嘌呤类物质产生菌及嘌呤类物质的制备方法

摘要

通过在培养基中培养具有嘌呤类物质产生能力、增强氧化磷酸戊糖途径的酶活性的芽孢杆菌属细菌，在该培养基中或者菌体内使嘌呤类物质生成蓄积，从该培养基中或菌体内回收嘌呤类物质，制备嘌呤类物质。

权利要求

1.一种枯草芽孢杆菌，其中该枯草芽孢杆菌具有产生嘌呤类物质的能力，并通过增加编码酶的基因的拷贝数或者用更强的启动子置换该基因的启动子而改变以提高氧化磷酸戊糖途径的酶活性，所述酶选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或核糖-5-磷酸异构酶，其中上述嘌呤类物质是肌苷，其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是由序列号48的氨基酸序列组成的蛋白质，而且其中所述5-磷酸异构酶是由序列号50的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1的枯草芽孢杆菌，其中编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因由序列号

47中记载的碱基序列组成。

3.权利要求1的枯草芽孢杆菌，其中编码所述核糖5-磷酸异构酶的基因由序列号49中记载的碱基序列组成。

4.权利要求1～3的任一项的枯草芽孢杆菌，特征在于，更进一步地改变以提高磷酸核糖焦磷酸合成酶活性。

5.权利要求1～3的任一项的枯草芽孢杆菌，特征在于，更进一步地通过破坏编码嘌呤操纵子的阻遏物的基因即purR基因，或者除去嘌呤操纵子的弱化子区域的一部分而改变以提高嘌呤操纵子的表达量。

6.权利要求1～3的任一项的枯草芽孢杆菌，特征在于，更进一步地通过破坏编码嘌呤核苷磷酸化酶的基因而改变以降低嘌呤核苷磷酸化酶活性。

7.嘌呤类物质的制备方法，特征在于，在培养基中培养权利要求1～6的任一项的枯草芽孢杆菌，使嘌呤类物质蓄积，回收嘌呤类物质，其中上述嘌呤类物质是肌苷。

8.嘌呤核苷酸的制备方法，特征在于，通过权利要求7的方法制备肌苷，使该肌苷与选自多磷酸、苯磷酸、氨甲酰磷酸的磷酸供体，通过具有产生核苷-5’-磷酸酯能力的微生物的作用，生成肌苷酸，并收集该肌苷酸。

说明书

嘌呤类物质产生菌及嘌呤类物质的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及5′-肌苷酸及5′-鸟苷酸代表的嘌呤核苷酸，及在作为这种合成原料的重要物质的肌苷和鸟苷等嘌呤核苷等的嘌呤类物质的制备方法中使用的芽孢杆菌属细菌。嘌呤类物质适用于调料、医药及其原料等。

[0002] 技术背景

[0003] 关于通过发酵法生产肌苷和鸟苷，使用需要腺嘌呤的菌株，或者而且对以嘌呤类似物为起始的各种药剂有抗性的芽孢杆菌属微生物(参考专利文献1～8)以及短杆菌属的微生物(参考专利文献9，10或非专利文献1)等的方法是已知的。

[0004] 为得到这种突变株，现有技术中通常进行紫外线照射、亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)处理等诱导突变的处理，采用合适的选择性培养基，得到目的突变株的方法。

[0005] 一方面，揭示了用芽孢杆菌属的微生物(参考专利文献11～20)、短杆菌属的微生物(参考专利文献21)以及大肠杆菌属的微生物(参考专利文献22)采用基因工程技术对嘌呤类物质的产生株进行育种。具体而言，例如，揭示了使用嘌呤操纵子的阻遏物蛋白基因(purR)被破坏的芽孢杆菌属细菌，有效地制备次黄嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤以及腺嘌呤等的核酸类物质的方法(参考专利文献23)。

[0006] 在枯草芽孢杆菌中，上述阻遏物蛋白，除已知调节嘌呤操纵子基因组以外，还调节与AMP生物合成有关的purA基因(参考非专利文献2)、与甲酰四氢叶酸生物合成有关的glyA基因(参考非专利文献3)以及编码次黄嘌呤/鸟嘌呤的转运蛋白的pbuG基因(参考非专利文献4)等的表达。

[0007] 进一步，揭示了通过除了破坏purR基因，破坏琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)，给予腺嘌呤要求性，以及破坏嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)，抑制肌苷分解为次黄嘌呤，有效地制备肌苷的方法(参考专利文献8)。

[0008] 氧化磷酸戊糖途径，是把葡萄糖通过葡萄糖激酶磷酸化生物合成葡萄糖 -6-磷酸，该葡萄糖-6-磷酸的氧化转换成核糖-5-磷酸的途径。该途径和嘌呤类物质的生物合成途径的关系还不太清楚，还没有尝试改变微生物的氧化的磷酸戊糖途径，来培养嘌呤类物质产生菌。

[0009] [专利文献1]特公昭38-23099号公报

[0010] [专利文献2]特公昭54-17033号公报

[0011] [专利文献3]特公昭55-2956号公报

[0012] [专利文献4]特公昭55-45199号公报

[0013] [专利文献5]特公昭57-14160号公报

[0014] [专利文献6]特公昭57-41915号公报

[0015] [专利文献7]特开昭59-42895号公报

[0016] [专利文献8]特开2004-242610号公报

[0017] [专利文献9]特公昭51-5075号公报

[0018] [专利文献10]特公昭58-17592号公报

[0019] [专利文献11]特开昭58-158197号公报

[0020] [专利文献12]特开昭58-175493号公报

[0021] [专利文献13]特开昭59-28470号公报

[0022] [专利文献14]特开昭60-156388号公报

[0023] [专利文献15]特开平1-27477号公报

[0024] [专利文献16]特开平1-174385号公报

[0025] [专利文献17]特开平3-58787号公报

[0026] [专利文献18]特开平3-164185号公报

[0027] [专利文献19]特开平5-84067号公报

[0028] [专利文献20]特开平5-192164号公报

[0029] [专利文献21]特开昭63-248394号公报

[0030] [专利文献22]国际公开第99/03988号小册子

[0031] [专利文献23]美国专利第6,284,495号

[0032] [非专利文献1]Agric.Biol.Chem.，1978，42，399-405

[0033] [非专利文献2]Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，7455-7459

[0034] [非专利文献3]J.Bacteriol.，2001，183，6175-6183

[0035] [非专利文献4]J.Bacteriol.，2003，185，5200-5209，

发明内容

[0036] 发明要解决的课题

[0037] 本发明的课题是为通过发酵法制备嘌呤核苷以及/或嘌呤核苷酸等的嘌呤类物质，建立合适的芽孢杆菌属细菌，并提供使用该细菌的嘌呤类物质的制备方法。 [0038] 解决课题的手段

[0039] 本发明人，为解决上述课题进行深入研究。结果发现，对于芽孢杆菌属细菌，通过增强氧化磷酸戊糖途径的酶活性，尤其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或核糖-5-磷酸异构酶的活性，来提高嘌呤核苷、嘌呤核苷酸的产生能力。又发现通过改变以提高编码磷酸核糖焦磷酸(ホスホリボシルピロリン酸)(PRPP)合成酶、或者与嘌呤核苷酸生物合成有关的酶的基因的表达，或者改变以降低嘌呤核苷磷酸化酶活性，可以进一步地提高芽孢杆菌属细菌的嘌呤类物质产生能力，达到完成本发明。

[0040] 即，本发明为以下几点。

[0041] (1)、芽孢杆菌属细菌，特征在于，具有产生嘌呤类物质的能力，改变以提高氧化磷酸戊糖途径的酶活性；

[0042] (2)、(1)的芽孢杆菌属细菌，上述嘌呤类物质是选自肌苷、黄苷、鸟苷、腺苷的嘌呤核苷；

[0043] (3)、(1)的芽孢杆菌属细菌，上述嘌呤类物质是选自肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸、腺苷酸的嘌呤核苷酸；

[0044] (4)、(1)～(3)的任一项的芽孢杆菌属细菌，上述氧化磷酸戊糖途径的酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或核糖-5-磷酸异构酶；

[0045] (5)、(1)～(4)的任一项的芽孢杆菌属细菌，通过增加编码上述酶的基因的拷贝数(コピ—数)或者改变该基因的表达调节序列而增强氧化磷酸戊糖途径的酶活性； [0046] (6)、(5)的芽孢杆菌属细菌，其中上述酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，编码该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因为在下列(A)或(B)中表示的编码蛋白质的基因；

[0047] (A)具有序列号48中记载的氨基酸序列的蛋白质

[0048] (B)在序列号48中记载的氨基酸序列中，具有含1个或者多个的氨基酸残基的置换、缺失、插入、添加、或者倒位的氨基酸序列，并且，具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的蛋白质

[0049] (7)、(5)的芽孢杆菌属细菌，其中上述酶是核糖5-磷酸异构酶，编码该核糖5-磷酸异构酶的基因是下列(E)或(F)中所示的编码蛋白质的基因；

[0050] (E)具有序列号50中记载的氨基酸序列的蛋白质

[0051] (F)在序列号50中记载的氨基酸序列中，具有含1个或者多个的氨基酸残基的置换、缺失、插入、添加、或者倒位的氨基酸序列，并且，具有核糖-5-磷酸异构酶活性的蛋白质

[0052] (8)、(6)及(7)的任一项的芽孢杆菌属细菌，其中上述多个氨基酸为2～20个氨基酸；

[0053] (9)、(5)的芽孢杆菌属细菌，其中上述酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，编码该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因为下列(a)或(b)中所示的DNA；

[0054] (a)含有序列号47中记载的碱基序列的DNA

[0055] (b)是在含有序列号47中记载的碱基序列或者从该碱基序列制备得到的探针和严格条件下杂交的DNA，而且编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA [0056] (10)(5)的芽孢杆菌属细菌，前述酶是核糖5-磷酸异构酶，编码该核糖5-磷酸异构酶的基因是下列(e)或(f)中所示的DNA；

[0057] (e)含有序列号49中记载的碱基序列的DNA

[0058] (f)是含有序列号49中记载的碱基序列或者从该碱基序列制备得到的探针和严格条件下杂交的DNA，并且编码具有核糖5-磷酸异构酶活性的蛋白质的DNA

[0059] (11)、(1)～(10)的任一项的芽孢杆菌属细菌，特征在于，更进一步地改变以提高磷酸核糖焦磷酸合成酶活性；

[0060] (12)、(1)～(11)的任一项的芽孢杆菌属细菌，特征在于，更进一步地改变以提高嘌呤操纵子的表达量；

[0061] (13)、(12)的芽孢杆菌属细菌，特征在于，通过破坏编码嘌呤操纵子的阻遏物的基因即purR基因，或者除去嘌呤操纵子的弱化子(プリンオペロンのアテニユエ一タ一)区域的一部分，来提高嘌呤操纵子的表达量；

[0062] [0062] (14)、(1)～(13)的任一项的芽孢杆菌属细菌，特征在于，更进一步地改 变以降低嘌呤核苷磷酸化酶活性；

[0063] (15)、嘌呤类物质的制备方法，特征在于，在培养基中培养(1)～(14)的任一项的芽孢杆菌属细菌，使嘌呤类物质蓄积，回收嘌呤类物质；

[0064] (16)、(15)的制备方法，嘌呤类物质是嘌呤核苷或者嘌呤核苷酸； [0065] (17)、(16)的制备方法，上述嘌呤类物质是选自肌苷、黄苷、鸟苷、腺苷的嘌呤核苷；

[0066] (18)、(16)的制备方法，上述嘌呤类物质是选自肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸、腺苷酸的嘌呤核苷酸；

[0067] (19)、嘌呤核苷酸的制备方法，特征在于，通过(17)的方法制备嘌呤核苷，该嘌呤核苷与选自多磷酸、苯磷酸、氨甲酰磷酸的磷酸供体，通过具有产生核苷-5’-磷酸酯能力的微生物或酸性磷酸酶的作用，生成嘌呤核苷酸，得到该嘌呤核苷酸。

[0068] 发明效果

[0069] 通过使用本发明的芽孢杆菌属细菌，能有效率地制备嘌呤核苷、嘌呤核苷酸等的嘌呤类物质。

附图说明

[0070] 图1显示嘌呤操纵子的构造图。方框框围起的序列为嘌呤操纵子引物，上面实线表示的序列为抗终止因子对(antiterminator dyad)，下面的虚线表示的序列为终止子对(terminator dyad)。缺失序列(75bp)用大写字母表示。

[0071] 图2显示各种改变型嘌呤操纵子启动子的转录活性的图。WT显示KMBS296的活性，ΔrpurR显示KMBS295的活性，ΔR+Ppur1显示KMBS296的活性，ΔR+Ppur3显示KMBS297的活性，ΔR+Ppur5显示KMBS298的活性，ΔR+Ppur-Δatt显示KMBS299的活性，以及ΔR+Ppur1-Δatt显示KMBS300的活性。

[0072] 实施本发明的最佳方案

[0073] <1>本发明的芽孢杆菌属细菌

[0074] (I)赋予嘌呤类物质产生能力

[0075] 本发明的芽孢杆菌属细菌，是具有嘌呤类物质产生能力，增强氧化磷酸 戊糖途径的酶活性的变异的芽孢杆菌属细菌。

[0076] 作为“嘌呤类物质”，是指含有嘌呤骨架的物质，例举嘌呤核苷、嘌呤核苷酸等。文中所述嘌呤核苷，指肌苷、黄苷、鸟苷、腺苷等，所述嘌呤核苷酸，指嘌呤核苷的5′-磷酸酯，例如肌苷酸(肌苷-5′-磷酸，以下称为“IMP”)、黄苷酸(黄苷5′-磷酸，以下称为“XMP”)、鸟苷酸(鸟苷-5′-单磷酸、以下称为“GMP”)、腺苷酸(腺苷-5′-单磷酸，以下称为“AMP’)等。

