包覆的磁性颗粒的制备方法

摘要

一种制备包覆的含有超顺磁性晶体的聚合物颗粒的方法，所述方法包括使0.5-1.8μm直径的、多孔的、表面官能化的、含超顺磁性晶体的聚合物颗粒与至少一种多异氰酸酯和至少一种二醇或至少一种环氧化物反应。

权利要求

1.一种制备包覆的含有超顺磁性晶体的聚合物颗粒的方法，所述方法包括使多孔的、表面官能化的、含超顺磁性晶体的0.5-1.8μm直径的聚合物颗粒与至少一种多异氰酸酯和至少一种二醇反应，其中聚合物上的表面官能团为能与多异氰酸酯反应，从而使该多异氰酸酯共价键合到表面上的基团，其中使所述颗粒在第一阶段中与多异氰酸酯和至少一种二醇的混合物反应，其中多异氰酸酯相对于二醇摩尔过量，并且在第二阶段中随后与至少一种二醇反应；或者使该颗粒在第一阶段中在没有二醇的条件下与多异氰酸酯反应，并且在第二阶段中与至少一种二醇反应。

2.如权利要求1所述的方法，其中采用至少两种二醇。

3.如权利要求2所述的方法，其中至少一种所述的二醇是聚乙二醇。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述的二醇为二甘醇和四甘醇。

5.如权利要求2所述的方法，其中一种所述二醇为聚乙二醇。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述的多异氰酸酯为4，4-亚甲基双(苯基异氰酸酯)或包含具有CH2-苯基异氰酸酯残基的4，4-亚甲基双(苯基异氰酸酯)的多异氰酸酯。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述的多异氰酸酯为二异氰酸酯。

8.如权利要求1所述的方法，其中在该反应的第一阶段中使用两种二醇，并且在第二阶段中使用一种或两种二醇。

9.如权利要求8所述的方法，其中在两个反应阶段中都使用二甘醇和四甘醇。

10.如权利要求1所述的方法，其中使所述颗粒在第一阶段中在没有二醇的条件下与多异氰酸酯反应，并且在第二阶段中与一种二醇反应，并且所述二醇为聚乙二醇。

11.如权利要求1所述的方法，其中使所述的颗粒还与聚合物交联剂反应。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述的交联剂为二乙烯基苯。

13.如权利要求1所述的方法，其中该颗粒是胺官能化的。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述的多孔的表面官能化聚合物颗粒是经硝化并还原的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒。

15.如权利要求1所述的方法，其中该聚合物颗粒的直径为0.5-1.2μm。

16.如权利要求15所述的方法，其中该聚合物颗粒的直径为1μm。

17.如权利要求1所述的方法，其中使所述的包覆颗粒随后甲苯磺酰化。

18.如权利要求1所述的方法，其中在包覆反应之后，使所述的颗粒偶合到药物分子、指示器部分或配体上。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述的配体为核酸、蛋白质或糖。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述的配体为单克隆抗体或多克隆抗体。

21.如权利要求18所述的方法，其中所述的配体为多糖、肽或肽编码核酸分子。

22.如权利要求18所述的方法，其中所述的配体为抗体片段。

23.如权利要求18所述的方法，其中所述的配体为低聚核苷酸、低聚肽或抗原。

24.如权利要求19所述的方法，其中所述的配体为抗生蛋白链菌素。

25.如权利要求2所述的方法，其中至少一种所述的二醇是具有通式HO((CH2)mO)nH的二醇，其中n为1-15的整数，并且m为2-6的整数。

26.由权利要求1-25中任一项所述的方法获得的颗粒。

27.如权利要求1-25中任一项所述方法的产物在非疾病的诊断和治疗的测定中的应用。

28.如权利要求27所述的应用，其中所述的测定为用于核酸检测或为免疫测定。

29.如权利要求1-25中任一项所述方法的产物在非疾病的诊断和治疗的疏水作用色谱法或非疾病的诊断和治疗的反相色谱法中的应用。

30.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒由乙烯类聚合物的组合制造。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述颗粒由苯乙烯、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯的组合制造。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述颗粒的聚合物通过加入交联剂交联。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述交联剂为二乙烯基苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯。

34.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒的直径为0.75-1.2μm。

说明书

包覆的磁性颗粒的制备方法

[0001] 本发明涉及包覆的磁性聚合物颗粒的制备方法。

[0002] 磁性聚合物颗粒在各种医药和生物化学领域中是普遍有效的，例如作为用于药物传递、诊断目的、分离目的和合成目的的运输载体。为了执行这些功能，这种颗粒依赖于它们的磁性。在诊断分析应用中，例如对含有结合在磁性聚合物颗粒上的被分析物的样品施加磁场，能使被分析物分离，而无需使用离心分离和过滤，以及在治疗应用中，例如对患者施加磁场，可使负载靶向药物的磁性聚合物颗粒送达预期的身体部位。

[0003] 磁性在此表示聚合物颗粒含有超顺磁性晶体的意思。因此该磁性聚合物颗粒是磁性可替换的(displaceable)，而非永久磁化的。很多制备磁性聚合物颗粒的方法是已知的，其中大量方法涉及由预成型的磁性氧化铁例如磁铁矿制备含磁赤铁矿或磁铁矿的聚合物颗粒。所涉及的一些方法描述在US-A-4,654,267(Ugelstad)，其中将其内容通过引用结合于此。

[0004] 因此US-A4,654,267概述了许多有关在它之前方法的局限性；这些包括在获得相似大小的磁性颗粒和/或其均匀或均一的磁性上的困难，以及包括更多一般性问题，涉及将磁性材料结合到多孔聚合物颗粒空腔中的困难。

[0005] 由于沉积主要发生在表面上或在大开孔的空腔中，因此磁性颗粒的浸出是有问题的，这缩短了磁性聚合物颗粒在其应用中的有效寿命。

[0006] 为了克服这些缺陷，US-A-4,654,267提出一种制备方法，通过以它们最简单的形式，用铁化合物溶液浸渍多孔聚合物颗粒，然后例如通过升高pH值使铁沉淀。该沉淀的铁化合物通过加热随后可转化成超顺磁性氧化铁晶体。

[0007] 为了制备在聚合物孔中沉积有磁性材料的多孔磁性聚合物颗粒，US-A-4,654,267主张使用具有用于将铁离子牵引到聚合物颗粒中的表面官能团的多孔聚合物颗粒。这些官能团可在聚合物制备中由使用官能化共聚单体产生，或由用以引入官能团的聚合物后聚合处理产生，例如通过偶合到聚合物表面上或转换聚合物表面上现有的基团。

[0008] 虽然公开于US-A-4,654,267的发明在某种程度上确实解决了制备具有更加均匀磁性的磁性聚合物颗粒的问题，但仍存在从聚合物颗粒中浸出超顺磁性晶体的问题。

[0009] 现已令人吃惊地发现，对于一定大小的颗粒，可以解决这些问题，并且具有特别适合的表面特性的磁性颗粒，可通过表面官能化的磁性聚合物颗粒与多异氰酸酯/二醇的组合或与环氧化单体的反应来制备，从而产生“包覆的”磁性聚合物颗粒。

