一种可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶及其制备方法

摘要

本发明公开一种可注射型pH敏感性壳聚糖季铵盐水凝胶及其制备方法，属于医药工程的药物制剂领域。该方法采用壳聚糖季铵盐与甘油磷酸盐制备出具有pH敏感性的可注射型水凝胶。其制备步骤为：(1)将壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵在反应温度下反应一段时间后，以丙酮沉淀、洗涤，经烘干得到壳聚糖季铵盐；(2)将制备的壳聚糖季铵盐溶解于酸性溶液中；(3)将甘油磷酸盐溶液逐滴加入壳聚糖季铵盐酸溶液中，搅拌得到均匀清澈的混合溶液；(4)升高温度到胶凝温度，并恒温一段时间，得到均匀透明的壳聚糖季铵盐水凝胶。该水凝胶可在体温下发生胶凝，并响应体内pH值变化发生溶胀、溶解并实现所包埋药物的智能释放。

权利要求

1.一种可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶，所述壳聚糖季铵盐水凝胶在温度低于

30℃、pH在6.8-8.0之间为溶液，在温度30-60℃、pH在6.8-8.0之间形成水凝胶，其通过如下方法制备：(1)将摩尔比为1∶2-1∶10的壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵在60-90℃间反应一段时间后，以丙酮沉淀、洗涤，经烘干得到季铵基团取代度为20％-100％的壳聚糖季铵盐；

(2)将步骤(1)中所述的壳聚糖季铵盐溶解于pH2.0-6.0的酸性溶液中得到

1.0-10.0wt％的壳聚糖季铵盐溶液；

(3)在1-10℃之间将1.0-20.0wt％的甘油磷酸盐溶液逐滴加入步骤(2)中所述的壳聚糖季铵盐溶液中，搅拌得到pH在6.5-8.0之间的均匀清澈混合溶液；

(4)升高温度到胶凝温度，并恒温一段时间，得到均匀透明的壳聚糖季铵盐水凝胶。

2.权利要求1所述水凝胶，可响应于pH变化发生溶胀、溶解。

3.权利要求1所述水凝胶的制备方法，步骤如下：

(1)将摩尔比为1∶2-1∶10的壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵在60-90℃间反应一段时间后，以丙酮沉淀、洗涤，经烘干得到季铵基团取代度为20％-100％的壳聚糖季铵盐；

(2)将步骤(1)中所述的壳聚糖季铵盐溶解于pH2.0-6.0的酸性溶液中得到

1.0-10.0wt％的壳聚糖季铵盐溶液；

(3)在1-10℃之间将1.0-20.0wt％的甘油磷酸盐溶液逐滴加入步骤(2)中所述的壳聚糖季铵盐溶液中，搅拌得到pH在6.5-8.0之间的均匀清澈混合溶液；

(4)升高温度到胶凝温度，并恒温一段时间，得到均匀透明的壳聚糖季铵盐水凝胶。

4.权利要求3所述制备方法，在步骤(3)中加入固体微粒、水溶性添加物、药物、多肽、蛋白质、酶、细胞、抗体等到所制的混合溶液中。

5.权利要求3所述制备方法，步骤(4)中包括以下步骤：(4a)将混合溶液倒入容器、模型或注射入动物或人组织、器官、身体空腔内，使溶液胶凝为所需形状。

6.权利要求3所述制备方法，步骤(1)中所述壳聚糖分子量范围为5-200万，脱乙酰度为65％-100％。

7.权利要求3所述制备方法，步骤(1)中所述壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的摩尔比范围为1∶4-1∶6。

