本发明公开了一种人用腮腺炎病毒组份疫苗及其制备方法和应用。该疫苗采用常规方法从感染腮腺炎病毒的人体内分离到一株腮腺炎病毒；该病毒经适应于Vero细胞培养后，可在该细胞内稳定生长，并达到105.0CCID50/ml产量，血凝滴度可达1∶8，病变周期为5～6天；然后制备单层静止或旋转Vero细胞培养物；经病毒的灭活与裂解及纯化分离，据其分子量大小，可判定为HN和NP两个抗原成分；该抗原组份在测定蛋白质含量后作为半成品疫苗；根据半成品疫苗蛋白浓度，以生理盐水稀释至100μl/ml，同时配制10.87mg/ml浓度的Al(OH)3，二者以对倍(V/V)混合，制成所需的腮腺炎病毒组份疫苗。该疫苗有效性高、安全性好。本发明的制备方法可用于制备数种副粘病毒的组份疫苗。
1.一种人用腮腺炎病毒组份疫苗，其特征在于，该疫苗是采用下述方法制备获得：
(1)腮腺炎病毒的分离：将感染腮腺炎病毒发病1～4天的患者的口漱液转入灭菌小平碟内，加入相当于口漱液量50％的Hanks液混合均匀，低速离心10分钟，取上清液，加入青霉素及链霉素，放置冰箱2小时后接种长成单层的Vreo细胞，后置37℃培养；每天观察有无细胞病变，培养6天后，出现细胞病变，后经血凝实验证实确有病毒感染；并用商业化的腮腺炎病毒抗体进行中和试验，明确所分离到的毒株即为腮腺炎病毒；
(2)制备单层静止或旋转Vero细胞培养物：采用0.25％胰酶0.01％EDTA消化已形成单层的Vero细胞，室温静置10min，弃去胰酶，再置室温10～15min，待细胞消化形成单个
后，以DMEM-8％BCS重悬细胞，稀释至10 细胞/ml，按10 细胞/瓶接种罗氏瓶静止培
养；按4×10 细胞/瓶，接种转瓶旋转培养；37℃培养2天，按0.01～0.05moi接种病毒，同时更换DMEM-1％BCS培养液，37℃继续培养5～6天，待细胞出现病变时收获病毒，取样
(3)病毒的灭活与裂解及纯化分离：收获病毒液经滴度测定及无菌检测后，按
1∶2000(V/V)加入福尔马林原液，37℃灭活7天，第一天内每隔2小时取样，第二天开始每天取样，测定病毒灭活曲线；7天后，灭活病毒经过滤浓缩，在原体积基础上浓缩100倍，按TritonX-1002％，SDS1％的比例，加入灭活病毒液，室温作用2小时；处理后灭活病毒液经由Sapharrose4B柱过滤后，采用试管共收集到两个峰，第二峰为样品分离组份；其病毒裂解产物分离，经血凝实验分析，确定取分离样品，经12％PAGE-SDS电泳分析，及Western blot，综合血凝实验分析，确定该分离组份包括两个主要抗原成分，据其分子量大小判定为HN和NP两个抗原成分，该抗原组份在测定蛋白质含量后作为半成品疫苗；
(4)腮腺炎病毒实验性疫苗的制备：根据半成品疫苗蛋白浓度，以生理盐水稀释至
100μl/ml，同时配制10.87mg/ml浓度的AL(OH)3，二者以对倍(V/V)混合，制成实验性组份疫苗并对其进行检测，其半成品蛋白含量＞2000μg/ml，无菌试验为(-)，甲醛残余量＜0.5mg/ml；该疫苗即为所需的腮腺炎病毒组份疫苗。
2.一种人用腮腺炎病毒组份疫苗的制备方法，其特征在于，该方法采用下述顺序的步骤：(1)腮腺炎病毒的分离：将感染腮腺炎病毒发病1～4天的患者的口漱液转入灭菌小平碟内，加入相当于口漱液量50％的Hanks液混合均匀，低速离心10分钟，取上清液，加入青霉素及链霉素，放置冰箱2小时后接种长成单层的Vreo细胞，后置37℃培养；每天观察有无细胞病变，培养6天后，出现细胞病变，后经血凝实验证实确有病毒感染；并用商业化的腮腺炎病毒抗体进行中和试验，明确所分离到的毒株即为腮腺炎病毒；
(2)制备单层静止或旋转Vero细胞培养物：采用0.25％胰酶0.01％EDTA消化已形成单层的Vero细胞，室温静置10min，弃去胰酶，再置室温10～15min，待细胞消化形成单个
后，以DMEM-8％BCS重悬细胞，稀释至10 细胞/ml，按10 细胞/瓶接种罗氏瓶静止培
养；按4×10 细胞/瓶，接种转瓶旋转培养；37℃培养2天，按0.01～0.05moi接种病毒，同时更换DMEM-1％BCS培养液，37℃继续培养5～6天，待细胞出现病变时收获病毒，取样