[0010] 因此，从第一方面看，本发明提供了制备包覆的含超顺磁性晶体的聚合物颗粒的方法，所述方法包括使多孔的、表面官能化的、含超顺磁性晶体的聚合物颗粒与至少一种、优选至少两种环氧化合物反应，其中该聚合物颗粒的直径为0.5-1.8μm、更优选0.75-1.2μm、特别地约为1μm。

[0011] 从第二方面看，本发明提供了包覆的含超顺磁性晶体的聚合物颗粒的制备方法，所述方法包括使多孔的、表面官能化的、含超顺磁性晶体的聚合物颗粒与至少一种多异氰酸酯，如二异氰酸酯，和至少一种、优选至少两种二醇反应，其中该聚合物颗粒的直径为0.5-1.8μm、如0.75-1.2μm、特别地约为1μm。

[0012] 优选的二醇为聚乙二醇或具有通式HO((CH2)mO)nH(其中n为1-15的整数，例如2-10，优选2-4，并且m为2-6的整数，优选2-3，最优选2)。当仅使用一种二醇时，该二醇优选为聚乙二醇，例如聚乙二醇300、400、500或600。

[0013] 在本发明方法中所用的多孔聚合物颗粒可为具有官能化表面的任意多孔聚合物，例如在US-A-4,654,267中所述的那些。

[0014] 聚合物上的表面官能团优选为能与多异氰酸酯或环氧化物反应，从而使多异氰酸酯或环氧化物共价键合到表面上的基团，其中该基团任选地具有活化作用。最优选，该表面是胺官能化的。

[0015] 聚合物优选地由乙烯类聚合物(vinylic polymer)的组合制造，该乙烯聚合物例如苯乙烯、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯。聚合物材料任选地为交联的，例如通过加入交联剂，例如作为共聚单体，如二乙烯基苯(DVB)或二甲基丙烯酸乙二醇酯。含有DVB的颗粒是优选的。

[0016] 所需交联剂(例如共聚单体)的适当量对本领域技术人员来说是众所周知的。聚合物优选为交联的苯乙烯类聚合物(例如苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，其通过使用含硝基的共聚单体如硝基-苯乙烯，并随后通过还原作用，从而使其表面官能化)或交联的(甲基)丙烯酸类聚合物，其通过使用含环氧基团的共聚单体(例如甲基丙烯酸缩水甘油酯)并随后胺化(例如通过与乙二胺反应)，从而使其表面官能化。

[0017] 在本发明方法中所用的聚合物颗粒中的超顺磁性晶体，可为能够在多孔聚合物颗粒中沉积成超顺磁性晶形的任意材料。磁性氧化铁，例如磁铁矿或磁赤铁矿是优选的；然而，如果希望的话，晶体可为混合金属氧化物或其它磁性材料。所存在的结晶磁性材料的总量通常大于1％，优选大于3％，理想地大于或等于5％(按重量计)，例如高达40重量％。该百分比是基于包覆的颗粒的总干重，按Fe(或在不同于氧化铁的其它磁性材料的情况下，按当量金属计)的重量基位计的。

[0018] 根据本发明的聚合物颗粒一般具有0.5-1.8μm，例如0.75-1.2μm，优选0.9-1.1μm的大小(即直径)。

[0019] 典型地，所用的多孔颗粒具有至少15m2/g的表面积(根据BET氮气吸收法测量)，2 2
和更优选至少30m/g的表面积，例如高达700m/g，当折算成2.7μm的平均粒径时(即表面积乘以2.7/MD，其中MD是以微米计的平均直径)。类似折算地，颗粒孔体积优选为至少
0.1mL/g。

[0020] 典型地，聚合物颗粒在被包覆前是球形的并且基本上是单分散的，和特别优选地，一旦它们被包覆后仍保持球形并基本上是单分散的。

[0021] 基本上是单分散的意思是，对于大多数颗粒而言(例如至少100，更优选至少1000)，该颗粒具有小于20％的变差系数(CV)，例如小于15％，优选小于12％，更优选小于
11％，再更优选小于10％，以及最优选不大于约8％，例如2-5％。如下式以百分比计确定CV：

[0022] CV＝(100×标准偏差)/平均数

[0023] 其中平均数为平均粒径，并且标准偏差为粒径的标准偏差。优选按主要模式计算CV，即通过使单模态分布曲线拟合测得的粒径分布来计算。因此在计算中，可以忽略一些低于或超出模型尺寸的颗粒，其中例如可基于约90％的总颗粒数(其为可检测的颗粒)。在Coulter LS 130粒径分析仪上可以进行这种CV测定。

[0024] 在本发明中特别有用的聚合物颗粒公开在WO99/19375(Dyno Industrier ASA)、WO00/61648(Dyno Specialty Polymers AS)中，如WO01/70825所公开的，该聚合物颗粒部分地由氨基苯乙烯制备，将其内容通过引用结合与此。

[0025] 可选择地，与WO01/70825相对比，聚合物材料的官能化(functionalisation)发生在聚合反应之后，例如通过硝化并随后将如此形成的硝基还原成侧胺基；或直接胺化，例如通过用氨基乙醇处理。作为进一步的选择，可以使用由著名的Ugelstad两步溶胀法制备的聚合物颗粒，及其公开于WO00/61647(Dyno)中的改进。这里还可以使用由WO99/19375和WO00/61648中公开的方法制备的聚合物颗粒。根据这些出版物中所述方法制备的多孔聚合物颗粒，可具有通过标准工艺(例如如上文所述的工艺)沉积在它们孔隙中的磁性颗粒。作为进一步的可能性，多孔聚合物颗粒可由硝基苯乙烯和DVB制备，并且如US-A-4,654,267中教导的引入磁性物质。所有这些方法中，在负载氨基的聚合物材料的制备中，使用氨基苯乙烯，具体地4-氨基苯乙烯作为单体或共聚单体是优选的。这种单体或共聚单体的使用避免了需要后聚合硝化和还原反应。而且，由此方法提供的更可预知的包覆层性能(均匀性)，使得可以使用更可靠的包覆层。

[0026] 多孔磁性聚合物颗粒与环氧化物或多异氰酸酯的反应，产生在聚合物颗粒孔内的聚合物，其基本上用于堵住这些孔，从而物理地包封住在聚合物颗粒内的超顺磁性晶体。所得“包覆的”颗粒从而相对于多孔原材料具有降低的孔隙率。我们已令人吃惊地发现，超顺磁性晶体显示出催化聚合反应的作用，以致包覆层优先在它们附近形成。

[0027] 如果希望的话，环氧类聚合物(epoxide polymer)包覆层可以是交联的，例如通过以已知方式应用异氰酸酯或二异氰酸酯。同样地如果希望的话，只要在包覆层聚合物交联之前，在包覆聚合反应之前或者在包覆聚合反应之后，都可以使另外的材料渗透到多孔颗粒中。这些另外的材料典型地为辐射发射体或吸收体，例如发色团、荧光团或放射性标记材料。

