标物储备液A至100mL容量瓶中。
2.用Milli-QTM水稀释至容积。可稳定保存1个月。
配制校准标准物
储备校准溶液。
于已去皮重的50mL容量瓶中，称量0.100g(+/-0.001g)天冬酰胺和0.100g(+/-0.001g)天冬氨酸。加入25mL Milli-QTM水和1mL 1N的HCl。将其置于声波浴中，直至溶解，然后用Milli-QTMH2O稀释至容积。冷冻下溶液可保持有效6个月。
工作标准物。
配制以下工作校准标准物：
Std# mL储备液 最终体积 (ml) ppm 1 5 200 50 2 5 100 100 3 1 10 200 4 3 10 600
冷冻下溶液可保持有效一个月。
样品的配制
1.称量1g样品于125mL锥形瓶中。
2.每个样品中加入48.0mL 5％HCl溶液。
3.每个样品中加入2mL ISTD A。
4.用铝箔将每个烧瓶盖上，并在60℃的水浴中放置30分钟。
5.每个样品中加入10ml二氯乙烷。
6.将样品匀化60秒。
7.将一部分样品倒入到30mL离心管中。
8.在5℃下以1047弧度/秒(10000rpm)离心32分钟。上清液用于“样品-稀释”步骤1中。
准备标准物和样品
使用三种方法来稀释样品/标准物、加入内标物、并形成FMOC衍生物。它们概述如下。
操作 所用的Microlab方法
稀释 TRANSDIL
加入内标物 ADDISTD
形成FMOC衍生物 ADDFMOC
使用 自动仪配制样品和标准物
步骤1：标准物-加入ISTD和稀释步骤
1.对于每个标准物，准备两套管子。在一套管中，放入约2ml标准物，将这些装有标准物的管子放置在最左边的位置上。
2.将放有空管子的管架放置在最右边的架位上。
3.将工作内标物溶液B注入20mL玻璃(闪烁)管中，并放置在的工作区上。
4.选择方法ADDISTD。(混合200μL ISTD B、50μL标准物溶液，用Milli-QTM水将总容积稀释至4000μL)。
5.实施该方法。
6.从左边位置上取下管组，弃于一边。
7.从工作区取出工作内标物溶液，并冷冻。
留下右边的管子用于步骤3。
步骤2：样品-稀释步骤(ISTD已在样品配制过程中加入)
1.对于每个样品，准备两套管子。在一套管子中，放入约2mL样品，将这些装有样品的管子放置在最左边的位置上。
2.将放有空管子的管架放置在最右边的架位上。
3.选择方法TRANSDIL。(设置样品的#，样品量为50μL，并且用Milli-QTM水稀释的最终稀释量为4000μL。)
4.实施该方法。
5.从左边位置上取下管组，弃于一边。
留下右边的管子用于步骤3。
步骤3：加入FMOC试剂-制备荧光衍生物
1.准备一架100 x 16mm的螺帽管。
2.将管架放置在最右边的架位上。
3.将得自上面稀释步骤的标准物管和样品管放置于最左边的架位上。
4.将等分(22ml)的FMOC试剂溶液转移到玻璃闪烁管中。加入大约100μL 40％氯化钙溶液；混合均匀。(加入氯化钙使FMOC试剂“带电”-这是用测定所必需的)。
5.将闪烁管放置于工作区上。
6.选择方法ADDFMOC。
7.将注射器1和2从水切换到稀释剂(pH 8.3至8.5)。
8.用稀释剂(pH 8.3至8.5)对注射器1和2进行洗涤至少五(5)个循环。
9.实施方法ADDFMOC。(将450μL FMOC溶液、250μL得自上面ADDISTD的样品混合，用稀释剂溶液稀释至最终容积为1300μL)。
10.从样品架位上取下管组，并丢弃。
11.从工作区取出FMOC试剂溶液，并冷冻。
12.从最右边的位置上取下管组，并置于通风橱中。静置至少10分钟，或直至溶液澄清(但不超过20分钟)。
13.每个管子中加入2mL萃取溶剂。盖上盖，并高速涡旋二(2)分钟，以萃取出未反应的FMOC试剂。
14.准备另一管架55x16mm的管子。每个管子中加入1ml流动相溶液。
15.将1.0ml水层(下层)从离心管中转移到55x16mm的管中。
16.弃去上层(有机层)。
17.将样品转移到自动取样瓶中，并密封。
色谱法
操作条件
装有Chem Station软件的HP 1100
检测器：Waters 474扫描荧光检测器
型号：Norm
信号：0.0000
波长：激发260
发射313
增益：10
衰减：1
响应：FST
色谱柱：Phenomex Luna C18(2)100 x 4.6mm 3u
LC方法
流量：1.000ml/min
等度操作(参见试剂配制-流动相)
注射体积：10.0μL
温度设置：不控温
计算
使用面积值，相对于已知量的标准曲线计算样品溶液：
y＝mx+b
y(天冬酰胺/ISTD比率)＝m(斜率)x(天冬酰胺浓度)+b(y轴截距)
(y-b)/m＝x
天冬酰胺(ppm)＝(天冬酰胺面积/ISTD面积-截距)/斜率
实施例：
天冬酰胺(ppm)＝(215.45436/551.828--0.0165)/0.0023＝176.93ppm
[ppm＝μg/mL]
对于样品制备步骤中稀释/均化的校正。
[ppm＝μg/mL]
实施例：
进行合格判断标准：
·工作标准物质对照样品的准确度必须在天冬酰胺已知结果的10％范围之内。
·校准曲线的线性度(r2)必须为0.995或更大。
样品的LC色谱分析
图3列出了样品的LC色谱图分析。
停留时间 化合物 4.5分钟 天冬酰胺 6.6分钟 天冬氨酸 11.5分钟 FMOC试剂 20.7分钟 ISTD
3.丙烯酰胺的减少％
丙烯酰胺的减少％＝[(对照样品中丙烯酰胺的含量-酶处理的样品中丙烯酰胺的含量)/对照样品中丙烯酰胺的含量]x 100。
除了没有加入酶，对照样品的配制方法与用酶处理样品的完全相同。
4.天冬酰胺减少％
天冬酰胺的减少％＝[(对照样品中天冬酰胺的含量-酶处理过的样品中天冬酰胺的含量)/对照样品中天冬酰胺的含量]x 100。
除了没有加入酶，对照样品的配制方法与用酶处理样品的完全相同。
实施例
以下实施例举例说明本发明，但不旨在对其进行限制。
实施例1-脱水的干磨玉米产品
根据常规方法制作灭菌的白玉米粉。研磨前加入有效量的天冬酰胺酶。所得灭菌白玉米粉的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例2-脱水的湿磨玉米产品
根据常规方法制作白玉米面团粉。干燥前加入有效量的天冬酰胺酶。所得面团粉的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例3-加工的未经发酵的玉米片
使用实施例2的白玉米面团粉制作未经发酵的玉米片，使用描述于Zimmerman等人的公布于2001年12月6日的WO 01/91581中的方法。所得未经发酵的玉米片的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例4-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片包装于袋中，以向消费者出售。袋上印有提示信息，声明“无丙烯酰胺产品！”
实施例5-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片包装于袋中，以向消费者出售。袋上印有提示信息，声明“丙烯酰胺含量低！”
实施例6-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片包装于袋中，以向消费者出售。袋上印有提示信息，声明“丙烯酰胺降低了90％以上！”该薄片的电视广告传递的信息是，“我们的薄片丙烯酰胺含量较低！”
实施例7-商品
将丙烯酰胺含量小于40ppb的统一形状的加工未经发酵的玉米片包装于三角形罐中，向消费者出售。该薄片的电视广告传递的信息是，“丙烯酰胺减少了！”
实施例8-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片置于柳条筐中，供餐厅顾客食用。张贴在销售玉米片的餐厅内的广告牌写道，“我们的玉米片含有减量的丙烯酰胺！”
实施例9-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片包装于袋中，向消费者出售。袋上印有提示信息，声明“用低天冬酰胺的成分制成！”