(3)病毒的灭活与裂解及纯化分离：收获病毒液经滴度测定及无菌检测后，按
1∶2000(V/V)加入福尔马林原液，37℃灭活7天，第一天内每隔2小时取样，第二天开始每天取样，测定病毒灭活曲线；7天后，灭活病毒经过滤浓缩，在原体积基础上浓缩100倍，按TritonX-1002％，SDS1％的比例，加入灭活病毒液，室温作用2小时；处理后灭活病毒液经由Sapharrose4B柱过滤后，采用试管共收集到两个峰，第二峰为样品分离组份；其病毒裂解产物分离，经血凝实验分析，确定取分离样品，经12％PAGE-SDS电泳分析，及Western blot，综合血凝实验分析，确定该分离组份包括两个主要抗原成分，据其分子量大小判定为HN和NP两个抗原成分，该抗原组份在测定蛋白质含量后作为半成品疫苗；
(4)腮腺炎病毒实验性疫苗的制备：根据半成品疫苗蛋白浓度，以生理盐水稀释至
100μl/ml，同时配制10.87mg/ml浓度的AL(OH)3，二者以对倍(V/V)混合，制成实验性组份疫苗并对其进行检测，其半成品蛋白含量＞2000μg/ml，无菌试验为(-)，甲醛残余量＜0.5mg/ml；该疫苗即为所需的腮腺炎病毒组份疫苗。
一种人用腮腺炎病毒组份疫苗及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种人用腮腺炎病毒组份疫苗。同时，本发明还涉及所述疫苗的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 腮腺炎疫苗是全球儿童常规接种的病毒性疫苗之一。目前，该疫苗的使用形式在各国均采用减毒活疫苗，由于其应用，已经成功地在多数国家，尤其是发达国家的许多地区控制了儿童腮腺炎的发病率。但是，随着这一减毒活疫苗在人群中的广泛应用和相应发病率的降低，其有可能和其它类似病毒活疫苗一样，存在着出现毒力变化及在人群中形成一个特定亚型的可能性。另外，这类疫苗的不同毒株之间也表现有程度不一的免疫学效果的差异性，所诱导的人群的免疫学效果尚不是最佳。因此，从疫苗的发展角度看，在现有的腮腺炎减毒活疫苗的基础上，进行相应疫苗的研究开发，将可以提升这类疫苗的有效性和安全性。从疫苗生物技术的角度看，探索具有较好免疫原性的组份疫苗或亚单位疫苗，将是下一步疫苗研制与使用的最佳形式。
[0003] 目前，使用亚单位形式的病毒疫苗仅为乙型肝炎病毒表面抗原疫苗，而作为病毒性组份疫苗，仅有裂解流感病毒疫苗作为一种初步的组份疫苗形式应用。因此，进一步研究多种病毒性疾病的组份或亚单位形式疫苗，具有重要的技术意义。而利用腮腺炎病毒来首先作为这项工作的对象，由于该病毒的结构特点及生物学特性，因此具有较为可行的技术意义。
[0004] 腮腺炎病毒属于副粘病毒，其基因组为负链单股RNA，由15500个核苷酸组成，其编码7个蛋白，它们分别是NP、P、M、F、SH、HN及L蛋白，其中的HN和NP蛋白在病毒的特异性免疫原性方面具有重要意义，二者均能够诱导机体的体液免疫及细胞免疫反应，尤其是HN可诱导机体产生中和性抗体，以及血凝抑制中和抗体。其中NP为70KD大小，HN为77KD大小，并具有血凝活性。另外，由于腮腺炎病毒能够生长于多种组织培养细胞，如Vero细胞，因而有利于大规模培养制备。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足及现实状况的迫切需要，利用生物技术手段，提供一种人用腮腺炎病毒组份疫苗。同时，本发明还提供一种所述组份疫苗的制备方法。该方法所建立的Vero细胞组织培养、病毒裂解及组份分离方法，可用于制备数种副粘病毒的组份疫苗。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
[0007] 本发明提供了一种人用腮腺炎病毒组份疫苗，该疫苗是采用下述方法制备获得：采用常规方法从腮腺炎流行的人体内分离到一株腮腺炎病毒；该病毒经适应于Vero细胞
5.0
培养后，可在该细胞内稳定生长，并达到10 CCID50/ml产量，血凝滴度可达1∶8，病变周期为5～6天；然后制备单层静止或旋转Vero细胞培养物；经病毒的灭活与裂解及纯化分离，获得相应的病毒蛋白组份，据其分子量大小，可判定为HN和NP两个抗原成分；该抗原组份在测定蛋白质含量后作为半成品疫苗；根据半成品疫苗蛋白浓度，以生理盐水稀释至
