用于获得肉毒毒素的不含动物制品的培养基和方法转让专利
申请号 : CN200480027687.2
文献号 : CN1856569B
文献日 : 2010-12-01
发明人 : S·多诺万
申请人 : 阿勒根公司
摘要 :
用于发酵肉毒梭菌并获得可用于配制肉毒毒素药物组合物的肉毒毒素的培养基和方法。通过使用非动物来源制品替换动物来源制品，生长培养基中所含肉或乳品副产物的水平显著降低。使用的培养基优选为基本不含动物来源制品。
权利要求 :
1.一种获得具有生物活性的肉毒毒素的方法，包括如下步骤：(a)提供不含动物来源制品的发酵培养基，其中所述培养基包含水解大豆；
(b)在可产生肉毒毒素的条件下，在所述发酵培养基中培养肉毒梭菌细菌；
(c)从所述发酵培养基中回收具有生物活性的肉毒毒素。
2.权利要求1的方法，其中在培养步骤中，所述培养一直进行到由于细胞溶解而使培养物的细胞密度下降为止。
3.权利要求1的方法，其中在培养步骤中，所述培养一直进行到由于细胞溶解而使细胞密度开始下降后的至少48小时为止。
4.一种生产肉毒毒素的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供不含动物来源制品、包含水解大豆的第一培养基；
(b)在肉毒梭菌可以生长的条件下，在第一培养基中培养肉毒梭菌细菌；
(c)提供不含动物来源制品、包含水解大豆的第二培养基；
(d)使用第一培养基接种第二培养基；
(e)在可产生肉毒毒素的条件下，在第二培养基中培养肉毒梭菌细菌；
(f)回收肉毒毒素。
5.权利要求4的方法，其中在第一培养基中培养肉毒梭菌的步骤中，所述条件包括温度约34℃，并且进一步包括在培养过程中细胞密度不下降，其中在使用第一培养基接种第二培养基的步骤中，2～4％的第一培养基用于接种第二培养基，并且在第二培养基中培养所述细菌的步骤中，可以生长的条件包括温度约34℃，并且进一步包括培养一直进行到由于细胞溶解而使培养物的细胞密度下降为止。
6.一种组合物，包括用来生产肉毒毒素的肉毒梭菌和培养基，其中所述培养基不含动物来源制品，包含水解大豆。
7.一种制备不含动物制品、以肉毒毒素为活性成分的药物组合物的方法，该方法包括如下步骤：(a)由权利要求1-5中任一项的方法获得具有生物活性的肉毒毒素；以及(b)将所述肉毒毒素与适当的赋形剂配制，由此制备出不含动物制品的、以肉毒毒素为活性成分的药物组合物。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种用于获得生物活性的肉毒毒素的培养基和方法。具体地说，本发明涉及一种生物体，如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)的基本不含动物制品的培养基、培养物和厌氧发酵方法以获得丰富的、具有生物活性的肉毒毒素。
背景技术
适于为治疗、诊断、研究或美容目的而施用于人或动物的药物组合物可包含活性成分。药物组合物还可包括一种或多种赋形剂、缓冲液、载体、稳定剂、防腐剂和/或填充剂。药物组合物中的活性成分可为生物制品，如肉毒毒素。肉毒毒素可通过培养、发酵和配制工艺获得，这些工艺中利用了一种或多种动物来源的制品(如肉汤培养基，以及血液组分或血液来源的赋形剂)。如果将一种药物组合物——其活性生物成分是通过利用动物来源制品的工艺获得——施用于患者，可使该患者具有接受多种病原体或传染物的潜在风险。例如，朊病毒可存在于药物组合物中。朊病毒是蛋白质感染性粒子，人们猜测它来自产生正常蛋白的相同的核酸序列，作为异常的构象异构体而产生。人们进一步猜测，其感染性来源于在翻译后水平上正常异构体蛋白向朊病毒蛋白异构体的“募集反应”。显然，正常内源性细胞蛋白被诱导，错误折叠形成病原体朊病毒构象。
克雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)是一种罕见的神经变性疾病——人传染性海绵状脑病，其传染物显然是一种异常异构体的朊病毒蛋白。一个患有克雅病的个体可在六个月之内，从完全健康恶化成运动不能性缄默症(akinetic mutism)。因此，施用含有使用动物来源制品获得的生物制剂(如肉毒毒素)的药物组合物，可能存在染上朊病毒介导的疾病(如克雅病)的潜在风险。
肉毒毒素
根据形态学和功能的分类，梭菌属有超过127个种类。厌氧的革兰氏阳性菌肉毒梭菌产生有效的多肽神经毒素即肉毒毒素，它在人类和动物中导致被称为肉毒中毒的神经麻痹疾病。肉毒梭菌及其孢子通常发现存在于土壤中，并且该细菌可在家庭式罐头厂未正确消毒和密封的食品容器中生长，这是导致多起肉毒中毒的原因。肉毒中毒作用通常出现于食用被肉毒梭菌培养物或孢子感染的食品后的18～36小时。显然，肉毒毒素可不衰减地穿过肠的衬里层(lining)并攻击外周运动神经元。肉毒毒素中毒的症状可从行走、吞咽和说话困难发展到呼吸肌麻痹和死亡。
A型肉毒毒素是人类已知的最致命的天然生物剂。大约50皮克的A型肉毒毒素(纯化的神经毒素络合物)即达到小鼠的LD50。以摩尔数计算，A型肉毒毒素的致死性比白喉高18亿倍，比氰化钠高6亿倍，比眼镜蛇毒素高3000万倍，比霍乱高1200万倍。Singh，Critical Aspectsof Bacterial Protein Toxins，Natural Toxin II的63～84页(第四章)，B.R.Singh等编辑，Plenum Press，纽约(1976)(根据约0.05ng等于1单位的事实对其中定义的A型肉毒毒素0.3ng等于1U这一LD50进行了校正)。是A型肉毒毒素纯化的神经毒素络合物的商标，可自加利福尼亚欧文市的阿勒根公司购得。1单位(U)的肉毒毒素定义为将其腹膜内注射到每只重18～20克的雌性SwissWebster小鼠中的LD50。换句话说，1单位肉毒毒素是将一组雌性SwissWebster小鼠杀死50％的肉毒毒素的量。七种常见免疫学上不同的肉毒神经毒素已被表征，分别为血清A、B、C1、D、E、F和G型肉毒神经毒素，各种血清型通过用类型特异性抗体中和区分。不同血清型的肉毒毒素在其感染的动物物种以及所引起的麻痹的严重程度和持续时间上均不相同。例如，据测定根据在大鼠中所测得的麻痹产生的速度，A型肉毒毒素比B型肉毒毒素强500倍。此外，据测定在灵长类动物中B型肉毒毒素在480U/kg的剂量下是无毒性的，而该剂量是A型肉毒毒素灵长类LD50的约12倍。肉毒毒素显然以高亲和力与胆碱能运动神经元结合，并转运到神经元中，从而阻断乙酰胆碱的突触前释放。
在临床环境下，肉毒毒素已用于治疗以骨骼肌机能亢进为特征的神经肌肉病症中。A型肉毒毒素已获得美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)的许可，主要用于治疗12岁以上患者的睑痉挛、斜视和偏侧面肌痉挛，治疗颈张力失常，以及治疗眉间线(面部)皱纹。FDA还已批准B型肉毒毒素用于治疗颈张力失常。A型肉毒毒素外周注射(即肌内注射或皮下注射)的临床效果通常显现于注射一周内，也常常在注射后几小时内。A型肉毒毒素单次肌内注射所产生的症状缓解(即松弛的肌肉麻痹)的持续时间通常可为大约3个月到大约6个月。
虽然所有肉毒毒素血清型在神经肌肉接头均显然抑制神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点切割上述蛋白进行的。A型肉毒毒素是一种锌内肽酶，它可以特异性水解细胞内、小泡(vesicle)相关蛋白SNAP-25的肽键。E型肉毒也切割25千道尔顿(kD)的突触相关蛋白(SNAP-25)，但与A型肉毒毒素相比，它针对该蛋白内不同的氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒毒素均作用于小泡相关蛋白(VAMP，又称为突触小泡蛋白)，但各血清型在不同的位点切割所述蛋白。最后，C1型肉毒毒素表现为切割突触融合蛋白和SNAP-25。上述作用机理的不同可能影响各种肉毒毒素血清型的相对效能(potency)和/或作用的持续时间。
不论何种血清型，其毒素中毒的分子机理似乎都是相似的并包括至少三个步骤或阶段。在过程的第一个步骤中，毒素通过重链(H链)和细胞表面受体之间特异性的相互作用与靶神经元的突触前膜结合；一般认为上述受体对于肉毒毒素的各种血清型和肉毒毒素是不同的。H链的羧基端片段HC似乎对于毒素靶向细胞表面很重要。
在第二个步骤中，毒素穿过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用(endocytosis)被细胞吞没并形成含有毒素的内体。然后毒素从内体中逃离到细胞的细胞质中。这一最后步骤被认为是由H链的氨基端片段HN介导的，当pH为约5.5或以下时，HN即产生应答引发毒素的构象变化。已知内体具有降低内体内pH的质子泵。构象变化暴露出毒素中的疏水残基，从而允许毒素将自身嵌入内体膜中。然后毒素通过内体膜转运到胞质溶胶中。
肉毒毒素活性机制的最后一步似乎涉及连接H链和L链的二硫键的还原。肉毒和肉毒毒素的全部毒性活性均包含在全毒素的L链中；L链是一种锌(Zn++)内肽酶，它选择性切割含有神经递质的小泡识别和停靠质膜胞质表面以及小泡与质膜融合所必需的蛋白质。肉毒神经毒素以及B、D、F和G型肉毒毒素导致一种突触小体膜蛋白即突触小泡蛋白(又称为小泡相关膜蛋白(VAMP))降解。上述切割活动中的任何一者都将导致大部分存在于突触小泡细胞质表面的VAMP被移除。各种毒素特异性切割不同的键。
对于所有七种已知的肉毒毒素血清型，其肉毒毒素蛋白分子的分子量均为约150kD。有趣的是，肉毒毒素是作为含有150kD的肉毒毒素蛋白分子和相关的无毒素蛋白的络合物从梭菌中释放出来的。因此，A型肉毒毒素络合物可由梭菌以900kD、500kD和300kD的形式产生。B型和C1型肉毒毒素显然仅以500kD的络合物产生。D型肉毒毒素以300kD和500kD的络合物产生。最后，E型和F型肉毒毒素仅以约300kD的络合物产生。所述络合物(即分子量大于约150kD)被认为含有非毒素的血凝素蛋白以及非毒素和无毒性的非血凝素蛋白。上述两种非毒素的蛋白(它们与肉毒毒素分子组成相关的神经毒素络合物)可能发生作用使肉毒毒素分子具有稳定性以避免变性，并在毒素被摄取时保护其以防消化酸。此外，有可能较大的(分子量大于约150kD)肉毒毒素络合物可使肉毒毒素从肉毒毒素络合物肌内注射部位的扩散速度减慢。通过使用pH7.3的红细胞处理毒素络合物，它可离解为毒素蛋白和血凝素蛋白。除去血凝素蛋白之后，毒素蛋白具有明显的不稳定性。
所有的肉毒毒素血清型均由肉毒梭菌作为无活性的单链蛋白产生，所述蛋白必需经由蛋白酶切割或切口以具有神经活性。产生血清型A和G肉毒毒素的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反地，血清型C1、D和E肉毒毒素由非蛋白酶解的菌株合成并因此在从培养物中回收时，通常是无活性的。血清型B和F由蛋白酶解和非蛋白酶解的菌株产生，因此可以活性或无活性形式回收。然而，即使是产生，例如，血清B型肉毒毒素的蛋白酶解菌株也仅切割所产生毒素的一部分。切口分子与无切口分子的精确比例取决于培养时间长短以及培养温度。因此，一定百分比的任何制品，如B型肉毒毒素很可能是无活性的，从而可能解释为什么B型肉毒毒素比A型肉毒毒素的效能低很多。临床制剂中无活性肉毒毒素分子的存在对制剂的全蛋白载荷(overall proteinload)有贡献，这与抗原性增大有关联，却未促进临床功效。另外知道，肌内注射后，B型肉毒毒素比相同剂量水平的A型肉毒毒素的活性期短，效力也弱。
体外研究已表明肉毒毒素抑制钾阳离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代细胞培养物中的释放。此外，据报道在脊髓神经元的原代培养物中，肉毒毒素抑制甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，并且在脑突触小体制品中，肉毒毒素抑制各种神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸)的释放。