[0077] 所述“嘌呤类物质产生能力”，是指在培养基中培养本发明的芽孢杆菌属细菌时，以能从细胞或培养基中回收嘌呤类物质的程度，向细胞内或培养基中分泌、生成、蓄积的能力。还有，本发明的芽孢杆菌属细菌，具有上述嘌呤类物质中的2种或2种以上的产生能力的也是可以的。

[0078] 作为具有嘌呤类物质的产生能力的芽孢杆菌属细菌，具有本来的嘌呤类物质产生能力的细菌是可以的，如以下所示，通过利用突变法、重组DNA法，使芽孢杆菌属细菌改变为具有嘌呤类物质产生能力而得到的细菌也是可以的。而且，如下列描述的那样，通过氧化磷酸戊糖合成途径的酶活性增强的改变，被赋予嘌呤类物质产生能力的芽孢杆菌属细菌也是可以的。

[0079] 作为用于得到本发明的芽孢杆菌属细菌的芽孢杆菌属细菌，例举枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。作为枯草芽孢杆菌，例举枯草芽孢杆菌168Marburg(ATCC6051)、枯草芽孢杆菌PY79(Plasmid，1984，12，1-9)等，而作为解淀粉芽孢杆菌，可举出解淀粉芽孢杆菌T(ATCC23842)以及解淀粉芽孢杆菌N(ATCC23845)等。 [0080] 具有肌苷产生能力的芽孢杆菌属细菌，是通过对如上述芽孢杆菌属细菌赋予，例如，腺嘌呤需要性、或更进一步对嘌呤类似物等的药剂的抗性而得出的细菌。(参考特公昭
38-23099、特公昭54-17033、特公昭55-45199、特公昭57-14160、特公昭57-41915、特公昭
59-42895、US2004-0166575A)。具有营养需求性以及药剂抗性的芽孢杆菌属细菌，是通过用于N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、或者EMS(甲基磺酸乙酯)等的常规突变处理的突变剂处理得到。

[0081] 作为属于芽孢杆菌属的肌苷产生菌株的具体实例，能使用枯草芽孢杆菌KMBS16菌株。该菌株，是导入了编码嘌呤操纵子阻遏物的purR基因的缺失(purR::spc)、编码琥珀酰-AMP合成酶purA基因的缺失(purA::erm)、以及编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因的缺失(deoD::kan)的已知的枯草芽孢杆 菌trpC2菌株(168Marburg)的衍生菌株(特开2004-242610)。另外，还可以使用枯草芽孢杆菌菌株AJ3772(FERM P-2555)(特开昭62-014794)等。

[0082] 作为具有鸟苷产生能力的芽孢杆菌属细菌，可以举出IMP脱氢酶的活性增强的芽孢杆菌属细菌(特开平3-58787)、在腺嘌呤要求性突变株中导入了嘌呤类似物抗性或德夸菌素抗性基因的重组的载体的芽孢杆菌属细菌(特公平4-28357)等。

[0083] 此外，作为产生嘌呤核苷酸的芽孢杆菌属细菌，例举如下。作为肌苷酸产生菌，报告了枯草芽孢杆菌的磷酸酶(フオスフアタ—ゼ)的活性减弱的肌苷产生菌株(Uchida，K.et al.，Agr.Biol.Chem.，1961，25，804-805、Fujimoto，M.Uchida，K.，Agr.Biol.Chem.，1965，29，249-259)。作为鸟苷酸生产菌，例举具有腺嘌呤需要性并且对德夸菌素或对甲硫氨酸亚砜具有抗性，并且具有5’-鸟苷酸(鸟苷-5’-单磷酸，以下称为“GMP”)产生能力的芽孢杆菌属的突变株(特公昭56-12438号公报)。

[0084] 此外，作为培育具有嘌呤类物质产生能力的芽孢杆菌属细菌的方法，例举以下的方法。例举与嘌呤核苷和嘌呤核苷酸共同的嘌呤生物合成有关的酶、即，使嘌呤生物合成酶在细胞内的活性提高的方法。该酶在细胞内的活性，优选比芽孢杆菌属细菌的非改变株(例如野生型的芽孢杆菌属细菌)的活性还高。所述“活性提高”，相当于例如，每个细胞的酶分子数的增加的情况、每个酶分子的比活性提高的情况。例如，通过使上述酶的基因的表达量提高，可以提高活性。

[0085] 作为与上述嘌呤生物合成有关的酶，例举磷酸核糖焦磷酸(PRPP)酰胺转移酶、PRPP合成酶等。

[0086] 磷酸戊糖类来源的葡萄糖等的糖原通过代谢生成的分解代谢物的一部分，经核酮糖-5-磷酸，成为核糖-5-磷酸。通过生物合成的核糖-5-磷酸，能生成嘌呤核苷、组氨酸以及作为色氨酸的生物合成的不可缺少的前体物质的PRPP。具体而言，核糖-5-磷酸，通过磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP synthetase[EC：2.7.6.1])转换成PRPP。因此，通过改变以提高PRPP合成酶的活性，能给予芽孢杆菌属细菌嘌呤类物质产生能力，如果与强化的磷酸戊糖类生物合成类酶、组合起来更有效。

[0087] 所述的“增强磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性”，指对于野生菌株或亲株等非改变株磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加。磷酸核糖焦磷酸酸合成酶的 活性，例如，根据Switzer等的方法(Methods Enzymol.，1978，51，3-11)、Roth等的方法(Methods Enzymol.，1978，51，12-17)，进行测定。磷酸核糖焦磷酸酸合成酶的活性增强的芽孢杆菌属细菌，例如，与特开2004-242610号公报中记载的方法一样，通过使用质粒的方法、在染色体上重组的方法等，通过使编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因在芽孢杆菌属细菌中高表达而制备。本发明中所用的编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因，可举出序列号57中记载的芽孢杆菌属细菌来源的prs基因(Genbank Accession No.NC_000964(15913..17376)，就连其他的细菌来源的基因、动植物来源的基因，只要是芽孢杆菌属中编码具有磷酸核糖焦磷酸合成酶活性的蛋白质的基因，可以任意使用。

[0088] 一方面，生成嘌呤核苷、组氨酸、以及色氨酸生物合成中不可缺少的前体物质的PRPP，其一部分，通过与嘌呤生物合成有关的酶类，转换成嘌呤核苷、嘌呤核苷酸。作为编码这样的酶类的基因，例如是枯草芽孢杆菌的purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD操纵子的基因(Ebbole DJ and ZalkinH，J.Biol.Chem.，1987，262，17，8274-87)(现在，也称为purEKBCSQLFMNHD：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives，Editor inChief：A.L.Sonenshein，ASM Press，Washington D.C.，2002)、以及大肠杆菌的嘌呤操纵子基因(Escherichia and Salmonella，Second Edition，Editor in Chief：F.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)。

[0089] 因此，通过增强这些基因的表达，能赋予嘌呤类物质产生能力。此外，本发明中可以使用的嘌呤操纵子基因不限于此，也可以使用其他的微生物、动植物来源的基因。 [0090] 作为使嘌呤操纵子的表达量增大的方法，与下文的使氧化磷酸戊糖途径的酶活性增加一样，例如，通过使用质粒的方法、在染色体上重组的方法等，使嘌呤操纵子基因在芽孢杆菌属细菌中高表达的方法。

[0091] 作为使嘌呤操纵子的表达量增大的第2种方法，例举将嘌呤操纵子固有的启动子置换为更强的启动子、将固有的启动子的-35、-10区域置换为共有序列。

[0092] 例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)中，嘌呤操纵子的-35序列是共有序列(TTGACA)，而-10序列是TAAGAT，与共有序列TATAAT是不同的(Ebbole，D.J.and H.Zalikn，J.Biol.Chem.，1987，262， 8274-8287)。因此，由于将-10序列(TAAGAT)改变为共有序列TATAAT或者TATGAT、TAAAAT，能使嘌呤操纵子的转录活性提高。此外，启动子序列的置换，可以用与下列的基因置换相同的方法进行。 [0093] 作为使嘌呤操纵子的表达量增大的第3种方法，例举使嘌呤操纵子的阻遏物的表达量降低的方法(US6,284,495号)。

[0094] 为使嘌呤阻遏物的表达量降低，例如，通过紫外线照射或NTG或EMS等通常的突变处理中使用的突变剂处理芽孢杆菌属细菌，可以采用筛选嘌呤阻遏物的表达量降低的突变株的方法。

[0095] 此外，嘌呤阻遏物的表达量降低的芽孢杆菌属细菌，突变处理以外，例如，能通过使用基因重组的方法的同源重组方法(Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory press(1972)：Matsuyama，S.andMizushima，S.，J.Bacteriol.，1985，162，1196-1202)，将编码染色体上的嘌呤阻遏物的基因(purR；GenBank Accession NC_000964序列号51)用无正常功能的基因(以下，称为“破坏型基因”)置换得到。 [0096] 用破坏型基因置换宿主染色体上的正常基因，例如如下。另外，以下的实例作为purR基因的实例进行说明，对于其他的基因，例如下文的purA或deoD基因，也同样能进行基因破坏。

[0097] 同源重组，是将具有和染色体上的序列同源性的序列，在芽孢杆菌属细菌内不能复制的质粒等导入细菌体内，在具有一定频度同源性的序列处开始重组，导入的质粒全部被整合到染色体上。然后，进一步地在具有染色体上的同源性的序列处开始重组，质粒再次从染色体上脱落，此时通过引起重组的位置而破坏的基因的部分在染色体上固定，原来的正常基因和质粒一起从染色体上脱落。通过筛选这样的菌株，能得到染色体上正常的purR基因被置换成破坏型purR基因的菌株。

[0098] 通过这样的同源重组的基因破坏技术已经确立，能利用使用直链DNA的方法、使用温度敏感性质粒的方法等。此外，即使通过使用包含在内部插入药物抗性等的标记基因的purR基因，而且在作为目的微生物细胞内不复制的质粒，也能进行purR基因的破坏。即，用上述质粒进行转化，获得药物抗性的转化体，标记基因整合在染色体DNA中。该标记基因，因为其两端的purR基因序列和染色体上的purR基因通过同源重组而整合的可能性高，能高效筛选到破坏型基因株。

[0099] 在基因破坏中使用的破坏型purR基因，具体而言，筛选通过限制性内切酶消化和再结合，使purR基因的一定区域缺失，向purR基因插入其他的DNA片段(标记基因等)，或点突变法(Kramer，W.and Fritz，H.J.，MethodsEnzymol.，1987，154，350-367)，或重组体PCR法(PCR Technology，StocktonPress(1989))、硫代硫酸钠、羟胺等的化学药剂处理(Shortle，D.and Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，75，2170-2174)，在purR基因的编码区或启动子区等的碱基序列中引起1个或多个碱基的置换、缺失、插入、添加或倒位，被编码的阻遏物的活性降低或消失，或purR基因的转录下降或消失基因而能得到。在这些实施中，经限制性内切酶消化和再结合使purR基因的一定区域缺失的方法或者向purR基因插入其他的DNA片段的方法，可靠性和稳定性的方面来说是令人满意的。 [0100] 此外，purR基因，从具有嘌呤操纵子的微生物的染色体DNA，能通过以根据已知的purR基因的碱基序列合成的寡核苷酸为引物的PCR法得到。此外，从具有嘌呤操纵子的微生物的染色体DNA库，通过以根据已知的purR基因的碱基序列合成的寡核苷酸为探针的杂交法，能得到purR基因。关于枯草芽孢杆菌168Marburg菌株，报告了purR基因的碱基序列(GenBankaccession No.D26185(编码区碱基号118041～118898)、NC_000964(编码区碱基号54439～55296))。purR基因的碱基序列以及该基因编码的氨基酸序列，在序列表的序列号51及52中显示(参考特开2004-242610号)。

[0101] 作为得到purR基因使用的PCR引物，如果扩增purR基因的一部分的也是可以的，具体而言，举出具有序列号59(GAAGTTGATGATCAAAA)及序列号60(ACATATTGTTGACGATAAT)中表示的碱基序列的寡核苷酸等。

[0102] 制备破坏型基因使用的purR基因，不一定含有全长，只要含有引起基因破坏的必要的长度就可以了。此外，得到各基因而使用的微生物，该基因，不特别限于具有与基因破坏株的建立使用的芽孢杆菌属细菌的purR基因发生同源重组程度的同源性。但是，通常优选使用与作为目的的芽孢杆菌属细菌相同的细菌来源的基因。

[0103] 能与芽孢杆菌属细菌的purR基因发生同源重组得到的DNA，也可以是编码在序列号52中所示的氨基酸序列中，可以是编码含有1或多个氨基酸置换、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的DNA。所述“多个”，例如2～50个，优选2～30个，更优选2～10。

[0104] 作为与上述芽孢杆菌属细菌的purR基因发生同源重组得到的DNA，具体而言，例举与具有序列号51表示的碱基序列的DNA，具有例如70％或70％以上，优选80％或80％以上，更优选90％或90％以上，最优选95％或95％以上的同源性的DNA。更具体而言，例举与具有序列号51表示的碱基序列的DNA，在严格的条件下，杂交的DNA。作为严格的条件，例举60℃，用相当于1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度进行洗涤的条件。

