内皮细胞特异性抗体及其用途

摘要

本发明提供的方法和组合物涉及内皮细胞增殖，迁移，和小管形成的抑制，因此用于治疗血管发生相关疾病，包括癌症，多囊性肾病，糖尿病视网膜病，类风湿性关节炎，和牛皮癣。公开了通过施用对于肿瘤内皮标记物(TEMs)特异性的抗体来抑制内皮细胞增殖，迁移，和小管形成的方法。还公开了通过施用在这样的方法中有用的TEM-特异性抗体和抗体组合物来抑制血管发生和肿瘤生长的方法。

权利要求

1.与人肿瘤内皮标记物(TEM)1的氨基酸33-684内的表位特异性结合的抗体或者其片段在制备用于抑制细胞增殖的药物中的用途，其中所述片段选自Fab片段、F(ab’)2片段和单链可变区。

2.与人TEM 1的氨基酸33-684内的表位特异性结合的抗体或者其生物活性片段在制备用于抑制细胞迁移的药物中的用途，其中所述片段选自Fab片段、F(ab’)2片段和单链可变区。

3.与人TEM 1的氨基酸33-684内的表位特异性结合的抗体或者其片段在制备用于抑制内皮管形成的药物中的用途，其中所述片段选自Fab片段、F(ab’)2片段和单链可变区。

4.与人TEM 1的氨基酸33-684内的表位特异性结合的抗体或者其片段在制备用于抑制血管发生的药物中的用途，其中所述片段选自Fab片段、F(ab’)2片段和单链可变区。

5.权利要求4的用途，其中所述血管发生是新血管发生。

6.权利要求4的用途，其中所述抗体偶联于抗血管发生剂或抗肿瘤剂。

7.与人TEM 1的氨基酸33-684内的表位特异性结合的抗体或者其片段在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途，其中所述片段选自Fab片段、F(ab’)2片段和单链可变区。

8.权利要求7的用途，其中所述抗体偶联于抗肿瘤剂或抗血管发生剂。

9.权利要求7的用途，其中所述肿瘤是腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤，或tetratocarcinoma。

10.权利要求7的用途，其中所述肿瘤是肾上腺，膀胱，骨，骨髓，脑，乳腺，子宫颈，胆囊，神经节，胃肠道，心脏，肾，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲状旁腺，阴茎，前列腺，唾液腺，皮肤，脾，睾丸，胸腺，甲状腺，或子宫的癌。

说明书

内皮细胞特异性抗体及其用途

技术领域

[0001] 本发明提供的方法和组合物通过抑制内皮细胞增殖，迁移，和/或小管形成，因此用于治疗脊椎动物血管发生相关失调和疾病，包括癌症。更具体地，所述方法涉及施用抑制血管发生或肿瘤生长的偶联或未偶联形式的对肿瘤内皮标记物(TEM)特异性的抗体，和这些方法中使用的组合物。

[0002] 发明背景

[0003] 血管发生包括组织或器官中新血管的产生。正常生理条件下，在非常特定的情形下发生血管发生，例如伤口愈合，胎儿发育，及黄体，子宫内膜和胎盘的形成。血管发生的过程通过天然存在的刺激物而被高度调节，例如，血管发生素-1，IL-8，血小板来源的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，和抑制剂，例如，血小板反应蛋白，干扰素，和金属蛋白酶抑制剂。

[0004] 血管发生也能作为多种疾病状态中的重要因素而存在。事实上，不受控制的血管发生直接导致与很多疾病相关的病理损害。这种不受控制的或过度的血管发生在血管发生因子失衡并且存在血管发生抑制剂时发生，例如，当产生过量血管发生因子时。不充足的血管发生也是某些疾病状态的原因。例如，不适当的血管生长导致与冠状动脉疾病、中风、和延迟的伤口愈合有关的病理。

[0005] 象糖尿病患者视网膜病、与年龄有关的黄斑变性、动脉粥样硬化、和炎症状况，例如类风湿性关节炎和牛皮癣这样的疾病中存在过度的血管发生。例如，在类风湿性关节炎中，关节滑膜中的血管经历不适当的血管发生。除了形成新血管网外，内皮细胞释放因子和活性氧物质，它们导致血管翳生长和软骨破坏，从而可以活跃地引起和帮助保持类风湿性关节炎的慢性炎症状态。参见，例如，Bodolay，E.，等，J.CellMol.Med.6：357-76(2002)。类似地，在骨关节炎中，血管发生相关因子对软骨细胞的激活可以引起关节的破坏。参见，例如，Walsh，D. A.，等，Arthritis Res.3：147-53(2001)。

[0006] 血管发生在癌的生长和转移中起着决定性作用。参见，例如，B.R.Zetter，Ann.Rev.Med.49：407-24(1998)，J.Follcman，Sem.Oncol.22：15-18(2002)。首先，血管发生导致原发肿瘤血管发生，对生长的肿瘤细胞供应必需的营养。其次，肿瘤的增加的血管发生提供进入血流的通路，从而增强肿瘤转移可能性。最后，转移肿瘤细胞离开原发肿瘤生长位点之后，必须发生血管发生来支持转移细胞在第二位点生长和扩展。

[0007] 正常和与疾病相关的血管发生似乎是以类似方式进行。基底膜包围的内皮细胞和周细胞形成毛细血管。疾病或损伤诱导产生促血管发生因子。最初，这些因子激活内皮细胞和白细胞，释放侵蚀或溶解存在的血管的基底膜的酶。覆盖血管腔的激活的内皮细胞然后突起通过基底膜。促血管发生刺激物然后诱导内皮细胞迁移通过受损的基底膜。迁移细胞形成离开母体血管的“芽状物”，在那里内皮细胞开始增殖。内皮芽状物彼此汇合，利用粘附因子形成毛细管回路，产生新的血管。另外的酶，例如基质金属蛋白酶，然后消化出芽血管尖端的组织，允许活性组织在新血管周围重塑。周细胞(即，特化的平滑肌细胞)稳定新形成的血管。一旦稳定，新血管就支持血流。

[0008] 已经鉴定出很多化合物是血管发生抑制剂。举例的化合物包括鱼精蛋白(Taylor等，Nature 297：307(1982))，肝素，甾族化合物(Folkman等，Science 221：719(1983)和美国专利Nos.5,001,116和4,994,443)，沙利度胺(R.J.D′Amato，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：4082-85(1994))，TNP-470(Ingmer，等，Nature 348：555-57(1990))，和羧基酰氨基三唑(CAI)(Kohn，等，Cancer Res.56：569-73(1996)。内源产生的抑制剂包括干扰素α(IFN-α)(White等，New England J.Med.320：1197-1200(1989)，Sidky等，Cancer Res.47：5155-61(1987)，制管张素(O′Reilly，等，Cell 79：315-28(1994))，和内皮抑素(O′Reilly，等，Cell 88：1-20(1997))。

[0009] 很多这样的化合物的局限性是它们的抗血管发生活性的普遍性质。换句话说，大多数化合物没有区别正常血管发生和与疾病相关的血管发生的能力。作为结果，显著的毒性限制很多已经鉴定的抗血管发生物质的临床应用，因为正常的和与疾病相关的血管发生都被抑 制。因此，选择性导向于与疾病相关的血管发生的血管发生抑制剂在降低毒性和有效增强长期效力方面提供显著的优势。

[0010] 发明概述

[0011] 这里提供抑制细胞增殖的方法，包括施用有效量的与选自肿瘤内皮标记物(TEM)1和TEM17的抗原特异性结合的抗体，或者其生物活性片段，从而抗体抑制细胞增殖。 [0012] 这里还提供了一种抑制细胞迁移的方法，包括施用有效量的与选自肿瘤内皮标记物TEM1，TEM9，和TEM17的抗原特异性结合的抗体，或者其生物活性片段，从而抗体抑制细胞迁移。

[0013] 这里提供一种抑制内皮管形成的方法，包括施用有效量的与选自肿瘤内皮标记物TEM1和TEM17的抗原特异性结合的抗体，或者其生物活性片段，从而抗体抑制内皮管形成。 [0014] 这里提供的方法的抗体可以是人抗体或人源化抗体。本发明方法中能使用完整抗体分子，单链可变区，Fab片段，或F(ab′)2片段。抗体可以是单克隆抗体，嵌合抗体，或多克隆抗体。转基因小鼠中能产生抗体。与生物活性剂偶联的抗体在本发明中也是有用的。在一个实施方案中，抗体对于抗原的胞外结构域是特异性的。本发明方法的抗体介导的抑制作用能在体外细胞中，在组织中，或者在受试者中发生。

[0015] 这里还提供了一种抑制血管发生的方法，包括对需要的受试者施用有效量的与选自TEM1，TEM9，和TEM17的抗原特异性结合的抗体，或者其生物活性片段，从而抗体抑制血管发生。接受本发明方法治疗的受试者表达感兴趣的TEM。血管发生可以是新血管发生。本发明方法中使用的抗体包括与抗血管发生剂或抗肿瘤剂偶联的抗体。本发明方法治疗的受试者包括具有但不限于下面疾病的患者：中枢神经系统肿瘤：多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，少突胶质瘤，室管膜和脉络丛肿瘤，松果体肿瘤，神经元肿瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，脑膜肉瘤；眼部肿瘤：基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，横纹肌肉瘤，成视网膜细胞瘤；内分泌腺肿瘤：垂体瘤，甲状腺瘤，肾上腺皮质肿瘤，神经内分泌系统肿瘤，胃肠胰腺内分泌系统肿瘤，生殖腺肿瘤；头颈肿瘤：头颈癌，口腔，咽，喉，牙原性肿瘤：胸部肿瘤：大细胞肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，胸部肿瘤，恶性间皮瘤，胸腺瘤，胸 部原发生殖细胞肿瘤；消化道肿瘤：食管肿瘤，胃肿瘤，肝肿瘤，胆囊肿瘤，外分泌胰腺肿瘤，小肠肿瘤，蠕虫样阑尾和腹膜，结肠和直肠腺癌，肛门肿瘤；泌尿生殖道肿瘤：肾细胞癌，肾盂和输尿管肿瘤，膀胱肿瘤，尿道肿瘤，前列腺肿瘤，阴茎肿瘤，睾丸肿瘤；女性生殖器官肿瘤：
外阴和阴道肿瘤，子宫颈肿瘤，子宫体腺癌，卵巢癌，妇科肉瘤；乳腺肿瘤；皮肤肿瘤：基底细胞癌，鳞癌，皮肤纤维肉瘤，Merkel细胞肿瘤；恶性黑素瘤；骨和软组织肿瘤：成骨肉瘤，恶性纤维性组织细胞瘤，软骨肉瘤，尤因氏肉瘤，原发性神经外胚层肿瘤，血管肉瘤；造血系统肿瘤：骨髓发育不良综合征，急性髓细胞白血病，慢性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，HTLV-1，和T-细胞白血病/淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，肥大细胞白血病；儿童肿瘤：急性成淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，成神经细胞瘤，骨肿瘤，横纹肌肉瘤，淋巴瘤，肾和肝肿瘤。其他疾病包括多囊性肾病；
糖尿病视网膜病；类风湿性关节炎；牛皮癣；骨关节炎；听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼和生脓性肉芽肿；黄斑变性；早发视网膜病；角膜移植排异；新血管青光眼和晶状体后纤维组织增生。与血管发生相关的其他疾病包括但不限于，流行性角膜结膜炎，维生素A缺乏，特应性角膜炎，上缘角膜炎，翼状胬肉干燥性角膜炎，干燥综合征，phylectenulosis，梅毒，分支杆菌感染，脂变性，化学损伤，细菌性溃疡，真菌性溃疡，单纯疱疹感染，带状疱疹感染，原虫感染，卡波西肉瘤，角膜侵蚀性溃疡，Terrien′s边缘变性，边缘角质层分离，系统性红斑狼疮，多动脉炎，创伤，Wegeners肉样瘤病，巩膜炎，斯约二氏病，类天疱疮放射状角膜切开术，角膜图形排斥，和慢性炎症。

