蛋白酶、编码该蛋白酶的DNA、蛋白酶的制备方法

摘要

本发明提供新型蛋白酶、编码该蛋白酶的DNA、蛋白酶的制备方法。蛋白酶具有以下①和②所示的性质：①分子量为21,000±1,000(SDS-PAGE测定)，②具有将含有以下所示的氨基酸序列(1)的肽或蛋白质在Gly-Phe位点切断，将含有氨基酸序列(2)的肽或蛋白质在Gly-Phe位点切断，将含有氨基酸序列(3)的肽或蛋白质在Ser-Leu位点切断的特异性蛋白酶活性。Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-GlyPro(1)；Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro(2)；Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro(3)。本发明公开了编码该蛋白酶的DNA、含有该DNA的转化体、使用该转化体的蛋白酶的制备方法。

权利要求

1.DNA，该DNA由序列表SEQ ID NO.1碱基序列的1-816位碱基序列或253-816位碱基序列组成。

2.蛋白质，该蛋白质由序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的氨基酸序列组成。

3.DNA，该DNA编码权利要求2的蛋白质的氨基酸序列。

4.重组载体，该重组载体含有权利要求1或3的DNA。

5.转化体，该转化体含有权利要求4的重组载体。

6.蛋白酶的制备方法，该方法是培养权利要求5的转化体，收集具有下述特异性蛋白酶活性的蛋白质：将含有以下所示的氨基酸序列(1)的肽或蛋白质在Gly-Phe位点切断，将含有氨基酸序列(2)的肽或蛋白质在Gly-Phe位点切断，和将含有氨基酸序列(3)的肽或蛋白质在Ser-Leu位点切断，Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro (1)Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro (2)Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro (3)。

说明书

蛋白酶、编码该蛋白酶的DNA、蛋白酶的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及新型蛋白酶、含有编码该蛋白酶的碱基序列的DNA、含有该DNA的重组载体、含有该重组载体的转化体、使用该转化体进行的蛋白酶的制备方法。

背景技术

[0002] 由热变性胶原得到的明胶作为凝胶化剂、发泡剂、增稠剂等，广泛地应用于食品、化妆品中，也可作为药物的胶囊使用。另一方面，胶原是与弹性蛋白一起构成动物的结缔组织的纤维状蛋白质，可以应用在食品、化妆品、药品、涂料、塑料材料等中。

[0003] 明胶与胶原的分子量通常为10万-30万左右，通常消化后的明胶或消化后的胶原的分子量为1万或以下。

[0004] 但是，考虑到如上所述的各种各样的用途，要求它们具有各种所需性质，例如低抗原性、易溶解性、低凝胶化强度、易成膜性、易包合性等，因此，希望分子量具有上述以外的大小。

[0005] 以往，为了分解明胶或胶原，获得更低的分子量，是采用蛋白酶或胶原酶进行分解，已知这些酶可通过培养无色杆菌(Achromo-bactoriophagus)或溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)来获得。

[0006] 但是，已确认这些微生物为病原性，且必须在厌氧条件下进行培养，为了从这些微生物中获取大量的酶，必须进行繁杂的操作。另外，由这些微生物得到的酶将明胶或胶原分解至最小单位(分子量为数百-数千)，无法获得具有适度的分子量的明胶或胶原分解产物。

[0007] 还已知有来自小肠的胶原酶，但价格很高，并且为了获得该胶原酶必须进行繁杂的操作，难以大量制备，难以说使用该方法是有利于工业生产的方法。并且该胶原酶将胶原分解至分子量为数百-数千。

[0008] 因此，本发明人首先为提供可制备适度分子量的明胶或胶原分解产物的酶而进行了各种研究。在自然界中寻求可以将明胶和胶原分解为适度分子量的肽的酶，结果在土壤中发现了一种微生物，该微生物可生产将分子量约为13万的明胶和胶原分解为分子量为约7万和约4万的肽的酶，并已经进行了专利申请(日本特开2000-102381号公报)，[0009] 上述专利公报中记载的蛋白酶具有以下(1)-(5)的性质。

[0010] (1)作用：

[0011] 显示可将分子量约为13万的热变性胶原和分子量约为30万的未变性可溶解胶原分解为分子量约为7万和分子量约为4万的肽的有限分解活性，对胶原酶底物——DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg合成底物显示些许分解活性，对于DNP Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg合成底物不显示分解活性。另外，对azocol和酪蛋白显示分解活性。这里，DNP表示二硝基苯基，D表示Arg为D构型。