[0105] 作为前述标记基因，例举大观霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等药物抗性基因。屎肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的大观霉素抗性基因，从芽孢杆菌ジェネチツクストツクセンタ—(BGSC)出售的大肠杆菌ECE101菌株，来制备质粒pDG1726，通过从该质粒作为组件(カセツト)取出，能够得到。此外，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的红霉素抗性基因，从芽孢杆菌ジェネチツクストツクセンタ—(BGSC)出售的大肠杆菌ECE91菌株，来制备质粒pDG646，通过从该质粒作为组件取出，能够得到。更进一步地，卡那霉素抗性基因，粪链球菌(Streptococcus faecalis)来源的卡那霉素抗性基因，由从芽孢杆菌ジェネチツクストツクセンタ—(BGSC)出售的大肠杆菌ECE94菌株，来制备质粒pDG783，通过从该质粒作为组件取出，能够得到。

[0106] 使用作为标记基因的药剂抗性基因时，如果用将该基因插入到质粒中的purR基因的合适的位置而得到的质粒转化微生物，若筛选药物抗性的转化体，则得到purR基因破坏株。染色体上的purR基因被破坏，通过Southern印迹杂交(サザンブロツテイング)或PCR法，经解析染色体上的purR基因或标记基因而能确认。确认前述大观霉素抗性基因、红霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因被重组在染色体DNA上，能通过使用能扩增这些基因的引物的PCR进行。

[0107] 此外，已知嘌呤操纵子的表达，被在启动子下游位置的终止子-抗终止子序列(terminator-antiterminator序列)(以下，称为抗终止子序列)抑制(Ebbole，D.J.and Zalkin，H.，J.Biol.Chem.，1987，262，8274-8287、Ebbole，D.J.andZalkin，H.，J.Biol.Chem.，1988，263，10894-10902、Ebbole，D.J.and Zalkin，H.，J.Bacteriol.，1989，171，2136-2141)(参考图1)。因此，通过使抗终止子序列缺失，能提高嘌呤操纵子的表达量。抗终止子序列的缺失，可以用与purR破 坏相同的方法进行。

[0108] 还有，为使嘌呤操纵子转录更进一步增大，可以使上述方法组合，例如，破坏purR基因并进一步用质粒扩增使抗终止子序列缺失的嘌呤操纵子，或者，可以使这样的嘌呤操纵子在染色体上多拷贝。

[0109] 此外，与嘌呤生物合成有关的酶活性增强，可以解除与嘌呤生物合成有关的酶的调节，例如，可以通过解除前述酶的反馈(フイ—ドバツク)阻碍的方法进行(WO99/03988)。

[0110] 更进一步，减少嘌呤类物质的细胞内摄取，也能增强嘌呤类物质产生能力。例如，嘌呤核苷的细胞内摄取，能通过阻断嘌呤核苷的细胞内摄取有关的反应而减少。与上述嘌呤核苷的细胞内摄取有关的反应，例如是核苷渗透酶(パ—ミア—ゼ)催化的反应。 [0111] 更进一步，为使嘌呤类物质产生能力增强，可以使分解嘌呤类物质的酶活性降低。作为这样的酶，例如是嘌呤核苷磷酸化酶。

[0112] 通过与嘌呤生物合成有关的酶类，从PRPP生物合成得到的嘌呤核苷酸被脱磷酸化，得到嘌呤核苷。为有效地蓄积嘌呤核苷，优选降低将嘌呤核苷更进一步地分解成次黄嘌呤等的嘌呤核苷磷酸化酶的活性。即，优选改变以起始肌苷的嘌呤核苷为底物的嘌呤核苷磷酸化酶减少或缺失。

[0113] 具体而言，用芽孢杆菌属细菌，能破坏编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因与pupG基因。本发明的芽孢杆菌属细菌，可以变异为将上述的deoD基因和pupG基因单独或同时破坏的细菌。deoD基因、pupG基因，能利用例如芽孢杆菌属来源的基因(deoD；Genbank Accession No.NC_000964(序列号55)，pupG；Genbank Accession No.NC_000964(序列号53))，用与上述破坏purR基因同样的方法得到基因破坏菌株。

[0114] 更进一步地，为使嘌呤类物质产生能力增强，可以使肌苷单磷酸(IMP)脱氢酶的活性降低。作为编码IMP脱氢酶的基因，例举guaB基因。作为guaB基因，例如，可以例举具有GenBank AccessionNo.NC_000964(15913..17376)中注册的碱基序列的基因(序列号61)。

[0115] 此外，作为使嘌呤类物质产生能力增强的方法，考虑扩增编码具有排出嘌呤类物质活性的蛋白质的基因。作为扩增这样的基因细菌，例如，扩增rhtA基因的芽孢杆菌属细菌(特开2003-219876)。

[0116] 用于本发明中的微生物，若进一步使编码核苷酶或核苷酸酶的基因缺 失，可以蓄积与它们各自对应的核苷或核苷酸，或者若满足肌苷的需求，则可以蓄积这些生物合成体系途径上的前体以及与其有关的物质。

[0117] (II)为提高氧化的磷酸戊糖途径的酶活性而产生变异的菌株

[0118] 本发明的芽孢杆菌属细菌，通过提高氧化磷酸戊糖途径的酶活性的改变，能得到具有上述那样的嘌呤类物质产生能力的菌株。但是，不论改变的顺序，在进行提高氧化磷酸戊糖途径的酶活性的改变的时候，可以赋予嘌呤核苷酸产生能力也是可以的。 [0119] 本文中所述的“氧化磷酸戊糖途径”，是指被摄入到细胞内的葡萄糖，通过葡萄糖激酶磷酸化，生物合成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸被转换为氧化核糖-5-磷酸的途径。所述的氧化磷酸戊糖酸途径的酶，具体而言，指葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC：1.1.1.49)或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(EC：1.1.1.44)，或者核糖-5-磷酸异构酶(EC：5.3.1.6)等酶，本发明的芽孢杆菌属细菌，可以是改变以提高这些酶中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和核糖-5-磷酸异构酶任一个的活性的菌株。

[0120] 氧化磷酸戊糖途径的酶活性，优选更提高野生株或非改变株的活性。提高酶活性，用如下的方法测定。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性，用如实施例6的(1)中记载的NADPH生成测定方法，或者，核糖-5-磷酸异构酶的酶活性，用如实施例6的(2)中记载的核酮糖5-磷酸盐(ribulose5-phosphate)生成测定方法进行测定。

[0121] 对于氧化磷酸戊糖途径的酶活性提高的改变，例如，也可以使编码氧化磷酸戊糖途径的酶的基因扩增。能使用的基因不特别限于编码具有氧化磷酸戊糖途径的酶活性的蛋白质的基因，例举如芽孢杆菌属来源的基因。

[0122] 枯草芽孢杆菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，例举由序列号48表示的489个氨基酸构成的，用于改变编码该蛋白质的基因，优选具有序列号47(zwf基因；Genbank Accession No.NC_000964)的碱基序列的基因。另外，zwf基因，存在于枯草芽孢杆菌染色体上的第212位(度)。

[0123] 此外，作为核糖-5-磷酸异构酶，例举由序列号50中所示的149个氨基酸构成的蛋白质，能用于改变编码该蛋白质的基因，优选具有序列号49的碱基序列的基因(ywlF基因；Genbank Accession No.NC_000964)。另外，ywlF基因，在枯草芽孢杆菌染色体上第324位，与编码丝氨酸羟基甲基转移酶的glyA基因近接存在。而且，核糖-5-磷酸异构酶，包含称为核糖-5-磷酸差向 异构酶的酶。

[0124] 此外，也能使用芽孢杆菌属以外的细菌，例如编码其他的微生物或动植物来源的氧化磷酸戊糖途径的酶的基因。编码微生物或动植物来源的氧化磷酸戊糖途径的酶的基因，能使用该碱基序列已经被决定的基因，或根据与那些碱基序列同源性(ホモロジ—)等编码具有氧化磷酸戊糖途径的酶活性的蛋白质的基因从微生物、动植物等的染色体上分离，决定碱基序列的基因等。此外，碱基序列被决定后，能使用该序列因此合成的基因。这能通过杂交法、PCR法扩增该启动子及含ORF部分的区域而得到。序列信息利用Genbank等数据库得到。

[0125] 对于芽孢杆菌属细菌，使这些作为目的的酶的细胞内活性提高，通过编码该酶的基因表达增强而达到。该基因的表达量的增强，通过提高该基因的拷贝数而达到。例如，将编码前述酶的基因片段与芽孢杆菌属细菌中功能载体，优选多拷贝(マルチコピ—)型的载体连结制备重组DNA，也可以将其在芽孢杆菌属细菌宿主中导入而转化。

[0126] 导入的基因，可以使用芽孢杆菌属细菌来源的基因以及只要具有芽孢杆菌属细菌的作用、大肠杆菌属细菌等其他生物来源的基因的任何基因。

[0127] 作为目的基因，例如，通过以芽孢杆菌属细菌的染色体DNA为模板的PCR法(参考PCR：polymerase chain reaction；White，T.J.et al.，Trends Genet.，1989，5，185-189)，能够得到。染色体DNA，例如根据斎藤、三浦的方法(参考H.Saito and K.Miura，Biochem.B iophys.Acta，1963，72，619-629、生物工学实験書、日本生物工学会 、97～98頁、培風館、1992年)等，能从作为DNA供给体的细菌制备。PCR用的引物，根据芽孢杆菌属细菌的已知基因序列，或根据其他的细菌等中序列在已知的基因间被保存的区域的信息能够制备。 [0128] 作为在芽孢杆菌属细菌中导入目的基因的自我复制可能的载体，例如，举例pUB110、pC194、pE194等。此外，作为整合目的基因到染色体DNA上的载体，例举如pHSG398(宝酒造(株))、pBluescript SK-(Stratagene)等的大肠杆菌用载体等。 [0129] 连结装有目的基因与芽孢杆菌属细菌中功能标记的载体，制备重组DNA，用与目的基因的末端匹配的限制性内切酶切割载体。连结通常用T4DNA连接酶等的连接酶进行。

[0130] 作为前述芽孢杆菌属中功能的标记基因，例举大观霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等的药物抗性基因。乳酸球菌来源的大观霉素抗性基因，从芽孢杆菌ジェネチツクストツクセンタ—(BGSC)出售的大肠杆菌ECE101菌株，构建质粒pDG1726，通过从该质粒作为组件取出，能够得到。此外，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的红霉素抗性基因，从芽孢杆菌ジェネチツクストツクセンタ—(BGSC)出售的大肠杆菌ECE91株，构建质粒pDG646，通过从该质粒作为组件取出，能够得到。进一步地，卡那霉素抗性基因，粪链球菌(Streptococcus faecalis)来源的卡那霉素抗性基因，从芽孢杆菌ジェネチツクストツクセンタ—(BGSC)出售的大肠杆菌ECE94株，构建质粒pDG783，通过从该质粒作为组件取出，能够得到。

[0131] 将如上述制备的重组DNA导入芽孢杆菌属细菌，可以根据在此前报告的转化法进行。例如，从增殖阶段的细胞制备感受态细胞，导入DNA的方法(Dubnau，D.，and Davidoff-Abelson，R.，J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)，或者在使宿主细胞处于容易整合重组DNA的原生质体(プロトプラスト)或者原生质球(スフェロプラスト)状态下将重组DNA导入DNA接受菌的方法(Chang，S.and Cohen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，1979，168，111-115)。

[0132] 提高目的基因拷贝数，也能达到使该基因在芽孢杆菌属细菌的染色体DNA上存在多拷贝。在芽孢杆菌属细菌的染色体DNA上多拷贝地导入目的基因，利用在染色体DNA上存在多拷贝的序列为靶标通过同源重组进行。作为在染色体DNA上多拷贝存在的序列，在转座子、重复序列、在转移因子的末端存在的反向重复序列(インバ—テツド·リピ—ト)等能利用。

[0133] 目的酶的活性增强，除扩增上述基因以外，通过将染色体DNA上或质粒上的目的基因的启动子等的表达调节序列置换成更强的而达到。启动子的强度，由RNA合成起始的频度来定义。启动子的强度的评价法及更强的启动子的实例，记载于Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters inbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中。此外，如国际公开W000/18935中揭示的那样，目的基因的启动子区中导入多碱基的碱基置换，能改变为更强的启动子。更进一步，已知核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔，尤其对起始密码子近上游的序列的多个的核苷酸的置换对mRNA的翻译效率有很大的影响。这些表达调节序列的改变，也可以与提高目的基因的拷贝数组合。

[0134] 例如，作为芽孢杆菌中功能的启动子，例举veg启动子、spac启动子、xyl启动子等。

[0135] 另外，在本发明的微生物中提高活性的氧化磷酸戊糖途径的酶，只要不损害它们各自酶活性，可以是含有在序列号48或50的序列中1个或多个位置上的1个或多个氨基酸置换、缺失、插入或添加的酶蛋白。此处，所说“多个”，是指对于氨基酸残基的蛋白质的立体构型，根据位置、种类不同，具体而言，2～30个，优选2～20个，更优选2～10个。 [0136] 上述的氧化磷酸戊糖途径的酶蛋白的突变，是维持酶活性的保留突变。所述置换，是氨基酸序列中至少1个残基被除去，在该处插入其他的残基的变化。置换酶蛋白本来的氨基酸，并且，作为被认为是保留置换的氨基酸，例如从ala向ser或thr的置换、从arg向gln、his或lys的置换、从asn向glu、gln、lys、his或asp的置换、从asp向asn、glu或gln的置换、从cys向ser或ala的置换、从gln向asn、glu、lys、his、asp或者arg的置换、从glu向gly、asn、gln、lys或asp的置换、从gly向pro的置换、从his向asn、lys、gln、arg或tyr的置换、从ile向leu、met、val或phe的置换、从leu向ile、met、val或phe的置换、从lys向asn、glu、gln、his或arg的置换、从met向ile、leu、val或phe的置换、从phe向trp、tyr、met、ile或leu的置换、从ser向thr或ala的置换、从thr向ser或ala的置换、从trp向phe或tyr的置换、从tyr向his、phe或trp的置换、以及从val向met、ile或leu的置换。