[0016] 这里提供抑制肿瘤生长的方法，包括对需要的受试者施用有效量的与选自TEM1，TEM17和TEM9的抗原特异性结合的抗体，或者其生物活性片段，从而抗体抑制肿瘤生长。本发明方法处理过的受试者表达感兴趣的TEM。本发明方法中有用的抗体包括与抗血管发生剂或抗肿瘤剂偶联的抗体。本发明的方法治疗的受试者包括患有腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤或tetratocarcinoma的患者。肿瘤可以是肾上腺，膀胱，骨，骨髓，脑，乳腺，子宫颈，胆囊，神经节，胃肠道，心脏，肾，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲状旁腺，阴茎，前列腺，唾液腺，皮肤，脾，睾丸，胸腺，甲状腺，和子宫的癌。这 样的肿瘤包括但不限于：中枢神经系统肿瘤：多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，少突胶质瘤，室管膜和脉络丛肿瘤，松果体肿瘤，神经元肿瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，脑膜肉瘤；眼部肿瘤：基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，横纹肌肉瘤，成视网膜细胞瘤；内分泌腺肿瘤：垂体瘤，甲状腺瘤，肾上腺皮质肿瘤，神经内分泌系统肿瘤，胃肠胰腺内分泌系统肿瘤，生殖腺肿瘤；头颈肿瘤：头颈癌，口腔，咽，喉，牙原性肿瘤：胸部肿瘤：大细胞肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，胸部肿瘤，恶性间皮瘤，胸腺瘤，胸部原发生殖细胞肿瘤；消化道肿瘤：食管肿瘤，胃肿瘤，肝肿瘤，胆囊肿瘤，外分泌胰腺肿瘤，小肠肿瘤，蠕虫样阑尾和腹膜，结肠和直肠腺癌，肛门肿瘤；泌尿生殖道肿瘤：肾细胞癌，肾盂和输尿管肿瘤，膀胱肿瘤，尿道肿瘤，前列腺肿瘤，阴茎肿瘤，睾丸肿瘤；女性生殖器官肿瘤：外阴和阴道肿瘤，子宫颈肿瘤，子宫体腺癌，卵巢癌，妇科肉瘤；乳腺肿瘤；皮肤肿瘤：基底细胞癌，鳞癌，皮肤纤维肉瘤，Merkel细胞肿瘤；恶性黑素瘤；骨和软组织肿瘤：成骨肉瘤，恶性纤维性组织细胞瘤，软骨肉瘤，尤因氏肉瘤，原发性神经外胚层肿瘤，血管肉瘤；造血系统肿瘤：骨髓发育不良综合征，急性髓细胞白血病，慢性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，HTLV-1，和T-细胞白血病/淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，肥大细胞白血病；儿童肿瘤：急性成淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，成神经细胞瘤，骨肿瘤，横纹肌肉瘤，淋巴瘤，肾和肝肿瘤。 [0017] 这里还提供了在本发明方法中有用的与包括抗血管发生剂或抗肿瘤剂的生物活性剂偶联的抗体的组合物。

[0018] 这里还提供了一种鉴定调节TEM1的血管发生抑制剂分子的方法，包括使携带肿瘤的TEM1转基因小鼠接触试验分子；并且检测对肿瘤生长的抑制作用，从而，当相对于没有接触试验分子的小鼠中的肿瘤生长来说，接触了试验分子的小鼠中的肿瘤生长减少时，将试验分子鉴定为调节TEM1的血管发生抑制剂分子。

[0019] 这里提供一种鉴定调节TEM9的血管发生抑制剂分子的方法，包括使携带肿瘤的TEM9转基因小鼠接触试验分子；并且检测对肿瘤生长的抑制作用，从而，当相对于没有接触试验分子的小鼠中的肿瘤生长来说，接触了试验分子的小鼠中的肿瘤生长减少时，将试验分子鉴 定为调节TEM9的血管发生抑制剂分子。

[0020] 这里提供一种鉴定调节TEM17的血管发生抑制剂分子的方法，包括使携带肿瘤的TEM17转基因小鼠接触试验分子；并且检测对肿瘤生长的抑制作用，从而，当相对于没有接触试验分子的小鼠中的肿瘤生长来说，接触了试验分子的小鼠中的肿瘤生长减少时，将试验分子鉴定为调节TEM17的血管发生抑制剂分子。

[0021] 这里还提供了特异性结合TEM1的单克隆抗体，或者其生物活性片段，其中抗体由杂交瘤产生。在一个实施方案中，杂交瘤是TEM1-70。在另一个实施方案中，杂交瘤是TEM1-7。在另一个实施方案中，杂交瘤是TEM1-38。这里还提供了单克隆抗体，或者其生物活性片段，其中所述抗体包括对TEM1特异性的抗体的可变区的相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体是IgG抗体。在一个具体的实施方案中，IgG抗体选自由IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4组成的Ig亚类中的成员。使用与原氨基酸不同的氨基酸通过缺失、添加、或取代，能改变抗体重链的至少一个氨基酸。此外，抗体能与抗肿瘤剂或抗血管发生剂偶联。在一个实施方案中，抗体抑制血管发生。在一个具体的实施方案中，血管发生促进或引起癌症。在一个具体的实施方案中，血管发生促进或引起多囊性肾病。在一个具体的实施方案中，血管发生促进或引起糖尿病视网膜病。在另一个具体的实施方案中，血管发生促进或引起类风湿性关节炎。在另一个具体的实施方案中，血管发生促进或引起牛皮癣。在一个实施方案中，TEM1-特异性抗体抑制肿瘤生长。肿瘤可以是腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤，或tetracarcinoma。肿瘤可以是肾上腺，膀胱，骨，骨髓，脑，乳腺，子宫颈，胆囊，神经节，胃肠道，心脏，肾，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲状旁腺，阴茎，前列腺，唾液腺，皮肤，脾，睾丸，胸腺，甲状腺，或子宫的癌。

[0022] 这里提供含有一定量的对TEM1特异性的单克隆抗体，或者其生物活性片段，和合适的赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，抗体是TEM1-70。在另一个实施方案中，抗体是TEM1-38。在另一个实施方案中，抗体是TEM1-7。

[0023] 这里提供杂交瘤株TEM1-70，杂交瘤株TEM1-7，和杂交瘤株TEM1-38。

[0024] 本发明的详细描述

[0025] 这里公开的方法和组合物涉及内皮细胞体外和体内生长和功能。具体地说，这些方法和组合物使用对于优先在肿瘤中发现的内皮细胞上表达并且已知是肿瘤内皮细胞标记物或TEM的内皮细胞上的一亚组表面分子特异性的抗体。因此，这些抗体优先导向于与疾病相关的血管发生。导向于TEM的抗体分子能通过至少四种不同的机理用作内皮细胞活性调节剂(例如，作为治疗药物)。首先，抗体通过调节或抑制关键大分子信号转导途径能直接作用于它的靶细胞。例如，抗体能结合关键配体或者其受体并且抑制必需的阳性刺激物，或者，诱导阴性信号(例如，引发凋亡的阴性信号)。其次，通过简单地结合其靶或者送递作为具有治疗益处的其偶联物，例如放射性核素或有效毒素的生物活性剂，抗体能间接作用于其靶细胞。第三，抗体能使得免疫系统的其他成分作用于靶细胞。例如，能使用抗体来触发抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞溶解(CDC)。第四，抗体能具有内在的细胞毒性。

[0026] 导向于肿瘤血管内皮具有几个独特的优点。首先，血管内皮的腔表面和静脉内施用的药剂之间有最小的屏障，增强送递给靶细胞的效率。其次，少数内皮细胞的局部损伤能导致作为内皮反应性肿胀结果的血管阻塞并且危害周围的内皮细胞，使得局部损伤实现更总体的效果。第三，内皮细胞不会对抗体产生抗性，允许反复施用抗体而不降低它的效力。 [0027] 任何肿瘤内皮标记物能在这里提供的方法和组合物中用作靶。如这里使用的，术语″肿瘤内皮标记物(TEM)″指优先在肿瘤内皮细胞上表达的分子。TEMs表达在正常(非肿瘤)血管上不存在或显著更低。参见，例如，St.Croix，等，Science 289：1197-1202(2000)，美国系列No.09/918715(公开号No.20030017157)。TEM包括在其半寿期的至少一部分在内皮细胞上表达的任何类型的分子。这样的分子包括但不限于TEM1，TEM2，TEM3，TEM4，TEM5，TEM6，TEM7，TEM 8，TEM9，TEM10，TEM11，TEM12，TEM13，TEM14，TEM15，TEM16，TEM17，TEM18，TEM19，TEM20，TEM21，TEM22，TEM23，TEM24，TEM25，TEM26，TEM27，TEM28，TEM29，TEM30，TEM31，TEM32，TEM33，TEM34，TEM35，TEM36，TEM37，TEM38，TEM39，TEM40，TEM41，TEM42，TEM43，TEM44，TEM45和TEM46。

[0028] 在一个实施方案中，靶分子是TEM1。内皮唾液酸蛋白是165kDa的糖蛋白。Rettig，等，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.89：10832-36(1992)，Christian，等，J.Biol.Chem.276：7408-14(2001)。St.Croix和colleagues在Science 289：1197-1202(2001)中将TEM1的序列鉴定为是内皮唾液酸蛋白的序列。TEM1是C-型凝集素样I型膜蛋白，具有信号前导肽，五个球形胞外结构域，接着是粘蛋白样区，跨膜片段和短胞质尾。N-末端显示与凝血调节蛋白和补体受体ClqRp的同源性，凝血调节蛋白是调节血液凝固中涉及的受体。Webster，等，J.Leuk.Biol.67：109-16(2000)。鼠类和人TEM1有77.5％氨基酸同一性，在跨膜区是
100％同一性。Opavsky，等，J.Biol.Chem.276：38795-807(2001)。TEM1的信号序列是氨基酸1-17并且其跨膜结构域是氨基酸686-708。其胞外结构域是残基1-685。TEM1表达随着细胞密度(或细胞周期)而变化。Opavsky等，上文(2001)。TEM1在汇合(G0)细胞中最大表达，这是体内细胞周期最适合期。美国系列No.09/918715(公开号No.20030017157)中公开TEM1的DNA序列是SEQ ID NO.196。