[0028] 颗粒可与单独的环氧化物反应形成包覆层。这里合适的环氧化物包括缩水甘油、烯丙基缩水甘油醚或甲基丙烯酸缩水甘油酯。具体地，包含与氯化铁(III)相结合的甲基丙烯酸缩水甘油酯的包覆反应制备出了有利的包覆层。

[0029] 然而，在优选的实施方式中，多孔聚合物颗粒与环氧化物的混合物反应，例如2-6环氧化物，特别地2、3或4环氧化物。其中优选含至少30mol％，更优选至少45mol％的双环氧化物或多环氧化物。

[0030] 根据本发明所使用的环氧化物优选地含有至少一种双环氧化物，例如两种双环氧化物的组合或单环氧化物和双环氧化物的组合。优选地，环氧化物含有至少一个醚链接和任选地含有疏水组分，例如C4-10亚烷基链或苯基或双苯基(bisphenyl)。通常，环氧化物具有3-50，优选地3-25的碳原子含量。

[0031] 可使用的典型的环氧化物包括表氯醇、表溴醇、异丙基缩水甘油醚、丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-双(2，3-环氧丙氧基)丁烷)、新戊二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚(例如Mw为150-1000g/mol)、丙三醇二缩水甘油醚、丙三醇丙氧基化物三缩水甘油醚、缩水甘油、甲基丙烯酸缩水甘油酯、和基于双酚A或双酚F的环氧化物，例如2，2-双(4-(2，3-环氧丙氧基)苯基)丙烷。

[0032] 特别优选的环氧化物包括2，2-双(4-(2，3-环氧丙氧基)苯基)-丙烷、烯丙基缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚和缩水甘油。具体地，以Araldite商标名出售的环氧化物是有利的，例如Araldite LY-564(2，2-双(4-(2，3-环氧丙氧基)苯基)丙烷和1，4-丁二醇二缩水甘油醚的混合物)和Araldite LY-026(80％的纯1，4-丁二醇二缩水甘油醚)。

[0033] 在本发明范围中，第一包覆反应可以使用单独的环氧化物进行，且第二包覆反应可以使用至少两种环氧化物的混合物进行。

[0034] 在另一个优选的实施方式中，由一种或多种(例如1、2或3)多异氰酸酯和一种或多种(例如2、3或4)二醇形成包覆层聚合物。优选地，可以使用一种多异氰酸酯，例如一种二异氰酸酯。可选择地，可以使用与多异氰酸酯密切相关的混合物(例如Desmodur)。

[0035] 可以使用的典型的多异氰酸酯包括亚甲基二异氰酸酯、六亚甲基二异氰酸酯、2，4-甲苯二异氰酸酯(2，4-TDI)(及其异构体或其混合物)、异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)、4，
4′-氧双(苯基异氰酸酯)、4，4′-二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、MDI和基于MDI的低聚物的混合物(例如Desmodur VL)、2，4-二苯基二异氰酸酯、亚甲基双环己基二异氰酸酯(H12MDI)、亚苯基二异氰酸酯(p-PDI)、反式-环己烷-1，4-二异氰酸酯(CHDI)、1，6-二异氰酸己酯(DICH)、1，5-二异氰酸萘酯(NDI)、对四甲基二甲苯二异氰酸酯(p-TMXDI)或间四甲基二甲苯二异氰酸酯(m-TMXDI)。

[0036] 特别优选的异氰酸酯为MDI或基于其的多异氰酸酯(例如Desmodur)。Desmodur包含MDI及其包含具有CH2-苯基异氰酸酯残基的MDI的低聚物。因此，Desmodur是各种衍生自MDI的多异氰酸酯的混合物。样品的构成可为：

[0037] 4，4-亚甲基双(苯基异氰酸酯)：40-50％

[0038] 4，4-亚甲基双(苯基异氰酸酯)+异氰酸苄酯：20-25％

[0039] 4，4-亚甲基双(苯基异氰酸酯)+2异氰酸苄酯：10％

[0040] 4，4-亚甲基双(苯基异氰酸酯)+3异氰酸苄酯：2％。

[0041] (在象这种产物的反应中也含有一些2-异构体)。该化合物是由Shell以Caradate商标名进行出售的和由Huntsman以Hylene和Rubinate商标名进行出售的。

[0042] 可优选使用两种二醇。当使用两种二醇时，二醇优选以0.5∶1-1∶0.5的摩尔比使用，更优选地0.8∶1-1∶0.8。优选地，没有一种二醇以超过二醇混合物的90mol％的量使用。

[0043] 优选的二醇包括二甘醇、四甘醇和聚乙二醇，例如PEG 300、400或600。优选的二醇组合为二甘醇和四甘醇。

[0044] 在涉及多异氰酸酯的包覆反应期间，如果这是优选的话，在第一阶段中多异氰酸酯是过量的(例如相对于任意二醇而言)。在包覆步骤的这个阶段中只使用多异氰酸酯，这是在本发明的范围之内。相信这样可以使在反应期间出现凝胶化的可能性最小化。在包覆反应初期，使用大量过量的多异氰酸酯，随后必需要在第二阶段中，使该包覆的颗粒与另外的二醇(例如如上所述的二醇)反应，从而与任何未反应的异氰酸酯基团反应。在包覆反应初期，单独使用多异氰酸酯时，其后将所得颗粒与至少一种二醇反应是必要的。

[0045] 在这个实施方式中，这种二醇优选为聚乙二醇。PEG二醇的长链使得在颗粒包覆层表面之间形成相当大的连接，并因此使得更易于和亲和性配体诸如抗生蛋白链菌素反应。

[0046] 将颗粒与多异氰酸酯并继之以二醇反应，即逐步法，从而产生包覆层，因此也在本发明的范围之内。

[0047] 因此典型地，包覆反应可通过用环氧化物或多异氰酸酯和二醇浸渍多孔磁性聚合物颗粒来进行，例如使用那些溶液(例如在诸如甲醇或二甘醇二甲醚的有机溶剂中)，或通过将在有机溶剂中的多孔颗粒分散体与液态环氧化物或二醇/多异氰酸酯混合物混合来进行。超声处理可用于改善浸渍，并且通过提高温度，例如至50-100℃可加速反应。通过施加低于环境的压力，可抽提出任何使用的溶剂。

[0048] 通常，磁性聚合物颗粒的应用，例如它们作为诊断工具的应用，需要适当程度的亲电性，以使它们可以在含水体系中(普遍地在生物介质中)，充分地参与到偶合及其它反应中。

[0049] 同时，包覆层整体的极性希望是亲电子的，可以结合某些含有疏水部分的包覆层，如此可将亲电性程度调节到希望的程度。这样，本发明可以提供有用的具有宽范围极性的诊断及其它工具。

[0050] 如果希望的话，在本发明的方法中，包覆的磁性聚合物颗粒表面可进一步官能化，例如通过偶合药物分子、指示器标记(例如发色团、荧光团、酶或放射性追踪剂)、或配体(例如抗体或抗体片段、金属离子络合剂、特定连接配对(binding partnerpair)的组分(例如生物素或抗生蛋白链菌素)、低聚肽、低聚核苷酸或低聚糖)。