100μl/ml，同时配制10.87mg/ml浓度的Al(OH)3，二者以对倍(V/V)混合，制成实验性组份疫苗，并对其进行检测：其半成品蛋白含量＞2000μg/ml，成品蛋白含量为100μg/ml，无菌试验为(-)，甲醛残余量＜0.5mg/ml；该疫苗即为所需的腮腺炎病毒组份疫苗。
[0008] 本发明同时提供了所述的人用腮腺炎病毒组份疫苗的制备方法，该方法采用下列顺序的步骤：
[0009] (1)腮腺炎病毒的分离
[0010] 从感染腮腺炎病毒的人体内分离到一株腮腺炎病毒，发病1～4天的患者的口漱液转入灭菌小平碟内，加入相当于口漱液量50％的Hanks液混合均匀，低速离心10分钟，取上清液，加入青霉素及链霉素，放置冰箱2小时后接种长成单层的Vero细胞，后置37℃培养。每天观察有无细胞病变，培养6天后，出现细胞病变，后经血凝试验证实确有病毒感染；并用商品化的腮腺炎病毒抗体进行中和试验，明确所分离到的毒株即为腮腺炎病毒。
[0011] 所分离腮腺炎病毒为SH基因及其旁侧序列，根据基因分型，确定其属于F基因型；5.0
该病毒经适应于Vero细胞培养后，可在该细胞内稳定生长，并达到10 CCID50/ml产量，血凝滴度可达1∶8，病变周期为5～6天。
[0012] (2)制备单层静止或旋转Vero细胞培养物
[0013] 采用0.25％胰酶-0.01％EDTA消化已形成单层的Vero细胞，室温静置10min，弃去胰酶，再置室温10-15min，待细胞消化形成单个后，以DMEM-8％BCS重悬细胞，稀释至5.0 6.0 6.0
10 细胞/ml，按10 细胞/瓶接种罗氏瓶静止培养；按4×10 细胞/瓶，接种转瓶旋转培养；37℃培养2天，按0.01-0.05moi接种病毒，同时更换DMEM-1％BCS培养液，37℃继续
5.0
培养5～6天，待细胞出现病变时收获病毒，取样测定滴度；其滴度应为10 CCID50/ml。
[0014] (3)病毒的灭活与裂解及纯化分离：
[0015] 收获病毒液经滴度测定及无菌检测后，按1∶2000(V/V)加入福尔马林原液，37℃灭活7天，第一天内每隔2小时取样，第二天开始每天取样，测定病毒灭活曲线(见图-1)；7天后，灭活病毒经过滤浓缩，在原体积基础上浓缩100倍，按2％TritonX-100，
11％SDS的比例，加入灭活病毒液，室温作用2小时。处理后灭活病毒液由Sapharose4B柱过滤，其病毒裂解产物分离结果见图-2，经血凝实验分析结果见图-3，确定取分离样品，经PAGE-SDS(12％)电泳分析，及Western blot(图-5)综合血凝实验分析，确定该分离组份包括两个主要抗原成分，据其分子量大小，可判定为HN和NP两个抗原成分；该抗原组份在测定蛋白质含量后作为半成品疫苗。
[0016] (4)腮腺炎病毒实验性疫苗的制备
[0017] 根据半成品疫苗蛋白浓度，以生理盐水稀释至100μl/ml，同时配制10.87mg/ml浓度的Al(OH)3，二者以对倍(V/V)混合，制成实验性组份疫苗，即为所需的人用腮腺炎病毒组份疫苗。
[0018] 本发明对所述的人用腮腺炎病毒组份疫苗进行蛋白含量、无菌、甲醛残余量的检测，检测结果如下：
[0019] 半成品蛋白含量：＞2000μg/ml；
[0020] 成品蛋白含量： 100μg/ml
[0021] 无菌试验： (-)
[0022] 甲醛残余量检测：＜0.5mg/ml
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
[0024] (1)品质优良：本发明所研制的腮腺炎病毒组份疫苗，仅含有HN、NP两个免疫原性强的蛋白亚单位；
[0025] (2)有效性高；将本发明所研制的腮腺炎病毒组份疫苗及商品化的腮腺炎病毒减毒活疫苗分别免疫小鼠，ELISA结果检测显示本组份疫苗所产生抗体效价明显高于商品化减毒活疫苗的抗体效价；充分说明本组份疫苗由于仅含免疫原性强的蛋白亚单位，因此能诱导机体产生更高的免疫应答效果；