[0029] 在另一个实施方案中，靶分子是TEM17。TEM17是I型膜蛋白，具有位于残基1-18的信号序列，与巢蛋白的G1结构域相似的N-末端区，与plexin同源的100个氨基酸的区域，位于427-445残基的跨膜结构域，和短的胞质尾。其胞外区包括残基1-426。plexin家族介导细胞指导指令，提示TEM17可以在该能力中发挥功能。鼠TEM17与人TEM17具有81％的序列同一性。美国系列号No.09/918715(公开号No.20030017157)中公开了TEM17的DNA序列是SEQID NO：230。

[0030] 在另一个实施方案中，靶分子是TEM9。TEM9是分泌素家族七跨膜G-蛋白偶联的受体。这种G-蛋白偶联受体的同源物既有残基1-26的信号序列又有7个跨膜结构域。N-末端胞外结构域由富亮氨酸重复(LRR)区，接着是免疫球蛋白结构域，肽激素受体结构域，和GPCR蛋白水解位 点结构域组成。其胞外区残基位于氨基酸1-769，其跨膜结构域是残基817-829(TM2和TM3)，残基899-929(TM4和TM5)，和残基1034-1040(TM6和TM7)。跨膜区与其他分泌素家族蛇根双碱受体的跨膜区同源。胞质区的起点包含对于GPCR-棕榈酰化作用典型的两个相邻的胱氨酸。因此，TEM9是具有作为细胞粘附蛋白的特征的胞外结构域的G-蛋白偶联的受体。小鼠直向同源物在残基1-29有预知的信号肽并且与人TEM9具有87％同源性。美国系列No.09/918715(公开号No.20030017157)中公开了TEM9的DNA序列是SEQ ID NO.212。

[0031] 在这里提供的方法和组合物中能使用任何特异性抗体。如这里使用的，术语″抗体″指包括来自轻链免疫球蛋白分子的至少一个可变区和来自重链分子的至少一个可变区组合形成靶抗原特异性结合位点的分子。抗体能以Fab片段，F(ab′)2片段，单链可变区，或完整抗体分子的形式使用。应用本领域公知的方法能产生完整分子的片段，包括酶促消化和重组方法。本发明方法中有用的片段是生物活性片段。如这里使用的，术语″生物活性″指能结合预期的抗原表位并且直接或间接发挥生物作用的抗体或抗体片段。直接作用包括但不限于生长信号的抑制，抗凋亡信号的抑制，激发凋亡或坏死信号，启动ADCC级联，和启动CDC级联。间接作用包括但不限于由于偶联物送递导致的毒性(例如，放射性核素，毒素，药物，或其他生物活性剂)或者对于第二药剂的敏化(例如，送递的药剂在暴露于另外的物质例如射线之后变得有毒性)。如这里使用的，术语″特异性″指抗体与靶抗原位点的选择性结合。通过在一组给定条件下比较与适当抗原的结合和与不相关抗原或抗原混合物的结合，能对抗体测定结合特异性。与不相关抗原或抗原混合物相比，如果抗体与适当抗原多结合多至少2，5，7，优选10被，则认为它是特异性的。在一个实施方案中，特异性抗体是结合人TEM抗原但是不结合非人TEM抗原，例如鼠TEM抗原的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人TEM抗原但是不结合与人TEM抗原有70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％或更大氨基酸同源性的非人TEM抗原的抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG抗体。例如，抗体是IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4抗体。

[0032] 在一个实施方案中，抗体是对TEM1有特异性的并且由杂交瘤TEM1-7产生的克隆7。在另一个实施方案中，抗体是对TEM1有特异性 的并且由杂交瘤TEM1-70产生的克隆70。
在另一个实施方案中，抗体是对TEM1有特异性的并且由杂交瘤TEM1-38产生的克隆38。根据布达佩斯条约，在2003年5月15日，在国际专利申请微生物保藏单位国立生命科学和人体技术研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566，日本)保藏了产生克隆7(TEM1-7)，克隆38(TEM1-38)，和克隆70(TEM1-70)的杂交瘤，保藏号是FERM BP-8380(TEM1-7)，FERM BP-8381(TEM1-38)，和FERM BP-8382(TEM1-70)。 [0033] 在本发明方法和组合物中有用的抗体可以在细胞培养物中，在噬菌体中，或者在各种动物中制备，所述动物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、羊、狗、猫、猴、黑猩猩、猿。因此本发明中有用的抗体是哺乳动物抗体。能利用噬菌体技术来分离最初的抗体或者产生有改变的特异性或亲和力特征的变体。这样的技术是常规的本领域公知的。在一个实施方案中，通过本领域公知的重组方法制备抗体。例如，通过用包含编码抗体的序列的载体转染宿主细胞能产生重组抗体。能使用一个或多个载体来转染在宿主细胞中表达至少一种VL和一种VH区的DNA序列。举例描述的抗体产生和制备的重组方法包括Delves，ANTIBODY PRODUCTION：ESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley，1997)；Shephard，等，MONOCLONAL ANTIBODIES(OxfordUniversity Press，2000)；和 Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press，1993)。本发明方法中使用的抗体能通过重组方法修饰，来增强抗体在介导期望的功能中的更大效力。还考虑利用重组方法通过取代作用来修饰抗体。典型地，取代作用是保守取代。例如，抗体的恒定区中至少一个氨基酸能用不同的残基置换。参见，例如，美国专利No.5,624,821，美国专利No.6,194,551，申请号No.WO9958572；和Angal，等，Mol.Immunol.30：105-08(1993)。氨基酸修饰包括氨基酸的缺失，添加，取代。在某些情况下，进行这样的变化来减小不期望的活性，例如补体依赖性细胞毒性。

[0034] 抗体可以是人源化抗体。如这里使用的，术语″人源化抗体″指其中改变非抗原结合区中的氨基酸序列使得抗体更类似于人抗体同时仍然保留它原来的抗原特异性的抗体。典型地，可变区是一种物种例如 小鼠的，恒定区来源是人。抗体可以是嵌合抗体。如这里使用的，术语″嵌合抗体″指其中改变氨基酸序列使得抗体包含来自一种以上哺乳动物的序列而同时保留它原来的抗原特异性的抗体。如这里使用的，术语″单链可变片段(ScFv)″指由柔性肽接头连接在一起的免疫球蛋白的可变重链(VH)和轻链(VL)构成的基因工程抗体。

[0035] 能使用任何形式的抗原产生足以产生生物活性抗体的抗体。因此，激发抗原可以是单表位，多个表位，或者单独的完整抗原或与本领域公知的一种或多种增强免疫原性的试剂组合。激发抗原可以是分离的全长蛋白质，细胞表面蛋白质(例如，使用用抗原的至少一部分转染的细胞免疫)，或可溶性蛋白质(例如，只是用蛋白质的胞外结构域部分免疫)。可以在遗传修饰的细胞中产生抗原。编码抗原的DNA可以是基因组或非基因组的(例如，cDNA)并且编码胞外结构域的至少一部分。如这里使用的，术语″部分″指构建感兴趣的抗原的免疫原性表位合适的氨基酸或核酸的最小数目。可以使用适合用于感兴趣的细胞转化的任何基因载体，包括但不限于腺病毒载体，质粒，和非病毒载体，例如阳离子脂质。在一个实施方案中，这里的方法和组合物的抗体特异性结合感兴趣的TEM胞外结构域的至少一部分。

[0036] 本发明方法和组合物的抗体可以是单克隆或多克隆的。如这里使用的，术语″单克隆抗体″指单一B细胞产生的单一抗体。如这里使用的，术语″多克隆抗体″指具有相同的抗原特异性但是由一种以上B细胞克隆产生的单克隆抗体的混合物。在一个实施方案中，多克隆抗体包含在包含多个抗原表位的单一抗原中具有不同的表位特异性、亲和性、或亲合力的单克隆抗体。

[0037] 在一个实施方案中，这里提供的抗体是人抗体。如这里使用的，术语″人抗体″指其中基本上轻链和重链序列的完整序列，包括互补决定区(CDRs)来自人基因的抗体。在一个实施方案中，通过trioma技术，人B-细胞技术(参见，例如，Kozbor，等，Immunol.Today4；72(1983)，EBV转化技术(参见，例如，Cole等，MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY 77-96(1985))，或者利用噬菌体展示(参见，例如，Marks等，J.Mol.Biol.222：
581(1991))制备单克隆抗体。在一个具体的实施方案中，在转基因小鼠中产生人抗体。
制备这样的部分至全部人抗体的技术是本领域公知的，并且能使用任何这样的技术。根 据一个特别优选的实施方案，在经基因工程化而表达人重链和轻链抗体基因的转基因小鼠中制备全人抗体序列。制备产生人抗体的转基因小鼠的举例描述见PCT公开No.WO
02/43478。来自产生期望抗体的转基因小鼠的B细胞然后能融合，来制备杂交瘤细胞系，用于连续制备抗体。参见，例如，美国专利No.5569825；5625126；5633425；5661016；和
5545806；和Jakobovits，Adv.Drug Del.Rev.31：33-42(1998)；Green，等，J.Exp.Med.188：
483-495(1998)。

[0038] 双特异性抗体在本发明方法和组合物中也是有用的。如这里使用的，术语“双特异性抗体”指对于至少两种不同的抗原表位有结合特异性的抗体，一般是单克隆抗体。在一个实施方案中，表位来自相同的抗原。在另一个实施方案中，表位来自两种不同的抗原。制备双特异性抗体的方法是本领域公知的。例如，利用两种免疫球蛋白重链/轻链对的共同表达能重组制备双特异性抗体。参见，例如，Milstein等，Nature 305：537-39(1983)。
或者，利用化学键能制备双特异性抗体。参见，例如，Hollinger，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48(1993)，Gruber，等，J.Immunol.152：5368(1994)。

[0039] 杂偶联物在本发明方法和组合物中是有用的。如这里使用的，术语“杂偶联物抗体”指两个共价连接的抗体。利用合成蛋白质化学，包括利用交联剂，能制备这样的抗体。参见，例如，美国专利No.4676980。