[0012] (2)最适pH：

[0013] pH5.5-7

[0014] (3)最适温度：

[0015] 37-40℃

[0016] (4)分子量

[0017] 23,000±2,000(SDS-PAGE测定)

[0018] (5)酶抑制

[0019] 邻菲咯啉、L-半胱氨酸抑制活性，乙二胺四乙酸、N-乙基马来酰亚胺、苯基甲磺酰基氟化物、碘乙酰胺对其活性少有抑制。

[0020] 可通过培养属于微杆菌属(Microbacterium)的蛋白酶生产菌，从其培养物中收集，来制备上述蛋白酶。上述专利公报中记载的是：上述蛋白酶的制备是培养属于金杆菌属(Aureobacterium)的蛋白酶生产菌，通过从其培养物中收集来制备。在后述的研究中，金杆菌属统归于微杆菌属。

[0021] 本发明人进一步研究，结果发现：上述培养物中含有除上述蛋白酶以外的新的蛋白酶，该蛋白酶是具有与上述专利公报中记载的蛋白酶不同的氨基酸序列酶切断特异性的蛋白酶，是可以将明胶和胶原分解为大片段的酶，并分析了其氨基酸序列和碱基序列，从而完成了本发明。

发明内容

[0022] 本发明如下：

[0023] (1)具有以下①和②所示的性质的蛋白酶：

[0024] ①分子量为21,000±1,000(SDS-PAGE测定)

[0025] ②具有将含有以下所示的氨基酸序列(1)的肽或蛋白质在Gly-Phe位点切断，将含有氨基酸序列(2)的肽或蛋白质在Gly-Phe位点切断，将含有氨基酸序列(3)的肽或蛋白质在Ser-Leu位点切断的特异性蛋白酶活性。

[0026] Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro (1)

[0027] Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro (2)

[0028] Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro (3)

[0029] (2)具有序列表SEQ ID NO.1碱基序列的1-816位碱基序列或253-816位碱基序列的DNA。

[0030] (3)在严谨条件下与含有以下碱基序列的DNA杂交且编码具有(1)的②所示的特异性蛋白酶活性的蛋白质的DNA，上述“以下碱基序列”为与具有序列表SEQ ID NO.1碱基序列的1-816位碱基序列或253-816位碱基序列的DNA互补的碱基序列。

[0031] (4)含有以下碱基序列，且编码具有(1)的特异性蛋白酶活性的蛋白质的DNA，上述“以下碱基序列”为在序列表SEQ ID NO.1碱基序列的1-816位碱基序列或253-816位碱基序列中，具有1至数个碱基缺失、置换和/或附加的碱基序列。

[0032] (5)具有序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的氨基酸序列的蛋白质。

[0033] (6)含有以下氨基酸序列且具有(1)的特异性蛋白酶活性的蛋白质，上述“以下氨基酸序列”为在序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的氨基酸序列中，具有1至数个氨基酸缺失、置换和/或附加的氨基酸序列。

[0034] (7)具有以下氨基酸序列且具有(1)的特异性蛋白酶活性的蛋白质，上述“以下氨基酸序列”为与序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的氨基酸序列具有70％或以上的同源性的氨基酸序列。

[0035] (8)编码(5)-(7)中任一项蛋白质氨基酸序列的DNA。

[0036] (9)含有(2)-(4)和(8)的DNA的重组载体。

[0037] (10)含有(9)的重组载体的转化体。

[0038] (11)蛋白酶的制备方法，该方法是培养(10)的转化体，收集具有(1)的特异性蛋白酶活性的蛋白质。

[0039] 附图简述

[0040] 图1是本发明的蛋白质(蛋白酶)的SDS-PAGE电泳结果。

[0041] 实施发明的最适方式

[0042] [蛋白酶]

[0043] 本发明的蛋白酶具有以下①和②所示的性质。

[0044] ①分子量为21,000±1,000(SDS-PAGE测定)

[0045] ②具有将含有以下所示的氨基酸序列(1)的肽或蛋白质在Gly-Phe位点切断，将含有氨基酸序列(2)的肽或蛋白质在Gly-Phe位点切断，将含有氨基酸序列(3)的肽或蛋白质在Ser-Leu位点切断的特异性蛋白酶活性。

[0046] Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro (1)

[0047] Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro (2)

[0048] Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro (3)