实施例10-玉米片早餐谷类食物
黄玉米被破碎(研磨)以得到4号至5号的粗粒，无细菌和麸皮。这些大块呈大约1/2玉米粒；并且它们在整个加工过程中保持它们的特征，每个颗粒最终形成玉米片。在圆柱形高压锅内放入约771kg(1700磅)粗磨玉米和136L(36加仑)由糖、麦芽(未糖化的)、盐和水组成的调味糖浆。将有效量的天冬酰胺酶加入高压锅，然后让混合物浸泡几个小时。随后烹制该混合物。
在烹制期间，充填物累积了来自蒸汽的附加水分使其流回压力锅内，水分上升至约33％。烹制在缓慢的旋转压力锅中于103至159(典型124)kPa(15至23(典型18)psi)的蒸汽压下进行1至2小时。不同批的玉米在所需的烹制时间长度上可相当地不同。终点可通过检查从为此所设的闸门阀中喷出的少量充填物样品来判断。谷粒中均匀的半透明物指示已充分烹制。此时压力降至大气压，打开压力锅，将内容物倾倒在移动带上。
当来自锅中的团块用回转轴破碎成单独颗粒后，将它们散布在一组干燥器上。对于某些情况，后面的装置基本上是垂直延伸的大管子或大罐。湿谷粒从顶部进入，当它们移动至底部时被逆流的热(65℃(150°F))空气干燥。
干燥的颗粒此时包含19％至23％水分，但是此水分是不均匀分布的，所以物料被传送至匀湿仓放置几个小时(多至24小时)以使水分平衡。匀湿后，硬、茶褐色的粗磨玉米粒已准备好可压片。
压片辊为每个重超过一吨的钢滚筒，并以约19至21弧度/秒(180至200rpm)的速度旋转。液压控制保持接触辊时的压力大于40吨。辊通过内部的水循环冷却。当烹制过干粗磨玉米粒经过该辊时被压成薄片。该制品此时仍有点柔韧，缺乏最终玉米片所需要的松脆和优选的风味。
玉米片从辊上直接进入旋转的烤面包炉，该面包炉通常是燃气的。润湿的玉米片翻滚通过多孔的转筒中，并经过几英寸的气体火焰。处理可在301℃(575°F)下进行50秒，或288℃(550°F)下进行2至3分钟。除了用该方法完全脱水以外，还将该玉米片烘烤和起泡。它们从炉中出来时水分小于3％。
离开炉后，玉米片被皮带输送至膨胀仓，在这里使它们冷却至室温。在途中，该制品用循环空气冷却，并通常用硫胺和其它B族维生素溶液的喷雾处理。
所得玉米片的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例11-商品
实施例10的玉米片被包装在袋中，然后将该袋放入盒子中，出售给消费者。盒子上印有提示信息，声明“丙烯酰胺减少了！”
实施例12-含酶的面团粉
将有效量的干燥酶与未经酶处理、传统方法加工的玉米面团粉混合。此混合物作为用于制作玉米面团基食品的成分销售。该混合物可用于制作丙烯酰胺减少量大于10％的食品。
实施例13-商品
实施例12的含酶面团粉包装在袋中出售。袋子上的说明描述使用面团粉使所得面团基食品的丙烯酰胺减少量大于10％的适宜条件(时间、温度、pH)。
尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可作出许多其它的变化和修改。因此，有意识地在附加的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
2002年4月，Swedish National Food Administration和Stockholm University的研究人员宣布了他们的发现：在许多种烹制的食物中产生了丙烯酰胺，一种可能致癌的化学物质。丙烯酰胺在老鼠体内具有与食物中其它致癌物类似的致癌能力，但对于人类，其在食物中的相对致癌能力还是未知的。对于丙烯酰胺，只有有限的人口资料，并且这些资料不能证明职业性接触丙烯酰胺有致癌的危险。(FAO/WHO Consultation on the Health Implications of Acrylamidein Food：Summary Report；Geneva，Switze rland，2002年6月25至27日。)
虽然需要进一步研究来确定人们以通常存在于上述食物中的含量食用丙烯酰胺可产生怎样的健康影响(若存在的话)，但许多消费者对此表示关注。因此，本发明的一个目的是提供一种降低玉米基食物中丙烯酰胺含量的方法。本发明还有一个目的是提供含减量丙烯酰胺的玉米基食品。此外，本发明还有一个目的是提供一种商品，该商品告知消费者该玉米基食品含有减量或低含量的丙烯酰胺。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种降低玉米基食品中丙烯酰胺含量的方法。在一个实施方案中，该方法包括在加热前将降低天冬酰胺的酶加入玉米基食品物料中。
在另一个方面，本发明提供了一种降低玉米基食品物料中天冬酰胺含量的方法。在一个实施方案中，该方法包括在加热前将降低天冬酰胺的酶加入玉米基食品物料中。
在另一个方面，本发明提供了具有减量丙烯酰胺的玉米基食品。
在另一个方面，本发明还提供了一种商品，该商品告知消费者该玉米基食品含有减量或低含量的丙烯酰胺或天冬酰胺。
本文所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
附图简述
图1列出了所提出的反应机理，根据该机理，丙烯酰胺形成于天冬酰胺和羰基源(如葡萄糖)。R1和R2可以是H、CH3、CH2OH、CH2(CH2)nCH3，或任何其它组成还原糖的组分；n可以是任何小于10的整数。
图2列出了所提出的反应机理，根据该机理，天冬酰胺酶与天冬酰胺反应以阻止丙烯酰胺的形成。
图3列出了天冬酰胺和天冬氨酸LC分析的样本色谱图。x轴表示保留时间，而y轴表示响应。
发明详述
申请者已发现，加热时，天冬酰胺(存在于几乎所有生物系统中的天然存在的氨基酸)可产生丙烯酰胺。从而加热时，含天冬酰胺越多的食物趋于包含越高含量的丙烯酰胺；当在存在还原糖的情况下加热含天冬酰胺食物时尤其如此。还已发现，当食物被烹制到较低的最终含水量时，生成的丙烯酰胺较多。
不受理论的约束，据信通过图1中所列的反应机理，在玉米基食品中产生丙烯酰胺。据信，游离天冬酰胺的α-氨基与羰基源反应形成席夫(Schiff)碱。加热条件下，该席夫碱加合物脱去羧基形成产物，该产物可以：(1)水解形成β-丙氨酸酰胺(加热条件下该化合物可进一步降解形成丙烯酰胺)，或(2)分解形成丙烯酰胺和相应的亚胺。(申请者已发现，环状前体的原子包含丙烯酰胺中的碳原子和氮原子。)
因此，申请者已进一步发现，通过在烹制前将食物中的天冬酰胺除去或转变为别的物质，可减少加热食品中丙烯酰胺的形成。因此，当加热含有减量天冬酰胺的玉米基食物时，形成的丙烯酰胺量被减少。
申请者已发现，在加热(例如烹制)食物前，加入可水解天冬酰胺侧链上酰胺基的酶，减少存在于最终食品中丙烯酰胺的含量。不受理论的约束，据信加入上述酶可使天冬酰胺的侧链降解，从而阻止天冬酰胺形成丙烯酰胺。在这种情况下，酰胺键被水解，并且天冬酰胺被转变为天冬氨酸。该反应机理列于图2中。
在玉米基食品加工中使用酶的优点是许多的。这些优点包括：(a)它们是天然、无毒的物质；(b)它们通常催化指定的反应，而不会产生无需的副反应；(c)在非常温和的温度和pH值条件下，它们具有活性；(d)在低浓度下，它们具有活性；(e)通过调节温度、pH值和所用酶的量，可控制反应速率；以及(f)在反应进行到所需程度后，它们可被失活。(“Food Chemistry”，第4版，Owen R.Fennema编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1985年，第427、433页。)
A.降低玉米基食品中丙烯酰胺的方法
在一个方面，本发明提供了一种降低玉米基食品中丙烯酰胺的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在最终加热(例如烹制)前，降低玉米基食品物料中的天冬酰胺含量。在另一个方面，所述方法包括向玉米基食品物料中加入能够水解游离天冬酰胺的酰胺基的酶。优选的酶是天冬酰胺酶。
在另一个方面，本发明提供了一种降低玉米基食品中天冬酰胺的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向玉米基食品物料中加入能够水解游离天冬酰胺的酰胺基的酶。优选的酶是天冬酰胺酶。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种降低玉米基食品中丙烯酰胺含量的方法，所述方法包括：