[0026] (3)安全性好；本发明所研制的腮腺炎病毒组份疫苗相对于灭活全病毒而言，由于病毒经过裂解剂处理之后，相对分子质量变小，并且只保留了具有抗原性的蛋白亚单位；因此，副反应大大降低，具有更好的安全性。
附图说明
[0027] 图1是病毒灭活曲线；图中：病毒灭活前以0点表示，感染性滴度为105.0CCID50/ml，灭活8小时后感染性滴度降为0，已彻底灭活。
[0028] 图2是第二峰14～23管的的PAGE-SDS(12％)电泳图谱、17管的Western blot图谱。
[0029] 图3是17、18管的电泳结果，可见出现两条带，大小均为70KD。
[0030] 图4是17管的Western blot结果，采用腮腺炎病毒抗血清作为一抗，可见出现两条特异性条带，综合血凝及电泳中条带位置的分子量大小，可明确为HN及NP蛋白。
具体实施方式
[0031] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但这并不是对本发明内容的限定。
[0032] 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
[0033] 实施例1
[0034] ——病毒的灭活与裂解及纯化分离
[0035] 收获病毒液经滴度测定及无菌检测后，按1∶2000(V/V)加入福尔马林原液，37℃灭活7天，第一天内每隔2小时取样，第二天开始每天取样，测定病毒灭活曲线，如图
1所示。7天后，灭活病毒经过滤浓缩，在原体积基础上浓缩100倍，按TritonX-100 2％，SDS1％的比例，加入灭活病毒液，室温作用2小时。处理后灭活病毒液由Sapharose4B柱过滤，其病毒裂解产物分离结果见表1，经血凝实验分析结果见表2，确定取分离样品，经PAGE-SDS(12％)电泳分析，及Western blot(见图2～图4)综合血凝实验分析，确定该分离组份包括两个主要抗原成分，据其分子量大小，可判定为HN和NP两个抗原成分；该抗原组份在测定蛋白质含量后作为半成品疫苗。
[0036] 表1.病毒裂解产物分离结果
[0037]
[0038] 如表1所示处理后灭活病毒液经由Sapharose4B柱过滤后，采用试管共收集到两个峰。
[0039] 实施例2
[0040] ——腮腺炎病毒实验性疫苗的制备
[0041] 根据半成品疫苗蛋白浓度，以生理盐水稀释至100μl/ml，同时配制10.87mg/ml浓度的Al(OH)3，二者以对倍(V/V)混合，制成实验性组份疫苗，所制成的即为本发明所研制的腮腺炎病毒组份疫苗。
[0042] 试验例1
[0043] ——对所述的组份疫苗的免疫原性分析
[0044] 取PSF小鼠若干只，以20只为一组，分别设定50μg/只剂量组，100μg/只剂量组，150μg/只剂量组，在小鼠后右肢皮下注射，4周后取血，分离血清，检测抗病毒抗原抗体的滴度，其结果见表2。检测结果表明100μg/只剂量组100％地出现了抗腮腺炎病毒抗体的阳转。使用这些抗体的中和试验表明，该腮腺炎病毒实验性疫苗诱导的抗体对腮腺炎病毒具有中和效力。采用ELISA试剂盒检测抗病毒抗原抗体的滴度，结果可见免疫后100μg/只剂量组100％地出现了抗相应病毒抗原抗体的阳转。
[0045] 表2.免疫后病毒抗体阳转结果
[0046]
[0047] 试验例2
[0048] ——组份疫苗的安全性分析
[0049] 对使用该组份疫苗的小鼠进行全面系统的病理学分析表明，该实验性疫苗不会引起任何器官产生可见的病理学变化。
[0050] 小鼠病理报告结果：心、肝、脾、肺、肾、腮腺、脑各脏器均未见异常。
[0051] 试验例3
[0052] ——血凝实验分析结果
[0053] 表3.
[0054]
[0055] 表3所示为每一管样品的血凝结果，血凝程度以++++、+++、++、+、±、-表示。结果为第二峰全部管数的样品均出现血凝++++，而第一峰及平台期各管血凝结果均为-。由此可初步判定第二峰为样品分离组份，并且含HA蛋白。再将第二峰各管样品作倍比稀释。
[0056] 表4.血凝效价结果
[0057]
[0058] 表4以+作为结果判定标准，并且各管血凝效价均高于原病毒血凝效价(1∶8)，因此更进一步确定第二峰为样品分离组份。