[0137] 编码与上述的氧化磷酸戊糖途径的酶蛋白基本相同的蛋白质的DNA，例如通过点突变法，特定位置上含有置换、缺失、插入、付加或倒位的氨基酸残基，能通过改变编码这样的酶的碱基序列得到。此外，如上述的被改变的DNA，通过以前已知的突变处理而得到。作为突变处理，用羟胺等体外处理突变处理前的DNA的方法，以及将保持突变处理前的DNA的微生物，例举，大肠杆菌属细菌通过紫外线照射或N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等用于常规突变处理的突变剂处理的方法。

[0138] 将具有上述的突变的DNA用合适的细胞表达，根据研究表达产物的活性，能得到编码与氧化磷酸戊糖途径的酶基本相同的蛋白质的DNA。此外，从有突变的编码氧化磷酸戊糖途径的酶的DNA或保持其的细胞，与例如序列表的序列号47，或者49中所示的碱基序列或者具有其一部分的探针在严 格条件下杂交，并且，能得到编码具有氧化磷酸戊糖途径的酶活性的蛋白质的DNA。此处所述“严格的条件”，是指形成所谓特异的杂交体，而不形成非特异的杂交体的条件。将该条件明确地数值化是困难的，举一个例子，同源性高的DNA之间，例如具有50％或50％以上，优选70％或70％以上，更优选80％或80％以上，特别优选90％或90％以上，最优选95％或95％以上的同源性的DNA之间杂交，比其同源性低的DNA之间不杂交的条件，或者常规的Southern杂交的洗涤条件例如为60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度的杂交条件。

[0139] 作为探针，可以使用序列号47、49的碱基序列的一部分的序列。该探针，能将根据序列号47、49的碱基序列制成的寡核苷酸作为引物，以含有序列号47、49的碱基序列的DNA片段为模板通过PCR制备。作为探针，在使用300bp长的DNA片段的情况下，杂交洗涤条件例如为50℃、2×SSC、0.1％SDS。

[0140] 作为编码与氧化磷酸戊糖途径的酶基本相同的蛋白质的DNA，具体而言，例如与序列号48、50中所示的氨基酸序列，具有优选50％或50％以上，更优选70％或70％以上，更优选80％或80％以上，特别优选90％或90％以上，最优选95％或95％以上的同源性，并且编码具有氧化磷酸戊糖途径的酶产物活性的蛋白质的DNA。

[0141] <2>嘌呤类物质的制备方法

[0142] 本发明的芽孢杆菌属细菌，有效地产生嘌呤类物质。因此，通过将本发明的芽孢杆菌属细菌在合适的培养基中培养，能使嘌呤核苷和嘌呤核苷酸等的嘌呤类物质在培养基中生成蓄积。

[0143] 作为本发明中使用的培养基，能通过使用含有碳源、氮源、无机盐类、其他必要的氨基酸、维生素等有机微量营养素的常规营养培养基的常规方法进行。能使用合成培养基或天然培养基中的任一种。在培养基中使用的碳源及氮源，只要是能利用的培养的菌株即可。

[0144] 作为碳源，可以使用葡萄、果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，阿拉伯糖，木糖，海藻糖，核糖，淀粉水解物，糖蜜等糖类，甘油、甘露糖醇等醇类，此外，也能单独使用葡萄糖酸、乙酸、柠檬酸，马来酸，富马酸，琥珀酸等有机酸等单独或与其他碳源联合使用。 [0145] 作为氮源，可以使用氨，硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵，乙酸铵等 铵盐，硝酸盐或大豆水解物等的有机氮等。

[0146] 作为有机微量营养素，可以使用氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，并且含有这些物质的胨，酪蛋白水解物，酵母提取物，大豆蛋白分解物等，使用有在生长发育中需要的氨基酸、核苷酸等的营养要求性的突变株的情况下，有必要辅加需要的营养素。

[0147] 作为无机盐类，可以使用磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐等。

[0148] 培养条件根据使用的芽孢杆菌属细菌的种类，例如是枯草芽孢杆菌时，发酵温度20～50℃，将pH调节至4～9同时进行通气培养。在培养中pH低下的情况下，用氨气等碱中和。通过如此培养40小时～3日，在培养液中蓄积嘌呤核苷。

[0149] 培养完成后，作为采取培养液中蓄积的肌苷等嘌呤类物质的方法，可以根据已知的方法进行。例如，可以根据沉淀法或离子交换色谱等分离。

[0150] 进一步，对于根据本发明的方法制备的肌苷或鸟苷，通过使嘌呤核苷磷酸化酶以及磷酸核糖转移酶起作用，得到5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸。

[0151] 此外，对于使用本发明的微生物产生的嘌呤核苷，通过选自多磷酸，苯磷酸，氨基甲酰磷酸的磷酸供给体和具有生成核苷-5’-磷酸酯能力的微生物、酸性磷酸酶的作用，可能产生嘌呤核苷酸(核苷-5’-磷酸酯)。具有生成核苷-5’-磷酸酯的能力的微生物，不特别限于具有嘌呤核苷转变为嘌呤核苷酸的能力，例如，例举国际公开小册子WO9637603号中记载的微生物。此外，可以使用特开平07-231793中公开的Escherichia blattae JCM 1650，Serratiaficaria ATCC33105，Klebsiella planticola IFO14939(ATCC33531)，Klebsiellapneumoniae IFO 3318(ATCC8724)，Klebsiella terrigena IFO 14941(ATCC33257)，Morganella morganii IFO 3168，Enterobacter aerogenes IFO 12010，Enterobacter aerogenes IFO 13534(ATCC13048)，Chromobacterium fluviatileIAM 13652，Chromobacterium violaceum IFO 12614，Cedecea lapagei JCM1684，Cedecea davisiae JCM 1685，Cedecea neteri JCM 5909等。

[0152] 作为酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)，例如，可以使用特开2002-000289、US6010851、US6015697、WO01/18184中公开的，更优选对核苷亲和性提高的酸性磷酸酶(参考特开平10-201481)、核苷酸酶活性低下的突变型酸性磷酸酶(参考WO9637603)，磷酸酯水解活性低下的突变型酸性磷酸酶(US6010851)等。

[0153] 实施例

[0154] 以下，根据实施例更进一步地具体说明本发明。

[0155] 实施例1

[0156] <嘌呤核苷磷酸化酶缺失株的构建和培养评价>

[0157] (1)嘌呤核苷磷酸化酶(pupG)缺失株的构建

[0158] 来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)，在缺失嘌呤操纵子阻遏物基因(purR)、琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)的重组体KMBS16(特开2004-2426l0号)中，导入pupG基因缺失的菌株，根据以下进行制备。 [0159] (i)pupG的5′端区域的克隆

[0160] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制备了具有以下碱基序列各20mer，29mer的PCR使用的引物。

[0161] ATTGCACGGCCGTTCGTCGG(序列号1)

[0162] cgcagatctCCGGATTTTCGATTTCGTCC(小写字母的碱基表示含有BglII位点的尾端(タグ)，序列号2)将枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA作为模板，使用上述引物PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR System Model9600(パ—キンエルマ—社制))进行，得到含有pupG基因翻译起始密码子上游的约610bp和其下游约120bp的扩增片段。

[0163] PCR扩增片段，使用Perfectly Blunt Cloning Kit(NOVAGEN)通过苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀进行纯化，在付属的pT7Blue质粒中克隆。得到该质粒的多克隆位点的两端是EcoRI和HindIII，pupG基因上游区存在EcoRI端的质粒pKM48。

[0164] (ii)pupG的3′端区域的克隆

[0165] 根据基因数据库(GenBank Accession NC_000964)的信息，制备具有以下碱基序列，各20mer，29mer的PCR使用的引物。

[0166] CAAAGATCTGTCCAGCCTGG(序列号3)

[0167] cgcctgcagTGCCTTTATCTAAAGCTTCC(小写字母的碱基表示含有PstI位点的尾端，序列号4)

[0168] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，使用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR System Model9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有pupG基因翻译终止密码子上游的约340bp和其下游约400bp的扩增片段。

[0169] 与pupG的5′端区域克隆的情况同样地，得到在pT7Blue质粒中克隆，pupG基因下游区域存在于EcoRI端的质粒pKM49。

[0170] (iii)ΔpupG片段的克隆

[0171] 将pKM49用SpeI处理后，通过克列诺片段(Klenow fragment)平滑化后，并且用PstI处理，剪切约740bp的DNA片段。将该片段pKM48用BglII处理，通过克列诺片段(Klenow fragment)平滑化后，使用经过PstI处理的质粒片段与T4DNA连接酶连结，得到pKM75。该质粒保持了含有pupG缺失DNA的约1470bp的插入片段，所述pupG缺失DNA为pupG构造基因内缺失约360bp。

[0172] (iv)pupG破坏用质粒的构建

[0173] 将pKM75用SacI和PstI处理，剪切出插入片段，将该片段使用经过该酶处理的染色体重组用载体pJPM1(Mueller et.al.，J.Bacteriol.，1992，174，4361-4373)和T4DNA连接酶连结，得到pKM76。

[0174] 用得到的质粒pKM76，转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS16株的感受态细胞，取得在含有2.5μg/ml的氯霉素的LB琼脂板上生长的菌落(1次重组株)。

[0175] 将得到的1次重组株在含有氯霉素的10ml LB培养基中接种，在37℃传代培养几天，筛选LB琼脂培养基上成为氯霉素敏感性的菌落。从得到的氯霉素敏感性菌落提取染色体DNA，使用序列号5和6的引物，进行上述同样的PCR，鉴定染色体上的pupG基因，通过2次重组而置换为内部缺失的pupG基因(ΔpupG)的菌株(purR::spc purA::erm deoD::kanΔpupG)。这样得到的2次重组株中的一个菌株，命名为KMBS93。

[0176] GGTCTGAGCTTTGCGAACC(序列号5)

[0177] CGCCTGCAGTGCCTTTATCTAAAGCTTCC(序列号6)

[0178] (2)在来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)，缺失嘌呤操纵子阻遏物基因(purR)，琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)的重组体KMBS13(特开2004-242610号公报)中，导入pupG基因缺失的菌株，如下进行制备。

[0179] 用pKM76，转化根据Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.， 1971，56，209-221)制备的KMBS13株的感受态细胞，取得在含有2.5μg/ml的氯霉素的LB琼脂平板上生长的菌落(1次重组株)。

[0180] 将得到的1次重组株接种到10ml的LB培养基中，37℃传代培养几天，筛选含有氯霉素的LB琼脂培养基上成为氯霉素敏感性的菌落。从得到的氯霉素敏感性菌落提取染色体DNA，使用序列号5和6的引物，进行上述同样的PCR，鉴定染色体上的pupG基因，通过2次重组而置换为内部缺失的pupG基因(ΔpupG)的菌株(purR::spc purA::erm ΔpupG)。这样得到的2次重组株中的一个菌株，命名为KMBS113。

[0181] (3)pupG基因缺失株的嘌呤核苷的产生

[0182] 将pupG基因缺失株(KMBS93株和KMBS113)以及作为对照株的KMBS16，在PS培养基平板(可溶性淀粉(Soluble starch)30g/L，酵母菌提取物(Yeast extract)5g/L，多蛋白胨(Polypeptone)5g/L，琼脂(Agar)20g/L，用KOH调至pH7.0)上毫无遗漏地涂布，34℃过夜培养。将1/8平板部分的菌体，接种到500ml容量的坂口烧瓶中的20ml发酵培养基，然后，将碳酸钙加至50g/L，在34℃振摇培养。在培养开始后100小时取样，用已知的方法测定培养液中含有的肌苷以及次黄嘌呤量。对于对照株KMBS16株，培养液中多量的次黄嘌呤被检测出来，但作为pupG基因缺失株的KMBS93株和KMBS113的次黄嘌呤的蓄积量，是非常低的，不能作为HPLC峰明确检出(表1)。此外，KMBS93株和KMBS113的肌苷的蓄积，比对照株的KMBS16株的高。

[0183] [发酵培养基组成]

[0184] 葡萄糖 80g/L

[0185] KH2PO4 1g/L

[0186] NH4Cl 32g/L

[0187] 大豆提取物(豆浓(T-N))* 1.35g/L

[0188] DL-蛋氨酸 0.3g/L

[0189] L-色氨酸 0.02g/L

[0190] 腺嘌呤 0.1g/L

[0191] MgSO4 0.4g/L

[0192] FeSO4 0.01g/L

[0193] MnSO4 0.01g/L

[0194] GD113 0.01ml/L

[0195] (用KOH调至pH7.0)

[0196] 碳酸钙 50g/L

[0197] *：蛋白水解物

[0198] 表1

[0199]

[0200] *1在使用的HPLC的条件下，不能明确地检出峰。

[0201] 实施例2

[0202] (1)突变型guaB基因的导入

[0203] 在来源于上述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，缺失嘌呤操纵子阻遏物基因(purR)，琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)，嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)的重组体KMBS1113中，导入IMP脱氢酶基因guaB中的guaB(A1)突变的菌株，如下进行制备。另外，所说的guaB(A1)突变菌株是指，在序列号62的第226位置上的丙氨酸被缬氨酸置换了渗漏突变体(降低IMP脱氢酶活性的变异)。

