水稻转座子基因转让专利
申请号 : CN200480018694.6
文献号 : CN1816624B
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 饭田滋 , 前川雅彦 , 梅根一夫
申请人 : 中国水稻研究所
摘要 :
本发明人鉴定出了易变的并表现为叶绿素蓄积低下的pyl突变体的致病基因，并发现分型为Ac/Ds型的新型转座子参与了该突变。首次确认了水稻的Ac/Ds型转座子nDart(SEQ ID NO：1)在正常的栽培条件下具有转座子活性。此外，通过分析所述的Ac/Ds型转座子发现了一种自主元件Dart。
权利要求 :
1.一种水稻转座子基因，其DNA序列由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成；
其中所述DNA在通过以化学试剂处理含有所述DNA的水稻时发生转座。
2.权利要求1的转座子基因，其中所述的化学试剂是5-氮胞苷。
3.包括权利要求1或2的转座子基因的质粒。
4.一种用于使权利要求1的转座子基因发生转座的方法，该方法包括用5-氮胞苷处理转导了所述转座子基因的植物。
5.权利要求4的方法，其中所述植物是拟南芥属植物、烟草、番茄、矮牵牛属植物、十字花科植物、棉属植物、水稻或玉米。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种水稻转座子基因，更具体地涉及一种水稻的Ac/Ds型转座子基因及其自主元件。
背景技术
依照转座的类型，转座元件大致分成I型元件以及II型元件，在I型元件中，转座元件经RNA中间物进行转座，而在II型元件中，转座元件在切断DNA后作为DNA分子进行转座。利用一种I型元件，即Tos17，已经发展出了大规模的水稻基因标记系统(tagging system)，但是，已知它诱导了高频率的体细胞突变，因为Tos17转座是通过愈伤组织培养完成的(Trend.Plant Sci.6：127-134(2001))。同时，报道了作为II型元件的基于MITE的mPing(Nature，vol.421，No.6919，pp.167-170(Jan.2003))。
本发明要解决的问题
但是，mPing转座需要进行花药培养或γ照射，而后者可诱导体细胞突变或高频率突变(Nature，vol.421，No.6919，pp.167-170(Jan.2003))。另外，因为这些转座子具有靶序列特异性，因此认为只能得到一部分可能的突变。因此，需要一种新的标记系统。
解决上述问题的手段
本发明人鉴定出了pyl(pale-yellow leaf)突变的致病基因，该突变是易变的并有叶绿素蓄积低下，并发现一种被分型为Ac/Ds型元件的新的转座子参与了该突变。这些结果首次确认了Ac/Ds型转座子nDart(非自主性Ds相关性活性水稻转座子(nonautonomous Ds-related active ricetransposon))的存在，它在水稻的正常栽培条件下具有转座子活性。此外，本发明人在对Ac/Ds型转座子分析的过程中发现了自主元件Dart。
因此，本发明涉及一种包括以下(1)或(2)的DNA的水稻转座子基因(nDart)：
(1)包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；
(2)包括与(1)的核苷酸序列具有98％以上同源性的核苷酸序列的DNA，其中通过以化学试剂处理含有所述DNA的水稻而进行所述DNA的转座。
此外，本发明涉及一种包括以下(3)或(4)的DNA的水稻转座子基因(Dart)：
(3)包括SEQ ID NO：6-8中的任一核苷酸序列的DNA；
(4)包括与(3)的核苷酸序列具有98％以上同源性的核苷酸序列的DNA，其中通过以化学试剂处理含有所述DNA的水稻而进行所述DNA的转座。
已经知道通过让植物在诱导活跃的细胞分裂的条件下进行培养可以增加转座子的转座频率。因此，为了增加在正常栽培条件下进行转座的nDart和Dart的转座频率，让植物在应激条件下生长是有效的。应激条件包括用化学试剂进行处理，例如诱导DNA脱甲基化的5-氮胞苷；暴露于照射例如UV和γ射线；或人工培养系统的应用，例如培养通过植物细胞的去分化而得到的愈伤组织。所述的处理增加了nDart和Dart的转座频率以及突变频率的增加使得能有效地得到所需的突变体。
此外，本发明涉及一种含有任何上述转座子基因的质粒。有用的质粒在此包括Ti质粒和二元载体例如pBI-121质粒等。有用的启动子在此包括花椰菜花叶病毒35S启动子、热休克启动子、化学趋化启动子和其他的启动子。另外，对于启动子和所述的基因之间的连接方法没有限定，可以任意地应用遗传工程的常用方法。
本发明还涉及一种转化体，其中转导了任何一种所述的转座子基因。宿主优选地是一种植物，且优选地是拟南芥属(Arabidopsis)植物、烟草、番茄、矮牵牛属植物、十字花科植物、棉属植物或玉米。为了转化植物，采用遗传工程的常用方法可以将这些基因插入到所述的质粒中并且可以转化植物。
本发明还涉及一种转化的植物或种子，其中用任一所述的方法转导了任一所述的转座子基因。植物优选地是拟南芥属植物、烟草、番茄、矮牵牛属植物、十字花科植物、棉属植物或玉米。