[0040] 这里提供的抗体可以与生物活性剂偶联。如这里使用的，术语“生物活性剂”指增强或介导期望的生物作用的任何合成的或天然存在的化合物。在一个实施方案中，期望的生物作用是停滞或细胞死亡(例如凋亡)。在另一个实施方案中，期望的生物作用来自使靶细胞对诱导停滞或细胞死亡的第二种试剂敏感的抗体。生物活性剂包括，例如，药物，例如化疗药物或毒素。它们可以包括细胞因子，配体，或另一种抗体。在一个实施方案中，这种试剂是抗肿瘤剂。如这里使用的，术语″抗肿瘤剂″指通过诱导免疫应答，停滞，细胞死亡，或坏死而抑制肿瘤生长的试剂。在一个实施方案中，这种药物是抗血管发生剂。如这里使用的，术语″抗血管发生剂″指通过诱导免疫应答，停滞，细胞死亡，或坏死而抑制内皮细胞增殖，迁移，管生成，或者它们的一些 组合的试剂。用于与抗体偶联的合适的试剂包括细胞因子，例如白细胞介素2(IL-2)，干扰素(IFN)，肿瘤坏死因子(TNF)；光敏剂(用于光131
动力学疗法)，包括酞菁四磺酸铝(III)，血卟啉，和酞菁；放射性核素，例如碘-131( I)，
90 212 213 99m 186 188
钇-90( Y)，铋-212( Bi)，铋-213( Bi)，锝-99m( Tc)，铼-186( Re)，和铼-188( Re)；
抗生素，例如阿霉素，亚德里亚霉素，柔红霉素，氨甲喋呤，柔毛霉素，新制癌菌素，和卡铂；
细菌，植物，和其他毒素，如白喉毒素，假单胞菌外毒素A，葡萄球菌肠毒素A，红豆毒素-A毒素，蓖麻毒素A(去糖基化蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A)，TGF-α毒素，来自中国眼镜蛇(naja naja atra)的细胞毒素，和gelonin(一种植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体灭活蛋白，例如局限曲菌素(局限曲菌Aspergillus restrictus产生的核糖体灭活蛋白)，皂草素(Saponaria officinalis产生的核糖体灭活蛋白)，和RNase；酪氨酸激酶抑制剂；1y207702(二氟化嘌呤核苷)；包含抗肿瘤剂的脂质体(例如，反义寡核苷酸，编码毒素的质粒，氨甲喋呤等)；和其他抗体或抗体片段，例如F(ab)。

[0041] 这里提供的抗体在鉴定本发明方法的TEMS的存在或表达的方法中是有用的。在一个实施方案中，提供了检测TEM多肽的方法，包括使样品与TEM-特异性抗体接触足以形成复合体的时间，并且检测复合体，如果检测到复合体，则样品中存在TEM。这样的分析的例子包括放射免疫分析，ELISAs，免疫化学，免疫沉淀，和其他公知的免疫分析，参见，例如，USING ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL(Harlow，等，编著，1999)。样品包括但不限于细胞，蛋白质或细胞的膜提取物，生物流体，例如唾液，血液，血清，血浆，或尿，或者生物学样品，例如福尔马林固定的或冷冻的组织切片。制备这样的用于分析的样品的方法是本领域公知的。利用这里公开的抗体分析的样品根据分析形式，检测方法的性质，和要分析的组织、细胞、或细胞提取物而不同。这样的制备和变化是本领域公知的。可以利用任何合适的检测系统。在一个具体实施方案中，能利用这里公开的检测系统来诊断，分阶段，或监测疾病进展或监测对治疗干预的反应。

[0042] 在另一个实施方案中，提供了包含进行这里提供的方法的分析的必需试剂的试剂盒。具体地说，这里提供了包括一个或多个容器的具有隔室的试剂盒，其中第一容器包括一种或多种TEM特异性抗体，包括下 面一种或多种物质的一个或多个其他容器：洗涤试剂，能检测被结合抗体的存在的试剂。容器可以是玻璃，塑料，或者塑料或纸条。检测试剂类型包括标记的第二抗体，其他标记的第二结合试剂，或者，如果第一抗体是标记的，这是能与被标记抗体反应的酶促或抗体结合试剂。

[0043] 这里提供了抑制细胞增殖的方法，包括施用有效量的特异性结合选自肿瘤内皮标记物(TEM)1和TEM17的人抗体，或者其生物活性片段，从而抗体抑制细胞增殖。可以使用用于测定细胞增殖的所有合适的方法。在一个实施方案中，抑制细胞增殖的方法包括使内皮细胞接触上述TEM特异性抗体或者其生物活性片段一定时间，然后测定相对于没有用抗体处理的细胞的增殖。

[0044] 如果相对于不存在抗体或者存在非结合抗体的细胞增殖，抗体抑制了细胞增殖，则该抗体是增殖抑制性的。利用任何合适的方法可以定量测定增殖。典型地，通过评定掺入到DNA中放射性标记的核苷酸(例如，3H-胸苷)来测定增殖。在一个实施方案中，通过TMATP发光测定增殖。在一个具体实施方案中，利用Promega生产的CellTiter-Glo 发光细胞存活力测定法来确定增殖。如下所述通过对组织或对受试者施用抗体也可以抑制细胞增殖。

[0045] 阻断TEM与增强的肿瘤内皮细胞增殖相关的功能的抗体对于恶性疾病产生低水平或不产生循环内皮前体细胞的受试者是最有利的，因此表明疾病来源的肿瘤血管很大一部分来自共同选择存在的血管上的内皮细胞增殖。阻断TEM与增强的肿瘤内皮细胞增殖相关的功能还能使受试者受到肿瘤负荷相对低的益处，因为肿瘤内皮细胞增殖的抑制导致对治疗的动力学慢反应。

[0046] 这里提供了抑制细胞迁移的方法，包括施用有效量的与选自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特异性结合的人抗体，或者其生物活性片段，从而抗体抑制细胞迁移。可以与本发明方法一起使用所有合适的评定细胞迁移的方法。在一个实施方案中，抑制细胞迁移的方法包括以下步骤：在没有化学引诱剂的一个腔室中让内皮细胞与如上所述的TEM特异性抗体或者其生物活性片段接触，在通过多孔膜与第二个腔室分开的腔室内用化学引诱剂温育内皮细胞和抗体，测定存在或不存在抗体时进入有化学引诱剂腔室的细胞数，当不存在抗体时迁移的细胞的 数目大于存在抗体时迁移的细胞数时，抗体对于迁移是抑制性的。 [0047] 如果存在抗体时的迁移细胞数相对于不存在抗体或存在非结合抗体或其他不相关抗体时的细胞迁移更少，则抗体对于迁移是抑制性的。利用任何合适的方法可以定量测定迁移。典型地，通过评估有化学引诱剂的腔室中的细胞数对保留在原腔室中的细胞数来测定迁移。在一个实施方案中，根据厂商说明，用PKH67绿染料预先标记细胞。在另一个实施方案中，用钙黄绿素AM标记细胞。温育之后，用荧光反相显微镜计数细胞。如下所述对组织或对受试者施用抗体也可以抑制迁移。

[0048] 阻断TEM与增强的肿瘤内皮细胞迁移相关的功能的抗体对于恶性疾病生长相对缓慢或无痛和/或有已知的转移病灶的受试者是最有利的，因为这些患者的病灶中血管形成最可能是由于来自骨髓的内皮前体细胞以及来自疾病的正常组织部位的内皮细胞，这样需要内皮细胞迁移作为主要功能。

[0049] 这里还提供了抑制内皮管形成的方法，包括施用有效量的与选自TEM1和TEM17的抗原特异性结合的人抗体，或者其生物活性片段，从而抗体抑制内皮管形成。评价管形成的所有合适的方法可以用于这里的方法。在一个实施方案中，抑制细胞内皮管形成的方法包括在合适基质存在下，使内皮细胞接触如上所述的TEM特异性抗体或其生物活性片段，在基质中温育内皮细胞和抗体，评价小管形成的步骤，其中当不存在抗体时形成的小管的数目或小管的特征相对于存在抗体下小管数目或小管的特征更大或者显著改变，则抗体对于小管形成是抑制性的。

[0050] 如果相对于不存在抗体或者存在非结合抗体形成的小管的数目，存在抗体时形成的小管的数目更少，则抗体对于小管形成是抑制性的。如果相对于不存在抗体或者存在非结合抗体形成的小管的特征，存在抗体时形成的小管的特征改变，则抗体对于小管形成是抑制性的。如这里使用的，术语″小管的特征″指基质中形成的小管网络的强度和持续时间。利用任何合适的方法可以定量测定小管形成。典型地，通过显微镜评价管形成。在一个实施方案中，根据厂商说明，用PKH67绿染料预先标记细胞。在另一个实施方案中，用钙黄绿素AM标记细胞。在基质中有或没有抗体存在下温育之后，用荧光反相显微镜检查小 管。如下所述通过对组织或受试者施用抗体也可以抑制细胞小管形成。

[0051] 阻断TEMs与肿瘤内皮细胞的增强的管形成相关的功能对于其恶性疾病产生高循环水平内皮前体细胞的患者是最有利的，因此表明他们疾病的肿瘤血管大部分源自循环内皮前体细胞建立的血管发育。阻断TEMs与肿瘤内皮细胞的增强的管形成相关的功能也有利于相对快速生长肿瘤的患者，其中血管发生的破坏或抑制阻断肿块的继续扩大。 [0052] 在抑制血管发生、增殖、迁移和/或内皮小管形成的方法中，表达感兴趣的TEM的任何细胞能被诱导表达感兴趣的TEM，或者表达非人TEM同源物(例如，鼠，牛等等)。在一个实施方案中，细胞是内源表达感兴趣的TEM的细胞系。在一个具体实施方案中，细胞系是鼠2H11内皮细胞系(ATCC)。在另一个实施方案中，诱导细胞表达感兴趣的TEM。在一个具体实施方案中，细胞是在碱性FGF(bFGF)，VEGF，和肝素存在下培养产生内皮前体细胞(EPC′s)的AC133+/CD34+人骨髓细胞，如实施例1所述。在另一个实施方案中，用感兴趣的TEM转染或转导细胞。在一个具体实施方案中，用编码感兴趣的TEM的腺病毒载体转导人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)或者人微血管内皮细胞。在另一个实施方案中，用编码感兴趣的TEM的质粒转染COS或293细胞。在一些实施方案中，TEM-表达细胞可以接触生长因子或其他细胞的条件培养基。例如，使用在无血清培养基中培养三天的人HCT116结肠癌细胞或人HT29结肠癌细胞的汇合培养物制备结肠癌条件培养基。用于补充培养基的因子包括VEGF和bFGF。在一个实施方案中，细胞来自或者是人或兽医受试者。

[0053] TEM-表达细胞能以任何合适的方式接触抗体任何合适长短的时间。在温育或处理期间细胞可以接触抗体一次以上。典型地，要求剂量在大约1微克/毫升至1000微克/毫升范围内，更典型地在100微克/毫升至800微克/毫升范围内。由细胞的体外培养物和使细胞暴露于不同剂量的抗体能容易地确定精确剂量。典型地，细胞接触抗体的时间是1小时至三天，更典型地24小时。可以使用任何合适的培养基。在一个实施方案中，培养基TM是重配的基底膜Matrigel 基质(BDSciences)。