(1)将降低天冬酰胺的酶加入玉米基食品物料中，其中所述玉米基食品物料包含天冬酰胺；
(2)非必需地将所述酶与所述玉米基食品物料混合；
(3)给予充分的时间，使酶与天冬酰胺反应；
(4)非必需地将酶失活或非必需地将酶除去；和
(5)加热所述玉米基食品物料以形成最终的玉米基食品。
1.将降低天冬酰胺的酶加入玉米基食品物料中，其中所述玉米基食品物料包含天冬酰胺
本文所用的“降低天冬酰胺的酶”包括任何能够降低玉米基食品物料中天冬酰胺含量的酶。在一个实施方案中，该降低天冬酰胺的酶是能够水解游离天冬酰胺的酰胺基的酶。可用于本文的优选酶是天冬酰胺酶。天冬酰胺酶的优选来源是Sigma-Aldrich，目录号为#A2925。可用于本文的另一个优选酶是谷氨酰胺酶。
本文所用术语“降低天冬酰胺的酶”和“酶”包括一种或多种酶；例如，该术语包括两种或多种酶的混合物。例如，具有天冬酰胺还原功能的脱酰氨基酶包括于该术语中。
本文所用的“玉米基”是指包含50％至100％的玉米。
本文所用的“玉米基食品物料”包括，但不限于任何类型含天冬酰胺的玉米基食物、玉米基食品、玉米基食物成分或它们的混合物。
玉米基食品物料可以是任何合适的形式，包括未加工的、干燥的、加工过的或预处理的。预处理玉米食品物料的合适方法可包括，但不限于，热烫、蒸、煮、切碎、浸渍、粉碎、减小粒径、加热干燥以及它们的组合。例如，玉米基食品物料可包括整颗玉米粒、粉碎的、玉米穗上或离开玉米穗的、部分玉米粒、颗粒结合体、粉末结合体(例如，粗粉或面粉)、已用任何方式(如，用碱例如石灰处理进行化学加工，例如在制作面团或浸渍粉糊)预处理过的烹制玉米粒以及它们的组合。在一个实施方案中，玉米基食品物料可以是用于制作其它食物的玉米基食物。
本文可使用任何合适的玉米。玉米类型可包括，但不限于，臼齿玉米、硬质玉米、粉玉米、甜玉米、爆玉米、荚玉米、蜡质品种以及它们的组合。玉米的颜色可包括，但不限于黄色、白色、蓝色以及它们的组合。玉米可来源自自然选择、杂交、基因改性以及它们的组合。
本文所用的向玉米基食品物料中“加入”酶包括，但不限于，任何将天冬酰胺和酶放在一起的方法。
可将酶以任何合适的形式加入到玉米基食品物料中。例如，酶可以粉末或溶液状(如，溶解在水中)加入。此外，还可将酶以任何合适的方式加入到玉米基食品物料中，如直接(例如，淋洒、倾倒或喷洒在玉米基食品物料上)或间接加入。在一个实施方案中，将酶与另一种不含天冬酰胺的食品物料混合，然后将所得混合物加入含天冬酰胺的玉米基食品物料中。
在另一个实施方案中，将酶加入基质(如，淀粉、二氧化硅)中；这有利于将酶均匀地加入玉米基食品物料中。所加酶的量与该酶所加入的玉米基食品物料的量相比相对较小。因此，通过加入酶作为稀释基质体系的一部分，可将更大量的酶/基质共混物加入玉米基物料中以获得相同的酶含量。
在另一个实施方案中，将至少一部分天冬酰胺从玉米食品物料中提取出来，所得提取物用酶处理，然后将至少一部分提取物加回到至少一部分玉米基食品物料中；例如，可将该酶加入到流液中，或将流液经由固定酶床或固定酶柱(在柱中，酶被吸附或化学键合在基质上，优选为惰性基质，如塑料片或小珠)吸出。
此外，可将酶在任何合适的加工阶段、或在不止一个加工阶段加入玉米基食品物料中。例如，酶可在玉米基食品物料加工或制作之前、之中或之后加入；酶可在将玉米基食品物料加入其它食品成分之前、之中或之后加入食品中；酶可在食品制作之后但最终加热之前加入食品中；以及它们的变化和组合。例如，可在混合用于制造加工玉米点心的玉米面团时将酶与面团成分混合。
加入酶的量可取决于天冬酰胺的减少量，以及由此所期望的丙烯酰胺的减少量。加入酶的量还可取决于玉米基食品原料中存在的天冬酰胺量；天冬酰胺含量较高的玉米基食品原料一般需要增加酶的量或增加反应时间，以达到相同的丙烯酰胺的减少量。加入酶的量还取决于所用的具体酶(例如，酶降解天冬酰胺的具体能力)和所处理的具体玉米基食品物料。
酶是按照活性单位来销售的，而不是按照重量或体积。因此，获得期望的最终玉米基食品丙烯酰胺减少量所需酶的有效量将取决于所用具体酶产品的活性。
本领域的技术人员将能够依据具体的玉米基食品物料、具体的酶、酶的具体活性和期望的结果，决定酶的有效量。
2.非必需地将酶与玉米基食品物料混合
非必需地但优选地将酶与玉米基食品物料充分混合。可使用任何合适的混合方法。在一个实施方案中，混合与玉米基食品物料的浸渍和酶的加入同时进行。
3.给予充分的时间，使酶与天冬酰胺反应
酶与天冬酰胺反应所需的时间取决于以下因素，包括，但不限于，所期望的丙烯酰胺减少量、具体玉米基食品物料的性质(如化学组成、天冬酰胺的含量、粒径)以及加入的具体酶。优选使酶反应充分的时间以得到一种玉米基食品物料，其中天冬酰胺的含量已降低至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，还更优选至少约70％，甚至更优选至少约90％。通常，让酶反应的时间越长，天冬酰胺减少的量就越大，因此丙烯酰胺减少的量也就越大。给予充分的时间使酶反应的步骤可以任何合适的方式进行；例如，该步骤可与将酶加入到玉米基食品物料中、酶与玉米基食品物料混合，或它们的组合同时进行。
如本领域所知，pH值和温度是影响酶活性的因素。本领域的技术人员应易于确定这些和其它参数(如含水量)的最佳条件。此外，具体酶的最佳pH值和温度条件典型地在文献中和/或酶供应商处获得。
4.非必需地将酶失活或非必需地将酶除去
在酶已反应至所需程度后，可非必需地使其失活，或从玉米基食品原料中除去。当使用可安全食用的酶(如天然存在和存在于普通玉米基食物中)时，可选择不将酶失活或除去。可供选择地，可使用任何合适的失活酶方法使酶失活。例如，通过利用热、pH调节、用蛋白酶处理或它们的组合可使酶失活。此外，可使用任何合适的方法将酶从玉米基食品物料中除去，该方法包括但不限于提取。酶可被失活、除去，或联合进行失活和除去。
酶失活可与其它加工步骤同时进行。例如，酶失活步骤可以是玉米干燥或湿磨加工步骤的一部分。在一个实施方案中，在浸渍粉糊产生过程中加入高pH的石灰水使酶改性。在另一个实施方案中，酶在浸渍粉糊加工的加热干燥过程中失活。
5.加热玉米基食品物料形成最终的玉米基食品
然后可以通常的方式加热玉米基食品物料，如烘烤、油炸、挤压、烘干(如，借助真空烘箱或滚筒式干燥机)、膨化或微波。在加热步骤中，可将至少一部分酶加入到玉米基食品物料中。可通过加热使酶失活，从而非必需的失活步骤和烹制步骤可同时进行。经烹制的加热处理可使酶变性和失活，使得玉米基食品物料不再具有持续的酶活性。并且在加热步骤中，给予至少一部分时间使酶进行反应。
本文所用术语“最终玉米基食品”或“玉米基食品”包括，但不限于，准备食用的玉米基食物和用作制作其它玉米食品成分的玉米基食物。
优选最终玉米基食品中丙烯酰胺的含量降低了至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，还更优选至少约70％，甚至更优选至少约90％。
B.实施方法的方式
可以任何合适的方式来实施本发明。例如，可以分批、半分批或连续的方式来实施本发明的方法。
C.含减量丙烯酰胺的玉米基食品
依照本文方法制作的玉米基食品可具有的丙烯酰胺减少量为至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，还更优选至少约70％，甚至更优选至少约90％。
本文的方法可被应用于生产任何合适的玉米基食品，包括，但不限于，制作时加热的含碳水化合物玉米基食物，尤其是低水分玉米基食物(如，少于约10％的水分)。例如，该方法可用于降低存在于加工点心、早餐谷类食物、面包、饼干、脆饼、烤油酥饼、比萨硬壳、椒盐卷饼、玉米饼、玉米面豆卷外壳、粗玉米糊、玉米粥、玉粉糊、油炸玉米球、爆米花、爆米花产品、玉米热狗、面粉、面团、淀粉、混合物、面糊、饮料(如，酒精饮料如威士忌)、饼馅、汤、肉汁、炖肉、炖牛肉、动物食物(如，狗食、猫食、雪貂食、豚鼠食、兔子食、大鼠食、小鼠食、鸡食、火鸡食、猪食、马食、山羊食、绵羊食、猴子食、鱼食)，和任何其他含玉米的食品中的丙烯酰胺含量。