8.权利要求3所述制备方法，步骤(1)中所述反应时间为1-24h。

9.权利要求3所述制备方法，步骤(2)中所述酸性溶液包括醋酸、盐酸、乳酸、柠檬酸、抗坏血酸、蚁酸。

10.权利要求3所述制备方法，步骤(4)中所述胶凝温度范围为30-60℃。

11.权利要求3所述制备方法，步骤(1)中所述反应时间为6-12h。

12.权利要求3所述制备方法，步骤(4)中所述胶凝温度范围为36-38℃。

说明书

一种可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶及其制备方法，属于医药工程的药物制剂领域。

背景技术

[0002] 壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基的产物，是由β(1→4)键合的D-葡糖胺残基和数目不同、分布无规的N-乙酰葡糖胺组成的线性多糖。壳聚糖由于分子链上具有游离氨基可以溶于稀酸溶液，因此比甲壳素具有更为广泛的用途。作为一种天然阳离子生物高聚物，壳聚糖具有来源广泛、无毒、无味、抗血栓、抗静电、耐碱、成膜性、生物黏附性、生物相容性和生物降解性，而且其降解产物无毒、无免疫原性、无致癌性。这些特性使壳聚糖成为应用前[1]景广阔的生物医药载体 。以碘甲烷或缩水甘油三甲基氯化铵等试剂与壳聚糖反应可得到壳聚糖季铵盐。壳聚糖季铵盐与壳聚糖相比，具有更好的水溶性、亲水性及阳离子性，因此在应用上壳聚糖季铵盐具有更高的吸湿保湿性、抑菌性、金属离子螯合性、絮凝性等，多用[2][3][4]
于化妆品、水处理等领域 。近来人们开始将壳聚糖季铵盐用于医药领域。如将壳聚[5]
糖季铵盐与壳聚糖复合成膜，在表面键合肝素，作为一种新型抗凝血材料 。将以缩水甘油三甲基氯化铵与壳聚糖反应所制得的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氨化铵壳聚糖纳米微粒用作蛋白质载体，结果表明该载药体系对于BSA模型蛋白可以得到较高的包埋率(90％)，[6]
并可实现BSA的缓慢释放 。

[0003] 壳聚糖及其衍生物常以水凝胶形式应用于生物医药领域。水凝胶具有亲水性好、组织相容性好、能有效保持所包埋蛋白质、多肽等活性生物物质活性的特点，因而广泛用于[7]药物载体、生物分离、细胞培养等领域 。尤其是智能水凝胶，因为其可以响应于环境刺激(如温度、pH值、电场等)而发生性质的改变，如体积溶胀度变化或相转变，从而实现对刺激的响应性，因此近年来智能水凝胶作为药物载体、分离介质、细胞培养基质、组织工程材[8]
料得到了广泛的研究 。利用壳聚糖本身的阳离子性质，或对其高分子链上的羟基、氨基修饰，可制备具有不同pH敏感响应性的水凝胶。Makarand等将聚乙烯吡咯烷酮与壳聚糖混合冻干制备水凝胶用于抗生素的释放，结果表明该水凝胶为半互穿网络结构，并表现出pH敏感溶胀性质，即在酸性环境中溶胀，在碱性环境中收缩。该体系可以作为抗生素在酸性环境[9]
中释放的载体 。Chen等对壳聚糖进行修饰，得到了N，O-羧甲基化壳聚糖，并以京尼平将其与海藻酸钠交联，制备了在中性环境中溶胀、酸性环境中收缩的pH敏感水凝胶，将其用[10]
于蛋白质的pH敏感释放 。将壳聚糖与聚丙烯酰胺类具有温度敏感性的聚合物结合，还可得到兼具温度敏感性和pH敏感性的水凝胶。Liliana等将壳聚糖与聚N-异丙基丙烯酰胺结合形成半互穿网络体系，利用壳聚糖的pH敏感性和聚N-异丙基丙烯酰胺的温度敏感[11]
性得到具有双重刺激响应性的水凝胶 。此外，Chenite等将甘油磷酸盐加入壳聚糖酸溶液中，通过调节壳聚糖与水分子之间的相互作用，可以使壳聚糖溶液在体温下发生胶凝，实[12]
现药物的长效释放 。

[0004] 然而目前所研究制备的智能水凝胶还存在着许多缺点，限制了它们在临床上的应用。首先，目前所制备的智能水凝胶大多不具有可注射性，通常在体外成形，必须通过手术植入才能进入体内，这给病人带来了经济上的负担和肉体上的痛苦以及应用上的不便。其次，目前所制备的智能水凝胶大多不能生物降解或缺乏生物相容性。当药物释放完毕后，必须通过手术从人体中取出，这也限制了水凝胶作为药物载体的临床应用。如聚丙烯酰胺类聚合物及其衍生物是目前研究的最广泛的温度敏感水凝胶，但聚丙烯酰胺类聚合物不能生物降解，且其单体对人体存在一定的毒性，因此该类水凝胶在临床上的应用存在着很大的障碍。另外目前所研制的pH敏感水凝胶的pH响应性不够灵敏，难以迅速响应体内pH的微小变化而实现药物释放的“通-断”。因此有必要制备一种可注射并具有较好pH敏感性的可生物降解水凝胶，以利用其来包埋药物、蛋白质、多肽、细胞、酶、抗体等，并实现所包埋物质的智能控释。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一在于提供一种可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶。该水凝胶可包埋药物、蛋白质、多肽、细胞、酶、抗体等，以溶液形式注射入体内，在体温下形成水凝胶，并可响应体内pH变化发生溶胀、溶解，实现药物的智能控释，临床应用方便。