本发明要解决的问题
但是，mPing转座需要进行花药培养或γ照射，而后者可诱导体细胞突变或高频率突变(Nature，vol.421，No.6919，pp.167-170(Jan.2003))。另外，因为这些转座子具有靶序列特异性，因此认为只能得到一部分可能的突变。因此，需要一种新的标记系统。
解决上述问题的手段
本发明人鉴定出了pyl(pale-yellow leaf)突变的致病基因，该突变是易变的并有叶绿素蓄积低下，并发现一种被分型为Ac/Ds型元件的新的转座子参与了该突变。这些结果首次确认了Ac/Ds型转座子nDart(非自主性Ds相关性活性水稻转座子(nonautonomous Ds-related active ricetransposon))的存在，它在水稻的正常栽培条件下具有转座子活性。此外，本发明人在对Ac/Ds型转座子分析的过程中发现了自主元件Dart。
因此，本发明涉及一种包括以下(1)或(2)的DNA的水稻转座子基因(nDart)：
(1)包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；
(2)包括与(1)的核苷酸序列具有98％以上同源性的核苷酸序列的DNA，其中通过以化学试剂处理含有所述DNA的水稻而进行所述DNA的转座。
此外，本发明涉及一种包括以下(3)或(4)的DNA的水稻转座子基因(Dart)：
(3)包括SEQ ID NO：6-8中的任一核苷酸序列的DNA；
(4)包括与(3)的核苷酸序列具有98％以上同源性的核苷酸序列的DNA，其中通过以化学试剂处理含有所述DNA的水稻而进行所述DNA的转座。
已经知道通过让植物在诱导活跃的细胞分裂的条件下进行培养可以增加转座子的转座频率。因此，为了增加在正常栽培条件下进行转座的nDart和Dart的转座频率，让植物在应激条件下生长是有效的。应激条件包括用化学试剂进行处理，例如诱导DNA脱甲基化的5-氮胞苷；暴露于照射例如UV和γ射线；或人工培养系统的应用，例如培养通过植物细胞的去分化而得到的愈伤组织。所述的处理增加了nDart和Dart的转座频率以及突变频率的增加使得能有效地得到所需的突变体。
此外，本发明涉及一种含有任何上述转座子基因的质粒。有用的质粒在此包括Ti质粒和二元载体例如pBI-121质粒等。有用的启动子在此包括花椰菜花叶病毒35S启动子、热休克启动子、化学趋化启动子和其他的启动子。另外，对于启动子和所述的基因之间的连接方法没有限定，可以任意地应用遗传工程的常用方法。
本发明还涉及一种转化体，其中转导了任何一种所述的转座子基因。宿主优选地是一种植物，且优选地是拟南芥属(Arabidopsis)植物、烟草、番茄、矮牵牛属植物、十字花科植物、棉属植物或玉米。为了转化植物，采用遗传工程的常用方法可以将这些基因插入到所述的质粒中并且可以转化植物。
本发明还涉及一种转化的植物或种子，其中用任一所述的方法转导了任一所述的转座子基因。植物优选地是拟南芥属植物、烟草、番茄、矮牵牛属植物、十字花科植物、棉属植物或玉米。
附图说明
图1显示了易变的pyl-v突变体。
图2显示了表型稳定的pyl-stb(左侧)和野生型“台中65号”(右侧)。显示了在种植于经改良的白色培养基后7天时的个体部分。
图3显示了基于ply基因图谱的克隆。
图4显示了实施例1的PCR产物的凝胶电泳的结果。
图5显示了OsClpP基因(一种pyl突变体)。黑色方块表示外显子以及atg表示起始密码子。
图6显示了ply-stb突变体内的OsClpP基因的转录起始位点的侧翼区。小写字母表示被翻译为蛋白的区域，有下划线的atg表示起始密码子。第一个箭头表示野生型的转录起始位点，其他的箭头表示ply-stb突变体的转录起始位点。斜上方的数字表示克隆的次数。
图7显示了回复体的OsClpP基因的结构(A)和残留足迹(footprint)(B)。有下划线的atg表示起始密码子。
图8显示了BLAST搜索到的自主元件。
图9显示了籼稻(indica rice)(Kasarasu)和台中65号(T-65)的pyl-v突变体之间的杂交体(B3F1)的突变区的DNA的凝胶电泳的结果。(1)显示了nDart1-0(3号染色体)突变；(2)nDart1-4(3-1)(3号染色体)；(3)nDart1-12(1号染色体)；(4)nDart200-2(12号染色体)。道1表示Kasarasu，道2表示T-65、pyl-v，道3-21表示杂交体(B3F1)。
发明详述
本发明人利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)搜索与nDart高度同源的转座子。所搜索的数据库位置是美国生物技术信息中心和国立遗传研究所的DNA数据库。搜索主题是nDart(SEQ ID NO：1)。水稻GAAS系统(Yu.J，Hu.S，(2002)Science 296：79-92)被用作基因预测程序。表1显示了我们利用BLAST进行分析的结果。31个核苷酸序列与nDart同源，其中的7个核苷酸序列与nDart具有98％以上的同源性。
任何栽培品种都可以携带活性的DNA转座子作为用于育种改良的有效诱变原，而不需要通过与外源基因进行杂交，因为本发明已经确定出nDart的核苷酸序列(SEQ ID NO：1).