[0054] 这里提供了抑制血管发生的方法，包括对需要的受试者施用有效量的与选自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特异性结合的人抗体或其生物活性片段，从而抗体抑制血管发生。如这里使用的，术语″血管发生″指血管发育。血管可以是已经存在的血管或新血管。如这里使用的，术语″新血管发生″指发育新血管。

[0055] 此外，这里提供了抑制肿瘤生长的方法，包括对需要的受试者施用有效量的与选自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特异性结合的人抗体或其生物活性片段，从而抗体抑制肿瘤生长。

[0056] 接受这些方法治疗的受试者表达感兴趣的TEM抗原。在开始用TEM-特异性治疗处理之前对患者样品进行筛选或诊断分析。使用任何样品可以进行这样的使用本发明抗体的诊断分析，包括但不限于细胞，蛋白质，或细胞的膜提取物，生物流体，例如痰、血液、血清、血浆、或尿，或生物样品，例如福尔马林固定的或冷冻组织切片。可以利用检测和分析TEM表达的任何合适的方法。

[0057] 用这里提供的方法和组合物能治疗任何受试者。这样的受试者是患有与血管发生相关的疾病或症状的哺乳动物，优选人。在一个具体的实施方案中，受试者患有癌症。也包括公开的方法和组合物的兽医应用。这样的应用包括对驯养动物、牲畜和纯种马的血管发生相关疾病和癌症的治疗。

[0058] 如这里使用的，″抑制″或″治疗″或″处理″包括延迟产生与不受控制的血管发生、肿瘤生长相关的症状和/或减小将要产生或预期产生的所述症状的严重程度。这些术语进一步包括减轻存在的不受控制的或不期望的血管发生-相关或肿瘤生长-相关症状，预防其它症状，和减轻或防止症状的潜在代谢原因。因此，这些术语指明有益结果已经赋予给有血管发生-相关疾病或症状特别是癌症，或者有可能产生这样的疾病或症状的脊椎动物受试者。

[0059] 如这里使用的，术语″治疗有效量″或″有效量″指当单独或与另外的治疗剂联合对细胞、组织或受试者施用时有效防止或减轻血管发生-和/或肿瘤-相关疾病状况或疾病进展的抗-TEM抗体的量。治疗有效量进一步指足以导致症状减轻，例如相关医学状况的治疗、治愈、防止或减轻，或者足以导致这样的病症的治疗、治愈、防止或减轻的比例增大的化合物的量。当指施用给个体单独的活性成分时，治疗有效 剂量指单独的该成分。当指联合给药的情况时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的合并量，不管是联合，顺序或同时给药。

[0060] 可以以治疗或减轻各种病症的剂量，以其本身，或者以混合有合适的载体或赋形剂的药物组合物对需要的受试者施用本发明方法中使用的抗体(不管产生的来源是什么，包括但不限于重组和非重组来源)。这样的组合物还可以含有(除了蛋白质和载体之外)稀释剂，填料，盐，缓冲剂，稳定剂，增溶剂，和本领域公知的其他材料。术语″药学可接受的″意思是不干扰活性成分生活活性效力的无毒材料。载体的特征取决于给药途径。本发明的药物组合物还可以含有其他抗-血管发生和抗-肿瘤药物，例如细胞因子或化疗剂。 [0061] 在实施这里提供的治疗方法或应用时，对具有要治疗的状况的哺乳动物施用治疗有效量的这里提供的抗体。根据本发明方法，可以单独地或与其他治疗方法联合施用抗体，所述其他治疗方法例如使用其他造血因子(例如细胞因子)，化疗剂，抗-血管发生剂等的治疗。当与一种或多种生物活性剂共同给药时，这里提供的抗体可以与生物活性剂同时或顺序给药。如果顺序给药，主治医师会决定与生物活性剂联合施用本发明蛋白质的合适的顺序。通过对细胞培养物或实验动物进行标准药学程序，例如用于测定LD50(使50％人群致死的剂量)和ED50(在50％人群中治疗有效的剂量)，能确定这样的化合物的毒性和治疗功效。毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，并且它可以表示为LD50和ED50之间的比值。具有高治疗指数的抗体是优选的。在配制对人使用的剂量范围中可以使用从这些细胞培养分析和动物研究获得的数据。这样的化合物的剂量优选在循环浓度范围之内，包括几乎没有或没有毒性的ED50。根据使用的剂型和利用的给药途径，剂量可以在这个范围内变化。各医生根据患者的状况能选择制剂，给药途径和剂量。参见，例如，Fingl等，THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS 1(1975)。可以分别判断剂量和间隔，提供足以保持期望的治疗效果或者最小的有效浓度(MEC)的活性部分的血浆浓度。MEC对于各种化合物是不同的但是能从体外数据估计；例如，利用这里描述的分析实现迁移活性50-90％抑制必需的浓度。

[0062] 给药方式不是特别重要的。在一个实施方案中，给药方式是静脉内快速浓注。处方医师会正常地确定这里提供的抗体的剂量。预期给药 剂量将根据各患者的年龄、体重和反应而不同。

[0063] 本发明方法的抗体的配制和给药技术参见REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，最新版。合适的给药途径例如包括口服、直肠、经粘膜、或肠内给药；肠胃外送递，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内，直接脑室内，静脉内，腹膜内，鼻内，或眼内注射。能以各种常规途径实现药物组合物中使用的抗体的给药或者实施本发明方法，例如口服摄取，吸入，局部施用或皮肤施用、皮下、腹膜内、肠胃外、动脉内或静脉内注射。对患者静脉内给药是优选的。

[0064] 或者，可以以局部而不是全身方式施用抗体，例如，通过对关节、纤维变性组织、或肿瘤中直接注射抗体，经常是以贮存或持续释放制剂形式。此外，可以在定向药物送递系统中施用抗体，例如，在组织-特异性抗体包被的脂质体中，定向于，例如，关节或纤维变性组织或肿瘤。脂质体定向于受损组织并且被受损组织选择性摄取。

[0065] 因此，利用一种或多种生理学可接受载体，包括有利于将活性化合物加工成能药学使用的制剂的赋形剂和辅助物质，用常规方法可以配制根据本发明方法使用的药物组合物。这些药物组合物可以以本身已知的方法制备，例如，利用常规混合，溶解，造粒，制成糖衣丸，磨细，乳化，制成胶囊，捕获或冻干方法。合适的制剂取决于选择的给药途径。当以液体形式给药时，可以加入液体载体，例如水、石油、动物或植物来源的油，例如花生油，矿物油，大豆油，或芝麻油，或者合成油。液体形式的药物组合物可以进一步含有生理盐水溶液，葡萄糖或其他糖溶液，或者二醇类，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时，药物组合物含有大约0.5至90重量％的本发明蛋白质，优选大约1至50重量％的本发明蛋白质。

[0066] 当通过静脉内，皮肤或皮下注射施用此处的方法中的治疗有效量的抗体时，本发明的蛋白质是无热源的肠胃外可接受的水溶液形式。这样的肠胃外可接受的蛋白质溶液的制备，有关pH，等渗性，稳定性等等，在本领域技术人员知识内。用于静脉内，皮肤或皮下注射的优选的药物组合物除了本发明的蛋白质之外，还应该含有等渗赋形剂，例如氯化钠注射液，林格氏注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化钠注射液，乳酸林格氏注射液，或者本领域公知的其他赋形剂。本发明的 药物组合物还可以含有稳定剂，防腐剂，缓冲液，抗氧化剂，或者本领域技术人员公知的其他添加剂。对于注射，可以在水溶液中，优选在生理相容性缓冲液中，例如Hanks′溶液，林格氏溶液，或生理盐水缓冲液中配制本发明的试剂。对于经粘膜给药，制剂中使用适合要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域一般是公知的。

[0067] 对于吸入给药，一般以气溶胶喷雾剂形式从加压包或雾化器方便地送递根据本发明方法使用的抗体，其中使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他合适的气体。在加压气溶胶情况下，通过提供阀门以送递经计量的量，可以确定剂量单位。可以配制含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物的在吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊和药筒。可以将化合物配制成通过注射给药的肠胃外给药剂型，例如，通过快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如以安瓿或多剂量容器存在，加有防腐剂。组合物可以是下面的形式：如油性或含水赋形剂中的悬浮液，溶液或乳状液，并且可以含有配制试剂，例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。

[0068] 用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物悬浮液制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。含水注射悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或提高化合物的溶解度使得可制备高浓缩溶液的试剂。或者，活性成分可以是用于在使用前用合适的赋形剂例如无菌无热源水配制的粉末形式。 [0069] 本发明公开的方法中用于药物组合物中的抗体的量取决于要治疗的状况的性质和严重程度，和取决于患者接受治疗之前的状况。总之，主治医师决定用来治疗各个患者的本发明蛋白质的量。开始时，主治医师施用低剂量的本发明方法的抗体并且观察患者反应。可以施用更大剂量的本发明的抗体直到获得对患者的最佳治疗效果，在这一点剂量不再增加。考虑用来实施本发明方法的各种药物组合物应该含有大约0.01微克至大约100毫克(优选大约0.1微克至大约10毫克，更优选大约0.1微克至大约1毫克)本发明抗体/千克体重。当给药时， 本发明中使用的治疗组合物当然是无热源的生理可接受形式。上述组合物中还可以任选地包括本发明方法的抗体之外的治疗上有用的试剂，可以两者选其一地或另外地，同时或顺序地和本发明方法中的组合物一起给药。

[0070] 这里提供的抗体可以单独地给药或者与其他治疗方式联合给药。例如，治疗方法可以进一步包括对接触抗体的细胞送递电离辐射的步骤。根据测定存活恶性细胞的分析判断，以足以诱导相当大程度的恶性增殖细胞中细胞杀伤的量给与电离辐射。诱导的细胞杀伤程度显著大于单独的抗体或单独的电离辐射诱导的程度。电离辐射的典型形式包括β射线，γ射线，α粒子，和X-射线。这些可以从外部源，例如X-射线机器或γ照相机给与，或者从对患者施用的放射性核素送递给恶性组织。放射性核素的使用是本领域公知的，不需要进一步详述。例如，S.Hellman，Principles of Radiation Therapy，CANCER：PRINCIPLES&PRACTICE OF ONCOLOGY 248(V.T.DeVita，Jr.，等，编著，第四版，1993)中描述了电离辐射在恶性肿瘤的治疗中的应用。可以使用的剂量范围在大约1和500cGy之间(即，大约1至大约500rads)。

