兔抗鹅IgY+IgY(△Fc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体

摘要

本发明提供的是兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体及其制备方法。本发明辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体是利用盐析、层析等蛋白纯化技术和酶标记技术，在提纯鹅卵黄免疫球蛋白的基础上，免疫家兔制备并纯化兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体，再通过改良过碘酸钠法将其与辣根过氧化物酶结合，并采用盐析及Sephodex G200纯化，从而制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体。应用此酶标记抗体可以建立多种鹅类疫病检测技术，预防鹅类多种传染病。

权利要求

1.兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体，其特征是：(1)它是由辣根过氧化物酶与兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体组成的酶抗体结合物，其可与鹅免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)特异性结合，并可使辣根过氧化物酶的底物显色；(2)它是克分子比在1.0-2.0之间，酶活性＞1000U/mg，ELISA使用浓度＞1∶1000，Weston-Blotting使用浓度＞1∶500的产品。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及的是一种酶抗体结合物及其制备方法，具体地说是辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体。

(二)背景技术

酶免疫检测技术是以酶的反应放大作用和抗原-抗体特异性结合特性为原理、以酶抗体和/或抗原结合物为基础的一种新型检测技术。其包括酶免疫组织化学染色和酶免疫检测技术(包括固和非固相酶免疫检测技术)，前者主要用于组织、细胞的免疫检测，后者主要用于抗原/抗体的检测。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是酶免疫检测技术中发展最快、应用最广泛的一种，其以快速、准确、灵敏的特点逐渐成为一种公认的检测技术。目前，该检测技术已在部分动物疫病检测中使用，但仅有极少数鹅类疾病的检测使用该技术。原因很多，其中缺乏一种高质量、可商品化生产的酶标记抗体是阻碍其发展的主要原因之一。

我国是世界养禽大国，更是世界主要鹅类养殖地和消费国，鹅类养殖业的持续、稳定、健康发展不仅直接关系到我国农村发展、农民增收，而且关系到我国畜牧业的持续稳定发展。而酶标记抗鹅抗体不仅为鹅类疫病的检测搭建物质平台，更为鹅类整体免疫机理的研究提供物质支持，并最终为鹅类养殖业的发展提供技术平台。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体。

本发明的目的是这样实现的：本发明中所使用的缩写分别代表：PBS：磷酸盐缓冲液；PB：磷酸缓冲液；DE52：阴离子交换纤维素；Sephodex G200：葡聚糖G200；IgY：免疫球蛋白Y：IgY(ΔFc)：免疫球蛋白Y(ΔFc)。

本发明的兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体是：

(1)它是由辣根过氧化物酶与兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体组成的酶抗体结合物，其可与鹅免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)特异性结合，并可使辣根过氧化物酶的底物显色；(2)它是克分子比在1.0-2.0之间，酶活性＞1000U/mg(临联茴香氨法)，ELISA使用浓度＞1∶1000，Weston-Blotting使用浓度＞1∶500的产品。

本发明的兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体是采用这样的方法来制备的：

1)纯化鹅卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)

按v/v为卵黄∶PBS(pH7.40.01mol/L)∶氯仿＝1∶2∶3的比例混匀，3000r/min离心30min，取上清，用终浓度(w/v)分别为18％、14％、9％、14％的无水Na2SO4依次盐析，3000r/min离心30min，其中，第三次取上清，其余三次取沉淀，末次沉淀用适量PBS悬浮，4℃PBS透析72h，将透析物2000r/min离心10～15min，以PB(PH7.4，0.01mol/L)为洗脱液，过DE52纤维素柱，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；

2)兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体的制备和纯化

首免，弗氏完全佐剂与鹅卵黄免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v为1∶1的比例混合，2ml/只兔背部皮下多点注射；以后每隔14～28d加强免疫，二免改用弗氏不完全佐剂，剂量方式同上；三免1ml(0.4mg/ml)耳缘静脉注射，心脏采血，37℃，1h，4℃过夜析出并收集血清；10ml血清经50％和33％饱和硫酸铵依次盐析3次，末次沉淀用2～4ml的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解并对其透析除盐，以PB(0.01mol/L，pH7.4)为洗脱液过DE52离子交换层析柱纯化，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；