[0051] 这种偶合可以是直接或间接的(并且该结合可以包括或不包括使用偶联剂，以在颗粒和被偶合到颗粒上的物质之间形成键)，和可以是可生物降解或不能生物降解的。如果磁性聚合物颗粒要用于活性化合物的靶向释放，可生物降解的偶合是希望的。相应地，在实施包覆后，包覆层的侧基可受控地产生用于这些物质结合的合适官能团(例如环氧基、羟基、氨基等官能团)。

[0052] 可将官能化的包覆的磁性颗粒结合到亲合性配体上，该配体的性质可基于它对特定的被分析物的亲和力来选择，以检测该被分析物在样品中是否存在。因此亲和性分子可包括能连接到磁性探针上的任意分子，其也能够明确识别特定的被分析物。因此亲和性配体包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、核酸、低聚核苷酸、蛋白质、低聚肽、多糖、糖、肽、肽编码核酸分子、抗原、药物和其它配体。合适的亲和性配体的例子在公开文献中是可获得的并且是众所周知的。其它在先有技术中常规的连接配体(binding partner)、第二亲和性配体和连接基团的使用，在这里不再作进一步的讨论，虽然意识到如果希望的话，这些物质与本发明的颗粒一起使用是可能的。

[0053] 在特别优选的实施方式中，颗粒包覆层是使用含有可与丙烯酸酯共聚的官能化基团，例如碳-碳双键的环氧化合物制备的，例如使用两种或三种环氧化物，其中一种含有不饱和碳-碳键。包覆的颗粒随后可通过与负载官能化基团，如羧酸基团的乙烯基或丙烯酸类单体(例如使用丙烯酸)反应而官能化。进一步的官能化可随后通过侧羧基的反应而容易地实现，例如通过与N-羟基琥珀酰亚胺或与抗生蛋白链菌素的反应实现。该方法和由其形成的颗粒是新的，并且构成了本发明的另一个方面。

[0054] 因此，从本发明另一个方面看，提供包覆的聚合物颗粒，任选地负载超顺磁性晶体，具有由至少两种环氧化物形成的包覆层，其中至少一种环氧化物含有可与丙烯酸类单体共聚的不饱和碳-碳键。

[0055] 从本发明另一个方面看，提供制备包覆的聚合物颗粒的方法，任选地含有超顺磁性晶体，所述方法包括：使多孔的、表面官能化的、任选地含超顺磁性晶体的聚合物颗粒与至少两种环氧化合物反应，其中至少一种环氧化合物含有可与丙烯酸类单体共聚的不饱和碳-碳键；并且

[0056] 使形成的颗粒与乙烯类单体(例如烯丙基缩水甘油醚，或丙烯酸类单体例如丙烯酸或丙烯酰胺)反应。随后将所得颗粒进一步与亲和性配体如抗生蛋白链菌素反应。

[0057] 从本发明的另一个方面看，提供本发明的颗粒在合成、提取或测定方面的应用，特别是在核酸检测方面的应用。

[0058] 在该方面使用的环氧化物包括甲基丙烯酸缩水甘油酯和烯丙基缩水甘油醚。

[0059] 可与例如丙烯酸聚合的乙烯基基团的引入，可以通过使包覆层表面与化合物(诸如甲基丙烯酸酐)的反应来实现。例如，含有由两种环氧化物反应形成的包覆层的包覆颗粒，其洗涤(例如在NaOH中)以暴露出羟基官能团，可容易地与甲基丙烯酸酐反应，从而使乙烯基基团引入到聚合物表面上。

[0060] 如上所述，偶合到颗粒上的外部物质的性质可基于它结合到特定目标材料上的能力来选择。核酸检测通常包括使用核酸探针探测认为是含目标核酸的样品，该核酸探针含有核酸序列，其明确地识别例如与目标核酸序列的杂化(hybridise)，诸如核酸亲和性配体和目标核酸的结合产生杂化层。本发明适当官能化的颗粒，例如由至少两种环氧化物包覆并负载可随后与抗生蛋白链菌素反应的羧基的那些颗粒，可理想地适用于核酸检测。

[0061] 连接到抗生蛋白链菌素珠(bead)上的生物素化单股低聚核苷酸探针可用于分离特定序列的DNA。生物素化探针是通过使适当量的珠与过量生物素化探针混合，从而连接到珠上的。然后在适于探针和DNA长度和序列的条件下，将珠/探针与DNA样品一起在杂化缓冲液(例如SSPE或SSC)中培养。将过量且不需要的DNA利用珠的磁性洗去。捕获的DNA可通过PCR等检测/量化。

[0062] 结合到抗生蛋白链菌素珠上的生物素化双股DNA片段可用于分离DNA序列特定结合蛋白。生物素化DNA是通过混合适当量的珠与过量生物素化DNA片段而结合到珠上的。然后在适于所研究的蛋白质的条件下，将珠/DNA与蛋白质样品一起在杂化缓冲液中培养。
将过量且不需要的蛋白质利用珠的磁性洗去。捕获的蛋白质可从探针中(通过高盐度、低盐度、加热、低pH等)洗脱，以用于后续的应用和检测。

[0063] 目标材料可任选为生物材料或合成有机(origin)原料，例如它可为分子或分子团，包括例如抗体、氨基酸、蛋白质、肽、多肽、酶、酶作用物、激素、淋巴因子、代谢物、抗原、半抗原、外源凝集素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、毒素、毒药(poison)、环境污染物质、碳水化合物、低聚糖、多糖、糖蛋白、糖脂、核苷酸、低聚核苷酸、核酸和核酸衍生物、DNA、RNA、天然或合成药物、受体、病毒粒子、细菌粒子病毒组分、细胞、细胞组分、天然或合成的脂囊泡、聚合物膜、聚合物捆绑物(polymer service)和颗粒和玻璃和塑料的表面。

[0064] 本发明珠用于免疫测定，现已令人吃惊地发现颗粒在包覆后的甲苯磺酰化反应导致颗粒显示出在免疫测定中的改善的性能。因此，在优选的实施方式中，可以使负载包覆层的颗粒甲苯磺酰化(tosylated)，例如通过颗粒与对甲苯磺酰氯(tosylchloride)在碱存在下反应。所得的甲苯磺酰化的包覆的颗粒是新的，并形成本发明另一个方面。甲苯磺酰基意思是甲苯-4-磺酰基基团。

[0065] 而且，这种甲苯磺酰化物可容易地与亲和性配体，例如抗生蛋白链菌素反应，形成更新的颗粒。

[0066] 因此从另一方面看，本发明提供包覆的聚合物颗粒，其负载超顺磁性晶体，具有由至少一种多异氰酸酯和至少一种二醇形成的包覆层，随后使该颗粒甲苯磺酰化，例如通过与对甲苯磺酰氯反应，然后任选地与亲和性配体反应，例如抗生蛋白链菌素。

[0067] 从另一方面看，本发明提供包覆的聚合物颗粒，其任选地负载超顺磁性晶体，具有由至少一种环氧化物形成的包覆层，随后使该颗粒甲苯磺酰化，例如通过与对甲苯磺酰氯反应，然后任选地与亲和性配体反应，例如抗生蛋白链菌素。