[0071] 利用这里公开的方法，这里提供的抗体可以单独使用或者与鉴定为内皮细胞增殖，迁移，和/或小管形成的抑制剂的其他抗体联合施用。共同施用的抗体对于相同的TEM的不同表位，不同的TEM，或者TEM和另一种血管发生-抑制或抗肿瘤靶是特异性的。 [0072] 利用本发明方法能治疗涉及血管发生的任何疾病。这样的疾病包括但不限于中枢神经系统肿瘤：多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，少突胶质瘤，室管膜和脉络丛肿瘤，松果体肿瘤，神经元肿瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，脑膜肉瘤；眼部肿瘤：基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，横纹肌肉瘤，成视网膜细胞瘤；内分泌腺肿瘤：垂体瘤，甲状腺瘤，肾上腺皮质肿瘤，神经内分泌系统肿瘤，胃肠胰腺内分泌系统肿瘤，生殖腺肿瘤；头颈肿瘤：头颈癌，口腔，咽，喉，牙原性肿瘤：胸部肿瘤：大细胞肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，胸部肿瘤，恶性间皮瘤，胸腺瘤，胸部原发生殖细胞肿瘤；消化道肿瘤：食管肿瘤，胃肿瘤，肝肿瘤，胆囊肿瘤，外分泌胰腺肿瘤，小肠肿瘤，蠕虫样阑尾和腹膜，结肠和直肠腺癌，肛门肿瘤；泌尿生殖道肿瘤：肾细胞癌，肾盂 和输尿管肿瘤，膀胱肿瘤，尿道肿瘤，前列腺肿瘤，阴茎肿瘤，睾丸肿瘤；女性生殖器官肿瘤：外阴和阴道肿瘤，子宫颈肿瘤，子宫体腺癌，卵巢癌，妇科肉瘤；乳腺肿瘤；皮肤肿瘤：基底细胞癌，鳞癌，皮肤纤维肉瘤，Merkel细胞肿瘤；恶性黑素瘤；骨和软组织肿瘤：成骨肉瘤，恶性纤维性组织细胞瘤，软骨肉瘤，尤因氏肉瘤，原发性神经外胚层肿瘤，血管肉瘤；造血系统肿瘤：骨髓发育不良综合征，急性髓细胞白血病，慢性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，HTLV-1，和T-细胞白血病/淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，肥大细胞白血病；儿童肿瘤：
急性成淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，成神经细胞瘤，骨肿瘤，横纹肌肉瘤，淋巴瘤，肾和肝肿瘤。其他疾病包括多囊性肾病；糖尿病视网膜病；类风湿性关节炎；牛皮癣；骨关节炎；听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼和生脓性肉芽肿；黄斑变性；早发视网膜病；角膜移植排异；新血管青光眼和晶状体后纤维组织增生。与血管发生相关的其他疾病包括但不限于，流行性角膜结膜炎，维生素A缺乏，特应性角膜炎，上缘角膜炎，翼状胬肉干燥性角膜炎，干燥综合征，phylectenulosis，梅毒，分支杆菌感染，脂变性，化学损伤，细菌性溃疡，真菌性溃疡，单纯疱疹感染，带状疱疹感染，原虫感染，卡波西肉瘤，角膜侵蚀性溃疡，Terrien′s边缘变性，边缘角质层分离，系统性红斑狼疮，多动脉炎，创伤，Wegeners肉样瘤病，巩膜炎，斯约二氏病，类天疱疮放射状角膜切开术，角膜图形排斥，和慢性炎症。

[0073] 这里提供的方法作为血管抑制和血管发生的生物测定也具有重要的非临床应用。通过在血管发生测定中提供阳性和阴性对照物，可以利用该方法检查和表征候选抗-血管发生分子的功效，同时评价对正常血管发生的可能的毒性作用。

[0074] 抗-血管发生分子是减少或消除血管发生的那些分子。这样的抑制作用通过导致抗-血管发生信号，空间位阻，减少的细胞表面表达等的TEM蛋白质的一种或多种关键结合残基的直接结合能产生。如这里使用的，术语″抗-血管发生分子″包括蛋白质和非蛋白质部分。在一个实施方案中，试剂是小分子。在另一个实施方案中，该试剂是蛋白质。 [0075] 这里提供了鉴定调节TEM蛋白质的血管发生抑制剂分子的方法，包括使携带肿瘤的TEM-转基因小鼠接触试验分子；并且测定肿瘤生长 的抑制作用，当接触试验分子的小鼠的肿瘤生长相对于没有接触试验分子的小鼠的肿瘤生长被减少时，鉴定该试验分子是调节TEM蛋白质或活性的血管发生抑制剂分子。在一个实施方案中，TEM是TEM1。在另一个实施方案中，TEM是TEM9。在另一个实施方案中，TEM是TEM17。

[0076] 利用常规转基因方法产生TEM转基因小鼠。在一个实施方案中，RPCI11-867G23 BAC克隆(GenBank登记号No.AP001107 InvitrogenCorp.)中的人TEM1cDNA是转基因。通过YS New Technology Institute，Inc.实施对C57B1/6小鼠胚胎的注射。得到的TEM1转基因小鼠然后与C57B1/6小鼠(Japan SLC，Inc.)杂交，得到另外的转基因后代。 [0077] 可以以任何合适的方式对任何合适的肿瘤注射，提供分析抗-血管发生分子的模型。肿瘤的鼠受者可以是任何合适的株。肿瘤可以是对肿瘤同基因，同种异基因，或异种的。受者可以是在一个或多个免疫相关功能中是有免疫能力的或者免疫受损的，包括但不限于nu/nu，scid，和beige小鼠。在一个实施方案中，受者是转基因小鼠。在一个具体实施方案中，转基因小鼠是带有人TEM1转基因的C57B1/6小鼠。人TEM1转基因包括RPCI11-867G23 BAC克隆(GenBank登记No.AP001107，Invitrogen Corp.)中TEM1的DNA序列。然后利用本领域常规方法将TEM1转基因注射到C57BL/6小鼠胚胎中。TEM1转基因小鼠然后与非转基因的相同株的小鼠杂交，增加转基因后代的数目。用同基因肿瘤细胞例如B16黑素瘤(ATCC)对TEM1转基因小鼠接种。利用常规方法通过定量测定原发或转移肿瘤生长能确定施用抗体对肿瘤生长的效果。至少一次给药中，抗体剂量的范围是1微克/小鼠至1毫克/小鼠。抗体可以通过任何合适的途径给药。在一个实施方案中，抗体的剂量是100微克/小鼠，每周两次。在一个具体实施方案中，在第0天，对C57B1/6人TEM1转基因小鼠皮下注射B16黑素瘤肿瘤，并且在指定的时间点通过使用卡钳测量原发肿瘤体积。可以使用任何合适的对照抗体。在一个例子中，对照抗体是产生抗半抗原二硝基苯的纯化的IgG1同位型对照抗体。

[0078] 利用这里提供的方法可以鉴定各种不同的试验抗-血管发生分子。抗-血管发生分子涉及多种化学种类。在一些实施方案中，它们是有机分子，优选具有大于50小于大约2500道尔顿分子量的小有机化合物。 抗-血管发生分子可以带有与蛋白质进行结构相互作用所必需的官能团，特别是氢键，并且可以包括至少一个胺基，羰基，羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。抗-血管发生分子可以带有被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。抗-血管发生分子还包括生物分子，如肽，糖，脂肪酸，甾族化合物，嘌呤，嘧啶，衍生物，结构类似物或者其组合。感兴趣的试验抗-血管发生分子还包括肽和蛋白质试剂，例如抗体或者其结合片段或模拟物，例如，Fv，F(ab′)2和Fab。 [0079] 试验抗-血管发生分子还可以从各种各样的来源获得，包括合成的或天然化合物文库。例如，对于各种各样的有机化合物和生物分子的随机和直接合成有多种方法，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可获得的或者容易制备。另外，天然或合成制备的文库容易通过常规化学、物理和生物化学方法修饰，并且可以用来制备组合库。可以对已知的试剂进行直接或随机化学修饰，例如酰化作用，烷基化作用，酯化作用，酰胺化作用等，来制备结构类似物。

[0080] 当能特异性抑制肿瘤生长至少20％，经常30，40，50，60，70，80或90％，有时100％时，试验抗-血管发生分子被鉴定为是一种抑制剂。利用常规测定方法能定量测定生长抑制作用。例如，对于原发肿瘤生长，对肿块垂直测量来计算肿瘤体积。根据需要，通过显微镜或肉眼观察能确定转移灶生长。对于转基因动物来说，肿瘤可以是同基因、同种异基因，或异种的。可以在肿瘤接种的时候，原发肿瘤生长确立之后，或者局部和/或远处转移确立之后施用试验抗-血管发生分子。利用任何常规给药方式能一次或多次施用试验分子，包括但不限于静脉内，腹膜内，瘤内，皮下和真皮内给药。

[0081] 下面的实施例是为了详细说明而不是限制本发明。

[0082] 实施例

[0083] 实施例1

[0084] 内皮前体细胞(EPC′s)

[0085] 在纤连蛋白或胶原单层培养物中，用VEGF，bFGF和肝素刺激表达内皮细胞系标记物AC133和CD34的骨髓细胞分化成描述为内皮前 体细胞(EPCs)的表型。简要地说，为了将骨髓细胞分化成EPC′s，利用常规方法分离AC133+/CD34+骨髓细胞群。在悬浮培养物中，在补充有15％FBS的IMDM培养基中用50ng/ml VEGF165，10-50ng/ml bFGF，和50ng/ml肝素刺激AC133+/CD34+细胞。细胞发生快速增殖和分化。然后在检查TEM功能的体外分析中使用得到的粘附细胞群。这些EPCs可以在培养物中扩增超过十二代并且表现出是来自骨髓的干细胞和完全分化的内皮细胞之间的中间群体。这些EPCs的表征表明它们具有很多与成熟内皮细胞例如HMVECs和HUVECs相同的性质。在体外，EPCs在Matrigel上能形成管，迁移和侵入，这是肿瘤微环境中新血管发生的重要性质。进行EPCs的SAGE分析，比较刺激(+VEGF)和非刺激(-VEGF)条件下的基因表达，观察显著差异。在体内，在免疫缺陷小鼠的Matrigel塞中植入人EPCs从而允许建立小鼠内人内皮血管发生模型时，人EPCs能形成管。根据流式细胞术分析，发现EPCs以类似于HUVEC和HMVEC的水平表达很多内皮表面标记物，包括CD31，P1H12，和CD105。另外，EPCs表达结肠肿瘤内皮标记物(TEMs)，与正常结肠粘膜内皮相比较，鉴定为来自结肠肿瘤新手术标本的内皮细胞中高水平表达的mRNAs。在人EPC中表达TEM mRNA的水平比在MHVECs和HUVECs中观察到的水平显著高。事实上，很多TEMs在MHVECs和HUVECs中检测不到。

[0086] 实施例2

[0087] TEM1抗体

[0088] 为了产生TEM1的小鼠多克隆抗体，用包含全长TEM1人基因的pcDNA 3.1人TEM1(hTEM1)质粒对C57B1/6小鼠肌内接种。使用3′和5′TEM1特异引物通过RT-PCR从人胎儿脑RNA克隆人TEM1编码序列。对5′端引物修饰使其包含CCACC 5′至ATG起始密码子的共有Kozak序列。测序证实扩增产物，2273碱基对(bp)片段，相应于美国系列No.09/918715(公开号No.20030017157)的SEQ ID NO.195(GenBank#；NM-020404)的核苷酸(nt)6-nt 2279，并且亚克隆到pCDNA3.1载体(Invitrogen)中。这种载体pcDNA3.1 hTEM1编码757个氨基酸的全长蛋白质。