[0049] 本发明的蛋白酶具有将含有上述(1)-(3)所示的任意氨基酸序列的肽和蛋白质在上述位点切断的特异性蛋白酶活性，本发明中，蛋白酶是指具有上述切断活性(特异性蛋白酶活性)的酶。本发明的蛋白酶也可以对含有任意2个或以上上述(1)-(3)所示的氨基酸序列的肽和蛋白质的上述各位点均切断。

[0050] 以下对本发明的蛋白酶的制备方法进行说明。

[0051] 将金杆菌变种(Aureobacterium sp.)MIM-CG-9535-I(FERM P-15326)接种于培养基上，按照常规方法进行培养，通过从所得培养物中收集所述蛋白酶来获得。由培养物中收集所述蛋白酶时，是根据本发明的蛋白酶的特异性蛋白酶活性、即上述②所示的氨基酸位点的切断活性进行的。关于这一点在后面有阐述。

[0052] 上述菌体培养中所使用的培养基可以使用通常的微生物培养基，只要是该菌体可生长繁殖的培养基即可，没有特别限定，优选该培养基中适量含有可利用的氮源、碳源、无机盐类。

[0053] 对氮源、碳源、无机盐类没有特别限定，例如氮源有肉膏、酵母提取物、蛋白胨，碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油，无机盐类有磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸铁、硫酸锌等。

[0054] 培养基的pH优选为6-7左右，优选在培养温度28-30℃下振荡培养20-48小时。

[0055] 从培养物中收集和纯化目标物质蛋白酶，这可以基于本发明的蛋白酶的特异性蛋白酶活性、即在上述②所示的氨基酸位点的切断活性进行。

[0056] 具体来说，通过将培养物离心或过滤来分离菌体，通过常规分离方法例如硫酸铵沉淀法、超滤膜浓缩后进行柱层析等进行纯化。纯化时，只回收具有上述②所示的氨基酸位点的切断活性的级分。

[0057] 上述专利公报中，在纯化蛋白酶时，回收了具有azocol活性的级分(0028段)。酶活检测中也应用了azocol活性。

[0058] 本发明人的研究结果显示：具有azocol活性的级分和具有上述②所示的氨基酸位点切断活性的级分部分重复。本发明的蛋白酶的制备中，要回收的具有上述②所示的氨基酸位点切断活性的级分也具有azocol活性。但是，具有azocol活性的级分则包括具上述②所示的氨基酸位点切断活性的级分和不具有上述切断活性的级分，上述专利公报中记载的蛋白酶是从几乎全部的具有azocol活性的级分中回收的蛋白质。

[0059] 由图1所示的蛋白质的SDS-PAGE电泳结果可知：本发明的蛋白质含有分子量为21,000±1,000的单一成分。而上述专利公报的图6中，SDS-PAGE电泳结果所表示的蛋白质分解酶的分子量为23,000±2,000，两者明显是不同的物质。由此可推测上述专利公报所记载的蛋白质分解酶是包含本发明的蛋白酶的多种蛋白质的混合物。如下所示，上述专利公报所记载的蛋白质分解酶与本发明的蛋白酶的底物特异性完全不同。因此可认为，上述专利公报所记载的蛋白质分解酶中即使含有本发明的蛋白酶，也是极少量的，实质上其特性并未被检测到。

[0060] 上述②所示的氨基酸位点切断活性(特异性蛋白酶活性)可通过以下的方法测定。

[0061] 可通过常规方法合成具有以下(1)-(3)所示氨基酸序列的荧光标记的肽。具体来说，在具有下述任意的氨基酸序列的肽的切断位点的一侧标记荧光物质，在另一侧标记消光物质。该标记的肽一被切断，即可观测到荧光，应用对下述氨基酸序列不具有切断活性的酶的底物，未观测到荧光。用于标记肽的物质只要是荧光物质和消光物质即可，没有特别限定，荧光物质例如可使用N-甲基邻氨基苯甲酸，消光物质例如可使用二硝基苯基。

[0062] Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro (1)

[0063] Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro (2)

[0064] Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro (3)

[0065] 本发明中，特异性蛋白酶活性如下测定：以在具有上述(1)-(3)所示任意氨基酸序列的肽的一端标记N-甲基邻氨基苯甲酸，在另一端标记二硝基苯基的任意荧光标记合成肽作为底物，在遮光下与规定量的酶温育规定时间，然后通过反相HPLC分离产物，测定分离物的荧光强度，检测切断活性。

[0066] 作为参考，也可以同样测定可被上述专利公报(日本特开2000-102381号公报)记载的酶分解的底物——Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln的分解活性。