[0068] 而且，现已令人吃惊地发现，在与较大尺寸的珠例如3μm的珠相比较时，这里所要求直径的颗粒具有大大增加的结合容量。所要求的珠的结合容量比较大珠的结合容量高200％以上，其允许在测定步骤中使用显著降低的颗粒量。

[0069] 因此本发明的珠在吸附/解吸附方法中是有效的，其类似于在反相色谱法或疏水作用色谱法中的机理。反相色谱法(RPC)是利用在溶质分子(例如蛋白质)和固定的疏水配体(例如珠表面)之间的疏水吸附作用的分离技术。该作用一般较强，以至于它可出现在低离子强度的溶液中，并且可通过使用有机溶剂(例如乙腈)而停止。反相色谱法可用于分馏复合蛋白质样品并且用于使蛋白质样品脱盐。RPC通常使用装填在色谱柱中的固相进行。本发明的珠能使得该技术无需色谱柱、无需样品稀释并且具有高通过量地自动进行。

[0070] 疏水作用色谱法(HIC)是利用在溶质分子(例如蛋白质)和固定的疏水配体(例如珠表面)之间的疏水吸附作用的分离技术。该相互作用弱于在RPC期间所利用的相互作用，并且需要通过高的盐浓度促进。因此，降低盐浓度可用于停止这些吸附相互作用(adsorption interaction)。HIC可用于分馏复合蛋白质样品并且用于使蛋白质样品脱盐。HIC通常使用装填在色谱柱中的固相进行。本发明的珠能使得该技术无需色谱柱、无需样品稀释并且具有高通过量地自动进行。

[0071] 现通过参考下述实施例进一步描述本发明。这些实施例不是限制性的，而仅是本发明的示例。

[0072] 实施例1

[0073] 0.3μm种子颗粒的制备

[0074] 将1600g苯乙烯用2L10重量％的氢氧化钠萃取，用水洗涤至pH 7，以及然后用氩气冲洗10分钟。在10L的反应器内，将8000g水和3.07g硼砂加热至80℃，并蒸馏出100g水以除氧。然后添加在200ml沸水中的19.97g癸基硫酸钠并搅拌10分钟。然后添加洗过的且基本无氧的苯乙烯，并搅拌15分钟。然后添加在200g沸水中的4.80g过氧化硫酸氢钾。在氩气气氛和80℃下，将聚合物保持13小时。形成0.3μm粒径的聚合物颗粒的单分散悬浮液。

[0075] 实施例2

[0076] 1.0μm聚苯乙烯颗粒的制备

[0077] 在两阶(two stage)Manton Gaulin均质器中，将8860g水、866g DOP(过氧化二辛2 2
胺)、433g丙酮和51.96g SDS，在第一阶段(stage)400kg/cm 和第二阶段100kg/cm 下均化25分钟。均化后，向5164g乳化液中加入实施例1的0.3μm粒径的单分散聚苯乙烯颗粒的种子悬浮液。使用1891g含297.8g聚合物颗粒和1593g水的种子悬浮液。

[0078] 在25℃下搅拌24小时后，向6414g活化种子颗粒悬浮液中加入乳化液，其中该乳化液含有103400g水、131g SDS(十二烷基硫酸钠)、1556g聚乙烯吡咯烷酮K-30、4157g63.2％的二乙烯基苯、1060g苯乙烯和11606g甲苯(作为成孔剂(porogen))。将该乳化液
2 2
在第一阶段400kg/cm 和第二阶段100kg/cm 下均化25分钟。

[0079] 在25℃下溶胀2小时后，将46676g水加入到反应器中，以及然后将分散体在60℃下聚合1小时并在70℃下聚合20小时。形成1.0μm粒径的单分散悬浮液。

[0080] 将颗粒用甲醇和乙酸丁酯洗涤并干燥。通过BET法测得比表面积为570m2/g干燥物质。

[0081] 实施例3

[0082] 硝化

[0083] 将9920g 95％硫酸与3020g 65％硝酸的混合物冷却至10℃，以及然后加入400g来自实施例2的1.0μm的干燥多孔交联聚苯乙烯颗粒。将温度升至30℃持续1小时30分钟。向悬浮液中加入60L冰和水。通过过滤用水和甲醇洗涤颗粒。所得颗粒含有9.0重量％的氮。

[0084] 实施例4

[0085] 铁的结合

[0086] 将2579g FeSO4.7H2O和3.2g MnSO4.H2O加入到4144g来自实施例3的硝化的多孔颗粒悬浮液中，其中该悬浮液含有450g颗粒和3694g水。将悬浮液在室温下搅拌30分钟。加入3285g 25％的NH3水。将温度升至60℃持续2小时。将悬浮液冷却，并通过离心过滤用水洗涤颗粒。在纯化后，将颗粒转移到甲醇中。颗粒分析显示出330mgFe/g DS(干燥物质)和0.9mg Mn/g DS的含量。

[0087] 实施例5

[0088] 包覆

[0089] 将133g甲醇悬浮液用93g二甘醇二甲醚洗涤5次，其中该悬浮液含有13.3g1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒，该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)。将在二甘醇二甲醚中的颗粒的干燥物质调节至15重量％，并且将缩水甘油(3.07g)、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(AralditeDY-026，
8.06g)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(5.68g)加入到该颗粒中。将混合物加热至75℃并搅拌
20小时。然后将颗粒用70g甲醇洗涤6次，并用80g异丙醇洗涤4次。

[0090] 实施例6

[0091] 用羧酸基团官能化

[0092] 向1806g在实施例5中制备的在异丙醇中的颗粒(425g)悬浮液中，加入甲醇(774g)、丙烯酸(514g)和2，2′-偶氮异丁腈(23.4g)。将混合物加热至73-75℃并搅拌20小时。然后将颗粒用2338g甲醇洗涤6次，并用3018g 0.15M NaOH洗涤1次。将颗粒含量(基于干燥物质)调节至12重量％，并将混合物加热至75℃并搅拌3.5小时。将颗粒用
3188g水洗涤3次并用3188g 0.01M NaOH洗涤5次。

[0093] 向47g在步骤(A)中制备的在异丙醇中的颗粒(13.3g)悬浮液中，加入甲醇(24g)、丙烯酸(9.64g)和2，2’-偶氮异丁腈(0.41g)。将混合物加热至73-75℃并搅拌20小时。然后将颗粒用73g甲醇洗涤6次，并用94g 0.15M NaOH洗涤1次。将颗粒和0.15MNaOH混合物的干燥物质调节至12重量％，并将混合物加热至75℃并搅拌3.5小时。将颗粒用99g水洗涤3次，并用99g 0.01M NaOH洗涤5次。

[0094] 实施例7

[0095] 羧酸基团对N-羟基琥珀酰亚胺酯的官能化

[0096] 通过使用0.1M乙酸洗涤(3×50mL)，使50g实施例6的5.0g颗粒悬浮液酸化。然后将酸化的颗粒(其具有0.5mmol/g DS的羧酸含量)用丙酮洗涤(4×50mL)，并在磁体上浓缩(concentrate)。加入额外的丙酮直至获得共35.6g悬浮液。然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(2.90g，25mmol)和二异丙基碳二亚胺(3.16g，25mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。然后将颗粒用丙酮洗涤(5×50mL)。