高质量的结晶A型肉毒毒素可由肉毒梭菌的Hall A菌株生产，所述毒素特征为≥3×107U/mg，A260/A278小于0.60，并且在凝胶电泳上有独特的带型。已知的Schantz方法可用于获得结晶A型肉毒毒素，如Schantz，E.J.等在Properties and use of Botulinum toxin and OtherMicrobial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev.56：80～99(1992)所述的。通常，通过在适宜的培养基中培养A型肉毒梭菌可从厌氧发酵中分离并纯化A型肉毒毒素络合物。可通过硫酸沉淀来收获粗制毒素，并通过超微滤浓缩。可通过将酸沉淀物溶于氯化钙中来进行纯化。然后毒素可使用冷乙醇沉淀。沉淀物可溶于磷酸钠缓冲液中并离心。干燥后，可获得约900kD的结晶A型肉毒毒素络合物，其特异性效能为3×107LD50U/mg或以上。分离出非毒素蛋白后，也可使用该已知方法获得纯肉毒毒素，例如，分子量为约150kD、特异性效能为1～2×108LD50U/mg或以上的纯化A型肉毒毒素；分子量为约156kD、特异性效能为1～2×108LD50U/mg或以上的纯化B型肉毒毒素；分子量为约155kD、特异性效能为1～2×107LD50U/mg或以上的纯化F型肉毒毒素。
肉毒毒素(150千道尔顿的分子)和肉毒毒素络合物(300kDa至900kDa)可从，例如List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，加利福尼亚；the Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，英国；Wako(日本大阪)以及密苏里州圣路易斯的SigmaChemicals购得。市售的含有肉毒毒素的药物组合物包括(A型肉毒毒素神经毒素络合物与人血清白蛋白以及氯化钠，可从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得，100单位瓶装的冻干粉末，使用前用0.9％的氯化钠复原)、(制剂中有A型肉毒梭菌毒素的血凝素络合物与人血清白蛋白以及乳糖，可从英国贝克郡的IpsenLimited购得，粉末状，使用前用0.9％的氯化钠复原)，以及MyoBlocTM(一种注射液，含有B型肉毒毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠，pH为约5.6，可从爱尔兰都柏林的Elan Corporation购得)。
A型肉毒毒素在治疗多种临床症状中的成功引起了对其它肉毒毒素血清型的兴趣。因此，至少A、B、E和F型肉毒毒素已经在临床上用于人类。此外，纯(约150kDa)肉毒毒素已用于治疗人类。参见例如，Kohl A.等，Comparison of the effect of botulinum toxin A(Botox(R))with the highly-purified neurotoxin(NT 201)in the extensordigitorum brevis muscle test，Mov Disord 2000；15(增补本3)：165。因此，可使用纯(约150kDa)肉毒毒素制备药物组合物。
A型肉毒毒素已知可溶于pH为4～6.8的稀水溶液中。当pH大于约7时，特别是当pH和温度升高时，起稳定作用的无毒性蛋白从神经毒素中游离出来，导致毒性逐渐丧失。Schantz E.J.等，Preparationand characterization of botulinum toxin type A for human treatment(具体见44～45页)，Jankovic，J.等，Therapy with Botulinum Toxin的第3章，Marcel Dekker，Inc(1994)。
同酶一样，通常，肉毒毒素(它是细胞内肽酶)的生物活性至少部分取决于其三维构象。因此，通过热、多种化学药品的表面拉伸(surface stretching)和表面干燥可使A型肉毒毒素丧失毒性。此外，已知将通过已知的培养、发酵和纯化所获得的毒素络合物稀释到非常非常低的、可用于药物组合物制剂的毒素浓度将导致毒素的快速解毒，除非有适宜的稳定剂存在。将毒素从毫克量稀释到每毫升含有毫微克的溶液有很大难度，因为经上述高度稀释后，毒素将迅速丧失特异性的毒性。由于可能在制成含有毒素的药物组合物数月或数年后才使用所述毒素，因此可用稳定剂，如白蛋白和明胶使毒素稳定。
据报道肉毒毒素已用于多种临床处置中，包括下述方面：
(1)每次肌内注射(多决肌肉)约75～125单位的以治疗颈张力失常；
(2)每次肌内注射5～10单位的以治疗眉间线(眉沟)(降眉间肌肌内注射5单位，各皱眉肌肌内注射10单位)；
(3)向耻骨直肠肌括约肌内(intrasphincter)注射约30～80单位的以治疗便秘；
(4)向上眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌和下眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌分别肌内注射约1～5单位的以治疗睑痉挛。
(5)向眼外肌肌内注射约1～5单位的以治疗斜视，注射的量根据待注射肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹的程度(即所需的屈光度校正)变化。
(6)为治疗中风后的上肢痉挛，按照如下方式向五块不同的上肢屈肌肌内注射
(a)跖深屈肌：7.5U～30U
(b)跖浅屈肌：7.5U～30U
(c)尺侧腕屈肌：10U～40U
(d)桡侧腕屈肌：15U～60U
(e)肱二头肌：50U～200U。对各指定的五块肌肉在相同的治疗期进行注射，因此患者在各治疗期接受90U～360U的的上肢屈肌肌内注射。
(7)颅骨膜注射(对称注射到眉间肌、额肌和颞肌)25U的以治疗偏头痛已证实具有非常有益的偏头痛的预防治疗效果，与赋形剂相比，在25U注射后的三个月内降低了偏头痛的发病率、最大严重程度、所伴随的呕吐以及所使用的急性药物治疗。
已知A型肉毒毒素的效能可长达12个月(European J.Neurology 6(增补本4)：S111～S1150：1999)，并且在某些情况下可长达27个月。The Laryngoscope 109：1344～1346：1999。然而，肌内注射的普通维持时间通常为约3～4个月。
市售的含有肉毒毒素的药物组合物，其出售的商标为BOTOX(从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得)。BOTOX由纯化的A型肉毒毒素络合物、人血清白蛋白和氯化钠在无菌、真空干燥形式下密封形成。A型肉毒毒素由在含有N-Z胺和酵母提取物的培养基中生长的肉毒梭菌Hall菌株的培养物制成。A型肉毒毒素络合物通过一系列酸沉淀从培养溶液中纯化为结晶的络合物，所述络合物由高分子量的活性毒素蛋白和相关的血凝素蛋白组成。将结晶络合物重新溶于含有盐水和白蛋白的溶液中，并在无菌过滤(0.2微米)后真空干燥。BOTOX在肌内注射前，可用无菌的新鲜盐水复原。每小瓶BOTOX含有无菌、真空干燥形式的约100单位(U)的A型肉毒梭菌毒素络合物，0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，并且无防腐剂。
通过将适量的稀释液抽取到尺寸适中的注射器中以采用无防腐剂的无菌标准盐水(0.9％的氯化钠注射)使真空干燥的BOTOX复原。由于BOTOX可能因冒泡或类似的剧烈搅拌而变性，因此稀释液应轻轻地注射到小瓶中。出于保持无菌状态考虑，BOTOX应在复原后四小时内给药。在这四小时中，复原的BOTOX可储存在冰箱(2℃～8℃)中。复原的BOTOX澄清、无色，并且没有不溶性微粒(particulatematter)。真空干燥的产品在-5℃或以下储存于冷冻装置中。
一般来讲，识别出了肉毒梭菌的四个生理组(I，II，III和IV)。能够产生血清上不同的毒素的生物体可来自一个以上的生理组。例如，B型和F型毒素可由来自组I或组II的菌株产生。另外，已经识别了可产生肉毒神经毒素的其他梭菌种类(巴氏梭菌(C.baratii)，F型；丁酸梭菌(C.butyricum)，E型；诺氏梭菌(C.novyi)，C1或D型)的菌株。
肉毒梭菌类型的生理分组列于表1中。
表1.肉毒梭菌的生理分组
组 毒素血 清型 生物化学 奶消 化 葡萄糖 发酵 脂肪 酶 噬菌体 和质粒 表型相关的梭菌 (不产生毒素) I A，B，F 蛋白酶解/糖解 + + + + 生孢梭菌(C. sporogenes) II B，E，F 非蛋白酶解/糖 解/精神药物 - + + + III C，D 非蛋白酶解/糖 解 ± + + + 诺氏梭菌 IV G 蛋白酶解/非糖 解 + - - - 近端梭菌(C. subterminale)
这些毒素类型可通过筛选来自适当生理组的肉毒梭菌有机体而制备。定为组I的有机体通常是指蛋白酶解的且产生A、B和F型肉毒毒素的有机体。定为组II的有机体是糖解的且产生B、E和F型肉毒毒素的有机体。定为组III的有机体只产生C和D型肉毒毒素，并且产生大量的丙酸，从而区别于组I和组II的有机体。组IV的有机体只产生G型神经毒素。
已知可使用基本不含动物制品的特定培养基获得破伤风毒素。参见例如，美国专利6,558,926。但值得注意的是，该专利公开的“不含动物制品”的培养基甚至使用了细菌蛋白胨(一种肉消化产物)。显然，通过破伤风梭菌生产破伤风毒素和通过肉毒梭菌生产肉毒毒素需要不同的培养、培养基和发酵的参数及注意事项。参见例如，Johnson，E.A.等，Clostridium botulinum and its neurotoxins：a metabolic and cellularperspective，Toxicon 39(2001)，1703-1722。
因此为了获得或生产具有生物活性的肉毒毒素，需要一种不含或基本不含动物制品(如动物来源的蛋白)的培养基和方法。
克雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)是一种罕见的神经变性疾病——人传染性海绵状脑病，其传染物显然是一种异常异构体的朊病毒蛋白。一个患有克雅病的个体可在六个月之内，从完全健康恶化成运动不能性缄默症(akinetic mutism)。因此，施用含有使用动物来源制品获得的生物制剂(如肉毒毒素)的药物组合物，可能存在染上朊病毒介导的疾病(如克雅病)的潜在风险。
肉毒毒素
根据形态学和功能的分类，梭菌属有超过127个种类。厌氧的革兰氏阳性菌肉毒梭菌产生有效的多肽神经毒素即肉毒毒素，它在人类和动物中导致被称为肉毒中毒的神经麻痹疾病。肉毒梭菌及其孢子通常发现存在于土壤中，并且该细菌可在家庭式罐头厂未正确消毒和密封的食品容器中生长，这是导致多起肉毒中毒的原因。肉毒中毒作用通常出现于食用被肉毒梭菌培养物或孢子感染的食品后的18～36小时。显然，肉毒毒素可不衰减地穿过肠的衬里层(lining)并攻击外周运动神经元。肉毒毒素中毒的症状可从行走、吞咽和说话困难发展到呼吸肌麻痹和死亡。
A型肉毒毒素是人类已知的最致命的天然生物剂。大约50皮克的A型肉毒毒素(纯化的神经毒素络合物)即达到小鼠的LD50。以摩尔数计算，A型肉毒毒素的致死性比白喉高18亿倍，比氰化钠高6亿倍，比眼镜蛇毒素高3000万倍，比霍乱高1200万倍。Singh，Critical Aspectsof Bacterial Protein Toxins，Natural Toxin II的63～84页(第四章)，B.R.Singh等编辑，Plenum Press，纽约(1976)(根据约0.05ng等于1单位的事实对其中定义的A型肉毒毒素0.3ng等于1U这一LD50进行了校正)。是A型肉毒毒素纯化的神经毒素络合物的商标，可自加利福尼亚欧文市的阿勒根公司购得。1单位(U)的肉毒毒素定义为将其腹膜内注射到每只重18～20克的雌性SwissWebster小鼠中的LD50。换句话说，1单位肉毒毒素是将一组雌性SwissWebster小鼠杀死50％的肉毒毒素的量。七种常见免疫学上不同的肉毒神经毒素已被表征，分别为血清A、B、C1、D、E、F和G型肉毒神经毒素，各种血清型通过用类型特异性抗体中和区分。不同血清型的肉毒毒素在其感染的动物物种以及所引起的麻痹的严重程度和持续时间上均不相同。例如，据测定根据在大鼠中所测得的麻痹产生的速度，A型肉毒毒素比B型肉毒毒素强500倍。此外，据测定在灵长类动物中B型肉毒毒素在480U/kg的剂量下是无毒性的，而该剂量是A型肉毒毒素灵长类LD50的约12倍。肉毒毒素显然以高亲和力与胆碱能运动神经元结合，并转运到神经元中，从而阻断乙酰胆碱的突触前释放。