通过nDart的转座，有可能得到具有断裂基因的突变体，以及从突变体的自体受精的子代中分离到其中nDart是再转座的以及残留有突变足迹的稳定突变体，和其中突变表型回复为野生表型的回复体。通过设计nDart序列内的引物、进行反向PCR等方法，可以鉴定出由于转座的nDart重新插入而被断裂的基因。通过分析这些突变体和它们的基因之间的关系，可以了解基因的功能。在这种情况中，利用所述的方法可以鉴定出因转座的nDart而断裂的基因。
此外，通过用常用的转化方法将转座子转导到其他植物中得到具有断裂基因的突变体是有可能的。通过分析这些突变体和它们的基因之间的关系，可以研究基因的功能。在这种情况中，利用所述的方法可以鉴定出因转座的转座子而断裂的基因。
作为一种利用本发明的nDart和Dart的方法，通过用这些转座子作为诱变剂可以产生用于水稻和其他所需植物的具有转座子的标记系统。在产生特别用于水稻的标记系统的情况中，杂交容易使得任何的水稻栽培品种都携带有nDart和活性的Dart基因。因为所述的标记系统不含外来基因，因此有可能利用常用的栽培方法而不需使用物理防范装置在田间大规模地发展标记系统，物理防范装置对于遗传学修饰的植物的栽培是必需的。因此用遗传分析或逆向遗传分析的方法可以分析所得到的突变体。遗传方法是一种根据突变体的表型分离致病基因的方法，其能够利用标签(转座子)容易地鉴定和分离出致病基因的方法，因为本发明的转座子和突变体的表型是相关的。
逆向遗传分析也是一种分离那些缺失了基因中的某些功能的突变体的方法。首先，在从各种突变体中分离到DNA后制备出DNA库，对该库进行PCR筛选，筛选能够挑选出其中转座子被插入到预期基因内的突变体。
实施例
下面的实施例举例说明了本发明，但无意于限制发明的范围。
试验例1
本发明的共同发明人Maekawa在1986年分离到了易变的pyl-v突变体(图1)，它是通过日本型水稻H-126和籼稻C-5052之间的杂交产生的，并具有叶绿素蓄积低下的杂色(图1)。在pyl-v突变体中观察到与野生型相似的深绿色部分与玉米色叶的细胞组一同出现，据此并根据遗传学分析，推测易变性的原因在于DNA型转座子的插入和释放。
试验例2
然后，在用从试验例1中所得到的pyl-v突变体与日本型水稻“Shiokari”或“台中65号”之间的反复杂交制备出近同系品系之后，分离出pyl-stb(pale-yellow leaf-stable)，其中pyl表型显然是稳定的。
既然pyl-stb可通过杂交导致再次分离到易变品系并可通过用化学试剂的处理转变成了易变品系，那么pyl-stb品系就是短暂稳定的，这可归结于自主元件的隔离或失活。
在土壤中发芽的pyl-stb突变体幼苗在第四叶阶段之前就枯萎。在这个试验例中，在无菌条件下将pyl-stb种子栽培在琼脂培养基中直到第四叶阶段，然后将其种植在土壤中。以这种方式，Pyl-stb产生很高的结果概率。如果在白色荧光灯的26μmol m-2sec-1连续光照、28℃和无菌条件下将pyl-stb种子种植在改良的白色培养基中并发芽，Pyl-stb种子就能生长超过第四叶阶段(Kusumi K.，Mizutani A.et al.(1997)Plant J.12：1241-50)。生长超过第四叶阶段的pyl-stb在移植到土壤后能产生很高的结果概率。图2显示了pyl-stb幼苗的生长。
实施例1
在这个实施例中，构建基于图谱的克隆以鉴定诱导pyl-v的杂色的DNA型转座子基因以及引起pyl突变的基因。
为了进行基于图谱的克隆的分析，使用了通过籼稻“Kasarasu”和近同系品系进行杂交所产生的F2代，近同系品系是在试验例1中所得到的pyl-v突变体和“Shiokari”之间的回交之后所产生的。从来自于该F2幼苗的21个pyl-v突变体中分离出DNA，并用覆盖12条染色体的54界标SSR标记物构建出pyl的简单图谱(Theor.Appl.Genet.100：697-712(2000))。从中发现pyl基因定位于3号染色体短臂的RM282和RM251之间的22cM内。
然后，选择出定位于上面2种标记物之间的日本晴(Nipponbare)的EST克隆(Plant cell 14，525-35(2002))。根据这些EST克隆的核苷酸序列，选择出叠连群(Science 296：79-92(2002))，其是一组含有这些EST克隆的籼稻93-11的连接的基因组DNA序列。同时，选择美国CSHL小组所报告的日本晴的BAC克隆并制备18个标记物，它们可用作获得用于鉴定的PCR产物的引物，这些标记物位于在两种选定的克隆的核苷酸序列之间有8个碱基对以上的差异的DNA区域的两侧。利用这些标记物，从11800株F2幼苗中选择出表达pyl表型的那些幼苗，得到3112株遗传学修饰的幼苗。作为结果，得到了约80.4kb长度内的pyl的侯选基因。图3显示了图谱示意图。
在这个区域内推定出9个ORF，设计了扩增基因组的所有这些ORF区的引物对，并检测了“台中65号”、pyl-stb和“Kasarasu”的PCR产物。
PCR反应混和物(50μl)含有2.5U LA Taq、1xGC缓冲液、400μMdATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP(Takara)、0.2μM引物对、100ng“台中65号”、pyl-stb和“Kasarasu”的基因组DNA，以及用于调整体积的无菌的MilliQ水(Milipore)。用0.8％LOIII琼脂糖凝胶(Takara)电泳分离PCR产物。
用引物Clp-3F(SEQ ID NO：2)和Clp-4R(SEQ ID NO：3)进行的PCR发现了pyl-stb和其他品系的PCR产物之间的约600个碱基对的差异。图4显示了电泳结果。
引物Clp-3F和Clp-4R所扩增的基因(OsClpP，SEQ ID NO：9)与拟南芥属的ClpP5基因(Trend.Plant Sci.6：127-134(2001))具有80％的同源性，并可能编码转运到叶绿体的蛋白酶。
实施例2
在这个实施例中，本发明人测定了PCR产物的核苷酸序列以确认实施例1所扩增的PCR产物的差异。
用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化实施例1的PCR产物，并用测序仪(ABI PRISM377，Applied Biosystem)测定其核苷酸序列和用各种软件分析其序列。然后，发现一个607个碱基对序列(SEQ ID NO：1)被插入到了OsClpP基因的外显子1中。图5显示了插入位点的结构。
在DNA转座子插入到这个区域的同时诱导了靶序列的8个碱基对的TSD(靶位点复制)，并在607个碱基对的插入体的两个末端产生了19个碱基对的TIR(末端反向重复).