[0097] 实施例8

[0098] 抗生蛋白链菌素的固定

[0099] 1.将20mg实施例6的羧酸官能化珠分散在1ml 0.01M NaOH中。

[0100] 2.使珠在磁体上分散并去掉上清液。

[0101] 3.将珠用1ml 30mM 2-吗啉代-乙磺酸(MES)pH6.1洗涤3次。

[0102] 4.将溶解于900μl 30mM MES pH 6.1中的1.8mg抗生蛋白链菌素加入到珠中。

[0103] 5.将珠和抗生蛋白链菌素在混合设备中在室温下培养15分钟。

[0104] 6.加入溶解于75μl冷却蒸馏水中的3mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)。

[0105] 7.将混合物在混合设备中在室温下培养1小时。

[0106] 8.将珠用具有0.01％(w/v)Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涤3次，以除去过量的抗生蛋白链菌素和EDC。

[0107] 9.将珠再悬浮在具有0.1％Tween 20的PBS pH7.4中。

[0108] 通过在包覆期间使用痕量I125-标记的抗生蛋白链菌素测定抗生蛋白链菌素的量。125
I -标记的抗生蛋白链菌素的相对量给出了包覆到表面的抗生蛋白链菌素的量。

[0109] 通过将过量C14-标记的生物素加入到抗生蛋白链菌素包覆珠中，来测定自由生物14
素结合容量(binding capacity)。洗去过量的生物素并使用β-闪烁计数器测定C -生物素的量。

[0110] 发现抗生蛋白链菌素包覆量为68μg/mg珠，并且自由生物素结合容量为3100pmol自由生物素/mg珠。

[0111] 实施例9

[0112] 步骤A

[0113] 向在200g二甘醇二甲醚中的40.0g 1.0μm的含超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)的苯乙烯二乙烯基苯聚合物颗粒(类似实施例4制备)中，加入100g 1，4-丁二醇二缩水甘油醚和100g缩水甘油。将反应混合物在90℃下以250rpm搅拌20小时。然后将颗粒用400mL甲醇洗涤5次，并用400mL去离子水洗涤4次。

[0114] 步骤B

[0115] 向72g如步骤A中制备的颗粒水悬浮液(颗粒含量10重量％)中，缓慢添加119g氢氧化钠。然后添加169.2g烯丙基缩水甘油醚。在60℃下以250rpm搅拌18小时后，将颗粒用1400mL甲醇洗涤5次。

[0116] 实施例10

[0117] 向在40g二甘醇二甲醚中的10g 1.0μm的苯乙烯二乙烯基苯聚合物颗粒中，添加16.7g烯丙基缩水甘油醚、16.8g 1，4-丁二醇二缩水甘油醚和16.8g缩水甘油，其中该颗粒中含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将反应混合物在90℃下以
300rpm搅拌20小时。然后将颗粒用100mL甲醇洗涤5次。

[0118] 实施例11

[0119] 向13g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液78g中，添加Desmodur VL(35.83g)、二甘醇(2.82g)、四甘醇(4.84g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)。将该混合物在80℃下加热并搅拌21小时。

[0120] 将二甘醇(47.04g)、四甘醇(80.45g)和1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(1.29g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物80℃下加热并搅拌2小时。将颗粒冷却，并用100g二甘醇二甲醚洗涤3次和用100g丙酮洗涤4次。

[0121] 实施例12

[0122] 将1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的甲醇悬浮液22g，用14g二甘醇二甲醚洗涤5次，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将在二甘醇二甲醚中的颗粒干燥物质调节至16重量％，并且将Araldite DY-026(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)(26g)和缩水甘油(26g)加入到颗粒中。将混合物加热至90℃并搅拌20小时。然后将颗粒用80g甲醇洗涤5次，并用45g二甘醇二甲醚洗涤4次。

[0123] 向颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液18g中，添加甲基丙烯酸酐(15g)和吡啶0.4g)。将混合物加热至75℃并搅拌20小时。然后将颗粒用90g甲醇洗涤5次，并用60g异丙醇洗涤3次。

[0124] 实施例13

[0125] 向20g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液124.45g中，添加2，2-双(4-(缩水甘油氧基(glycidyloxy))苯基)丙烷(双酚A二缩水甘油醚，Araldit LY-564)(42g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将该混合物加热至60℃并搅拌2小时，和冷却至室温并搅拌整夜。将悬浮液用二甘醇二甲醚洗涤3次，并将干燥物质调节至12％。

[0126] 添加缩水甘油(4.58g)、Araldite DY-026(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)(12.1g)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(8.57g)。将混合物在75℃下加热并搅拌21小时。将颗粒悬浮液冷却，以及将颗粒用100g甲醇洗涤6次，并用100g异丙醇洗涤4次。

[0127] 实施例14

[0128] 向51.6g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的水悬浮液516g中，加入固态氢氧化钠(144.89g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(375g)，在添加期间，搅拌该混合物并使温度保持在42℃以下。添加烯丙基缩水甘油醚(206.4g)，并将混合物加热至60℃并搅拌18小时。将颗粒悬浮液冷却，并将颗粒用1500g甲醇洗涤4次。

[0129] 实施例15

[0130] 将15g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的甲醇悬浮液90g，用60g二甘醇二甲醚洗涤3次，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)，并且添加2，2-双[4-(缩水甘油氧基)苯基]丙烷(双酚A二缩水甘油醚，Araldit LY-564)(70.40g)和1，4-丁二醇二缩水甘油醚(Araldit DY-026)(4.61g)。将混合物在95℃下加热20小时。将颗粒冷却，和用100g二甘醇二甲醚洗涤3次，并用100g甲醇洗涤3次。

[0131] 实施例16

[0132] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液23.48g中，加入2，2-双[4-(缩水甘油氧基)苯基]丙烷(双酚A二缩水甘油醚，Araldit LY-564)(23.47g)和聚乙二醇二缩水甘油醚Mw～300(3.07g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在95℃下加热20小时。将颗粒冷却，并用40g甲醇洗涤4次。

[0133] 实施例17

[0134] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液24.46g中，加入2，2-双[4-(缩水甘油氧基)苯基]丙烷(双酚A二缩水甘油醚，Araldit LY-564)(23.54g)和聚乙二醇二缩水甘油醚Mw～500(15.28g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在95℃下加热20小时。将颗粒冷却，并用40g甲醇洗涤5次。

[0135] 实施例18

[0136] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液26.82g中，加入2，2-双[4-(缩水甘油氧基)苯基]丙烷(双酚A二缩水甘油醚，Araldit LY-564)(46.93g)和丙三醇丙氧基化物三缩水甘油醚(69.98g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在95℃下加热20小时。将颗粒冷却，并用40g甲醇洗涤5次。

[0137] 实施例19

[0138] 抗生蛋白链菌素的固定

[0139] 将20mg来自实施例17的包覆珠分散在1ml 0.1M Na-磷酸盐缓冲液pH7.4中。使珠在磁体上分散并倒出上清液。重复此步骤2次。将溶解于900μl 0.1M Na-磷酸盐缓冲液pH7.4中的1mg抗生蛋白链菌素加入到珠中。将珠和抗生蛋白链菌素在室温下在混合设备中培养20小时。将珠用具有0.1％BSA的PBS pH7.4洗涤3次。