在一个实施方案中，未经发酵的玉米片的丙烯酰胺含量小于约75ppb，优选小于约50ppb，更优选小于约10ppb。
在另一个实施方案中，玉米片的丙烯酰胺含量小于约75ppb，优选小于约50ppb，更优选小于约10ppb。
在另一个实施方案中，玉米基早餐谷类食物，优选玉米片含小于约60ppb丙烯酰胺，优选小于约40ppb丙烯酰胺，更优选小于约20ppb丙烯酰胺，最优选小于约10ppb丙烯酰胺。
在一个优选实施方案中，未经发酵的玉米片由处理过的干面团粉制成。在一个优选实施方案中，可用水将干面团粉再水化制成面团，然后用该面团制作未经发酵的玉米片，如Zimmerman等人在2001年12月6日公布的WO 01/91581中所描述的。
虽然本文的方法通常是用优选的玉米基食品来描述，但本领域的技术人员应该知道，本文的方法可应用于任何合适的玉米基食品。
1.干磨的玉米基食品物料
本文的方法可用于制作干磨玉米产品。用干磨制成的这类产品可包括，但不限于，粗磨玉米粉、玉米粗粉和玉米面。这些干磨产品可用于制作食品，如早餐谷类食物、混合物(如，薄烤饼、甜面包、松饼)、焙烤品、点心、包衣(如，面包屑或面糊)、面包块或比萨的抗粘剂以及婴儿食物。
在典型的干磨过程中，清洁玉米粒然后使用本领域熟知的方法除菌。然后研磨干燥的玉米制成干磨玉米产品。根据本发明，酶可在研磨之前、之中或之后或其组合加入玉米中。
例如，酶可在干磨之前的洗涤步骤中加入，其中水量和接触时间的长度都增加以得到充分的酶反应时间。在一个实施方案中，在高压和/或高温(如酶未失活或变性的压力和温度)下将酶加入水合玉米中。如本领域的技术人员可容易确定的，可使用任何合适的水-玉米比率。玉米粒接触水的时间长度应当足够长，以使水透过果皮传送至谷粒内部的柔软胚乳。优选玉米接触水的时间长度是不会发生谷粒的过度膨胀。理想的是，当在用显微镜在偏振光下观察时，谷粒内的玉米淀粉颗粒将保持双折射特性。如本领域的技术人员可容易确定的，可使用任何合适的水-玉米接触时间以得到所需的天冬酰胺的减少量。水温可稍微升高以使水能够更快地扩散透过果皮。优选该温度可使玉米淀粉颗粒保持双折射(未胶凝化)。优选搅拌水和玉米粒混合物。
然后玉米优选在灭菌之前干燥。玉米可用许多方法来干燥，这些方法包括，但不限于，烘箱、流化床、干燥塔或填料床单元操作中所使用的传导、对流空气、或辐射热传递模式。优选将干燥条件设成可提供包含约1％至约50％水分，优选约5％至约35％水分，更优选约10％至约30％水分，最优选约15％至约25％水分的玉米粒。然后，将玉米干磨。可使用本领域已知的技术来干燥和研磨玉米，如存在于Corn Chemistry and Technology，Watson，S.A.和Ramstad，P.E.，AACC Monograph Series，1987年(下文“Corn Chemistry andTechnology”)，351至376页中的那些。
在另一个实施方案中，将玉米粒灭菌，然后浸泡在酶的水溶液中。
在另一个实施方案中，洗涤过程中酶处理过的玉米用来制作干磨产品，然后该干磨产品再用酶处理。优选搅拌总混合物。合适的混合方法可包括但不限于带叶轮式搅拌器的间歇储罐、持续搅拌式的罐式反应器、活塞流搅拌器反应器、使用分散气相作为提供运动的方式的流化床搅拌器、或可以是单或多螺杆构型的挤出式搅拌器。混合和搅拌的程度可以不同以改善酶与玉米之间的接触从而缩短所需的接触时间，同时还保持玉米产品的其它所需性质。然后将干磨的玉米产品干燥。合适的干燥方法可包括，但不限于滚筒干燥、喷雾干燥、喷雾冷却、流化床炉或塔或喷射区型烘干机，如本领域已知的那些。
本新工艺的优选实施方案包括直接使用润湿状态的处理过的干磨产品来制作最终用途的产品；这避免了额外的步骤和干燥此物料所消耗的能量。湿的处理物料可以与其它干原料组分的混合物形式使用以形成部分或完全水合的面团组合物，所述组合物可非必需接收更多添加的水。
在另一个实施方案中，将酶粉末加入研磨过的干玉米产品中。说明书包含在此干玉米产品的包装上，它指导产品的使用者将适量的水加入产品中，以使在加工成食品时酶将天冬酰胺转变成天冬氨酸。此外，此含干燥酶的玉米研磨产品的生产者可提供说明书，详细说明可获得所需的减少量的适当温度、水、pH和培育时间。
在另一个实施方案中，酶可在加工或制作成品如早餐谷类食物或点心时加入。酶处理可在制作成品的任何生产步骤中进行，这些步骤包括但不限于将研磨的玉米产品与水或其它润湿成分混合、挤压、研磨面团、或将面团制成片，所述面团包含所述的研磨玉米产品和非必需地其它成分。可用任何可行的方法将酶加入研磨的玉米产品中，这些方法包括但不限于将酶加入水或另一种随后与研磨的玉米产品混合的液体中、在与其它干或湿成分混合之前或之中将酶加入至研磨的玉米产品、在挤出研磨的玉米产品时注入酶溶液、混合、挤出或研磨成片后将酶溶液喷、抹或滴在研磨的玉米产品上。在加工最终用途产品时处理研磨的玉米是优选的，因为如果干磨玉米产品在制作最终用途产品之前单独酶处理，可避免加入干燥步骤。
在另一个实施方案中，处理的物料与其它已预先水合的成分混合以形成颗粒状、附聚的颗粒或面团结合体。
在另一个实施方案中，干磨玉米产品与组成最终食品的其它原料同时一起用酶处理。干物料可首先共混成单独、均一化的干混合物或在与水和酶混合物混合过程中混合。
2.湿磨的玉米基食品物料
对湿磨操作而言，用酶处理玉米的优选方法是在原有的浸泡、烹制或浸渍过程中加入酶。使用此现有步骤避免了引入额外的加工复杂性。这些水接触过程的目的是软化玉米粒以使得能够增加处理化学药品的扩散、玉米粒组分的分离或通过研磨的粒径减小。水接触过程应当保持在通常用于递送所需的玉米产品属性的条件下，前提条件是温度保持在对酶的稳定性有害的水平以下。这些条件典型地包括水-玉米的比率、接触时间、压力和温度。为了确保酶的功能性，优选任何可能影响酶功效的成分(如改变pH的组分)在酶培育期之后加入。
在一个实施方案中，用于淀粉生产的玉米浸渍的水体积为每907kg(2000磅)玉米粒约1.2m3至1.4m3。优选浸渍玉米约22小时至约50小时以使果皮和胚乳能够软化，并使玉米在浸渍过程中的水分增加为约16％至约45％。浸渍水优选加热至约29℃(85°F)至约65℃(150°F)，更优选约38℃(100°F)至约57℃(135°F)，最优选约49℃(120°F)至约54℃(130°F)的温度。加工助剂如二氧化硫可非必需加入水中，通过帮助破坏蛋白质淀粉基质，使水能够更快地扩散到谷粒基质中。浸渍可用间歇或优选连续方法进行。典型地，该方法包括一系列浸渍槽，其中浸渍水逆流从一个槽流向另一个槽。湿磨玉米的方法可见于Corn Chemistry and Technology，第377至397页。
特定的湿磨方法包括面团的生产，如本领域所已知的，其为具有与众不同纹理和风味的研磨石灰烹制玉米。参见，例如，CornChemistry and Technology，第410至411页。以这种方法处理的玉米最经常用于制作诸如未经发酵的玉米片、玉米粉圆饼和玉米片这类的制品。面团可被加工来直接制造玉米基食品如未经发酵的玉米片，或者它可被研磨并干燥制成面团粉用于以后的加工。
制作面团的方法涉及在石灰水溶液中烹制整粒玉米，然后在无额外热量的情况下浸渍。然后用水洗涤该软化的石灰处理的玉米，脱水，然后研磨成所需的颗粒状。面团有几种用法。它可直接喂入成型挤出机中制成点心产品或送至片成型体系中，然后被烹制(如，烘焙、烧烤)制成传统的玉米粉圆饼。此外，未经发酵的玉米片可通过直接油炸最终的玉米粉圆饼或面团而制成。非必需面团可干燥并筛分制成面团粉。
酶可在面团或食品制作过程的多个加工步骤中加入。优选处理在面团制作过程的早期进行，以使得有足够的停留时间来完成天冬酰胺的酶转化，并且在面团粉制作过程的干燥步骤之前，或制作玉米粉圆饼或面团基点心食物的烹制步骤之前，因为一定量的丙烯酰胺可能会在此干燥步骤中形成。优选酶处理在pH调节(如，加入石灰)之前进行，以得到天冬酰胺减少的最大功效。
在面团制作方法的一个实施方案中，使用传统的间歇烹制或浸渍方法将玉米加工成面团或面团粉。用于烹制或浸渍玉米的水量可表示成无量纲的水重量与玉米重量的重量比。优选此比率为约0.6至约3.0，更优选约1.0至约2.0，更优选约1.0至约1.5，最优选约1.2至约1.5。石灰可于任何时候加入水中，在烹制过程之前或之中以获得所需的最终产品特性。在传统的方法中，石灰优选先于玉米加入烹制水中以使玉米与石灰水溶液的接触时间最大。