在临床环境下，肉毒毒素已用于治疗以骨骼肌机能亢进为特征的神经肌肉病症中。A型肉毒毒素已获得美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)的许可，主要用于治疗12岁以上患者的睑痉挛、斜视和偏侧面肌痉挛，治疗颈张力失常，以及治疗眉间线(面部)皱纹。FDA还已批准B型肉毒毒素用于治疗颈张力失常。A型肉毒毒素外周注射(即肌内注射或皮下注射)的临床效果通常显现于注射一周内，也常常在注射后几小时内。A型肉毒毒素单次肌内注射所产生的症状缓解(即松弛的肌肉麻痹)的持续时间通常可为大约3个月到大约6个月。
虽然所有肉毒毒素血清型在神经肌肉接头均显然抑制神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点切割上述蛋白进行的。A型肉毒毒素是一种锌内肽酶，它可以特异性水解细胞内、小泡(vesicle)相关蛋白SNAP-25的肽键。E型肉毒也切割25千道尔顿(kD)的突触相关蛋白(SNAP-25)，但与A型肉毒毒素相比，它针对该蛋白内不同的氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒毒素均作用于小泡相关蛋白(VAMP，又称为突触小泡蛋白)，但各血清型在不同的位点切割所述蛋白。最后，C1型肉毒毒素表现为切割突触融合蛋白和SNAP-25。上述作用机理的不同可能影响各种肉毒毒素血清型的相对效能(potency)和/或作用的持续时间。
不论何种血清型，其毒素中毒的分子机理似乎都是相似的并包括至少三个步骤或阶段。在过程的第一个步骤中，毒素通过重链(H链)和细胞表面受体之间特异性的相互作用与靶神经元的突触前膜结合；一般认为上述受体对于肉毒毒素的各种血清型和肉毒毒素是不同的。H链的羧基端片段HC似乎对于毒素靶向细胞表面很重要。
在第二个步骤中，毒素穿过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用(endocytosis)被细胞吞没并形成含有毒素的内体。然后毒素从内体中逃离到细胞的细胞质中。这一最后步骤被认为是由H链的氨基端片段HN介导的，当pH为约5.5或以下时，HN即产生应答引发毒素的构象变化。已知内体具有降低内体内pH的质子泵。构象变化暴露出毒素中的疏水残基，从而允许毒素将自身嵌入内体膜中。然后毒素通过内体膜转运到胞质溶胶中。
肉毒毒素活性机制的最后一步似乎涉及连接H链和L链的二硫键的还原。肉毒和肉毒毒素的全部毒性活性均包含在全毒素的L链中；L链是一种锌(Zn++)内肽酶，它选择性切割含有神经递质的小泡识别和停靠质膜胞质表面以及小泡与质膜融合所必需的蛋白质。肉毒神经毒素以及B、D、F和G型肉毒毒素导致一种突触小体膜蛋白即突触小泡蛋白(又称为小泡相关膜蛋白(VAMP))降解。上述切割活动中的任何一者都将导致大部分存在于突触小泡细胞质表面的VAMP被移除。各种毒素特异性切割不同的键。
对于所有七种已知的肉毒毒素血清型，其肉毒毒素蛋白分子的分子量均为约150kD。有趣的是，肉毒毒素是作为含有150kD的肉毒毒素蛋白分子和相关的无毒素蛋白的络合物从梭菌中释放出来的。因此，A型肉毒毒素络合物可由梭菌以900kD、500kD和300kD的形式产生。B型和C1型肉毒毒素显然仅以500kD的络合物产生。D型肉毒毒素以300kD和500kD的络合物产生。最后，E型和F型肉毒毒素仅以约300kD的络合物产生。所述络合物(即分子量大于约150kD)被认为含有非毒素的血凝素蛋白以及非毒素和无毒性的非血凝素蛋白。上述两种非毒素的蛋白(它们与肉毒毒素分子组成相关的神经毒素络合物)可能发生作用使肉毒毒素分子具有稳定性以避免变性，并在毒素被摄取时保护其以防消化酸。此外，有可能较大的(分子量大于约150kD)肉毒毒素络合物可使肉毒毒素从肉毒毒素络合物肌内注射部位的扩散速度减慢。通过使用pH7.3的红细胞处理毒素络合物，它可离解为毒素蛋白和血凝素蛋白。除去血凝素蛋白之后，毒素蛋白具有明显的不稳定性。
所有的肉毒毒素血清型均由肉毒梭菌作为无活性的单链蛋白产生，所述蛋白必需经由蛋白酶切割或切口以具有神经活性。产生血清型A和G肉毒毒素的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反地，血清型C1、D和E肉毒毒素由非蛋白酶解的菌株合成并因此在从培养物中回收时，通常是无活性的。血清型B和F由蛋白酶解和非蛋白酶解的菌株产生，因此可以活性或无活性形式回收。然而，即使是产生，例如，血清B型肉毒毒素的蛋白酶解菌株也仅切割所产生毒素的一部分。切口分子与无切口分子的精确比例取决于培养时间长短以及培养温度。因此，一定百分比的任何制品，如B型肉毒毒素很可能是无活性的，从而可能解释为什么B型肉毒毒素比A型肉毒毒素的效能低很多。临床制剂中无活性肉毒毒素分子的存在对制剂的全蛋白载荷(overall proteinload)有贡献，这与抗原性增大有关联，却未促进临床功效。另外知道，肌内注射后，B型肉毒毒素比相同剂量水平的A型肉毒毒素的活性期短，效力也弱。
体外研究已表明肉毒毒素抑制钾阳离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代细胞培养物中的释放。此外，据报道在脊髓神经元的原代培养物中，肉毒毒素抑制甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，并且在脑突触小体制品中，肉毒毒素抑制各种神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸)的释放。
高质量的结晶A型肉毒毒素可由肉毒梭菌的Hall A菌株生产，所述毒素特征为≥3×107U/mg，A260/A278小于0.60，并且在凝胶电泳上有独特的带型。已知的Schantz方法可用于获得结晶A型肉毒毒素，如Schantz，E.J.等在Properties and use of Botulinum toxin and OtherMicrobial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev.56：80～99(1992)所述的。通常，通过在适宜的培养基中培养A型肉毒梭菌可从厌氧发酵中分离并纯化A型肉毒毒素络合物。可通过硫酸沉淀来收获粗制毒素，并通过超微滤浓缩。可通过将酸沉淀物溶于氯化钙中来进行纯化。然后毒素可使用冷乙醇沉淀。沉淀物可溶于磷酸钠缓冲液中并离心。干燥后，可获得约900kD的结晶A型肉毒毒素络合物，其特异性效能为3×107LD50U/mg或以上。分离出非毒素蛋白后，也可使用该已知方法获得纯肉毒毒素，例如，分子量为约150kD、特异性效能为1～2×108LD50U/mg或以上的纯化A型肉毒毒素；分子量为约156kD、特异性效能为1～2×108LD50U/mg或以上的纯化B型肉毒毒素；分子量为约155kD、特异性效能为1～2×107LD50U/mg或以上的纯化F型肉毒毒素。
肉毒毒素(150千道尔顿的分子)和肉毒毒素络合物(300kDa至900kDa)可从，例如List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，加利福尼亚；the Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，英国；Wako(日本大阪)以及密苏里州圣路易斯的SigmaChemicals购得。市售的含有肉毒毒素的药物组合物包括(A型肉毒毒素神经毒素络合物与人血清白蛋白以及氯化钠，可从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得，100单位瓶装的冻干粉末，使用前用0.9％的氯化钠复原)、(制剂中有A型肉毒梭菌毒素的血凝素络合物与人血清白蛋白以及乳糖，可从英国贝克郡的IpsenLimited购得，粉末状，使用前用0.9％的氯化钠复原)，以及MyoBlocTM(一种注射液，含有B型肉毒毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠，pH为约5.6，可从爱尔兰都柏林的Elan Corporation购得)。
A型肉毒毒素在治疗多种临床症状中的成功引起了对其它肉毒毒素血清型的兴趣。因此，至少A、B、E和F型肉毒毒素已经在临床上用于人类。此外，纯(约150kDa)肉毒毒素已用于治疗人类。参见例如，Kohl A.等，Comparison of the effect of botulinum toxin A(Botox(R))with the highly-purified neurotoxin(NT 201)in the extensordigitorum brevis muscle test，Mov Disord 2000；15(增补本3)：165。因此，可使用纯(约150kDa)肉毒毒素制备药物组合物。
A型肉毒毒素已知可溶于pH为4～6.8的稀水溶液中。当pH大于约7时，特别是当pH和温度升高时，起稳定作用的无毒性蛋白从神经毒素中游离出来，导致毒性逐渐丧失。Schantz E.J.等，Preparationand characterization of botulinum toxin type A for human treatment(具体见44～45页)，Jankovic，J.等，Therapy with Botulinum Toxin的第3章，Marcel Dekker，Inc(1994)。
同酶一样，通常，肉毒毒素(它是细胞内肽酶)的生物活性至少部分取决于其三维构象。因此，通过热、多种化学药品的表面拉伸(surface stretching)和表面干燥可使A型肉毒毒素丧失毒性。此外，已知将通过已知的培养、发酵和纯化所获得的毒素络合物稀释到非常非常低的、可用于药物组合物制剂的毒素浓度将导致毒素的快速解毒，除非有适宜的稳定剂存在。将毒素从毫克量稀释到每毫升含有毫微克的溶液有很大难度，因为经上述高度稀释后，毒素将迅速丧失特异性的毒性。由于可能在制成含有毒素的药物组合物数月或数年后才使用所述毒素，因此可用稳定剂，如白蛋白和明胶使毒素稳定。
据报道肉毒毒素已用于多种临床处置中，包括下述方面：
(1)每次肌内注射(多决肌肉)约75～125单位的以治疗颈张力失常；
(2)每次肌内注射5～10单位的以治疗眉间线(眉沟)(降眉间肌肌内注射5单位，各皱眉肌肌内注射10单位)；
(3)向耻骨直肠肌括约肌内(intrasphincter)注射约30～80单位的以治疗便秘；
(4)向上眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌和下眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌分别肌内注射约1～5单位的以治疗睑痉挛。
(5)向眼外肌肌内注射约1～5单位的以治疗斜视，注射的量根据待注射肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹的程度(即所需的屈光度校正)变化。
(6)为治疗中风后的上肢痉挛，按照如下方式向五块不同的上肢屈肌肌内注射
(a)跖深屈肌：7.5U～30U
(b)跖浅屈肌：7.5U～30U
(c)尺侧腕屈肌：10U～40U
