编码非生物胁迫反应相关蛋白质的核酸序列,以及提高对环境胁迫耐性的植物和植物细胞转让专利
申请号 : CN200480016684.9
文献号 : CN1863916B
文献日 : 2012-06-06
发明人 : P·普齐奥 , A·沙尔多南 , A·雪莉 , 王西青 , R·萨里亚-米兰 , B·麦克尔西 , 陈若英
申请人 : 巴斯福植物科学有限公司
摘要 :
本发明一般性涉及编码与非生物胁迫反应相关蛋白质的核酸序列和植物的非生物胁迫耐性。本发明进一步涉及与相应未转化的野生型植物细胞相比具有改变的代谢活性的转化植物细胞，其中通过转化编码胁迫相关蛋白质(SRP)的核酸改变代谢活性并导致与相应的未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性。
权利要求 :
1.通过转化编码胁迫相关蛋白质的核酸而与相应未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫耐性和/或抗性提高的转基因植物细胞，其中所述编码胁迫相关蛋白质的核酸选自：a)编码示于SEQ ID NO：65的多肽的核酸分子；
b)示于SEQ ID NO：64的核酸分子；
c)由于遗传密码的简并性可以从核酸分子(a)或(b)编码的多肽序列推导出其序列的核酸分子；
或其序列与上述核酸分子互补的核酸分子。
2.权利要求1的转基因植物细胞，其来自单子叶植物或双子叶植物。
3.权利要求1或2的转基因植物细胞，其来自裸子植物。
4.增加植物的胁迫耐性的方法，该方法包括在植物中表达或过表达胁迫相关蛋白质，其中所述胁迫相关蛋白质编码核酸选自：a)编码示于SEQ ID NO：65的多肽的核酸分子；
b)示于SEQ ID NO：64的核酸分子；
c)由于遗传密码的简并性可以从核酸分子(a)或(b)编码的多肽序列推导出其序列的核酸分子；
或其序列与上述核酸分子互补的核酸分子。
5.权利要求4的方法，其中使用下述表达载体，且所述表达载体包含(i)胁迫相关蛋白质编码核酸；或
(ii)含有一个或多个调节元件并赋予下述胁迫相关蛋白质编码核酸表达的核酸构建体；
其中所述胁迫相关蛋白质编码核酸选自：a)编码示于SEQ ID NO：65的多肽的核酸分子；
b)示于SEQ ID NO：64的核酸分子；
c)由于遗传密码的简并性可以从核酸分子(a)或(b)编码的多肽序列推导出其序列的核酸分子；
或其序列与上述核酸分子互补的核酸分子。
6.胁迫相关蛋白质编码核酸在转化时赋予植物提高的环境胁迫耐性的用途，其中所述胁迫相关蛋白质编码核酸选自：a)编码示于SEQ ID NO：65的多肽的核酸分子；
b)示于SEQ ID NO：64的核酸分子；
c)由于遗传密码的简并性可以从核酸分子(a)或(b)编码的多肽序列推导出其序列的核酸分子；
或其序列与上述核酸分子互补的核酸分子。
7.胁迫相关蛋白质编码核酸用作选择具有提高的环境胁迫耐性的植物或植物细胞的标记的用途，其中所述胁迫相关蛋白质编码核酸选自：a)编码示于SEQ ID NO：65的多肽的核酸分子；
b)示于SEQ ID NO：64的核酸分子；
c)由于遗传密码的简并性可以从核酸分子(a)或(b)编码的多肽序列推导出其序列的核酸分子；
或其序列与上述核酸分子互补的核酸分子。
8.胁迫相关蛋白质编码核酸用作检测植物或植物细胞中胁迫的标记的用途，其中胁迫相关蛋白质编码核酸选自：a)编码示于SEQ ID NO：65的多肽的核酸分子；
b)示于SEQ ID NO：64的核酸分子；
c)由于遗传密码的简并性可以从核酸分子(a)或(b)编码的多肽序列推导出其序列的核酸分子；
或其序列与上述核酸分子互补的核酸分子。
说明书 :
编码非生物胁迫反应相关蛋白质的核酸序列，以及提高对
环境胁迫耐性的植物和植物细胞
[0001] 本发明一般涉及编码非生物胁迫反应相关蛋白质的核酸序列和植物的非生物胁迫耐性。
[0002] 本发明还涉及与未转化的相应野生型植物细胞相比代谢活性有所改变的转化的植物细胞，其中通过转化编码胁迫相关蛋白质(SRP)的核酸改变代谢活性并导致与相应的
未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性。
未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性。
[0003] 具体来说，本发明涉及编码使植物具有干旱、热、冷和/或盐耐性和/或抗性的蛋白质的核酸序列，尤其通过改变代谢活性引起植物具有干旱、热、冷和/或盐耐性和/或抗
性。本发明还涉及制备、筛选及培育这些植物细胞或植物的方法以及检测植物细胞或植物
中胁迫的方法。
性。本发明还涉及制备、筛选及培育这些植物细胞或植物的方法以及检测植物细胞或植物
中胁迫的方法。
[0004] 如干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫和冷胁迫的非生物环境胁迫是植物生长和生产率的主要限制因子(Boyer. 1982.Science 218，443-448)。由这些胁迫引起的主要农作物如稻、
玉蜀黍(玉米)和小麦的农作物损失及农作物产量损失表现为重要的经济和政治因素，并
引起许多不发达国家的食品短缺。
玉蜀黍(玉米)和小麦的农作物损失及农作物产量损失表现为重要的经济和政治因素，并
引起许多不发达国家的食品短缺。
[0005] 植物在其生命周期中通常暴露于环境水含量减少的条件下。大部分植物已进化出在低水或干燥(干旱)条件下保护自身的策略。然而，如果干旱条件的强度太大、持续时间
太长的话，其对植物发育、生长和大多数农作物产量的影响是极大的。持续暴露于干旱引起
植物代谢的较大变化。这些代谢中的巨大变化最终导致细胞死亡并因此引起产量损失。
太长的话，其对植物发育、生长和大多数农作物产量的影响是极大的。持续暴露于干旱引起
植物代谢的较大变化。这些代谢中的巨大变化最终导致细胞死亡并因此引起产量损失。
[0006] 发展耐胁迫植物是可能解决或调解至少部分问题的策略(McKersie和Leshem，1994，《Stress and Stress Coping in Cultivated Plants》，KluwerAcademic
Publishers)。然而，发展对这些种类的胁迫表现出抗性(耐性) 的新植物的传统植物育
种策略相对缓慢，并需要特定抗性的植物与需要的植物杂交。用于胁迫耐性的有限的种质
资源和关系较远的植物物种间杂交的不相容性是常规培养中遇到的重要问题。另外，引起
干旱、冷和盐耐性的天然细胞过程是复杂的而且涉及细胞适应的多重机制和大量代谢途径
(McKersie和Leshem，1994.《Stress and Stress Coping in CultivatedPlants》，Kluwer
Academic Publishers)。胁迫耐性的多成分的特性不仅使得耐性育种很大程度上不成功，
而且还限制了使用生物技术方法遗传设计胁迫耐受植物的能力。
Publishers)。然而，发展对这些种类的胁迫表现出抗性(耐性) 的新植物的传统植物育
种策略相对缓慢，并需要特定抗性的植物与需要的植物杂交。用于胁迫耐性的有限的种质
资源和关系较远的植物物种间杂交的不相容性是常规培养中遇到的重要问题。另外，引起
干旱、冷和盐耐性的天然细胞过程是复杂的而且涉及细胞适应的多重机制和大量代谢途径
(McKersie和Leshem，1994.《Stress and Stress Coping in CultivatedPlants》，Kluwer
Academic Publishers)。胁迫耐性的多成分的特性不仅使得耐性育种很大程度上不成功，
而且还限制了使用生物技术方法遗传设计胁迫耐受植物的能力。
[0007] 干旱、热、冷和盐胁迫具有对植物生长而言很重要的共同因素，即水的可用度。植物在其整个生命周期中暴露在环境水含量减少的条件下。大部分植物已进化出在这些条件
下保护自身的策略。然而，如果干旱条件的强度太大、持续时间太长的话，其对植物发育、生
长和大多数农作物产量的影响是极大的。由于一些土壤中的高盐含量引起细胞可吸收的
水分减少，所以其影响类似于在干旱条件下所观察到的。另外，低于冰冻温度时，质外体中
开始形成冰并从共质体中夺取水分而导致植物细胞损失水分(McKersie和Leshem，1994，
《Stress and Stress Coping in CultivatedPlants》，Kluwer Academic Publishers)。通
常，植物对这些胁迫条件的每一种的分子反应机制是相似的。
下保护自身的策略。然而，如果干旱条件的强度太大、持续时间太长的话，其对植物发育、生
长和大多数农作物产量的影响是极大的。由于一些土壤中的高盐含量引起细胞可吸收的
水分减少，所以其影响类似于在干旱条件下所观察到的。另外，低于冰冻温度时，质外体中
开始形成冰并从共质体中夺取水分而导致植物细胞损失水分(McKersie和Leshem，1994，
《Stress and Stress Coping in CultivatedPlants》，Kluwer Academic Publishers)。通
常，植物对这些胁迫条件的每一种的分子反应机制是相似的。
[0008] 目前的研究结果表明干旱耐性是复杂的定量特性，且目前为止没有得到真正的鉴别标记。高盐浓度或脱水可能在干旱胁迫下引起细胞水平的损害，但是精确的伤害并不完
全清楚(Bray，1997.Trends Plant Sci. 2，48-54)。对机制理解的缺乏使得难于设计转
基因途径来提高干旱耐性。然而，损伤的一个重要结果可能是引起细胞损伤的活性氧自由
基的产生，所述损伤如脂质过氧化反应或蛋白质和核酸的修饰。氧自由基的化学性质和他
们与细胞组件(如细胞膜)的反应已有详细描述(McKersie和Leshem，1994，Stress and
Stress Coping in Cultivated Plants》，Kluwer AcademicPublishers)。
全清楚(Bray，1997.Trends Plant Sci. 2，48-54)。对机制理解的缺乏使得难于设计转
基因途径来提高干旱耐性。然而，损伤的一个重要结果可能是引起细胞损伤的活性氧自由
基的产生，所述损伤如脂质过氧化反应或蛋白质和核酸的修饰。氧自由基的化学性质和他
们与细胞组件(如细胞膜)的反应已有详细描述(McKersie和Leshem，1994，Stress and
Stress Coping in Cultivated Plants》，Kluwer AcademicPublishers)。
[0009] 本发明的目的是鉴定在表达或过表达时能够赋予植物胁迫耐性的新的、独特的基因。
[0010] 本发明的另一目的是鉴定、制备并培育新的、独特的耐胁迫或/和抗胁迫植物细胞或植物，以及在植物或植物细胞中诱导和检测胁迫耐性和/或抗性的方法。本发明的另
一目的是鉴定在植物或植物细胞中检测胁迫耐性和/或抗性的新方法。鉴定在表达或过表
达时能够赋予植物胁迫耐性的新的、独特的基因也是本文的目的。
一目的是鉴定在植物或植物细胞中检测胁迫耐性和/或抗性的新方法。鉴定在表达或过表
达时能够赋予植物胁迫耐性的新的、独特的基因也是本文的目的。
[0011] 本发明提供了与未转化的相应野生型植物细胞相比代谢活性有所改变的转化的植物细胞，其中通过转化编码胁迫相关蛋白质(SRP)的核酸改变代谢活性并引起与相应的
未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性。
未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性。
[0012] 本发明提供了用编码胁迫相关蛋白质(SRP)的核酸转化的转基因植物细胞。所述核酸选自：
[0013] a)编码序列图1a、1b或1c所示多肽之一或其片段的核酸分子，所述核酸分子在生物或其局部中赋予改变的代谢活性；
[0014] b)含有序列图1a、1b或1c所示核酸分子之一的核酸分子；
[0015] c)由于遗传密码的简并性可以从核酸分子(a)或(b)编码的多肽序列推导出其序列并在生物或其局部中赋予改变的代谢活性的核酸分子；
[0016] d)所编码的多肽与(a)到(c)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少50％的同一性并在生物或其局部中赋予改变的代谢活性的核酸分子；
[0017] e)在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交并在生物或其局部中赋予改变的代谢活性的核酸分子；
[0018] f)核酸分子，其包括通过使用表2的引物从cDNA文库或基因组文库中扩增核酸分子而获得的核酸分子，并在生物或其局部中赋予改变的代谢活性；
[0019] g)编码借助单克隆抗体分离的多肽并在生物或其局部中赋予改变的代谢活性的核酸分子，其中所述单克隆抗体助针对(a)到(f)之一的核酸分子所编码的多肽；
[0020] h)编码的多肽含有图1所示共有序列并在生物或其局部中赋予改变的代谢活性的核酸分子；和
[0021] i)可以通过在严格杂交条件下以探针或探针片段筛选适当的核酸文库获得并在生物或其局部中赋予改变的代谢活性的核酸分子，其中所述探针含有(a)到(k)核酸分
子之一的序列，或所述探针片段具有(a)到(k)所表征核酸分子的至少15nt，优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，或所述核酸含有与上述核酸分子互补的序列。
子之一的序列，或所述探针片段具有(a)到(k)所表征核酸分子的至少15nt，优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，或所述核酸含有与上述核酸分子互补的序列。
[0022] 就本发明而言，术语“序列图1a、1b或1c”包括并指SEQ ID NO：1到556，示于图1的术语“共有序列”指SEQ ID NO：557到560。
[0023] 本文中所用术语“代谢物”涉及中间物质，优选在细胞或植物合成代谢和分解代谢中产生的低分子量的物质，换言之即在代谢中产生或消耗的物质。
[0024] 术语“改变的代谢活性”是指在特定体积中相对于相应体积的对照、参考或野生型，代谢物数量、浓度或活性(本文中指用于化学反应和其他质量作用的有效浓度)的变化
(提高或降低)，包括与相应的未转化野生型植物细胞相比有所改变(提高或降低)的活性
或表达的从新产生，其通过例如下文所述方法之一来测量。
(提高或降低)，包括与相应的未转化野生型植物细胞相比有所改变(提高或降低)的活性
或表达的从新产生，其通过例如下文所述方法之一来测量。
[0025] 术语“提高的”、“上升的”、“延伸的”、“增强的”、“改进的”或“扩大的”涉及生物、生物部分(如组织、种子、根、叶、花等)或细胞中相应的性质的改变，并可互换使用。当提
高或增强涉及基因产物活性的提高或增强时，优选提高或增强了体积中的全部活性，并且
不依赖基因产物的数量或基因产物的比活性或者两者是否提高或增强，也不依赖于编码基
因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效率是否提高或增强。术语“减少”、“降低”
或“缺失”涉及生物、生物部分(如组织、种子、根、叶、花等)或细胞中相应的性质的改变。
当减少、降低或缺失涉及基因产物活性的减少、降低或缺失时，优选减少、降低或缺失了体
积中的全部活性，并且不依赖于基因产物的数量或基因产物的比活性或者两者是否减少、
高或增强涉及基因产物活性的提高或增强时，优选提高或增强了体积中的全部活性，并且
不依赖基因产物的数量或基因产物的比活性或者两者是否提高或增强，也不依赖于编码基
因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效率是否提高或增强。术语“减少”、“降低”
或“缺失”涉及生物、生物部分(如组织、种子、根、叶、花等)或细胞中相应的性质的改变。
当减少、降低或缺失涉及基因产物活性的减少、降低或缺失时，优选减少、降低或缺失了体
积中的全部活性，并且不依赖于基因产物的数量或基因产物的比活性或者两者是否减少、
[0026] 术语“提高”或“降低”涉及在生物、生物部分(如组织、种子、根、叶、花等)或细胞中相应的性质的改变。当提高或增强涉及基因产物活性的提高，优选提高了体积中的全
部活性，并且不依赖基因产物的数量或基因产物的比活性或者两者是否提高或产生，也不
依赖于编码基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效率是否提高。
部活性，并且不依赖基因产物的数量或基因产物的比活性或者两者是否提高或产生，也不
依赖于编码基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效率是否提高。
[0027] 在“性质的改变”中，应当理解基因产物的活性、表达水平或数量或代谢物的含量是在特定体积中相对于相应体积的对照、参考或野生型而有所改变，包括活性或表达的从
新产生。
新产生。
[0028] 术语“提高”或“降低”包括所述性质只在本发明研究对象的部分有所变化，例如修饰可见于细胞区室(如细胞器)，或植物部分(如组织、种子、根、叶、花等)中，但是如果
检测整个研究对象(即完整的细胞或植株)，则检测不到。优选提高或降低是细胞内的，因
此术语“活性的提高”或“代谢物含量的提高”涉及与野生型细胞相比的细胞内提高。
检测整个研究对象(即完整的细胞或植株)，则检测不到。优选提高或降低是细胞内的，因
此术语“活性的提高”或“代谢物含量的提高”涉及与野生型细胞相比的细胞内提高。
[0029] 因此，术语“提高”或“降低”是指酶的比活性以及化合物或代谢物(例如多肽、核酸分子)或本发明的精细化学药品或编码mRNA或DNA的量在体积内可提高或降低。
[0030] 术语“野生型”、“对照”或“参考”可互换使用并可以是细胞或生物的一部分(如细胞器或组织)或生物，尤其是未经根据本发明的方法修饰或处理的微生物或植物。相应
地，作为野生型、对照或参考的细胞或生物的一部分(如细胞器或组织)或生物(尤其是微
生物或植物)要与细胞、生物或其局部尽可能地符合，且除本发明方法结果外的任何其他
性质与本发明的研究对象尽可能一致。因此，野生型、对照或参考的处理要一致或尽可能一
致，即只有不影响测试性质的质量的条件或性质才可不同。
地，作为野生型、对照或参考的细胞或生物的一部分(如细胞器或组织)或生物(尤其是微
生物或植物)要与细胞、生物或其局部尽可能地符合，且除本发明方法结果外的任何其他
性质与本发明的研究对象尽可能一致。因此，野生型、对照或参考的处理要一致或尽可能一
致，即只有不影响测试性质的质量的条件或性质才可不同。
[0031] 优选地，任何比较要在类似条件下进行。术语“类似条件”是指要比较的实验之间的所有条件，例如培养或生长条件，实验条件(例如缓冲液组成、温度、底物、病原菌株、浓
度等)保持一致。
度等)保持一致。
[0032] “参考”、“对照”或“野生型”优选未根据本文所述本发明方法修饰或处理并且其他任何性质与本发明研究对象尽可能相似的对象，如细胞器、细胞、组织、生物，尤其是植物或
微生物。参考、对照或野生型在基因组、转录组、蛋白质组或代谢组方面与本发明的研究对
象尽可能相似。优选地，术语“参考”“对照”或“野生型”细胞器、细胞、组织或生物(尤其是
植物或微生物)涉及与本发明细胞器、细胞、组织或生物(尤其是植物或微生物)或生物的
一部分在遗传上几乎一致的细胞器、细胞、组织或生物(尤其是植物或微生物)，优选95％，
更优选98％，甚至更优选99.00％，尤其特别优选99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、
99.90％、99.99％、99.999％或更高的同一性。最优选除了赋予反应或活性的核酸分子或其
编码的基因产物被根据本发明的方法修正、操作、交换或引入之外，“参考”、“对照”或“野生
型”是与本发明方法使用的生物、细胞或细胞器遗传上一致的对象，如细胞器、细胞、组织或
生物。
微生物。参考、对照或野生型在基因组、转录组、蛋白质组或代谢组方面与本发明的研究对
象尽可能相似。优选地，术语“参考”“对照”或“野生型”细胞器、细胞、组织或生物(尤其是
植物或微生物)涉及与本发明细胞器、细胞、组织或生物(尤其是植物或微生物)或生物的
一部分在遗传上几乎一致的细胞器、细胞、组织或生物(尤其是植物或微生物)，优选95％，
更优选98％，甚至更优选99.00％，尤其特别优选99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、
99.90％、99.99％、99.999％或更高的同一性。最优选除了赋予反应或活性的核酸分子或其
编码的基因产物被根据本发明的方法修正、操作、交换或引入之外，“参考”、“对照”或“野生
型”是与本发明方法使用的生物、细胞或细胞器遗传上一致的对象，如细胞器、细胞、组织或
生物。
[0033] 优选地，参考、对照或野生型只在本发明多肽的细胞活性方面与本发明研究对象不同，这些差异是由于例如提高本发明核酸分子水平，或提高本发明多肽的比活性，例如通
过提高具有胁迫相关蛋白质(SRP)活性的蛋白质或其同源物的表达水平或活性、改变其生
物化学或遗传因素，及改变的代谢活性。
过提高具有胁迫相关蛋白质(SRP)活性的蛋白质或其同源物的表达水平或活性、改变其生
物化学或遗传因素，及改变的代谢活性。
[0034] 当不能提供仅由于不作为本发明方法的对象而区别于与本发明对象的对照、参考或野生型时，则对照、参考或野生型可以是这样的生物，其中回复或关闭了导致本文所述的
代谢活性或本发明核酸分子表达发生改变的活性调控因素，这可通过例如敲除相关基因产
物而实现，例如通过反义抑制、灭活激活剂或激动剂、激活抑制剂或拮抗剂、加入抑制抗体
而抑制、加入活性化合物(如激素)、引入负显性突变等。可通过例如引入导致酶活性抑制
或不稳定或结合辅因子的能力受到抑制等的灭活点突变来敲除基因产物。
代谢活性或本发明核酸分子表达发生改变的活性调控因素，这可通过例如敲除相关基因产
物而实现，例如通过反义抑制、灭活激活剂或激动剂、激活抑制剂或拮抗剂、加入抑制抗体
而抑制、加入活性化合物(如激素)、引入负显性突变等。可通过例如引入导致酶活性抑制
或不稳定或结合辅因子的能力受到抑制等的灭活点突变来敲除基因产物。
[0035] 因此，优选参考对象为本发明方法的起始对象。优选在例如标准化和规范化总RNA、DNA或蛋白质或活性或参考基因(如泛素、肌动蛋白或核糖体蛋白质等看家基因)的
表达量后比较参考和本发明研究对象。
表达量后比较参考和本发明研究对象。
[0036] 存在一系列的机制，通过它蛋白质(例如本发明的多肽)的修饰可以直接或间接影响氨基酸的产量、生产和/或生产效率。
[0037] 例如，可提高分子数量或多肽的比活性或核酸分子。如果本发明的多肽或核酸在缺乏所述蛋白质活性的生物中从头表达，则可产生更大量的精细化学药品。然而，也可通过
例如修饰基因的调控，或提高相应mRNA或本发明核酸分子编码的相应基因产物的稳定性，
或引入来自其他生物并被不同调控(如非反馈敏感)的同源基因来提高生物中天然存在基
因的表达。
例如修饰基因的调控，或提高相应mRNA或本发明核酸分子编码的相应基因产物的稳定性，
或引入来自其他生物并被不同调控(如非反馈敏感)的同源基因来提高生物中天然存在基
因的表达。
[0038] 这也类似的应用于将本发明的核酸分子或其基因产物与氨基酸生物合成途径的其它酶(如在精细化学药品合成中有用的酶)组合的表达提高。
[0039] 根据本发明的提高、降低或调节可是组成型的，例如由于稳定的永久转基因表达，或由于编码本发明核酸分子的相应内源基因的稳定突变，或由于表达的调控或赋予本发明
多肽表达的基因行为的调控，也可以是或瞬时的，例如由于瞬时转化或临时添加调质(如
激动剂或拮抗剂)；或者是诱导型的，例如转化了载有位于诱导型启动子控制下的本发明
核酸分子的可诱导构建体并加入诱导物(如四环素)后或本文下文所述。
多肽表达的基因行为的调控，也可以是或瞬时的，例如由于瞬时转化或临时添加调质(如
激动剂或拮抗剂)；或者是诱导型的，例如转化了载有位于诱导型启动子控制下的本发明
核酸分子的可诱导构建体并加入诱导物(如四环素)后或本文下文所述。
[0040] 细胞、组织、细胞器、器官或生物或其局部与对照、参考或野生型相比较，多肽活性的提高优选总计至少5％，更优选至少20％或至少50％，特别优选至少70％、80％、90％或
更多，尤其特别优选至少200％，最优选至少500％或更多。
更多，尤其特别优选至少200％，最优选至少500％或更多。
[0041] 本发明的核酸分子所编码多肽或本发明多肽的比活性可如实例中所述检测。具体而言，所述蛋白质在细胞(如植物细胞或微生物)中的表达及与对照相比精细化合物水平
的提高是容易检测的，并可根据本领域的描述实施。
的提高是容易检测的，并可根据本领域的描述实施。
[0042] 术语“提高”包括将化合物或活性从头引入细胞或之前化合物或活性从未检测到，换言之即“产生”。
[0043] 因此，在下文中，术语“提高的”还包括术语“产生的”或“刺激的”。活性的提高由精细化学药品的提高表明。
[0044] 在其他的一致条件下(例如培养条件、植物年龄等)比较转化的植物细胞和相应的属于同属和同种的未转化野生型。在本文的上下文中，与未转化生物相比较代谢活性有
至少10％，有利的是至少20％，优选至少30％，特别是至少40％、50％或60％，尤其特别优
选至少70％、80％、90％、95％或甚至100％或更多的变化是有利的。
至少10％，有利的是至少20％，优选至少30％，特别是至少40％、50％或60％，尤其特别优
选至少70％、80％、90％、95％或甚至100％或更多的变化是有利的。
[0045] 优选地，转化植物细胞的代谢物浓度变化是与相应的未转化野生型相比较的变化。优选地，代谢物浓度的变化经由HPLC测量，并通过各自内标的峰面积除每种分析物(代
谢物)的峰高或峰面积来计算。使用单个样品新重来标准化数据。所得的值除以在对照条
件下生长的野生型的同一序列中分析所得的平均值，产生所谓的比值，其代表了不依赖于
分析序列的值。这些比值表明了与野生型对照植物中的浓度相比转化植物的代谢物浓度行
为。
谢物)的峰高或峰面积来计算。使用单个样品新重来标准化数据。所得的值除以在对照条
件下生长的野生型的同一序列中分析所得的平均值，产生所谓的比值，其代表了不依赖于
分析序列的值。这些比值表明了与野生型对照植物中的浓度相比转化植物的代谢物浓度行
为。
[0046] 根据该方法，与相应的未转化野生型相比转化植物细胞中至少一种代谢产物浓度的变化是至少10％，有利的是至少20％，优选至少40％、60％或80％，特别优选至少90％、
100％或200％，极其优选至少700％、800％、900％或更多。
100％或200％，极其优选至少700％、800％、900％或更多。
[0047] 可通过本领域技术人员所知的所有统计学方法确定数据显著性，优选通过t-检验，更优选学生t-检验。
[0048] 改变的代谢活性还涉及与相应的未转化野生型植物细胞相比，在转化后不产生或只在转化后产生的代谢物。
[0049] 本发明优选的代谢物为2，3-二甲基-5-叶绿基醌醇或2-羟基棕榈酸或3，4-二羟基苯丙氨酸(＝多巴)或3-羟基棕榈酸或5-羟脯氨酸或丙氨酸或α-亚麻酸(c18:3(c9，
c12，c15))或α-生育酚或氨基己二酸或脱水葡萄糖或精氨酸或天冬胺酸或β-阿朴胡
萝卜素醛或β-胡萝卜素或β-谷固醇或β-生育酚或(Δ-7-顺式，10-顺式)-十六碳
二烯酸或十六碳三烯酸或十七烷酸或Δ-15-顺式-二十四烯酸或阿魏酸或油菜甾醇或蜡
酸(c26:0)或瓜氨酸或隐黄素或 二十烯酸(20:1)或果糖或延胡索酸或半乳糖或γ-氨基
丁酸或γ-生育酚或葡糖酸或葡萄糖或谷氨酸或甘油酸或甘油醛或甘油或甘油-3-磷酸
或甘氨酸或同型丝氨酸或肌醇或异亮氨酸或异麦芽糖或异戊烯焦磷酸或亮氨酸或二十四
烷酸(c24:0)或亚油酸(C18:2(c9，c12))或芦台因或番茄红素或苹果酸或甘露糖或甲硫
氨酸或甲基呋喃半乳糖苷或甲基吡喃半乳糖苷或甲基吡喃半乳糖苷或棕榈酸(c16:0)或
苯丙氨酸或磷酸或脯氨酸或腐胺或丙酮酸或棉子糖或核糖酸或丝氨酸或莽草素或芥子酸
(sinapine acid)或硬脂酸(c18:0)或琥珀酸或蔗糖或苏氨酸或三十烷酸或色氨酸或酪氨
酸或泛醌或udp-二磷酸葡萄糖或缬氨酸或玉米黄素。
c12，c15))或α-生育酚或氨基己二酸或脱水葡萄糖或精氨酸或天冬胺酸或β-阿朴胡
萝卜素醛或β-胡萝卜素或β-谷固醇或β-生育酚或(Δ-7-顺式，10-顺式)-十六碳
二烯酸或十六碳三烯酸或十七烷酸或Δ-15-顺式-二十四烯酸或阿魏酸或油菜甾醇或蜡
酸(c26:0)或瓜氨酸或隐黄素或 二十烯酸(20:1)或果糖或延胡索酸或半乳糖或γ-氨基
丁酸或γ-生育酚或葡糖酸或葡萄糖或谷氨酸或甘油酸或甘油醛或甘油或甘油-3-磷酸
或甘氨酸或同型丝氨酸或肌醇或异亮氨酸或异麦芽糖或异戊烯焦磷酸或亮氨酸或二十四
烷酸(c24:0)或亚油酸(C18:2(c9，c12))或芦台因或番茄红素或苹果酸或甘露糖或甲硫
氨酸或甲基呋喃半乳糖苷或甲基吡喃半乳糖苷或甲基吡喃半乳糖苷或棕榈酸(c16:0)或
苯丙氨酸或磷酸或脯氨酸或腐胺或丙酮酸或棉子糖或核糖酸或丝氨酸或莽草素或芥子酸
(sinapine acid)或硬脂酸(c18:0)或琥珀酸或蔗糖或苏氨酸或三十烷酸或色氨酸或酪氨
酸或泛醌或udp-二磷酸葡萄糖或缬氨酸或玉米黄素。
[0050] 也可改变与一种或多种上述代谢物的一种或多种衍生物相关的代谢活性。
[0051] 优选改变与选自上述所有代谢物的一种或多种有关的代谢活性。
[0052] 另外，可改变与选自甘露糖、肌醇、磷酸盐、门冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、γ-氨基丁酸、甘油醛(glycerinaldehyd)、蔗糖、油菜甾醇、缬氨酸、β-生育酚、泛醌、棕榈
酸(c16:0)、2-羟基棕榈酸或2，3-二甲基-5-叶绿基醌醇、β-胡萝卜素、α-亚麻酸
(c18:3(c9，c12，c15))、番茄红素中的一种或多种代谢物相关的代谢活性。
酸(c16:0)、2-羟基棕榈酸或2，3-二甲基-5-叶绿基醌醇、β-胡萝卜素、α-亚麻酸
(c18:3(c9，c12，c15))、番茄红素中的一种或多种代谢物相关的代谢活性。
[0053] 另外，可改变与选自甲基呋喃半乳糖苷、β-谷固醇、Δ-15-顺式-二十四烯酸(c24:1me)、十七烷酸(c17:0me)、硬脂酸(c18:0)、甲基吡喃半乳糖苷、γ-生育酚、亚油酸
(C18:2(c9，c12))、十六碳三烯酸(c16:3me)、莽草素、棉子糖、谷氨酸、谷氨酰胺、udp-二磷
酸葡萄糖、脯氨酸、苏氨酸、异戊烯焦磷酸、5-羟脯氨酸、阿魏酸、芥子酸中的一种或多种代
谢物相关的代谢活性。
(C18:2(c9，c12))、十六碳三烯酸(c16:3me)、莽草素、棉子糖、谷氨酸、谷氨酰胺、udp-二磷
酸葡萄糖、脯氨酸、苏氨酸、异戊烯焦磷酸、5-羟脯氨酸、阿魏酸、芥子酸中的一种或多种代
谢物相关的代谢活性。
[0054] 另外，可改变与选自色氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘油酸、精氨酸、3-羟基棕榈酸、腐胺、3，4-二羟苯丙氨酸(＝多巴)、α-生育酚、氨基己二酸、脱水葡萄糖、β-阿朴胡
萝卜素醛、Δ-7-顺式，10-顺式-十六碳二烯酸(c16:2丙酮)，蜡酸(c26:0)，隐黄素、二十
碳烯酸(20:1)，果糖、延胡索酸中的一种或多种代谢物相关的代谢活性。
萝卜素醛、Δ-7-顺式，10-顺式-十六碳二烯酸(c16:2丙酮)，蜡酸(c26:0)，隐黄素、二十
碳烯酸(20:1)，果糖、延胡索酸中的一种或多种代谢物相关的代谢活性。
[0055] 另外，可改变与选自半乳糖、葡糖酸、葡萄糖、甘油、甘油-3-磷酸、甘氨酸、同型丝氨酸、异麦芽糖、木蜡酸(c24:0)、芦台因、苹果酸、三十烷酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙酮酸、
核糖酸、琥珀酸、酪氨酸、玉米黄素中的一种或多种代谢物相关的代谢活性。
核糖酸、琥珀酸、酪氨酸、玉米黄素中的一种或多种代谢物相关的代谢活性。
[0056] 本发明提供了转基因植物细胞，其中所述核酸序列在植物细胞中的表达引起了导致与未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫提高耐性和/或抗性的改变的代谢活性。一种
优选的野生型植物细胞是未转化的拟南芥属(Arabidopsis)植物细胞。此处的实例为拟南
芥野生型C24(NottinghamArabidopsis Stock Centre，UK；NASC Stock N906)。
优选的野生型植物细胞是未转化的拟南芥属(Arabidopsis)植物细胞。此处的实例为拟南
芥野生型C24(NottinghamArabidopsis Stock Centre，UK；NASC Stock N906)。
[0057] 其他优选的野生型植物细胞为选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜、芸苔、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉
璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、turnip rape、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、
番茄、蚕豆、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属、油椰、椰子、多年生草本和饲料作物等的未转
化植物细胞。
璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、turnip rape、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、
番茄、蚕豆、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属、油椰、椰子、多年生草本和饲料作物等的未转
化植物细胞。
[0058] 更优选的野生型植物细胞为未转化的亚麻属植物细胞，优选亚麻(Linumusitatissimum)，更优选品种为Brigitta、Golda、Gold Merchant、Helle、Juliel、Olpina、
Livia、Marlin、Maedgold、Sporpion、Serenade、Linus、Taunus、Lifax或Liviola、未转化
的向日葵属(Helianthus)植物细胞，优选向日葵(Helianthus annuus)，更优选的品种为
Aurasol、Capela、Flavia、Flores、Jazzy、Palulo、Pegasol、PIR64A54、Rigasol、Sariuca、
Sideral、Sunny、Alenka、Candisol或Floyd，或未转化的芸苔属植物细胞，优选欧洲油
菜(Brassica napus)，更优选品种为Dorothy、Evita、Heros、Hyola、Kimbar、Lambada、
Licolly、Liconira、Licosmos、Lisonne、Mistral、Passat、Serator、Siapula、Sponsor、
Star、Caviar、Hybrido、Baical、Olga、Lara、Doublol、Karola、Falcon、Spirit、Olymp、Zeus、
Libero、Kyola、Licord、Lion、Lirajet、Lisbeth、Magnum、Maja，Mendel、Mica、 Mohican、
Olpop、Ontarion、Panthar、Prinoe、Pronio、Susanna、Talani、Titan、Transfer、Wiking、
Woltan、Zeniah、Artus、Contact或Smart。
Livia、Marlin、Maedgold、Sporpion、Serenade、Linus、Taunus、Lifax或Liviola、未转化
的向日葵属(Helianthus)植物细胞，优选向日葵(Helianthus annuus)，更优选的品种为
Aurasol、Capela、Flavia、Flores、Jazzy、Palulo、Pegasol、PIR64A54、Rigasol、Sariuca、
Sideral、Sunny、Alenka、Candisol或Floyd，或未转化的芸苔属植物细胞，优选欧洲油
菜(Brassica napus)，更优选品种为Dorothy、Evita、Heros、Hyola、Kimbar、Lambada、