优选在本方法中，将石灰加入已用酶预先处理过的玉米中。在一个实施方案中，石灰是含水或无水形式的氢氧化钙。加入水中的石灰量可表示为无量纲的石灰重量与玉米重量的重量比。石灰与玉米的重量比率优选为约0.01至约5.0，更优选约0.10至约2.0，更优选约0.20至约1.0，最优选约0.20至约0.75。烹制时间优选为约1至约120分钟，更优选约4至约60分钟，更优选约4至约45分钟，最优选约20至约45分钟。烹制水的温度优选为约54℃(130°F)至约100℃(212°F)，更优选约65℃(150°F)至约93℃(200°F)，最优选约71℃(160°F)至约90℃(195°F)。烹制后玉米浸渍或浸泡在石灰水中的时间优选为约0.1至约48小时，更优选约2至约24小时，更优选约2至约16小时，最优选约4至约12小时。在浸渍过程中在无额外热量的情况下使石灰水冷却。制作面团的可供选择的方法可包括，但不限于，在无石灰的水中烹制，然后在浸渍过程中加入石灰，在烹制步骤后将水换成无石灰的新鲜水，或在烹制后将水换成新的石灰水溶液。使用石灰水可能与加入的酶不相容，尤其是如果pH非常高，如大于10。在pH很高的情况下，优选酶在石灰水处理之前或之后加入。然而，可在面团加工中的任何合适的时间使用酶。
面团加工的一个实施方案是传统的面团制作方法，其包括以下步骤：
(1)将玉米与水和石灰混合形成混合物；
(2)烹制该混合物；
(3)浸渍该混合物形成浸渍粉糊；
(4)非必需地洗涤和/或中和浸渍粉糊，优选用酸溶液；
(5)研磨浸渍粉糊形成面团；
(6)非必需地将面团与其它成分混合；
(7)非必需地将面团输送至加工设备如挤出机或压片机-切割机；
(8)非必需地将面团经过制作加工如挤压、压片、切割或它们的组合。
(9)烹制面团，优选使用焙烤和/或油炸，制成最终的食品；和
(10)在上述步骤1至8中的任何一个之前、之中和/或之后加入酶。
对于制作面团粉的过程，可在将浸渍粉糊研磨成面团之后使用以下步骤。用以下步骤处理未预先处理或预先处理的面团。通常，该方法包括：
(1)干燥面团；
(2)非必需地筛分该面团；和
(3)非必需地将酶加入面团中。
在一个实施方案中，预先处理的面团进一步用酶处理以获得更多的天冬酰胺、从而丙烯酰胺的减少。
同样，可使用可供选择的面团和面团粉制作方法，包括但不限于有或无石灰的挤出，如美国专利5,558,886和4,985,269中所述，持续烹制-浸渍方法，使用谷粒的分离组分的持续生产，如美国专利6,068,873中所述，或本领域的技术人员所已知的其它方法。减少天冬酰胺的酶处理可在上述方法的任何合适步骤中或任何可供选择方法的任何合适步骤中进行，非必需地在多个步骤中或与多个处理一起进行。将酶加入玉米产品中进行处理的方法包括但不限于将干燥酶加入玉米中，在烹制之前、之中或之后将酶加入烹制水中，在浸渍之前、之中或之后加入酶，在洗涤之前、之中或之后加入酶；在洗涤步骤中加入酶非必需地使玉米浸泡在酶溶液中，在研磨之前或之中加入干燥酶或非必需地水溶液中的酶，在混合时加入干燥或含水的酶，在挤出或压片时加入干燥或含水的酶，或在研磨、混合、挤出或压片之前、之中或之后将酶水溶液喷、抹或滴在面团上。在面团制作过程中这些可供选择的处理玉米方法必需不影响降低天冬酰胺含量的功效，前提条件是在不显著降解酶的温度下使降低天冬酰胺的酶保持充足的停留时间。最适宜的条件可从具体酶的制造商处获得，或者本领域的技术人员可容易确定酶处理的适宜条件。
干面团粉酶处理的非必需方法是以干粉形式将酶加入面团粉中。例如，当作为干粉加入时，最终使用者可加入水使酶能够在面团粉加工成制成食品时将天冬酰胺转化成天冬氨酸。酶可非必需地被除去或失活。水可在培育期后非必需地被除去。这种含干燥酶的面团粉的生产者可提供说明书，详细说明获得所需减少量的适当温度、水、pH、和培育时间。
面团粉和预先胶凝化或预先烹制的玉米粉可以可供选择用挤出型方法制作，其中玉米用单或多螺杆输送通过精密公差的机罩如筒或轴。保持挤出物的温度以避免酶组合物降解是重要的。优选将酶体系引入挤出机的第一区中，其中设置温度和停留时间以有利于酶的最佳活性。更优选两个挤出机串联使用，其中第一个挤出机用作引入酶体系的搅拌器以使所述酶体系在有利于酶最大转换的条件下与玉米完全接触。最优选玉米与预混机中的酶体系在引入挤出过程之前预处理。混合体系可包括，但不限于间歇釜、连续釜、活塞流反应器、S形搅拌器、带状或桨状搅拌器、行星状搅拌器、粉碎搅拌器、流化床、或喷雾冷却操作或它们的组合。
相应地，用于湿磨操作的玉米可首先进行酶预处理以获得低的天冬酰胺含量，然后以润湿状态向前进行后续的加工或可供选择干燥并保存以便以后使用。
可供选择地，从玉米湿磨操作中得到的包括但不限于玉米粥、粗玉米糊、浸渍粉糊、面团和淀粉物的最终产品在湿磨制造后可用酶处理。
3.由脱水玉米产品制成的玉米基食物
脱水玉米产品可按原样使用或可非必需再水合并用以制造玉米基食品如玉米糊、玉米粥、玉米面包、玉米松饼、玉米粉圆饼、粗玉米糊和其它玉米点心如玉米片和挤出的玉米糕饼。脱水玉米产品也可用于面包、肉汁、沙司、婴儿食物或任何其它合适的玉米基食品。在一个实施方案中，玉米基食品用作油炸食物如鱼、夏南瓜、蘑菇和奶酪棒的包衣。在另一个实施方案中，所述产品用作隔离剂，例如喷洒在比萨底部或比萨盘上以有利于将比萨从盘中取出。所述产品也可用作面包条的隔离剂。
酶处理的脱水玉米产品可用于制作加工玉米点心，优选未经发酵的玉米片或玉米片。在优选的实施方案中，在点心制作过程中使用附加酶(除了用于制作加工脱水玉米产品的酶以外)以便进一步增加丙烯酰胺的减少量。
在一个实施方案中，制作的玉米点心可用以下方法制作，该方法包括：
(1)将降低天冬酰胺的酶加入包含玉米面团的玉米基面团中；
(2)由生面团制成点心坯；和
(3)烹制点心坯，制成加工点心。
在另一个实施方案中，可用以下方法制作加工点心，该方法包括：
(1)混合包含面团粉和非必需其它成分的干成分；
(2)加入水；
(3)制成面团；
(4)非必需地制成面片；
(5)制成点心坯；和
(6)烹制点心坯，制成加工点心；
(7)在上述步骤(1)至(5)中任何一个之前、之中或之后加入降低天冬酰胺的酶。
在本发明的一个实施方案中，由面团制成的未经发酵的玉米片用以下方法制作，该方法包括：
(1)将酶加入包含面团和非必需地其它成分的面团中；
(2)由生面团制成点心坯；和
(3)烹制点心坯，制成未经发酵的玉米片。
在另一个实施方案中，由面团粉制成的未经发酵的玉米片用以下方法制作，该方法包括：
(1)混合包含面团粉和非必需地其它成分的干成分；
(2)可非必需地向干成分中加入乳化剂；
(3)加水；
(4)混合形成生面团；
(5)制成面片；
(6)由面片制成点心坯；
(7)烹制点心坯，制成加工点心；和
(8)在上述步骤(1)至(6)中任何一个之前、之中或之后加入降低天冬酰胺的酶。
可在该方法的任何合适步骤中加入酶，例如，可在混合、可非必需地，加入乳化剂、加入水、混合和/或成形步骤中加入酶。可供选择地，可将酶(优选以溶液的形式)涂抹到面团表面；这可在由面片制成点心坯之前或之后进行。在一个实施方案中，将酶溶液加到面片的表面上。
可用任何合适的方法进行烹制，例如油炸、烘烤，或油炸或烘烤的组合。此外，成形和烹制步骤可同时进行，例如通过挤压。
在一个实施方案中，未经发酵的玉米片的丙烯酰胺含量小于约75ppb，优选小于约50ppb，更优选小于约10ppb。
在另一个实施方案中，玉米片的丙烯酰胺含量小于约75ppb，优选小于约50ppb，更优选小于约10ppb。
D.商品
本发明的另一个实施方案是商品，其包括：
(a)玉米基食品，其中所述玉米基食品含有减量的丙烯酰胺；
(b)用于装盛所述玉米基食品的容器；和
(c)与容器有关的提示信息。
该提示信息告诉使用者，该玉米基食品包含减量的丙烯酰胺。该提示信息可以是直接或间接附在容器上、直接或间接附在容器附近的印刷物，或可供选择地，可以是与玉米基食品或与容器相结合的印刷、电子或广播提示信息。