(d)桡侧腕屈肌：15U～60U
(e)肱二头肌：50U～200U。对各指定的五块肌肉在相同的治疗期进行注射，因此患者在各治疗期接受90U～360U的的上肢屈肌肌内注射。
(7)颅骨膜注射(对称注射到眉间肌、额肌和颞肌)25U的以治疗偏头痛已证实具有非常有益的偏头痛的预防治疗效果，与赋形剂相比，在25U注射后的三个月内降低了偏头痛的发病率、最大严重程度、所伴随的呕吐以及所使用的急性药物治疗。
已知A型肉毒毒素的效能可长达12个月(European J.Neurology 6(增补本4)：S111～S1150：1999)，并且在某些情况下可长达27个月。The Laryngoscope 109：1344～1346：1999。然而，肌内注射的普通维持时间通常为约3～4个月。
市售的含有肉毒毒素的药物组合物，其出售的商标为BOTOX(从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得)。BOTOX由纯化的A型肉毒毒素络合物、人血清白蛋白和氯化钠在无菌、真空干燥形式下密封形成。A型肉毒毒素由在含有N-Z胺和酵母提取物的培养基中生长的肉毒梭菌Hall菌株的培养物制成。A型肉毒毒素络合物通过一系列酸沉淀从培养溶液中纯化为结晶的络合物，所述络合物由高分子量的活性毒素蛋白和相关的血凝素蛋白组成。将结晶络合物重新溶于含有盐水和白蛋白的溶液中，并在无菌过滤(0.2微米)后真空干燥。BOTOX在肌内注射前，可用无菌的新鲜盐水复原。每小瓶BOTOX含有无菌、真空干燥形式的约100单位(U)的A型肉毒梭菌毒素络合物，0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，并且无防腐剂。
通过将适量的稀释液抽取到尺寸适中的注射器中以采用无防腐剂的无菌标准盐水(0.9％的氯化钠注射)使真空干燥的BOTOX复原。由于BOTOX可能因冒泡或类似的剧烈搅拌而变性，因此稀释液应轻轻地注射到小瓶中。出于保持无菌状态考虑，BOTOX应在复原后四小时内给药。在这四小时中，复原的BOTOX可储存在冰箱(2℃～8℃)中。复原的BOTOX澄清、无色，并且没有不溶性微粒(particulatematter)。真空干燥的产品在-5℃或以下储存于冷冻装置中。
一般来讲，识别出了肉毒梭菌的四个生理组(I，II，III和IV)。能够产生血清上不同的毒素的生物体可来自一个以上的生理组。例如，B型和F型毒素可由来自组I或组II的菌株产生。另外，已经识别了可产生肉毒神经毒素的其他梭菌种类(巴氏梭菌(C.baratii)，F型；丁酸梭菌(C.butyricum)，E型；诺氏梭菌(C.novyi)，C1或D型)的菌株。
肉毒梭菌类型的生理分组列于表1中。
表1.肉毒梭菌的生理分组
组 毒素血 清型 生物化学 奶消 化 葡萄糖 发酵 脂肪 酶 噬菌体 和质粒 表型相关的梭菌 (不产生毒素) I A，B，F 蛋白酶解/糖解 + + + + 生孢梭菌(C. sporogenes) II B，E，F 非蛋白酶解/糖 解/精神药物 - + + + III C，D 非蛋白酶解/糖 解 ± + + + 诺氏梭菌 IV G 蛋白酶解/非糖 解 + - - - 近端梭菌(C. subterminale)
这些毒素类型可通过筛选来自适当生理组的肉毒梭菌有机体而制备。定为组I的有机体通常是指蛋白酶解的且产生A、B和F型肉毒毒素的有机体。定为组II的有机体是糖解的且产生B、E和F型肉毒毒素的有机体。定为组III的有机体只产生C和D型肉毒毒素，并且产生大量的丙酸，从而区别于组I和组II的有机体。组IV的有机体只产生G型神经毒素。
已知可使用基本不含动物制品的特定培养基获得破伤风毒素。参见例如，美国专利6,558,926。但值得注意的是，该专利公开的“不含动物制品”的培养基甚至使用了细菌蛋白胨(一种肉消化产物)。显然，通过破伤风梭菌生产破伤风毒素和通过肉毒梭菌生产肉毒毒素需要不同的培养、培养基和发酵的参数及注意事项。参见例如，Johnson，E.A.等，Clostridium botulinum and its neurotoxins：a metabolic and cellularperspective，Toxicon 39(2001)，1703-1722。
因此为了获得或生产具有生物活性的肉毒毒素，需要一种不含或基本不含动物制品(如动物来源的蛋白)的培养基和方法。
发明内容
本发明迎合了此需要，为了获得或生产具有生物活性的肉毒毒素，提供了一种不含或基本不含动物制品(如动物来源的蛋白)的培养基和方法。获得的肉毒毒素可用来制备肉毒毒素活性成分药物组合物。
定义
本文使用的下述词语或术语具有如下定义。
“约”是指以其限定的项、参数或期限包括所述的项、参数或期限的值以上和以下的正或负10％的范围。
“给药”或“施用”是指将药物组合物给予(即施用于)患者的步骤。本文公开的药物组合物为“局部施用”，给药途径为例如肌内(i.m.)、皮内、皮下给药、鞘内给药、颅内、腹膜内(i.p.)给药、局部(经皮)和植入(即植入缓释设备如多聚植入物或微渗泵)。
“不含动物制品”或“基本不含动物制品”分别包括“不含动物蛋白”或“基本不含动物蛋白”，是指不存在或基本不存在血液来源的、血液汇集的或其他动物来源的制品或化合物。“动物”指哺乳动物(如人类)、鸟类、爬行类、鱼类、昆虫、蜘蛛或其他动物种类。“动物”不包括微生物，例如细菌。因此在本发明范围内不含动物制品的培养基或方法或基本不含动物制品的培养基或方法可包括肉毒毒素或肉毒梭菌细菌。例如，不含动物制品的方法或基本不含动物制品的方法是指基本不含或者大体上不含或者完全不含动物来源蛋白(如免疫球蛋白、肉消化产物、肉类副产品和奶或乳制品或消化产物)的方法。因此，不含动物制品的方法的一个实例是不使用肉和乳制品或者肉或乳副产品的方法(如细菌培养或细菌发酵方法)。
“肉毒毒素”是指由肉毒梭菌产生的神经毒素，以及由非梭菌种类重组产生的肉毒毒素(或其轻链或重链)。本文使用的短语“肉毒毒素”包括血清A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。本文使用的肉毒毒素还包括肉毒毒素络合物(即300、600和900kDa络合物)，以及纯化肉毒毒素(即约150kDa)。“纯化肉毒毒素”定义为与其他蛋白，包括形成肉毒毒素络合物的蛋白分离或基本分离的肉毒毒素。纯化肉毒毒素的纯度可为95％以上，优选在99％以上。肉毒C2和C3细胞毒素不是神经毒素，不在本发明范围之中。
“梭菌神经毒素”是指由梭菌细菌如肉毒梭菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌(Clostridium beratti)产生的或者由这些细菌天然产生的神经毒素，以及由非梭菌种类重组制造的梭菌神经毒素。
“完全不含”(即术语“由......组成”)是指在所用仪器或方法的检测范围内，检测不到该物质或者不能确定其存在。
“大体上不含”(或“主要由......组成”)是指只能检测到痕量的该物质。
“固定”是指防止受试者移动一个或多个身体部位的步骤。如果足够多的身体部位被固定，受试者就会因此被固定。所以，“固定”包括身体部位(如肢体)的固定，和/或受试者的完全固定。
“修饰的肉毒毒素”是指与天然的肉毒毒素相比，其至少一个氨基酸缺失、修饰或替换。此外，修饰的肉毒毒素可为重组制备的神经毒素，或者重组制备的神经毒素的衍生物或片段。修饰的肉毒毒素保留至少一种天然肉毒毒素的生物学活性，如结合肉毒毒素受体的能力，或抑制神经递质从神经元上释放的能力。修饰的肉毒毒素的一个实例是轻链来自一种肉毒毒素血清型(如血清型A)，而重链来自另外一种肉毒毒素血清型(如血清型B)的肉毒毒素。修饰的肉毒毒素的另一个实例是与神经递质(如P物质)相耦合的肉毒毒素。
“患者”是指接受医疗或兽医处理的人类或非人类受试者。因此，本发明所公开的组合物可用于治疗任何动物，例如哺乳动物。
“药物组合物”是指一种制剂，其中活性成分可为肉毒毒素。词语“制剂”是指在药物组合物中，除了神经毒素活性成分，至少还有另外一种成分。因此，药物组合物是一种适于对受试者(如人类患者)进行诊断性或治疗性给药(即肌内注射或皮下注射或植入缓释物(depot)或植入物)的制剂。药物组合物可以是：冻干或真空干燥的状态；使用盐水或水复原冻干的或真空干燥的药物组合物所形成的溶液；或者不需要复原的溶液。活性成分可以是血清A、B、C1、D、E、F或G型肉毒毒素之一或者一种肉毒毒素，它们都可天然地由梭菌细菌制备。如上所述，药物组合物可为，例如通过真空干燥的液体或固体。药物组合物的组成成分可包含于单一组合物(即除了所需的复原流体，所有组成成分在药物组合物配制之初即存在)中，或者作为双组分系统，例如一种使用稀释剂(如盐水)复原的真空干燥的组合物，其中稀释剂含有在药物组合物配制之初不存在的成分。双组分系统的优点在于它可以引入与双组分系统的第一组分在长期共同贮存的情况下没有足够的相容性的成分。例如，复原赋形剂或稀释剂可包括防腐剂，所述防腐剂可在使用期间(如一周时间的冷藏保存)提供足够的保护以防止微生物生长，而在两年时间的冷冻保存中不存在，因为这期间它可能会使毒素降解。与梭菌毒素或其他成分在长时间内不相容的其他成分可以这种方式加入；即，在即将使用前在第二赋形剂中(即在复原流体中)加入。配制肉毒毒素活性成分药物组合物的方法公开于美国专利公开文本2003 0118598 A1中。
“基本不含”是指低于药物组合物的1wt％(重量百分比)的水平。
“治疗制剂”是指可用于治疗并因而减轻病症或疾病(如以外周肌肉的活动过度(即痉挛状态)为特征的病症或疾病)的制剂。
本发明提供的培养基包括至少较低水平的动物或乳品副产物，优选基本不含动物或乳品副产物。“动物或乳品副产物”是指在动物(不包括细菌)细胞中或者由动物细胞在体内或体外产生的任何化合物或化合物的结合物(combination)。优选的非动物来源的培养基成分如蛋白、氨基酸和氮，包括植物、微生物(如酵母)和合成化合物。
本发明还提供了获得肉毒毒素的方法，该方法使用至少一种基本不含动物或乳品副产物的培养基。例如，肉毒毒素可通过在基本不含动物制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌来获得。
本发明还包括通过在基本不含动物制品并且包括植物来源制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌而获得的肉毒毒素。此外，肉毒毒素可通过在基本不含动物制品而是包括一些大豆制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌来获得。
在另一个优选的实施方案中，肉毒毒素可通过在基本不含动物制品而是包括水解大豆以替换动物来源制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌来获得。优选地，在发酵培养基中培养至少进行到开始出现细胞溶解。用于接种发酵培养基的肉毒梭菌源可来自含肉毒梭菌的种子培养基。优选地，在种子培养基中培养并用作发酵培养基的接种菌的肉毒梭菌没有经过细胞溶解。用于接种种子培养基的肉毒梭菌源可来自冻干的培养物。肉毒梭菌可以动物奶或豆奶中培养物的形式冻干。肉毒梭菌优选以豆奶中培养物的形式冻干。
本发明还提供了一种组合物，所述组合物包括用于培养肉毒梭菌、基本不含动物来源制品的培养基。
在一个实施方案中，所述组合物包括基本不含动物来源制品、而是含有至少一种非动物来源制品、还含有肉毒梭菌的培养基。
在另一个实施方案中，所述组合物包括基本不含动物来源制品、而是含有至少一种植物来源制品、还含有肉毒梭菌的培养基。本发明最后一个实施方案是一种组合物，所述组合物包括基本不含动物来源制品、而是含有至少一种大豆来源制品、还含有肉毒梭菌的培养基。
定义
本文使用的下述词语或术语具有如下定义。
“约”是指以其限定的项、参数或期限包括所述的项、参数或期限的值以上和以下的正或负10％的范围。