Licolly、Liconira、Licosmos、Lisonne、Mistral、Passat、Serator、Siapula、Sponsor、
Star、Caviar、Hybrido、Baical、Olga、Lara、Doublol、Karola、Falcon、Spirit、Olymp、Zeus、
Libero、Kyola、Licord、Lion、Lirajet、Lisbeth、Magnum、Maja，Mendel、Mica、 Mohican、
Olpop、Ontarion、Panthar、Prinoe、Pronio、Susanna、Talani、Titan、Transfer、Wiking、
Woltan、Zeniah、Artus、Contact或Smart。
[0059] 所述核酸序列在植物细胞中的表达可直接或间接地影响转化植物细胞的代谢活性。优选其影响上述代谢物的活性。
[0060] 优选通过转化一种或多种选自序列图1a、1b或1c和/或的核酸序列或之前提到序列的同源物，并编码胁迫相关蛋白质(SRP)的核酸序列而改变代谢物的活性。
[0061] 本发明包括在靶植物尤其是作物植物中鉴定由选自序列图1a、1b或1c中的核酸和/或其同源物中的核酸序列编码的基因，然后表达相应的基因以得到引起对环境胁迫提
高耐性和/或抗性的改变的代谢活性。因此本发明不限于指定的植物。
高耐性和/或抗性的改变的代谢活性。因此本发明不限于指定的植物。
[0062] 拥有提供改变代谢活性的活性的蛋白质优选具有本文所述多肽的结构，尤其是含有图1所示共有序列的多肽或序列图1a、1b或1c所示多肽或本文所述其功能同源物的结
构；或由本文所表征的核酸分子或根据本发明的核分子编码，例如由序列图1a、1b或1c中
所示核酸分子或本文所述其功能同源物编码并具有本文所提到的活性。
构；或由本文所表征的核酸分子或根据本发明的核分子编码，例如由序列图1a、1b或1c中
所示核酸分子或本文所述其功能同源物编码并具有本文所提到的活性。
[0063] 还可能通过筛选与非胁迫条件相比植物细胞变化的代谢活性来检测植物细胞或植物中的环境胁迫。这允许甚至在没有可见症状时监测植物中胁迫水平。因此能更早执行
应对措施，例如通过及时的浇水将作物的损失减到最小。
应对措施，例如通过及时的浇水将作物的损失减到最小。
[0064] 本发明还包括通过在胁迫条件下筛选与非胁迫条件相比具有改变的代谢活性的植物细胞，从而筛选对环境胁迫有提高的耐性和/或抗性的植物细胞或植物。这允许不通
过基因鉴定或可见症状而挑选对环境胁迫有提高的耐性和/或抗性的植物。
过基因鉴定或可见症状而挑选对环境胁迫有提高的耐性和/或抗性的植物。
[0065] 通过在胁迫条件下筛选与非胁迫条件相比具有改变代谢活性的植物细胞并挑选具有对环境提高的耐性和/或抗性的植物细胞，根据本发明还可能培育具有对环境提高的
耐性和/或抗性的植物细胞或植物。筛选代谢活性比例如筛选基因要更快且更容易。
耐性和/或抗性的植物细胞或植物。筛选代谢活性比例如筛选基因要更快且更容易。
[0066] 筛选是本领域技术人员所熟知的，且一般指的是寻找特殊属性或性状。在本发明中植物或植物细胞的这种性状优选为代谢物浓度，特别优选上述代谢物的浓度。筛选的方
法和设备是本领域技术人员所熟悉的，并包括GC(气相层析)、LC(液相层析)、HPLC(高效
(压)液相层析)、MS(质谱)、NMR(核磁共振)光谱、IR(红外)光谱、光度计方法等，以及
这些方法的结合。
法和设备是本领域技术人员所熟悉的，并包括GC(气相层析)、LC(液相层析)、HPLC(高效
(压)液相层析)、MS(质谱)、NMR(核磁共振)光谱、IR(红外)光谱、光度计方法等，以及
这些方法的结合。
[0067] 培育也是本领域技术人员的常识。应理解为特殊属性或性状定向并稳定地整合入植物或植物细胞。
[0068] 不同的培育步骤以明确定义的人为干涉所表征，所述干涉如选择用于杂交的株系、指导亲本株系的授粉或选择合适的子代植物。由所需性质决定使用不同的培育措施。所
有的技术都是本领域技术人员熟知的，包括(但不限于)例如杂交、近交、回交育种、多系育
种、多种混交(variety blend)、种间杂交、非整倍体技术等。杂交技术还包括通过机械、化
学或生物化学手段使植物产生雄性或雌性的不育植物，而造成植物不育。雄性不育植物与
不同株系花粉间异花受粉确保了雄性不育而雌性可育的植物基因组将一致地获得亲本株
系双方的特性。根据本发明的转基因种子和植物可因此用于育种改进的植物株系，其提高
了常规方法(如除草剂或杀虫剂处理)的功效，或能使植物由于其修饰的遗传特性而豁免
于所述处理的方法。另外，可得到具有改进的胁迫耐性(优选干旱和温度耐性)的新型作
物，所述作物由于优化的遗传“装备”而产生与不能耐受相应不利发育条件的产物相比更佳
质量的收获产物。
有的技术都是本领域技术人员熟知的，包括(但不限于)例如杂交、近交、回交育种、多系育
种、多种混交(variety blend)、种间杂交、非整倍体技术等。杂交技术还包括通过机械、化
学或生物化学手段使植物产生雄性或雌性的不育植物，而造成植物不育。雄性不育植物与
不同株系花粉间异花受粉确保了雄性不育而雌性可育的植物基因组将一致地获得亲本株
系双方的特性。根据本发明的转基因种子和植物可因此用于育种改进的植物株系，其提高
了常规方法(如除草剂或杀虫剂处理)的功效，或能使植物由于其修饰的遗传特性而豁免
于所述处理的方法。另外，可得到具有改进的胁迫耐性(优选干旱和温度耐性)的新型作
物，所述作物由于优化的遗传“装备”而产生与不能耐受相应不利发育条件的产物相比更佳
质量的收获产物。
[0069] 本发明提供的环境胁迫可是盐、干旱、温度、金属、化学药品、病原和氧化胁迫，或它们的组合，优选干旱和/或温度。
[0070] 本发明的目的是其中SRP(＝胁迫相关蛋白质)优选来自酵母，优选酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)，或大肠杆菌或植物，优选欧洲油菜、大豆(Glycine max)或
稻(Oryza sativa)的转基因植物细胞。
稻(Oryza sativa)的转基因植物细胞。
[0071] 本发明的目的还有转基因植物细胞，其中编码SRP的核酸与序列图1a、1b或1c中的核酸之一具有至少50％的同原性。
[0072] 在本发明的转基因植物细胞中，所述核酸的表达导致与相应的未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫提高的耐性，优选通过改变代谢活性来达到。其中环境胁迫选自盐、干
旱、温度、金属、化学药品、病原和氧化胁迫，或它们的组合，优选干旱和/或温度。
旱、温度、金属、化学药品、病原和氧化胁迫，或它们的组合，优选干旱和/或温度。
[0073] 术语“表达”是指有编码意义的基因片段或基因的转录和/或表达。通常产生的产物是mRNA或者蛋白质。然而，表达产物也可包括功能性RNA如反义链、核酸、tRNAs、snRNAs、
rRNAs、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是整体的、局部的或瞬时的，例如局限于某些细胞类
型、组织、器官或时期。
rRNAs、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是整体的、局部的或瞬时的，例如局限于某些细胞类
型、组织、器官或时期。
[0074] 除非另有说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本发明上下文中可互换使用。除非另有说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本发明上下文中可互换使用。术语
“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，取决于使用术语“序列”的语
境。本文所用术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”此处使
用是指任意长度多聚体形式的核苷酸，包括核糖核酸或脱氧核糖核酸。术语只涉及分子的
一级结构。
“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，取决于使用术语“序列”的语
境。本文所用术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”此处使
用是指任意长度多聚体形式的核苷酸，包括核糖核酸或脱氧核糖核酸。术语只涉及分子的
一级结构。
[0075] 因此，本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链DNA及RNA。其还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、用类似物
替代一个或多个天然存在的核苷酸。优选本发明的DNA或RNA序列含有编码本文定义多肽
的编码序列。
替代一个或多个天然存在的核苷酸。优选本发明的DNA或RNA序列含有编码本文定义多肽
的编码序列。
[0076] “编码序列”是指当置于合适调节序列控制下时转录为mRNA和/或翻译为多肽的核苷酸序列。编码序列的边界由5’末端的翻译起始密码子和3’末端的翻译终止密码子决
定。编码序列可包括(但不限于)mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，其中内含子最
好还是存在于一定的环境中。
定。编码序列可包括(但不限于)mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，其中内含子最
好还是存在于一定的环境中。
[0077] 此外，转基因植物细胞来自于单子叶植物。或者，转基因植物细胞来自双子叶植物。优选地，转基因植物细胞选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉
花、油菜籽、芸苔、木薯、胡椒、向 日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、turnip
rape、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳
属、油椰、椰子、多年生草本植物、饲料作物和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。另外，本发
明的转基因植物细胞可来自裸子植物。优选选自云杉、松树和冷杉的植物。
花、油菜籽、芸苔、木薯、胡椒、向 日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、turnip
rape、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳
属、油椰、椰子、多年生草本植物、饲料作物和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。另外，本发
明的转基因植物细胞可来自裸子植物。优选选自云杉、松树和冷杉的植物。
[0078] 本发明进一步提供了转化了SRP编码核酸的转基因植物产生的种子，其中植物具有与野生型植物细胞相比对环境胁迫提高的耐性的纯种，优选该提高的耐性通过改变的代
谢活性来获得。转基因植物可以是单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。本发明还提供表达
SRP的转基因植物产生的种子，其中该植物是具有与野生型植物细胞相比对环境胁迫提高
的耐性的纯种，优选该提高的耐性通过改变的代谢活性来获得。本发明涉及由转基因植物
产生的种子，其中该种子是与野生型植物相比对环境胁迫有提高耐性的遗传上的纯合子，
优选该提高的耐性通过改变的代谢活性来获得。
谢活性来获得。转基因植物可以是单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。本发明还提供表达
SRP的转基因植物产生的种子，其中该植物是具有与野生型植物细胞相比对环境胁迫提高
的耐性的纯种，优选该提高的耐性通过改变的代谢活性来获得。本发明涉及由转基因植物
产生的种子，其中该种子是与野生型植物相比对环境胁迫有提高耐性的遗传上的纯合子，
优选该提高的耐性通过改变的代谢活性来获得。
[0079] 本发明还提供由以下所述任一转基因植物、植物部分(如叶、花瓣、花药、根、块茎、茎、芽、花或种子)产生的农产品。本发明还提供包含编码SRP的核酸序列的分离的重
组表达载体。
组表达载体。
[0080] 本发明还提供了制备含有SRP编码核酸的转基因植物的方法，其中核酸在植物中的表达导致与相应的未转化野生型植物细胞相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性，优选
通过改变的代谢活性来获得。该方法包含：
通过改变的代谢活性来获得。该方法包含：
[0081] a)用含有选自序列图1a、1b或1c和/或其同源物或其部分的SRP编码核酸的表达载体转化植物细胞，并
[0082] b)从该植物细胞制备与相应的未转化野生型植物相比对环境胁迫有提高耐性的转基因植物。
[0083] 关于本发明，“转化的或转基因”是指所有通过遗传操作产生的植物或其部分，且在其中
[0084] c)一个或多个基因，优选由一个或多个序列图1a、1b或1c中所述的核酸序列和/或其同源物编码的基因，或
[0085] d)与例如序列图1a、1b或1c中所述的核酸序列和/或其同源物功能性连接的遗传调节元件(如启动子)，或
[0086] e)(a)和(b)
[0087] 存在于不是它/它们的天然遗传环境中或经遗传操作方法修饰，修饰可通过例如替代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸基团。
[0088] “天然遗传环境”是指在起始生物中的天然染色体位点或存在于基因组文库中。就基因组文库而言，核酸序列的天然遗传环境优选至少部分维持不变。环境与核酸序列至少
在一侧相连并至少拥有50bp序列长度，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，尤其特别优
选至少5000bp。
在一侧相连并至少拥有50bp序列长度，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，尤其特别优
选至少5000bp。
[0089] 在所述制备含有SRP的转基因植物的方法中，编码SRP的核酸序列选自序列图1a、1b或1c的核酸和/或之前提到序列的同源物。此外，在所述方法中使用的编码SRP的核酸
与序列图1a、1b或1c的核酸至少50％同源。
与序列图1a、1b或1c的核酸至少50％同源。
[0090] 如果植物或植物细胞对于一具体性状是遗传上纯合的，以至于当纯种植物自花受粉时，没有观察到子代该性状显著的自由分离，则认为其是“纯种”。在本发明中，该性状源
于一种或多种引入植物细胞或植物的DNA序列的转基因表达。
于一种或多种引入植物细胞或植物的DNA序列的转基因表达。
[0091] 本发明还提供修饰植物胁迫耐性的方法，包括修饰SRP核酸在植物中的表达水平。本发明提供制备具有合成的、新的或修饰的转录因子的转基因植物的方法，所述因子通
过提高SRP基因的转录来起作用。理论上也可能获得基因的降低表达。
过提高SRP基因的转录来起作用。理论上也可能获得基因的降低表达。
[0092] 在植物细胞或植物中检测环境胁迫的方法也属于本发明的范围，包括筛选与非胁迫条件相比植物细胞改变的代谢活性。
[0093] 本发明还包括筛选对环境胁迫有提高耐性和/或抗性的植物细胞或植物的方法，包括在胁迫条件下筛选与非胁迫条件相比植物细胞改变的代谢活性。
[0094] 本发明还包括培育具有对环境胁迫提高的耐性和/或抗性的植物细胞或植物的方法，包括在胁迫条件下筛选与非胁迫条件相比植物细胞改变的代谢活性并挑选对环境胁
迫具有提高的耐性和/或抗性的植物细胞。
迫具有提高的耐性和/或抗性的植物细胞。
[0095] 在这些方法中，代谢活性改变优选与上述代谢物和代谢物组相关。
[0096] 本发明还包括改变的代谢活性和/或编码SRP的核酸(选自包含序列图1a、1b或1c的核酸和/或之前提到序列的同源物或其部分)作为筛选对环境胁迫具有提高耐性的植
物或植物细胞的标记物的用途。
物或植物细胞的标记物的用途。
[0097] 本发明还包括改变的代谢活性和/或编码SRP的核酸(选自包含序列图1a、1b或1c的核酸和/或之前提到序列的同源物或其部分)作为检测植物或植物细胞中胁迫的标记
物的用途。
物的用途。
[0098] 本发明还包括改变作物植物胁迫耐性的方法，包括利用编码SRP的核酸序列鉴定种群中因提高或降低的环境胁迫抗生(DNA标记物)而分离的植物个体。
[0099] 在所述改变植物胁迫耐性的方法中，编码SRP的核酸可选自序列图1a、1b或1c的核酸和/或之前提到序列的同源物。而且此处使用的编码SRP的核酸应与序列图1a、1b或
1c中的一种核酸有至少50％的同源性。并且本发明中所述的表达载体应按照所述方法使
用。
1c中的一种核酸有至少50％的同源性。并且本发明中所述的表达载体应按照所述方法使
用。
[0100] 在所述改变胁迫耐性方法的变形方法，用指导SRP表达的诱导型启动子转化植物。例如，启动子是组织特异性的。在改变的方法中，使用的启动子是发育调节型的。
[0101] 在另外的实施方案中，改变胁迫耐性的方法包含一个或多个的以下步骤：
[0102] a)稳定蛋白质，所述蛋白质赋予本发明核酸分子编码的蛋白质或具有本文提到的改变代谢活性之活性的本发明多肽提高表达；
[0103] b)稳定mRNA，所述蛋白质赋予本发明核酸分子编码的蛋白质或其同源物或编码具有本文提到的能改变代谢活性之活性的本发明多肽的mRNA提高表达；
[0104] c)提高蛋白质的比活性，所述蛋白质赋予本发明核酸分子编码的蛋白质或本发明多肽提高表达，或降低本发明多肽的抑制调节；
[0105] d)产生或提高介导蛋白质表达的内源或人工转录因子的表达，所述蛋白质赋予本发明核酸分子编码的蛋白质或具有本文提到的能改变代谢活性之活性的本发明多肽提高
表达；
表达；
[0106] e)通过在生物或其局部中添加一种或多种外源诱导因子刺激蛋白质的活性，所述蛋白质赋予本发明核酸分子编码的蛋白质或具有本文提到的能改变代谢活性之活性的本
发明多肽提高表达；
发明多肽提高表达；
[0107] f)表达编码蛋白质的转基因，所述蛋白质赋予本文本发明核酸分子编码的蛋白质或具有本文提到的能改变代谢活性之活性的本发明多肽提高表达；并/或
[0108] g)提高基因的拷贝数，所述基因赋予本发明核酸分子编码蛋白质或具有本文提到的能改变代谢活性之活性的本发明多肽提高表达；
[0109] h)通过加入正表达元件或去除负表达元件来提高编码本发明多肽或其同源物的内源基因的表达，例如可使用同源重组向启动子中引入如植物35s增强子的正调节元件或
从调节区去除抑制元件。另外可使用基因转变法破坏抑制元件或增强正元件活性，正因子
可通过T-DNA或转座子诱变随机引入植物，并筛选其中正因子被整合在本发明基因附近并
使本发明基因表达因此增强的株系；
从调节区去除抑制元件。另外可使用基因转变法破坏抑制元件或增强正元件活性，正因子
可通过T-DNA或转座子诱变随机引入植物，并筛选其中正因子被整合在本发明基因附近并
使本发明基因表达因此增强的株系；
[0110] i)以使编码本发明蛋白质的基因或蛋白质本身的表达或活性的方式增强的方式调控植物的生长条件；
[0111] j)从天然或诱变资源中挑选具有特别高活性的本发明蛋白质的生物并将其培育为目的生物，例如良种作物。
[0112] 优选地，所述mRNA是本发明的核酸分子并且/或赋予本发明核酸分子编码的蛋白质或具有本文提到的能改变代谢活性之活性的多肽提高表达的蛋白质是本发明多肽，例如
通过改变代谢活性赋予对环境胁迫提高的耐性。
通过改变代谢活性赋予对环境胁迫提高的耐性。
[0113] 通常，细胞或生物区室中mRNA、多核苷酸或核酸分子的数量与其编码蛋白质的数量相关因此与所述体积中编码蛋白质的总体活性相关。所述关联并非总是线性的，体积中
的活性取决于分子的稳定性、分子的降解或激活或抑制辅因子的存在。另外，产物或离析物
对酶的抑制是众所周知的，如Zinser等《酶抑制/酶抑制子》。
的活性取决于分子的稳定性、分子的降解或激活或抑制辅因子的存在。另外，产物或离析物
对酶的抑制是众所周知的，如Zinser等《酶抑制/酶抑制子》。
[0114] 可通过许多种方法提高上文提到的蛋白质和/或本发明核酸分子编码的多肽的活性。例如，通过提高基因产物数量提高在生物或其局部(如细胞中)的活性，例如通过引
入强启动子提高表达率或提高表达的mRNA的稳定性而提高翻译率，和/或提高基因产物的
稳定性而降低降解的蛋白质可提高基因产物数量。另外，可以以降低或增加反应速率或改
变(降低或提高)底物亲和力的方式影响酶的活性或转换。突变本发明多肽(如酶)催化
中心可调整酶的转换率，例如必须氨基酸的敲除可引起酶活性的降低或完全丢失，或调节
子结合位点的缺失或突变可降低负调节，如反馈抑制(当底物浓度也提高时的底物抑制)。
可提高本发明的酶的比活性以提高转换率或促进辅助因子的结合。提高编码mRNA或蛋白
质的稳定性也可以增加基因产物的活性。活性的刺激也属于术语“提高的活性”的范围。
入强启动子提高表达率或提高表达的mRNA的稳定性而提高翻译率，和/或提高基因产物的
稳定性而降低降解的蛋白质可提高基因产物数量。另外，可以以降低或增加反应速率或改
变(降低或提高)底物亲和力的方式影响酶的活性或转换。突变本发明多肽(如酶)催化
中心可调整酶的转换率，例如必须氨基酸的敲除可引起酶活性的降低或完全丢失，或调节
子结合位点的缺失或突变可降低负调节，如反馈抑制(当底物浓度也提高时的底物抑制)。
可提高本发明的酶的比活性以提高转换率或促进辅助因子的结合。提高编码mRNA或蛋白
质的稳定性也可以增加基因产物的活性。活性的刺激也属于术语“提高的活性”的范围。
[0115] 此外，可改变上述核酸序列的调节从而提高基因表达。这可以通过异源调节序列或通过改变(例如突变)现有的天然调节序列来有利地实现。这些有利的方法也可互相组
合。
合。
[0116] 通常，生物或其局部，尤其是植物细胞、植物或植物组织或其部分或微生物中基因产物的活性可通过提高所述生物或其局部中特定编码mRNA或相应的蛋白质的数量来提
高。“蛋白质或mRNA的数量”理解为生物、组织、细胞或细胞区室中多肽或mRNA的分子数。
蛋白质数量的“增加”是指与野生型、对照或参考相比，所述蛋白质在生物、组织、细胞或细
胞区室或其部分中分子数量有所增加，例如通过下述方法之一提高。
高。“蛋白质或mRNA的数量”理解为生物、组织、细胞或细胞区室中多肽或mRNA的分子数。
蛋白质数量的“增加”是指与野生型、对照或参考相比，所述蛋白质在生物、组织、细胞或细
胞区室或其部分中分子数量有所增加，例如通过下述方法之一提高。
[0117] 分子数量的提高优选至少1％，优选多于10％，更优选30％或更多，特别优选50％、70％或更多，尤其特别优选100％，最优选500％或更多。然而，从头表达也视为本发
明的课题。
明的课题。
[0118] 可由内源或外源因素引起改变(例如提高或降低)。例如，生物或其局部中活性的提高可由向培养基或营养物中添加基因产物或前体或激活剂或激动剂引起，或由向生物瞬
时或稳定地引入所述研究对象引起。
时或稳定地引入所述研究对象引起。
[0119] 在一个实施方案中，通过提高本发明多肽的内源水平来实现植物或其部分(如细胞、组织、器官、细胞器等)中代谢活性的提高或降低。相应地，在本发明的一个实施方案
中，本发明涉及一种方法，其中提高了编码本发明多核苷酸或核酸分子的基因的基因拷贝
数。此外，可通过例如改变多肽的转录或翻译调节来提高本发明多肽的内源水平。
中，本发明涉及一种方法，其中提高了编码本发明多核苷酸或核酸分子的基因的基因拷贝
数。此外，可通过例如改变多肽的转录或翻译调节来提高本发明多肽的内源水平。
[0120] 在一个实施方案中，可通过本发明内源基因的定向或随机诱变改变植物或其部分中的代谢活性。例如可使用同源重组向启动子中引入如植物35s增强子的正调
节元件，或从调节区去除抑制元件。另外可使用如Kochevenko和Willmitzer(Plant
Physio.2003May；132(174-84))和其中引文所述方法的基因转换来破坏抑制元件或增强
正调节元件的活性。此外可通过T-DNA或转座子诱变将正元件随机引入(植物)基因组，
并筛选正元件整合在本发明基因附近并因此使本发明的基因表达增强的株系。Hayashi等
1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等，2000(Plant Physio.122，1003-1013)和其中
所引用的其它引文已经描述了通过增强元件的随机整合激活植物基因。
节元件，或从调节区去除抑制元件。另外可使用如Kochevenko和Willmitzer(Plant
Physio.2003May；132(174-84))和其中引文所述方法的基因转换来破坏抑制元件或增强
正调节元件的活性。此外可通过T-DNA或转座子诱变将正元件随机引入(植物)基因组，
并筛选正元件整合在本发明基因附近并因此使本发明的基因表达增强的株系。Hayashi等
1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等，2000(Plant Physio.122，1003-1013)和其中
所引用的其它引文已经描述了通过增强元件的随机整合激活植物基因。
[0121] 多个案例中已描述了鉴定靠近目的基因的插入(最终载有激活元件)的反向遗传策略，例如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)；Sessions等，2002(Plant
Cell 2002，14，2985-2994)；Young 等，2001，(PlantPhysiol.2001，125，513-518)；Koprek
等，2000(Plant J.2000，24，253-263)；Jeon等，2000(Plant J.2000，22，561-570)；Tissier
等，1999(Plant Cell 1999，11，1841-1852)；Speulmann 等 1999(Plant Cell 1999，11，
1853-1866)。简要地，从大的T-DNA的所有植物或转座子诱变植物种群中收集材料并制备
基因组DNA。然后依照如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)中所述特殊工
艺(architectures)合并基因组DNA。
Cell 2002，14，2985-2994)；Young 等，2001，(PlantPhysiol.2001，125，513-518)；Koprek
等，2000(Plant J.2000，24，253-263)；Jeon等，2000(Plant J.2000，22，561-570)；Tissier
等，1999(Plant Cell 1999，11，1841-1852)；Speulmann 等 1999(Plant Cell 1999，11，
1853-1866)。简要地，从大的T-DNA的所有植物或转座子诱变植物种群中收集材料并制备
基因组DNA。然后依照如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)中所述特殊工
艺(architectures)合并基因组DNA。
[0122] 然后通过特定的多重PCR反应检测插入的诱变剂(例如T-DNA或转座子)和目的基因的组合来筛选基因组DNA库。因此使用T-DNA或转座子边界引物和基因特异引物的组
合在DNA库中进行PCR反应。引物设计的一般原则可见Krysan等1999(Plant Cell 1999，
11，2283-2290)。较低水平DNA库的再筛选导致鉴定出其中目的基因被插入的诱变剂激活
的植物个体。
合在DNA库中进行PCR反应。引物设计的一般原则可见Krysan等1999(Plant Cell 1999，
11，2283-2290)。较低水平DNA库的再筛选导致鉴定出其中目的基因被插入的诱变剂激活
的植物个体。
[0123] 正调节元件的增强或负调控因子的破坏或减弱也可通过普通的诱变技术实现：制备化学和辐射突变种群是常规技术且为技术人员所掌握。植物的方法由Koorneef等1982
及其中的引文以及和Lightner和Caspar在《Methods in Molecular Biology》82卷中描
述。这些技术通常诱导可使用如TILLING(Colbert等2001)方法在任一已知基因中鉴定的
点突变。
及其中的引文以及和Lightner和Caspar在《Methods in Molecular Biology》82卷中描
述。这些技术通常诱导可使用如TILLING(Colbert等2001)方法在任一已知基因中鉴定的
点突变。
[0124] 因此，如果通过同源重组、Tilling途径或基因转换修饰编码提高本发明多肽(尤其是含有本发明核酸分子的基因)表达的多肽的内源基因，可提高表达水平。
[0125] 调节序列可与内源蛋白质的编码区有效连接并控制其转录和翻译或控制编码mRNA或表达蛋白质的稳定性或降解。为了改变并控制表达，可改变、添加或修正启动子、
UTR、剪接位点、加工信号、多腺苷酸化位点、终止子、增强子、抑制子、转录后或翻译后修
饰位点。例如，Hayashi等，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等，2000(Plant
Physio.122，1003-1013)和其中引用的其他文献描述了通过随机整合增强子元件激活植物
基因。例如，可通过用更强的转基因启动子替换内源启动子或用不改变编码区而提供更高
稳定性的3′UTR替换内源性3′UTR来调控内源性蛋白质的表达水平。另外，可通过引入
如实施例中所述的人工转录因子来调控转录调节。下文描述了可另选的启动子、终止子和
UTR。
UTR、剪接位点、加工信号、多腺苷酸化位点、终止子、增强子、抑制子、转录后或翻译后修
饰位点。例如，Hayashi等，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等，2000(Plant
Physio.122，1003-1013)和其中引用的其他文献描述了通过随机整合增强子元件激活植物
基因。例如，可通过用更强的转基因启动子替换内源启动子或用不改变编码区而提供更高
稳定性的3′UTR替换内源性3′UTR来调控内源性蛋白质的表达水平。另外，可通过引入
如实施例中所述的人工转录因子来调控转录调节。下文描述了可另选的启动子、终止子和
UTR。
[0126] 拥有上述活性(如改变代谢活性后可赋予对环境胁迫提高的耐性)的内源多肽可通过引入与本发明蛋白质的编码区紧密结合并激活其转录的合成转录因子来激活。可解析
含有特殊DNA结合结构域和激活结构域(例如单纯疱疹病毒的VP16结构域)的嵌合锌指
蛋白。特定的结合结构域可 结合蛋白质编码区的调节区。嵌合转录因子在植物中的表达
引起本发明蛋白质的特定表达，见例如W001/52620，Oriz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，
第99卷，13290或Guan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，13296。
含有特殊DNA结合结构域和激活结构域(例如单纯疱疹病毒的VP16结构域)的嵌合锌指
蛋白。特定的结合结构域可 结合蛋白质编码区的调节区。嵌合转录因子在植物中的表达
引起本发明蛋白质的特定表达，见例如W001/52620，Oriz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，
第99卷，13290或Guan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，13296。
[0127] 在根据本发明方法的另一个实施方案中，使用在其中一种上述基因或一种上述核酸经如下突变的植物，即突变使得编码的基因产物的活性与未突变蛋白质相比更少地受到
细胞因子的影响，或完全不受影响。例如，众所周知的酶活性调节机制是底物抑制或反馈调
节机制。置换、缺失和添加相应序列的一个或多个碱基、核苷酸或氨基酸的方法和技术描述
于下文所列相应段落和参考文献中，例如Sambrook等，《Molecular Cloning》，ColdSpring
Habour，NY，1989。本领域技术人员可以通过使用包含鉴定结合位点和调节结构域的算法的
计算机软件手段将本发明核酸分子序列或其表达产物与本领域的情况(state)比较，或通
过引入核酸分子或蛋白质系统突变并测定能引起比活性提高或单位体积(尤其是单个细
胞)中活性提高的那些突变来鉴定调节子的调节结构域和结合结构域。
细胞因子的影响，或完全不受影响。例如，众所周知的酶活性调节机制是底物抑制或反馈调
节机制。置换、缺失和添加相应序列的一个或多个碱基、核苷酸或氨基酸的方法和技术描述
于下文所列相应段落和参考文献中，例如Sambrook等，《Molecular Cloning》，ColdSpring
Habour，NY，1989。本领域技术人员可以通过使用包含鉴定结合位点和调节结构域的算法的
计算机软件手段将本发明核酸分子序列或其表达产物与本领域的情况(state)比较，或通
过引入核酸分子或蛋白质系统突变并测定能引起比活性提高或单位体积(尤其是单个细
胞)中活性提高的那些突变来鉴定调节子的调节结构域和结合结构域。
[0128] 因此，在植物中表达来自于进化上疏远的生物的本发明的核酸分子或本发明的多肽(如在真核宿主中使用原核基因)是有利的，因为在这样的情况下宿主细胞的调节机制
不会降低基因或其表达产物的活性(细胞活性或比活性)。
不会降低基因或其表达产物的活性(细胞活性或比活性)。
[0129] 以不会对氨基酸的产生造成不利影响的方式引入突变。
[0130] 基因或其基因产物的调节受到较小的影响意味着酶活性调节的下降导致基因或其产物的比活性或细胞活性的提高。酶活性的提高可理解为酶的活性与起始生物相比提高
至少10％，有利的是至少20、30或40％，特别有利的是至少50、60或70％。
至少10％，有利的是至少20、30或40％，特别有利的是至少50、60或70％。
[0131] 本发明上述方法的实施导致肋迫耐性的提高。还可能获得降低的胁迫耐性。
[0132] 本发明不局限于所指的具体核酸、多肽、细胞类型、宿主细胞、条件或方法等，而是可以有所改变，并且本领域技术人员熟知大量的修饰和变更。还应理解本文使用的术语仅
用于描述具体实施方案，并无限制的意图。
用于描述具体实施方案，并无限制的意图。
[0133] 本发明还涉及选自序列图1a、1b或1c的蛋白质和/或其同源物的分离的胁迫相关蛋白质(SRP)。优选地，本发明的分离的胁迫相关蛋白质(SRP)选自酵母或大肠杆菌。另
外，本发明涉及选自序列图1a、1b或1c核酸和/或其同源物的编码分离的胁迫相关蛋白质
(SRP)的核酸。此处优选编码选自酵母或大肠杆菌的SRP的胁迫相关蛋白质的编码核酸。
外，本发明涉及选自序列图1a、1b或1c核酸和/或其同源物的编码分离的胁迫相关蛋白质
(SRP)的核酸。此处优选编码选自酵母或大肠杆菌的SRP的胁迫相关蛋白质的编码核酸。
[0134] 本发明提供选自酵母中序列图1a、1b或1c核酸的胁迫相关基因序列，优选来自酿酒酵母或大肠杆菌。
[0135] 上述序列的同源物可有利地分离自酵母、真菌、病毒、藻类、细菌中分离，例如从Acetobacter(subgen.Acetobacter)aceti；嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus
ferrooxidans)；不动杆菌属(Acinetobacter sp.)；放线杆菌属(Actinobacillus sp.)；
杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)；根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；
超耐热菌(Aquifex aeolicus)；隐秘杆菌属(Arcanobacterium pyogenes)；翠菊黄
化植物菌原体(Asteryellows phytoplasma)；芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；双歧杆
菌属(Bifidobacterium sp.)；博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；扩展短杆