在本发明的一个实施方案中，含减量丙烯酰胺的玉米基食品提供在具有与此有关提示信息的容器中。可配发、呈现、展示或储存玉米基食品的任何容器均是合适的。合适的容器包括，但不限于，袋、罐、盒、碗、盘、盆和筒。
该提示信息告诉消费者，该玉米基食品包含减量的丙烯酰胺。该提示信息可以是直接或间接附在容器上、直接或间接附在容器附近的印刷物，或可供选择地，可以是与玉米基食品或与容器相结合的印刷、电子或广播提示信息。合适的提示信息包括，但不限于，告知“减量”或“少量”丙烯酰胺的提示信息，告知含有小于规定量丙烯酰胺(如小于5ppb)的提示信息，以及告知该玉米基食品达到或超过建议量或强制量(如规定的阈值或正常含量)的提示信息。
在另一个实施方案中，该提示信息告知消费者该玉米基食品由具有减量或少量天冬酰胺的一种或多于一种的成分制成。
分析方法
用特定的分析方法量化用于表征本发明元素的参数。这些方法详细描述如下。
1.丙烯酰胺
测定食品中丙烯酰胺(AA)的方法
概述
将1-13C-丙烯酰胺(13C-AA)掺入到食品中，然后用热水萃取。用乙酸乙酯萃取含水上清液三次，然后合并乙酸乙酯萃取物，并浓缩，然后用带有特别检测AA和13C-AA的选择性离子监测的LC/MS分析。
样品的萃取
1.称量6.00±0.01g样品，放于125mL锥形瓶中。注意：将样品放到食品加工机中，并脉动30秒，使粒径达约0.32cm(1/8英寸)或更小。如果样品太小以致不能在食品加工机中被有效地粉碎，则将样品置于一个新塑料袋中(如Whirl-PakTM或等效物)，然后用橡皮锤粉碎，直至粒径达约0.32cm(1/8英寸)或更小。
2.使用可调节的1000-μL移液管(已校准)将120μL的100ng/μL 13C-AA去离子蒸馏水溶液(ISTD 2)直接加在样品上。
3.使用分配器，将40mL去离子蒸馏水加入到烧瓶中，并以箔覆盖。
4.于65℃的水浴中放置30分钟。
5.用分配器将10mL 1，2-二氯乙烷加入到烧瓶中，然后用Tekmar TissumizerTM(SDT-1810)或Ultra-(T18 Basic)匀化30秒，或直至均匀。用去离子蒸馏水冲洗探头，洗液接至该烧瓶中。
6.将25g均匀混合物放入到8打兰的小瓶中。
7.盖紧管口，然后以262至544弧度/秒(2500至5200rpm)的速度离心30分钟。
8.将8g上清液小心地转移到另一个8打兰的小瓶中，注意不要将固体颗粒转移过去。
9.用分配器加入10ml乙酸乙酯，盖上盖，并涡旋10秒。
10.使所有乳液破乳；这可借助于涡旋或振荡一次或两次，然后使各层分开。
11.将尽可能多的上层(乙酸乙酯)转移到闪烁管中，而不要转移界面处的任何液体(水)。每次用5ml乙酸乙酯萃取两次以上，并加入到同一个闪烁管中。然后，加入约2g无水硫酸钠。
12.在60℃至65℃的水浴中，用和缓的氮气流将该萃取物浓缩至约1mL。将该萃取物转移到Pierce REACTI-VIALTM或等效的锥形玻璃瓶中，并进一步浓缩该萃取物，直至最终体积约为100μL至200μL。将该萃取物放入到带锥形套管的自动取样瓶中。
标准物的配制
储备液和内标物
溶液 重量 容量瓶 溶剂 浓度(ppm) 储备液1 0.1000g丙烯酰胺 (AA) 100ml 乙酸乙酯 1000 ISTD 1 0.0100g 13C-丙烯酰胺 100ml 乙酸乙酯 100 储备液2 0.1000g丙烯酰胺 (AA) 100ml 去离子蒸馏水 1000 ISTD 2 0.0100g 13C-丙烯酰胺 100ml 去离子蒸馏水 100
中间标准物
溶液 储备液1AA的体积(μL) 容量瓶 (ml) 溶剂 浓度 (ppm) INT 1 100 10 乙酸乙酯 10 INT 2 1000 10 乙酸乙酯 100
校正标准物
标准物 体积 INT 1 (μL) 体积 INT 2 (μL) ISTD 1 的体积 (μL) 容量瓶 (ml) 溶剂 浓度 AA (ppm) 浓度 ISTD 1 (ppm) 0 0 0 450 10 乙酸乙酯 0 4.50 0.25 250 0 450 10 乙酸乙酯 0.250 4.50 0.75 750 0 450 10 乙酸乙酯 0.750 4.50 1.5 0 150 450 10 乙酸乙酯 1.50 4.50 3.0 0 300 450 10 乙酸乙酯 3.00 4.50 5.0 0 500 450 10 乙酸乙酯 5.00 4.50
匀化器清洁方法
在测定每个样品的间隔，用该清洁方法清洁匀化器。
1.将热自来水注入一个1L的锥形瓶中(≈80％满)，然后加入一滴DawnTM餐具洗涤液(购自Procter & Gamble Co.)或等效物。
2.将分散元件的探头尽可能深地插入到水中。
3.将溶液匀化约10至15秒。
4.将洗涤液从锥形瓶中倒出；用热自来水冲洗并再注入该锥形瓶。
5.再次匀化约10至15秒。
6.将锥形瓶倒空，再注入热自来水；再次匀化约10至15秒。
7.如果水不澄清且有颗粒物，则继续按需要多次匀化干净的热自来水，直至达到这个条件。
8.当热自来水澄清且无颗粒物时，用去离子蒸馏水冲洗探头。
用LC/MS分析
使用连接在Micromass LCZ质谱仪上的Waters 2690LC，对样品进行分析。
流动相 100％H2O，10mM NH4Ac，pH值调节至4.6w/甲酸 色谱柱 2.0mm x 150mm，YMC C18AQ(购自Waters Corp.) 流速 0.2ml/min 界面 直接(无分层) 进样体积 5μL
流动相 100％H2O，10mM NH4Ac，pH值调节至4.6w/甲酸 Ms离子化方式 电喷雾，正离子模式 MS检测方式 选择性离子监测：m/z 72(AA)，m/z 73(13C-AA)；停 留时间：0.5秒
数据分析
对于一系列乙酸乙酯中的五个标准样品，将响应比(AA峰的面积/13C-AA峰的面积)对相应的浓度比作图。所有标准样品包含4.5μg/ml的13C-AA，并且AA的浓度为0μg/ml至5μg/ml。线性回归产生标准曲线，借助该标准曲线，从所测定的响应比中确定萃取物中的浓度比。当该浓度比乘以在萃取方法的步骤二加入到样品中的精确已知的13C-AA含量(标称2ppm)时，就可得到AA的ppm含量。
LC/MS的样品计算：
通过将y轴上的响应比(m/z 72的面积/m/z 73的面积)，对x轴上的浓度比([AA]/[13C-AA])作图，产生标准曲线。对于本实施例，该线的方程是y＝0.899x+0.0123。
4.0分钟时AA峰(m/z 72)的测定面积：100,000
4.0分钟时13C-AA峰(m/z 73)的测定面积：500,000
响应比Rr＝0.200。从标准曲线的斜率和截距，计算浓度比Rc为：Rc＝(0.200-0.0123)/0.899＝0.209
已知样品中13C-AA的掺入量(2ppm)，则AA的测定含量为0.209 x 2ppm＝0.418ppm
质量保证/质量控制(QA/QC)
1.在准备标准物和/或样品时使用的所有天平，必须每周用一系列标准砝码检查它们的校准。这些天平应使用至少三个覆盖待测样品/标准物重量范围的砝码来检查。
2.应每天作出六个点的校准曲线。
3.应使用每一组样品分析工作参考物质(WRM)。该物质浓度的游动平均值应在2σ之内。如果不在该范围内，则该仪器应重新校准，并重新计算WRM。
2.天冬酰胺
测定食物和饮料制品中的天冬酰胺和天冬氨酸
原理
将已称过重量的样品与5％HCl混合，并加热30分钟，然后匀化。将一部分均匀混合物离心，然后将一部分上清液稀释，并用FMOC试剂(9-芴甲基氯甲酸酯)处理，该试剂与天冬酰胺和天冬氨酸反应形成强荧光衍生物。然后用反相HPLC将FMOC-天冬酰胺从其它样品基质组分中分离开来。在260nm处激发，检测313纳米(nm)处的荧光发射。已知浓度的标准物分析可进行定量。
线性度
四个标准样品(50至600ppm)的工作标准曲线给出的相关性为0.998或更高。由2000ppm的样品得出的曲线也给出了0.998的相关性。
精度
马铃薯制品：
马铃薯淀粉中掺入四种含量的天冬酰胺和天冬氨酸(40、200、400和600ppm)。天冬酰胺的回收为100％(相对标准偏差小于4％)，而天冬氨酸的回收为110％(相对标准偏差小于4％)。
参考文献