[0204] (i)在来源于B.subtilis 168 Marburg的野生菌株的guaB基因中间插入卡那霉素抗性基因的菌株的制备

[0205] guaB基 因 上 游 区 的 扩 增，根 据 基 因 数 据 库 (data bank)(GenBank AccessionNC_000964及V01547)的信息，用具有以下的碱基序列的各34mer，50mer的PCR所用的引物制备。

[0206] cgcggatccGGCTTAACGTTCGACGATGTGCTGC(小写字母的碱基是含BamHI位点的尾端(tag)-序列号7)

[0207] gctttgcccattctatagatatattGAGTCATTGTATCGCCAGTTACACC(小写字母碱基是在pDG783(BGSC)上克隆的卡那霉素抗性基因(kan)的启动子上游区的序列，序列号8)[0208] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，使用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到guaB基因5′端区的扩增片段(约710bp)。

[0209] 在guaB基因3′端区的扩增中，根据基因数据库(GenBank AccessionNC_000964和V01547)的信息，用具有以下的碱基序列的各50mer，34mer的PCR所用的引物制备。cctagatttagatgtctaaaaagctGTGATTGTTATCGATACAGCTCACG(序列号9；小写字母的碱基是在pDG783(BGSC)上克隆的卡那霉素抗性基因(kan)的结构基因下游区的序列)

[0210] cgcgaattcGTAATCTGTACGTCATGCGGATGGC(小写字母的碱基是含有EcoRI位点的尾端，序列号10)

[0211] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到guaB基因3′端区的扩增片段(约730bp)。

[0212] 通过PCR法扩增kan基因3′端区，根据基因数据库(GenBank AccessionNo.V01277以及NC_000964)的信息，制作具有以下碱基序列各50mer的PCR用引物。 [0213] ggtgtaactggcgatacaatgactcAATATATCTATAGAATGGGCAAAGC(小写字母的碱基是用guaB上游区的序列与序列号8的3’末端区域互补设计，序列号11)

[0214] cgtgagctgtatcgataacaatcacAGCTTTTTAGACATCTAAATCTAGG(小写字母的碱基是用guaB下游区的序列与序列号9的3’末端区域互补设计的，序列号12)

[0215] 装入卡那霉素抗性基因(kan)的质粒，例如以pDG783等的质粒DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；GeneAmp PCR System Model9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含kan基因约1150bp的扩增片段。

[0216] 通过插入kan基因的guaB区域的重组PCR法扩增，上述扩增的3种DNA片段用MicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化后， 将适量混合物作为模板，用序列号7及10，进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR System Model 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到插入kan基因的guaB区域的扩增片段。

[0217] 将得到的插入kan基因的guaB区域(guaB：：kan)的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳后，将目的片段从凝胶中提取出来。使用这样纯化的DNA片段，根据Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的枯草芽孢杆菌标准株，将该株的感受态细胞转化，得到在含有2.5μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的腺嘌呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从该菌落提取染色体DNA，通过用序列号7及10的PCR法，鉴定染色体上的guaB区域为通过2次重组置换内部经过卡那霉素抗性基因置换的guaB区域(guaB：：kan)的菌株。这样得到的重组株为需要腺嘌呤菌株，将其中的一个菌株命名为KMBS193。

[0218] (ii)插入来源于枯草芽孢杆菌168Marburg的菌株的guaB突变(A1)的菌株的制备

[0219] guaB基因5′端区扩增，根据基因数据库(GenBank Accession NC_000964)的信息，制备具有以下的碱基序列各25mer，46mer的PCR用引物。

[0220] CATAAAATGTACGCATAGGCCATTC(序列号13)

[0221] TTGTATCGCCAGTTACACCAACTaCCGCGCCAACGATCAGGCGGCC(小写字母的碱基表示突变点，序列号14)

[0222] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到guaB基因5’末端区域及5′末端区的扩增片段(约1210bp)。

[0223] 然后扩增guaB基因下游区域。根据基因数据库(GenBank AccessionNC_000964)的信息，制备具有以下碱基序列各46mer，26mer的PCR用引物。

[0224] GGCCGCCTGATCGTTGGCGCGGtAGTTGGTGTAACTGGCGATACAA(小写字母的碱基表示突变点，与序列号14引物互补，序列号15)

[0225] CCTTGATCAATTGCTTCCAATAACAG(序列号16)

[0226] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR System Model9600(パ—キンエルマ—社制))，得到guaB基因3’末端区域及下游区的扩增片段(约1220bp)。

[0227] 通过导入guaB突变(A1)的guaB区域的重组PCR法的扩增，将如上述扩增的2种DNA片段进行琼脂糖电泳后，纯化目的DNA片段。以两DNA片段适量混合物为模板，用序列号13及16，进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR System Model 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到导入guaB突变(A1)的guaB区域扩增片段。 [0228] 将得到的导入guaB突变(A1)的guaB区域(guaB(A1))的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳后，将目的片段从凝胶中提取出来。使用这样纯化的DNA片段，转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS193的感受态细胞，取得最小培养基琼脂平板上生长的菌落。从这些菌落提取染色体DNA，通过用序列号13及16的PCR法，鉴定染色体上的guaB：：kan区域由2次重组置换为含有guaB(A1)突变的guaB区域的菌株。这样得到的重组株为鸟嘌呤非需要株，这样得到的菌株中的一个菌株，命名为YMBS9。

[0229] (iii)肌苷产生菌KMBS113中导入guaB突变(A1)的菌株的制备

[0230] 提 取KMBS193(guaB::kan) 的 染 色 体 DNA，用 其 转 化 通 过 Dubnau 和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS113株的感受态细胞，得到在含有2.5μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的鸟嘌呤的LB琼脂平板上生长的菌落。这样的菌株成为鸟嘌呤渗漏(グアニンリ—き—)需要，这样的菌株内的一个株命名为YMBS6(purR::spc purA::erm ΔpupGguaB::kan trpC2)。

[0231] 其 次，提 取YMBS9(guaB(A1))的 染 色 体DNA，用 其 转 化 通 过Dubnau 和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的YMBS6株的感受态细胞，得到在含有20μg/ml的腺嘌呤的最小培养基琼脂平板上生长的菌落。这样得到的菌株需要鸟嘌呤类(グアニンリ—キ—)，这样的菌株内的一株命名为YMBS2(purR::spc purA::erm guaB(A1)ΔpupG trpC2)。

[0232] (2)导入guaB突变的肌苷生产菌株的嘌呤类核酸的产生

[0233] 将导入guaB突变(A1)的肌苷产生菌株(YMBS2株)以及作为对照株的KMBS113，在PS培养基平板(可溶淀粉30g/L，酵母提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，用KOH调至pH7.0)上毫无遗漏地涂布，34℃过夜培 养。将1/8平板部分的菌体接种到500ml容量的坂口烧瓶中的20ml发酵培养基中，然后，将碳酸钙加至50g/L，在34℃振荡培养。培养开始后96小时取样，用已知方法测定培养液中含有的肌苷及次黄嘌呤量。

[0234] [发酵培养基组成]

[0235] 葡萄糖 60g/L

[0236] KH2PO4 1g/L

[0237] NH4Cl 32g/L

[0238] 大豆提取物((T-N))* 1.35g/L

[0239] DL-蛋氨酸 0.3g/L

[0240] L-色氨酸 0.02g/L

[0241] 腺嘌呤 0.1g/L

[0242] MgSO4 0.4g/L

[0243] FeSO4 0.01g/L

[0244] MnSO4 0.01g/L

[0245] GD113 0.01ml/L

[0246] (用KOH调至7.0)

[0247] 碳酸钙 50g/L

[0248] *：蛋白水解物

[0249] 表2

[0250]

[0251] 实施例3

[0252] <嘌呤操纵子扩增株的制备>

[0253] (1)

[0254] 用来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，如下进行破坏嘌呤操纵子启动子(Ppur)的菌株的制备。

[0255] (i)通过PCR法扩增Ppur上游区

[0256] 根据基因数据库(GenBank Accession NC_000964以及V01277)的信息，制备具有以下碱基序列的各34mer，50mer的PCR用引物。

[0257] cgcggatccTTATTTAGCGGCCGGCATCAGTACG(序列号17；小写字母的碱基是含有BamHI位点的尾端)

[0258] cgtttgttgaactaatgggtgctttATGGATAATGTCAACGATATTATCG(序列号18；小写字母的碱基是在pC194上克隆的氯霉素抗性基因(cat)的启动子上游区的序列)

[0259] 以B.subtilis 168 Marburg株的染色体DNA为模板，使用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有Ppur-35序列和上游的约730bp的扩增片段。

[0260] (ii)通过PCR法扩增Ppur下游区

[0261] 根据基因数据库(GenBank Accession NC_000964以及V01277)的信息，制备含有以下碱基序列各50mer，34mer的PCR用引物。

[0262] acagctccagatccatatccttcttCCTCATATAATCTTGGGAATATGGC(序列号19；小写字母的碱基是在pC194上克隆的氯霉素抗性基因(cat)的结构基因下游区的序列)

[0263] cgcggatccTCTCTCATCCAGCTTACGGGCAAGG(序列号20；小写字母的碱基是含有BamHI位点的尾端)

[0264] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，使用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有purE基因翻译启始密码子上游的约230bp和其下游约440bp的扩增片段。

[0265] (iii)通过PCR法扩增cat基因

[0266] 根据基因数据库(GenBank Accession No.V01277以及NC_000964)的信息，制备含有以下碱基序列各50mer的PCR用引物。

[0267] cgataatatcgttgacattatccatAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG(序列号21；小写字母的碱基是用Ppur上游区的序列与序列号18的3’末端区域互补设计)

[0268] gccatattcccaagattatatgaggAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT(序列号22；小写字母的碱基是用purE基因翻译起始密码子上游区的序列与序列号 19的3’末端区域互补设计的)

[0269] 装入氯霉素抗性基因(cat)的质粒，例如以pC194等的质粒DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene AmpPCR System Model9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有cat基因的约980bp的扩增片段。

[0270] (iv)通过重组PCR法扩增插入cat基因的Ppur区域

[0271] (i)～(iii)扩增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)纯化后，将适量混合物作为模板，使用序列号17及20，进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到插入cat基因的Ppur区域的扩增片段。

[0272] (v)破坏的Ppur的菌株的制备

[0273] 将(iv)中得到的插入cat基因的Ppur区域(Ppur::cat)的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳后，将目的片段从凝胶中提取出来。用这样纯化的DNA片段，转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的B.subtilis标准株的感受态细胞，得到在含有2.5μg/ml的氯霉素的LB琼脂平板上生长的菌落。从这样的菌落提取染色体DNA，通过(iv)中显示的PCR法鉴定了菌株，菌株染色体上的Ppur区域，经过2次重组置换为在内部由氯霉素抗性基因插入的Ppur区域(Ppur::cat)。这样得到的重组株为腺嘌呤需要株，其中的一种菌株命名为KMBS198。

[0274] (2)<嘌呤操纵子启动子突变株的制备>

[0275] 用来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，如下进行将Ppur的-10序列转变为共有序列TATAAT(Ppur1)，或TATGAT(Ppur3)、TAAAAT(Ppur5)的菌株的制备。

[0276] (i)通过PCR法扩增含有-10序列改变的Ppur上游区

[0277] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制备含有以下的碱基序列的序列号42表示的25mer的PCR用引物、含有3种改变型Ppur序列、38mer的改变用引物。

[0278] AATAGATATAAAGAGGTGAGTCTGC(序列号42)

[0279]

[0280] TTTTGATTTCATGTTTattataACAACGGACATGGATA(序列号23；小写 字母的碱基表示Ppur1序列)

[0281]

[0282] TTTTGATTTCATGTTTatcataACAACGGACATGGATA(序列号24；小写字母的碱基表示Ppur3序列)

[0283]

[0284] TTTTGATTTCATGTTTattttaACAACGGACATGGATA(序列号25；小写字母的碱基表示Ppur5序列)

[0285] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，使用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有Ppur和其上游序列(约1060bp)的扩增片段。

[0286] (ii)通过PCR法扩增含有-10序列改变的Ppur下游区

[0287] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制备含有以下碱基序列的序列号26表示的25mer的PCR用引物，含有3种改变型Ppur序列的、38mer的改变用引物。

[0288] GGGTAATAAGCAGCAGCTCACTTCC(序列号26)

[0289]

[0290] TATCCATGTCCGTTGTtataatAAACATGAAATCAAAA(序列号27；小写字母的碱基表示Ppur1序列，与序列号23表示的引物互补)

[0291]

[0292] TATCCATGTCCGTTGTtatgatAAACATGAAATCAAAA(序列号28；小写字母的碱基表示Ppur3序列，与序列号24表示的引物互补)

[0293]

[0294] TATCCATGTCCGTTGTtaaaatAAACATGAAATCAAAA(序列号29；小写字母的碱基表示Ppur5序列，与序列号25表示的引物互补)

[0295] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，使用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有Ppur-10序列和其下游序列(约1070bp)的扩增片段。 [0296] (iii)通过PCR法扩增含有-10序列改变的Ppur区域

[0297] (i)和(ii)中扩增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化后，以适量混合物为模板，用序列号42及26，进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到-10序列改变为Ppur1，Ppur3，或Ppur5的Ppur区域的扩增片段。

[0298] (iv)-10序列改变为Ppur1，Ppur3，或Ppur5的菌株的制备

[0299] 将(iii)中得到的含有-10序列改变的Ppur区域(Ppur1，Ppur3，或Ppur5)的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳后，将目的片段从凝胶中提取出来。用这样纯化的DNA片段，转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS198株的感受态细胞，得到在最小培养基琼脂平板上生长的菌落。从这样的菌落染色体提取DNA，通过(iii)中显示的PCR法，鉴定染色体上的Ppur::cat区域，由2次重组置换为Ppur1，Ppur3，或Ppur5的菌株。这样得到的重组株为腺嘌呤非需要株，其中的一个菌株各命名为KMBS210，KMBS211，KMBS222。