依照8个碱基对的TSD以及TIR与已知DNA转座子的相似性，将该插入序列分型为Ac/Ds型。表2显示了已知的Ac/Ds型转座子和该插入序列(nDart)之间的比较。这个插入序列是一种与不伴有自主元件的Ds相似的新型转座子基因。
实施例3
推定该基因编码OsClpP蛋白并含有pyl突变体中的插入的nDart(SEQ ID NO：1)，为了测定该基因的转录起始位点和全长，本发明人在这个实施例中进行5’RACE和3’RACE以认识mRNA的CAP结构。
用硫氰酸胍盐酸从pyl-stb中分离出RNA，并用THERMOSCRIPT(Invitrogen)由1μg总RNA制备cDNA。通过利用根据GeneRacer试剂盒(Invitrogen)制备的引物PG8-813R(SEQ ID NO：4)和引物Clp-3R(SEQID NO：5)以及OsClpP基因的核苷酸序列、和利用所述的cDNA作为模板的反复PCR测定出转录起始位点。图6显示了结果。
发现绝大多数转录起始位点都定位在pyl-stb中的编码甲硫氨酸序列的下游，甲硫氨酸是所翻译的蛋白的第一个氨基酸，并且认为pyl突变归因于OsClpP基因。
实施例4
为了检查nDart在来自于在pyl-v突变体中所出现的15个独立品系的49个回复体中的释放情况，本发明人在本实施例中用引物Clp-3F(SEQ IDNO：2)和Clp-4R(SEQ ID NO：3)进行PCR以扩增来自OsClpP基因的第一外显子到第七外显子的区域。
PCR反应混和物(50μl)含有2.5U LA Taq、1xGC缓冲液、400μMdATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP (Takara)、0.2μM引物对、100ng回复体的基因组DNA，以及用于调整体积的无菌的MilliQ水(Milipore)。用0.8％LOIII琼脂糖凝胶(Takara)电泳分离PCR产物，并确认扩增出了具有与DNA片段相同大小的PCR产物，其中转座子基因(SEQ ID NO：1)是缺失的。
实施例5
为了确认实施例4所扩增的PCR产物是转座子基因(SEQ ID NO：1)从OsClpP基因的第一外显子区的转座的结果，本发明人在本实施例中测定了PCR产物的核苷酸序列。
用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化实施例4的PCR产物，并用测序仪(ABI PRISM377，Applied Biosystem)测定其核苷酸序列和用各种软件分析其序列。图7显示了结果。
除了所述回复体的两类足迹的核苷酸序列的变化，在OsClpP基因的外显子1中没有观察到任何变化。所述的足迹变化也不会对从OsClpP的mRNA到蛋白的翻译有所影响，以及在所述回复体中可以产生与野生型相同的CLP蛋白。
实施例6
在本实施例中，确认了通过氮胞苷的处理能将实施例2所得到的pyl-stb种子变为pyl-v突变体。
将pyl-stb种子在0.15、0.3或0.45mM氮胞苷水溶液中、30℃下浸泡24个小时，将其洗涤、发芽并检查pyl-v的表达。表3显示了结果。随着氮胞苷浓度的增加，增加了nDart转座的频率。
实施例7
在本实施例中，用Blast(Basic Local Alignment Search Tool)搜索控制nDart转座的自主元件。
因为推定含有转座酶基因的核苷酸序列在其序列的两末端都具有与nDart相同的序列并在序列内具有转座酶基因，因此搜索具有与nDart(SEQ ID NO：1)的两末端相同序列的序列，并发现了3个序列(SEQ IDNO：6-8)。图8显示了序列。
SEQ ID NO：6的序列具有在它们中间具有最高同源性的末端序列。SEQ ID NO：6的两末端的每个183个碱基对的序列都与SEQ ID NO：1的两末端的序列具有98％以上的同源性，用基因预测程序显示出SEQ IDNO：6序列内的ORF具有转座酶基因。认为SEQ ID NO：6序列是一种自主元件，它与所报告的金鱼草属植物(Antirrhinum)的Tam3转座酶高度同源。
然后，搜索从SEQ ID NO：6序列中预测到的具有与Tam3最高同源性的自主元件。因为，报告Tam3的转座酶基因为没有内含子的结构，从所述的31个核苷酸序列中搜索出没有内含子的转座酶基因，并鉴定出SEQ IDNO：7序列。根据基因预测程序的分析，SEQ ID NO：7序列为没有内含子的结构并在其3’末端含有BED锌指区，这是一种DNA结合区。SEQ ID NO：7序列可能是控制nDart转座的自主元件。
根据作为索引的从SEQ ID NO：7序列中预测到的转座酶基因，搜索出具有不同剪切模式的核苷酸序列并鉴定出SEQ ID NO：8序列。如图8所示，SEQ ID NO：8序列具有同源区1和3，但没有2，预计它具有不同于SEQ ID NO：7的表达模式和功能。
实施例8
将籼稻(Kasarasu)和试验例2中所得到的台中65号(T-65)的pyl-v突变体杂交，并将nDart和自主元件(Dart)转导到Kasarasu内。进行回交3次，理论上预计转化为Kasarasu表型的频率是93.8％。
对于pyl突变体，突变的致病基因是OsClpP基因内插入了nDart-Origin(称作为nDart1-0)。通过BLAST分析，发现日本型水稻(日本晴)具有至少14个nDart，它与nDart1-0具有98％以上的同源性。根据与nDart1-0同源的程度，将nDart命名为nDart1-1到nDart1-12。因为两组nDart(nDart1-3和nDart1-4)具有相同的核苷酸序列，但定位于水稻基因组的不同位点，因为根据括号中所示的染色体号码将其分型。
用PCR扩增籼稻(Kasarasu)和台中65号的pyl-v突变体之间的杂交品系(B3F1)的突变区。在PCR中，将SEQ ID NO：10(F)和11(R)的寡核苷酸用作nDart1-0(3号染色体)的引物，将SEQ ID NO：12(F)和13(R)的寡核苷酸用作nDart1-4(3-1)(3号染色体)的引物，将SEQ IDNO：14(F)和15(R)的寡核苷酸用作nDart1-12(1号染色体)的引物，以及将SEQ ID NO：16(F)和17(R)的寡核苷酸用作nDart200-2(12号染色体)的引物。