[0089] 为了产生对于TEM1胞外结构域的多克隆特异性，将TEM1的全 长人基因的nt102至nt1963亚克隆到VV-1载体(Genovac AG，Freiburg，德国)，与位于5′端的5′信号序列和myc-TAG和位于3′端的GPI跨膜锚定基序位于同一读框中，产生VV-1TEM1。载体中包括的胞外部分编码美国系列No.09/918715(公开号No.20030017157)的SEQ ID NO.196(GenBank#NM-020404)的氨基酸33至684的TEM1。用VV-1TEM1载体对兔免疫接种。然后利用常规方法纯化兔多克隆的IgG成分。

[0090] 细胞表面表达：为了测定细胞表面上是否存在TEM1，用质粒载体pCFA-TEM1对COS细胞(ATCC)瞬时转染。将全长人TEM1克隆到pCFA载体主链中(Yew等，Hum.Gene Ther.10：223-34(1999)。然后用兔抗-TEM1多克隆对(没有透化的)细胞染色，接着用CY3-标记的抗-兔Ig抗体染色。然后用核染料(DAPI)对细胞复染并且通过荧光显微镜检查。荧光染色限于COS细胞的细胞表面，因此证明在转染细胞的表面上表达TEM1。

[0091] 利用流式细胞仪分析，在2H11内皮细胞(2H11细胞内源表达鼠TEM1)上用鼠多克隆抗TEM1抗体和使用VV-TEM1转染并且用兔多克隆抗人TEM1处理的Hek-293细胞证实TEM1的细胞表面表达。两种细胞都用抗-TEM1抗体阳性染色。这些实验第一次证明，TEM1是胞外和膜局部蛋白质。

[0092] 增殖测定：使用根据实施例1所述制备的人内皮前体细胞(EPC′s)，通过Crouch等，J.Immunol.Meth.160：81(1993)和Kangas等，Med.Biol.62：338(1984)中描述的方法，检测增殖。在补充有2％胎牛血清的培养基中在使用2×103细胞/孔的96孔板系统中评TM价增殖。ATP发光测定(CellTiter Glo Luminescent Cell Viability试剂盒，Promega)用作接触兔多克隆抗-人TEM1的人EPC的生长抑制终点。细胞与从100-800微克/毫升渐增浓度的抗体一起温育48-小时。对照IgG抗体是Sigma购买的兔血清IgG成分。不存在抗体时，检测3,662±354EPC′s。抗体是200，400和800微克/毫升时，对照IgG存在下观察到的细胞数目分别是4,185±117，4,418±38，和4,611±165。相反，200，400和
800微克/毫升抗-TEM1抗体存在下观察到的细胞数目分别是3,756±92，3,881±97，和
3,773±127，证明抗-TEM1抗体的抗-增殖作用。在用兔抗-TEM1多克隆抗体处理的鼠2H11内皮细胞中也观察到这种抗-增殖作用。不存在抗体时，2H11 细胞产生9,216±102个细胞。与200，400或800微克/毫升对照IgG一起温育的2H11细胞分别产生10,672±292个细胞，10,846±475个细胞，和11,977±267个细胞。但是存在抗-TEM1抗体，以200，400和800微克/毫升存在时，细胞数目分别减小至10,205±113个细胞，10,269±114个细胞，和8,725±97个细胞。

[0093] 迁移测定：根据Glaser等，Nature 288：483-84(1983)和Alessandri等，Cancer4
Res.43：1790-97(1983)所述，使用在8微米孔膜顶部上室中以每室5×10 在无血清培养基中平板培养的人EPC′s(根据实施例1所述制备)分析迁移。在下室中将补充有0.5％胎牛血清的培养基换为化学-诱引剂。在存在和不存在800微克/毫升抗-人TEM1兔多克隆抗血清或对照兔IgG成分下，让细胞通过膜下侧迁移48小时。抗体置于实验孔的上室和下室中。然后用钙黄绿素对通过膜迁移的细胞染色并且通过荧光强度定量测定。48小时之后，当没有抗体或者在对照IgG存在下温育时，迁移细胞分别产生7000和7750RFUs。然而，在抗-TEM1抗体存在下，RFUs减小至4200，表明迁移细胞数目显著减小。

[0094] 内皮管形成测定：根据Souza，等，Biotechniques，26：502-08(1999)所述，使用pAD(vantage)系统构建包含编码全长人TEM1的基因的腺病毒载体(Ad2CMV-TEM1)。使用Ad2CMV-TEM1感染人微血管内皮细胞(HMVEC)，MOI是300。病毒感染之后72小时，用胰蛋白酶消化HMVEC并且铺于Matrigel板，用于管形成测定。测定在24孔板上进行24小时。然后在37℃下用钙黄绿素AM(分子探针)对细胞染色30-60分钟，并且进行管荧光成像。利TM 4用MetaMorph成像分析定量测定管占据的区域。使用250微升Matrigel 以3×10 细胞/孔的密度将细胞铺板。没有抗体存在下，没有感染的，空载体(EV)-感染的，和TEM1-感染的细胞的管面积分别是90000，61000，和110000像素。存在对照抗体下，没有感染的，空载体(EV)-感染的，和TEM1-感染的细胞的管面积分别是38000，62000，和61000像素。存在
800微克/毫升抗-TEM1兔多克隆抗血清下，相对于接触预先免疫兔血清的细胞来说，发现腺病毒-TEM1-感染的HMVEC中管形成减少。没有感染的，空载体(EV)-感染的，和TEM1-感染的细胞的管面积分别是38000，80000，和42000。抗-TEM1抗体处理过的细胞相对于没有暴 露于抗-TEM1抗体的细胞中管面积来说管面积减小63％。

[0095] 实施例3

[0096] TEM17抗体

[0097] 为了产生TEM17胞外结构特异性多克隆抗体，将TEM17全长人基因的nt 152至nt1318亚克隆到VV-1载体(Genovac AGG，Freiburg，德国)，与位于5′端的5′信号序列和myc-TAGG和位于3′端的GPI跨膜锚定基序位于同一读框中，产生VV-1TEM17。载体中包括的胞外部分编码美国系列号No.09/918715(公开号No.20030017157)的SEQ IDNO.230的氨基酸24至412的TEM17。用VV-1TEM17载体对兔免疫接种。

[0098] 为了生产TEM17的鼠多克隆抗体，用包含全长TEM17人基因的pcDNA 3.1 hTEM17质粒对C57B1/6小鼠肌内免疫。使用3′和5′TEM17特异引物通过RT-PCR从人胎儿脑RNA克隆人TEM17编码序列。对5′端引物修饰使其包含CCACC 5′至ATG起始密码子的共有Kozak序列。测序证实1503bpd的扩增产物相应于美国系列No.09/918715(公开号No.20030017157)的SEQ ID NO.229(GenBank#；AF-279144)的nt83-nt1585，并且亚克隆到pCDNA3.1载体(Invitrogen)中。这种载体pcDNA3.1 hTEM17编码500个氨基酸的全长蛋白质。应用常规方法纯化兔和鼠多克隆的IgG成分。

[0099] 细胞表面表达：为了测定细胞表面上是否存在TEM17，用质粒载体pCFA-TEM17对COS细胞(ATCC)瞬时转染。将全长人TEM17克隆到pCFA载体主链中。pCFA载体主链在Yew等，Hum.GGene Ther.10：223-34(1999)中有描述。然后用兔抗-TEM17多克隆对(没有透化的)细胞染色，接着用CY3-标记的抗-兔Ig抗体染色。然后用核染料(DAPI)对细胞复染并且通过荧光显微镜检查。荧光染色限于COS细胞的细胞表面，因此证明在转染细胞的表面上表达TEM17。

[0100] 利用流式细胞仪分析，在2H11内皮细胞(2H11细胞内源表达鼠TEM17)上用鼠多克隆抗人TEM17抗体和使用VV-TEM17转染并且用兔多克隆抗人TEM17处理的Hek-293细胞证实TEM17的细胞表面表达。两种细胞都用抗-TEM17抗体阳性染色。这些实验第一次证明，TEM17是胞外和膜局部蛋白质。

[0101] 增殖测定：使用根据实施例1所述制备的人内皮前体细胞(EPC′s)，通过Crouch等，J.Immunol.Meth.160：81(1993)和Kangas等，Med.Biol.62：338(1984)中描述的方法，3
检测增殖。在补充有2％胎牛血清的培养基中在使用2×10 细胞/孔的96孔板系统中评TM
价增殖。ATP发光测定(CellTiter Glo Luminescent Cell Viability试剂盒，Promega)用作接触兔多克隆抗-人TEM17的人EPC的生长抑制终点。细胞与从100-800微克/毫升渐增浓度的抗体一起温育48-小时。对照IgG抗体是从Sigma购买的兔血清IgG成分。不存在抗体时，检测到3,662±354EPC′s。抗体是200，400和800微克/毫升时，对照IgG存在下观察到的细胞数目分别是4,185±117，4,418±38，和4,611±165。相反，200，400和
800微克/毫升抗-TEM17抗体存在下观察到的细胞数目分别是3,480±190，3,472±35，和
3,536±166，证明抗-TEM17抗体的抗-增殖作用。在用兔抗-TEM17多克隆抗体处理的鼠
2H11内皮细胞中没有观察到这种抗-增殖作用。

[0102] 迁移测定：根据Glaser等，Nature 288：483-84(1983)和Alessandri等，Cancer4
Res.43：1790-97(1983)所述，使用在8微米孔膜顶部上室中以每室5×10 在无血清培养基中铺板的EPC′s(根据实施例1所述制备)分析迁移。在下室中将补充有0.5％胎牛血清的培养基换为化学-诱引剂。在存在和不存在800微克/毫升抗-人TEM17兔多克隆抗血清或对照兔IgG成分下，让细胞通过膜下侧迁移48小时。抗体置于实验孔的上室和下室中。然后用钙黄绿素对通过膜迁移的细胞染色并且通过荧光强度定量测定。48小时之后，当没有抗体或者在对照IgG存在下温育时，迁移细胞分别产生4500和10000RFUs。然而，在抗-TEM17抗体存在下，RFUs减小至3500，表明迁移细胞数目相对于对照抗体处理的细胞显著减小。