[0006] 本发明的另一目的在于提供一种制备这种水凝胶的方法。

[0007] 本发明所提供的水凝胶由以下成分组成：

[0008] (1)1.0-10.0wt％的壳聚糖季铵盐；

[0009] (2)1.0-20.0wt％的α-或β-甘油磷酸盐。

[0010] 所述壳聚糖季铵盐水凝胶在温度低于30℃、pH在6.8-8.0之间为溶液，在温度30-60℃、pH在6.5-8.0之间形成水凝胶并保持稳定。

[0011] 所述壳聚糖季铵盐水凝胶可以响应于pH变化发生溶胀、溶解。

[0012] 固体微粒、水溶性添加物、药物、多肽、蛋白质、酶、细胞、抗体可在胶凝前预先加入到所述水凝胶中。

[0013] 所述壳聚糖季铵盐水凝胶可以在动物或人的组织、器官内在位形成，可以用作在位释放药物、试剂的载体。

[0014] 本发明中提出了一种制备所述可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶的方法，步骤如下：

[0015] (1)将一定摩尔比的壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵在60-90℃间反应一段时间后，以丙酮沉淀、洗涤，经烘干得到季铵基团取代度为20％-100％的壳聚糖季铵盐；

[0016] (2)将步骤(1)中所述的壳聚糖季铵盐溶解于pH2.0-6.0的酸性溶液中以得到1.0-10.0wt％的壳聚糖季铵盐溶液；

[0017] (3)在1-10℃之间将1.0-20.0wt％的甘油磷酸盐溶液逐滴加入步骤(2)中所述的壳聚糖季铵盐溶液中，搅拌得到pH在6.5-8.0之间的均匀清澈混合溶液；

[0018] (4)升高温度到胶凝温度，并恒温一段时间，得到均匀透明的壳聚糖季铵盐水凝胶。

[0019] 所述方法在步骤(3)中可加入固体微粒、水溶性添加物、药物、多肽、蛋白质、酶、细胞、抗体到所制的混合溶液中。

[0020] 所述方法可在步骤(4)中包括以下步骤：(4a)将混合溶液倒入容器、模型或注射入动物或人组织、器官、身体空腔内，以使溶液胶凝为所需形状。

[0021] 壳聚糖分子量范围为5-200万，脱乙酰度为65％-100％。

[0022] 壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的摩尔比范围为1∶2-1∶10，优选为1∶4-1∶6。

[0023] 制备壳聚糖季铵盐的反应时间范围为1-24h，优选为6-12h。

[0024] 酸性溶液包括醋酸、盐酸、乳酸、柠檬酸、抗坏血酸、蚁酸。

[0025] 胶凝温度范围为30-60℃，优选为36-38℃，胶凝在1h内完成。

[0026] 本发明的优点在于采用壳聚糖季铵盐、甘油磷酸盐制备的可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶，可通过环境温度的变化实现溶液-凝胶转变。该体系可以溶液形式注射入体内，在体温下在位胶凝，能适应体内组织或空隙的不同形状，可用于填充空隙，修复缺损。该体系保留了壳聚糖生物材料的生物相容性、生物降解性，并提高了其亲水性、pH敏感性，可响应于体内pH值变化发生溶胀、溶解以实现药物的智能释放，提高了药物在体内的利用率和安全性。

[0027] 本发明提供的可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶及其制备方法还具备以下特点：

[0028] (1)本发明提供的制备方法，方法简便，条件温和，可望保持生物活性药物的高活性。

[0029] (2)本发明提供的壳聚糖季铵盐水凝胶，pH响应性高，可望实现灵敏的、重现性好的药物智能控制释放。

附图说明

[0030] 图1壳聚糖及壳聚糖季铵盐的红外光谱。

[0031] 注：图中a线为壳聚糖的红外光谱，b线为季铵化后的壳聚糖季铵盐的红外光谱。-1 -1
从图中可知，季铵化后1597cm 处的氨基伸缩振动峰消失，在1481cm 出现-CH3的C-H弯曲振动强吸收峰。

[0032] 图2实施例2制备的壳聚糖季铵盐-甘油磷酸盐水溶液及在37℃下形成的水凝胶照片。

[0033] 注：图中a为壳聚糖季铵盐溶液，b为壳聚糖季铵盐-β-甘油磷酸钠混合溶液，c为在37℃下加热胶凝后形成的壳聚糖季铵盐水凝胶。

[0034] 图3实施例2制备的壳聚糖季铵盐水凝胶的扫描电镜照片。

[0035] 图4实施例2制备的壳聚糖季铵盐水凝胶在不同pH缓冲溶液中质量比随时间变化示意图。

[0036] 图5实施例2制备的壳聚糖季铵盐水凝胶的pH敏感性示意图。具体实施方案

[0037] 本发明包括可注射型pH敏感壳聚糖季铵盐水凝胶及其制备方法。壳聚糖季铵盐水凝胶制备的具体方法和步骤说明如下：

[0038] (1)壳聚糖季铵盐的制备

[0039] 将壳聚糖分散于水或异丙醇中，将2，3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液加入壳聚糖分散液中，加热到反应温度，反应一段时间。将反应液倒入丙酮中沉淀、洗涤，烘干得到壳聚糖季铵盐。