图9显示了杂交品系(B3F1，图9，3-12道)的突变区的凝胶电泳的结果。19株个体中的9株具有nDart(SEQ ID NO：1)的转导(图9(1))。因为同时出现了Kasarasu型条带，因此甚至在回交个体中也发生nDart的缺失。所述的nDart定位于3号染色体上。检查了Kasarasu在其他染色体上的转导程度，发现在所有的19株个体中1、3和12号染色体的染色体标记物都变成了Kasarasu型(图9(2)-(4))。从上述的结果中，可以得出结论认为nDart和自主元件(Dart)甚至在籼稻中也能保持它们的活性。
此外，用氮胞苷处理籼稻(93-11)并确认了nDart的释放.在通常的生长条件下，不能观察到nDart的释放，但是在用氮胞苷处理过的93-11中确认出现了nDart的释放.
序列表
<110>独立行政法人 科学技术振兴机构
<120>水稻转座子基因
<130>FS04-411PCT
<160>17
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>607
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>1
tagaggtggc caaacgggcc gggccaaaac gggcggcccg aggcacggcg gaacctgtag 60
ccggcacggc ccggcacggc ctgctacagt aacgggccgt gccggcacgg cacgagtagc 120
cgtgccgtgc ttgggccgcc ggccgagccc gcgggccggc acggcacggc acagctactg 180
tagtaagtcc gcatctcatc cttccgcaag tccgtatctc atccctccca actgacggcc 240
cagcccgcta gccgcctccg caagtccgtt gagcacccct cctagctgat ggcccagccc 300
gccagccacc tccgcaagtc cgcatcgcat ccctccgcgc catttcggtt cctgggccaa 360
ccgtgccccg tccacggccc atttttcatt cacgggcccg tactgacacg gcgggccaca 420
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cgaaacgggc cgtgccggac ccgtgcccgt gccgtgccgg gccgggccgc ccgtttggcc 600
acctcta 607
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>2
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<211>22
<212>DNA
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<220>
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>5
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<210>6
<211>3591
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>6
tagaggtggc caaatgggcc gggccaaacg ggcggcccga ggcacggccg aacctgtagc 60
aggcacggcc cggcacggcc tgctacagta acgggccgtg ccggcacggc acgagtagcc 120
gtgccgtgct tgggccgctg gccgagcccg cgggccggca cggcacggca cggctactgt 180
agcgggccgg cacggcacgg cccgcggcac ggcacggcac ggcacgccgg cggcccgtca 240
ggcgcggaca gggcgggcgg cggtcgaatg ggaaggcgcc acgtggcact aacggctatt 300
tgaccgttca aatttgaaaa taaccgttgg gaggctaaaa aattcataaa aatttcgaaa 360
aaattccaaa aaatctcaaa tttcgcccta taaatagggc atgaacccca gccatttctc 420
ctcatcccac actcctcatc ttgtgctctc aagtgtttta agtgctctct ttgttctcaa 480
gtgtgcattt tttttgattt tgacaaaatt tgctcaaatt ttgtcaaaaa tcaaaattag 540
tttcgtagtt caacagtttg atcgcagagg tttgaagagc tcgcagttgg aaagatgtaa 600
gtaatattca aatttgtgta ttatttgtat tgtgtttgtg aattcaataa atattcgaaa 660
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cgatttggtc tttccgttag a 21
图2显示了表型稳定的pyl-stb(左侧)和野生型“台中65号”(右侧)。显示了在种植于经改良的白色培养基后7天时的个体部分。
图3显示了基于ply基因图谱的克隆。
图4显示了实施例1的PCR产物的凝胶电泳的结果。