“给药”或“施用”是指将药物组合物给予(即施用于)患者的步骤。本文公开的药物组合物为“局部施用”，给药途径为例如肌内(i.m.)、皮内、皮下给药、鞘内给药、颅内、腹膜内(i.p.)给药、局部(经皮)和植入(即植入缓释设备如多聚植入物或微渗泵)。
“不含动物制品”或“基本不含动物制品”分别包括“不含动物蛋白”或“基本不含动物蛋白”，是指不存在或基本不存在血液来源的、血液汇集的或其他动物来源的制品或化合物。“动物”指哺乳动物(如人类)、鸟类、爬行类、鱼类、昆虫、蜘蛛或其他动物种类。“动物”不包括微生物，例如细菌。因此在本发明范围内不含动物制品的培养基或方法或基本不含动物制品的培养基或方法可包括肉毒毒素或肉毒梭菌细菌。例如，不含动物制品的方法或基本不含动物制品的方法是指基本不含或者大体上不含或者完全不含动物来源蛋白(如免疫球蛋白、肉消化产物、肉类副产品和奶或乳制品或消化产物)的方法。因此，不含动物制品的方法的一个实例是不使用肉和乳制品或者肉或乳副产品的方法(如细菌培养或细菌发酵方法)。
“肉毒毒素”是指由肉毒梭菌产生的神经毒素，以及由非梭菌种类重组产生的肉毒毒素(或其轻链或重链)。本文使用的短语“肉毒毒素”包括血清A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。本文使用的肉毒毒素还包括肉毒毒素络合物(即300、600和900kDa络合物)，以及纯化肉毒毒素(即约150kDa)。“纯化肉毒毒素”定义为与其他蛋白，包括形成肉毒毒素络合物的蛋白分离或基本分离的肉毒毒素。纯化肉毒毒素的纯度可为95％以上，优选在99％以上。肉毒C2和C3细胞毒素不是神经毒素，不在本发明范围之中。
“梭菌神经毒素”是指由梭菌细菌如肉毒梭菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌(Clostridium beratti)产生的或者由这些细菌天然产生的神经毒素，以及由非梭菌种类重组制造的梭菌神经毒素。
“完全不含”(即术语“由......组成”)是指在所用仪器或方法的检测范围内，检测不到该物质或者不能确定其存在。
“大体上不含”(或“主要由......组成”)是指只能检测到痕量的该物质。
“固定”是指防止受试者移动一个或多个身体部位的步骤。如果足够多的身体部位被固定，受试者就会因此被固定。所以，“固定”包括身体部位(如肢体)的固定，和/或受试者的完全固定。
“修饰的肉毒毒素”是指与天然的肉毒毒素相比，其至少一个氨基酸缺失、修饰或替换。此外，修饰的肉毒毒素可为重组制备的神经毒素，或者重组制备的神经毒素的衍生物或片段。修饰的肉毒毒素保留至少一种天然肉毒毒素的生物学活性，如结合肉毒毒素受体的能力，或抑制神经递质从神经元上释放的能力。修饰的肉毒毒素的一个实例是轻链来自一种肉毒毒素血清型(如血清型A)，而重链来自另外一种肉毒毒素血清型(如血清型B)的肉毒毒素。修饰的肉毒毒素的另一个实例是与神经递质(如P物质)相耦合的肉毒毒素。
“患者”是指接受医疗或兽医处理的人类或非人类受试者。因此，本发明所公开的组合物可用于治疗任何动物，例如哺乳动物。
“药物组合物”是指一种制剂，其中活性成分可为肉毒毒素。词语“制剂”是指在药物组合物中，除了神经毒素活性成分，至少还有另外一种成分。因此，药物组合物是一种适于对受试者(如人类患者)进行诊断性或治疗性给药(即肌内注射或皮下注射或植入缓释物(depot)或植入物)的制剂。药物组合物可以是：冻干或真空干燥的状态；使用盐水或水复原冻干的或真空干燥的药物组合物所形成的溶液；或者不需要复原的溶液。活性成分可以是血清A、B、C1、D、E、F或G型肉毒毒素之一或者一种肉毒毒素，它们都可天然地由梭菌细菌制备。如上所述，药物组合物可为，例如通过真空干燥的液体或固体。药物组合物的组成成分可包含于单一组合物(即除了所需的复原流体，所有组成成分在药物组合物配制之初即存在)中，或者作为双组分系统，例如一种使用稀释剂(如盐水)复原的真空干燥的组合物，其中稀释剂含有在药物组合物配制之初不存在的成分。双组分系统的优点在于它可以引入与双组分系统的第一组分在长期共同贮存的情况下没有足够的相容性的成分。例如，复原赋形剂或稀释剂可包括防腐剂，所述防腐剂可在使用期间(如一周时间的冷藏保存)提供足够的保护以防止微生物生长，而在两年时间的冷冻保存中不存在，因为这期间它可能会使毒素降解。与梭菌毒素或其他成分在长时间内不相容的其他成分可以这种方式加入；即，在即将使用前在第二赋形剂中(即在复原流体中)加入。配制肉毒毒素活性成分药物组合物的方法公开于美国专利公开文本2003 0118598 A1中。
“基本不含”是指低于药物组合物的1wt％(重量百分比)的水平。
“治疗制剂”是指可用于治疗并因而减轻病症或疾病(如以外周肌肉的活动过度(即痉挛状态)为特征的病症或疾病)的制剂。
本发明提供的培养基包括至少较低水平的动物或乳品副产物，优选基本不含动物或乳品副产物。“动物或乳品副产物”是指在动物(不包括细菌)细胞中或者由动物细胞在体内或体外产生的任何化合物或化合物的结合物(combination)。优选的非动物来源的培养基成分如蛋白、氨基酸和氮，包括植物、微生物(如酵母)和合成化合物。
本发明还提供了获得肉毒毒素的方法，该方法使用至少一种基本不含动物或乳品副产物的培养基。例如，肉毒毒素可通过在基本不含动物制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌来获得。
本发明还包括通过在基本不含动物制品并且包括植物来源制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌而获得的肉毒毒素。此外，肉毒毒素可通过在基本不含动物制品而是包括一些大豆制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌来获得。
在另一个优选的实施方案中，肉毒毒素可通过在基本不含动物制品而是包括水解大豆以替换动物来源制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌来获得。优选地，在发酵培养基中培养至少进行到开始出现细胞溶解。用于接种发酵培养基的肉毒梭菌源可来自含肉毒梭菌的种子培养基。优选地，在种子培养基中培养并用作发酵培养基的接种菌的肉毒梭菌没有经过细胞溶解。用于接种种子培养基的肉毒梭菌源可来自冻干的培养物。肉毒梭菌可以动物奶或豆奶中培养物的形式冻干。肉毒梭菌优选以豆奶中培养物的形式冻干。
本发明还提供了一种组合物，所述组合物包括用于培养肉毒梭菌、基本不含动物来源制品的培养基。
在一个实施方案中，所述组合物包括基本不含动物来源制品、而是含有至少一种非动物来源制品、还含有肉毒梭菌的培养基。
在另一个实施方案中，所述组合物包括基本不含动物来源制品、而是含有至少一种植物来源制品、还含有肉毒梭菌的培养基。本发明最后一个实施方案是一种组合物，所述组合物包括基本不含动物来源制品、而是含有至少一种大豆来源制品、还含有肉毒梭菌的培养基。
具体实施方式
本发明基于这样一种发现，即不含或基本不含动物制品或动物副产物的培养基和方法可用于培养和发酵能够产生具有生物活性肉毒毒素的生物体(如肉毒梭菌细菌)。所获肉毒毒素可用于制备肉毒毒素活性成分的药物组合物。因此，本文公开的生长培养基中肉或乳品副产物的水平显著减少，优选的培养基实施方案为基本不含此类动物制品。
本发明包括了发明人的一项惊人的发现，即动物来源的制品在培养肉毒梭菌的培养基中不是必需的，特别是植物来源制品可替换在培养肉毒梭菌的培养基中通常采用的动物来源制品。
目前用于培养和发酵细菌的培养基通常包括一种或多种动物来源成分。根据本发明，培养肉毒梭菌的优选培养基所含的动物来源成分占培养基总重量的不超过约5％至约10％。更优选地，本发明范围内的培养基包括不超过约1％至低于约5％培养基总重量的动物来源制品。最优选地，用于制备肉毒毒素而培养肉毒梭菌的所有培养基和培养物完全不含动物来源制品。这些培养基包括但不限于小规模和大规模发酵肉毒梭菌的培养基，培养用于接种种子(第一)培养基和发酵(第二)培养基的肉毒梭菌培养物的培养基，以及用于长期贮存肉毒梭菌培养物(如原种培养物)的培养基。
在本发明某一优选的实施方案中，培养肉毒梭菌和制备肉毒毒素的培养基可包括大豆来源制品以替换动物来源制品。或者，若不使用大豆来源制品，可使用脱苦味的羽扇豆(Lupinus campestris)种子。已知羽扇豆种子中的蛋白含量与大豆极为接近。优选地，这些培养基包括经过水解可溶于水的大豆或羽扇豆来源的制品。然而，不溶性大豆或羽扇豆制品也可用于本发明中以替换动物制品。可被大豆或羽扇豆制品替换的常用动物来源制品包括牛心浸液(BHI)、动物来源的蛋白胨制品如细菌蛋白胨、水解的酪蛋白、以及乳品副产物如动物奶。
优选地，含大豆或羽扇豆来源制品用来培养肉毒梭菌的培养基与通常使用的含动物来源制品的生长培养基相似，除了基本上所有的动物来源制品被植物来源制品替换。例如，基于大豆的发酵培养基可包括大豆来源制品，碳源如葡萄糖，盐类如NaCl和KCl，含磷酸盐的成分如Na2HPO4、KH2PO4，二价阳离子如铁和镁，铁粉，以及氨基酸如L-半胱氨酸和L-酪氨酸。用于培养接种发酵(第二)培养基的肉毒梭菌培养物的培养基(即种子培养基或第一培养基)优选至少包含大豆来源制品、盐类来源如NaCl、以及碳源如葡萄糖。
本发明提供了一种使用基本不含动物来源制品的培养基培养肉毒梭菌以使肉毒毒素产量最大化的方法。为生产肉毒梭菌和肉毒毒素而进行的培养可通过在含大豆副产物代替动物副产物来源的成分的培养基中发酵来实现。发酵培养基的接种菌可来自较小规模的生长培养基(一种种子培养基)。根据发酵步骤的大小和体积不同，为提高培养物的生物量而在种子培养基中连续培养的次数可以不同。为培养适量的用于接种发酵培养基的肉毒梭菌，可进行一步或多步涉及在种子培养基中培养的步骤。对于培养不含动物来源制品的肉毒梭菌的方法来说，优选培养的肉毒梭菌来自贮存于非动物来源培养基中的培养物。贮存的培养物(优选冻干的)通过在含大豆来源的蛋白而不含动物副产物的培养基中培养产生。在发酵培养基中培养肉毒梭菌可通过从贮存的、冻干的培养物直接接种进行。
在本发明优选的实施方案中，培养肉毒梭菌分为两个阶段——种子培养和发酵来进行。这两个阶段都在厌氧环境下进行。种子培养阶段一般用于“扩大”来自贮存培养物的微生物的数量。种子培养阶段的目的是增加可用于发酵的微生物的数量。另外，种子培养阶段可使贮存的培养物中相对来说休眠的微生物复苏并生成活跃生长的培养物。而且，与贮存的培养物相比，从活跃生长的培养物可更加精确地控制用于接种发酵培养物的活微生物的体积和数量。因此，优选培养用于接种发酵培养基的种子培养物。另外，为了增加用于接种发酵培养基的肉毒梭菌的数量，可进行任何次数的涉及在种子培养基中培养的连续步骤。应该注意，在发酵阶段培养肉毒梭菌可通过直接从贮存的培养物直接接种来进行。
在发酵阶段，将来自种子培养的含肉毒梭菌的种子培养基的一部分或全部用于接种发酵培养基。优选地，将大约2～4％来自种子培养阶段的含肉毒梭菌的种子培养基用于接种发酵培养基。发酵在大规模厌氧环境下，用于产生最大数量的微生物(Ljungdahl等，Manual ofindustrial microbiology and biotechnology(1986)，Demain等编著，American Society for Microbiology，Washington，D.C.第84页)。
肉毒毒素可使用蛋白纯化领域的普通技术人员公知的蛋白纯化方法来进行分离和纯化(Coligan等，Current Protocols in Protein Science，Wiley & Sons；Ozutsumi等，Appl.Environ.Microbiol.49；939-943：1985)。
为了制备肉毒毒素，肉毒梭菌培养物可在用于接种发酵培养基的种子培养基中培养。根据在发酵阶段生产肉毒毒素的规模不同，涉及在种子培养基中培养的连续步骤数可以不同。然而，如前所述，在发酵阶段的培养可从贮存的培养物直接接种来进行。基于动物的培养肉毒梭菌的培养基通常包括BHI、细菌蛋白胨、NaCl和葡萄糖。如前所述，可根据本发明制备另一种种子培养基，其中动物来源组分被非动物来源组分替换。例如但不限于，在培养肉毒梭菌和生产肉毒毒素的种子培养基中，大豆来源制品可替换BHI和细菌蛋白胨。优选地，大豆来源制品可溶于水，并且包含水解的大豆，尽管肉毒梭菌培养物可在含不溶性大豆的培养基中生长。然而，在可溶性大豆制品制成的培养基中，生长水平和随后的毒素产量均较高。