菌(Brevibacterium linens)；羊流产布 氏杆菌(Brucella melitensis)；Buchnera
sp.；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter
jejuni)；新 月 柄 杆 菌 (Caulobacter crescentus)；衣 原 体 属 (Chlamydia sp.)；
嗜衣体属(Chlamydophila sp.)；泥生氯菌(Chlorobiumlimicola)；柠檬酸杆 菌
(Citrobacter)rodentium；梭状芽胞杆菌属(Clostridium sp.)；睾丸酮丛毛单胞菌
(Comamonas testosteroni)；棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)；伯纳特氏立克次
氏体(Coxiella burnetii)；耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)；节瘤偶
蹄形菌(Dichelobacternodosus)；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)；肠杆
菌属(Enterobactersp.)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠
杆菌 (Escherichia coli)；黄杆菌属(Flavobacterium sp.)；土拉热弗朗西丝氏菌
(Francisella tularensis)；Frankia sp.Cpl1；具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)；
嗜 热 杆 菌(Geobacillus stearothermophilus)；氧 化 葡 糖 杆 菌 (Gluconobacter
oxydans)；嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)；幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)；
肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)；乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)；乳酸乳球
菌(Lactococcus lactis)；李斯特菌属(Listeria sp.)；曼氏溶血杆菌(Mannheimia
haemolytic)；Mesorhizobiumloti；深海噬甲基菌(Methylophaga thalassic)；铜绿微囊
蓝细菌(Microcystisaeruginosa)；微囊蓝细菌属(Microscilla sp.)PRE1；摩拉克氏菌属
(Moraxella sp.)TA144；分支杆菌属(Mycobacterium sp.)；支原菌属(Mycoplasma sp.)；
奈瑟氏菌属(Neisseria sp.)；亚硝化单孢菌属(Nitrosomonas sp.)；念珠藻属(Nostoc
sp.)PCC 7120；Novosphingobiumaromaticivorans；酒酒球菌(Oenococcus oeni)；柠
檬泛菌(Pantoea citrea)；出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；戊糖片
球菌(Pediococcuspentosaceus)；坑形席蓝细菌(Phormidium foveolarum)；植原体属
(Phytoplasma sp.)；鲍氏织线藻(Plectonema boryanum)；栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella
ruminicola)；丙酸菌属(Propionibacterium sp.)；普通变形杆菌(Proteus vulgaris)；
假单胞菌属(Pseudomonas sp.)；Ralstonia sp.；根瘤菌属(Rhizobium sp.)；马红球菌
(Rhodococcus equi)；Rhodothermusmarinus；立克次体种(Rickettsia sp.)；鸭疫里默氏
菌(Riemerellaanatipestifer)；生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)；沙门氏
菌属(Salmonella sp.)；反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)；嗜虫沙雷菌
(Serratia entomophila)；志贺氏杆菌属(Shigella sp.)；苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium
meliloti)；葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)；链球菌属(Streptococcus sp.)；链霉菌
属(Streptomyces sp.)；聚球蓝细菌属(Synechococcus sp.)；(Synechocystis sp).PCC
6803；海栖热袍菌(Thermotoga maritime)；密螺旋体种(Treponema sp.)；尿素分解尿素
原体(Ureaplasma urealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholera)；副溶血性弧 菌(Vibrio
parahaemolyticus)；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；耶尔森菌属(Yersinia sp.)；运
动发酵单胞菌(Zymomonas mobils)，优选沙门氏菌属或大肠杆菌或植物，优选来自酵母如
来自毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉森氏酵母属(Hansenula)、球拟酵母
菌属(Torulopsis)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等属的酵母(Saccharomyces)
或植物，例如拟南芥、玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、红
花、亚麻子、报春花、油菜籽、turnip rape、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物(例如马铃
薯、烟草、茄子和番茄)、蚕豆、豌豆、苜蓿、灌木植物(例如咖啡、可可、茶)、柳属、树(例如
油椰、椰子)、多年生草本(例如黑麦草和羊茅草)以及饲料作物(例如苜蓿和三叶草)，以
及来自例如云杉、松树或冷杉。更优选可从酿酒酵母、大肠杆菌或植物中分离的上述序列的
同源物，优选欧洲油菜、大豆或稻。
ferrooxidans)；不动杆菌属(Acinetobacter sp.)；放线杆菌属(Actinobacillus sp.)；
杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)；根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；
超耐热菌(Aquifex aeolicus)；隐秘杆菌属(Arcanobacterium pyogenes)；翠菊黄
化植物菌原体(Asteryellows phytoplasma)；芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；双歧杆
菌属(Bifidobacterium sp.)；博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；扩展短杆
菌(Brevibacterium linens)；羊流产布 氏杆菌(Brucella melitensis)；Buchnera
sp.；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter
jejuni)；新 月 柄 杆 菌 (Caulobacter crescentus)；衣 原 体 属 (Chlamydia sp.)；
嗜衣体属(Chlamydophila sp.)；泥生氯菌(Chlorobiumlimicola)；柠檬酸杆 菌
(Citrobacter)rodentium；梭状芽胞杆菌属(Clostridium sp.)；睾丸酮丛毛单胞菌
(Comamonas testosteroni)；棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)；伯纳特氏立克次
氏体(Coxiella burnetii)；耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)；节瘤偶
蹄形菌(Dichelobacternodosus)；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)；肠杆
菌属(Enterobactersp.)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠
杆菌 (Escherichia coli)；黄杆菌属(Flavobacterium sp.)；土拉热弗朗西丝氏菌
(Francisella tularensis)；Frankia sp.Cpl1；具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)；
嗜 热 杆 菌(Geobacillus stearothermophilus)；氧 化 葡 糖 杆 菌 (Gluconobacter
oxydans)；嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)；幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)；
肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)；乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)；乳酸乳球
菌(Lactococcus lactis)；李斯特菌属(Listeria sp.)；曼氏溶血杆菌(Mannheimia
haemolytic)；Mesorhizobiumloti；深海噬甲基菌(Methylophaga thalassic)；铜绿微囊
蓝细菌(Microcystisaeruginosa)；微囊蓝细菌属(Microscilla sp.)PRE1；摩拉克氏菌属
(Moraxella sp.)TA144；分支杆菌属(Mycobacterium sp.)；支原菌属(Mycoplasma sp.)；
奈瑟氏菌属(Neisseria sp.)；亚硝化单孢菌属(Nitrosomonas sp.)；念珠藻属(Nostoc
sp.)PCC 7120；Novosphingobiumaromaticivorans；酒酒球菌(Oenococcus oeni)；柠
檬泛菌(Pantoea citrea)；出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；戊糖片
球菌(Pediococcuspentosaceus)；坑形席蓝细菌(Phormidium foveolarum)；植原体属
(Phytoplasma sp.)；鲍氏织线藻(Plectonema boryanum)；栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella
ruminicola)；丙酸菌属(Propionibacterium sp.)；普通变形杆菌(Proteus vulgaris)；
假单胞菌属(Pseudomonas sp.)；Ralstonia sp.；根瘤菌属(Rhizobium sp.)；马红球菌
(Rhodococcus equi)；Rhodothermusmarinus；立克次体种(Rickettsia sp.)；鸭疫里默氏
菌(Riemerellaanatipestifer)；生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)；沙门氏
菌属(Salmonella sp.)；反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)；嗜虫沙雷菌
(Serratia entomophila)；志贺氏杆菌属(Shigella sp.)；苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium
meliloti)；葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)；链球菌属(Streptococcus sp.)；链霉菌
属(Streptomyces sp.)；聚球蓝细菌属(Synechococcus sp.)；(Synechocystis sp).PCC
6803；海栖热袍菌(Thermotoga maritime)；密螺旋体种(Treponema sp.)；尿素分解尿素
原体(Ureaplasma urealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholera)；副溶血性弧 菌(Vibrio
parahaemolyticus)；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；耶尔森菌属(Yersinia sp.)；运
动发酵单胞菌(Zymomonas mobils)，优选沙门氏菌属或大肠杆菌或植物，优选来自酵母如
来自毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉森氏酵母属(Hansenula)、球拟酵母
菌属(Torulopsis)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等属的酵母(Saccharomyces)
或植物，例如拟南芥、玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、红
花、亚麻子、报春花、油菜籽、turnip rape、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物(例如马铃
薯、烟草、茄子和番茄)、蚕豆、豌豆、苜蓿、灌木植物(例如咖啡、可可、茶)、柳属、树(例如
油椰、椰子)、多年生草本(例如黑麦草和羊茅草)以及饲料作物(例如苜蓿和三叶草)，以
及来自例如云杉、松树或冷杉。更优选可从酿酒酵母、大肠杆菌或植物中分离的上述序列的
同源物，优选欧洲油菜、大豆或稻。
[0136] 优选通过重组DNA技术制备本发明的胁迫相关蛋白质。例如，将编码蛋白质的核酸分子克隆进表达载体(例如二元载体)，将表达载体引入宿主细胞(例如拟南芥野生型
NASC N906或任何下文实施方案中所述其他植物细胞)，在所述宿主细胞中表达胁迫相关蛋
白质在。二元载体例如pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreen
或pPZP(Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994和Hellens等，Trends
in Plant Science(2000)5，446-451.)。
NASC N906或任何下文实施方案中所述其他植物细胞)，在所述宿主细胞中表达胁迫相关蛋
白质在。二元载体例如pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreen
或pPZP(Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994和Hellens等，Trends
in Plant Science(2000)5，446-451.)。
[0137] 有利地，将本发明的核酸序列或基因构建体与至少一个报告基因一同克隆进表达盒中，所述表达盒通过载体或直接整合入基因组引入生物中。该报告基因应该容易通过生
长、荧光、化学、生物发光或抗性实验或通过光度测量法来检测。可能提到的报告基因的实
例为抗生素或除草剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代
谢基因或生物合成基因，例如Ura3基因、liv2基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、
gfp基因、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖苷酸酶基因、β-内酰胺酶基因、新
霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因或BASTA (＝草丁膦抗性)基因。这些基因
易于测量和量化其转录活性及其基因的表达。通过这种方法可以鉴定出表现不同生产率的
基因组位置。
长、荧光、化学、生物发光或抗性实验或通过光度测量法来检测。可能提到的报告基因的实
例为抗生素或除草剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代
谢基因或生物合成基因，例如Ura3基因、liv2基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、
gfp基因、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖苷酸酶基因、β-内酰胺酶基因、新
霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因或BASTA (＝草丁膦抗性)基因。这些基因
易于测量和量化其转录活性及其基因的表达。通过这种方法可以鉴定出表现不同生产率的
基因组位置。
[0138] 在优选的实施方案中，核酸构建体(例如表达盒)含有上游(即编码序列的5’端)启动子、下游(即3’端)多腺苷酸化信号以及任选的其他与具有序列图1a、1b或1c核酸的
插入编码序列有效连接的调节元件。通过有效的连接指启动子、编码序列、终止子和任选的
其他调节元件以使各个调节元件在编码序列的表达中按照应有的方式发挥其功能的方式
依次排列。用于有效连接的优选序列为确保在质体中亚细胞定位的靶向序列。然而，也可以
使用确保在线粒体、内质网(＝ER)、核、脂质小体、或其他区室中亚细胞定位的靶向序列，
以及翻译启动子，如烟草花叶病毒中5’前导序列(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，
8693-8711)。
插入编码序列有效连接的调节元件。通过有效的连接指启动子、编码序列、终止子和任选的
其他调节元件以使各个调节元件在编码序列的表达中按照应有的方式发挥其功能的方式
依次排列。用于有效连接的优选序列为确保在质体中亚细胞定位的靶向序列。然而，也可以
使用确保在线粒体、内质网(＝ER)、核、脂质小体、或其他区室中亚细胞定位的靶向序列，
以及翻译启动子，如烟草花叶病毒中5’前导序列(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，
8693-8711)。
[0139] 核酸构建体(例如表达盒)可包含例如组成型启动子或组织特异的启动子(优选USP或油菜籽蛋白启动子)、待表达基因和ER滞留信号。对于ER滞留信号，优选使用
KDEL氨基酸序列(赖氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)或KKX氨基酸序列(赖氨酸-赖氨
酸-X-终止子，其中X是指任一其他已知氨基酸)。
KDEL氨基酸序列(赖氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)或KKX氨基酸序列(赖氨酸-赖氨
酸-X-终止子，其中X是指任一其他已知氨基酸)。
[0140] 为了在原核或真核宿主生物例如微生物(如真菌)或植物中表达，将表达盒有利的插入载体中，例如质粒、噬菌体或其他能够使基因在宿主细胞中得到最佳表达的DNA。
合适的质粒的实例为：大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列(如pBR322)、pUC系列
(如pUC18或pUC19)、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、
113
pUR290、pIN-III -B1、λgt11或pBdCl；链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；
芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌中的pSA77或pAJ667；真菌中的pALS1、
pIL2或pBB116；其他有利的真菌载体描述于Romanos，M.A.等[(1992)″Foreign gene
expression inyeast：a review″，Yeast 8：423-488]和van den Hondel，C.A.M.J.J.等
[(1991)″Heterologous gene expression in filamentous fungi″]，以及《More Gene
Manipulations in Fungi》[J.W.Bennet&L.L.Lasure，编，396-428页，Academic Press：San
Diego]和《Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi》
[van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)in：Applied Molecular Genetics of
Fungi，Peberdy，J.F.等编辑，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]。有利
的酵母启动子实例为2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子实例为
pLGV23、pGHlac±1、pBIN19、pAK2004、pVkH或pDH51(参阅Schmidt，R.和Willmitzer，L.，
1988)。上述鉴定的载体以及上述鉴定载体的衍生物只是可选载体的一小部分。其他质粒
为本领域技术人员所熟知并可用于《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等编辑，Elsevier，
Amsterdam-NewYork-Oxford，1985ISBN 10444904018)一书。合适的植物载体还在《Methods
in Plant Molecular Biology and Biotechnology》(CRC Press)，Ch.6/7，71-119页中有
所描述。认为在大肠杆菌和农杆菌中复制的穿梭载体或二元载体是有利的载体。
合适的质粒的实例为：大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列(如pBR322)、pUC系列
(如pUC18或pUC19)、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、
113
pUR290、pIN-III -B1、λgt11或pBdCl；链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；
芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌中的pSA77或pAJ667；真菌中的pALS1、
pIL2或pBB116；其他有利的真菌载体描述于Romanos，M.A.等[(1992)″Foreign gene
expression inyeast：a review″，Yeast 8：423-488]和van den Hondel，C.A.M.J.J.等
[(1991)″Heterologous gene expression in filamentous fungi″]，以及《More Gene
Manipulations in Fungi》[J.W.Bennet&L.L.Lasure，编，396-428页，Academic Press：San
Diego]和《Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi》
[van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)in：Applied Molecular Genetics of
Fungi，Peberdy，J.F.等编辑，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]。有利
的酵母启动子实例为2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子实例为
pLGV23、pGHlac±1、pBIN19、pAK2004、pVkH或pDH51(参阅Schmidt，R.和Willmitzer，L.，
1988)。上述鉴定的载体以及上述鉴定载体的衍生物只是可选载体的一小部分。其他质粒
为本领域技术人员所熟知并可用于《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等编辑，Elsevier，
Amsterdam-NewYork-Oxford，1985ISBN 10444904018)一书。合适的植物载体还在《Methods
in Plant Molecular Biology and Biotechnology》(CRC Press)，Ch.6/7，71-119页中有
所描述。认为在大肠杆菌和农杆菌中复制的穿梭载体或二元载体是有利的载体。
[0141] 载体是指除质粒以外本领域技术人员所知的所有其他载体，例如噬菌体、病毒(如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒)、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线性或环状DNA。
这些载体可在宿主生物中自主复制或随染色体复制，优选随染色体复制。
这些载体可在宿主生物中自主复制或随染色体复制，优选随染色体复制。
[0142] 在本载体的另一实施方案中，本发明的表达盒也可有利的以线性DNA的形式引入生物并通过异源或同源重组的方式整合进宿主生物基因组。该线性DNA可以由线性化的质
粒组成，或只由作为载体的表达盒或本发明的核酸序列组成。
粒组成，或只由作为载体的表达盒或本发明的核酸序列组成。
[0143] 在另一有利的实施方案中，本发明的核酸序列被可独立地引入生物。
[0144] 如果要将除了本发明核酸序列外的其他基因引入生物，不管是所有的基因连同报告基因处于一个载体还是各基因单独与报告基因处于一个载体，都可以引入生物，由此不
同的载体可以同时或先后引入。
同的载体可以同时或先后引入。
[0145] 载体有利的包含本发明的核酸序列的至少一个拷贝和/或本发明的表达盒(＝基因构建体)。
[0146] 本发明还提供含有如上所述SRP核酸的分离的重组表达载体，其中载体在宿主细胞中的表达引起与野生型品种宿主细胞相比对环境胁迫提高的耐性。本文使用的术语“载
体”是指能够转运其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，是指可以
连接附加DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片
段可以被连接进病毒基因组。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有
细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(如非附加型哺乳动物载
体)在被引入宿主细胞后即被整合在宿主细胞基因组中，并因此随着宿主基因组一起被复
制。此外，某些载体可以指导与其有效连接的基因的表达。本文中“表达载体”即指这些载
体。通常，在DNA重组技术中使用的表达载体常为质粒形式。由于质粒是最常用的载体形
式，本说明书中“质粒”和“载体”可相互交换使用。然而，本发明意图包括提供相同功能的
其他形式的表达载体，例如病毒载体(如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
体”是指能够转运其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，是指可以
连接附加DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片
段可以被连接进病毒基因组。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有
细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(如非附加型哺乳动物载
体)在被引入宿主细胞后即被整合在宿主细胞基因组中，并因此随着宿主基因组一起被复
制。此外，某些载体可以指导与其有效连接的基因的表达。本文中“表达载体”即指这些载
体。通常，在DNA重组技术中使用的表达载体常为质粒形式。由于质粒是最常用的载体形
式，本说明书中“质粒”和“载体”可相互交换使用。然而，本发明意图包括提供相同功能的
其他形式的表达载体，例如病毒载体(如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0147] 本发明的重组表达载体以适合在宿主细胞中表达本发明核酸的形式含有本发明核酸，这意味着重组表达载体包含一个或多个与待表达的核酸序列有效连接的调节序列，
调节序列的选择基于用于表达的宿主细胞。就重组表达载体而言，本文使用的“有效连
接”旨在表示目的核苷酸序列以允许核苷酸序列(例如在体外转录/翻译体系或当载体
引入宿主细胞时在宿主细胞中)表达的方式与调节序列连接。术语“调节序列”旨在包
括启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调节序列在例如
Goeddel，《Gene Expression Technology：Methods inEnzymology185》，Academic Press，
San Diego，CA(1990)及Gruber和Crosby，《Methods in Plant Molecular Biology and
Biotechnology》，Glick和Thompson编，第7章，89-108，CRC Press：Boca Raton，Florida，
包括 其参考文献中有所描述。调节序列包括指导核苷酸序列在多种类型宿主细胞中组成
型表达的序列，以及只在某些宿主细胞中或某些条件下指导核苷酸序列表达的序列。本领
域技术人员会理解，表达载体的设计基于这些因素，如待转化宿主细胞的选择、需要的多肽
表达水平等。本发明的表达载体可被引入宿主细胞从而产生由本文所述核酸编码的多肽或
肽，包括融合多肽或肽(例如SRP、SRP的突变体形式、融合多肽等)。
调节序列的选择基于用于表达的宿主细胞。就重组表达载体而言，本文使用的“有效连
接”旨在表示目的核苷酸序列以允许核苷酸序列(例如在体外转录/翻译体系或当载体
引入宿主细胞时在宿主细胞中)表达的方式与调节序列连接。术语“调节序列”旨在包
括启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调节序列在例如
Goeddel，《Gene Expression Technology：Methods inEnzymology185》，Academic Press，
San Diego，CA(1990)及Gruber和Crosby，《Methods in Plant Molecular Biology and
Biotechnology》，Glick和Thompson编，第7章，89-108，CRC Press：Boca Raton，Florida，
包括 其参考文献中有所描述。调节序列包括指导核苷酸序列在多种类型宿主细胞中组成
型表达的序列，以及只在某些宿主细胞中或某些条件下指导核苷酸序列表达的序列。本领
域技术人员会理解，表达载体的设计基于这些因素，如待转化宿主细胞的选择、需要的多肽
表达水平等。本发明的表达载体可被引入宿主细胞从而产生由本文所述核酸编码的多肽或
肽，包括融合多肽或肽(例如SRP、SRP的突变体形式、融合多肽等)。
[0148] 可设计本发明的重组表达载体以在原核或真核细胞中表达SRPs。例如，SRP基因可在细菌细胞(如谷氨酸棒杆菌，C.glutamicum)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载
体)、酵母和其他真菌细胞(见Romanos，M.A.等，1992，Foreign gene expression in
yeast：a review，Yeast 8：423-488；vanden Hondel，C.A.M.J.J. 等，1991；《More Gene
Manipulations in Fungi》，J.W.Bennet&L.L.Lasure，编，396-428页Heterologous gene
expression infilamentous fungi：Academic Press：San Diego；和 van den Hondel，
C.A.M.J.J.&Punt，P.J.，1991，《Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy》，
J.F.等编1-28页“Gene transfer systems and vector development forfilamentous
fungi”，Cambridge University Press：Cambridge)，藻类(Falciatore等，1999，Marine
Biotechnology 1(3)：239-251)中的全毛亚纲(Holotrichia)，缘毛亚纲(Peritrichia)，
旋 毛 亚纲 (Spirotrichia)，吸 管 亚纲 (Suctoria)，四 膜 虫属(Tetrahymena)，草
履 虫 (Paramecium)， 豆 形 虫 (Colpidium)，Glaucoma、Platyophrya、Potomacus、
Pseudocohnilembus、Euplotes、Engelmaniella和Stylonychia种类的纤毛虫，尤其是按照
PCTApplication No.WO98/01572中所述转化方法的具有载体的Stylonychialemnae属，多
细胞植物细胞(见Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988，Highefficiency Agrobacterium
tumefaciens-mediated transtormation ofArabidopsis thaliana leaf and cotyledon
explants，Plant Cell Rep.583-586；《Plant Molecular Biology and Biotechnology》，
C Press，Boca Raton，Florida，6/7 章，S.71-119(1993)；F.F. White，B.Jenes 等，
《TransgenicPlants》，第1卷，“Engineering and Utilization”，Kung和R.Wu编，128-43
的“Techniques for Gene Transfer”，Academic Press：1993；Potrykus，1991，Annu.Rev.
Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42：205-225及其引用的参考文献)或哺乳动物细胞中
表达。合适的宿主细胞在Goeddel，《Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology
185》，Academic Press：San Diego，CA(1990)中有进一步的讨论。另外，重组表达载体可以
体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
体)、酵母和其他真菌细胞(见Romanos，M.A.等，1992，Foreign gene expression in
yeast：a review，Yeast 8：423-488；vanden Hondel，C.A.M.J.J. 等，1991；《More Gene
Manipulations in Fungi》，J.W.Bennet&L.L.Lasure，编，396-428页Heterologous gene
expression infilamentous fungi：Academic Press：San Diego；和 van den Hondel，
C.A.M.J.J.&Punt，P.J.，1991，《Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy》，
J.F.等编1-28页“Gene transfer systems and vector development forfilamentous
fungi”，Cambridge University Press：Cambridge)，藻类(Falciatore等，1999，Marine
Biotechnology 1(3)：239-251)中的全毛亚纲(Holotrichia)，缘毛亚纲(Peritrichia)，
旋 毛 亚纲 (Spirotrichia)，吸 管 亚纲 (Suctoria)，四 膜 虫属(Tetrahymena)，草
履 虫 (Paramecium)， 豆 形 虫 (Colpidium)，Glaucoma、Platyophrya、Potomacus、
Pseudocohnilembus、Euplotes、Engelmaniella和Stylonychia种类的纤毛虫，尤其是按照
PCTApplication No.WO98/01572中所述转化方法的具有载体的Stylonychialemnae属，多
细胞植物细胞(见Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988，Highefficiency Agrobacterium
tumefaciens-mediated transtormation ofArabidopsis thaliana leaf and cotyledon
explants，Plant Cell Rep.583-586；《Plant Molecular Biology and Biotechnology》，
C Press，Boca Raton，Florida，6/7 章，S.71-119(1993)；F.F. White，B.Jenes 等，
《TransgenicPlants》，第1卷，“Engineering and Utilization”，Kung和R.Wu编，128-43
的“Techniques for Gene Transfer”，Academic Press：1993；Potrykus，1991，Annu.Rev.
Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42：205-225及其引用的参考文献)或哺乳动物细胞中
表达。合适的宿主细胞在Goeddel，《Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology
185》，Academic Press：San Diego，CA(1990)中有进一步的讨论。另外，重组表达载体可以
体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
[0149] 通常用包含指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体进行原核生物中的多肽表达。融合载体给其编码的多肽增加若干氨基酸，通常加在重组体多肽的
氨基端，但也有加在C端或融合在多肽的适当区域。这些融合载体一般服务于三个目的：1)
提高重组多肽的表达；2)提高重组多肽的溶解性；以及3)作为亲和纯化的配体来协助重组
多肽的纯化。在融合表达载体中，常在融合部分与重组多肽的连接处引入蛋白酶剪切位点，
以使在纯化融合多肽后能够将融合部分与重组多肽分离。这些酶以及它们的同源识别序列
包括凝血因子Xa、凝血酶和肠激酶。
氨基端，但也有加在C端或融合在多肽的适当区域。这些融合载体一般服务于三个目的：1)
提高重组多肽的表达；2)提高重组多肽的溶解性；以及3)作为亲和纯化的配体来协助重组
多肽的纯化。在融合表达载体中，常在融合部分与重组多肽的连接处引入蛋白酶剪切位点，
以使在纯化融合多肽后能够将融合部分与重组多肽分离。这些酶以及它们的同源识别序列
包括凝血因子Xa、凝血酶和肠激酶。
[0150] 例如植物表达盒可置于pRT转化载体((a)Toepfer等，1993，MethodsEnzymol.，217：66-78；(b)Toepfer等.1987，Nucl.Acids.Res.15：5890 ff.)
[0151] 另外，重组载体(＝表达载体)还可以在体外转录和翻译，例如通过使用T7启动子和T7RNA聚合酶。
[0152] 原核生物中使用的表达载体常使用带有或不带有融合蛋白质或融合寡肽的可诱导系统，其中这些融合物可以相继发生在N末端和C末端或蛋白质的其他有用的结构域。这
样的融合载体通常具有如下目的：i.)提高RNA表达率；ii.)提高可获得的蛋白质合成率；
iii.)提高蛋白质的溶解性；iv.)或通过可用于亲和层析的结合序列来简化纯化。也常常
通过融合蛋白质引入蛋白酶剪切位点，其使得可以切除融合蛋白的部分并纯化。这些蛋白
酶的识别序列被例如凝血因子Xa、凝血酶和肠激酶所识别。
样的融合载体通常具有如下目的：i.)提高RNA表达率；ii.)提高可获得的蛋白质合成率；
iii.)提高蛋白质的溶解性；iv.)或通过可用于亲和层析的结合序列来简化纯化。也常常
通过融合蛋白质引入蛋白酶剪切位点，其使得可以切除融合蛋白的部分并纯化。这些蛋白
酶的识别序列被例如凝血因子Xa、凝血酶和肠激酶所识别。
[0153] 典型的有利的融合和表达载体是pGEX[Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40]、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和含有
谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白质和A蛋白的pRIT5(Pharmacia，Piscataway，
NJ)。
谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白质和A蛋白的pRIT5(Pharmacia，Piscataway，
NJ)。
[0154] 在一个实施方案中，SRP的编码序列被克隆进pGEX表达载体以产生编码融合多肽的载体，所述多肽从N端到C端包含GST-凝血酶裂解位点-X多肽。可通过使用谷胱甘肽
琼脂糖树脂的亲和层析纯化融合蛋白。可以通过凝血酶裂解融合多肽来回收未融合GST的
重组PKSRP。
琼脂糖树脂的亲和层析纯化融合蛋白。可以通过凝血酶裂解融合多肽来回收未融合GST的
重组PKSRP。
[0155] 大肠杆菌表达载体的其他实例为pTrc[Amann等，(1988)Gene 69：301-315]和pET载体[Studier等，《Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185》，Academic
Press，San Diego，California(1990)60-89；Stratagene，Amsterdam，The Netherlands]。
Press，San Diego，California(1990)60-89；Stratagene，Amsterdam，The Netherlands]。
[0156] 从载体pTrc表达靶基因依赖于杂合的trp-lac融合启动子起始的宿主RNA聚合酶转录。从pET11d载体表达靶基因依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的
T7gn10-lac融合启动子起始的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)
在lacUV5启动子转录控制下从携带有T7gn1基因的定居λ原噬菌体提供。
T7gn10-lac融合启动子起始的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)
在lacUV5启动子转录控制下从携带有T7gn1基因的定居λ原噬菌体提供。
[0157] 一种最大化重组多肽表达的策略是在蛋白酶切重组多肽的能力受损的宿主细菌中表达多肽(Gottesman，S.，《Gene Expression Technology：Methods in Enzymology
185》，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一个策略是改变待插
入表达载体的核酸序列，使得每个氨基酸的个体密码子是在选定用于表达的细菌(例如谷
氨酸棒杆菌)中优先利用的那些(Wada等，1992，Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本
发明核酸序列的这些改变可以通过标准DNA合成技术实施。
185》，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一个策略是改变待插
入表达载体的核酸序列，使得每个氨基酸的个体密码子是在选定用于表达的细菌(例如谷
氨酸棒杆菌)中优先利用的那些(Wada等，1992，Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本
发明核酸序列的这些改变可以通过标准DNA合成技术实施。
[0158] 其他酵母中使用的有利的载体是pYepSec1(Baldari，等，(1987)EmboJ.6：229-234)、pMFa(Kurjan和 Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz 等，
(1987)Gene 54：113-123)以及pYES的衍生物(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
丝状真菌中使用的载体描述于van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)《Applied
Molecular Genetics of Fungi》，J.F.Peberdy，等编，1-28页″Gene transfer systems
andvector development for filamentous fungi ″，Cambridge University Press：
Cambridge。
(1987)Gene 54：113-123)以及pYES的衍生物(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
丝状真菌中使用的载体描述于van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)《Applied
Molecular Genetics of Fungi》，J.F.Peberdy，等编，1-28页″Gene transfer systems
andvector development for filamentous fungi ″，Cambridge University Press：
Cambridge。
[0159] 另外，昆虫细胞表达载体也可以有利地用于如在Sf9细胞中表达。这些载体是例如pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和
Summers(1989)Virology 170：31-39)的载体。
Summers(1989)Virology 170：31-39)的载体。
[0160] 另外，植物细胞和藻类细胞可有利地用于基因表达。植物表达载体的实例可见 于 Becker，D. 等(1992) ″ New plant binary vectors with selectablemarkers
located proximal to the left border″，Plant Mol.Biol.20：1195-1197或Bevan，
M.W.(1984)″Binary Agrobacterium vectors for planttransformation″，Nucl.Acid.
Res.12：8711-8721。
located proximal to the left border″，Plant Mol.Biol.20：1195-1197或Bevan，
M.W.(1984)″Binary Agrobacterium vectors for planttransformation″，Nucl.Acid.
Res.12：8711-8721。
[0161] 另外，核酸序列也可在哺乳动物细胞中(有利地在非人类哺乳动物细胞中)表达。相应表达载体的实例是Seed，B.(1987)Nature 329：840或Kaufman等(1987)EMBO J.6：
187-195中提到的pCDM8和pMT2PC。同时，优选使用的启动子为病毒来源的，例如作为实
例的多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒或猿猴病毒40的启动子。其他原核和真核表达系统参考
Sambrook等，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，第二版，ColdSpring Harbor
Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989的16
和17章。
187-195中提到的pCDM8和pMT2PC。同时，优选使用的启动子为病毒来源的，例如作为实
例的多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒或猿猴病毒40的启动子。其他原核和真核表达系统参考
Sambrook等，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，第二版，ColdSpring Harbor
Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989的16
和17章。
[0162] 在本发明优选的实施方案中，SRPs在植物和植物细胞中表达，例如单细胞植物细胞(如藻类)(见Falciatore等，1999，Marine Biotechnology1(3)：239-251及其参考文
献)以及来自高等植物的植物细胞(例如种子植物，如作物植物)。可以通过任任手段将
SRP“引入”植物细胞，包括转染、转化或转导，电穿孔法、粒子轰击、农杆菌感染等。一种本
领域技术人员已知的转化方法是将正在开花的植物浸入含有SRP核酸的农杆菌的溶液中，
然后培育转化的配子。
献)以及来自高等植物的植物细胞(例如种子植物，如作物植物)。可以通过任任手段将
SRP“引入”植物细胞，包括转染、转化或转导，电穿孔法、粒子轰击、农杆菌感染等。一种本
领域技术人员已知的转化方法是将正在开花的植物浸入含有SRP核酸的农杆菌的溶液中，
然后培育转化的配子。
[0163] 其他用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法可见于Sambrook等，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，
Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989，以及其他实验室手
册，例如《Methods inMolecular Biology》，1995，第44卷，《Agrobacterium protocols》，
Garland和Davey编，Humana Press，Totowa，New Jersey。因为生物和非生物胁迫耐性
是希望能够在广泛植物种类，如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、
油菜籽和芸苔、木薯、胡椒、向日葵和万寿菊、茄科植物(如马铃薯、烟草、茄子和番茄)、蚕
豆、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属、树(油椰、椰子)、多年生草本和饲料作
物中遗传的普遍性状，这些作物植物也是作为本发明另一实施方案的基因工程优选的靶植
物。饲料作物包括(但不限于)Wheatgrass，Canarygrass，Bromegrass，Wildrye Grass，
Bluegrass，Orchardgrass，Alfalfa，Salfoin，Birdsfoot Trefoil，Alsike Clover，Red
Clover，和SweetClover。
Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989，以及其他实验室手
册，例如《Methods inMolecular Biology》，1995，第44卷，《Agrobacterium protocols》，
Garland和Davey编，Humana Press，Totowa，New Jersey。因为生物和非生物胁迫耐性
是希望能够在广泛植物种类，如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、
油菜籽和芸苔、木薯、胡椒、向日葵和万寿菊、茄科植物(如马铃薯、烟草、茄子和番茄)、蚕
豆、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属、树(油椰、椰子)、多年生草本和饲料作
物中遗传的普遍性状，这些作物植物也是作为本发明另一实施方案的基因工程优选的靶植
物。饲料作物包括(但不限于)Wheatgrass，Canarygrass，Bromegrass，Wildrye Grass，
Bluegrass，Orchardgrass，Alfalfa，Salfoin，Birdsfoot Trefoil，Alsike Clover，Red
Clover，和SweetClover。
[0164] 在本发明的一个实施方案中，通过农杆菌介导的基因转移来完成SRP进入植物的转染。农杆菌介导的植物转化可使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.
Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
菌株来完成。转化可通过标准转化和再生技术来实施(Deblaere等，1994，Nucl.Acids
Res.13：4777-4788；Gelvin，Stanton B. 和 Schilperoort，Robert A，《PlantMolecular
Biology Manual》，第二版-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-in Sect.，
Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-PISBN0-7923-2731-4；Glick，BernardR.；
Thompson，John E.，《Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology》，Boca
Raton：CRC Press，1993360S.，ISBN0-8493-5164-2)。例如，油菜籽可通过子叶或胚轴转
化来转化(Moloney等，1989，Plant cell Report 8：238-242；De Block等，1989，Plant
Physiol.91：694-701)。农杆菌和植物选择中使用的抗生素取 决于转化中使用的二元载
体和农杆菌菌株。油菜籽的选择通常使用卡那霉素作为植物选择标记来进行。农杆菌介导
的亚麻中的基因转移可使用例如Miynarova等，1994，Plant Cell Report 13：282-285所
述的技术实施。另外，大豆的转化可使用例如European Patent No.0424047，U.S.Patent
No.5,322,783，European Patent No.0397687，U.S.Patent No.5,376,543，或U.S.Patent
No.5,169,770中所述的技术实施。玉米转化可通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或
通过金刚砂纤维技术完成(见例如Freeing和Walbot《The maize handbook》，Springer
Verlag：New York(1993)ISBN3-540-97826-7)。玉米转化的具体实例可见于U.S.Patent
No.5,990,387，小麦转化的具体实例可见于PCT Application No.WO93/07256。
Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
菌株来完成。转化可通过标准转化和再生技术来实施(Deblaere等，1994，Nucl.Acids
Res.13：4777-4788；Gelvin，Stanton B. 和 Schilperoort，Robert A，《PlantMolecular
Biology Manual》，第二版-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-in Sect.，
Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-PISBN0-7923-2731-4；Glick，BernardR.；
Thompson，John E.，《Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology》，Boca
Raton：CRC Press，1993360S.，ISBN0-8493-5164-2)。例如，油菜籽可通过子叶或胚轴转
化来转化(Moloney等，1989，Plant cell Report 8：238-242；De Block等，1989，Plant
Physiol.91：694-701)。农杆菌和植物选择中使用的抗生素取 决于转化中使用的二元载
体和农杆菌菌株。油菜籽的选择通常使用卡那霉素作为植物选择标记来进行。农杆菌介导
的亚麻中的基因转移可使用例如Miynarova等，1994，Plant Cell Report 13：282-285所
述的技术实施。另外，大豆的转化可使用例如European Patent No.0424047，U.S.Patent
No.5,322,783，European Patent No.0397687，U.S.Patent No.5,376,543，或U.S.Patent
No.5,169,770中所述的技术实施。玉米转化可通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或
通过金刚砂纤维技术完成(见例如Freeing和Walbot《The maize handbook》，Springer
Verlag：New York(1993)ISBN3-540-97826-7)。玉米转化的具体实例可见于U.S.Patent
No.5,990,387，小麦转化的具体实例可见于PCT Application No.WO93/07256。
[0165] 根据本发明，如果引入的SRP整合在非染色体的自主复制子上或整合进植物染色体中，则其可在植物细胞中稳定地存在。另外，引入的SRP可存在于染色体外非复制载体
上，并瞬时表达或有瞬时的活性。
上，并瞬时表达或有瞬时的活性。
[0166] 在一个实施方案中，可以构建其中SRP整合进染色体的同源重组微生物，制备包含至少一部分SRP基因的载体，其中已向SRP基因引入了缺失、添加或替换，以改变(如功
能性破坏)SRP基因。SRP基因优选是酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆、或稻SRP基因，但也
可以是相关植物或甚至来自于哺乳动物或昆虫来源的同源物。在一个实施方案中，设计载
体使得同源重组后，内源SRP基因被功能性地破坏(即不再编码功能性多肽；也被称为敲除
载体)。另外，可以设计载体使得同源重组后，内源SRP基因被突变或改变，但仍然编码功能
性多肽(例如可改变上游调节区从而改变内源SRP的表达)。
能性破坏)SRP基因。SRP基因优选是酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆、或稻SRP基因，但也
可以是相关植物或甚至来自于哺乳动物或昆虫来源的同源物。在一个实施方案中，设计载
体使得同源重组后，内源SRP基因被功能性地破坏(即不再编码功能性多肽；也被称为敲除
载体)。另外，可以设计载体使得同源重组后，内源SRP基因被突变或改变，但仍然编码功能
性多肽(例如可改变上游调节区从而改变内源SRP的表达)。
[0167] 为了通过同源重组产生点突变，可在被称为嵌合修复(chimeraplasty)的技 术 (Cole-Strauss 等，1999，Nucleic Acids Research27(5)：1323-1330 和 Kmiec，
1999Gene therapy American Scientist.87(3)：240-247)中使用DNA-RNA杂合体。在
Physcomitrella patens中同源重组的方法也是本领域熟知的，并设想在本发明中使用。
1999Gene therapy American Scientist.87(3)：240-247)中使用DNA-RNA杂合体。在
Physcomitrella patens中同源重组的方法也是本领域熟知的，并设想在本发明中使用。
[0168] 然而在同源重组载体中，SRP基因改变部分的5’和3’侧末端具有SRP基因的额外核酸分子，以允许在微生物或植物中进行载体所带外源SRP基因和内源SRP基因之间的同
源重组。额外的侧翼SRP核酸分子的长度应足以用于与内源基因成功地同源重组。通常，
载体中包含数百至上千碱基对的侧翼DNA(在5’和3’两端)。参阅例如Thomas，K.R.，和
Capecchi，M.R.，1987，Cell 51：503中关于同源重组载体的描述或Strepp等，1998，PNAS，
95(8)：4368-4373中Physcomitrella patens中以cDNA为基础的重组。
源重组。额外的侧翼SRP核酸分子的长度应足以用于与内源基因成功地同源重组。通常，
载体中包含数百至上千碱基对的侧翼DNA(在5’和3’两端)。参阅例如Thomas，K.R.，和
Capecchi，M.R.，1987，Cell 51：503中关于同源重组载体的描述或Strepp等，1998，PNAS，
95(8)：4368-4373中Physcomitrella patens中以cDNA为基础的重组。
[0169] 载体被引入微生物或植物细胞(例如通过聚乙二醇介导的DNA)，并通过本领域已知技术选择引入的PKSRP基因与内源PKSRP基因发生同源重组的细胞。
[0170] 在另一实施方案中，可以产生包含能够可调节地表达引入基因的所选系统的重组微生物。例如，包含位于乳糖操纵子控制下的SRP基因使得只有IPTG存在才表达SRP基因。
这样的调节系统为本领域所熟知。
这样的调节系统为本领域所熟知。
[0171] 无论存在于染色体外非复制载体中或存在于整合进染色体的载体中，SRP多核苷酸都优选位于植物表达盒中。植物表达盒优选包含能够在植物细胞中驱动基因表达的调节
序列，这些序列有效连接，以使各个序列都可以实现各自的功能，例如多腺苷酸化信号引起
转录终止。
序列，这些序列有效连接，以使各个序列都可以实现各自的功能，例如多腺苷酸化信号引起
转录终止。
[0172] 优选的多腺苷酸化信号为源于根瘤农杆菌t-DNA的序列，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合酶的基因3(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)或其功能性等效物，但
是所有其他在植物中有功能活性的终止子也是合适的。由于植物基因表达通常不局限
于转录水平，植物表达盒优选包含其他有效连接的序列，如翻译增强子例如包含来自烟
草花叶病毒的5’非翻译前导序列、提高多肽/RNA比率的超驱动序列(Gallie等，1987，
Nucl.AcidsResearch 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括在Becker，D.等，1992，
New plant binary vectors with selectable markers located proximal to theleft
border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和 Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacterium
vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721，以及《Transgenic
Plants》，第1卷“Engineering and Utilization”，Kung和R.Wu编，Academic Press，1993，
S.15-38页Vectors for GeneTransfer in Higher Plants中详细描述的那些。
是所有其他在植物中有功能活性的终止子也是合适的。由于植物基因表达通常不局限
于转录水平，植物表达盒优选包含其他有效连接的序列，如翻译增强子例如包含来自烟
草花叶病毒的5’非翻译前导序列、提高多肽/RNA比率的超驱动序列(Gallie等，1987，
Nucl.AcidsResearch 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括在Becker，D.等，1992，
New plant binary vectors with selectable markers located proximal to theleft
border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和 Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacterium
vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721，以及《Transgenic
Plants》，第1卷“Engineering and Utilization”，Kung和R.Wu编，Academic Press，1993，
S.15-38页Vectors for GeneTransfer in Higher Plants中详细描述的那些。
[0173] “转化”在本文中定义为将异源DNA引入植物细胞、植物组织或植物中的方法。它可在天然或人工条件下使用本领域熟知的多种方法实施。转化可依赖于将外源核酸序列插
入原核或真核宿主细胞的任何已知方法。基于待转化宿主细胞来选择方法，其可包括(但
不限于)病毒感染、电穿孔法、脂质转染法和粒子轰击。这样“转化的”细胞包括稳定转化了
的细胞，在其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分来复制。它
们还包括在有限的时期瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。转化的植物细胞、植物组织或
植物应理解为不仅包括转化过程的最终产物，而且包括其转基因后代。
入原核或真核宿主细胞的任何已知方法。基于待转化宿主细胞来选择方法，其可包括(但
不限于)病毒感染、电穿孔法、脂质转染法和粒子轰击。这样“转化的”细胞包括稳定转化了
的细胞，在其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分来复制。它
们还包括在有限的时期瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。转化的植物细胞、植物组织或
植物应理解为不仅包括转化过程的最终产物，而且包括其转基因后代。
[0174] 术语“转化的”、“转基因”和“重组的”是指引入了异源核酸分子的宿主生物，如细菌或植物。核酸分子可稳定的整合进宿主基因组或者核酸分子也可作为染色体外分子存
在。这样的染色体外分子可自主复制。转化的细胞、组织或植物应理解为不仅包括转化过
程的最终产物，而且包括其转基因后代。“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主是
指不包含异源核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。
在。这样的染色体外分子可自主复制。转化的细胞、组织或植物应理解为不仅包括转化过
程的最终产物，而且包括其转基因后代。“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主是
指不包含异源核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。
[0175] 本文使用的“转基因植物”指包含插入其核基因组或细胞器基因组的外源核苷酸序列的植物。它还包括后代，即T1-、T2-和后续世代或BC1-、BC2-和后续世代以及它与非
转基因或其他转基因植物的杂种后代。
转基因或其他转基因植物的杂种后代。
[0176] 宿主生物(＝转基因生物)有利的含有至少一个拷贝的本发明核酸和/或本发明的核酸构建体。
[0177] 原则上，所有的植物可用作宿主生物。优选的转基因植物为例如选自槭树 科 (Aceraceae)、漆 树 科 (Anacardiaceae)、Apiaceae、菊 科 (Asteraceae)、芸
苔科(Brassicaceae)、仙 人掌科(Cactaceae)、葫 芦科 (Cucurbitaceae)、大戟 科
(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂
粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、
Arecaceae、凤梨科(Bromeliaceae)、萍草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百
合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆 科(Gentianaceae)、Labiaceae、木 兰
科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄
参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科
(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或Poaceae科的且优选来自
于选自Apiaceae、菊科(Asteraceae)、芸苔科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、
豆科(Fabaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茄科(Solanaceae)、
百合科(Liliaceae)或Poaceae科的植物。作物植物优选有利的选自花生(peanut)、
oilseed rape、芸苔(canola)、向日葵(sunflower)、红花(safflower)、橄榄(olive)、芝
麻(sesame)、榛子(hazelnut)、almond、酪梨(avocado)、bay、pumpkin/squash、亚麻子
(linseed)、大豆(soya)、pistachio、琉璃苣(borage)、玉米(maize)、小麦、黑麦、燕麦、高
梁(sorghum)and millet、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、茄子、苜蓿和多年生草本
及饲料植物、油椰、蔬菜(芸苔、root vegetables，tubervegetables，pod vegetables，
fruiting vegetables，onion vegetables，leafyvegetables and stem vegetables)荞麦
(buckwheat)、Jerusalem artichoke、蚕豆(broad bean)、vetches、扁豆(lentil)、dwarf
bean、羽扇豆(lupin)、三叶草(clover)和苜蓿属的植物，提到的只是其中一部分。
苔科(Brassicaceae)、仙 人掌科(Cactaceae)、葫 芦科 (Cucurbitaceae)、大戟 科
(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂
粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、
Arecaceae、凤梨科(Bromeliaceae)、萍草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百
合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆 科(Gentianaceae)、Labiaceae、木 兰
科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄
参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科
(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或Poaceae科的且优选来自
于选自Apiaceae、菊科(Asteraceae)、芸苔科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、
豆科(Fabaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茄科(Solanaceae)、
百合科(Liliaceae)或Poaceae科的植物。作物植物优选有利的选自花生(peanut)、
oilseed rape、芸苔(canola)、向日葵(sunflower)、红花(safflower)、橄榄(olive)、芝
麻(sesame)、榛子(hazelnut)、almond、酪梨(avocado)、bay、pumpkin/squash、亚麻子
(linseed)、大豆(soya)、pistachio、琉璃苣(borage)、玉米(maize)、小麦、黑麦、燕麦、高
梁(sorghum)and millet、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、茄子、苜蓿和多年生草本
及饲料植物、油椰、蔬菜(芸苔、root vegetables，tubervegetables，pod vegetables，
fruiting vegetables，onion vegetables，leafyvegetables and stem vegetables)荞麦
(buckwheat)、Jerusalem artichoke、蚕豆(broad bean)、vetches、扁豆(lentil)、dwarf
bean、羽扇豆(lupin)、三叶草(clover)和苜蓿属的植物，提到的只是其中一部分。
[0178] 在一个优选的实施方案中，宿主植物选自槭树科(Aceraceae)、漆树科 (Anacardiaceae)、Apiaceae、菊 科 (Asteraceae)、芸 苔 科 (Brassicaceae)、仙
人 掌 科(Cactaceae)、葫 芦 科(Cucurbitaceae)、大 戟 科(Euphorbiaceae)、豆 科
(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、
蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、Arecaceae、凤梨科
(Bromeliaceae)、萍草科(Cyperaceae)、 鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰
科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、Labiaceae、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨
科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、
石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科
(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或Poaceae科并优选来自选自Apiaceae、菊科
(Asteraceae)、芸苔科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Fabaceae)、
罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茄科(Solanaceae)、百合科(Liliaceae)
或Poacea科的植物。优选作物植物，尤其是上文提到的植物作为宿主植物，如上文提
到的科和属，例如优选种类，如腰果(Anacardiumoccidentale)、金盏菊(Calendula
officinalis)、红花(Carthamus tinctorius)、菊苣(Cichorium intybus)、洋蓟(Cynara
scolymus)、向日葵、Tagetes lucida，Tagetes erecta，Tagetes tenuifolia；胡turnip
rape(Daucus carota)、Corylusavellana，Corylus colurna、Borago officinalis；欧
洲油菜、芜青(Brassicarapa ssp.)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica
juncea)、芥菜变种(Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.
crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥菜(Brassica nigra)、
Brassicasinapioides、Melanosinapis communis、甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥、
凤梨(Ananas comosus)、Ananas ananas、Bromelia comosa、番木瓜(Caricapapaya)、
大 麻 (Cannabis sative)、甘 薯(Ipomoea batatus)、甘 薯 属 (Ipomoea)pandurata、
旋 花 属 (Convolvulus)batatas、Convolvulus tiliaceus、Ipomoeafastigiata、
Ipomoea tiliacea、三裂叶薯(Ipomoea triloba)、Convolvuluspanduratus、甜菜(Beta
vulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、Beta vulgarisvar.vulgaris、沿 海 甜 菜
(Beta maritime)、Beta vulgaris var.perennis、Betavulgaris var.conditiva、Beta
vulgaris var.esculenta、笋瓜(Cucurbitamaxima)、灰子南 瓜(Cucurbita mixta)、
西 葫 芦 (Cucurbita pepo)、南 瓜 (Cucurbita moschata)、Olea europaea、Manihot
utilissima、Janiphamanihot、Jatropha manihot.、Manihot aipil、Manihot dulcis、
Manihot manihot、Manihotmelanobasis、Manihotesculenta、蓖 麻(Ricinuscommunis)、
豌豆(Pisum sativum)、Pisum arvense、Pisum humile、紫苜蓿(Medicago sativa)、野
苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(medicagovaria)、大豆(Glycine max Dolichos
soja)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、大豆(Glycine hispida)、Phaseolus max、Soja
hispida、Soja max、椰子(Cocosnucifera)、茶子天竺葵(Pelargonium grossularioides)、
Oleum cocoas、Laurus nobilis、鳄梨(Persea Americana)、落花生(Arachis hypogaea)、
亚麻、Linum humile、奥地利亚麻(Linum austriacum)、苍白胡麻(Linumbienne)、
窄叶亚麻(Linum angustifolium)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linum
flavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinumgrandiflorum、刘易斯亚麻
(Linum lewisii)、那旁亚麻(Linum narbonense)、宿根亚麻(Linum perenne)、Linum
perenne var. lewisii、Linum pratense、Linum trigynum、石榴(Punica granatum)、
陆 地 棉(Gossypium hirsutum)、树 棉(Gossypium arboreum)、海 岛 棉 (Gossypium
barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)、香蕉
(Musanana)、小果野蕉(Musa acuminata)、粉芭蕉(Musa paradisiacal)、Musaspp.、
油棕(Elaeis guineensis)、鬼罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaverrhoeas)、
Papaver dubium、胡麻(Sesamum indicum)、Piper aduncum、Piperamalago、狭叶胡椒
(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betle)、毕澄茄(Piper cubeba)、
长胡椒(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、Piperretrofractum、Artanthe adunca、
Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata、大麦
(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、海滨大麦(Hordeum murinum)、野芒
大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、Hordeumaegiceras、
Hordeum hexastichon.、栽培四棱大麦(Hordeum hexastichum)、Hordeum irregulare、大
麦(Hordeum sativum)、野芒大麦草、燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕
麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、两色蜀黍
(Sorghum bicolor)、石茅高梁 (Sorghum halepense)、甜高梁(Sorghum saccharatum)、
蜀 黍 (Sorghumvulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、
Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡 佛 尔 高 梁 (Sorghumcaffrorum)、
垂穗 高梁 草(Sorghum cernuum)、Sorghum dochna、Sorghumdrummondii、硬高 梁 草
(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghumlanceolatum、多 脉高 梁 草 (Sorghum
nervosum)、甜 高 梁、Sorghumsubglabrescens、Sorghum verticilliflorum、蜀 黍、石
茅 高 梁 (Holcushalepensis)、Sorghum miliaceum millet、Panicum militaceum、玉
蜀黍(Zeamays)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱
小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybemum、玛卡小麦(Triticum macha)、普通小
麦(Triticum sativum)、Cofea spp.、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea
canephora)、大果咖啡(Coffea liberica)、辣椒(Capsicumannuum)、Capsicum annuum
var.glabriusculum、小米辣(Capsicumfrutescens)、辣椒、烟草(Nicotiana tabacum)、马
铃薯(Solanum tuberosum)、茄(Solanum melongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、
Lycopersiconlycopersicum.、Lycopersicon pyriforme、红茄(Solanum integrifolium)、
番茄(Solanum lycopersicum)、可可树(Theobroma cacao)或茶(Camelliasinensis)。
人 掌 科(Cactaceae)、葫 芦 科(Cucurbitaceae)、大 戟 科(Euphorbiaceae)、豆 科
(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、
蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、Arecaceae、凤梨科
(Bromeliaceae)、萍草科(Cyperaceae)、 鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰
科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、Labiaceae、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨
科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、
石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科
(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或Poaceae科并优选来自选自Apiaceae、菊科
(Asteraceae)、芸苔科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Fabaceae)、
罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茄科(Solanaceae)、百合科(Liliaceae)
或Poacea科的植物。优选作物植物，尤其是上文提到的植物作为宿主植物，如上文提
到的科和属，例如优选种类，如腰果(Anacardiumoccidentale)、金盏菊(Calendula
officinalis)、红花(Carthamus tinctorius)、菊苣(Cichorium intybus)、洋蓟(Cynara
scolymus)、向日葵、Tagetes lucida，Tagetes erecta，Tagetes tenuifolia；胡turnip
rape(Daucus carota)、Corylusavellana，Corylus colurna、Borago officinalis；欧
洲油菜、芜青(Brassicarapa ssp.)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica
juncea)、芥菜变种(Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.
crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥菜(Brassica nigra)、
Brassicasinapioides、Melanosinapis communis、甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥、
凤梨(Ananas comosus)、Ananas ananas、Bromelia comosa、番木瓜(Caricapapaya)、
大 麻 (Cannabis sative)、甘 薯(Ipomoea batatus)、甘 薯 属 (Ipomoea)pandurata、
旋 花 属 (Convolvulus)batatas、Convolvulus tiliaceus、Ipomoeafastigiata、
Ipomoea tiliacea、三裂叶薯(Ipomoea triloba)、Convolvuluspanduratus、甜菜(Beta
vulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、Beta vulgarisvar.vulgaris、沿 海 甜 菜
(Beta maritime)、Beta vulgaris var.perennis、Betavulgaris var.conditiva、Beta
vulgaris var.esculenta、笋瓜(Cucurbitamaxima)、灰子南 瓜(Cucurbita mixta)、
西 葫 芦 (Cucurbita pepo)、南 瓜 (Cucurbita moschata)、Olea europaea、Manihot
utilissima、Janiphamanihot、Jatropha manihot.、Manihot aipil、Manihot dulcis、
Manihot manihot、Manihotmelanobasis、Manihotesculenta、蓖 麻(Ricinuscommunis)、
豌豆(Pisum sativum)、Pisum arvense、Pisum humile、紫苜蓿(Medicago sativa)、野
苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(medicagovaria)、大豆(Glycine max Dolichos
soja)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、大豆(Glycine hispida)、Phaseolus max、Soja
hispida、Soja max、椰子(Cocosnucifera)、茶子天竺葵(Pelargonium grossularioides)、
Oleum cocoas、Laurus nobilis、鳄梨(Persea Americana)、落花生(Arachis hypogaea)、
亚麻、Linum humile、奥地利亚麻(Linum austriacum)、苍白胡麻(Linumbienne)、
窄叶亚麻(Linum angustifolium)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linum
flavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinumgrandiflorum、刘易斯亚麻
(Linum lewisii)、那旁亚麻(Linum narbonense)、宿根亚麻(Linum perenne)、Linum
perenne var. lewisii、Linum pratense、Linum trigynum、石榴(Punica granatum)、
陆 地 棉(Gossypium hirsutum)、树 棉(Gossypium arboreum)、海 岛 棉 (Gossypium
barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)、香蕉
(Musanana)、小果野蕉(Musa acuminata)、粉芭蕉(Musa paradisiacal)、Musaspp.、
油棕(Elaeis guineensis)、鬼罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaverrhoeas)、
Papaver dubium、胡麻(Sesamum indicum)、Piper aduncum、Piperamalago、狭叶胡椒
(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betle)、毕澄茄(Piper cubeba)、
长胡椒(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、Piperretrofractum、Artanthe adunca、
Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata、大麦
(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、海滨大麦(Hordeum murinum)、野芒
大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、Hordeumaegiceras、
Hordeum hexastichon.、栽培四棱大麦(Hordeum hexastichum)、Hordeum irregulare、大
麦(Hordeum sativum)、野芒大麦草、燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕
麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、两色蜀黍
(Sorghum bicolor)、石茅高梁 (Sorghum halepense)、甜高梁(Sorghum saccharatum)、
蜀 黍 (Sorghumvulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、
Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡 佛 尔 高 梁 (Sorghumcaffrorum)、
垂穗 高梁 草(Sorghum cernuum)、Sorghum dochna、Sorghumdrummondii、硬高 梁 草
(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghumlanceolatum、多 脉高 梁 草 (Sorghum
nervosum)、甜 高 梁、Sorghumsubglabrescens、Sorghum verticilliflorum、蜀 黍、石
茅 高 梁 (Holcushalepensis)、Sorghum miliaceum millet、Panicum militaceum、玉
蜀黍(Zeamays)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱
小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybemum、玛卡小麦(Triticum macha)、普通小
麦(Triticum sativum)、Cofea spp.、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea
canephora)、大果咖啡(Coffea liberica)、辣椒(Capsicumannuum)、Capsicum annuum
var.glabriusculum、小米辣(Capsicumfrutescens)、辣椒、烟草(Nicotiana tabacum)、马
铃薯(Solanum tuberosum)、茄(Solanum melongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、
Lycopersiconlycopersicum.、Lycopersicon pyriforme、红茄(Solanum integrifolium)、
番茄(Solanum lycopersicum)、可可树(Theobroma cacao)或茶(Camelliasinensis)。
[0179] 漆树科(Anacardiaceae)例如Pistacia、芒果属(Mangifera)、如腰果 属(Anacardium) 例 如 Pistacia vera[pistachios、Pistazie]、Mangifer indica[Mango]
或Anacardium occidentale[Cashew]；菊科(Asteraceae)例如金盏花属(Calendula)、
Carthamus、Centaure、菊苣属(Cichorium)、Cynara、向日葵属、莴苣属(Lactuca)、
Locusta、万寿 菊属(Tagetes)、Valeriana例 如Calendula officinalis[Marigold]、
Carthamus tinctorius[safflower]、Centaureacyanus[cornflower]、Cichorium
intybus[blue daisy]、Cynarascolymus[Artichoke]、向日葵、Lactuca sativa、Lactuca
crispa、Lactucaesculenta、Lactuca scariolaL.ssp.saliva、Lactucascariola L.var.
integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、Lacfuca sativa subsp.ronana、
Locusta communis、Valeriana locusta[lettuce]、Tageteslucida、Tagetes erecta 或
Tagetes tenuifolia[Marigold]；Apiaceae例如Daucus如Daucuscarota[carrot]；桦木
科(Betulaceae)例如榛属(Corylus)如Corylusavellana或Coryluscolurna[hazelnut]；
紫 草 科 (Boraginaceae) 例 如 Borago 如 Boragoofficinalis[borage]；芸 苔 科
(Brassicaceae)例如芸苔(Brassica)、Melanosinapis、Sinapis、拟南芥(Arabadopsis)
如欧洲油菜、芜青[canola、oilseed rape、turnip rape]、Sinapisarvensis Brassica
juncea、Brassicajunceavar.juncea、Brassicajuncea var.crispifolia，Brassica juncea
var.foliosa、黑 芥 菜、Brassica sinapioides、Melanosinapis communis[mustard]、
甘 蓝[fodder beet]或 拟南 芥；凤 梨 科(Bromeliaceae)例 如Anana、Bromelia如
Anana comosus、Ananas ananas 或 Bromelia comosa[pineapple]；Caricaceae 例 如
Carica如番木瓜；大麻科(Cannabaceae)(例如大麻属，如大麻)Convolvulaceae例如
Ipomea、Convolvulus 如 Ipomoea battus、Ipomoea pandurata、Convolvulusbatatas、
Convolvulustiliaceus、Ipomoeafastigiata、Ipomoea tiliacea、三裂叶薯或Convolvulus
panduratus[sweetpotato、Man of the Earth、wild potato]、藜科(Chenopodiaceae)
例如甜菜属，即甜菜(Beta vulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、Beta vulgaris
var.Vulgaris、Betamaritima、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.
conditiva 或Beta vulgaris var.esculenta[sugar beet]；葫 芦科(Cucurbitaceae)
例如南瓜属，如笋瓜、灰子南瓜、西葫芦或南瓜；胡颓子科(Elaeagnaceae)例如胡颓子属
(Elaeagnus)如Olea europaea[橄榄]；杜鹃花科(Ericaceae)例如山月桂属(Kalmia)
如 Kalmialatifolia、Kalmia angustifolia、Kalmia microphylla、Kalmia politolia、
Kalmiaoccidentalis、Cistus chamaerhodendros 或 Kalmia lucida[Americanlaurel、
broad-leafed laurel、calico bush、spoon wood、sheep laurel、alpinelaurel、bog
laurel、western bog-laurel、swamp-laurel]；大戟科(Euphorbiaceae)例如木薯属
(Manihot)、Janipha、麻风树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)如Manihot utilissima、
Janipha manihot、Jatropha manihot.、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot
manihot、Manihotmelanobasis、Manihot esculenta [manihot、arrowroot、tapioca、
cassava]或蓖麻[castor bean、Castor Oil Bush、Castor Oil Plant、Palma Christi、
Wonder Tree]；Fabaceae 例 如 豌 豆 属 (Pisum)、Albizia、Cathormion、Feuillea、
Inga、Pithecolobium、金合欢属(Acacia)、害羞草属(Mimosa)、Medicajo、大豆属
(Glycine)、镰扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja如豌豆、Pisum arvense、
Pisum humile[pea]、Albizia berteriana、Albiziajulibrissin、Albizia lebbeck、
Acacia berteriana、Acacialittralis、Albiziaberteriana、Albizzia berteriana、
Cathormion befteriana、Feuilleaberteriana、lnga fragrans、Pithecellobium
berterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecellobium berterianum、Pseudalbizzia
berteriana、Acaciajulibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、
Mimosajulibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acacia lebbeck、
Acacia macrophylla、Albizialebbek、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa
speciosa[bastard logwood、silk tree、East Indian Walnut]、紫苜蓿、野苜蓿、杂交
苜 蓿、Glycine max Dolichos soja、Glycinegracilis、Glycinehispida、Phaseolus
max、Soja hispida或Soja max[soybean]；牻牛儿苗科(Geraniaceae)，例如天竺葵
属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum如椰子、茶子天竺葵或Oleum cocois[椰
子]；禾本科(Gramineae)例如甘蔗属(Saccharum)如甘蔗(Saccharum officinarum)；
胡桃科(Juglandaceae)例如胡桃属(Juglans)、Wallia如胡桃(Juglans regia)、台
湾胡桃(Juglansailanthifolia)、山核桃(Juglans sieboldiana)、灰核桃(Juglans
cinerea)、Walliacinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃 (Juglans califonica)、印
度 黑 核 桃 (Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大 核
桃(Juglansmajor)、小 果黑核(Juglans microcarpa)、黑核桃 (Juglans nigra)或
Wallianigra[walnut、black walnut、common walnut、persian walnut、whitewalnut、
butternut、black walnut]；樟科(Lauraceae)例如鳄梨属(Persea)、月桂(Laurus)如月
桂(Laurus nobilis)[bay、laurel、bay laurel、sweetbay]、 鳄梨(Persea Americana)、
鳄梨、食物鳄梨(Persea gratissima)或Perseapersea[鳄梨]；豆科(Leguminosae)
例如落花生属(Arachis)如落花生[花生]；亚麻科(Linaceae)例如亚麻属(Linum)、
Adenolinum如亚麻、Linumhumile、奥地利亚麻、苍白胡麻、窄叶亚麻、泻亚麻、金黄亚麻、大
花亚麻、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻、那旁亚麻、宿根亚麻、Linumperenne var.
lewisii、Linum pratense或Linum tfigynum[亚麻、亚麻籽]；千屈菜科(Lythrarieae)
例如石榴属(Punica)如石榴；锦葵科(Malvaceae)例如棉属(Gossypium)如陆地棉、
树棉、海岛棉、草棉或瑟伯氏棉[棉花]；芭蕉科(Musaceae)例如芭蕉属(Musa)如香
蕉、小果野蕉、粉芭蕉、Musa spp.[香蕉]；柳叶菜科(Onagraceae)例如Camissonia、月
见草属(Oenothera)如Oeyiothera biennis或Camissonia brevipes[报春花、月见
草]；棕榈科(Palmae)例如油棕属(Elacis)如油棕；罂粟科(Papaveraceae)例如罂粟
属(Papaver)如鬼罂粟、虞美人、Papaver dubium[罂粟、东洋罂粟(orientalpoppy)、角
罂粟(corn poppy)、蓟罂粟(field poppy)、shirley poppies、蓟罂粟(field poppy)、
长荚罂粟(long-headed poppy)、long-pod poppy]；胡麻科(Pedaliaceae)例如胡麻
属(Sesamum)如胡麻[芝麻]；胡椒科(Piperaceae)例如胡椒属(Piper)、Artanthe、
Peperomia、Steffensia如Piper aduncum、Piper amalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎
叶、毕澄茄、长胡椒、胡椒、Piper retrofiactusn、Artanthe adunca、Artanthe elongata、
Peperomiaelongata、Piper elongatum、Steffensia elongata.[辣椒(Cayenne pepper)、
wild pepper]；Poaceae例如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、
高梁属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻
属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)如大麦、芒颖大麦草、海滨大麦、野芒
大麦草、栽培二棱大麦、Hordeum aegiceras、Hordeum hexastichon.、栽培四棱大麦、
Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、野芒大麦草[大麦、珍珠麦、狐尾大
麦(foxtail barley)、wall barley、meadow barley]、黑麦(Secale cereale)、燕麦、
野燕麦、比赞燕麦、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦[燕麦]、两色蜀黍、石茅高梁、
甜 高梁、蜀黍、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum
aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高梁、垂穗高梁草、Sorghum dochna、Sorghum
drummondii、硬高梁草、Sorghumguineense、Sorghum lanceolatum、多脉高梁草、甜高梁、
Sorghumsubglabrescens、Sorghum verticilliflorum、蜀黍、石茅高梁、Sorghummiliaceum
millet、Panicum militaceum[Sorghum、millet]、稻、Oryzalatifolia[rice]、玉 蜀 黍
[玉米]、普通小麦、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticumhybemum、玛卡小麦、普通小麦[小麦、
面包小麦、普通小麦]、山龙眼科(Proteaceae)例如澳洲坚果属(Macadamia)如全缘叶
澳洲坚果(Macadamiaintergrifolia)[macadamia]；茜草科(Rubiaceae)例如咖啡属
(Coffea)如Cofea spp.、小果咖啡、中果咖啡或大果咖啡；玄参科(Scrophulariaceae)
例如毛蕊花属(Verbascum)如毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、东方毛蕊花
(Verbascum chaixii)、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum
longifolium、剪 秋 罗 毛 蕊 花 (Verbascum lychnitis)、Verbascumnigrum、奥 林 匹
克 毛 蕊 花(Verbascum olympicum)、Verbascufnphlomoides、紫 毛 蕊 花 (Verbascum
phoeniceum)、毛 蕊 花 (Verbascumpulverulentuin或 Verbascum thapsus)[毛 蕊 花
(mullein)、white mothmullein、nettle-leaved mullein、dense-flowered mullein、
silver mullein、long-leaved mullein、白色毛蕊花(white mullein)、黑色毛蕊花
(darkmullein)、希腊毛蕊花(greek mullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫色毛
蕊花(purple mullein)、灰色毛蕊花(hoary mullein)、大毛蕊花(greatmullein)]；
茄科(Solanaceae)例如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、
番茄属(Lycopersicon)如辣椒、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米辣[胡
椒]、辣椒[paprika]、烟草、花烟草(Nicotianaalata)、Nicotiana attenuata、光烟草
(Nicotiana glauca)、Nicotianalangsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana
quadrivalvis、波叶烟草(Nicotiana repanda)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林生烟草
(Nicotianasylvestris)、马铃薯、茄、番茄、Lycopersicon lycopersicum.、Lycopersicon
pyriforme、红茄或番茄；梧桐科(Sterculiaceae)例如可可树属(Theobroma)如可可树
(Theobroma cacao)；山茶科(Theaceae)例如山茶属(Camellia)如茶。
或Anacardium occidentale[Cashew]；菊科(Asteraceae)例如金盏花属(Calendula)、
Carthamus、Centaure、菊苣属(Cichorium)、Cynara、向日葵属、莴苣属(Lactuca)、
Locusta、万寿 菊属(Tagetes)、Valeriana例 如Calendula officinalis[Marigold]、
Carthamus tinctorius[safflower]、Centaureacyanus[cornflower]、Cichorium
intybus[blue daisy]、Cynarascolymus[Artichoke]、向日葵、Lactuca sativa、Lactuca
crispa、Lactucaesculenta、Lactuca scariolaL.ssp.saliva、Lactucascariola L.var.
integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、Lacfuca sativa subsp.ronana、
Locusta communis、Valeriana locusta[lettuce]、Tageteslucida、Tagetes erecta 或
Tagetes tenuifolia[Marigold]；Apiaceae例如Daucus如Daucuscarota[carrot]；桦木
科(Betulaceae)例如榛属(Corylus)如Corylusavellana或Coryluscolurna[hazelnut]；
紫 草 科 (Boraginaceae) 例 如 Borago 如 Boragoofficinalis[borage]；芸 苔 科
(Brassicaceae)例如芸苔(Brassica)、Melanosinapis、Sinapis、拟南芥(Arabadopsis)
如欧洲油菜、芜青[canola、oilseed rape、turnip rape]、Sinapisarvensis Brassica
juncea、Brassicajunceavar.juncea、Brassicajuncea var.crispifolia，Brassica juncea
var.foliosa、黑 芥 菜、Brassica sinapioides、Melanosinapis communis[mustard]、
甘 蓝[fodder beet]或 拟南 芥；凤 梨 科(Bromeliaceae)例 如Anana、Bromelia如
Anana comosus、Ananas ananas 或 Bromelia comosa[pineapple]；Caricaceae 例 如
Carica如番木瓜；大麻科(Cannabaceae)(例如大麻属，如大麻)Convolvulaceae例如
Ipomea、Convolvulus 如 Ipomoea battus、Ipomoea pandurata、Convolvulusbatatas、
Convolvulustiliaceus、Ipomoeafastigiata、Ipomoea tiliacea、三裂叶薯或Convolvulus
panduratus[sweetpotato、Man of the Earth、wild potato]、藜科(Chenopodiaceae)
例如甜菜属，即甜菜(Beta vulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、Beta vulgaris
var.Vulgaris、Betamaritima、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.
conditiva 或Beta vulgaris var.esculenta[sugar beet]；葫 芦科(Cucurbitaceae)
例如南瓜属，如笋瓜、灰子南瓜、西葫芦或南瓜；胡颓子科(Elaeagnaceae)例如胡颓子属
(Elaeagnus)如Olea europaea[橄榄]；杜鹃花科(Ericaceae)例如山月桂属(Kalmia)
如 Kalmialatifolia、Kalmia angustifolia、Kalmia microphylla、Kalmia politolia、
Kalmiaoccidentalis、Cistus chamaerhodendros 或 Kalmia lucida[Americanlaurel、
broad-leafed laurel、calico bush、spoon wood、sheep laurel、alpinelaurel、bog
laurel、western bog-laurel、swamp-laurel]；大戟科(Euphorbiaceae)例如木薯属
(Manihot)、Janipha、麻风树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)如Manihot utilissima、
Janipha manihot、Jatropha manihot.、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot
manihot、Manihotmelanobasis、Manihot esculenta [manihot、arrowroot、tapioca、
cassava]或蓖麻[castor bean、Castor Oil Bush、Castor Oil Plant、Palma Christi、
Wonder Tree]；Fabaceae 例 如 豌 豆 属 (Pisum)、Albizia、Cathormion、Feuillea、
Inga、Pithecolobium、金合欢属(Acacia)、害羞草属(Mimosa)、Medicajo、大豆属
(Glycine)、镰扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja如豌豆、Pisum arvense、
Pisum humile[pea]、Albizia berteriana、Albiziajulibrissin、Albizia lebbeck、
Acacia berteriana、Acacialittralis、Albiziaberteriana、Albizzia berteriana、
Cathormion befteriana、Feuilleaberteriana、lnga fragrans、Pithecellobium
berterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecellobium berterianum、Pseudalbizzia
berteriana、Acaciajulibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、
Mimosajulibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acacia lebbeck、
Acacia macrophylla、Albizialebbek、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa
speciosa[bastard logwood、silk tree、East Indian Walnut]、紫苜蓿、野苜蓿、杂交
苜 蓿、Glycine max Dolichos soja、Glycinegracilis、Glycinehispida、Phaseolus
max、Soja hispida或Soja max[soybean]；牻牛儿苗科(Geraniaceae)，例如天竺葵
属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum如椰子、茶子天竺葵或Oleum cocois[椰
子]；禾本科(Gramineae)例如甘蔗属(Saccharum)如甘蔗(Saccharum officinarum)；
胡桃科(Juglandaceae)例如胡桃属(Juglans)、Wallia如胡桃(Juglans regia)、台
湾胡桃(Juglansailanthifolia)、山核桃(Juglans sieboldiana)、灰核桃(Juglans
cinerea)、Walliacinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃 (Juglans califonica)、印
度 黑 核 桃 (Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大 核
桃(Juglansmajor)、小 果黑核(Juglans microcarpa)、黑核桃 (Juglans nigra)或
Wallianigra[walnut、black walnut、common walnut、persian walnut、whitewalnut、
butternut、black walnut]；樟科(Lauraceae)例如鳄梨属(Persea)、月桂(Laurus)如月
桂(Laurus nobilis)[bay、laurel、bay laurel、sweetbay]、 鳄梨(Persea Americana)、
鳄梨、食物鳄梨(Persea gratissima)或Perseapersea[鳄梨]；豆科(Leguminosae)
例如落花生属(Arachis)如落花生[花生]；亚麻科(Linaceae)例如亚麻属(Linum)、
Adenolinum如亚麻、Linumhumile、奥地利亚麻、苍白胡麻、窄叶亚麻、泻亚麻、金黄亚麻、大
花亚麻、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻、那旁亚麻、宿根亚麻、Linumperenne var.