[0140] 如实施例20所述测定自由生物素结合容量，并发现该自由生物素结合容量为1900pmol自由生物素/mg珠。

[0141] 实施例20 对生物素化DNA分子的结合容量

[0142] 1.将1090、526、217碱基对的质粒DNA片段生物素化并通过PCR铕标记。

[0143] 2.通过商业PCR净化工艺除去过量的生物素和铕标记，并且将标记的DNA通过在260nm下的光密度和时间分辨荧光进行量化。

[0144] 3.将抗生蛋白链菌素包覆珠(实施例8)在2倍浓缩的结合缓冲液(bindingbuffer)(2M NaCl，20mM Tris HCl，0.2M EDTA pH7.5)中洗涤1次。

[0145] 4.在96孔(well)孔板的各个孔中，将5μg洗涤过的珠再悬浮于100μl结合缓冲液中。

[0146] 5.将在100μl水中稀释的过量DNA(0.55pmol 1090碱基对(bp)、1.1pmol 526碱基对和2.2pmol 217碱基对)加入到珠中，并在室温下采用柔和振荡培养15-30分钟。

[0147] 6.将板放置在磁体上并除去上清液。

[0148] 7.将珠-DNA复合物用200μl的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.8，0.01％Tween20)洗涤3次。

[0149] 8.将珠-DNA复合物再悬浮于200μl DELFIA增强液(Enhancement solution)中，并在室温下采用振荡避光培养10分钟。

[0150] 9.将板放置在磁体上并将增强液转移到FluorNunc 96孔孔板中，以及通过时间分辨荧光(Wallac Victor平板读取器)测定铕信号，并以每秒计数(cps)给出。

[0151] 10.由0.55、1.1和2.2pmol结合到珠上的DNA的累计的cps百分数计算出结合到珠上的DNA。

[0152] 对于217碱基对片段，珠的结合容量约为200pmol/mg，对于526碱基对片段约为80-100pmol/mg，对于1090碱基对片段约为3545pmol/mg。

[0153] 实施例21

[0154] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液23.8g中，添加Desmodur VL(18.34g)、二甘醇(1.45g)、四甘醇(2.48g)和二甘醇二甲醚(36.2g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。

[0155] 将聚乙二醇Mw～300(68.24g)、四甘醇(41.30g)和1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.68g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用100g二甘醇二甲醚洗涤3次和用100g丙酮洗涤4次。

[0156] 实施例22

[0157] 免疫球蛋白的固定

[0158] 将20mg来自实施例21的包覆珠分散在1ml 0.1M的硼酸盐缓冲液pH9.0中。使珠在磁体上分散并倒出上清液。重复此步骤2次。将溶解于900μl 0.1M的硼酸盐缓冲液pH9.0中的1mg小鼠IgG1抗人α胎儿蛋白质(feto protein)加入到珠中。将珠和抗体在混合设备中在室温下培养20小时。将珠用具有0.1％BSA的PBS pH7.4洗涤3次。

[0159] 通过在包覆期间使用痕量I125-标记的抗体测定结合到珠上的抗体量。结合到珠上的标记抗体的相对量给出了固定的抗体总量。固定到珠上的蛋白质的量为22μg抗体/mg珠。

[0160] 通过脐带血稀释(diltuion)的添加，测量α胎儿蛋白质对固定抗体的结合，并通3+
过使用由Eu 标记的第二小鼠IgG抗人α胎儿蛋白质来检测。用时间分辨荧光光谱检测标记的抗体。脐带血稀释液标准曲线显示随浓度增加而增强的信号。

[0161] 实施例23

[0162] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液26.82g中，加入Desmodur VL(18.34g)、聚乙二醇Mw～600(15.84g)和二甘醇二甲醚(33.20g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。

[0163] 将聚乙二醇Mw～600(263.82g)与1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.66g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用100g二甘醇二甲醚洗涤3次和用100g丙酮洗涤4次。

[0164] 实施例24

[0165] 用羧酸基团官能化

[0166] 向15.87g在异丙醇中的实施例5中制备的颗粒(2.5g)悬浮液中，加入丙烯酸(1.84g)、丙烯酰胺(1.79g)、甲醇(5.95g)和2，2′-偶氮异丁腈(0.28g)。将混合物加热至75℃并搅拌20小时。然后将颗粒用20g异丙醇洗涤4次，和用25g 0.15M NaOH洗涤4次。

[0167] 实施例25

[0168] 用羧酸基团官能化

[0169] 向8.44g在水中的实施例5中制备的颗粒(1g)悬浮液中，加入丙烯酸(0.37g)、烯丙基缩水甘油醚(1.34g)、二甲亚砜(0.91g)和2，2′-偶氮异丁腈(0.06g)。将混合物加热至75℃并搅拌20小时。然后将颗粒用10g异丙醇洗涤4次，和用10g 0.15MNaOH洗涤4次。

[0170] 实施例26

[0171] 向2.7g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液3.9g中，加入六亚甲基二异氰酸酯(2.5g)、二甘醇(0.5g)和四甘醇(1.0g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。

[0172] 将二甘醇(2.65g)、四甘醇(4.66g)和1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.07g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在95℃下加热并搅拌2-3小时。将颗粒冷却并用20g丙酮洗涤4次。

[0173] 实施例27

[0174] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液23.8g中，加入Desmodur VL(18.34g)、二甘醇(1.45g)、四甘醇(2.48g)和二甘醇二甲醚(36.2g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。

[0175] 将聚乙二醇Mw～400(90.03g)、四甘醇(41.20g)与1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.68g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用100g二甘醇二甲醚洗涤3次和用100g丙酮洗涤4次。

[0176] 实施例28

[0177] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液23.8g中，加入Desmodur VL(18.34g)、二甘醇(1.45g)、四甘醇(2.48g)和二甘醇二甲醚(36.2g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。

[0178] 将聚乙二醇Mw～600(135g)、四甘醇(41.30g)与1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.66g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用100g二甘醇二甲醚洗涤3次和用100g丙酮洗涤4次。

[0179] 实施例29

[0180] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液23.8g中，加入DesmodurVL(18.34g)、二甘醇(1.45g)、四甘醇(2.48g)和二甘醇二甲醚(36.2g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。

[0181] 将乙二醇(27.29g)与1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.66g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用100g二甘醇二甲醚洗涤3次和用100g丙酮洗涤4次。

[0182] 实施例30

[0183] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液26.82g中，加入Desmodur VL(18.34g)和乙二醇(1.64g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。将乙二醇(27.29g)与1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.66g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用
100g二甘醇二甲醚洗涤3次和用100g丙酮洗涤4次。

[0184] 实施例31

[0185] 用甲苯磺酰基基团活化

[0186] 向4g实施例30的丙酮悬浮液17.1g中，加入对甲苯磺酰氯(16g)和吡啶(7.85g)。将混合物在25℃下搅拌17小时。然后将颗粒用50ml丙酮洗涤3次，用80重量％丙酮的水混合物50ml洗涤1次，用60重量％丙酮的水混合物50ml洗涤1次，用30重量％丙酮的水混合物50ml洗涤1次，以及用50ml水洗涤3次。