[0067] 本发明的酶(蛋白酶)和上述专利公报所记载的酶的切断活性汇总在表1中。

[0068] 表1蛋白酶的切断活性(合成底物的分解)

[0069]合成底物的氨基酸序列 本发明的酶 专利公报的酶
Gly-Pro-Ala-Gly-↓-Phe-Ala-Gly-Pro (○)可分解 (×)不可分解
Gly-Pro-Gln-Gly-↓-Phe-Gln-Gly-Pro (○)可分解 (×)不可分解
Gln-Thr-Gln-Ser-↓-Leu-Val-Tyr-Pro (○)可分解 (×)不可分解
Pro-Gln-Gly-↓-Ile-Ala-Gly-Gln (×)不可分解 (○)可分解

[0070] 注意：↓表示切断位置。

[0071] 本发明的上述特异性蛋白酶活性的表达需要作为底物的肽或蛋白质含有上述(1)-(3)所示氨基酸序列的全部，即使缺失上述氨基酸序列的一部分，上述特异性蛋白酶活性也不能表达。不过，只要含有上述(1)-(3)所示氨基酸序列的全部，即使还含有追加的氨基酸，上述特异性蛋白酶活性也可表达。另外，上述(1)和(2)所示的氨基酸序列所对应的上述合成底物在其N末端含有Gly，但不管是否含有Gly，上述特异性蛋白酶活性均表达。

[0072] 使用改变了肽链的序列改变的荧光标记合成肽，利用通过改变(1)的氨基酸序列中的肽链序列所获得的荧光标记合成肽进行检测，以确定表现特异性蛋白酶活性表达所必须的氨基酸序列，结果如下表所示。由该表的结果可知：特异性蛋白酶的活性表达必须是含有上述(1)所示的氨基酸序列的全部。表2中，氨基酸以一个字母表示。

[0073] 表2 蛋白酶的切断活性(合成底物的分解)

[0074]肽链 特异性分解活性的有物
GPAG FAGP 有
GPAG FAG 无
GPAG FA 无
GPAG F 无
PAG FAGP 有
AG FAGP 无
G FAGP 无

[0075] 本发明的蛋白酶除具有上述②所示的特异性蛋白酶活性以外，还具有以下特性。

[0076] (1)最适pH5.5-7.0

[0077] (2)最适温度37-40℃

[0078] (3)酶抑制如下表3所示.

[0079] 表3

[0080]抑制剂名称 浓度mM 残留活性(％)
无添加 0 100
邻菲咯啉 2 0
EDTA 10 93
EGTA 10 68
L-Cys 20 0
2-ME 20 73
N-乙基马来酰亚胺 20 79
抗蛋白酶 0.05 94
亮抑酶肽 0.05 92
E-64 0.05 95
膦酰二肽 0.05 91
胰蛋白酶抑制剂 0.05 95
胰凝乳蛋白酶抑制剂 0.05 85
TCPK 0.1 95

[0081]PMSF 20 84
碘乙酰胺 20 77

[0082] 本发明包含具有SEQ ID NO.1碱基序列的1-816位碱基序列、或253-816位碱基序列的DNA。具有SEQ ID NO.1碱基序列的1-816位碱基序列的DNA是编码前原体的DNA，而具有SEQ ID NO.1碱基序列的253-816位碱基序列的DNA是编码成熟体的DNA。

[0083] 本发明还包含在严谨条件下与含有以下碱基序列的DNA杂交且编码具有上述②所示的特异性蛋白酶活性的蛋白质的DNA，上述“以下碱基序列”为与具有序列表SEQ ID NO.1碱基序列的1-816位碱基序列或253-816位碱基序列的DNA互补的碱基序列。

[0084] 上述“在严谨条件下杂交”是指使用DNA作为探针，通过使用集落杂交法、噬菌斑杂交法或DNA印迹杂交法等而获得的DNA碱基序列，例如可以是在0.7-1.0M NaCl存在下，使用用于固定来自集落或噬菌斑的DNA或该DNA片段的滤膜，在65℃进行杂交，然后通过使用0.1-2×SSC溶液(2×SSC溶液未150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65℃的条件下通过洗涤滤膜而鉴定出DNA等。杂交可以按照分子克隆第2版等中记载的方法进行。

[0085] 在严谨条件下进行杂交的DNA有：与作为探针的DNA的碱基序列具有一定或以上的同源性的DNA，例如具有70％或以上、优选80％或以上、更优选90％或以上、进一步优选93％或以上、特别优选95％或以上、最有选98％或以上的同源性的DNA。