lewisii、Linum pratense或Linum tfigynum[亚麻、亚麻籽]；千屈菜科(Lythrarieae)
例如石榴属(Punica)如石榴；锦葵科(Malvaceae)例如棉属(Gossypium)如陆地棉、
树棉、海岛棉、草棉或瑟伯氏棉[棉花]；芭蕉科(Musaceae)例如芭蕉属(Musa)如香
蕉、小果野蕉、粉芭蕉、Musa spp.[香蕉]；柳叶菜科(Onagraceae)例如Camissonia、月
见草属(Oenothera)如Oeyiothera biennis或Camissonia brevipes[报春花、月见
草]；棕榈科(Palmae)例如油棕属(Elacis)如油棕；罂粟科(Papaveraceae)例如罂粟
属(Papaver)如鬼罂粟、虞美人、Papaver dubium[罂粟、东洋罂粟(orientalpoppy)、角
罂粟(corn poppy)、蓟罂粟(field poppy)、shirley poppies、蓟罂粟(field poppy)、
长荚罂粟(long-headed poppy)、long-pod poppy]；胡麻科(Pedaliaceae)例如胡麻
属(Sesamum)如胡麻[芝麻]；胡椒科(Piperaceae)例如胡椒属(Piper)、Artanthe、
Peperomia、Steffensia如Piper aduncum、Piper amalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎
叶、毕澄茄、长胡椒、胡椒、Piper retrofiactusn、Artanthe adunca、Artanthe elongata、
Peperomiaelongata、Piper elongatum、Steffensia elongata.[辣椒(Cayenne pepper)、
wild pepper]；Poaceae例如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、
高梁属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻
属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)如大麦、芒颖大麦草、海滨大麦、野芒
大麦草、栽培二棱大麦、Hordeum aegiceras、Hordeum hexastichon.、栽培四棱大麦、
Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、野芒大麦草[大麦、珍珠麦、狐尾大
麦(foxtail barley)、wall barley、meadow barley]、黑麦(Secale cereale)、燕麦、
野燕麦、比赞燕麦、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦[燕麦]、两色蜀黍、石茅高梁、
甜 高梁、蜀黍、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum
aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高梁、垂穗高梁草、Sorghum dochna、Sorghum
drummondii、硬高梁草、Sorghumguineense、Sorghum lanceolatum、多脉高梁草、甜高梁、
Sorghumsubglabrescens、Sorghum verticilliflorum、蜀黍、石茅高梁、Sorghummiliaceum
millet、Panicum militaceum[Sorghum、millet]、稻、Oryzalatifolia[rice]、玉 蜀 黍
[玉米]、普通小麦、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticumhybemum、玛卡小麦、普通小麦[小麦、
面包小麦、普通小麦]、山龙眼科(Proteaceae)例如澳洲坚果属(Macadamia)如全缘叶
澳洲坚果(Macadamiaintergrifolia)[macadamia]；茜草科(Rubiaceae)例如咖啡属
(Coffea)如Cofea spp.、小果咖啡、中果咖啡或大果咖啡；玄参科(Scrophulariaceae)
例如毛蕊花属(Verbascum)如毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、东方毛蕊花
(Verbascum chaixii)、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum
longifolium、剪 秋 罗 毛 蕊 花 (Verbascum lychnitis)、Verbascumnigrum、奥 林 匹
克 毛 蕊 花(Verbascum olympicum)、Verbascufnphlomoides、紫 毛 蕊 花 (Verbascum
phoeniceum)、毛 蕊 花 (Verbascumpulverulentuin或 Verbascum thapsus)[毛 蕊 花
(mullein)、white mothmullein、nettle-leaved mullein、dense-flowered mullein、
silver mullein、long-leaved mullein、白色毛蕊花(white mullein)、黑色毛蕊花
(darkmullein)、希腊毛蕊花(greek mullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫色毛
蕊花(purple mullein)、灰色毛蕊花(hoary mullein)、大毛蕊花(greatmullein)]；
茄科(Solanaceae)例如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、
番茄属(Lycopersicon)如辣椒、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米辣[胡
椒]、辣椒[paprika]、烟草、花烟草(Nicotianaalata)、Nicotiana attenuata、光烟草
(Nicotiana glauca)、Nicotianalangsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana
quadrivalvis、波叶烟草(Nicotiana repanda)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林生烟草
(Nicotianasylvestris)、马铃薯、茄、番茄、Lycopersicon lycopersicum.、Lycopersicon
pyriforme、红茄或番茄；梧桐科(Sterculiaceae)例如可可树属(Theobroma)如可可树
(Theobroma cacao)；山茶科(Theaceae)例如山茶属(Camellia)如茶。
[0180] 原则上可以通过本领域技术人员已知的所有方法完成本发明核酸的引入(将表达盒或载体引入生物(如植物)中)。核酸序列的引入产生重组或转基因生物。
[0181] 对于微生物，本领域技术人员可在以下教科书中找到适当的方法：Sambrook，J. 等 (1989)《Molecular cloning：A laboratory manual》，ColdSpring Harbor
Laboratory Press；F.M.Ausubel等(1994)《Currentprotocols in molecular biology》，
John Wiley and Sons；D.M.Glover等，《DNA Cloning》第一卷(1995)，IRL Press(ISBN
019-963476-9)；Kaiser等(1994)《Methods in Yeast Genetics》，Cold Spring Harbor
LaboratoryPress或Guthrie等《Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，
Methods in Enzymology》，1994，Academic Press。
Laboratory Press；F.M.Ausubel等(1994)《Currentprotocols in molecular biology》，
John Wiley and Sons；D.M.Glover等，《DNA Cloning》第一卷(1995)，IRL Press(ISBN
019-963476-9)；Kaiser等(1994)《Methods in Yeast Genetics》，Cold Spring Harbor
LaboratoryPress或Guthrie等《Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，
Methods in Enzymology》，1994，Academic Press。
[0182] 外源基因向植物基因组的转移称为转化。为此，使用所述用于转化及从植物组织或植物细胞再生植株的方法进行瞬时或稳定转化。合适的方法为通过聚(乙二醇)诱导的
DNA摄取的原生质体转化、使用基因炮的“生物射弹”方法(指如微粒轰击的方法)、电穿孔、
在DNA溶液中孵育干胚、微注射和农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于例如B.Jenes
等，《Transgenic Plants》，第一卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编，
Academic Press(1993)128-143的Techniques for Gene Transfer和Potrykus Annu.Rev.
Plant Physio.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225。用于表达的核酸或构建体优选克隆
进适合转化根瘤农杆菌的载体中，例如pBinl9(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。
接着转化了这一载体的农杆菌可用于按已知方式转化植物特别是作物植物，如烟草植物，
例如将捣碎的叶片或切碎的叶片浸泡在农杆菌溶液中，接着在合适的培养基中培养。依
靠根瘤农杆菌的植物转化由例如Hofgen和Willmitzer在Nucl. Acid Res.(1988)16，
9877中描述，或此外公知于F.F.White，《TransgenicPlants》，第1卷，Engineering and
Utilization，S.D.Kung和R.Wu编，Academic Press，1993，15-38页的“Vectors for Gene
Transfer in HigherPlants”。
DNA摄取的原生质体转化、使用基因炮的“生物射弹”方法(指如微粒轰击的方法)、电穿孔、
在DNA溶液中孵育干胚、微注射和农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于例如B.Jenes
等，《Transgenic Plants》，第一卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编，
Academic Press(1993)128-143的Techniques for Gene Transfer和Potrykus Annu.Rev.
Plant Physio.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225。用于表达的核酸或构建体优选克隆
进适合转化根瘤农杆菌的载体中，例如pBinl9(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。
接着转化了这一载体的农杆菌可用于按已知方式转化植物特别是作物植物，如烟草植物，
例如将捣碎的叶片或切碎的叶片浸泡在农杆菌溶液中，接着在合适的培养基中培养。依
靠根瘤农杆菌的植物转化由例如Hofgen和Willmitzer在Nucl. Acid Res.(1988)16，
9877中描述，或此外公知于F.F.White，《TransgenicPlants》，第1卷，Engineering and
Utilization，S.D.Kung和R.Wu编，Academic Press，1993，15-38页的“Vectors for Gene
Transfer in HigherPlants”。
[0183] 转化了本发明表达载体的农杆菌同样可以已知方式(例如捣磨碎的叶片或切碎的叶片浸泡在农杆菌溶液中，接着在合适的培养基中培养)用于植物转化，如试验植物，如
拟南芥或作物植物，如谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日
葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡turnip rape、辣椒、油菜、树薯、木薯、葛、万寿菊、苜
蓿、莴苣以及各种树木、坚果和藤本物种，特别是含油作物植物，如大豆、花生、蓖麻油植物、
向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、棕榈、红花或可可豆。
拟南芥或作物植物，如谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日
葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡turnip rape、辣椒、油菜、树薯、木薯、葛、万寿菊、苜
蓿、莴苣以及各种树木、坚果和藤本物种，特别是含油作物植物，如大豆、花生、蓖麻油植物、
向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、棕榈、红花或可可豆。
[0184] 经遗传修饰的植物细胞可以通过本领域技术人员已知的所有方法再生。适当的方法可见于前述S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Hofgen和Willmitzer的文献。
[0185] 因此，本发明另一方面涉及转化了至少一种本发明的核酸序列、表达盒或载体的转基因生物及细胞、细胞培养物、组织、部分(例如植物生物的叶、根等)或来自这些生物的
繁殖材料。术语“宿主生物”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物”和“转基因(宿主)细胞”
在此可互换使用。当然这些术语不仅涉及特定的宿主生物或特定靶细胞，而且涉及这些生
物或细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响在连续世代中可能形成某些修饰，这些
后代不一定与亲本细胞完全相同，但仍包含在本文使用的术语中。
繁殖材料。术语“宿主生物”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物”和“转基因(宿主)细胞”
在此可互换使用。当然这些术语不仅涉及特定的宿主生物或特定靶细胞，而且涉及这些生
物或细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响在连续世代中可能形成某些修饰，这些
后代不一定与亲本细胞完全相同，但仍包含在本文使用的术语中。
[0186] 就本发明而言，对于例如含有本发明核酸序列的核酸序列、表达盒(＝基因构建体、核酸构建体)或载体，或转化了本发明核酸序列、表达盒或载体的生物，“转基因的”或
“重组的”指所有这些构建体由遗传工程方法产生，其中a)序列图1a、1b或1c中描述的核酸
序列或其衍生物或部分，或者b)与a)描述的核酸序列功能连接的遗传控制序列，例如3’和
/或5’ 遗传控制序列(如启动子或终止子)，或者c)(a)和(b)在其天然遗传环境中未发
现或通过遗传工程方法进行了修饰，其中修饰可以通过例如替代、添加、缺失、倒位或插入
一个或多个核酸残基。天然遗传环境指源生物或宿主生物中或基因组文库中的天然基因组
或染色体位点。对于基因组文库，优选至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。该环境至少
在核酸序列的一侧边界且长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选
至少5000bp。当通过非天然、合成(“人工”)的方法如诱变修饰后，天然存在的表达盒——
例如天然存在的本发明核酸序列的天然启动子与相应的Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延伸酶和/
或Δ-5-去饱和酶基因的组合——转变为转基因表达盒。合适的方法在例如US5,565,350
或WO00/15815中有所描述。
“重组的”指所有这些构建体由遗传工程方法产生，其中a)序列图1a、1b或1c中描述的核酸
序列或其衍生物或部分，或者b)与a)描述的核酸序列功能连接的遗传控制序列，例如3’和
/或5’ 遗传控制序列(如启动子或终止子)，或者c)(a)和(b)在其天然遗传环境中未发
现或通过遗传工程方法进行了修饰，其中修饰可以通过例如替代、添加、缺失、倒位或插入
一个或多个核酸残基。天然遗传环境指源生物或宿主生物中或基因组文库中的天然基因组
或染色体位点。对于基因组文库，优选至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。该环境至少
在核酸序列的一侧边界且长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选
至少5000bp。当通过非天然、合成(“人工”)的方法如诱变修饰后，天然存在的表达盒——
例如天然存在的本发明核酸序列的天然启动子与相应的Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延伸酶和/
或Δ-5-去饱和酶基因的组合——转变为转基因表达盒。合适的方法在例如US5,565,350
或WO00/15815中有所描述。
[0187] 原则上，适合表达如前述的重组基因的所有生物都有利地是适合本发明的核酸、表达盒或载体的生物或宿主生物。可能提到的其他实例为植物例如拟南芥、菊科(如金盏
草)或作物植物，如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、亚麻、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、棕
榈、红花或可可豆。
草)或作物植物，如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、亚麻、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、棕
榈、红花或可可豆。
[0188] 本方面的另一目的涉及含有编码序列图1a、1b、或1c多肽的DNA序列或与其杂交的DNA序列的核酸构建体(例如表达盒)在转化植物细胞、组织、或植物的一部分中的用
途。
途。
[0189] 为此，取决于启动子的选择，序列图1a、1b或1c的序列可在植物的叶、种子、根瘤、根、茎或其他部分特异表达。过量产生序列图1a、1b或1c序列的转基因植物、其繁殖材料
连同其植物细胞、组织或部分为本发明另外的目的。
连同其植物细胞、组织或部分为本发明另外的目的。
[0190] 另外，含有序列图1a、1b或1c序列的本发明表达盒或核酸序列或构建体也可以用于转化上述生物，例如细菌、酵母、丝状真菌和植物。
[0191] 在本发明框架内，改变的代谢活性是指由于序列图1a、1b或1c序列在本发明生物中(有利的是在本发明转基因植物中)功能性过表达而与非 遗传修饰的原始植物相比至
少延续一个植物世代的提高生物合成性能的人工获得性状。
少延续一个植物世代的提高生物合成性能的人工获得性状。
[0192] 此外，序列图1a、1b或1c外源序列的组成型表达是有利的。然而，另一方面也可能需要诱导型表达。
[0193] 可以例如在体外通过茎分生组织繁殖(shoot meristem propagation)测定序列图1a、1b或1c序列的表达效率。另外，天然修饰的序列图1a、1b或1c序列的表达及其表
达水平和对代谢途径性能的影响可在温室试验的测试植物中测试。
达水平和对代谢途径性能的影响可在温室试验的测试植物中测试。
[0194] 本发明额外的目的包括转基因植物，如用含有本发明序列图1a、1b或1c序列或与其杂交的DNA序列的表达盒转化的转基因植物，以及这些植物的转基因细胞、组织、部分和
繁殖材料。本发明特别优选的是转基因作物植物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、
稻、棉花、甜菜、油菜和芸苔、向日葵、亚麻、大麻、蓟、马铃薯、烟草、番茄、树薯、木薯、葛、苜
蓿、莴苣和各种树木、坚果和藤本物种。
繁殖材料。本发明特别优选的是转基因作物植物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、
稻、棉花、甜菜、油菜和芸苔、向日葵、亚麻、大麻、蓟、马铃薯、烟草、番茄、树薯、木薯、葛、苜
蓿、莴苣和各种树木、坚果和藤本物种。
[0195] 就本发明而言，植物为单子叶和双子叶植物、藓类或藻类。
[0196] 本发明另一目的为如前所述含有本发明核酸序列或构建体或本发明表达盒的的转基因植物。
[0197] 另外，衍生物是指序列图1a、1b或1c序列的同系物，例如真核同系物、截短的序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或编码和非编码DNA序列的RNA。
[0198] 另外，序列图1a、1b或1c序列的同系物是指衍生物，例如启动子变体。这些变体可以通过对启动子功能性或效率没有不利影响的一个或多个核酸交换、插入和/或缺失而
而修饰。另外，可通过改变其序列或用甚至是异种生物的更有效的启动子完全取代而提高
启动子的效率。
而修饰。另外，可通过改变其序列或用甚至是异种生物的更有效的启动子完全取代而提高
启动子的效率。
[0199] 衍生物也有利地指在起始密码子前-1到-2000区域改变了核苷酸序列以修饰(优选提高)基因表达和/或蛋白质表达的变体。另外，通过衍生物也指在3’端修饰了的
变体。
变体。
[0200] 原则上，可以在生物中控制外源基因表达的所有启动都是表达盒中适合的启动子，所述生物为微生物或植物，如原生动物(如纤毛虫)、藻类(如绿藻、褐藻、红藻或蓝
藻如Euglenia)、细菌(如革兰氏阳性或革兰氏阴性菌)、酵母如酵母(Saccharomyces)、
毕赤酵母或裂殖酵母或真菌如被孢霉(Mortierella)、破囊壶菌(Thraustochytrium)或
Schizochytrium，有利的是在植物或真菌中。特别优选使用植物启动子或来自植物病毒
的启动子。本发明方法有利的调节序列可见于例如启动子中的序列，例如cos、tac、trp、
tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR启动子或
有利于用于革兰氏阴性菌的λ-PR启动子。其他有利的调节序列可见于例如革兰氏阳性
启动子amy和SP02、酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH
或植物启动子CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、
nos(＝Nopalin合酶启动子)或泛素或菜豆蛋白启动子。表达盒也可以含有化学诱导型
启动子，通过该启动子可以在特定时间有利的在植物中控制SEQ ID NO：1-269中奇数编号
的外源序列的表达。有利的该类型植物启动子为例如PRP1启动子[Ward等，Plant.Mol.
Biol.22(1993)，361-366]，可被苯磺胺诱导的启动子(EP 388186)、可被四环素诱导的启动
子[Gatz等，(1992)Plant J.2，397-404]、可被水杨酸诱导的启动子(WO95/19443)、可被
脱落酸诱导的启动子(EP 335528)和可被乙醇或环己酮诱导的启动子(WO93/21334)。其
他可有利使用的植物启动子的实例为马铃薯来源的细胞质FBPase启动子、马铃薯来源的
ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)、大豆来源的磷核糖基焦磷酸氨
基转移酶启动子(也参见gene bank)登录号(187999)、或EP 249676中所述的nodiene特
异的启动子。特别有利的为确保在进行脂肪酸生物合成或其前体阶段的组织或植物部分/
器官中(如在胚乳或发育的胚中)表达的植物启动子。 特别值得注意的为确保种子特异
性表达的启动子，例如USP启动子或其衍生物、LEB4启动子、菜豆蛋白启动子或油菜籽蛋白
启动子。本发明引用的特别有利的USP启动子或其衍生物介导种子发育极早期的基因表
达[Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67]。其他可用于单子叶或双子叶植
物的有利的种子特异性启动子为适合双子叶植物的启动子，例如油菜来源的油菜籽蛋白基
因启动子(US5,608,152)、拟南芥来源的油质蛋白启动子(WO98/45461)、菜豆(Phaseolus
vulgaris)来源的菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、芸苔(Brassic)来源的Bce4启动子
(WO91/13980)或豆科(leguminous)B4启动子(LeB4，Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：
233-239)或适合单子叶植物的启动子，大麦中Ipt2或Ipt1基因的启动子(WO95/15389和
WO95/23230)或如WO99/16890中所述的大麦hordeine基因、水稻谷蛋白基因、稻水稻素基
因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、白谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白
基因、高梁kasirin基因或裸麦醇溶蛋白基因的启动子。
藻如Euglenia)、细菌(如革兰氏阳性或革兰氏阴性菌)、酵母如酵母(Saccharomyces)、
毕赤酵母或裂殖酵母或真菌如被孢霉(Mortierella)、破囊壶菌(Thraustochytrium)或
Schizochytrium，有利的是在植物或真菌中。特别优选使用植物启动子或来自植物病毒
的启动子。本发明方法有利的调节序列可见于例如启动子中的序列，例如cos、tac、trp、
tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR启动子或
有利于用于革兰氏阴性菌的λ-PR启动子。其他有利的调节序列可见于例如革兰氏阳性
启动子amy和SP02、酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH
或植物启动子CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、
nos(＝Nopalin合酶启动子)或泛素或菜豆蛋白启动子。表达盒也可以含有化学诱导型
启动子，通过该启动子可以在特定时间有利的在植物中控制SEQ ID NO：1-269中奇数编号
的外源序列的表达。有利的该类型植物启动子为例如PRP1启动子[Ward等，Plant.Mol.