[0187] 实施例32

[0188] α胎儿蛋白质的免疫测定

[0189] 将50ug来自实施例22中的免疫球蛋白包覆珠加入到100ul脐带血稀释液中，并且在15分钟的培养期间，使其结合一定量的α胎儿蛋白质。将过量的脐带血洗去。向此3+
复合物中加入用Eu 标记的第二检测小鼠IgG抗人α胎儿蛋白质。在培养并除去过量的检测抗体后，用时间分辨荧光光谱检测标记的抗体量。具有已知量α胎儿蛋白质的脐带血稀释液标准曲线显示随浓度增加而增强的信号。通过使用该标准曲线，可以测得样品中α胎儿蛋白质的量。

[0190] 实施例33

[0191] 肌肉球蛋白的免疫测定

[0192] 在Liaison免疫测定仪上，使用类似实施例22但具有小鼠IgG抗人肌肉球蛋白的包覆珠，来分析在含柠檬酸盐的人血浆(human citrated plasma)样品中的肌肉球蛋白的含量。将珠和样品(10ul)培养10分钟，并洗去过量样品。添加与吖啶 (Acridinium)有机酯结合的检测抗体。培养10分钟后洗去过量的检测抗体，以及在Liaison仪中的发光读取器中产生并检测化学发光信号。

[0193] 实施例34

[0194] D-二聚体的免疫测定.

[0195] 在Liaison免疫测定仪上，使用类似实施例22但具有小鼠IgG抗人D-二聚体的包覆珠，来分析在含柠檬酸盐的人血浆样品中肌肉球蛋白的含量。将珠和样品(10ul)培养10分钟并洗去过量样品。添加与吖啶 有机酯结合的检测抗体。培养10分钟后洗去过量的检测抗体，以及在Liaison仪中的发光读取器中产生并检测化学发光信号。

[0196] 实施例35

[0197] 全段甲状旁腺激素(intact PTH)的免疫测定

[0198] 在Liaison免疫测定仪上，使用如实施例19中具有抗生蛋白链菌素的包覆珠，来分析在含EDTA的人血浆(human EDTA plasma)样品中全段(intact)PTH含量。将150ul含EDTA的血浆(EDTA plasma)与抗全段PTH的生物素化多克隆山羊抗体一起培养，并且结合多克隆山羊抗体的吖啶 酯类似地产生免疫复合物(immuncomplex)。将抗生蛋白链菌素包覆珠加入到免疫复合物中并培养，以使生物素结合到固定的抗生蛋白链菌素上。洗涤该珠，并在Liaison仪的发光读取器中产生并测量化学发光信号。

[0199] 实施例36

[0200] 将1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的甲醇悬浮液22g，用14g二甘醇二甲醚洗涤5次，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将在二甘醇二甲醚中的颗粒干燥物质调节至16重量％，并将甲基丙烯酸缩水甘油酯(50g)和氯化铁(III)(0.62g)加入到颗粒中。将混合物加热至75℃并搅拌20小时。然后将颗粒用14g甲醇洗涤6次并用13g异丙醇洗涤4次。

[0201] 实施例37

[0202] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液26.82g中，加入Desmodur VL(18.34g)和二甘醇二甲醚(33.20g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。将聚乙二醇Mw～600(236.82g)与1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.66g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用100g二甘醇二甲醚洗涤3次和用100g丙酮洗涤4次。

[0203] 实施例38

[0204] 向2g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液10.74g中，加入缩水甘油(6.84g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在90℃下加热20小时。将颗粒冷却并用17g甲醇洗涤8次和用17g水洗涤4次。

[0205] 实施例39

[0206] 向2.50g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液14.52g中，加入2，2-双[4-(缩水甘油氧基)苯基]丙烷(双酚A二缩水甘油醚，Araldit LY-564)(13.03g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)(类似实施例4制备)。将混合物在95℃下加热20小时。将颗粒冷却并用17g二甘醇二甲醚洗涤3次和用17g甲醇洗涤5次。

[0207] 实施例40

[0208] 对生物素化蛋白质分子的结合容量

[0209] 1.将5μg抗生蛋白链菌素珠(实施例19)在DELFIA分析缓冲液(assay buffer)3+
中洗涤1次，并在96孔孔板中与用铕 标记的过量生物素化抗体混合。

[0210] 2.在混合下，在室温进行20分钟的培养，以使抗体结合到珠上。

[0211] 3.将板放置在磁体上并除去上清液。

[0212] 4.用200μl DELFIA洗涤缓冲液洗涤珠-抗体复合物3次。

[0213] 5.将珠-抗体复合物再悬浮于200μl DELFIA增强液中，并在室温下采用振荡避光培养10分钟。

[0214] 6.将板放置在磁体上并将增强液转移到FluorNunc96孔孔板中，通过时间分辨荧光(Wallac Victor平板读取器)测定铕信号，并以每秒计数(cps)给出。

[0215] 7.由结合到珠上的累计cps百分数计算出结合到珠上的抗体量。珠的结合容量约为8.0μg生物素化抗体/mg珠。

[0216] 实施例41

[0217] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液30.1g中，加入Desmodur VL(13.8g)和二甘醇(2.08g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。将二甘醇(35g)与1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.5g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用80ml二甘醇二甲醚洗涤3次和用80ml丙酮洗涤5次。

[0218] 实施例42

[0219] 向5g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒的二甘醇二甲醚悬浮液30.8g中，加入Desmodur VL(13.8g)，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)。将混合物在80℃下加热并搅拌20小时。将二甘醇(35g)与1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(0.5g)的混合物加入到颗粒悬浮液中。将混合物在80℃下加热并搅拌1小时。将颗粒冷却并用80ml二甘醇二甲醚洗涤3次和用80ml丙酮洗涤5次。

[0220] 实施例43

[0221] 将在二甘醇二甲醚中的7.0g 1.0μm的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒调节至20重量％的干燥物质，其中该颗粒表面通过硝化作用和还原作用而官能化，并含有超顺磁性氧化铁(33重量％Fe)。将17.5g Araldit Dy-026和17.5g缩水甘油加入到悬浮液中，并将混合物在90℃下加热20小时。将颗粒用甲醇(200ml)洗涤5次，并用水(200ml)洗涤5次。

[0222] 实施例44

[0223] 向80g实施例43中的8.0g珠的悬浮液中，加入22.5g氢氧化钠和32g烯丙基缩水甘油醚。将珠在60℃下搅拌并加热18小时，以及通过用240甲醇洗涤4次去污(work up)。

[0224] 实施例45

[0225] 反相色谱法(RPC)

[0226] 将实施例41、42、11、15和30的珠用于分馏蛋白质混合物，该混合物由伴清蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、醇脱氢酶(alcohol dehdrogenase)、细胞色素C和二胺氧化酶组成，或由SW480细胞的细胞溶解产物组成。将1mg珠预洗涤并再悬浮于10ul RPC吸附缓冲液中