[0300] (3)嘌呤操纵子的弱化子序列缺失株的制备

[0301] 用来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)，如下进行缺失位于Ppur下游的弱化子序列的菌株的制备。图1表示缺失的序列。

[0302] (i)通过PCR法扩增部分缺失的弱化子序列及其上游区

[0303] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制备序列号17表示的PCR用引物和含有以下碱基序列的序列号30表示的52mer的引物。

[0304] GCTTTTGTTTTCAGAAAATAAAAAATAcgATATATCCATGTCAGTTTTATCG(序列号30；小写字母的碱基是通过弱化子序列的部分序列(75bp)缺失而新制成的连接(ジャンクション)) [0305] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；53℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有部分缺失的弱化子序列和其上游序列(约840bp)的扩增片段。 [0306] (ii)通过PCR法扩增部分缺失的弱化子序列及其下游区

[0307] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制备序列号26表示的PCR用引物和含有以下碱基序列的序列号31表示的52mer引物。

[0308] CGATAAAACTGACATGGATATATcgTATTTTTTATTTTCTGAAAACAAAAGC(序列号31；小写字母的碱基是通过弱化子序列的部分序列(75bp)的缺失而新形成的连接，这样的引物与序列号30表示的引物互补)

[0309] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，用上述引物用进行PCR(94℃，30秒；53℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有部分缺失的弱化子序列及其下游序列(约850bp)的扩增片段。

[0310] (iii)通过PCR法扩增含有弱化子序列部分缺失的Ppur区域

[0311] (i)和(ii)中扩增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)纯化后，以适量混合物为模板，用序列号17及26，进行PCR(94℃，30秒；53℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有弱化子序列部分缺失的Ppur区域的扩增片段。

[0312] (iv)弱化子序列部分缺失的菌株的制备

[0313] 将(iii)中得到的含有弱化子序列部分缺失的Ppur区域(Ppur-Δatt)的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中提取目的片段。用这样纯化的DNA片段，转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS198株的感受态细胞，得到在最小培养基琼脂平板上生长的菌落。从这样的菌落中提取染色体DNA，通过(iii)表示的PCR法，鉴定染色体上的Ppur：：cat区域由2次重组置换为Ppur-Δatt的菌株。这样得到的重组株为腺嘌呤非需要株，其中的一个菌株被命名为KMBS252。

[0314] (4)用来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)，将Ppur的-10序列改变为共有序列TATAAT(Ppur1)，而且部分缺失弱化子序列的菌株，如下制备。 [0315] (i)通过PCR法扩增含有-10序列改变(Ppur1)的Ppur上游区

[0316] 以(3)中制备的部分缺失弱化子序列的菌株，例如KMBS252的染色体DNA为模板，使用根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息制备的序列号42和序列号23表示的引物，进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR System Model9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有Ppur1的Ppur上游区的扩增片段(约1060bp)。

[0317] (ii)通过PCR法扩增Ppur1及部分缺失的弱化子区域及其下游区

[0318] 以(3)中制备的部分缺失弱化子序列的菌株，例如KMBS252的染色体DNA为模板，使用根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息制备的序列号26及序列号27表示的引物，进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR System Model 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到Ppur1及部分缺失的弱化子序列及其下游区的扩增片段(约990bp)。

[0319] (iii)通过PCR法扩增Ppur1及含部分缺失弱化子序列的Ppur区域

[0320] 将(i)及(ii)中扩增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)纯化后，以适量混合物为模板，使用序列号42及26，进行PCR(94℃，30秒；55℃，2分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到Ppurl及含有弱化子序列部分缺失的Ppur区域的扩增片段。

[0321] (iv)制备-10序列改变为Ppur1，并且部分缺失弱化子序列的菌株

[0322] 将(iii)中得到的Ppur1及含有部分缺失弱化子序列的Ppur区域(Ppur1-Δatt)的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳后，将目的片段从凝胶中提取出来。用这样纯化的DNA片段，转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS198株的感受态细胞，得到在最小培养基琼脂平板上生长的菌落。从这些菌落提取染色体DNA，通过(iii)显示的PCR法，鉴定染色体上的Ppur::cat区域通过2次重组置换为Ppur1-Δatt的菌株。这样得到的重组株为不需要腺嘌呤菌株，其中的一株命名为KMBS261。

[0323] (5)构建嘌呤操纵子转录活性测定用质粒

[0324] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制备具有以下碱基序列各29mer的PCR用引物。

[0325] cgcaagcttTATTTTCTGAAAACAAAAGC(序列号32；小写字母的碱基为含有HindIII位点的尾端)

[0326] cgcggatccTTTCTCTTCTCTCATCCAGC(序列号33；小写字母的碱基为含有BamHI位点的尾端)

[0327] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有purE结构基因的一部分(445 bp)，及其上游的SD序列的区域(40bp)的扩增片段。

[0328] 将PCR扩增片段，通过MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化，用HindIII和BamHI限制处理。用纯化的DNA片段，与该酶处理的pMutin4(Vagner，V.，et.al.，Microbiology，1998，144，3097-3104)的lacZ的上游，用T4DNA连接酶连结，得到pKM191。pKM191含有purE结构基因(445bp)的一部分，而它的上游区(40bp)包含SD序列。

[0329] (6)制备嘌呤操纵子转录活性测定用菌株

[0330] 嘌呤操纵子转录活性测定用菌株的构建如下进行。

[0331] (i)导入Ppur破坏的菌株的制备

[0332] 提 取KMBS198(Ppur::cat) 的 染 色 体 DNA，用 其 转 化 通 过 Dubnau 和Davidoff-Abelson的方法 (J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的 带有purR缺 失(purR:;spc)的KMBS4株(特开2004-242610)，得到在含有2.5μg/ml的氯霉素的LB琼脂平板上生长的菌落。这样得到的重组株缺失purR，而且为腺嘌呤需要株，将其中的一株命名KMBS278。

[0333] (ii)具有purR缺失及改变型Ppur区域的菌株的制备

[0334] 提取KMBS210，KMBS211，KMBS222，KMBS252，KMBS261株染色体的DNA，用其转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS278株的感受态细胞，得到在最小培养基琼脂平板上生长，而且在LB琼脂平板上大观霉素抗性的菌落。从这些菌落提取染色体DNA，通过(1)(iv)中所示的PCR法，鉴定染色体上的Ppur::cat通过2次重组置换为改变型Ppur区域的菌株。其中的一株各命名为KMBS283，KMBS284，KMBS285，KMBS286，KMBS287。

[0335] (iii)导入pKM191的菌株的制备

[0336] 使用 嘌 呤 操 纵子 转 录 活性 测 定 用质 粒pKM191，转 化 通过 Dubnau和 Davidoff-Abelson 的 方 法 (J.Mol.Biol.，1971，56，209-221) 制 备 的B.subtilis168Marburg株，KMBS4、KMBS283、KMBS284、KMBS285、KMBS286、KMBS287的感受态细胞，得到在含有2.5μg/ml氯霉素LB琼脂平板上生长的菌落。这样得到的菌落，是含有pKM191的lacZ的purE基因被置换为野生型purE基因的1次重组株，lacZ通过Ppur来表达，成为含有80μg/ml的X-Gal的LB琼脂平板上的蓝色菌落。其中的一株各命名为KMBS292，KMBS295，KMBS296，KMBS297，KMBS298，KMBS299，KMBS300。

[0337] (7)嘌呤操纵子转录活性测定

[0338] 用(6)(iii)中制备的菌株，通过lacZ进行Ppur转录活性测定。即，对照株，是具有168Marburg株的背景(バツクグランド)KMBS292，或具有嘌呤操纵子阻遏物PurR基因缺失背景的KMBS295。其他的菌株，为purR缺失的背景下，改变-10序列的菌株(KMBS296，KMBS297，KMBS298)、弱化子序列部分缺失的菌株(KMBS299)、同时导入-10序列的共有序列化(Ppur1)与弱化子序列部分缺失的菌株(KMBS300)。

[0339] 将这些6株在含有鸟嘌呤(20mg/L)的LB培养基(20ml)中，37℃下培养至指数增长后期(OD600＝1.1-1.4)，取样适量培养液，进行β-半乳糖甘酶活性测定。β-半乳糖甘酶活性测定，根据Fouet等(Fouet，A.and Sonenshein，A.LJ.Bacteriol.，1990，172，835-844)的方法进行。结果在图2中表示。与168M株相比，ΔpurR株的活性增加约4.5倍。并且，由于-10序列改变成为Ppur1，增加约3倍。此外，通过弱化子序列的部分缺失，活性达到约15倍，有两方面的变异的菌株，活性增加至26.5倍。

[0340] 实施例4

[0341] <改变型Ppur区域导入株的构建和评价>

[0342] (1)用来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，使缺失嘌呤操纵子阻遏物基因(purR)、琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)，使用在IMP脱氢酶基因(guaB)中导入鸟嘌呤类(リ—キ—)需要突变guaB(A1)的重组体YMBS2，如下进行改变嘌呤操纵子引物并且部分缺失弱化子序列的菌株的制备。 [0343] 提取枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA，使用其转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS113株(purR::spc purA::ermΔpupG trpC2)的感受态细胞，得到在最小培养基琼脂平板上生长(即腺嘌呤非需要)，并且为LB琼脂平板上大观霉素抗性的菌落。从这些菌落提取染色体DNA，通过实施例1(1)(iv)中所示的PCR法，鉴定ΔpupG的菌株。其中的一株被命名为KMBS180(purR::spcΔpupGtrpC2)。

[0344] 接着，提取KMBS198株的染色体DNA，用其转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS180株 的感受态细胞，取得在含2.5μg/ml的氯霉素的LB琼脂平板上生长的菌落。从这些菌落提取染色体DNA，通过实施例3(1)(iv)中所示的PCR法，鉴定染色体上的Ppur区域通过2次重组置换为Ppur::cat的菌株。这样的菌株需要腺嘌呤，其中的一株被命名为KMBS216(Ppur::cat purR::spcΔpupG trpC2)。

[0345] 接着，提取KMBS252(Ppur-Δatt)的染色体DNA，用其转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS216株的感受态细胞，得到在最小培养基琼脂平板上生长的菌落。从这些菌落提取染色体DNA，通过实施例3(1)(iv)中所示的PCR法，鉴定染色体上的Ppur::cat通过2次重组置换为Ppur-Δatt区域的菌株。这样的菌株为腺嘌呤非需要，其中的一株被命名为KMBS264(Ppur-Δatt purR::spcΔpupG trpC2)。对于导入Ppur1-Δatt的菌株KMBS261，也依照同样的程序得到。

[0346] 接着，提取KMBS9(purA::erm trpC2；特开2004-242610号)的染色体DNA，用其转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS264株或KMBS261株的感受态细胞，得到在含有0.5μg/ml的红霉素的LB琼脂平板上生长的菌落。这样的菌株为腺嘌呤非需要，其中的一株被命名为KMBS265(Ppur-Δatt purR::spc purA::ermΔpupGtrpC2) 和 KMBS267(Ppur1-Δatt purR::spc purA::ermΔpupG trpC2)。

[0347] 接着，提取KMBS193(guaB::kan)的染色体DNA，用其转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS265株或KMBS267株的感受态细胞，得到在含有2.5μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的鸟嘌呤的LB琼脂平板上生长的菌落。这样的菌株为鸟嘌呤需要，其中的一株被命名为KMBS270(Ppur-Δatt purR::spc purA::erm guaB::kanΔpupG trpC2) 和 KMBS271(Ppur1-Δatt purR::spc purA::erm guaB::kanΔpupGtrpC2)。

[0348] 最 后，提 取YMBS2(guaB(A1))的 染 色 体DNA，用 其 转 化 通 过Dubnau 和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS270株或KMBS271株的感受态细胞，得到在含有20μg/ml的腺嘌呤的最小培养基琼脂平板上生长的菌落。这样的菌株需要鸟嘌呤类，其中的一株被命名为KMBS279(Ppur-Δatt purR::spc purA::ermguaB(A1)ΔpupG trpC2) 和 KMBS280(Ppur1-Δatt purR::spc purA::erm guaB(A1)ΔpupG trpC2)。

[0349] (2)具有改变型Ppur区域的菌株的嘌呤核苷产生的确认

[0350] 将具有改变型Ppur区域的菌株(KMBS279株和KMBS280)以及对照株的YMBS2，在PS培养基平板(可溶淀粉30g/L，酵母菌提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，用KOH调至pH7.0)上毫无遗漏地涂布，34℃过夜培养。将1/8平板部分的菌体接种在500ml容量的坂口烧瓶中的20ml发酵培养基中，然后，将碳酸钙加至50g/L，34℃振摇培养。培养开始后96小时取样，用已知的方法测定培养液中含有的肌苷和次黄嘌呤的量。

[0351] [发酵培养基组成]

[0352] 葡萄糖 60g/L

[0353] KH2PO4 1g/L

[0354] NH4Cl 32g/L

[0355] 大豆提取物((T-N))* 1.35g/L

[0356] DL-蛋氨酸 0.3g/L

[0357] L-色氨酸 0.02g/L

[0358] 腺嘌呤 0.1g/L

[0359] 鸟嘌呤 0.05g/L

[0360] MgSO4 0.4g/L

[0361] FeSO4 0.01g/L

[0362] MnSO4 0.01g/L

[0363] GD113 0.01ml/L

[0364] (用KOH调至pH7.0)