Biol.22(1993)，361-366]，可被苯磺胺诱导的启动子(EP 388186)、可被四环素诱导的启动
子[Gatz等，(1992)Plant J.2，397-404]、可被水杨酸诱导的启动子(WO95/19443)、可被
脱落酸诱导的启动子(EP 335528)和可被乙醇或环己酮诱导的启动子(WO93/21334)。其
他可有利使用的植物启动子的实例为马铃薯来源的细胞质FBPase启动子、马铃薯来源的
ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)、大豆来源的磷核糖基焦磷酸氨
基转移酶启动子(也参见gene bank)登录号(187999)、或EP 249676中所述的nodiene特
异的启动子。特别有利的为确保在进行脂肪酸生物合成或其前体阶段的组织或植物部分/
器官中(如在胚乳或发育的胚中)表达的植物启动子。 特别值得注意的为确保种子特异
性表达的启动子，例如USP启动子或其衍生物、LEB4启动子、菜豆蛋白启动子或油菜籽蛋白
启动子。本发明引用的特别有利的USP启动子或其衍生物介导种子发育极早期的基因表
达[Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67]。其他可用于单子叶或双子叶植
物的有利的种子特异性启动子为适合双子叶植物的启动子，例如油菜来源的油菜籽蛋白基
因启动子(US5,608,152)、拟南芥来源的油质蛋白启动子(WO98/45461)、菜豆(Phaseolus
vulgaris)来源的菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、芸苔(Brassic)来源的Bce4启动子
(WO91/13980)或豆科(leguminous)B4启动子(LeB4，Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：
233-239)或适合单子叶植物的启动子，大麦中Ipt2或Ipt1基因的启动子(WO95/15389和
WO95/23230)或如WO99/16890中所述的大麦hordeine基因、水稻谷蛋白基因、稻水稻素基
因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、白谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白
基因、高梁kasirin基因或裸麦醇溶蛋白基因的启动子。
[0201] 另外，特别优选的为确保在例如进行脂肪酸、油脂或脂类或它们的前体阶段的生物合成的组织或植物部分中表达的启动子。特别值得注意的是确保种子特异性表达
的启动子。值得注意的是油菜来源的油菜籽蛋白启动子(US5,608,152)、蚕豆(Vicia
faba)来源的USP启动子(USP＝未知种子蛋白质，Baeumlein等，Mol Gen Genet，
1991，225(3)：459-67)、拟南芥来源的油质蛋白基因启动子(WO98/45461)、菜豆蛋白启
动子(US5,504,200)或豆球蛋白B4基因(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，
2(2)：233-9)。其他将提到的启动子为在单子叶植物中介导种子特异性表达的大麦
来源的Ipt2或Ipt1基因的启动子(WO95/15389和WO95/23230)。其他有利的种子
特异性启动子为WO99/16890中公开的稻、玉米或小麦的启动子或Amy32b、Amy6-6或
aleurain(US5,677,474)、Bce4(油菜，US5,530,149)、大豆球蛋白(大豆，EP 571741)、磷
酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆，JP06/62870)、ADR12-2(大豆，WO98/08962)、异柠檬酸酶
(isocitratlyase)(油菜，US5,689,040)或β-淀粉酶(大麦，EP 781849)。
的启动子。值得注意的是油菜来源的油菜籽蛋白启动子(US5,608,152)、蚕豆(Vicia
faba)来源的USP启动子(USP＝未知种子蛋白质，Baeumlein等，Mol Gen Genet，
1991，225(3)：459-67)、拟南芥来源的油质蛋白基因启动子(WO98/45461)、菜豆蛋白启
动子(US5,504,200)或豆球蛋白B4基因(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，
2(2)：233-9)。其他将提到的启动子为在单子叶植物中介导种子特异性表达的大麦
来源的Ipt2或Ipt1基因的启动子(WO95/15389和WO95/23230)。其他有利的种子
特异性启动子为WO99/16890中公开的稻、玉米或小麦的启动子或Amy32b、Amy6-6或
aleurain(US5,677,474)、Bce4(油菜，US5,530,149)、大豆球蛋白(大豆，EP 571741)、磷
酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆，JP06/62870)、ADR12-2(大豆，WO98/08962)、异柠檬酸酶
(isocitratlyase)(油菜，US5,689,040)或β-淀粉酶(大麦，EP 781849)。
[0202] 如前文所述，表达构建体(＝基因构建体、核酸构建体)可以还含有要引入生物的其他基因。这些基因可以与序列图1a、1b或1c的序列分别调控或置于同一调节区。这些
基因为例如允许增加合成的其他生物合成基因，有利的为脂肪酸生物合成、维生素生物合
成等基因。
基因为例如允许增加合成的其他生物合成基因，有利的为脂肪酸生物合成、维生素生物合
成等基因。
[0203] 原则上，所有天然启动子及其调节序列可以如前文提到的基因一样用于本发明的表达盒和本发明的方法。除此以外，也可以有利的使用合成的启动子。
[0204] 在表达盒的制备中，可以操作各种DNA片段以得到按正确方向阅读并带有正确读码框(reading raster)的核苷酸序列。可在片段上附加接头或连接子以使这些DNA片段
(＝本发明核酸)彼此连接。
(＝本发明核酸)彼此连接。
[0205] 可以利用含有一个或多个限制性位点的接头或多聚接头在转录方向上有效地提供启动子和终止子区域，所述限制性位点用于插入这一序列。通常，接头具有1到10个，常
为1到8个，优选2到6个限制性位点。通常调节区中接头的大小小于100bp，常小于60bp，
但至少为5bp。启动子可以为宿主生物例如宿主植物中天然的或同源的以及外源或异源基
因。表达盒沿5’-3’转录方向含有启动子、编码序列图1a、1b或1c基因的DNA序列和转录
终止区。不同的终止区可以以任何所需的方式彼此互换。
为1到8个，优选2到6个限制性位点。通常调节区中接头的大小小于100bp，常小于60bp，
但至少为5bp。启动子可以为宿主生物例如宿主植物中天然的或同源的以及外源或异源基
因。表达盒沿5’-3’转录方向含有启动子、编码序列图1a、1b或1c基因的DNA序列和转录
终止区。不同的终止区可以以任何所需的方式彼此互换。
[0206] 另外，可以采用提供合适的限制性接口或去除过量的DNA或限制性接口的操作。当考虑插入、缺失或替换(如转换或颠换)时，可以使用体外诱变、引物修复、限制或连接。
在适当的操作如限制、chewing back或补平突出端成为平末端中，可以提供用以连接的互
补末端。
在适当的操作如限制、chewing back或补平突出端成为平末端中，可以提供用以连接的互
补末端。
[0207] 附加特异的ER滞留信号SEKDEL对于有利的高表达可能尤其重要(Schouten，A.等，Plant Mol.Biol.30(1996)，781-792)。由此平均表达水平可达三倍甚至四倍。植物
和动物蛋白质中天然存在的定位在ER的其它滞留信号也可用于表达盒的构建。另一个优
选的实施方案中，如Napier J.A.[Targeting of foreign proteins to the chloroplast，
Methods Mol.Biol.，49，1995：369-3761]所述使用了质体靶向序列。Colin Lazarus
[Guerineau F.， Woolston S.，Brooks L.，Mullineaux P.“An expression cassette for
targetingforeign proteins into chloroplast”；Nucleic.Acids Res.，Dec 9，16(23)，
1988：11380]公开了含有所述质体靶向序列的优选使用的载体。
和动物蛋白质中天然存在的定位在ER的其它滞留信号也可用于表达盒的构建。另一个优
选的实施方案中，如Napier J.A.[Targeting of foreign proteins to the chloroplast，
Methods Mol.Biol.，49，1995：369-3761]所述使用了质体靶向序列。Colin Lazarus
[Guerineau F.， Woolston S.，Brooks L.，Mullineaux P.“An expression cassette for
targetingforeign proteins into chloroplast”；Nucleic.Acids Res.，Dec 9，16(23)，
1988：11380]公开了含有所述质体靶向序列的优选使用的载体。
[0208] 优选的多腺苷酸化信号为植物多腺苷酸化信号，优选基本对应于根瘤农杆菌来源的T-DNA多腺苷酸化信号，特别是Ti质粒pTiACH5的T-DNA的(章鱼碱合酶)基因3(Gielen
等，EMBO J.3(1984)，835以下)或其功能等效物的多腺苷酸化信号。
等，EMBO J.3(1984)，835以下)或其功能等效物的多腺苷酸化信号。
[0209] 通过常规重组和克隆技术将合适的启动子与序列图1a、1b或1c中合适的序列以及多腺苷酸化信号融合产生表达盒，所述技术描述于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch
和 J.Sambrook，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor
Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989) 以 及 T.J.Silhavy，M.L.Berman 和
L.W.Enquist，《Experiments with GeneFusions》，Cold Spring Harbor Laboratory，
Cold Spring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，《Current Protocols in Molecular
Biology》，GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)。
和 J.Sambrook，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor
Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989) 以 及 T.J.Silhavy，M.L.Berman 和
L.W.Enquist，《Experiments with GeneFusions》，Cold Spring Harbor Laboratory，
Cold Spring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，《Current Protocols in Molecular
Biology》，GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)。
[0210] 在表达盒的制备中，可以操作各种DNA片段以得到按正确方向有效阅读并带有正确读码框的核苷酸序列。可以附加接头或连接子以连接DNA片段。
[0211] 可以利用含有一个或多个限制性位点的接头或多聚接头在转录方向上有效地提供启动子和终止子区域，所述限制性位点用于插入这一序列。通常，接头具有1到10个，常
为1到8个，优选2到6个限制性位点。通常调节区中接头的大小小于100bp，常小于60bp，
但至少为5bp。启动子可以为宿主生物例如宿主植物中天然的或同源物以及外源或异源基
因。表达盒沿5’-3’转录方向含有启动子、编码SEQ ID NO：1-269中奇数编号基因的DNA
序列和转录终止区。不同的终止区可以以任何所需的方式彼此互换。
为1到8个，优选2到6个限制性位点。通常调节区中接头的大小小于100bp，常小于60bp，
但至少为5bp。启动子可以为宿主生物例如宿主植物中天然的或同源物以及外源或异源基
因。表达盒沿5’-3’转录方向含有启动子、编码SEQ ID NO：1-269中奇数编号基因的DNA
序列和转录终止区。不同的终止区可以以任何所需的方式彼此互换。
[0212] 在表达盒的制备中，可以操作各种DNA片段以得到按正确方向有效阅读并带有正确的读码框的核苷酸序列。可以附加接头或连接子以连接DNA片段。
[0213] 编码本发明方法中使用的核酸序列(如序列图1a、1b或1c序列)的DNA序列含有实现各自生物合成的正确定位所需的全部序列特征。因此，其本身不需要其他的靶向序
列。然而，这样的定位可能是需要的和有利的并因此经过人工修饰或强化，因此这些融合构
建体也是本发明有利的优选实施方案。
列。然而，这样的定位可能是需要的和有利的并因此经过人工修饰或强化，因此这些融合构
建体也是本发明有利的优选实施方案。
[0214] 特别优选的为确保靶向质体的序列。在某些情况下也可能需要靶向其他区室(报道于：Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423)如液泡、线粒体、内质网、过氧
化物酶体、脂质结构或胞质(由于缺乏滞留在起源区室的相应有效序列)。
化物酶体、脂质结构或胞质(由于缺乏滞留在起源区室的相应有效序列)。
[0215] 本文使用的术语“环境胁迫”指任何亚最适生长条件，包括(但不限于)与盐度、干旱、温度、金属、化学、病原和氧化胁迫或其组合相关的亚最适条件。在优选的实施方案中，
环境胁迫可以为盐度、干旱、热或低温或其组合，特别是低含水量或低温。其中干旱胁迫指
任何导致植物缺水或减少植物水供应的环境胁迫，其中低温胁迫指在4℃以下冰冻植物以
及在15℃以下冷冻植物，而其中高温胁迫指例如高于35℃的温度。胁迫的范围和胁迫反应
取决于本发明使用的不同植物，即如小麦的植物和如拟南芥的植物之间存在区别。植物对
于环境胁迫的通常反应是产量和质量的降低。同时也应理解说明书。
环境胁迫可以为盐度、干旱、热或低温或其组合，特别是低含水量或低温。其中干旱胁迫指
任何导致植物缺水或减少植物水供应的环境胁迫，其中低温胁迫指在4℃以下冰冻植物以
及在15℃以下冷冻植物，而其中高温胁迫指例如高于35℃的温度。胁迫的范围和胁迫反应
取决于本发明使用的不同植物，即如小麦的植物和如拟南芥的植物之间存在区别。植物对
于环境胁迫的通常反应是产量和质量的降低。同时也应理解说明书。
[0216] 本文使用的术语“核酸”和“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA和RNA的类似物。该术语
同样包括位于编码区3’和5’端的非翻译序列：基因编码区5’端上游序列的至少约1000
核苷酸和3’端下游序列至少约200核苷酸。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链
DNA。
同样包括位于编码区3’和5’端的非翻译序列：基因编码区5’端上游序列的至少约1000
核苷酸和3’端下游序列至少约200核苷酸。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链
DNA。
[0217] “分离的”核酸分子是与存在于该核酸的天然来源中的其他核酸分子基本上分离的核酸分子。这意味着其他核酸分子的存在量小于目的核酸重量的5％，优选小于重量的
2％，更优选小于重量的1％，最优选小于重量的0.5％。“分离的”核酸优选不含有核酸所
来源生物的基因组DNA中核酸两侧天然存在的序列(如位于核酸5’和3’端的序列)。例
如，在不同的实施方案中分离的编码胁迫相关蛋白质的核酸分子可含有核酸所来源细胞的
基因组DNA中核酸分子两侧天然存在的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷
酸序列。另外，“分离的”核酸分子如cDNA分子，可不含有其他其天然结合的胞内物质，或通
过重组技术产生时的培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学试剂。
2％，更优选小于重量的1％，最优选小于重量的0.5％。“分离的”核酸优选不含有核酸所
来源生物的基因组DNA中核酸两侧天然存在的序列(如位于核酸5’和3’端的序列)。例
如，在不同的实施方案中分离的编码胁迫相关蛋白质的核酸分子可含有核酸所来源细胞的
基因组DNA中核酸分子两侧天然存在的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷
酸序列。另外，“分离的”核酸分子如cDNA分子，可不含有其他其天然结合的胞内物质，或通
过重组技术产生时的培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学试剂。
[0218] 可使用标准分子生物学技术以及本文提供的序列信息分离本发明的核酸分子(例如编码在植物中提供对环境胁迫的耐性和/或抗性的SRP或其一部分的核酸分子)。
例如，可以使用序列图1a、1b或1c序列之一的全部或部分从拟南芥cDNA文库中分离编码
拟南芥胁迫相关蛋白质的DNA。另外，包括序列图1a、1b或1c序列之一的全部或部分的核
酸分子可以通过使用基于这一序列设计的寡核苷酸引物的聚合酶链式反应进行分离。例如
可以从植物细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等，1979Biochemistry 18：5294-5299的
硫氰酸胍提取方法)并可使用反转录酶(例如可购自Gibco/BRL、Bethesda、MD的Moloney
MLV反转录酶或可购自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL的AMV反转录酶)制
备cDNA。可基于序列图1a、1b或1c中显示的核苷酸序列之一设计用于聚合酶链式反应的
合成的寡核苷酸引物。可以使用作为模板的cDNA或者基因组DNA和适当的寡核苷酸引物
按照标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸分子可以克隆进适当的载
体，并通过DNA序列分析描述其特征。另外，可以通过标准合成技术(例如使用自动DNA合
成仪)制备相应于编码SRP的核苷酸序列的寡核苷酸。
例如，可以使用序列图1a、1b或1c序列之一的全部或部分从拟南芥cDNA文库中分离编码
拟南芥胁迫相关蛋白质的DNA。另外，包括序列图1a、1b或1c序列之一的全部或部分的核
酸分子可以通过使用基于这一序列设计的寡核苷酸引物的聚合酶链式反应进行分离。例如
可以从植物细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等，1979Biochemistry 18：5294-5299的
硫氰酸胍提取方法)并可使用反转录酶(例如可购自Gibco/BRL、Bethesda、MD的Moloney
MLV反转录酶或可购自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL的AMV反转录酶)制
备cDNA。可基于序列图1a、1b或1c中显示的核苷酸序列之一设计用于聚合酶链式反应的
合成的寡核苷酸引物。可以使用作为模板的cDNA或者基因组DNA和适当的寡核苷酸引物
按照标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸分子可以克隆进适当的载
体，并通过DNA序列分析描述其特征。另外，可以通过标准合成技术(例如使用自动DNA合
成仪)制备相应于编码SRP的核苷酸序列的寡核苷酸。
[0219] 在优选的实施方案中，本发明的分离核酸分子含有序列图1a、1b或1c中显示的编码SRP的一种核苷酸序列(即“编码区”)，以及5’非翻译序列和3’非翻译序列。
[0220] 另外，本发明的核酸分子可以只含有序列图1a、1b或1c核酸序列之一的部分编码区，例如可以作为探针或引物使用的片段或编码SRP生物活性部分的片段。
[0221] 本发明编码SRP的核酸分子编码的蛋白质部分优选为本文所述的生物活性部分。本文使用的术语SRP的“生物活性部分”旨在包括植物中参与胁迫耐性和/或抗性反应的
胁迫相关蛋白质的部分，例如结构域/基序。为鉴定SRP或其生物活性部分是否在植物中
导致提高的胁迫耐性，可以对含有SRP的植物进行胁迫分析。如实施例中所详细描述的，这
些分析方法为本领域技术人员所熟知。更具体地，可通过分离序列图1a、1b或1c的核酸序
列之一的部分、表达SRP或肽的编码部分(如通过体外重组表达)、评估SRP或多肽编码部
分的活性来制备编码SRP生物活性部分的核酸片段。
胁迫相关蛋白质的部分，例如结构域/基序。为鉴定SRP或其生物活性部分是否在植物中
导致提高的胁迫耐性，可以对含有SRP的植物进行胁迫分析。如实施例中所详细描述的，这
些分析方法为本领域技术人员所熟知。更具体地，可通过分离序列图1a、1b或1c的核酸序
列之一的部分、表达SRP或肽的编码部分(如通过体外重组表达)、评估SRP或多肽编码部
分的活性来制备编码SRP生物活性部分的核酸片段。
[0222] SRP的生物活性部分包含于本发明，并包括含有SRP编码基因的氨基酸序列所衍生氨基酸序列的肽，或与SRP同源的蛋白质的氨基酸序列，所述序列包括比全长SRP更少的
氨基酸或与SRP同源的全长蛋白质，并至少表现出SRP的某些酶活性。一般地，生物活性部
分(例如长度为5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多氨基酸的肽)包含带
有至少一种SRP活性的结构域/基序。另外，可以通过重组技术制备缺失蛋白质其他区域
的生物活性部分，并评估一种或多种本文所述的活性。优选的SRP生物活性部分包括一个
或多个选定的具有生物活性的结构域/基序或其部分。
氨基酸或与SRP同源的全长蛋白质，并至少表现出SRP的某些酶活性。一般地，生物活性部
分(例如长度为5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多氨基酸的肽)包含带
有至少一种SRP活性的结构域/基序。另外，可以通过重组技术制备缺失蛋白质其他区域
的生物活性部分，并评估一种或多种本文所述的活性。优选的SRP生物活性部分包括一个
或多个选定的具有生物活性的结构域/基序或其部分。
[0223] 术语“生物活性部分”或“生物活性”指具有天然或起始酶至少10％或20％、优选20％、30％、40％或50％、特别优选至少60％、70％或80％的酶活性的SRP或SRP部分。
[0224] 另外，可以通过聚合酶链式反应分离包含本方法使用的核酸分子完整序列的核酸分子，例如本发明的多核苷酸或其部分，其中使用基于所述序列或其部分的寡核苷酸引
物。例如含有完整序列或其部分的核酸分子可以通过使用基于该序列产生的寡核苷酸引
物的聚合酶链式反应分离。例如，可从细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等.(1979)
Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取方法)并通过反转录酶(例如从Gibco/
BRL、Bethesda、MD获得的Moloney MLV反转录酶，或可从SeikagakuAmerica，Inc.、
St.Petersburg，FL获得的AMV反转录酶)产生cDNA。
物。例如含有完整序列或其部分的核酸分子可以通过使用基于该序列产生的寡核苷酸引
物的聚合酶链式反应分离。例如，可从细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等.(1979)
Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取方法)并通过反转录酶(例如从Gibco/
BRL、Bethesda、MD获得的Moloney MLV反转录酶，或可从SeikagakuAmerica，Inc.、
St.Petersburg，FL获得的AMV反转录酶)产生cDNA。
[0225] 聚合酶链式反应扩增使用的合成寡核苷酸引物针(例如表2所示)可以基于本文所述的序列(如序列图1a、1b或1c中所示序列或来自序列图1a、1b或1c中所示多肽序
列)产生。
列)产生。
[0226] 另外，可以通过与本发明方法所使用的多肽(特别是本发明的多肽序列)进行蛋白质序列比对鉴定多种生物中的保守区域，从中可以得出保守区域和简并引物。序列图1a、
1b或1c所示的比对指出了本发明多肽的保守区域。保守区域为在不同来源的几种同源物
中一个特定位置的氨基酸极少变化的区域。图1所示的共有序列来自所述的比对。
1b或1c所示的比对指出了本发明多肽的保守区域。保守区域为在不同来源的几种同源物
中一个特定位置的氨基酸极少变化的区域。图1所示的共有序列来自所述的比对。
[0227] 然后可以使用简并引物通过PCR扩增具有前述活性(如SPR活性)的新蛋白质片段或来源于其他生物的本发明多肽的其他功能性同源物的片段。
[0228] 然后可以使用这些片段作为杂交探针分离完整基因序列。作为备选，可以通过RACE-PCR(cDNA末端快速扩增)方法分离遗漏的5’和3’序列。可以使用cDNA或作为代替
的基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物按照标准PCR扩增技术扩增本发明的核
酸分子。由此扩增的核酸分子可以克隆进合适的载体并通过DNA序列分析的方法描述其特
征。可以通过标准合成方法(例如自动DNA合成仪)产生相应于方法中使用的核酸分子之
一的寡核苷酸。
的基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物按照标准PCR扩增技术扩增本发明的核
酸分子。由此扩增的核酸分子可以克隆进合适的载体并通过DNA序列分析的方法描述其特
征。可以通过标准合成方法(例如自动DNA合成仪)产生相应于方法中使用的核酸分子之
一的寡核苷酸。
[0229] 有利于本发明方法的核酸分子可以基于它们与本文公开的核酸分子的同源性进行分离，所述分离使用该序列或其部分作为杂交探针，在严格杂 交条件下按照标准杂交技
术进行。在本文中可以使用例如与前述核酸分子(特别是含有本发明方法中使用的核酸分
子或编码本发明使用的蛋白质或本发明的核酸分子的核苷酸序列)在严格条件下杂交，且
长度为至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多核苷酸，优选至少15、20或25个核苷酸的分
离的核酸分子。也可以使用具有30、50、100、250或更多核苷酸的核酸分子。
术进行。在本文中可以使用例如与前述核酸分子(特别是含有本发明方法中使用的核酸分
子或编码本发明使用的蛋白质或本发明的核酸分子的核苷酸序列)在严格条件下杂交，且
长度为至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多核苷酸，优选至少15、20或25个核苷酸的分
离的核酸分子。也可以使用具有30、50、100、250或更多核苷酸的核酸分子。
[0230] 除了本文所述的SRP片段以外，本发明包括植物中天然存在的SRP和SRP编码核酸的同源物或类似物。
[0231] “同源物”在本文中定义为分别具有相似的或“同源的”核苷酸或氨基酸序列的两个核酸或蛋白质。同源物包括下文定义的SRP的等位变体、直系同源物、旁系同源物、激动
剂或拮抗剂。术语“同源物”另外包括由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO.XXX序
列所示的核苷酸序列之一(及其部分)，并因而编码与SEQ ID NO.XXX序列所示的核苷酸序
列编码同样的SRP的核酸分子。本文使用的“天然存在的”SRP指自然界中存在的SRP氨基
酸序列。
剂或拮抗剂。术语“同源物”另外包括由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO.XXX序
列所示的核苷酸序列之一(及其部分)，并因而编码与SEQ ID NO.XXX序列所示的核苷酸序
列编码同样的SRP的核酸分子。本文使用的“天然存在的”SRP指自然界中存在的SRP氨基
酸序列。
[0232] 术语“同源性”指各核酸分子或编码的蛋白质在功能和/或结构上是等效的。与前文所述核酸分子同源并为所述核酸分子的衍生物的核酸分子是例如存在相同生物功能
的修饰的所述核酸分子的变体，特别是编码具有相同或基本相同的生物功能的蛋白质的变
体。它们可以是天然存在的变体，如来源于其他植物变种或物种体的序列，或是突变序列。
这些突变体可以是天然存在的或是通过诱变技术得到的。等位变体可以是天然存在的等位
变体以及合成产生或遗传改造的变体。例如，可以通过测试所述多肽与抗体的结合或基于
计算机预测来鉴定结构等效物。结构等效物具有相似的免疫学特性，例如含有相似的表位。
的修饰的所述核酸分子的变体，特别是编码具有相同或基本相同的生物功能的蛋白质的变
体。它们可以是天然存在的变体，如来源于其他植物变种或物种体的序列，或是突变序列。
这些突变体可以是天然存在的或是通过诱变技术得到的。等位变体可以是天然存在的等位
变体以及合成产生或遗传改造的变体。例如，可以通过测试所述多肽与抗体的结合或基于
计算机预测来鉴定结构等效物。结构等效物具有相似的免疫学特性，例如含有相似的表位。
[0233] 本发明SEQ ID NO：YYY所示的多肽通过替代、插入或缺失衍生的功能等效物与本发明序列图1a、1b或1c所示的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至
少55％、60％、65％或70％，优选至少80％、特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或
94％，极优选 至少95％、97％、98％或99％的同源性，并通过与序列图1a、1b或1c所示的
多肽基本相同的特性区分。
少55％、60％、65％或70％，优选至少80％、特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或
94％，极优选 至少95％、97％、98％或99％的同源性，并通过与序列图1a、1b或1c所示的
多肽基本相同的特性区分。
[0234] 如本发明SEQ ID NO：YYY所示的核酸序列通过替代、插入或缺失衍生的功能性等效物与本发明序列图1a、1b或1c所示的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，
优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、
93％或94％，极优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并编码与序列图1a、1b或1c所
示的多肽具有基本相同的特性的多肽。
优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、
93％或94％，极优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并编码与序列图1a、1b或1c所
示的多肽具有基本相同的特性的多肽。
[0235] 功能性等效物“基本相同的特性”首先应理解为功能性等效物具有上文提到的活性，例如在提高所述功能性等效物在生物如微生物、植物或植物或动物组织、植物、或动物
细胞或其部分中的蛋白质量、活性或功能的同时，增加精细化学品的量。
细胞或其部分中的蛋白质量、活性或功能的同时，增加精细化学品的量。
[0236] “杂交”指这些核酸分子在常规杂交条件下杂交，优选在严格条件下(例如Sambrook《Molecular Cloning；A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor
Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)或《Cu rrent Protocols in Molecular
Biology》，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.中所述的严格条件)杂交。
Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)或《Cu rrent Protocols in Molecular
Biology》，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.中所述的严格条件)杂交。
[0237] 根据本发明，本发明核酸的DNA及RNA分子可以作为探针使用。另外，可以作为鉴定功能同系物的模板进行Northern印迹测定和Southern印迹测定。Nouthern印迹测定有
利的提供关于表达的基因产物的其他信息：例如表达图式、加工步骤(如剪接和加帽)的发
生等。Southern印迹测定提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织的额外
信息。
利的提供关于表达的基因产物的其他信息：例如表达图式、加工步骤(如剪接和加帽)的发
生等。Southern印迹测定提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织的额外
信息。
[0238] 严格杂交条件优选的非限制性实例为在约45℃下，6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中杂交，接着在50到60℃，例如50℃、55℃或60℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中进行
一次或多次洗涤步骤。技术人员清楚这些杂交条件作为核酸类型的函数而变化，并(例
如当存在有机溶剂时)与缓冲液的温度和浓度有关。“标准杂交条件”下的温度作为核酸
类型的函数而变化， 例如在0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4×或5×SSC浓度的水性缓冲
液中(pH7.2)介于42℃和58℃之间，优选在45℃和50℃之间。当前述缓冲液中存在有
机溶剂(例如50％甲酰胺)时，标准条件下的温度约为40℃、42℃或45℃。DNA:DNA杂
合体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选30℃
和45℃之间。DNA:RNA杂合体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、
50℃或55℃，优选45℃和55℃之间。前文提到的杂交温度以例如在无甲酰胺时长度约
100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸确定。借助于如前述的教科书或以下教科书，
技术人员了解如何确定所需杂交条件：Sambrook等，《Molecular Cloning》，Cold Spring
Harbor Laboratory，1989；Hames and Higgins编1985，《Nucleic Acids Hybridization：
A PracticalApproach》，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown 编
1991，《Essential Molecular Biology：A Practical Approach》，IRL Press atOxford
University Press，Oxford。
一次或多次洗涤步骤。技术人员清楚这些杂交条件作为核酸类型的函数而变化，并(例
如当存在有机溶剂时)与缓冲液的温度和浓度有关。“标准杂交条件”下的温度作为核酸
类型的函数而变化， 例如在0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4×或5×SSC浓度的水性缓冲
液中(pH7.2)介于42℃和58℃之间，优选在45℃和50℃之间。当前述缓冲液中存在有
机溶剂(例如50％甲酰胺)时，标准条件下的温度约为40℃、42℃或45℃。DNA:DNA杂
合体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选30℃
和45℃之间。DNA:RNA杂合体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、
50℃或55℃，优选45℃和55℃之间。前文提到的杂交温度以例如在无甲酰胺时长度约
100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸确定。借助于如前述的教科书或以下教科书，
技术人员了解如何确定所需杂交条件：Sambrook等，《Molecular Cloning》，Cold Spring
Harbor Laboratory，1989；Hames and Higgins编1985，《Nucleic Acids Hybridization：
A PracticalApproach》，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown 编
1991，《Essential Molecular Biology：A Practical Approach》，IRL Press atOxford
University Press，Oxford。
[0239] 这些严格杂交条件之一的其他实例是在65℃，4×SSC中杂交，接着在65℃在0.1×SSC中洗涤一小时。另外的代表性严格杂交条件为在50％甲酰胺中、42℃下
4×SSC。另外，洗涤步骤的条件可以从由低严格条件(约2×SSC、50℃)和高严格条件(约
0.2×SSC、50℃，优选65℃)(20×SSC：0.3M柠檬酸钠、3M氯化钠、pH7.0)限定的条件范围
内选出。另外，洗涤步骤的温度可以从低严格条件的室温(约22℃)提高到高严格条件的
约65℃。盐浓度和温度两个参数可以同时变化，或两个参数中的一个保持恒定而只有另一
个变化。也可以在杂交中使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。存在50％甲酰胺时，优选在42℃
进行杂交。相关因素如i)处理的长度、ii)盐条件、iii)洗涤剂条件、iv)竞争DNA、v)温
度和vi)探针的选择可以逐一组合，因此本文不可能提到所有的可能性。
4×SSC。另外，洗涤步骤的条件可以从由低严格条件(约2×SSC、50℃)和高严格条件(约
0.2×SSC、50℃，优选65℃)(20×SSC：0.3M柠檬酸钠、3M氯化钠、pH7.0)限定的条件范围
内选出。另外，洗涤步骤的温度可以从低严格条件的室温(约22℃)提高到高严格条件的
约65℃。盐浓度和温度两个参数可以同时变化，或两个参数中的一个保持恒定而只有另一
个变化。也可以在杂交中使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。存在50％甲酰胺时，优选在42℃
进行杂交。相关因素如i)处理的长度、ii)盐条件、iii)洗涤剂条件、iv)竞争DNA、v)温