根据本发明，可使用任何来源的基于大豆的制品。大豆优选为水解大豆。水解大豆源可从多家厂商购得。它们包括但不限于Hy-Soy(Quest International)，Soy peptone(Gibco)，Bac-soytone(Difco)，AMISOY(Quest)，NZ soy(Quest)，NZ soy BL4，NZ soy BL7，SE50M(DMV International Nutritionals，Fraser，N.Y.)，以及SE50MK(DMV)。水解大豆源最优选Hy-Soy或SE50MK。其他可用的水解大豆源也是已知的。
根据本发明的种子培养基中Hy-Soy的浓度范围在25～200g/L之间。种子培养基中Hy-Soy的浓度范围优选在50～150g/L之间。种子培养基中Hy-Soy的浓度最优选大约100g/L。此外，NaCl浓度范围在0.1～2.0g/L之间。NaCl浓度范围优选在0.2～1.0g/L之间。种子培养基中NaCl浓度最优选大约0.5g/L。葡萄糖的浓度范围在0.1g/L～5.0g/L之间。葡萄糖的浓度范围优选在0.5～2.0g/L之间。种子培养基中葡萄糖的浓度最优选大约1.0g/L。还有对于本发明来说优选而非必需的是，将葡萄糖与种子培养基的其他组分一起高压灭菌。培养前种子培养基的pH范围优选在7.5～8.5之间。培养肉毒梭菌前种子培养基的pH最优选大约8.1。
在种子培养基中培养肉毒梭菌可分为一个或多个阶段进行。在种子培养基中培养优选分为两个阶段进行。在第一阶段，肉毒梭菌培养物悬浮于一些种子培养基中，并在34±1℃、厌氧环境下培育24～48小时。第一阶段的培养优选进行大约48小时。在第二阶段，将部分或全部含肉毒梭菌的第一阶段培养基用于接种第二阶段种子培养基以进一步培养。接种后，第二阶段培养基在34±1℃、也在厌氧环境下培育大约1～4天。在第二阶段种子培养基中的培养优选进行大约3天。还优选在使用种子培养基中的最终培养物接种发酵培养基之前，任一阶段的种子培养基中的培养都不导致细胞溶解。
培养肉毒梭菌的含动物副产物的标准发酵培养基可基于Mueller和Miller的配方(MM；J.Bacteriol.67：271，1954)。含动物副产物的MM培养基的成分中包括BHI和NZ-CaseTT。NZ-CaseTT是可在市面上购买的肽和氨基酸源，它来自酪蛋白(在动物奶中发现的一组蛋白)的酶消化产物。本发明证实，非动物来源制品可替换发酵培养基中的BHI和NZ-CaseTT。例如但不限于，大豆制品可替换用于发酵肉毒梭菌的MM培养基中的动物来源组分。大豆制品优选为水溶性，并且来自水解大豆，尽管如前所述，不溶性大豆制品也可用于实施本发明。
根据本发明可使用任何来源的大豆制品。水解大豆优选获自QuestInternational(Sheffield)，商品名Hy-Soy，或者获自DMV InternationalNutritionals(Fraser，N.Y.)，商品名SE50MK。可溶性大豆制品还可从多个来源获得，包括但不限于Soy peptone(Gibco)Bac-soytone(Difco)，AMISOY(Quest)，NZ soy(Quest)，NZ soy BL4，NZ soy BL7，以及SE50MK(DMV International Nutritionals，Fraser，N.Y.)。
在本发明另一个优选的实施方案中，用于发酵肉毒梭菌的培养基不含动物副产物，并且包括水解大豆、葡萄糖、NaCl、Na2HPO4、MgSO47H2O、KH2PO4、L-半胱氨酸、L-酪氨酸以及铁粉。正如所公开的种子培养基一样，水解大豆可替换发酵培养基中的动物副产物。这些动物副产物包括BHI和NZ-Case TT(酶消化的酪蛋白)。
生产肉毒毒素的发酵培养基中Hy-Soy的浓度范围优选在大约10～100g/L之间。Hy-Soy的浓度范围优选在大约20～60g/L之间。发酵培养基中Hy-Soy的浓度最优选大约35g/L。为使肉毒毒素产量最大化，发酵培养基中特别优选的组分浓度是大约7.5g/L，葡萄糖；5.0g/L NaCl；0.5g/L Na2HPO4；175mg/L KH2PO4；50mg/L MgSO47H2O；125mg/L L-半胱氨酸；以及125mg/L L-酪氨酸。所用铁粉的量可在50mg/L至2000mg/L范围内。铁粉的量优选在大约100mg/L至1000mg/L范围内。发酵培养基中铁粉的量最优选在大约200mg/L至600mg/L范围内。
为使毒素生产水平最高，基于大豆的发酵培养基的初始pH值(高压灭菌前)范围优选在大约5.5至7.1之间。发酵培养基的初始pH值优选在大约6.0至6.2之间。如针对种子培养基所述，包括葡萄糖和铁在内的发酵培养基组分优选一起高压灭菌。
优选地，用于培养肉毒梭菌的第二阶段种子培养基的一部分用于接种发酵培养基。发酵在厌氧培养室中大约34.±1℃下持续大约7到9天。通过测量培养基的光密度(O.D.)来监测生长情况。优选地，在通过生长测量手段(光密度)测得细胞溶解已持续至少48小时后停止发酵。细胞溶解时，培养基的O.D.值下降。
在本发明一个优选的实施方案中，用于长期贮存肉毒梭菌和接种种子培养基的肉毒梭菌培养物在贮存于4℃下之前在豆奶中培养和冻干。冻干保存的动物奶中的肉毒梭菌培养物也可用于制备肉毒毒素。然而，为了保持在整个生产肉毒毒素的过程中培养基基本不含动物副产物，优选肉毒梭菌的初始培养物保存在豆奶中而不是动物奶中。
实施例
以下实施例阐明包含于本发明中的具体的方法，并非意在限制本发明的范围。肉毒梭菌培养物可从数个来源获得，包括ListLaboratories，Campbell，California。所有的实验和培养基均使用双蒸水制备。在以下所有的实施例中，“肉毒梭菌”指A型肉毒梭菌的HallA(ATCC指定编号3502)菌株。
实施例1
制备不含动物制品的肉毒梭菌种子培养基
每1升培养基中使用下列组分制备对照种子培养基：NaCl(5g)，细菌蛋白胨(10g)，葡萄糖(10g)，BHI(至1升)，pH8.1(使用5N NaOH调节)。
每1升培养基中使用下列组分制备试验(不含动物制品)种子培养基：NaCl(5g)，大豆蛋白胨(10g)，葡萄糖(10g)，Hy-Soy(35g/升，补足1升流体培养基)，pH8.1(使用5N NaOH调节)。
实施例2
在不含动物制品的种子培养基中培养肉毒梭菌
可将冻干的肉毒梭菌培养物悬浮于实施例1的对照和试验种子培养基各1ml之中，分装(每种种子培养基)于两个试管中，每个试管中装有10ml相应的种子培养基，然后在34℃下培育约24～48小时。然后可使用1ml培养物接种含40ml(相应的)种子培养基的125mlDeLong Bellco培养瓶。接种的培养物可在Coy厌氧培养室(CoyLaboratory Products Inc.，Grass Lake，Mich.)中在33℃.±1℃下培育24小时。
实施例3
制备不含动物制品的肉毒梭菌发酵培养基
每2升培养基中使用下列成分制备基础发酵培养基：葡萄糖(15g)，NaCl(10g)，NaH2PO4(1g)，KH2PO4(0.350g)，MgSO47H2O(0.1g)，半胱氨酸-HC(0.250g)，酪氨酸-HCl(0.250g)，铁粉(1g)，ZnCl2(0.250g)，和MnCl2(0.4g)。
每2升制备的培养基中使用下列成分制备对照发酵培养基：BHI(500ml；这相当于大约45.5克干重牛心浸液)，NZ-CaseTT(30g)，以及基础培养基(至2升)，pH6.8。
可先制备基础发酵培养基并调节pH至6.8。然后制备牛心浸液(BHI)BHI，并使用5N NaOH调节其pH值至.8。然后将BHI加至基础培养基中。下一步制备NZ-CaseTT。然后将NZ-CaseTT加入已经加有牛心浸液的基础培养基中，并加入HCl溶解。然后使用5NNaOH调节pH值至6.8。然后将该培养基分成8ml的小份，分别装入16支100mm试管中，然后在120℃下高压灭菌25分钟。
可通过以试验氮源替换存在于对照发酵培养基中的BHI来制备试验发酵培养基(不含动物制品)。适当的试验发酵培养基氮源包括：Hy-Soy(Quest)，AMI-Soy(Quest)，NZ-Soy(Quest)，NZ-Soy BL4(Quest)，NZ-Soy BL7(Quest)，Sheftone D(Sheffield)，SE50M(DMV)，SE50(DMV)，SE％)MK(DMV)，大豆蛋白胨(Gibco)，Bacto-Soyton(Difco)，Nutrisoy 2207(ADM)，Bakes Nutrisoy(ADM)Nutrisoy flour，大豆粉，细菌-酵母提取物(Difco)酵母提取物(Gibco)，Hy-Yest 412(Quest)，Hy-Yest 441(Quest)，Hy-Yest 444(Quest)，Hy-Yest 455(Quest)Bacto-Malt Extract(Difco)，Corn Steep，以及Proflo(Traders)。
试验发酵培养基可通过以上针对对照发酵培养基叙述的方法进行制备，除了不加入BHI，以及首先使用3N HCl或5N NaOH将相关氮源的pH值调节至6.8。将该培养基分成8ml的小份，装入16支100mm试管中，然后在120℃下高压灭菌20～30分钟。
实施例4
在不含动物制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌
40μl的试验种子培养基培养物(不含动物制品)的小份可用于接种在8ml 16×100mm试管中的各8ml对照或试验发酵培养基等份。然后在33±1℃下培育该培养物24小时。然后将试管在厌氧培养室中培育，以使细菌生长。各培养基实验可平行进行三次(即同一培养基包括三次独立的接种)，还可包括未接种的对照，以在分光光度计中用作空白。每隔24小时使用Turner分光光度计(型号330)在660nm下测定生长状况(通过光密度OD值测定)。细胞溶解已经持续约48小时时停止培养，随后测定肉毒毒素的产量。
另外还可使用每500ml培养基中含下列成分的Hy-Soy发酵培养基进行实验：Hy-Soy(17.5g)，葡萄糖(3.75g)；NaCl(2.5g)；Na2HPO4(0.25g)，MgSO47H2O(0.025g)，KH2PO4(0.0875g)，L-半胱氨酸(0.0625g)，L-酪氨酸(0.0625g)，铁粉(0.25g)，pH6.8。
实施例5
对使用在不含动物制品的发酵培养基中培养的肉毒梭菌生产肉毒毒素 进行测定
将实施例4中的培养物细胞离心，测定上清液pH值。测定给定样本中的肉毒毒素水平，可通过加入标准抗毒素，测定出现絮凝所需时间来进行。Kf(出现絮凝所需时间，分钟)和Lf(絮凝限度；如通过絮凝建立，相应于1国际单位的标准抗毒素，)两者均可测定。对于给定的培养物，可从各发酵管中取4ml发酵液，汇集在一起，总共12ml混合于15ml离心管中。离心管在4℃、5000rpm(3400g)下离心30分钟。可将1ml小份的上清液加入含0.1～0.6ml标准肉毒毒素抗血清的试管中，轻轻摇动试管使管内物质混合。然后将管放入45±1℃的水浴中，记录起始时间。经常检查试管，记录絮凝开始时间作为Kf。可最先引起絮凝的试管中的毒素浓度可定为LfFF。可在第二位引起絮凝的试管中的毒素浓度可定为LfF。
平行的发酵、培养和毒素生产实验可针对以下两种液体培养基进行：(a)对照种子培养基(用于接种对照发酵培养基)和对照发酵培养基；(2)(不含动物制品的)试验种子培养基(用于接种试验发酵培养基)和(不含动物制品的)试验发酵培养基。较为显著的是，经测定，不含动物制品的培养基中的肉毒梭菌发酵以及使用同样不含动物制品(使用大豆制品替换动物制品)的培养物接种，可导致Lf毒素为约50或更高。最少，Lf毒素等于大约10。Lf毒素优选至少20。Lf毒素最优选大于50。