图5显示了OsClpP基因(一种pyl突变体)。黑色方块表示外显子以及atg表示起始密码子。
图6显示了ply-stb突变体内的OsClpP基因的转录起始位点的侧翼区。小写字母表示被翻译为蛋白的区域，有下划线的atg表示起始密码子。第一个箭头表示野生型的转录起始位点，其他的箭头表示ply-stb突变体的转录起始位点。斜上方的数字表示克隆的次数。
图7显示了回复体的OsClpP基因的结构(A)和残留足迹(footprint)(B)。有下划线的atg表示起始密码子。
图8显示了BLAST搜索到的自主元件。
图9显示了籼稻(indica rice)(Kasarasu)和台中65号(T-65)的pyl-v突变体之间的杂交体(B3F1)的突变区的DNA的凝胶电泳的结果。(1)显示了nDart1-0(3号染色体)突变；(2)nDart1-4(3-1)(3号染色体)；(3)nDart1-12(1号染色体)；(4)nDart200-2(12号染色体)。道1表示Kasarasu，道2表示T-65、pyl-v，道3-21表示杂交体(B3F1)。
发明详述
本发明人利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)搜索与nDart高度同源的转座子。所搜索的数据库位置是美国生物技术信息中心和国立遗传研究所的DNA数据库。搜索主题是nDart(SEQ ID NO：1)。水稻GAAS系统(Yu.J，Hu.S，(2002)Science 296：79-92)被用作基因预测程序。表1显示了我们利用BLAST进行分析的结果。31个核苷酸序列与nDart同源，其中的7个核苷酸序列与nDart具有98％以上的同源性。
任何栽培品种都可以携带活性的DNA转座子作为用于育种改良的有效诱变原，而不需要通过与外源基因进行杂交，因为本发明已经确定出nDart的核苷酸序列(SEQ ID NO：1).
通过nDart的转座，有可能得到具有断裂基因的突变体，以及从突变体的自体受精的子代中分离到其中nDart是再转座的以及残留有突变足迹的稳定突变体，和其中突变表型回复为野生表型的回复体。通过设计nDart序列内的引物、进行反向PCR等方法，可以鉴定出由于转座的nDart重新插入而被断裂的基因。通过分析这些突变体和它们的基因之间的关系，可以了解基因的功能。在这种情况中，利用所述的方法可以鉴定出因转座的nDart而断裂的基因。
此外，通过用常用的转化方法将转座子转导到其他植物中得到具有断裂基因的突变体是有可能的。通过分析这些突变体和它们的基因之间的关系，可以研究基因的功能。在这种情况中，利用所述的方法可以鉴定出因转座的转座子而断裂的基因。
作为一种利用本发明的nDart和Dart的方法，通过用这些转座子作为诱变剂可以产生用于水稻和其他所需植物的具有转座子的标记系统。在产生特别用于水稻的标记系统的情况中，杂交容易使得任何的水稻栽培品种都携带有nDart和活性的Dart基因。因为所述的标记系统不含外来基因，因此有可能利用常用的栽培方法而不需使用物理防范装置在田间大规模地发展标记系统，物理防范装置对于遗传学修饰的植物的栽培是必需的。因此用遗传分析或逆向遗传分析的方法可以分析所得到的突变体。遗传方法是一种根据突变体的表型分离致病基因的方法，其能够利用标签(转座子)容易地鉴定和分离出致病基因的方法，因为本发明的转座子和突变体的表型是相关的。
逆向遗传分析也是一种分离那些缺失了基因中的某些功能的突变体的方法。首先，在从各种突变体中分离到DNA后制备出DNA库，对该库进行PCR筛选，筛选能够挑选出其中转座子被插入到预期基因内的突变体。
实施例
下面的实施例举例说明了本发明，但无意于限制发明的范围。
试验例1
本发明的共同发明人Maekawa在1986年分离到了易变的pyl-v突变体(图1)，它是通过日本型水稻H-126和籼稻C-5052之间的杂交产生的，并具有叶绿素蓄积低下的杂色(图1)。在pyl-v突变体中观察到与野生型相似的深绿色部分与玉米色叶的细胞组一同出现，据此并根据遗传学分析，推测易变性的原因在于DNA型转座子的插入和释放。
试验例2
然后，在用从试验例1中所得到的pyl-v突变体与日本型水稻“Shiokari”或“台中65号”之间的反复杂交制备出近同系品系之后，分离出pyl-stb(pale-yellow leaf-stable)，其中pyl表型显然是稳定的。
既然pyl-stb可通过杂交导致再次分离到易变品系并可通过用化学试剂的处理转变成了易变品系，那么pyl-stb品系就是短暂稳定的，这可归结于自主元件的隔离或失活。
在土壤中发芽的pyl-stb突变体幼苗在第四叶阶段之前就枯萎。在这个试验例中，在无菌条件下将pyl-stb种子栽培在琼脂培养基中直到第四叶阶段，然后将其种植在土壤中。以这种方式，Pyl-stb产生很高的结果概率。如果在白色荧光灯的26μmol m-2sec-1连续光照、28℃和无菌条件下将pyl-stb种子种植在改良的白色培养基中并发芽，Pyl-stb种子就能生长超过第四叶阶段(Kusumi K.，Mizutani A.et al.(1997)Plant J.12：1241-50)。生长超过第四叶阶段的pyl-stb在移植到土壤后能产生很高的结果概率。图2显示了pyl-stb幼苗的生长。
实施例1
在这个实施例中，构建基于图谱的克隆以鉴定诱导pyl-v的杂色的DNA型转座子基因以及引起pyl突变的基因。
为了进行基于图谱的克隆的分析，使用了通过籼稻“Kasarasu”和近同系品系进行杂交所产生的F2代，近同系品系是在试验例1中所得到的pyl-v突变体和“Shiokari”之间的回交之后所产生的。从来自于该F2幼苗的21个pyl-v突变体中分离出DNA，并用覆盖12条染色体的54界标SSR标记物构建出pyl的简单图谱(Theor.Appl.Genet.100：697-712(2000))。从中发现pyl基因定位于3号染色体短臂的RM282和RM251之间的22cM内。