1.Herbert，P.；Santos，L；Alves，A.Journal of Food Science(2001年)，第66卷(第9期)，第1319至1325页。
2.Heems，Dany；Luck，Geneviewe；Fraudeau，Chrisophe；Verette，Eric.Journal of Chromatography，A(1998年)，第798卷(第1+2期)，第9至17页。
体系可重复性
在五天内一式两份平行测定薯片的工作参考物质。结果如下：
ug/g ug/g
天冬酰胺 天冬氨酸
平均值 7832.07 1440.98
STD 625.59 195.80
％RSTD 7.99 13.59
以下是建议使用的化学药品和仪器；然而，等效物质的替换是可接受的。
化学药品
水，HPLC级或Milli-QTM级(Millipore)
乙腈，HPLC级 Burdick & Jackson#AH015-4
甲醇，HPLC级 Fisher#A452-4
乙酸乙酯 Baker#9280-3
戊烷 Burdick & Jackson#GC312-4
天冬酰胺一水合物 EM Science
天冬氨酸 Sigma#A-8949
氨基异丁酸 Sigma#A-8379
9-芴基氯甲酸酯(FMOC) ICN#150200
硼酸钠 EM Science#SX 0355-1
硼酸 Fisher#A-73
碳酸氢钠 ICN#194847
四甲基氯化铵 Fisher#04640-500
柠檬酸钠 MCB#SX445
无水柠檬酸 Baker#0122-01
丙酮 Burdick & Jackson#010-4
盐酸，0.1N Fisher#SA48-500
二水氯化钙 Aldrich#22,350-6
设备
移液管，聚乙烯(Samco#222)
容量瓶(25、100、250、1000mL)
定容吸移管(10mL)
量筒(100至1000mL)
HPLC贮液器(500ml、1L或2L)
烧杯
磁力搅拌器/搅拌子
分析天平(4位)
闪烁管
离心管，螺帽盖(100x16mm)
自动取样瓶(8x30mm，1mL)，卡口帽
安全性：该方法需要使用通风橱，并且涉及接触化学药品。请查阅关于通风橱使用和化学品溅出的安全规章。
色谱柱
Phenomenex Luna 100 x 4.6mm C-18(2)3微米#00D-4251-EO
配制试剂
稀释剂(pH 8.3至8.5；1000mL)。
1.称量3.0克硼酸钠、3.0克硼酸和8.0克碳酸氢钠于一个已去皮重的干燥烧杯中。
2.在磁力搅拌器上放置一个空的800mL烧杯。加入约500mLMilli-QTM水和搅拌子。剧烈搅拌水，但不要喷溅出来。
3.将步骤1的试剂定量转移到水中；搅拌直至其完全溶解。
4.将步骤3的溶液定量转移到1L的容量瓶中，并用Milli-QTM水稀释至容积；混合均匀。可稳定放置最多六(6)个月。
氯化钙溶液(100克)。
1.称量40克二水合氯化钙于已去皮重的250ml烧杯中。
2.加入60克Milli-QTM水。混和均匀。在环境条件下保存于有盖的玻璃瓶中。可稳定放置最多1年。
萃取溶剂(戊烷∶乙酸乙酯80∶20；500mL)
安全性：戊烷和乙酸乙酯是易挥发和易燃的。在通风橱中进行以下操作。
1.将400mL戊烷转移至500mL HPLC贮液瓶中。
2.加入100mL乙酸乙酯。混和均匀。在通风橱中/下盖上盖保存。
流动相(缓冲剂∶甲醇∶乙腈60∶5∶35，pH 3.2，2L)
1.称量1.35克四甲基氯化铵、3.65克柠檬酸和1.60克柠檬酸钠于已去皮重的干燥烧杯中。
2.在磁力搅拌器上放置一个空的800mL烧杯。加入约500mLMilli-QTM水和搅拌子。剧烈搅拌水，但不要喷溅出来。
3.将步骤1的试剂定量转移到水中；搅拌直至其完全溶解。
4.将步骤3的溶液定量转移到1L量筒中，并用Milli-QTM水稀释至1000ml；混合均匀。
5.将其转移至2升的HPLC流动相贮液器中。
6.加入200mL Milli-QTM水、100mL甲醇和700mL乙腈。在剧烈搅拌下，缓慢地加入后两种溶剂。在通风橱中进行该操作，并穿戴个人防护装备。具体细节请参见相关的物质安全性数据表(MSDS)。
7.搅拌时，用真空抽吸对流动相进行脱气。
FMOC试剂溶液(丙酮中)
1.称量0.10克FMOC试剂于已去皮重的100ml容量瓶中。
2.加入丙酮溶解，同样用它稀释至容积。混和均匀。在通风橱中进行该操作。穿戴上化学药品的MSDS中规定的PPE。
3.冷冻保存不超过六(6)个月。
用于样品萃取的酸溶液(5％HCl)
1.将100mL Milli-QTM水加入200mL容量瓶中。
2.将4mL 1N的HCl加入容量瓶中。
用Milli-QTM水稀释至容积。
配制内标物(氨基异丁酸)
ISTD A-内标物储备液A
1.称量0.5克氨基异丁酸于已去皮重的250ml容量瓶中。
2.加入25mL 1.0N HCl和约100mL Milli-QTM水。涡旋混合，直至溶解。
用Milli-QTM水稀释至容积，并混合均匀。冷冻保存不超过六(6)个月。
ISTD B-工作内标物溶液B(将此溶液加入到校准标准物中)
1.吸移1mL内标物储备液A至100mL容量瓶中。
2.用Milli-QTM水稀释至容积。可稳定保存1个月。
配制校准标准物
储备校准溶液。
于已去皮重的50mL容量瓶中，称量0.100g(+/-0.001g)天冬酰胺和0.100g(+/-0.001g)天冬氨酸。加入25mL Milli-QTM水和1mL 1N的HCl。将其置于声波浴中，直至溶解，然后用Milli-QTMH2O稀释至容积。冷冻下溶液可保持有效6个月。
工作标准物。
配制以下工作校准标准物：
Std# mL储备液 最终体积 (ml) ppm 1 5 200 50 2 5 100 100 3 1 10 200 4 3 10 600
冷冻下溶液可保持有效一个月。
样品的配制
1.称量1g样品于125mL锥形瓶中。
2.每个样品中加入48.0mL 5％HCl溶液。
3.每个样品中加入2mL ISTD A。
4.用铝箔将每个烧瓶盖上，并在60℃的水浴中放置30分钟。
5.每个样品中加入10ml二氯乙烷。
6.将样品匀化60秒。
7.将一部分样品倒入到30mL离心管中。
8.在5℃下以1047弧度/秒(10000rpm)离心32分钟。上清液用于“样品-稀释”步骤1中。
准备标准物和样品
使用三种方法来稀释样品/标准物、加入内标物、并形成FMOC衍生物。它们概述如下。
操作 所用的Microlab方法
稀释 TRANSDIL
加入内标物 ADDISTD
形成FMOC衍生物 ADDFMOC
使用 自动仪配制样品和标准物
步骤1：标准物-加入ISTD和稀释步骤
1.对于每个标准物，准备两套管子。在一套管中，放入约2ml标准物，将这些装有标准物的管子放置在最左边的位置上。
2.将放有空管子的管架放置在最右边的架位上。
3.将工作内标物溶液B注入20mL玻璃(闪烁)管中，并放置在的工作区上。
4.选择方法ADDISTD。(混合200μL ISTD B、50μL标准物溶液，用Milli-QTM水将总容积稀释至4000μL)。
5.实施该方法。
6.从左边位置上取下管组，弃于一边。
7.从工作区取出工作内标物溶液，并冷冻。
留下右边的管子用于步骤3。
步骤2：样品-稀释步骤(ISTD已在样品配制过程中加入)
1.对于每个样品，准备两套管子。在一套管子中，放入约2mL样品，将这些装有样品的管子放置在最左边的位置上。
2.将放有空管子的管架放置在最右边的架位上。
3.选择方法TRANSDIL。(设置样品的#，样品量为50μL，并且用Milli-QTM水稀释的最终稀释量为4000μL。)
4.实施该方法。
5.从左边位置上取下管组，弃于一边。
留下右边的管子用于步骤3。
步骤3：加入FMOC试剂-制备荧光衍生物
1.准备一架100 x 16mm的螺帽管。
2.将管架放置在最右边的架位上。
3.将得自上面稀释步骤的标准物管和样品管放置于最左边的架位上。
4.将等分(22ml)的FMOC试剂溶液转移到玻璃闪烁管中。加入大约100μL 40％氯化钙溶液；混合均匀。(加入氯化钙使FMOC试剂“带电”-这是用测定所必需的)。
5.将闪烁管放置于工作区上。
6.选择方法ADDFMOC。