另外还可测得，在不含BHI的发酵培养基中，各种大豆制品支持肉毒梭菌的生长。因此，可使用可溶性大豆制品替换BHI培养肉毒梭菌。最佳浓度可为12.5或25g/L。使用Hy-Soy(Sheffield)时的生长情况最好。不溶性大豆制品的效果较差。
另外，获得的结果显示，在替换BHI培养肉毒梭菌的能力方面，Quest Hy-Soy，DMV SE50MK，和Quest NZ-Soy是效果较好的大豆制品。该结果显示有利于生长的大豆制品(如Quest Hy-Soy，DMVSE50MK，和Quest NZ-Soy)同样在替换BHI生产毒素方面有效。对生产毒素来说最佳大豆制品是22.75g/l下的Quest Hy-Soy。提高该制品的浓度可使生长状况更好，但不会提高毒素产量。此外显示使用SE50MK可获得相似的结果，提高其浓度可改善生长状况，但不会提高毒素产量。另一方面，NZ-Soy在更高的浓度下可提供更好的生长状况和更高的毒素产量。
最后，可确定大豆制品可有效替换BHI以及NZ-CaseTT。从基于大豆的培养基中除去NZ-CaseTT可使生长减缓约2～4倍。对于存在或不存在NZ-CaseTT的生长培养基，最佳大豆制品是SE50MK。在生产毒素中，HY-Soy可替换BHI和NZ-CaseTT两者。然而，可能需要1天或2天的更长的发酵循环。在生产毒素的培养基中，HY-Soy可替换BHI和NZ-CaseTT两者。然而，可确定酵母提取物可抑制毒素产生。
可确定在毒素生产中，22.75g/l的HY-Soy可完全替换BHI和HY-CaseTT两者。不像对生长的影响(56.88g/l的HY-Soy最佳)，34.13g/l HY-Soy对毒素生产阶段最佳。
因而，发明人已经出人意料地测定出在肉毒梭菌种子培养的培养基中是否可以使用Hy-Soy或〔Hy-Soy+Hy-Yest〕替换BHI和细菌蛋白胨。另外，为通过肉毒梭菌生产得到最高水平的肉毒毒素产量，可设计实验测定种子培养基中各组分的最佳浓度。通过在不含BHI和NZ-CaseTT的种子培养基和发酵培养基中培养的肉毒梭菌所得的毒素产量，可达到或超过在含BHI和NZ-CaseTT的培养基中获得的产量水平。
可测定在种子培养基中对于生长来说Hy-Soy或〔Hy-Soy+Hy-Yest〕的最佳浓度。实验可以确定，在培养肉毒梭菌以及在随后的发酵阶段生产肉毒毒素的种子培养基中，Hy-Soy可替换BHI和细菌蛋白胨作为氮源。同样，在种子培养基中以Hy-Soy作为氮源，与Hy-Soy加Hy-Yest相比，在随后的发酵步骤中可产生更高水平的肉毒毒素。可产生最高水平毒素的种子培养基中的Hy-Soy的浓度范围是从大约62.5g/L至100g/L。
设计另外的实验以测定通过肉毒梭菌发酵具有最高肉毒毒素产量时的种子培养基中的Hy-Soy的最佳浓度。因而，在种子培养基中30g、50g、75g和100g Hy-Soy通过发酵肉毒梭菌均可产生肉毒毒素，而且与含BHI和细菌蛋白胨作为氮源的种子培养基相比，其肉毒毒素生产水平相当或更高。
可以发现，种子培养基中Hy-Soy浓度为100g/L时可使随后的发酵步骤中毒素产生水平最高。另外，数据显示Hy-Soy种子培养基的种子步骤1在48小时后比24小时后可产生更好的生长状况。
本文引用了多种出版物、专利和/或参考文献，其内容通过引用的方式全文纳入本说明书中。
尽管已经针对特定优选的方法详尽地叙述了本发明，但也有可能采用在本发明范围内的其他实施方案、版本和修改。例如，很多种不含动物制品的方法均包含于本发明的范围之中。
因此，所附权利要求的精神和范围不应限制于以上提出的优选实施方案的叙述。
本发明包括了发明人的一项惊人的发现，即动物来源的制品在培养肉毒梭菌的培养基中不是必需的，特别是植物来源制品可替换在培养肉毒梭菌的培养基中通常采用的动物来源制品。
目前用于培养和发酵细菌的培养基通常包括一种或多种动物来源成分。根据本发明，培养肉毒梭菌的优选培养基所含的动物来源成分占培养基总重量的不超过约5％至约10％。更优选地，本发明范围内的培养基包括不超过约1％至低于约5％培养基总重量的动物来源制品。最优选地，用于制备肉毒毒素而培养肉毒梭菌的所有培养基和培养物完全不含动物来源制品。这些培养基包括但不限于小规模和大规模发酵肉毒梭菌的培养基，培养用于接种种子(第一)培养基和发酵(第二)培养基的肉毒梭菌培养物的培养基，以及用于长期贮存肉毒梭菌培养物(如原种培养物)的培养基。
在本发明某一优选的实施方案中，培养肉毒梭菌和制备肉毒毒素的培养基可包括大豆来源制品以替换动物来源制品。或者，若不使用大豆来源制品，可使用脱苦味的羽扇豆(Lupinus campestris)种子。已知羽扇豆种子中的蛋白含量与大豆极为接近。优选地，这些培养基包括经过水解可溶于水的大豆或羽扇豆来源的制品。然而，不溶性大豆或羽扇豆制品也可用于本发明中以替换动物制品。可被大豆或羽扇豆制品替换的常用动物来源制品包括牛心浸液(BHI)、动物来源的蛋白胨制品如细菌蛋白胨、水解的酪蛋白、以及乳品副产物如动物奶。
优选地，含大豆或羽扇豆来源制品用来培养肉毒梭菌的培养基与通常使用的含动物来源制品的生长培养基相似，除了基本上所有的动物来源制品被植物来源制品替换。例如，基于大豆的发酵培养基可包括大豆来源制品，碳源如葡萄糖，盐类如NaCl和KCl，含磷酸盐的成分如Na2HPO4、KH2PO4，二价阳离子如铁和镁，铁粉，以及氨基酸如L-半胱氨酸和L-酪氨酸。用于培养接种发酵(第二)培养基的肉毒梭菌培养物的培养基(即种子培养基或第一培养基)优选至少包含大豆来源制品、盐类来源如NaCl、以及碳源如葡萄糖。
本发明提供了一种使用基本不含动物来源制品的培养基培养肉毒梭菌以使肉毒毒素产量最大化的方法。为生产肉毒梭菌和肉毒毒素而进行的培养可通过在含大豆副产物代替动物副产物来源的成分的培养基中发酵来实现。发酵培养基的接种菌可来自较小规模的生长培养基(一种种子培养基)。根据发酵步骤的大小和体积不同，为提高培养物的生物量而在种子培养基中连续培养的次数可以不同。为培养适量的用于接种发酵培养基的肉毒梭菌，可进行一步或多步涉及在种子培养基中培养的步骤。对于培养不含动物来源制品的肉毒梭菌的方法来说，优选培养的肉毒梭菌来自贮存于非动物来源培养基中的培养物。贮存的培养物(优选冻干的)通过在含大豆来源的蛋白而不含动物副产物的培养基中培养产生。在发酵培养基中培养肉毒梭菌可通过从贮存的、冻干的培养物直接接种进行。
在本发明优选的实施方案中，培养肉毒梭菌分为两个阶段——种子培养和发酵来进行。这两个阶段都在厌氧环境下进行。种子培养阶段一般用于“扩大”来自贮存培养物的微生物的数量。种子培养阶段的目的是增加可用于发酵的微生物的数量。另外，种子培养阶段可使贮存的培养物中相对来说休眠的微生物复苏并生成活跃生长的培养物。而且，与贮存的培养物相比，从活跃生长的培养物可更加精确地控制用于接种发酵培养物的活微生物的体积和数量。因此，优选培养用于接种发酵培养基的种子培养物。另外，为了增加用于接种发酵培养基的肉毒梭菌的数量，可进行任何次数的涉及在种子培养基中培养的连续步骤。应该注意，在发酵阶段培养肉毒梭菌可通过直接从贮存的培养物直接接种来进行。
在发酵阶段，将来自种子培养的含肉毒梭菌的种子培养基的一部分或全部用于接种发酵培养基。优选地，将大约2～4％来自种子培养阶段的含肉毒梭菌的种子培养基用于接种发酵培养基。发酵在大规模厌氧环境下，用于产生最大数量的微生物(Ljungdahl等，Manual ofindustrial microbiology and biotechnology(1986)，Demain等编著，American Society for Microbiology，Washington，D.C.第84页)。
肉毒毒素可使用蛋白纯化领域的普通技术人员公知的蛋白纯化方法来进行分离和纯化(Coligan等，Current Protocols in Protein Science，Wiley & Sons；Ozutsumi等，Appl.Environ.Microbiol.49；939-943：1985)。
为了制备肉毒毒素，肉毒梭菌培养物可在用于接种发酵培养基的种子培养基中培养。根据在发酵阶段生产肉毒毒素的规模不同，涉及在种子培养基中培养的连续步骤数可以不同。然而，如前所述，在发酵阶段的培养可从贮存的培养物直接接种来进行。基于动物的培养肉毒梭菌的培养基通常包括BHI、细菌蛋白胨、NaCl和葡萄糖。如前所述，可根据本发明制备另一种种子培养基，其中动物来源组分被非动物来源组分替换。例如但不限于，在培养肉毒梭菌和生产肉毒毒素的种子培养基中，大豆来源制品可替换BHI和细菌蛋白胨。优选地，大豆来源制品可溶于水，并且包含水解的大豆，尽管肉毒梭菌培养物可在含不溶性大豆的培养基中生长。然而，在可溶性大豆制品制成的培养基中，生长水平和随后的毒素产量均较高。
根据本发明，可使用任何来源的基于大豆的制品。大豆优选为水解大豆。水解大豆源可从多家厂商购得。它们包括但不限于Hy-Soy(Quest International)，Soy peptone(Gibco)，Bac-soytone(Difco)，AMISOY(Quest)，NZ soy(Quest)，NZ soy BL4，NZ soy BL7，SE50M(DMV International Nutritionals，Fraser，N.Y.)，以及SE50MK(DMV)。水解大豆源最优选Hy-Soy或SE50MK。其他可用的水解大豆源也是已知的。
根据本发明的种子培养基中Hy-Soy的浓度范围在25～200g/L之间。种子培养基中Hy-Soy的浓度范围优选在50～150g/L之间。种子培养基中Hy-Soy的浓度最优选大约100g/L。此外，NaCl浓度范围在0.1～2.0g/L之间。NaCl浓度范围优选在0.2～1.0g/L之间。种子培养基中NaCl浓度最优选大约0.5g/L。葡萄糖的浓度范围在0.1g/L～5.0g/L之间。葡萄糖的浓度范围优选在0.5～2.0g/L之间。种子培养基中葡萄糖的浓度最优选大约1.0g/L。还有对于本发明来说优选而非必需的是，将葡萄糖与种子培养基的其他组分一起高压灭菌。培养前种子培养基的pH范围优选在7.5～8.5之间。培养肉毒梭菌前种子培养基的pH最优选大约8.1。
在种子培养基中培养肉毒梭菌可分为一个或多个阶段进行。在种子培养基中培养优选分为两个阶段进行。在第一阶段，肉毒梭菌培养物悬浮于一些种子培养基中，并在34±1℃、厌氧环境下培育24～48小时。第一阶段的培养优选进行大约48小时。在第二阶段，将部分或全部含肉毒梭菌的第一阶段培养基用于接种第二阶段种子培养基以进一步培养。接种后，第二阶段培养基在34±1℃、也在厌氧环境下培育大约1～4天。在第二阶段种子培养基中的培养优选进行大约3天。还优选在使用种子培养基中的最终培养物接种发酵培养基之前，任一阶段的种子培养基中的培养都不导致细胞溶解。
培养肉毒梭菌的含动物副产物的标准发酵培养基可基于Mueller和Miller的配方(MM；J.Bacteriol.67：271，1954)。含动物副产物的MM培养基的成分中包括BHI和NZ-CaseTT。NZ-CaseTT是可在市面上购买的肽和氨基酸源，它来自酪蛋白(在动物奶中发现的一组蛋白)的酶消化产物。本发明证实，非动物来源制品可替换发酵培养基中的BHI和NZ-CaseTT。例如但不限于，大豆制品可替换用于发酵肉毒梭菌的MM培养基中的动物来源组分。大豆制品优选为水溶性，并且来自水解大豆，尽管如前所述，不溶性大豆制品也可用于实施本发明。
根据本发明可使用任何来源的大豆制品。水解大豆优选获自QuestInternational(Sheffield)，商品名Hy-Soy，或者获自DMV InternationalNutritionals(Fraser，N.Y.)，商品名SE50MK。可溶性大豆制品还可从多个来源获得，包括但不限于Soy peptone(Gibco)Bac-soytone(Difco)，AMISOY(Quest)，NZ soy(Quest)，NZ soy BL4，NZ soy BL7，以及SE50MK(DMV International Nutritionals，Fraser，N.Y.)。