然后，选择出定位于上面2种标记物之间的日本晴(Nipponbare)的EST克隆(Plant cell 14，525-35(2002))。根据这些EST克隆的核苷酸序列，选择出叠连群(Science 296：79-92(2002))，其是一组含有这些EST克隆的籼稻93-11的连接的基因组DNA序列。同时，选择美国CSHL小组所报告的日本晴的BAC克隆并制备18个标记物，它们可用作获得用于鉴定的PCR产物的引物，这些标记物位于在两种选定的克隆的核苷酸序列之间有8个碱基对以上的差异的DNA区域的两侧。利用这些标记物，从11800株F2幼苗中选择出表达pyl表型的那些幼苗，得到3112株遗传学修饰的幼苗。作为结果，得到了约80.4kb长度内的pyl的侯选基因。图3显示了图谱示意图。
在这个区域内推定出9个ORF，设计了扩增基因组的所有这些ORF区的引物对，并检测了“台中65号”、pyl-stb和“Kasarasu”的PCR产物。
PCR反应混和物(50μl)含有2.5U LA Taq、1xGC缓冲液、400μMdATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP(Takara)、0.2μM引物对、100ng“台中65号”、pyl-stb和“Kasarasu”的基因组DNA，以及用于调整体积的无菌的MilliQ水(Milipore)。用0.8％LOIII琼脂糖凝胶(Takara)电泳分离PCR产物。
用引物Clp-3F(SEQ ID NO：2)和Clp-4R(SEQ ID NO：3)进行的PCR发现了pyl-stb和其他品系的PCR产物之间的约600个碱基对的差异。图4显示了电泳结果。
引物Clp-3F和Clp-4R所扩增的基因(OsClpP，SEQ ID NO：9)与拟南芥属的ClpP5基因(Trend.Plant Sci.6：127-134(2001))具有80％的同源性，并可能编码转运到叶绿体的蛋白酶。
实施例2
在这个实施例中，本发明人测定了PCR产物的核苷酸序列以确认实施例1所扩增的PCR产物的差异。
用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化实施例1的PCR产物，并用测序仪(ABI PRISM377，Applied Biosystem)测定其核苷酸序列和用各种软件分析其序列。然后，发现一个607个碱基对序列(SEQ ID NO：1)被插入到了OsClpP基因的外显子1中。图5显示了插入位点的结构。
在DNA转座子插入到这个区域的同时诱导了靶序列的8个碱基对的TSD(靶位点复制)，并在607个碱基对的插入体的两个末端产生了19个碱基对的TIR(末端反向重复).
依照8个碱基对的TSD以及TIR与已知DNA转座子的相似性，将该插入序列分型为Ac/Ds型。表2显示了已知的Ac/Ds型转座子和该插入序列(nDart)之间的比较。这个插入序列是一种与不伴有自主元件的Ds相似的新型转座子基因。
实施例3
推定该基因编码OsClpP蛋白并含有pyl突变体中的插入的nDart(SEQ ID NO：1)，为了测定该基因的转录起始位点和全长，本发明人在这个实施例中进行5’RACE和3’RACE以认识mRNA的CAP结构。
用硫氰酸胍盐酸从pyl-stb中分离出RNA，并用THERMOSCRIPT(Invitrogen)由1μg总RNA制备cDNA。通过利用根据GeneRacer试剂盒(Invitrogen)制备的引物PG8-813R(SEQ ID NO：4)和引物Clp-3R(SEQID NO：5)以及OsClpP基因的核苷酸序列、和利用所述的cDNA作为模板的反复PCR测定出转录起始位点。图6显示了结果。
发现绝大多数转录起始位点都定位在pyl-stb中的编码甲硫氨酸序列的下游，甲硫氨酸是所翻译的蛋白的第一个氨基酸，并且认为pyl突变归因于OsClpP基因。
实施例4
为了检查nDart在来自于在pyl-v突变体中所出现的15个独立品系的49个回复体中的释放情况，本发明人在本实施例中用引物Clp-3F(SEQ IDNO：2)和Clp-4R(SEQ ID NO：3)进行PCR以扩增来自OsClpP基因的第一外显子到第七外显子的区域。
PCR反应混和物(50μl)含有2.5U LA Taq、1xGC缓冲液、400μMdATP、400μM dGTP、400μM dCTP、400μM dTTP (Takara)、0.2μM引物对、100ng回复体的基因组DNA，以及用于调整体积的无菌的MilliQ水(Milipore)。用0.8％LOIII琼脂糖凝胶(Takara)电泳分离PCR产物，并确认扩增出了具有与DNA片段相同大小的PCR产物，其中转座子基因(SEQ ID NO：1)是缺失的。
实施例5
为了确认实施例4所扩增的PCR产物是转座子基因(SEQ ID NO：1)从OsClpP基因的第一外显子区的转座的结果，本发明人在本实施例中测定了PCR产物的核苷酸序列。
用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化实施例4的PCR产物，并用测序仪(ABI PRISM377，Applied Biosystem)测定其核苷酸序列和用各种软件分析其序列。图7显示了结果。
除了所述回复体的两类足迹的核苷酸序列的变化，在OsClpP基因的外显子1中没有观察到任何变化。所述的足迹变化也不会对从OsClpP的mRNA到蛋白的翻译有所影响，以及在所述回复体中可以产生与野生型相同的CLP蛋白。
实施例6
在本实施例中，确认了通过氮胞苷的处理能将实施例2所得到的pyl-stb种子变为pyl-v突变体。
将pyl-stb种子在0.15、0.3或0.45mM氮胞苷水溶液中、30℃下浸泡24个小时，将其洗涤、发芽并检查pyl-v的表达。表3显示了结果。随着氮胞苷浓度的增加，增加了nDart转座的频率。
实施例7
在本实施例中，用Blast(Basic Local Alignment Search Tool)搜索控制nDart转座的自主元件。
因为推定含有转座酶基因的核苷酸序列在其序列的两末端都具有与nDart相同的序列并在序列内具有转座酶基因，因此搜索具有与nDart(SEQ ID NO：1)的两末端相同序列的序列，并发现了3个序列(SEQ IDNO：6-8)。图8显示了序列。