[0365] 碳酸钙 50g/L

[0366] *：蛋白水解物

[0367] 表3

[0368]

[0369] 实施例5

[0370]

[0371] (1)用来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)，使缺失嘌呤操纵子阻遏物基因(purR)、琥珀酰-AMP合成基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)，并且在IMP脱氢酶基因(guaB)中导入guaB突变(A1)，并且使用改变了嘌呤操纵子启动子区域的重组体KMBS280，制备改变PRPP合成酶基因(prs)的SD序列的菌株，如下进行。 [0372] (i)通过PCR法扩增含有SD序列改变的SD序列上游区

[0373] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制备含有以下的碱基序列的序列号34中所示的34mer的PCR用引物，含有3种的改变型Ppur序列，46mer的改变用引物。

[0374] cgcggatccAACATACACAAAGAGAAGCGAAAGC(小写字母的碱基为含有BamHI位点的尾端的序列号34)

[0375]

[0376] GATTAGACATGGATAAA TTTAGGATTATTTTTTATGAA(小写字母的碱基为突变点，框内序列表示改变的SD序列1的序列号35)

[0377]

[0378] GATTAGACATGGATAAA TTTAGGATTATTTTTTATGAA(小写字母的碱基为突变点，框内序列表示改变的SD序列2的序列号36)

[0379]

[0380] GATTAGACATGGATAAA TTTAGGATTATTTTTTATGAA(小写字母的碱基为突变点，框内序列表示改变的SD序列3的序列号37)

[0381] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1.5分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有prs起始密码子上游序列(约1040bp)和下游序列(10bp)的扩增片段。

[0382] (ii)通过PCR法扩增含有SD序列改变的SD序列下游区

[0383] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制备含有以下的碱基序列的序列号38中所示的34mer的PCR用引物，含有3种的改变型SD序列的46mer的改变用引物。

[0384] cgcggatccGGTTTAGCTGAACAGATAGCTGACTGATTGC(小写字母的碱基为含有BamHI位点的尾端的序列号38)

[0385]

[0386] TTCATAAAAAATAATCCTAAA TTTATCCATGTCTAATC(小写字母的碱基为突变点，框内序列表示改变的SD序列1，该引物是与序列号35互补的序列号为39) [0387]

[0388] TTCATAAAAAATAATCCTAAA TTTATCCATGTCTAATC(小写字母的碱基为突变点，框内序列表示改变SD序列2，该引物是与序列号36互补的序列号为40) [0389]

[0390] TTCATAAAAAATAATCCTAAA TTTATCCATGTCTAATC(小写字母的碱基为突变点，框内序列表示改变SD序列3，该引物是与序列号37互补的序列号为41) [0391] 以B.subtilis 168 Marburg株的染色体DNA为模板，使用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1.5分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有prs起始密码子上游序列(36bp)和下游序列(约960bp)的扩增片段。

[0392] (iii)通过PCR法扩增含有改变型SD序列区域

[0393] 将(i)及(ii)扩增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)纯化后，以适量的混合物为模板，用序列号34及38，进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2.5分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到SD序列改变为SD序列1、2或3(SD1，SD2，SD3)的DNA的扩增片段。

[0394] (iv)含有改变型SD序列的区域的克隆

[0395] 将含有改变型SD序列(SD1，SD2，SD3)的区域的DNA片段纯化，将用BamHI处理的DNA片段，用该酶处理，与通过牛小肠磷酸酶而脱磷酸化的染色体重组用的载体pJPM1(Mueller et.al.，J.Bacteriol.，1992，174，4361-4373)用T4DNA连接酶进行连接，得到pKM196(SD1)、pKM197(SD2)、pKM198(SD3)。

[0396] (v)导入改变型SD序列的肌苷产生菌株的制备

[0397] 用得到的质粒pKM196(SD1)、pKM197(SD2)或pKM198(SD3)，转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS280株的感受态细胞，得到在含有2.5μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上生长的菌落(1次重组)。

[0398] 将得到的1次重组株接种到10mlLB培养基中，37℃进行传代培养几天，筛选LB琼脂培养基上氯霉素敏感性的菌落。提取得到的氯霉素敏感性菌落的染色体DNA，用序列号34和38的引物进行上述同样的PCR，通过解析DNA序列，鉴定染色体上的prs基因的SD序列，通过2次重组置换为改变型SD序列的菌株。这样得到的2次重组株内的一株被命名为KMBS310(SD1)，KMBS318(SD2)，KMBS322(SD3)。

[0399] (2)导入改变型SD序列的肌苷产生菌株的嘌呤核苷的产生

[0400] 将导入了改变型SD序列SD1、SD2或SD3的肌苷产生菌株(KMBS310株、KMBS318株和KMBS322株)以及对照株KMBS280，在PS培养基平板(可溶淀粉30g/L，酵母菌提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，用KOH调至pH7.0)上毫无遗漏地涂布，34℃下过夜培养。
将1/8平板部分的菌体，接种到500ml容量的坂口烧瓶中的20ml发酵培养基中，然后，将碳酸钙加至50g/L，34℃下振摇培养。培养开始后120小时取样，用已知方法测定培养液中含有的肌苷及次黄嘌呤量。

[0401] [发酵培养基组成]

[0402] 葡萄糖 60g/L

[0403] KH2PO4 1g/L

[0404] NH4Cl 32g/L

[0405] 大豆提取物((T-N))* 1.35g/L

[0406] DL-蛋氨酸 0.3g/L

[0407] L-色氨酸 0.02g/L

[0408] 腺嘌呤 0.1g/L

[0409] 鸟苷 0.075g/L

[0410] MgSO4 0.4g/L

[0411] FeSO4 0.01g/L

[0412] MnSO4 0.01g/L

[0413] GD113 0.01ml/L

[0414] (用KOH调至pH7.0)

[0415] 碳酸钙 50g/L

[0416] *：蛋白水解物

[0417] 表4

[0418]

[0419] 实施例6

[0420] 氧化的磷酸戊糖途径酶活性提高的菌株的构建

[0421] (1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性提高株的构建

[0422] 用来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)，使缺失嘌呤操纵子阻遏物基因(purR)，琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)，嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG和deoD)，而且在IMP脱氢酶基因(guaB)中导入guaB突变(A1)，而且用改变嘌呤操纵子启动子区域及PRPP合成酶基因(prs)的SD序列的重组体，导入装入编码氧化磷酸戊糖途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf的质粒菌株的制备，如下进行。

[0423] (i)通过PCR扩增zwf结构基因及其上游区

[0424] 根 据 基 因 数 据 库 (GenBank Accession No.NC_000964CAB14317.glucose-6-phospha...[gi：2634820])的信息，制备含有以下碱基序列各29mer的PCR用引物。

[0425] cgcggatccGCCTCTGAAAAGAACAATCC(序列号43；小写字母的碱基为含有BamHI位点的尾端)

[0426] cgcggatccAAGCTCTTAAGCTTTGGGGG(序列号44；小写字母碱基为含有BamHI位点的尾端)

[0427] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，使用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有zwf结构基因及其上游区(约160bp)的扩增片段。 [0428] (ii)zwf结构基因及其上游区的克隆

[0429] 将zwf结构基因及其上游区的DNA片段纯化，将BamHI处理过的DNA片段用该酶处理，与使用通过牛肠磷酸酶(Calf intestinal phosphatase)脱磷酸化的E.coli-Bacillus的穿梭载体(シャトルベクタ—)pHY300PLK(ャクルト社制)用T4DNA连接酶连结，得到扩增的zwf基因用质粒。

[0430] (iii)导入zwf基因扩增用质粒的肌苷产生菌株的制备

[0431] 用得到的质粒，或者pHY300PLK载体，转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的实施例5中记载的肌苷产生菌KMBS321株的感受态细胞，得到含有12.5μg/ml的四环素的LB琼脂平板上生长的菌落。导入装有zwf的质粒的菌株内的一株命名为TABS125，导入pHY300PLK的菌株的一株命名为TABS100。确认葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的提高，用以下的方法进行。

[0432] 葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf基因产物)活性测定法

[0433] 反应溶液

[0434] 50mM Tris-HCl(pH7.6)

[0435] 10mM MgSO4·7H2O

[0436] 0.3mM NADP

[0437] 4mM葡萄糖6-磷酸盐

[0438] 酶溶液

[0439] 制备上述反应溶液(1ml)，开始37℃反应。在340nm的吸收测定生成的NADPH的浓度变化。

[0440] (iv)导入装有zwf的质粒的肌苷生产菌株的嘌呤类核酸生产

[0441] 将TABS125和TABS100，在含有12.5μg/ml的四环素的PS培养基平板(可溶淀粉30g/L，酵母菌提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，用 KOH调至pH7.0)上毫无遗漏地涂布，34℃过夜培养。将1/8平板部分的菌体接种在500ml容量的坂口烧瓶中的20ml发酵培养基中，然后，将碳酸钙加至50g/L，34℃振摇培养。在培养开始后120时间取样，用已知的方法测定培养液中含有的肌苷及次黄嘌呤量(表5)。用这样的方法得到提高嘌呤核苷产生能力的菌株。

[0442] [发酵培养基组成例]

[0443] 葡萄糖 60g/L

[0444] KH2PO4 1g/L

[0445] NH4Cl 32g/L

[0446] 大豆提取物((T-N))* 1.35g/L

[0447] 酵母提取物 1g/L

[0448] DL-蛋氨酸 0.3g/L

[0449] L-色氨酸 0.02g/L

[0450] 腺嘌呤 0.1g/L

[0451] 鸟苷 0.075g/L

[0452] MgSO4 0.4g/L

[0453] FeSO4 0.01g/L

[0454] MnSO4 0.01g/L

[0455] GD113 0.01ml/L

[0456] (用KOH调至pH7.0)

[0457] 碳酸钙 50g/L

[0458] *：蛋白水解物

[0459] 表5

[0460]

[0461] (2)核糖-5-磷酸异构酶活性增强株的构建

[0462] 用来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)，使缺失嘌呤操纵子阻遏物基因(purR)，琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)，嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG和deoD)，而且在IMP脱氢酶基因(guaB)中导入guaB突变(A1)，而且使用改变嘌呤操纵子启动子区域及PRPP合成酶基因(prs)的SD序列的重组体，制备导入装有氧化磷酸戊糖途径基因ywlF的质粒的菌株，如下进行。

[0463] (i)通过PCR扩增ywlF结构基因及其上游区

[0464] 根据基因数据库(GenBank Accession No.NC_000964CAB15709.[gi：2636217])的信息，制备含有以下碱基序列各34mer的PCR用引物。

[0465] cgcgaattcGTAGATAAGTTGTCAGAAAATCTGC(序列号45；小写字母的碱基为含有EcoRI位点的尾端)

[0466] cgcgaattcTGTTTCAACTCATTCATTAAACAGC(序列号46；小写字母的碱基为含有EcoRI位点的尾端)

[0467] 以枯草芽孢杆菌168Marburg株的染色体DNA为模板，用上述引物进行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循环；Gene Amp PCR SystemModel9600(パ—キンエルマ—社制))，得到含有ywlF结构基因及其上游区(约160bp)的扩增片段。

[0468] (ii)ywlF结构基因及其上游区的克隆

[0469] 将ywlF结构基因及其上游区的DNA片段纯化，EcoRI处理过的DNA片段用同酶处理，与通过牛小肠磷酸酶而脱磷酸化的大肠杆菌-芽孢杆菌(E.coli-Bacillus)的穿梭载体pHY300PLK(ャクルト社制)用T4DNA连接酶连接，得到ywlF基因扩增用质粒。 [0470] (iii)导入了ywlF基因扩增用质粒的肌苷产生菌株的制备

[0471] 用得到的质粒，或pHY300PLK，转化KMBS321株的感受态细胞，得到在含有12.5μg/ml的四环素的LB琼脂平板上生长的菌落。导入装有ywlF的质粒的菌株的一株命名为TABS102。把导入了对照的pHY300PLK的菌株中的一个命名为TABS100。

[0472] KMBS321株为通过以下方法进行制备。

[0473] 根据Fouet和Sonenshein的方法(J.Bacteriol.，1990，172，835-844)，使用由KMBS16(purR::spc purA::erm deoD::kan；US2004-0166575A)制备得到的基因组DNA，转化枯草杆菌[(B.subtilis)168Marburg株]的感受态细胞，刮取在含有5μg/ml的卡那霉素的LB琼脂板上生长的菌落。在如此培育而得到的几个菌落中筛选未达到大观霉素抗药性或红霉素抗药性的菌落，将其中的一株命名为KMBS5(deoD::kan)。

[0474] 根据Fouet和Sonenshein的方法(J.Bacteriol.，1990，172，835-844)，使用由KMBS5(deoD::kan)制备得到的基因组DNA，转化上述KMBS310株的感受态细胞，刮取在含有5μg/ml的卡那霉素和20μg/ml鸟嘌呤的LB琼脂板上生长的菌落。在如此培育而得到的几个菌落中筛选菌落，野生型deoD基因被deoD::kan置换且来源于KMBS310的所有变异当确认了未被置换为野生型序列的转化体时，将其中的一株命名为KMBS321。

[0475] 确认提高核糖-5-磷酸异构酶活性，通过以下的方法进行。

[0476] 核糖5-磷酸异构酶(ywlF基因产物)活性测定法

[0477] 反应溶液

[0478] 50mM HEPES(pH7.5)