[0086] 蛋白质具有上述②所示的特异性蛋白酶活性，这可以如上所述，使用荧光标记合成肽进行测定。

[0087] 本发明还包含含有以下碱基序列且编码具有上述②所示的特异性蛋白酶活性的蛋白质的DNA，上述“以下碱基序列”为在序列表SEQID NO.1碱基序列的1-816位碱基序列或253-816位碱基序列中具有1至数个碱基缺失、置换和/或附加的碱基序列。

[0088] 蛋白质具有上述②所示的特异性蛋白酶活性，这可以与上述同样地进行测定。

[0089] 本说明书中所述“具有1至数个碱基缺失、置换和/或附加的碱基序列”中的“1至数个”的范围没有特别限定，例如指1-40个、优选1-30个、更优选1-20个、进一步优选1-10个、更进一步优选1-5个、特别优选1-3个的程度。

[0090] 本发明的DNA的获得方法没有特别限定。可以是：根据本说明书中序列表SEQ ID NO.1碱基序列的信息制备适当的探针或引物，使用它们，对各种微生物、特别是对属于微杆菌属的蛋白酶生产菌的cDNA文库进行筛选，由此可以分离本发明的DNA。如上所述，金杆菌属被统归于微杆菌属，因此通过对属于金杆菌属的蛋白酶生产菌的cDNA文库进行筛选，也可以分离本发明的DNA。cDNA文库可通过常规方法，从表达本发明的DNA的细胞中制备。

[0091] 也可通过PCR法获得本发明的DNA。使用上述蛋白酶生产菌的染色体DNA文库或cDNA文库作为模板，使用设计为可扩增SEQ IDNO.1碱基序列的一对引物进行PCR。PCR的反应条件可适当设定，例如有：以含有94℃30秒(变性)、55℃30秒-1分钟(退火)、72℃2分钟(伸长)的反应步骤作为一个循环，例如进行30个循环后，在72℃反应7分钟的条件等。接着，将扩增的DNA片段克隆到可在大肠杆菌等宿主中扩增的适当的载体中。

[0092] 上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目标基因的克隆等操作是本领域技术人员已知的，例如可以按照Molecular Cloning：A laboratory ndMannual，2 Ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989(以下简称为分子克隆第2版)、Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，JohnWiley & Songs(1987-1997)(以下简称为Current Protocols in MolecularBiology)等记载的方法进行。

[0093] 本发明包含具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3氨基酸序列的蛋白质。具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的蛋白质是氨基酸数为272的蛋白质，是包合成熟体(85-27)的前体。而具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的蛋白质(氨基酸数为188)是成熟体蛋白质。

[0094] 本发明还包含含有以下氨基酸序列且具有上述②所示的特异性蛋白酶活性的蛋白质，上述“以下氨基酸序列”是在SEQ ID NO.2或SEQID NO.3氨基酸序列中，具有1至数个氨基酸缺失、置换和/或附加的氨基酸序列。

[0095] 蛋白质具有上述②所示的特异性蛋白酶活性，这可与上述同样地测定。

[0096] 本说明书中所述“具有1至数个氨基酸缺失、置换和/或附加的氨基酸序列”中的“1至数个”的范围没有特别限定。例如指1-20个、优选1-10个、更优选1-7个、进一步优选1-5个、特别优选1-3个的程度。

[0097] 本发明包含具有与序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3氨基酸序列具有70％或以上的同源性的氨基酸序列，且具有上述②所示的特异性蛋白酶活性的蛋白质。

[0098] 本说明书中所述“与序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3氨基酸序列具有70％或以上的同源性的氨基酸序列”中的同源性只要是70％或以上即可，没有特别限定，例如优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、特别优选95％或以上。

[0099] 对本发明的蛋白质的获得方法没有特别限定，可以是通过化学合成的蛋白质，也可以是通过基因重组技术制备的重组蛋白质。

[0100] 制备重组蛋白质时，首先要获得编码本说明书上述该蛋白质的基因(DNA)。通过将该DNA导入适当的表达系中，可以生产本发明的蛋白质。表达系中蛋白质的表达在后面的本说明书中有述。

[0101] 本发明还包含编码上述蛋白质氨基酸序列的DNA。该DNA可基于序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3氨基酸序列和碱基序列的信息，通过化学合成、基因工程方法或诱变等本领域技术人员已知的任意的方法来制备。