3)改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体

将N×4mg辣根过氧化物酶溶于N×1ml去离子水，加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L)，20～25℃搅拌20min，于醋酸钠缓冲液(pH4.4，0.001mol/L)4℃透析过夜，加入N×mg纯化的兔抗鹅抗体，立即加入0.2mol/L的碳酸钠缓冲液(pH9.5)调节pH值致9-9.5，20～25℃搅拌2h(注：N为常数)；

4)标记物的纯化

将上述标记物平均分为2份，一份用50％饱和硫酸铵盐析30min，离心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)，并于PBS透析除盐；另一部分以PB(0.02mol/L，pH7.2)透析过夜，并以其为洗脱液过SephodexG200层析柱，1ml/15min，2ml/管，将两部分合并；

5)酶标记抗体的质量鉴定

280nm和403nm测定其OD值，计算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、结合物标记率(A403/A280×100％)酶结合物产率(酶含量×结合物总体积/最初加入酶量)，联茴香胺法测定标记物及的酶学活性，直接ELISA测法定其最佳使用浓度。当酶标记抗体的酶结合物产率在30％-60％之间、克分子比在1.0-2.0之间、酶结合物标记率＞60％，酶活性＞1000U/mg、使用浓度＞1∶1000时符合制备标准。

采用本发明的方法可用于：

①本方法可用于提纯鹅类卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)；

②本方法可用于兔抗鹅辣根过氧化物酶标记坑体的质量鉴定；

采用本发明生产的产品可用于：

①本产品可用于鹅类相关酶免疫组织化学染色。

②本产品可用于鹅类相关的各种匀相和非匀相免疫酶检测技术，主要包括各种ELISA试验、Weston-Blotting、酶免疫沉淀试验等。

本发明的产品优点表现在：应用此酶标记抗体可以建立多种鹅类疫病检测技术，预防鹅类多种传染病。

(四)具体实施方式

1)纯化鹅卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)

按v/v为卵黄∶PBS(pH7.40.01mol/L)∶氯仿＝1∶2∶3的比例混匀，3000r/min离心30min，取上清，用终浓度(w/v)分别为18％、14％、9％、14％的无水Na2SO4依次盐析，3000r/min离心30min，其中，第三次取上清，其余三次取沉淀，末次沉淀用适量PBS悬浮，4℃PBS透析72h，将透析物2000r/min离心10～15min，以PB(PH7.4，0.01mol/L)为洗脱液，过DE 52纤维素柱，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；

2)兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体的制备和纯化

首免，弗氏完全佐剂与鹅卵黄免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v为1∶1的比例混合，2ml/只兔背部皮下多点注射；以后每隔14～28d加强免疫，二免改用弗氏不完全佐剂，剂量方式同上；三免1ml(0.4mg/ml)耳缘静脉注射，心脏采血，37℃，1h，4℃过夜析出并收集血清。10ml血清经50％和33％饱和硫酸铵依次盐析3次，末次沉淀用2～4ml的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解并对其透析除盐，以PB(0.01mol/L，pH7.4)为洗脱液过DE52离子交换层析柱纯化，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；

3)改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体

将N×4mg辣根过氧化物酶溶于N×1ml去离子水，加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L)，20～25℃搅拌20min，于醋酸钠缓冲液(pH4.4，0.001mol/L)4℃透析过夜，加入N×mg纯化的兔抗鹅抗体，立即加入0.2mol/L的碳酸钠缓冲液(pH9.5)调节pH值致9-9.5，20～25℃搅拌2h(注：N为常数)；

4)标记物的纯化

将上述标记物平均分为2份，一份用50％饱和硫酸铵盐析30min，离心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)，并于PBS透析除盐；另一部分以PB(0.02mol/L，pH7.2)透析过夜，并以其为洗脱液过SephodexG200层析柱，1ml/15min，2ml/管，将两部分合并；

5)酶标记抗体的质量鉴定

280nm和403nm测定其OD值，计算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、结合物标记率(A403/A280×100％)酶结合物产率(酶含量×结合物总体积/最初加入酶量)，联茴香胺法测定标记物及的酶学活性，直接ELISA测法定其最佳使用浓度。当酶标记抗体的酶结合物产率在30％-60％之间、克分子比在1.0-2.0之间、酶结合物标记率＞60％，酶活性＞1000U/mg、使用浓度＞1∶1000时符合制备标准。