[0479] 0.1M NaCl

[0480] 10mM核糖5-磷酸盐

[0481] 酶溶液

[0482] 制备上述的反应溶液(1ml)，在37℃开始反应。在290nm吸收测定生成的核酮糖5-磷酸盐的浓度变化。

[0483] (iv)导入装有ywlF的质粒的肌苷产生菌株的嘌呤类核酸产生

[0484] 将TABS100或TABS102株，在含12.5μg/ml的四环素的PS培养基平板(可溶淀粉30g/L，酵母菌提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，用KOH调至pH7.0)上毫无遗漏地涂布，在34℃过夜培养。将1/8平板部分的菌体，接种到500ml容量的坂口烧瓶中的20ml发酵培养基中，然后，将碳酸钙加至50g/L，34℃振荡培养。培养开始后120小时取样，用已知的方法测定培养液中含有的肌苷及次黄嘌呤量(表6)。核糖-5-磷酸异构酶活性增强株，与非改变株相比，提高肌苷产生能力。

[0485] [发酵培养基组成例]

[0486] 葡萄糖 60g/L

[0487] KH2PO4 1g/L

[0488] NH4Cl 32g/L

[0489] 大豆提取物(T-N)* 1.35g/L

[0490] 酵母提取物 1g/L

[0491] DL-蛋氨酸 0.3g/L

[0492] L-色氨酸 0.02g/L

[0493] 腺嘌呤 0.1g/L

[0494] 鸟苷 0.075g/L

[0495] MgSO4 0.4g/L

[0496] FeSO4 0.01g/L

[0497] MnSO4 0.01g/L

[0498] GD113 0.01ml/L

[0499] (用KOH调至pH7.0)

[0500] 碳酸钙 50g/L

[0501] *：蛋白水解物

[0502] 表6

[0503]

[0504] 产业上的利用可能性

[0505] 通过使用本发明的芽孢杆菌属细菌，提高嘌呤核苷及/或嘌呤核苷酸的产生效率。

[0506] 序列表

[0507] <110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

[0508] <120>嘌呤类物质产生菌及嘌呤类物质的制备方法

[0509] <130>OP-C6032

[0510] <150>JP2005-067560

[0511] <151>2005-03-10

[0512] <150>JP2005-280186

[0513] <151>2005-09-27

[0514] <160>62

[0515] <170>PatentIn version3.1

[0516] <210>1

[0517] <211>20

[0518] <212>DNA

[0519] <213>人工序列

[0520] <220>

[0521] <223>引物

[0522] <400>1

[0523]

[0524] <210>2

[0525] <211>29

[0526] <212>DNA

[0527] <213>人工序列

[0528] <220>

[0529] <223>引物

[0530] <400>2

[0531]

[0532] <210>3

[0533] <211>20

[0534] <212>DNA

[0535] <213>人工序列

[0536] <220>

[0537] <223>引物

[0538] <400>3

[0539]

[0540] <210>4

[0541] <211>29

[0542] <212>DNA

[0543] <213>人工序列

[0544] <220>

[0545] <223>引物

[0546] <400>4

[0547]

[0548] <210>5

[0549] <211>19

[0550] <212>DNA

[0551] <213>人工序列

[0552] <220>

[0553] <223>引物

[0554] <400>5

[0555]

[0556] <210>6

[0557] <211>29

[0558] <212>DNA

[0559] <213>人工序列

[0560] <220>

[0561] <223>引物

[0562] <400>6

[0563]

[0564] <210>7

[0565] <211>34

[0566] <212>DNA

[0567] <213>人工序列

[0568] <220>

[0569] <223>引物

[0570] <400>7

[0571]

[0572] <210>8

[0573] <211>50

[0574] <212>DNA

[0575] <213>人工序列

[0576] <220>

[0577] <223>引物

[0578] <400>8

[0579]

[0580] <210>9

[0581] <211>50

[0582] <212>DNA

[0583] <213>人工序列

[0584] <220>

[0585] <223>引物

[0586] <400>9

[0587]

[0588] <210>10

[0589] <211>34

[0590] <212>DNA

[0591] <213>人工序列

[0592] <220>

[0593] <223>引物

[0594] <400>10

[0595]

[0596] <210>11

[0597] <211>50

[0598] <212>DNA

[0599] <213>人工序列

[0600] <220>

[0601] <223>引物

[0602] <400>11

[0603]

[0604] <210>12

[0605] <211>50

[0606] <212>DNA

[0607] <213>人工序列

[0608] <220>

[0609] <223>引物

[0610] <400>12

[0611]

[0612] <210>13

[0613] <211>25

[0614] <212>DNA

[0615] <213>人工序列

[0616] <220>

[0617] <223>引物

[0618] <400>13

[0619]

[0620] <210>14

[0621] <211>46

[0622] <212>DNA

[0623] <213>人工序列

[0624] <220>

[0625] <223>引物

[0626] <400>14

[0627]

[0628] <210>15

[0629] <211>46

[0630] <212>DNA

[0631] <213>人工序列

[0632] <220>

[0633] <223>引物

[0634] <400>15

[0635]

[0636] <210>16

[0637] <211>26

[0638] <212>DNA

[0639] <213>人工序列

[0640] <220>

[0641] <223>引物

[0642] <400>16

[0643]

[0644] <210>17

[0645] <211>34

[0646] <212>DNA

[0647] <213>人工序列

[0648] <220>

[0649] <223>引物

[0650] <400>17

[0651]

[0652] <210>18

[0653] <211>50

[0654] <212>DNA

[0655] <213>人工序列

[0656] <220>

[0657] <223>引物

[0658] <400>18

[0659]

[0660] <210>19

[0661] <211>50

[0662] <212>DNA

[0663] <213>人工序列

[0664] <220>

[0665] <223>引物

[0666] <400>19

[0667]

[0668] <210>20

[0669] <211>34

[0670] <212>DNA

[0671] <213>人工序列

[0672] <220>

[0673] <223>引物

[0674] <400>20

[0675]

[0676] <210>21

[0677] <211>50

[0678] <212>DNA

[0679] <213>人工序列

[0680] <220>

[0681] <223>引物

[0682] <400>21

[0683]

[0684] <210>22

[0685] <211>50

[0686] <212>DNA

[0687] <213>人工序列

[0688] <220>

[0689] <223>引物

[0690] <400>22

[0691]

[0692] <210>23

[0693] <211>38

[0694] <212>DNA

[0695] <213>人工序列

[0696] <220>

[0697] <223>引物

[0698] <400>23

[0699]

[0700] <210>24

[0701] <211>38

[0702] <212>DNA

[0703] <213>人工序列

[0704] <220>

[0705] <223>引物

[0706] <400>24

[0707]

[0708] <210>25

[0709] <211>38

[0710] <212>DNA

[0711] <213>人工序列

[0712] <220>

[0713] <223>引物

[0714] <400>25

[0715]

[0716] <210>26

[0717] <211>25

[0718] <212>DNA

[0719] <213>人工序列

[0720] <220>

[0721] <223>引物

[0722] <400>26

[0723]

[0724] <210>27

[0725] <211>38

[0726] <212>DNA

[0727] <213>人工序列

[0728] <220>

[0729] <223>引物

[0730] <400>27

[0731]

[0732] <210>28

[0733] <211>38

[0734] <212>DNA

[0735] <213>人工序列

[0736] <220>

[0737] <223>引物

[0738] <400>28

[0739]

[0740] <210>29

[0741] <211>38

[0742] <212>DNA

[0743] <213>人工序列

[0744] <220>

[0745] <223>引物

[0746] <400>29

[0747]

[0748] <210>30

[0749] <211>52

[0750] <212>DNA

[0751] <213>人工序列

[0752] <220>

[0753] <223>引物

[0754] <400>30

[0755]

[0756] <210>31

[0757] <211>52

[0758] <212>DNA

[0759] <213>人工序列

[0760] <220>

[0761] <223>引物

[0762] <400>31

[0763]

[0764] <210>32

[0765] <211>29

[0766] <212>DNA

[0767] <213>人工序列

[0768] <220>

[0769] <223>引物

[0770] <400>32

[0771]

[0772] <210>33

[0773] <211>29

[0774] <212>DNA

[0775] <213>人工序列

[0776] <220>

[0777] <223>引物

[0778] <400>33

[0779]

[0780] <210>34

[0781] <211>34

[0782] <212>DNA

[0783] <213>人工序列

[0784] <220>

[0785] <223>引物

[0786] <400>34

[0787]

[0788] <210>35

[0789] <211>46

[0790] <212>DNA

[0791] <213>人工序列

[0792] <220>

[0793] <223>引物

[0794] <400>35

[0795]

[0796] <210>36

[0797] <211>46

[0798] <212>DNA

[0799] <213>人工序列

[0800] <220>

[0801] <223>引物

[0802] <400>36

[0803]

[0804] <210>37

[0805] <211>46

[0806] <212>DNA

[0807] <213>人工序列

[0808] <220>

[0809] <223>引物

[0810] <400>37

[0811]

[0812] <210>38

[0813] <211>40

[0814] <212>DNA

[0815] <213>人工序列

[0816] <220>

[0817] <223>引物

[0818] <400>38

[0819]

[0820] <210>39

[0821] <211>46

[0822] <212>DNA

[0823] <213>人工序列

[0824] <220>

[0825] <223>引物

[0826] <400>39

[0827]

[0828] <210>40

[0829] <211>46

[0830] <212>DNA

[0831] <213>人工序列

[0832] <220>

[0833] <223>引物

[0834] <400>40

[0835]

[0836] <210>41

[0837] <211>46

[0838] <212>DNA

[0839] <213>人工序列

[0840] <220>

[0841] <223>引物

[0842] <400>41

[0843]

[0844] <210>42

[0845] <211>25

[0846] <212>DNA

[0847] <213>人工序列

[0848] <220>

[0849] <223>引物

[0850] <400>42

[0851]

[0852] <210>43

[0853] <211>29

[0854] <212>DNA

[0855] <213>人工序列

[0856] <220>

[0857] <223>引物

[0858] <400>43

[0859]

[0860] <210>44

[0861] <211>29

[0862] <212>DNA

[0863] <213>人工序列

[0864] <220>

[0865] <223>引物

[0866] <400>44

[0867]

[0868] <210>45

[0869] <211>34

[0870] <212>DNA

[0871] <213>人工序列

[0872] <220>

[0873] <223>引物

[0874] <400>45

[0875]

[0876] <210>46

[0877] <211>34

[0878] <212>DNA

[0879] <213>人工序列

[0880] <220>

[0881] <223>引物

[0882] <400>46

[0883]

[0884] <210>47

[0885] <211>1470

[0886] <212>DNA

[0887] <213>枯草芽胞杆菌

[0888] <220>

[0889] <221>CDS

[0890] <222>(1)..(1470)

[0891] <223>

[0892] <400>47

[0893]

[0894]

[0895] <210>48

[0896] <211>489

[0897] <212>PRT

[0898] <213>枯草芽胞杆菌

[0899] <400>48

[0900]

[0901]

[0902] <210>49

[0903] <211>450

[0904] <212>DNA

[0905] <213>枯草芽胞杆菌

[0906] <220>

[0907] <221>CDS

[0908] <222>(1)..(450)

[0909] <223>

[0910] <400>49

[0911]

[0912]

[0913] <210>50

[0914] <211>149

[0915] <212>PRT

[0916] <213>枯草芽胞杆菌

[0917] <400>50

[0918]

[0919] <210>51

[0920] <211>858

[0921] <212>DNA

[0922] <213>枯草芽胞杆菌

[0923] <220>

[0924] <221>CDS

[0925] <222>(1)..(858)

[0926] <223>

[0927] <400>51

[0928]

[0929]

[0930] <210>52

[0931] <211>285

[0932] <212>PRT

[0933] <213>枯草芽胞杆菌

[0934] <400>52

[0935]

[0936] <210>53

[0937] <211>816

[0938] <212>DNA

[0939] <213>枯草芽胞杆菌

[0940] <220>

[0941] <221>CDS

[0942] <222>(1)..(816)

[0943] <223>

[0944] <400>53

[0945]

[0946]

[0947] <210>54

[0948] <211>271

[0949] <212>PRT

[0950] <213>枯草芽胞杆菌

[0951] <400>54

[0952]

[0953] <210>55

[0954] <211>702

[0955] <212>DNA

[0956] <213>枯草芽胞杆菌

[0957] <220>

[0958] <221>CDS

[0959] <222>(1)..(702)

[0960] <223>

[0961] <400>55

[0962]

[0963] <210>56

[0964] <211>233

[0965] <212>PRT

[0966] <213>枯草芽胞杆菌

[0967] <400>56

[0968]

[0969] <210>57

[0970] <211>954

[0971] <212>DNA

[0972] <213>枯草芽胞杆菌

[0973] <220>

[0974] <221>CDS

[0975] <222>(1)..(954)

[0976] <223>

[0977] <400>57

[0978]

[0979]

[0980]

[0981] <210>58

[0982] <211>317

[0983] <212>PRT

[0984] <213>枯草芽胞杆菌

[0985] <400>58

[0986]

[0987]

[0988] <210>59

[0989] <211>17

[0990] <212>DNA

[0991] <213>人工序列

[0992] <220>

[0993] <223>引物

[0994] <400>59

[0995]

[0996] <210>60

[0997] <211>19

[0998] <212>DNA

[0999] <213>人工序列

[1000] <220>

[1001] <223>引物

[1002] <400>60

[1003]

[1004] <210>61

[1005] <211>1467

[1006] <212>DNA

[1007] <213>枯草芽胞杆菌

[1008] <220>

[1009] <221>CDS

[1010] <222>(1)..(1464)

[1011] <223>

[1012] <400>61

[1013]

[1014]

[1015]

[1016] <210>62

[1017] <211>488

[1018] <212>PRT

[1019] <213>枯草芽胞杆菌

[1020] <400>62

[1021]

[1022]