在本发明另一个优选的实施方案中，用于发酵肉毒梭菌的培养基不含动物副产物，并且包括水解大豆、葡萄糖、NaCl、Na2HPO4、MgSO47H2O、KH2PO4、L-半胱氨酸、L-酪氨酸以及铁粉。正如所公开的种子培养基一样，水解大豆可替换发酵培养基中的动物副产物。这些动物副产物包括BHI和NZ-Case TT(酶消化的酪蛋白)。
生产肉毒毒素的发酵培养基中Hy-Soy的浓度范围优选在大约10～100g/L之间。Hy-Soy的浓度范围优选在大约20～60g/L之间。发酵培养基中Hy-Soy的浓度最优选大约35g/L。为使肉毒毒素产量最大化，发酵培养基中特别优选的组分浓度是大约7.5g/L，葡萄糖；5.0g/L NaCl；0.5g/L Na2HPO4；175mg/L KH2PO4；50mg/L MgSO47H2O；125mg/L L-半胱氨酸；以及125mg/L L-酪氨酸。所用铁粉的量可在50mg/L至2000mg/L范围内。铁粉的量优选在大约100mg/L至1000mg/L范围内。发酵培养基中铁粉的量最优选在大约200mg/L至600mg/L范围内。
为使毒素生产水平最高，基于大豆的发酵培养基的初始pH值(高压灭菌前)范围优选在大约5.5至7.1之间。发酵培养基的初始pH值优选在大约6.0至6.2之间。如针对种子培养基所述，包括葡萄糖和铁在内的发酵培养基组分优选一起高压灭菌。
优选地，用于培养肉毒梭菌的第二阶段种子培养基的一部分用于接种发酵培养基。发酵在厌氧培养室中大约34.±1℃下持续大约7到9天。通过测量培养基的光密度(O.D.)来监测生长情况。优选地，在通过生长测量手段(光密度)测得细胞溶解已持续至少48小时后停止发酵。细胞溶解时，培养基的O.D.值下降。
在本发明一个优选的实施方案中，用于长期贮存肉毒梭菌和接种种子培养基的肉毒梭菌培养物在贮存于4℃下之前在豆奶中培养和冻干。冻干保存的动物奶中的肉毒梭菌培养物也可用于制备肉毒毒素。然而，为了保持在整个生产肉毒毒素的过程中培养基基本不含动物副产物，优选肉毒梭菌的初始培养物保存在豆奶中而不是动物奶中。
实施例
以下实施例阐明包含于本发明中的具体的方法，并非意在限制本发明的范围。肉毒梭菌培养物可从数个来源获得，包括ListLaboratories，Campbell，California。所有的实验和培养基均使用双蒸水制备。在以下所有的实施例中，“肉毒梭菌”指A型肉毒梭菌的HallA(ATCC指定编号3502)菌株。
实施例1
制备不含动物制品的肉毒梭菌种子培养基
每1升培养基中使用下列组分制备对照种子培养基：NaCl(5g)，细菌蛋白胨(10g)，葡萄糖(10g)，BHI(至1升)，pH8.1(使用5N NaOH调节)。
每1升培养基中使用下列组分制备试验(不含动物制品)种子培养基：NaCl(5g)，大豆蛋白胨(10g)，葡萄糖(10g)，Hy-Soy(35g/升，补足1升流体培养基)，pH8.1(使用5N NaOH调节)。
实施例2
在不含动物制品的种子培养基中培养肉毒梭菌
可将冻干的肉毒梭菌培养物悬浮于实施例1的对照和试验种子培养基各1ml之中，分装(每种种子培养基)于两个试管中，每个试管中装有10ml相应的种子培养基，然后在34℃下培育约24～48小时。然后可使用1ml培养物接种含40ml(相应的)种子培养基的125mlDeLong Bellco培养瓶。接种的培养物可在Coy厌氧培养室(CoyLaboratory Products Inc.，Grass Lake，Mich.)中在33℃.±1℃下培育24小时。
实施例3
制备不含动物制品的肉毒梭菌发酵培养基
每2升培养基中使用下列成分制备基础发酵培养基：葡萄糖(15g)，NaCl(10g)，NaH2PO4(1g)，KH2PO4(0.350g)，MgSO47H2O(0.1g)，半胱氨酸-HC(0.250g)，酪氨酸-HCl(0.250g)，铁粉(1g)，ZnCl2(0.250g)，和MnCl2(0.4g)。
每2升制备的培养基中使用下列成分制备对照发酵培养基：BHI(500ml；这相当于大约45.5克干重牛心浸液)，NZ-CaseTT(30g)，以及基础培养基(至2升)，pH6.8。
可先制备基础发酵培养基并调节pH至6.8。然后制备牛心浸液(BHI)BHI，并使用5N NaOH调节其pH值至.8。然后将BHI加至基础培养基中。下一步制备NZ-CaseTT。然后将NZ-CaseTT加入已经加有牛心浸液的基础培养基中，并加入HCl溶解。然后使用5NNaOH调节pH值至6.8。然后将该培养基分成8ml的小份，分别装入16支100mm试管中，然后在120℃下高压灭菌25分钟。
可通过以试验氮源替换存在于对照发酵培养基中的BHI来制备试验发酵培养基(不含动物制品)。适当的试验发酵培养基氮源包括：Hy-Soy(Quest)，AMI-Soy(Quest)，NZ-Soy(Quest)，NZ-Soy BL4(Quest)，NZ-Soy BL7(Quest)，Sheftone D(Sheffield)，SE50M(DMV)，SE50(DMV)，SE％)MK(DMV)，大豆蛋白胨(Gibco)，Bacto-Soyton(Difco)，Nutrisoy 2207(ADM)，Bakes Nutrisoy(ADM)Nutrisoy flour，大豆粉，细菌-酵母提取物(Difco)酵母提取物(Gibco)，Hy-Yest 412(Quest)，Hy-Yest 441(Quest)，Hy-Yest 444(Quest)，Hy-Yest 455(Quest)Bacto-Malt Extract(Difco)，Corn Steep，以及Proflo(Traders)。
试验发酵培养基可通过以上针对对照发酵培养基叙述的方法进行制备，除了不加入BHI，以及首先使用3N HCl或5N NaOH将相关氮源的pH值调节至6.8。将该培养基分成8ml的小份，装入16支100mm试管中，然后在120℃下高压灭菌20～30分钟。
实施例4
在不含动物制品的发酵培养基中培养肉毒梭菌
40μl的试验种子培养基培养物(不含动物制品)的小份可用于接种在8ml 16×100mm试管中的各8ml对照或试验发酵培养基等份。然后在33±1℃下培育该培养物24小时。然后将试管在厌氧培养室中培育，以使细菌生长。各培养基实验可平行进行三次(即同一培养基包括三次独立的接种)，还可包括未接种的对照，以在分光光度计中用作空白。每隔24小时使用Turner分光光度计(型号330)在660nm下测定生长状况(通过光密度OD值测定)。细胞溶解已经持续约48小时时停止培养，随后测定肉毒毒素的产量。
另外还可使用每500ml培养基中含下列成分的Hy-Soy发酵培养基进行实验：Hy-Soy(17.5g)，葡萄糖(3.75g)；NaCl(2.5g)；Na2HPO4(0.25g)，MgSO47H2O(0.025g)，KH2PO4(0.0875g)，L-半胱氨酸(0.0625g)，L-酪氨酸(0.0625g)，铁粉(0.25g)，pH6.8。
实施例5
对使用在不含动物制品的发酵培养基中培养的肉毒梭菌生产肉毒毒素 进行测定
将实施例4中的培养物细胞离心，测定上清液pH值。测定给定样本中的肉毒毒素水平，可通过加入标准抗毒素，测定出现絮凝所需时间来进行。Kf(出现絮凝所需时间，分钟)和Lf(絮凝限度；如通过絮凝建立，相应于1国际单位的标准抗毒素，)两者均可测定。对于给定的培养物，可从各发酵管中取4ml发酵液，汇集在一起，总共12ml混合于15ml离心管中。离心管在4℃、5000rpm(3400g)下离心30分钟。可将1ml小份的上清液加入含0.1～0.6ml标准肉毒毒素抗血清的试管中，轻轻摇动试管使管内物质混合。然后将管放入45±1℃的水浴中，记录起始时间。经常检查试管，记录絮凝开始时间作为Kf。可最先引起絮凝的试管中的毒素浓度可定为LfFF。可在第二位引起絮凝的试管中的毒素浓度可定为LfF。
平行的发酵、培养和毒素生产实验可针对以下两种液体培养基进行：(a)对照种子培养基(用于接种对照发酵培养基)和对照发酵培养基；(2)(不含动物制品的)试验种子培养基(用于接种试验发酵培养基)和(不含动物制品的)试验发酵培养基。较为显著的是，经测定，不含动物制品的培养基中的肉毒梭菌发酵以及使用同样不含动物制品(使用大豆制品替换动物制品)的培养物接种，可导致Lf毒素为约50或更高。最少，Lf毒素等于大约10。Lf毒素优选至少20。Lf毒素最优选大于50。
另外还可测得，在不含BHI的发酵培养基中，各种大豆制品支持肉毒梭菌的生长。因此，可使用可溶性大豆制品替换BHI培养肉毒梭菌。最佳浓度可为12.5或25g/L。使用Hy-Soy(Sheffield)时的生长情况最好。不溶性大豆制品的效果较差。
另外，获得的结果显示，在替换BHI培养肉毒梭菌的能力方面，Quest Hy-Soy，DMV SE50MK，和Quest NZ-Soy是效果较好的大豆制品。该结果显示有利于生长的大豆制品(如Quest Hy-Soy，DMVSE50MK，和Quest NZ-Soy)同样在替换BHI生产毒素方面有效。对生产毒素来说最佳大豆制品是22.75g/l下的Quest Hy-Soy。提高该制品的浓度可使生长状况更好，但不会提高毒素产量。此外显示使用SE50MK可获得相似的结果，提高其浓度可改善生长状况，但不会提高毒素产量。另一方面，NZ-Soy在更高的浓度下可提供更好的生长状况和更高的毒素产量。
最后，可确定大豆制品可有效替换BHI以及NZ-CaseTT。从基于大豆的培养基中除去NZ-CaseTT可使生长减缓约2～4倍。对于存在或不存在NZ-CaseTT的生长培养基，最佳大豆制品是SE50MK。在生产毒素中，HY-Soy可替换BHI和NZ-CaseTT两者。然而，可能需要1天或2天的更长的发酵循环。在生产毒素的培养基中，HY-Soy可替换BHI和NZ-CaseTT两者。然而，可确定酵母提取物可抑制毒素产生。
可确定在毒素生产中，22.75g/l的HY-Soy可完全替换BHI和HY-CaseTT两者。不像对生长的影响(56.88g/l的HY-Soy最佳)，34.13g/l HY-Soy对毒素生产阶段最佳。
因而，发明人已经出人意料地测定出在肉毒梭菌种子培养的培养基中是否可以使用Hy-Soy或〔Hy-Soy+Hy-Yest〕替换BHI和细菌蛋白胨。另外，为通过肉毒梭菌生产得到最高水平的肉毒毒素产量，可设计实验测定种子培养基中各组分的最佳浓度。通过在不含BHI和NZ-CaseTT的种子培养基和发酵培养基中培养的肉毒梭菌所得的毒素产量，可达到或超过在含BHI和NZ-CaseTT的培养基中获得的产量水平。
可测定在种子培养基中对于生长来说Hy-Soy或〔Hy-Soy+Hy-Yest〕的最佳浓度。实验可以确定，在培养肉毒梭菌以及在随后的发酵阶段生产肉毒毒素的种子培养基中，Hy-Soy可替换BHI和细菌蛋白胨作为氮源。同样，在种子培养基中以Hy-Soy作为氮源，与Hy-Soy加Hy-Yest相比，在随后的发酵步骤中可产生更高水平的肉毒毒素。可产生最高水平毒素的种子培养基中的Hy-Soy的浓度范围是从大约62.5g/L至100g/L。
设计另外的实验以测定通过肉毒梭菌发酵具有最高肉毒毒素产量时的种子培养基中的Hy-Soy的最佳浓度。因而，在种子培养基中30g、50g、75g和100g Hy-Soy通过发酵肉毒梭菌均可产生肉毒毒素，而且与含BHI和细菌蛋白胨作为氮源的种子培养基相比，其肉毒毒素生产水平相当或更高。
可以发现，种子培养基中Hy-Soy浓度为100g/L时可使随后的发酵步骤中毒素产生水平最高。另外，数据显示Hy-Soy种子培养基的种子步骤1在48小时后比24小时后可产生更好的生长状况。
本文引用了多种出版物、专利和/或参考文献，其内容通过引用的方式全文纳入本说明书中。
尽管已经针对特定优选的方法详尽地叙述了本发明，但也有可能采用在本发明范围内的其他实施方案、版本和修改。例如，很多种不含动物制品的方法均包含于本发明的范围之中。
因此，所附权利要求的精神和范围不应限制于以上提出的优选实施方案的叙述。