7.将注射器1和2从水切换到稀释剂(pH 8.3至8.5)。
8.用稀释剂(pH 8.3至8.5)对注射器1和2进行洗涤至少五(5)个循环。
9.实施方法ADDFMOC。(将450μL FMOC溶液、250μL得自上面ADDISTD的样品混合，用稀释剂溶液稀释至最终容积为1300μL)。
10.从样品架位上取下管组，并丢弃。
11.从工作区取出FMOC试剂溶液，并冷冻。
12.从最右边的位置上取下管组，并置于通风橱中。静置至少10分钟，或直至溶液澄清(但不超过20分钟)。
13.每个管子中加入2mL萃取溶剂。盖上盖，并高速涡旋二(2)分钟，以萃取出未反应的FMOC试剂。
14.准备另一管架55x16mm的管子。每个管子中加入1ml流动相溶液。
15.将1.0ml水层(下层)从离心管中转移到55x16mm的管中。
16.弃去上层(有机层)。
17.将样品转移到自动取样瓶中，并密封。
色谱法
操作条件
装有Chem Station软件的HP 1100
检测器：Waters 474扫描荧光检测器
型号：Norm
信号：0.0000
波长：激发260
发射313
增益：10
衰减：1
响应：FST
色谱柱：Phenomex Luna C18(2)100 x 4.6mm 3u
LC方法
流量：1.000ml/min
等度操作(参见试剂配制-流动相)
注射体积：10.0μL
温度设置：不控温
计算
使用面积值，相对于已知量的标准曲线计算样品溶液：
y＝mx+b
y(天冬酰胺/ISTD比率)＝m(斜率)x(天冬酰胺浓度)+b(y轴截距)
(y-b)/m＝x
天冬酰胺(ppm)＝(天冬酰胺面积/ISTD面积-截距)/斜率
实施例：
天冬酰胺(ppm)＝(215.45436/551.828--0.0165)/0.0023＝176.93ppm
[ppm＝μg/mL]
对于样品制备步骤中稀释/均化的校正。
[ppm＝μg/mL]
实施例：
进行合格判断标准：
·工作标准物质对照样品的准确度必须在天冬酰胺已知结果的10％范围之内。
·校准曲线的线性度(r2)必须为0.995或更大。
样品的LC色谱分析
图3列出了样品的LC色谱图分析。
停留时间 化合物 4.5分钟 天冬酰胺 6.6分钟 天冬氨酸 11.5分钟 FMOC试剂 20.7分钟 ISTD
3.丙烯酰胺的减少％
丙烯酰胺的减少％＝[(对照样品中丙烯酰胺的含量-酶处理的样品中丙烯酰胺的含量)/对照样品中丙烯酰胺的含量]x 100。
除了没有加入酶，对照样品的配制方法与用酶处理样品的完全相同。
4.天冬酰胺减少％
天冬酰胺的减少％＝[(对照样品中天冬酰胺的含量-酶处理过的样品中天冬酰胺的含量)/对照样品中天冬酰胺的含量]x 100。
除了没有加入酶，对照样品的配制方法与用酶处理样品的完全相同。
实施例
以下实施例举例说明本发明，但不旨在对其进行限制。
实施例1-脱水的干磨玉米产品
根据常规方法制作灭菌的白玉米粉。研磨前加入有效量的天冬酰胺酶。所得灭菌白玉米粉的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例2-脱水的湿磨玉米产品
根据常规方法制作白玉米面团粉。干燥前加入有效量的天冬酰胺酶。所得面团粉的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例3-加工的未经发酵的玉米片
使用实施例2的白玉米面团粉制作未经发酵的玉米片，使用描述于Zimmerman等人的公布于2001年12月6日的WO 01/91581中的方法。所得未经发酵的玉米片的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例4-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片包装于袋中，以向消费者出售。袋上印有提示信息，声明“无丙烯酰胺产品！”
实施例5-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片包装于袋中，以向消费者出售。袋上印有提示信息，声明“丙烯酰胺含量低！”
实施例6-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片包装于袋中，以向消费者出售。袋上印有提示信息，声明“丙烯酰胺降低了90％以上！”该薄片的电视广告传递的信息是，“我们的薄片丙烯酰胺含量较低！”
实施例7-商品
将丙烯酰胺含量小于40ppb的统一形状的加工未经发酵的玉米片包装于三角形罐中，向消费者出售。该薄片的电视广告传递的信息是，“丙烯酰胺减少了！”
实施例8-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片置于柳条筐中，供餐厅顾客食用。张贴在销售玉米片的餐厅内的广告牌写道，“我们的玉米片含有减量的丙烯酰胺！”
实施例9-商品
将实施例3的未经发酵的玉米片包装于袋中，向消费者出售。袋上印有提示信息，声明“用低天冬酰胺的成分制成！”
实施例10-玉米片早餐谷类食物
黄玉米被破碎(研磨)以得到4号至5号的粗粒，无细菌和麸皮。这些大块呈大约1/2玉米粒；并且它们在整个加工过程中保持它们的特征，每个颗粒最终形成玉米片。在圆柱形高压锅内放入约771kg(1700磅)粗磨玉米和136L(36加仑)由糖、麦芽(未糖化的)、盐和水组成的调味糖浆。将有效量的天冬酰胺酶加入高压锅，然后让混合物浸泡几个小时。随后烹制该混合物。
在烹制期间，充填物累积了来自蒸汽的附加水分使其流回压力锅内，水分上升至约33％。烹制在缓慢的旋转压力锅中于103至159(典型124)kPa(15至23(典型18)psi)的蒸汽压下进行1至2小时。不同批的玉米在所需的烹制时间长度上可相当地不同。终点可通过检查从为此所设的闸门阀中喷出的少量充填物样品来判断。谷粒中均匀的半透明物指示已充分烹制。此时压力降至大气压，打开压力锅，将内容物倾倒在移动带上。
当来自锅中的团块用回转轴破碎成单独颗粒后，将它们散布在一组干燥器上。对于某些情况，后面的装置基本上是垂直延伸的大管子或大罐。湿谷粒从顶部进入，当它们移动至底部时被逆流的热(65℃(150°F))空气干燥。
干燥的颗粒此时包含19％至23％水分，但是此水分是不均匀分布的，所以物料被传送至匀湿仓放置几个小时(多至24小时)以使水分平衡。匀湿后，硬、茶褐色的粗磨玉米粒已准备好可压片。
压片辊为每个重超过一吨的钢滚筒，并以约19至21弧度/秒(180至200rpm)的速度旋转。液压控制保持接触辊时的压力大于40吨。辊通过内部的水循环冷却。当烹制过干粗磨玉米粒经过该辊时被压成薄片。该制品此时仍有点柔韧，缺乏最终玉米片所需要的松脆和优选的风味。
玉米片从辊上直接进入旋转的烤面包炉，该面包炉通常是燃气的。润湿的玉米片翻滚通过多孔的转筒中，并经过几英寸的气体火焰。处理可在301℃(575°F)下进行50秒，或288℃(550°F)下进行2至3分钟。除了用该方法完全脱水以外，还将该玉米片烘烤和起泡。它们从炉中出来时水分小于3％。
离开炉后，玉米片被皮带输送至膨胀仓，在这里使它们冷却至室温。在途中，该制品用循环空气冷却，并通常用硫胺和其它B族维生素溶液的喷雾处理。
所得玉米片的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例11-商品
实施例10的玉米片被包装在袋中，然后将该袋放入盒子中，出售给消费者。盒子上印有提示信息，声明“丙烯酰胺减少了！”
实施例12-含酶的面团粉
将有效量的干燥酶与未经酶处理、传统方法加工的玉米面团粉混合。此混合物作为用于制作玉米面团基食品的成分销售。该混合物可用于制作丙烯酰胺减少量大于10％的食品。
实施例13-商品
实施例12的含酶面团粉包装在袋中出售。袋子上的说明描述使用面团粉使所得面团基食品的丙烯酰胺减少量大于10％的适宜条件(时间、温度、pH)。
尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可作出许多其它的变化和修改。因此，有意识地在附加的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。