[0102] 例如，可采用使作为诱变源的试剂与具有序列表SEQ ID NO.1碱基序列的DNA接触的方法、照射紫外线的方法、基因工程方法等进行。基因工程方法之一的定点诱变法是将特定的变异导入特定的位置的方法，因而有效，诱变可以按照分子克隆第2版、Current Protocols inMolecular Biology记载的方法进行。

[0103] 本发明包含含有上述本发明的DNA的重组载体。

[0104] 本发明的DNA可以插入适当的载体中使用。本发明中使用的载体的种类没有特别限定，例如可以是自主复制的载体(例如质粒等)，或者在导入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，与被整合的染色体一起复制的载体。

[0105] 优选本发明中使用的载体是表达载体。表达载体中，本发明的基因与转录所必需的要素(例如启动子等)功能性连接。启动子是宿主细胞中显示表达活性的DNA序列，可以根据宿主的种类适当选择。

[0106] 细菌细胞中可起作用的启动子有：嗜热脂肪芽胞杆菌麦芽糖淀粉酶基因(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(Bacillus licheniformis a-amylase gene)、解淀粉芽孢杆菌BAN淀粉酶基因(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(Bacillus Subtilis alkaline protease gene)或短小芽孢杆菌木糖苷酶基因(Bacillus pumilus xylosldase gene)的启动子或λ-噬菌体的Pr或PL启动子、大肠杆菌的lac、trp或tac启动子等。

[0107] 根据需要，本发明的基因可以与适当的终止子功能性连接。本发明的重组载体还可以具有聚酰苷酸化信号(例如来自SV40或腺病毒5E1b区)、转录增强子(例如SV40增强子)等要素。

[0108] 本发明的重组载体还可具备可使该载体在宿主细胞内复制的DNA序列，其一个例子是：SV40复制起点(宿主细胞为哺乳类细胞时)。

[0109] 本发明的重组载体还可以含有选择性标志。选择性标志的例子有：象二氢叶酸还原酶(DHFR)或裂殖酵母TPI基因等那样的其补体在宿主细胞上缺失的基因、或者例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、泛酸氯霉素、新霉素或潮霉素等的抗药基因。本发明的基因、启动子、以及根据需要的终止子和/或分泌信号分别连接，将它们插入适当的载体中的方法是本领域技术人员公知的。

[0110] 构成本发明的重组载体的载体只要是在宿主内可表达的载体即可，没有特别限制，可根据与宿主的关系适当决定。

[0111] 本发明包含含上述本发明的重组载体的转化体。

[0112] 通过将本发明的DNA或重组载体导入适当的宿主中，可以制备转化体。

[0113] 导入本发明的基因或重组载体的宿主细胞只要可以表达本发明的基因即可，可以是任意的细胞，有细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。

[0114] 对构成本发明的转化体的宿主没有特别限制，细菌细胞的例子有杆菌或链球菌等革兰氏阳性菌或大肠杆菌等革兰氏阴性菌。这些细菌的转化可以采用原生质体法或公知的方法，通过使用感受态细胞来进行。

[0115] 从可高效地生产本发明的蛋白质(蛋白酶)的观点看，构成本发明的转化体的宿主优选为属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的微生物。属于短芽孢杆菌属的微生物有：短芽孢杆菌(B.brevis)、桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)、美丽短芽孢杆菌(B.formosus)、副短芽孢杆菌(B.parabrevis)、罗伊兹氏短芽孢杆菌(B.reuszeri)、田野短芽孢杆菌(B.agri)、中孢短芽孢杆菌(B.centrosporus)、波茨坦短芽孢杆菌(B.borstelensis)、侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)、热红短芽孢杆菌(B.thermoruber)等。

[0116] 除细菌细胞之外，还有酵母细胞。酵母细胞的例子有属于酵母或者裂殖酵母的细胞，例如有酿酒酵母(Saccharomyces cerevislae)或克鲁氏酵母(Saccharomyces kluyveri)等。重组载体导入酵母宿主的方法例如有电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法等。

[0117] 其它真菌细胞的例子有丝状菌，例如是属于曲霉属、链孢霉、镰刀菌或木霉菌的细胞。使用丝状菌作为宿主细胞时，可以通过将DNA构建物整合到宿主染色体中得到重组宿主细胞而进行转化。DNA构建物向宿主染色体的整合可以按照公知的方法、例如同源重组或非同源重组进行。