SEQ ID NO：6的序列具有在它们中间具有最高同源性的末端序列。SEQ ID NO：6的两末端的每个183个碱基对的序列都与SEQ ID NO：1的两末端的序列具有98％以上的同源性，用基因预测程序显示出SEQ IDNO：6序列内的ORF具有转座酶基因。认为SEQ ID NO：6序列是一种自主元件，它与所报告的金鱼草属植物(Antirrhinum)的Tam3转座酶高度同源。
然后，搜索从SEQ ID NO：6序列中预测到的具有与Tam3最高同源性的自主元件。因为，报告Tam3的转座酶基因为没有内含子的结构，从所述的31个核苷酸序列中搜索出没有内含子的转座酶基因，并鉴定出SEQ IDNO：7序列。根据基因预测程序的分析，SEQ ID NO：7序列为没有内含子的结构并在其3’末端含有BED锌指区，这是一种DNA结合区。SEQ ID NO：7序列可能是控制nDart转座的自主元件。
根据作为索引的从SEQ ID NO：7序列中预测到的转座酶基因，搜索出具有不同剪切模式的核苷酸序列并鉴定出SEQ ID NO：8序列。如图8所示，SEQ ID NO：8序列具有同源区1和3，但没有2，预计它具有不同于SEQ ID NO：7的表达模式和功能。
实施例8
将籼稻(Kasarasu)和试验例2中所得到的台中65号(T-65)的pyl-v突变体杂交，并将nDart和自主元件(Dart)转导到Kasarasu内。进行回交3次，理论上预计转化为Kasarasu表型的频率是93.8％。
对于pyl突变体，突变的致病基因是OsClpP基因内插入了nDart-Origin(称作为nDart1-0)。通过BLAST分析，发现日本型水稻(日本晴)具有至少14个nDart，它与nDart1-0具有98％以上的同源性。根据与nDart1-0同源的程度，将nDart命名为nDart1-1到nDart1-12。因为两组nDart(nDart1-3和nDart1-4)具有相同的核苷酸序列，但定位于水稻基因组的不同位点，因为根据括号中所示的染色体号码将其分型。
用PCR扩增籼稻(Kasarasu)和台中65号的pyl-v突变体之间的杂交品系(B3F1)的突变区。在PCR中，将SEQ ID NO：10(F)和11(R)的寡核苷酸用作nDart1-0(3号染色体)的引物，将SEQ ID NO：12(F)和13(R)的寡核苷酸用作nDart1-4(3-1)(3号染色体)的引物，将SEQ IDNO：14(F)和15(R)的寡核苷酸用作nDart1-12(1号染色体)的引物，以及将SEQ ID NO：16(F)和17(R)的寡核苷酸用作nDart200-2(12号染色体)的引物。
图9显示了杂交品系(B3F1，图9，3-12道)的突变区的凝胶电泳的结果。19株个体中的9株具有nDart(SEQ ID NO：1)的转导(图9(1))。因为同时出现了Kasarasu型条带，因此甚至在回交个体中也发生nDart的缺失。所述的nDart定位于3号染色体上。检查了Kasarasu在其他染色体上的转导程度，发现在所有的19株个体中1、3和12号染色体的染色体标记物都变成了Kasarasu型(图9(2)-(4))。从上述的结果中，可以得出结论认为nDart和自主元件(Dart)甚至在籼稻中也能保持它们的活性。
此外，用氮胞苷处理籼稻(93-11)并确认了nDart的释放.在通常的生长条件下，不能观察到nDart的释放，但是在用氮胞苷处理过的93-11中确认出现了nDart的释放.
序列表
<110>独立行政法人 科学技术振兴机构
<120>水稻转座子基因
<130>FS04-411PCT
<160>17
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>607
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>1
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<220>
<223>primer
<400>2
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<213>Artificial Sequence
<220>
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<400>3
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>4
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<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
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<400>5
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<210>6
<211>3591
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>6
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<210>7
<211>3843
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>7
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aggcccaggc ccggcacggc acgccggcct gtgggccgtg ccggcacggc ccgtttaccc 120
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