[0103] 内皮管形成测定：为了检查抗-TEM17抗体对内皮细胞管形成的作用，在兔抗-TEM17多克隆抗体的存在下将人EPC(根据实施例1所述制备的)预先温育过夜。然后TM 4在用Matrigel 预先包被的48孔板上以2×10 细胞/孔在补充有0.5％和2％胎牛血清(FBS)的基础培养基中铺板。24小时之后，在37℃下用钙黄绿素AM(分子探针)对细胞染色
30-60分钟，并且进行管荧光成像。利用MetaMorph图像分析定量测定管占据的区域。存在对照抗体下，0.5％和2％FBS分别存在下，EPC 管面积分别是3000和2800像素。存在800微克/毫升抗-TEM17兔多克隆抗血清时，0.5％和2％FBS分别存在下，EPC的管面积分别是
2200和600象素，证明抗-TEM17抗体的有效抑制作用。类似地，在兔多克隆抗-TEM17存在下2H11内皮细胞的管形成被抑制。2H11细胞与800mg/ml抗体预先温育，然后在Matrigel中形成网络/管5小时。在对照IgG存在下，管面积是6000象素，而在抗-TEM17抗体存在下，面积是2300象素，表明抗-TEM17抗体对人EPCs和2H11内皮细胞的管形成提供抑制作用。

[0104] 实施例4

[0105] TEM9抗体

[0106] 为了生产TEM9的鼠多克隆抗体，用包含全长TEM9人基因的pcDNA3.1 hTEM9质粒对C57B1/6小鼠肌内免疫接种。通过人胎儿肾cDNA文库在pCMV Sport2中的集落杂交克隆人TEM9 cDNA。使用编码TEM9序列的1100bp PCR片段对cDNA筛选并且对阳性克隆完全测序。通过在cDNA的3′和5′端加入Notl和Sall位点产生cDNA文库。选择包含与美国系列号No.09/918715(公开号No.20030017157)的SEQ ID NO.211(AF-378755)的nt35-nt4030相同的3996bp全长TEM9 ORF的克隆pCMV Sport-2 TEM9(克隆9-1)中的一个。并且将pCMV Sport-2 TEM9的全长序列亚克隆到pCDNA3.1载体(Invitrogen)中，产生pcDNA3.1 hTEM9，在对小鼠的免疫中使用它。

[0107] 为了产生TEM9胞外结构特异性多克隆抗体，将TEM9全长人基因的nt 127至nt2290亚克隆到VV-1载体(Genovac AG，Freiburg，德国)，与位于5′端的5′信号序列和myc-TAG和位于3′端的GPI跨膜锚定基序位于同一读框中，产生VV-1TEM9载体。载体中包括的胞外部分编码美国系列No.09/918715(公开号No.20030017157)的SEQ IDNO.212的氨基酸32至752的TEM9。用VV1-TEM9载体对兔免疫接种。然后应用常规方法纯化兔和鼠多克隆的IgG成分。

[0108] 细胞表面表达：为了测定细胞表面上是否存在TEM9，用质粒载体pCFA-TEM9对COS细胞(ATCC)瞬时转染。将全长人TEM9克隆到pCFA载体主链中。pCFA载体主链在Yew等，Hum.Gene Ther.10：223-34(1999)中有描述。然后用兔抗-TEM9多克隆对(没有透化的)细胞染 色，接着用CY3-标记的抗-兔Ig抗体染色。然后用核染料(DAPI)对细胞复染并且通过荧光显微镜检查。荧光染色限于COS细胞的细胞表面，因此证明在转染细胞的表面上表达TEM9。

[0109] 利用流式细胞仪分析，在2H11内皮细胞(2H11细胞内源表达鼠TEM9)上用鼠多克隆抗TEM9抗体和使用VV-TEM9转染并且用兔多克隆抗人TEM9处理的Hek-293细胞证实TEM9的细胞表面表达。两种细胞类型都用抗-TEM9抗体阳性染色。这些实验第一次证明，TEM9是胞外和膜局部蛋白质。

[0110] 增殖检测：使用根据实施例1所述制备的人内皮前体细胞(EPC′s)，通过Crouch等，J.Immunol.Meth.160：81(1993)和Kangas等，Med.Biol.62：338(1984)中描述的方法，3
检测增殖。在补充有2％胎牛血清的培养基中在使用2×10 细胞/孔的96孔板系统中评TM
价增殖。ATP发光测定(CellTiter Glo Luminescent Cell Viability试剂盒，Promega)用作接触兔多克隆抗-人TEM9的人EPC的生长抑制终点。细胞与从100-800微克/毫升渐增浓度的抗体一起温育48-小时。对照IgG抗体是Sigma购买的兔血清IgG成分。对于EPC或鼠2H11细胞没有观察到增殖的抑制作用。

[0111] 迁移测定：根据Glaser等，Nature 288：483-84(1983)和Alessandri等，Cancer4
Res.43：1790-97(1983)所述，使用在8微米孔膜顶部上室中以每室5×10 在无血清培养基中平板培养的人EPC′s(根据实施例1所述制备)分析迁移。铺板之前2H11细胞与抗体预先温育30分钟。在下室中将补充有0.5％胎牛血清的培养基换为化学-诱引剂。在存在和不存在800微克/毫升抗-人TEM9兔多克隆抗血清或对照兔IgG成分下，让EPC和
2H11细胞分别通过膜下侧迁移48小时和4小时。抗体置于实验孔的上室和下室中。然后用钙黄绿素对通过膜迁移的细胞染色并且通过荧光强度定量测定。单独与对照血清温育导致迁移2H11细胞产生1000RFU，而抗-TEM9抗体将相对荧光减小至820RFUs，表明TEM抗体对迁移有抑制作用。在抗-TEM9抗体存在下对EPC观察到类似的抑制作用。使用如下所述制备的腺病毒-TEM9感染的(Ad2CMV-TEM9)HMVECs进一步证实抗-TEM9抗体对迁移的抑制作用。在对照IgG存在下，迁移的腺病毒-TEM9-感染的EPCs荧光强度是1899。抗-TEM9抗体的存在将荧光强度减小至1254。

[0112] 内皮管形成测定：根据Souza，等，Biotechniques，26：502-08(1999)所述，使用pAD(vantage)系统构建包含编码全长人TEM9的基因的腺病毒载体(Ad2CMV-TEM9)。使用Ad2CMV-TEM9转染人微血管内皮细胞(HMVEC)，MOI是300。病毒感染之后72小时，用胰蛋TM白酶消化HMVEC并且铺板于Matrigel ，用于管形成测定。测定在24孔板上进行24小时。
然后在37℃下用钙黄绿素AM(分子探针)对细胞染色30-60分钟，并且进行管荧光成像。
TM 4
利用MetaMorph图像分析定量测定管占据的区域。使用250微升Matrigel 以3×10 细胞/孔的密度对细胞铺板。与没有暴露于抗-TEM9抗体的细胞相比，抗-TEM9处理过的细胞的管面积没有减小。

[0113] 实施例5

[0114] 人抗-TEM1抗体

[0115] 通过免疫接种表达TEM1的FM3A细胞(FM3A/TEM1)或表达TEM1的L929细胞TM
(L929/TEM1)，使KM小鼠 (WO02/043478)产生抗TEM1人抗体，根据使用抗人TEM1的兔多克隆抗体试剂的流式细胞术分析(FACS)所测定的，这两种细胞稳定表达高水平人TEM1。为了建立FM3A/TEM1，通过电穿孔用包含人TEM1cDNA的质粒转染鼠FM3A乳腺癌细胞(ATCC)。通过使用BstXI位点将来自pcDNA3.1人TEM1的TEM1cDNA亚克隆到
pTracerEF-Bsd(Invitrogen)中来构建质粒。为了建立L929/TEM1，使用IT-LT1(MirUs)通过脂转染法用相同的质粒转染鼠L929成纤维细胞(ATCC)。然后使用细胞分选器，FACSVantage(BDBiosciences)，从用兔多克隆抗体试剂染色的转染子收集表达TEM1的细胞。FM3A/TEM1保持在补充有10％胎牛血清(FBS)和10微克/毫升杀稻瘟素S的改进的Eagle′s培养基中，而L929/TEM1保持在补充有10％FBS和10微克/毫升杀稻瘟素S的
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Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基中。5×10FM3A/TEM1细胞或1×10L929/TEM1细胞以两周间隔对小鼠腹膜内免疫接种三次。最后一次免疫接种时，细胞融合之前3天，对免疫的小鼠腹膜内注射5微克人白细胞介素-6。使用SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(ATCC)作为融合配偶体，从免疫动物的脾制备杂交瘤。通过使用表达TEM1的FM3A细胞对上清液进行的FACS分析筛选产生抗人TEM1的抗体的杂交瘤。简要地说，表达TEM1的FM3A细胞与 上清液在0℃下温育1小时。清洗之后，0℃下，细胞与RPE-偶联的抗-人κ链特异性抗体或RPE-偶联的抗-人γ链特异性抗体温育1小时。清洗之后，对细胞进行FACS分析。通过有限稀释方法克隆选择的杂交瘤。

[0116] 抗体的纯化：为了纯化抗体，使杂交瘤适应补充有1％低IgG FBS(HyClone)，5微克/毫升的胰岛素，5微克/毫升的转铁蛋白，10μM的乙醇胺，和25nM的亚硒酸钠的eRDF培养基(Kyokuto Pharmacy)。利用对于抗体生产常用的常规技术的组合从发酵肉汤中纯化IgG。澄清培养收集物，去除细胞和细胞碎屑，然后开始纯化程序。将收集物过滤实现纯化。澄清之后，捕获抗体并且利用在蛋白质A基质(MabSelect；Amersham Biosciences)上的亲和层析显著纯化。抗体与蛋白质A基质结合，将基质清洗之后，通过减小pH来洗脱。然后通过阴离子交换色谱(Q Sepharose Fast Flow；Amersham Biosciences)和阳离子交换色谱(SP Sepharose Fast Flow；Amersham Biosciences)实现抗体的进一步纯化。并且去除杂质，这个步骤也用来将缓冲液交换成PBS。

[0117] 增殖测定：在补充有2％胎牛血清的培养基中在使用2x103细胞/孔的96孔板系TM统中评价人内皮前体细胞(EPC)增殖。ATP发光测定(CellTiter Glo Luminescent Cell Viability试剂盒，Promega)用作与人抗体温育的人EPC的生长抑制终点。细胞与1微克/毫升的人抗-TEM1上清液一起温育48-小时。一定数量的抗体上清液对于EPC增殖是抑制性的。

[0118] 人TEM1抗体对肿瘤生长的抑制作用：为了体外评价抗人TEM1的人TEM1抗体，使用RPCI11-867G23 BAC克隆(InvitrogenCorporation)作为转基因建立人TEM1转基因小鼠。由YS NewTechnology Institute，Inc.进行对C57B1/6胚胎的转基因注射。然后TEM1转基因小鼠与非转基因C57BL/6小鼠(Japan SLC，Inc.)杂交，扩增转基因后代。第0天，6
对成年TEM1转基因小鼠皮下接种1×10 个B16黑素瘤细胞(ATCC)，在指定的时间点使用卡钳测量各个实验组各个小鼠的肿瘤体积。以100微克/小鼠的剂量从第一天起始，一周两次施用来自克隆7，克隆38，和克隆70的纯化的TEM1抗体，和纯化的对于半抗原(即