[0118] 本发明包含蛋白酶的制备方法，该方法是培养上述本发明的转化体，收集具有上述②所示的特异性蛋白酶活性的蛋白质。

[0119] 本发明的转化体的培养可以根据宿主的种类适当确定。

[0120] 转化体的培养所使用的培养基可使用通常微生物的培养基，只要该转化体是可生长繁殖的即可，对此没有特别限定，该培养基中优选含有适量的可利用的氮源、碳源、无机盐类。

[0121] 对氮源、碳源、无机盐类没有特别限定，例如氮源有肉膏、酵母提取物、蛋白胨，碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油，无机盐类有磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸铁、硫酸锌等。

[0122] 培养基的pH和培养基温度可根据宿主的种类决定，当宿主为属于杆菌的微生物时，可以使pH为7.5-10、培养温度为约30℃。

[0123] 培养时间也可适当确定，例如可以振荡培养20-48小时。

[0124] 本发明的蛋白质以溶解状态在细胞内表达时，可以在培养结束后，通过离心回收细胞，悬浮于水系缓冲液中，然后通过超声波破碎机破碎细胞，得到无细胞提取液。通过常规蛋白质的分离纯化方法、即，将溶剂提取法、硫酸铵等的盐析法、除盐法、有机溶剂沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)琼脂糖等树脂的阴离子交换层析法、使用S-SepharoseFF(Pharmacia公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖或苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和柱层析法、层析聚焦法、等电位电泳等电泳法等方法单独或组合使用，可以从通过离心该无细胞提取液而得到上清中得到纯化标准品。

[0125] 从培养物中收集和纯化目标物质蛋白酶，这可以根据本发明的蛋白酶的特异性活性、即上述②所示的氨基酸位点的切断活性来进行。切断活性的测定与上述本发明的蛋白酶制备方法中的说明相同。

[0126] 实施例

[0127] 以下，通过实施例进一步详细说明本发明。

[0128] 实施例1

[0129] 本发明的蛋白酶的制备

[0130] 将金杆菌变种MIM-CG-9535-I(FERM P-15326)在繁殖培养基(表4)中、在28℃有氧培养16-24小时。培养后，通过离心分离菌体，得到培养液，向其中加入硫酸铵，将55％饱和沉淀组分进行离心，并收集。将该沉淀溶解于20mM Tris盐酸(pH 7.5)、8mM氯化钙、0.1M硫酸铵缓冲液中，制备该缓冲液的0.8M硫酸铵浓度，然后离心，得到上清。

[0131] 表4

[0132]培养基成分 混合量
聚胨 5g
酵母提取物 5g
氯化钠 10g
葡萄糖 10g
Na2HPO4 7.04g
K2HPO4 4.14g
Hunter无机盐溶液 40mL
水 1L

[0133] PH6.8

[0134] 通过以下纯化方法纯化上述上清。

[0135] 纯化方法(硫酸铵纯化)

[0136] 缓冲液A：20mM Tris-HCl(pH 7.4)、1mM CaCl2、0.9M AmSO4

[0137] 缓冲液B：20mM Tris-HCl(pH 7.4)、1mM CaCl2、0.1M AmSO4

[0138] i)将-20℃冷冻保存的培养浓缩液进行融解。

[0139] ii)制作离子层析柱(Butyl-TOYOPEARL)，用缓冲液A平衡。

[0140] iii)加入AmSO4，使融解的培养液与缓冲液A相同电导率，充分搅拌，制备为pH7.4，离心，得到上清。

[0141] iv)将上清过柱，结束后洗涤。

[0142] v)洗涤后，使用缓冲液A和缓冲液B进行洗脱，测定得到的级分的活性和蛋白质量，再进行各级分的电泳。确定混合组分。

[0143] vi)通过分子量为1万的膜浓缩混合组分，然后进行透析。

[0144] vii)溶解于5mM MES(pH 5.5)、150mM NaCl2、5mM CaCl2，结束纯化。

[0145] 分子量的测定

[0146] 分子量的测定如下进行。

[0147] 将经SDS和2-巯基乙醇(还原剂)处理的组分进行电泳，由分子量标志和样品的泳动距离计算上述纯化的酶的分子量。结果如图1所示。

[0148] 切断活性(特异性蛋白酶活性)的测定

[0149] 切断活性(特异性蛋白酶活性)的测定如下进行。

[0150] 通过常规方法，使用肽合成仪，合成具有以下(1)-(3)所示的氨基酸序列、一端标记N-甲基邻氨基苯甲酸，另一端标记二硝基苯基的Nma/Dnp型荧光标记肽(激发波长340nm、荧光波长440nm)。