[0040] 壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的摩尔比为1∶2-1∶10，反应温度为60-90℃，反应时间为1-24h。

[0041] (2)壳聚糖季铵盐水凝胶的制备

[0042] 将上述步骤(1)所得的壳聚糖季铵盐溶解于酸性溶液中，冷却到1-10℃，搅拌下逐滴加入适量一定浓度的甘油磷酸盐溶液，继续搅拌一段时间使其混合均匀。将所得混合溶液加热到胶凝温度，并恒温一段时间直到溶液胶凝完全。

[0043] 酸性溶液pH范围为2.0-6.0。壳聚糖季铵盐溶液浓度范围为1.0-10.0wt％，甘油磷酸盐浓度范围为1.0-20.0wt％，胶凝温度为30-60℃。

[0044] (3)载药壳聚糖季铵盐水凝胶的制备

[0045] 将上述步骤(1)所得的壳聚糖季铵盐溶解于酸性溶液中，冷却到1-10℃，加入所需包埋的药物、蛋白质、多肽、细胞、酶或抗体等，搅拌下逐滴加入适量一定浓度的甘油磷酸盐溶液，继续搅拌一段时间使其混合均匀。将所得混合溶液加热到胶凝温度，并恒温一段时间直到溶液胶凝完全。

[0046] 上述方法将通过下面的实例进一步描述，但是提供的实例不能作为对此方法的限制。

[0047] 实施例1

[0048] 将3.0g壳聚糖分散于20mL水中，在80℃下搅拌1h。将16.94g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵溶解于15mL水中，加入壳聚糖分散液中。在80℃下搅拌反应12h后，将反应液倒入丙酮中沉淀，在冰箱中搅拌洗涤过夜后烘干，得到白色疏松产物。通过红外光谱表征(附图1)，证明壳聚糖链上发生季铵基团取代，生成壳聚糖季铵盐。

[0049] 实施例2

[0050] 将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g溶解于8mL 0.1mol/L的乳酸溶液中，完全溶解。冷却至4℃，搅拌下逐滴加入0.25g/mL的β-甘油磷酸钠溶液2mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液pH值为7.4。将该混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。该体系在4℃下可稳定保存。壳聚糖季铵盐溶液、壳聚糖季铵盐-β-甘油磷酸钠混合溶液、37℃下胶凝形成的壳聚糖季铵盐水凝胶的照片如附图2所示。

[0051] 实施例3

[0052] 将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g溶解于8mL 0.1mol/L的醋酸溶液中，完全溶解。冷却至4℃，搅拌下逐滴加入0.25g/mL的β-甘油磷酸钠溶液2mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液pH值为7.0。将该混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。该体系在4℃下可稳定保存。

[0053] 实施例4

[0054] 将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g溶解于8mL 0.1mol/L的乳酸溶液中，完全溶解。冷却至4℃，搅拌下逐滴加入0.25g/mL的β-甘油磷酸钠溶液2mL，充分搅拌使其混合均匀。向混合溶液中加入20wt％的牛血清白蛋白(BSA，模型药物)溶液，并混合均匀。将含有牛血清白蛋白的混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。该体系在4℃下可稳定保存。

[0055] 实施例5

[0056] 将实施例2中所制壳聚糖季铵盐水凝胶浸于不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中，定时取出称重。壳聚糖季铵盐水凝胶在酸性环境中发生溶胀、溶解，在中性、碱性环境基本保持原有状态不变。水凝胶在不同pH值缓冲溶液中的质量比随时间的变化曲线如图4所示。质量比为Wt/W0，式中Wt为一定时间间隔时水凝胶的质量，W0为水凝胶的初始质量。将壳聚糖季铵盐水凝胶浸于不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中，定时取出称重，直至达到恒重。壳聚糖季铵盐的pH敏感性示意图如图5所示，即水凝胶在不同缓冲溶液中的最终质量比与pH值的关系曲线。最终质量比为We/W0，式中We为水凝胶在不同pH值缓冲溶液中的最终质量，W0为水凝胶的初始质量。

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