[0151] Nma-Gly-Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-(DNP)r-NH2 (1)

[0152] Nma-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Pro-Lys-(DNP)r-NH2 (2)

[0153] Nma-Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Thr-Pro-Lys-(DNP)r-NH2 (3)

[0154] Nma：N-甲基邻氨基苯甲酸

[0155] DNP：二硝基苯基

[0156] 以所得任意的荧光标记合成肽作为底物，在以下的条件下进行切断活性的测定。

[0157] 将100μg荧光标记合成肽用10mMTris缓冲液调节至0.2mg/mL，添加1μg上述本发明的蛋白酶，在遮光下、37℃温育10分钟。通过使用TSK凝胶ODS 80T(东ソ一)的反相HPLC，通过0.1％TFA至乙腈-0.1％TFA、流速1mL/分钟，对所得酶反应溶液进行40分钟的梯度分离，分离分解肽。使用A215和岛津公司制造的高效液相色谱用分光荧光检测器，检测激发波长340nm、荧光波长440nm的荧光强度。

[0158] 结果如上述表1所示。

[0159] 为了比较，在同样条件下测定上述专利公报(日本特开2000-102381号公报)中的酶的切断活性。结果如上述表1所示。

[0160] 对于上述专利公报中记载的酶显示切断活性的Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln，与上述同样地，制得荧光标记合成肽，与上述同样地，对本发明的酶和上述专利公报所记载酶测定切断活性。结果如上述表1所示。

[0161] 对于(1)所示的氨基酸序列，改变肽链的构成，与上述同样地合成荧光标记合成肽，与上述同样的进行切断活性的测定，验证上述特异性分解活性所必需的氨基酸。结果如上述表2所示。

[0162] 对上述得到的本发明的酶(蛋白酶)如下测定以下特性。

[0163] (1)酶的温度稳定性和最适温度

[0164] i)温度稳定性

[0165] 在0-60℃的各温度下将酶放置1小时，然后在37℃下与合成底物反应30分钟，然后测定酶活性。

[0166] ii)最适温度

[0167] 在0-60℃的各温度下将合成底物溶液与酶液反应30分钟，然后测定酶活性。

[0168] (2)酶的pH稳定性和最适pH

[0169] i)pH稳定性

[0170] 以pH 0.5为一个刻度制备缓冲液，在pH3.0-5.0范围时，用乙酸-乙酸钠缓冲液、在pH5.0-9.0时用MES-HEPES-硼酸缓冲液。向各缓冲液中添加酶，一边缓慢搅拌一边冰冷却1小时。然后加入合成底物溶液，测定残余酶活性。

[0171] ii)最适pH

[0172] 用上述各缓冲液制备合成底物溶液，添加酶液，测定酶活性。

[0173] (3)酶抑制的影响

[0174] 作为抑制剂使用的试剂为邻菲咯啉、EDTA、EGTA、L-半胱氨酸、2-巯基乙醇、N-乙基马来酰亚胺、抗蛋白酶、亮抑酶肽、E-64、膦酰二肽、胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、TCPK、PMSF、碘乙酰胺。将各试剂与合成底物混合，向其中添加酶。37℃下进行30分钟分解反应，测定酶活性。以未添加抑制剂时为100％，计算相对残余酶活性。

[0175] 上述测定结果如下。

[0176] (1)温度稳定性

[0177] 酶本身不耐热，在40℃或以上几乎失活，在30℃也只有一半的残余活性。

[0178] 最适温度37-40℃

[0179] (2)pH稳定性在pH 3-9这样的宽范围内稳定。

[0180] 最适pH5.5-7.0

[0181] (3)酶抑制如上述表3所示。

[0182] 对由上述得到的本发明的酶(蛋白酶)进行DNA序列确定和氨基酸序列的确定。

[0183] DNA序列确定法

[0184] 碱基序列的确定使用正向/反向引物，通过DYEnamicTMETTerminator Sequencing Kit(Amarsham)进行测序PCR。使用DNASYS软件和Genetyx-Mac-10.0进行序列分析。结果如序列表SEQ ID NO.1所示。

[0185] 氨基酸序列确定法

[0186] 通过气相蛋白测序仪对N末端氨基酸序列进行分析，同样地对蛋白酶分解物的内部氨基酸序列进行分析。以所得序列为基础，制备寡核苷酸引物，通过PCR进行扩增。结果如序列表SEQ ID NO.2和3所示。