度和vi)探针的选择可以逐一组合，因此本文不可能提到所有的可能性。
[0240] 因此，在优选的实施方案中，Northern印迹与Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth、Karlsruhe)在68℃预杂交2小时。在68℃与放射性标记的探针杂交过夜。接着在68℃以
1×SSC进行洗涤步骤。
1×SSC进行洗涤步骤。
[0241] 对于Southern印迹测定，膜与Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth、Karlsruhe)在68℃预杂交2小时。在68℃与放射性标记的探针杂交过液。接着丢弃杂交缓冲液，使用
2×SSC、0.1％SDS短时洗涤滤器。丢弃洗涤缓冲液后加入新的2×SSC、0.1％SDS缓冲液，
并在68℃孵育15分钟。该洗涤步骤进行两次，接着使用1×SSC、0.1％SDS在68℃进行10
分钟额外的洗涤步骤。
2×SSC、0.1％SDS短时洗涤滤器。丢弃洗涤缓冲液后加入新的2×SSC、0.1％SDS缓冲液，
并在68℃孵育15分钟。该洗涤步骤进行两次，接着使用1×SSC、0.1％SDS在68℃进行10
分钟额外的洗涤步骤。
[0242] DNA杂交(Southern印迹测定)和洗涤步骤的其他一些实例如下所示：
[0243] (1)杂交条件可选自例如以下的条件：
[0244] a)4×SSC、65℃，
[0245] b)6×SSC、45℃，
[0246] c)6×SSC、100mg/ml变性的鱼精DNA片段、68℃，
[0247] d)6×SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性的鲑精DNA、68℃，
[0248] e)6×SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性的鲑精DNA片段、42℃，
[0249] f)50％甲酰胺、4×SSC、42℃，
[0250] g)50％(体积/体积)甲酰胺、0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚糖体、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)、750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠、42℃，
[0251] h)2×或4×SSC、50℃(低严格条件)，或
[0252] i)30到40％甲酰胺、2×或4×SSC、42℃(低严格条件)
[0253] (2)洗涤条件可选自例如以下的条件：
[0254] a)0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS、50℃，
[0255] b)0.1×SSC、65℃，
[0256] c)0.1×SSC、0.5％SDS、68℃，
[0257] d)0.1×SSC、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃，
[0258] e)0.2×SSC、0.1％SDS、42℃，
[0259] f)2×SSC、65℃(低严格条件)。
[0260] 在另一实施方案中，标准条件(取决于有关核酸)指例如在含有浓度为0.1和5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.2)之间或额外存在50％甲酰胺的水缓
冲液中，温度在42℃和58℃之间(例如42℃)，在5×SSC、50％甲酰胺中的条件。DNA:DNA
杂合体的杂交条件有利的为0.1×SSC、温度在约20℃和45℃之间，优选在约30℃和45℃
之间。对于DNA:RNA杂合体杂交条件有利的为0.1×SSC，温度在约30℃和55℃之间，优
选在约45℃和55℃之间。这些指定的杂交温度为例如长度为约100个核苷酸且G+C含量
为50％的核酸在无甲酰胺时计算出的解链温度。DNA杂交的实验条件在相关遗传学教科
书(例如Sambrook等，《Molecular Cloning》，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)
中有所描述，并可以通过技术人员已知的公式计算，例如作为核酸长度、杂合体特性或G+C
含量的函数。本领域技术人员可以在以下教科书中得到杂交的其他信息：Ausubel等编，
1985，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley&Sons，New York、Hames
和Higgins编，1985，《Nucleic AcidsHybridization：A Practical Approach》，IRL Press
at Oxford UniversityPress，Oxford、Brown编，1991，《Essential Molecular Biology：A
PracticalApproach》，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
冲液中，温度在42℃和58℃之间(例如42℃)，在5×SSC、50％甲酰胺中的条件。DNA:DNA
杂合体的杂交条件有利的为0.1×SSC、温度在约20℃和45℃之间，优选在约30℃和45℃
之间。对于DNA:RNA杂合体杂交条件有利的为0.1×SSC，温度在约30℃和55℃之间，优
选在约45℃和55℃之间。这些指定的杂交温度为例如长度为约100个核苷酸且G+C含量
为50％的核酸在无甲酰胺时计算出的解链温度。DNA杂交的实验条件在相关遗传学教科
书(例如Sambrook等，《Molecular Cloning》，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)
中有所描述，并可以通过技术人员已知的公式计算，例如作为核酸长度、杂合体特性或G+C
含量的函数。本领域技术人员可以在以下教科书中得到杂交的其他信息：Ausubel等编，
1985，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley&Sons，New York、Hames
和Higgins编，1985，《Nucleic AcidsHybridization：A Practical Approach》，IRL Press
at Oxford UniversityPress，Oxford、Brown编，1991，《Essential Molecular Biology：A
PracticalApproach》，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
[0261] 来自其他生物的具有前述活性(即赋予改变的代谢活性)的多肽可由与序列图1a、1b或1c所示的序列在宽松的杂交条件下杂交的其他DNA序列编码，所述序列图1a、1b
或1c所示的序列编码赋予代谢活性改变的多肽。
或1c所示的序列编码赋予代谢活性改变的多肽。
[0262] 另外，一些应用只能在低严格杂交条件下进行，对于杂交的特异性没有影响。例如可以用本发明的核酸分子进行探测总DNA的Southern印迹分析，并在低严格(55℃在
2×SSC、0.1％SDS中)下洗涤。杂交分析可以揭示只有编码本发明的多肽或本发明方法中
所用多肽的基因才有的简单模式(例如具有本文所述的增加精细化学品的活性)。这类低
严格杂交条件的另一实例为4×SSC，50℃或使用30％到40％甲酰胺在42℃杂交。这些分
子含有本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽的片段、类似物或衍生 物，并通过例如单
独或组合的氨基酸或核苷酸缺失、插入、替代、添加和/或重组或任何本领域已知的其他修
饰而区别于前述氨基酸序列或其编码核苷酸序列。然而，优选使用高严格杂交条件。
2×SSC、0.1％SDS中)下洗涤。杂交分析可以揭示只有编码本发明的多肽或本发明方法中
所用多肽的基因才有的简单模式(例如具有本文所述的增加精细化学品的活性)。这类低
严格杂交条件的另一实例为4×SSC，50℃或使用30％到40％甲酰胺在42℃杂交。这些分
子含有本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽的片段、类似物或衍生 物，并通过例如单
独或组合的氨基酸或核苷酸缺失、插入、替代、添加和/或重组或任何本领域已知的其他修
饰而区别于前述氨基酸序列或其编码核苷酸序列。然而，优选使用高严格杂交条件。
[0263] 应该有利地与至少5、10、15、20、25、30、35或40bp，有利地至少50、60、70或80bp，优选至少90、100或110bp的片段进行杂交。最优选至少15、20、25或30bp的片段。同样
优选与长度至少100bp或200bp、极优选至少400bp的片段杂交。在特别优选的实施方案
中，应在前述条件下与完整核酸序列进行杂交。
优选与长度至少100bp或200bp、极优选至少400bp的片段杂交。在特别优选的实施方案
中，应在前述条件下与完整核酸序列进行杂交。
[0264] 术语“片段”、“序列片段”或“序列部分”指所述原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)的长度可大泛范变化；最小长度为足够提供至少一项与所述原始序
列相当的功能和/或活性，或与本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子在严格条
件下杂交的序列，而最大长度不严格。在一些应用中，最大长度通常不显著大于提供需要的
原始序列的活性和/或功能所需的长度。
列相当的功能和/或活性，或与本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子在严格条
件下杂交的序列，而最大长度不严格。在一些应用中，最大长度通常不显著大于提供需要的
原始序列的活性和/或功能所需的长度。
[0265] 除了本文所述SRP的片段和融合多肽以外，本发明包括植物中天然存在的SRP和SRP编码核酸的同源物和类似物。“同源物”在本文中定义为分别具有相似的或基本相同的
核苷酸或氨基酸序列的两个核酸或多肽。同源物包括如下文定义的SRP的等位变体、直系
同源物、旁系同源物、激动剂和拮抗剂。术语“同源物”另外包括于遗传密码的简并性区别
于序列图1a、1b或1c所示的核苷酸序列之一(及其部分)，并因而与序列图1a、1b或1c所
示的核苷酸序列编码相同的SRP的核酸分子。本文使用的“天然存在的”SRP指在自然界中
存在的SRP氨基酸序列。天然存在的SRP优选含有选自序列图1a、1b或1c多肽的氨基酸
序列。
核苷酸或氨基酸序列的两个核酸或多肽。同源物包括如下文定义的SRP的等位变体、直系
同源物、旁系同源物、激动剂和拮抗剂。术语“同源物”另外包括于遗传密码的简并性区别
于序列图1a、1b或1c所示的核苷酸序列之一(及其部分)，并因而与序列图1a、1b或1c所
示的核苷酸序列编码相同的SRP的核酸分子。本文使用的“天然存在的”SRP指在自然界中
存在的SRP氨基酸序列。天然存在的SRP优选含有选自序列图1a、1b或1c多肽的氨基酸
序列。
[0266] SRP的激动剂可保留SRP基本相同的生物活性或其部分。SRP的拮抗剂可以抑制SRP天然存在形式的一项或多项活性。例如，SRP拮抗剂可以与包括SRP的细胞膜成分代谢
级联的上游或下游成员竞争性结合，或与介导化合物跨膜转运的SRP结合，从而阻止转运
的发生。
级联的上游或下游成员竞争性结合，或与介导化合物跨膜转运的SRP结合，从而阻止转运
的发生。
[0267] 可以基于与本文所述的酿酒酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆或稻SRP 核酸的同一性，使用SRP cDNA或其部分作为杂交探针，按照标准杂交技术在严格杂交条件下分离相应
于SRP cDNA的天然等位变体和类似物、直系同源物和旁系同源物的核酸分子。在另一实施
方案中，可以通过筛选SRP突变体(如截短突变体)组合文库的SRP激动剂或拮抗剂的活
性来鉴定SRP的同源物。在一个实施方案中，SRP变体的杂色文库(Variegatedlibrary)通
过核酸水平的组合诱变产生，并由杂色基因文库编码。SRP变体杂色文库的产生可以通过
例如将合成的寡核苷酸混合物酶连接进基因序列从而使潜在SRP序列的简并集可作为单
个多肽表达，或另外作为含有SRP序列集的较大的融合多肽表达(例如噬菌体展示)。可
以使用多种方法从简并寡核苷酸序列产生潜在SRP同源物的文库。可以在自动DNA合成仪
中化学合成简并基因序列，然后将合成的基因连接进合适的表达载体。使用基因的简并集
允许在一个混合物中提供编码需要的潜在SRP序列集的全部序列。合成简并寡核苷酸的方
法为本领域技术人员所公知。参阅例如Narang，S.A.，1983，Tetrahedron 39：3；itakura
等，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，1984，Science 198：1056；Ike等，1983，
NucleicAcid Res.11：477。
于SRP cDNA的天然等位变体和类似物、直系同源物和旁系同源物的核酸分子。在另一实施
方案中，可以通过筛选SRP突变体(如截短突变体)组合文库的SRP激动剂或拮抗剂的活
性来鉴定SRP的同源物。在一个实施方案中，SRP变体的杂色文库(Variegatedlibrary)通
过核酸水平的组合诱变产生，并由杂色基因文库编码。SRP变体杂色文库的产生可以通过
例如将合成的寡核苷酸混合物酶连接进基因序列从而使潜在SRP序列的简并集可作为单
个多肽表达，或另外作为含有SRP序列集的较大的融合多肽表达(例如噬菌体展示)。可
以使用多种方法从简并寡核苷酸序列产生潜在SRP同源物的文库。可以在自动DNA合成仪
中化学合成简并基因序列，然后将合成的基因连接进合适的表达载体。使用基因的简并集
允许在一个混合物中提供编码需要的潜在SRP序列集的全部序列。合成简并寡核苷酸的方
法为本领域技术人员所公知。参阅例如Narang，S.A.，1983，Tetrahedron 39：3；itakura
等，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，1984，Science 198：1056；Ike等，1983，
NucleicAcid Res.11：477。
[0268] 另外，SRP编码区片段文库可以用于产生SRP片段的杂色群以筛选并接着选出SRP的同源物。在一个实施方案中，可以通过在只对每个分子产生一个切口的条件下用核酸酶
处理SRP编码序列的双链PCR片段、变性双链DNA、复性DNA形成双链DNA(可包括来自的具
有不同切口的产物的有义/反义对)、通过S1核酸酶处理从重新形成的配对中去除单链部
分、将得到的片段文库连接进表达载体来产生编码序列片段的文库。通过这一方法可以得
到编码SRP的N-端、C-端和各种大小的居间片段的表达文库。
处理SRP编码序列的双链PCR片段、变性双链DNA、复性DNA形成双链DNA(可包括来自的具
有不同切口的产物的有义/反义对)、通过S1核酸酶处理从重新形成的配对中去除单链部
分、将得到的片段文库连接进表达载体来产生编码序列片段的文库。通过这一方法可以得
到编码SRP的N-端、C-端和各种大小的居间片段的表达文库。
[0269] 若干用于筛选点突变或截短产生的组合文库的基因产物以及从DNA文库筛选具有所选特性的基因产物的技术为本领域所公知。这些技术适于快速筛选通过SRP同源物
的组合诱变产生的基因文库。筛选大基因文库使用的适于高通量分析的最广泛技术一般
包括将基因文库克隆进可复制的表 达载体、将得到的载体文库转化进合适的细胞，并在所
需活性的检测便于分离编码所检测产物基因的载体的条件下表达组合基因。提高文库中
功能突变体频率的新技术——循环总体诱变(Reaursive ensemble mutagenesis，REM》可
以与鉴定SRP筛选测定法组合使用以鉴定SRP同源物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS 89：
7811-7815；Delgrave等，1993，PolypeptideEngineering 6(3)：327-331)。在另一实施方
案中，可以使用本领域公知的方法开发基于细胞的测定法以分析杂色SRP文库。本发明另
外提供了鉴定新SRP的方法，包括(a)获得应答于本文所述SRP或其片段的特异性抗体；
(b)用抗体筛选推定的SRP材料，其中抗体与材料的特异结合表示存在潜在的新SRP；并
(c)与已知SRP比较分析结合的材料，以鉴定其新颖性。
的组合诱变产生的基因文库。筛选大基因文库使用的适于高通量分析的最广泛技术一般
包括将基因文库克隆进可复制的表 达载体、将得到的载体文库转化进合适的细胞，并在所
需活性的检测便于分离编码所检测产物基因的载体的条件下表达组合基因。提高文库中
功能突变体频率的新技术——循环总体诱变(Reaursive ensemble mutagenesis，REM》可
以与鉴定SRP筛选测定法组合使用以鉴定SRP同源物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS 89：
7811-7815；Delgrave等，1993，PolypeptideEngineering 6(3)：327-331)。在另一实施方
案中，可以使用本领域公知的方法开发基于细胞的测定法以分析杂色SRP文库。本发明另
外提供了鉴定新SRP的方法，包括(a)获得应答于本文所述SRP或其片段的特异性抗体；
(b)用抗体筛选推定的SRP材料，其中抗体与材料的特异结合表示存在潜在的新SRP；并
(c)与已知SRP比较分析结合的材料，以鉴定其新颖性。
[0270] 如前文所指出，本发明包括SRP及其同源物。为确定两个氨基酸序列(例如序列图1a、1b或1c序列之一和其突变体形式)的序列同一性百分数，以最佳比较的目的将序列进
行比对(例如为了与一个多肽或核酸的最佳的比对，可以在另一个多肽序列中引入缺口)。
接着比较相应氨基酸位置的氨基酸残基。当一个序列(例如序列图1a、1b或1c的序列之
一)中的位置被与另一序列(例如选自序列图1a、1b或1c多肽的序列的突变体形式)相
应位置上相同的氨基酸残基占据时，两分子在该位置上是一致的。可以在两核酸序列间进
行同样类型的比较。
行比对(例如为了与一个多肽或核酸的最佳的比对，可以在另一个多肽序列中引入缺口)。
接着比较相应氨基酸位置的氨基酸残基。当一个序列(例如序列图1a、1b或1c的序列之
一)中的位置被与另一序列(例如选自序列图1a、1b或1c多肽的序列的突变体形式)相
应位置上相同的氨基酸残基占据时，两分子在该位置上是一致的。可以在两核酸序列间进
行同样类型的比较。
[0271] 两序列的序列同一性百分数是序列间共享的一致位置的数目的函数(即序列同一性百分数＝一致位置的数目/位置总数×100)。本发明包括的分离的氨基酸同源物优选
与序列图1a、1b或1c所示的氨基酸完整序列具有至少约50-60％、优选至少约60-70％、更
优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％、并最优选至少约96％、97％、
98％、99％或更高的同一性。在另一个实施方案中，本发明包括的分离的氨基酸同源物与序
列图1a、1b或1c所示的核酸序列编码的完整氨基酸序列具有至少约50-60％、优选至少约
60-70％、更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％、并最优选至少约
96％、97％、98％、99％或更高的同 一性。在其他实施方案中，SRP氨基酸同源物具有序列
图1a、1b或1c中超过至少15个连续氨基酸残基、更优选至少25个连续氨基酸残基、最优
选至少35个连续氨基酸残基的序列同一性。
与序列图1a、1b或1c所示的氨基酸完整序列具有至少约50-60％、优选至少约60-70％、更
优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％、并最优选至少约96％、97％、
98％、99％或更高的同一性。在另一个实施方案中，本发明包括的分离的氨基酸同源物与序
列图1a、1b或1c所示的核酸序列编码的完整氨基酸序列具有至少约50-60％、优选至少约
60-70％、更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％、并最优选至少约
96％、97％、98％、99％或更高的同 一性。在其他实施方案中，SRP氨基酸同源物具有序列
图1a、1b或1c中超过至少15个连续氨基酸残基、更优选至少25个连续氨基酸残基、最优
选至少35个连续氨基酸残基的序列同一性。
[0272] 在另一优选的实施方案中，本发明的分离的核酸同源物含有与序列图1a、1b或1c所示的核苷酸序列或其含有至少20、30、40、50、60个连续核苷酸的部分具有至少
约50-60％、优选至少约60-70％、更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或
90-95％、并最优选至少约96％、97％、98％、99％或更高的同一性的核酸序列。核酸序列比
较优选的长度为至少75个核苷酸、更优选至少100个核苷酸并最优选编码区的完整长度。
约50-60％、优选至少约60-70％、更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或
90-95％、并最优选至少约96％、97％、98％、99％或更高的同一性的核酸序列。核酸序列比
较优选的长度为至少75个核苷酸、更优选至少100个核苷酸并最优选编码区的完整长度。
[0273] 另外优选本发明的分离的核酸同源物编码与序列图1a、1b或1c的氨基酸序列具有至少85％同一性，并且在植物中发挥环境胁迫反应调节子功能的SRP或其部分。在更优
选的实施方案中，植物中核酸同源物的过表达提高植物对环境胁迫的耐性。
选的实施方案中，植物中核酸同源物的过表达提高植物对环境胁迫的耐性。
[0274] 就本发明而言，使用Vector NTI 6.0(PC)软件包(InforMax，7600WisconsinAve.，Bethesda，MD 20814)测定两核酸或多肽序列之间的序列同一性百分数。测定两核酸
的同一性百分数时使用的缺口打开罚分为15，缺口延伸罚分为6.66。鉴定两多肽同一性百
分数使用的缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.1。所有其他参数设定为其默认设置。为
了多重比对(Clustal W算法)，缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.05的blosum62矩
阵的0.05。应该理解，就确定序列同一性而言，将DNA序列与RNA序列比较时，胸腺嘧啶核
苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。
的同一性百分数时使用的缺口打开罚分为15，缺口延伸罚分为6.66。鉴定两多肽同一性百
分数使用的缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.1。所有其他参数设定为其默认设置。为
了多重比对(Clustal W算法)，缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.05的blosum62矩
阵的0.05。应该理解，就确定序列同一性而言，将DNA序列与RNA序列比较时，胸腺嘧啶核
苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。
[0275] 另一方面，本发明提供含有与序列图1a、1b或1c的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的分离核酸。更具体地，本发明的分离核酸分子长度至少为15个核苷酸，并在严
格条件下与含有序列图1a、1b或1c核苷酸序列的核酸分子杂交。在另一个实施方案中，核
酸分子长度为至少30、50、100、250或更多核苷酸。优选本发明分离核酸的同源物含有与序
列图1a、1b或1c的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，并在植物中作为胁迫耐性
调节子发挥功能。在其他优选的实施方案中，植物中分离核酸同 源物的过表达提高植物对
环境胁迫的耐性。
格条件下与含有序列图1a、1b或1c核苷酸序列的核酸分子杂交。在另一个实施方案中，核
酸分子长度为至少30、50、100、250或更多核苷酸。优选本发明分离核酸的同源物含有与序
列图1a、1b或1c的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，并在植物中作为胁迫耐性
调节子发挥功能。在其他优选的实施方案中，植物中分离核酸同 源物的过表达提高植物对
环境胁迫的耐性。
[0276] 对于DNA到DNA印迹的杂交，本文使用的术语“严格条件”在一个实施方案中指在10×Denharts溶液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性的鲑精DNA中于60℃杂交过
夜。在62℃用3×SSC/0.1％SDS、接着用1×SSC/0.1％SDS、最后用0.1×SSC/0.1％SDS
每次30分钟洗涤印迹。同时本文使用的“高严格条件”指在10×Denharts溶液、6×SSC、
0.5％SDS和100μg/ml变性的鲑精DNA中于65℃杂交过夜。在65℃用3×SSC/0.1％
SDS、接着用1×SSC/0.1％SDS、最后用0.1×SSC/0.1％SDS每次30分钟洗涤印迹。核
酸杂交的方法描述于Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138：267-284、Ausubel等
编，1995，《Current Protocols inMolecular Biology》， 第 2 章，Greene Publishing
and Wiley-Interscience，New York、以及Tijssen，1993，《Laboratory Techniques in
Biochemistry andMolecular Biology：Hybridization with Nucleic Acid Probes》，第1
部，第2章，Elsevier，New York。优选地，与序列图1a、1b或1c序列在严格或高严格条件
下杂交的本发明的分离核酸分子对应于天然存在的核酸分子。本文使用的“天然存在”的
核酸分子指具有自然界中存在(例如编码天然多肽)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。在
一个实施方案中，核酸编码天然存在的酿酒酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆或稻SRP。
夜。在62℃用3×SSC/0.1％SDS、接着用1×SSC/0.1％SDS、最后用0.1×SSC/0.1％SDS
每次30分钟洗涤印迹。同时本文使用的“高严格条件”指在10×Denharts溶液、6×SSC、
0.5％SDS和100μg/ml变性的鲑精DNA中于65℃杂交过夜。在65℃用3×SSC/0.1％
SDS、接着用1×SSC/0.1％SDS、最后用0.1×SSC/0.1％SDS每次30分钟洗涤印迹。核
酸杂交的方法描述于Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138：267-284、Ausubel等
编，1995，《Current Protocols inMolecular Biology》， 第 2 章，Greene Publishing
and Wiley-Interscience，New York、以及Tijssen，1993，《Laboratory Techniques in
Biochemistry andMolecular Biology：Hybridization with Nucleic Acid Probes》，第1
部，第2章，Elsevier，New York。优选地，与序列图1a、1b或1c序列在严格或高严格条件
下杂交的本发明的分离核酸分子对应于天然存在的核酸分子。本文使用的“天然存在”的
核酸分子指具有自然界中存在(例如编码天然多肽)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。在
一个实施方案中，核酸编码天然存在的酿酒酵母、大肠杆菌、欧洲油菜、大豆或稻SRP。
[0277] 使用前述方法及本领域技术人员已知的其他方法，本领域普通技术人员可以分离含有序列图1a、1b或1c所示的氨基酸序列的SRP的同源物。这些同源物的一个子集为等
位变体。本文使用的术语“等位变体”指含有引起SRP氨基酸序列变化的多态性的核苷酸
序列，并且该多态性在天然种群(例如植物种或变种)中存在。这些天然的等位改变通常
导致SRP核酸中1-5％的变异。等位变体可以通过在大量不同植物中对目的核酸序列进行
测序而鉴定，可以方便的使用杂交探针鉴定那些植物中相同的SRP基因位点。本发明意图
包括任一和全部的这类核酸变异，以及作为天然等位变异并且不改变SRP功能活性的结果
而产生的SRP中的氨基酸多态性或变异。
位变体。本文使用的术语“等位变体”指含有引起SRP氨基酸序列变化的多态性的核苷酸
序列，并且该多态性在天然种群(例如植物种或变种)中存在。这些天然的等位改变通常
导致SRP核酸中1-5％的变异。等位变体可以通过在大量不同植物中对目的核酸序列进行
测序而鉴定，可以方便的使用杂交探针鉴定那些植物中相同的SRP基因位点。本发明意图
包括任一和全部的这类核酸变异，以及作为天然等位变异并且不改变SRP功能活性的结果
而产生的SRP中的氨基酸多态性或变异。
[0278] 可以通过向序列图1a、1b或1c的核酸序列中分别引入一个或多个核苷酸的替换、添加或缺失，并因而向编码的多肽中引入一个或多个氨基酸替换、添加或缺失而产生编码
与序列图1a、1b或1c多肽序列具有序列同一性的SRP的分离核酸分子。可以通过标准技
术(如定向诱变和PCR介导的诱变向序列图1a、1b或1c的序列中引入突变。优选地，在一
个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是用具
有相似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基的替换。
与序列图1a、1b或1c多肽序列具有序列同一性的SRP的分离核酸分子。可以通过标准技
术(如定向诱变和PCR介导的诱变向序列图1a、1b或1c的序列中引入突变。优选地，在一
个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是用具
有相似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基的替换。
[0279] 本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如门冬氨酸、谷氨
酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨
酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨
酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨
酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，
SRP中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的氨基酸取代。另外，在另一实施
方案中，可以如通过饱和诱变在全部或部分的SRP编码序列中随机引入突变，可以筛选所
得突变体的本文所述的SRP活性以鉴定保留SRP活性的突变体。对SEQ IDNO：XXX的序列
之一进行诱变后，可以重组表达编码的多肽并可以如本文所述通过分析表达该多肽的植物
的胁迫耐性来测定多肽的活性。
酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨
酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨
酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨
酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，
SRP中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的氨基酸取代。另外，在另一实施
方案中，可以如通过饱和诱变在全部或部分的SRP编码序列中随机引入突变，可以筛选所
得突变体的本文所述的SRP活性以鉴定保留SRP活性的突变体。对SEQ IDNO：XXX的序列
之一进行诱变后，可以重组表达编码的多肽并可以如本文所述通过分析表达该多肽的植物
的胁迫耐性来测定多肽的活性。
[0280] 另外，可以产生优化的SRP核酸。本文使用的“优化的”指经遗传设改造以提高在给定植物或动物中表达的核酸。为给植物提供优化的SRP核酸，基因的DNA序列可以
修饰成1)含有高表达植物基因优选的密码子；2)含有在植物中大量发现的核苷酸碱基
组成的A+T含量；3)形成植物起始序列；或4)去除导致RNA的不稳定、不正确的多腺苷
酸化、降解和终止，或形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列。可以通过利用在植物中
普遍的或在特定中的植物密码子使用分布频率提高SRP核酸在植物中的表达。优化植物
中核酸表达的方法可见于EPA0359472、EPA0385962、 PCT Application No.WO91/16432、
U.S.PatentNo.5,380,831、U.S.Patent No.5,436,391、Perlack等，1991，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 88：3324-3328；和Murray等，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。
修饰成1)含有高表达植物基因优选的密码子；2)含有在植物中大量发现的核苷酸碱基
组成的A+T含量；3)形成植物起始序列；或4)去除导致RNA的不稳定、不正确的多腺苷
酸化、降解和终止，或形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列。可以通过利用在植物中
普遍的或在特定中的植物密码子使用分布频率提高SRP核酸在植物中的表达。优化植物
中核酸表达的方法可见于EPA0359472、EPA0385962、 PCT Application No.WO91/16432、
U.S.PatentNo.5,380,831、U.S.Patent No.5,436,391、Perlack等，1991，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 88：3324-3328；和Murray等，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。
[0281] 本文使用的“优选密码子的使用频率”指特定宿主细胞在指定给定氨基酸的核苷酸密码子使用上表现出的优先性。为鉴定基因中特定密码子的使用频率，用该密码子在基
因中出现的次数除以该基因中指定同一氨基酸的全部密码子出现的总次数。类似地，可以
通过将宿主细胞表达的大量基因中优选密码子使用的频率平均化而计算宿主细胞所显示
出的优选密码子的使用频率。该分析优选限制在宿主细胞高表达的基因中。首先测定宿主
细胞中单密码子使用频率的偏差百分数，然后得到全部密码子的平均偏差，从而计算宿主
细胞使用的合成基因优选密码子使用频率的偏差百分数的计算。如本文所定义，计算包括
唯一密码子(即ATG和TGG)。一般来说，使用等式1A＝n＝1ZXn-YnXn乘以100Z计算宿
主细胞中优化基因的密码子使用的总体平均偏差，其中Xn＝宿主细胞中密码子n的使用频
率；Yn ＝合成基因中密码子n的使用频率；n代表指定氨基酸的单个密码子；总密码子数为
Z。密码子使用频率的总体偏差——A对于全部氨基酸应优选小于约25％，更优选小于约
10％。
因中出现的次数除以该基因中指定同一氨基酸的全部密码子出现的总次数。类似地，可以
通过将宿主细胞表达的大量基因中优选密码子使用的频率平均化而计算宿主细胞所显示
出的优选密码子的使用频率。该分析优选限制在宿主细胞高表达的基因中。首先测定宿主
细胞中单密码子使用频率的偏差百分数，然后得到全部密码子的平均偏差，从而计算宿主
细胞使用的合成基因优选密码子使用频率的偏差百分数的计算。如本文所定义，计算包括
唯一密码子(即ATG和TGG)。一般来说，使用等式1A＝n＝1ZXn-YnXn乘以100Z计算宿
主细胞中优化基因的密码子使用的总体平均偏差，其中Xn＝宿主细胞中密码子n的使用频
率；Yn ＝合成基因中密码子n的使用频率；n代表指定氨基酸的单个密码子；总密码子数为
Z。密码子使用频率的总体偏差——A对于全部氨基酸应优选小于约25％，更优选小于约
10％。
[0282] 因此，可以优化SRP核酸以使密码子使用分布频率与高表达植物基因的偏差优选不大于25％、更优选不大于约10％。另外，需要考虑简并的第三碱基的G+C含量百分数
(单子叶植物在该位置表现出对G+C的偏好，而双子叶植物则不然)。还已知双子叶植物中
XCG(其中X为A、T、C或G)是最不优选的密码子，而XTA在单子叶植物和双子叶植物中都
应该避免。优化的本发明SRP核酸同样优选与选定植物(即欧洲油菜、大豆或稻)接近的
CG和TA二联子回避指数。更优选与宿主偏差不超过10-15％的指数。
(单子叶植物在该位置表现出对G+C的偏好，而双子叶植物则不然)。还已知双子叶植物中
XCG(其中X为A、T、C或G)是最不优选的密码子，而XTA在单子叶植物和双子叶植物中都
应该避免。优化的本发明SRP核酸同样优选与选定植物(即欧洲油菜、大豆或稻)接近的
CG和TA二联子回避指数。更优选与宿主偏差不超过10-15％的指数。
[0283] 除了编码前述SRP的核酸分子以外，本发明的另一方面与其反义核酸分子相关。反义多核苷酸被认为通过与靶多核苷酸特异结合并干扰靶多核苷酸的转录、剪接、转运、翻
译和/或稳定性而抑制靶多核苷酸的基因表 达。现有技术中已描述了将反义多核苷酸靶
向染色体DNA、原初RNA转录物或加工的mRNA的方法。优选的靶区域包括剪接位点、翻译起
始密码子、翻译终止密码子和可读框内的其他序列。
译和/或稳定性而抑制靶多核苷酸的基因表 达。现有技术中已描述了将反义多核苷酸靶
向染色体DNA、原初RNA转录物或加工的mRNA的方法。优选的靶区域包括剪接位点、翻译起
始密码子、翻译终止密码子和可读框内的其他序列。
[0284] 本发明的术语“反义”指含有足以与基因的全部或部分、原初转录物或加工的mRNA互补以干扰内源基因表达的多核苷酸的核酸。“互补”多核苷酸能够根据标准Watson-Crick
互补原则形成碱基配对。具体地，嘌呤与嘧啶碱基配对形成组合，鸟嘌呤与胞嘧啶配对
(G:C)且腺嘌呤与胸腺嘧啶(在DNA中)(A:T)或尿嘧啶(在RNA中)(A:U)配对。应该理
解，只要两个多核苷酸各含有至少一个与另一多核苷酸基本互补的区域，即使它们并不彼
此完全互补也可以互相杂交。术语“反义核酸”包括单链RNA以及可转录产生反义RNA的
双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能够与原初转录物或编码多肽的mRNA选择性杂交的
反义RNA分子，所述多肽与序列图1a、1b或1c的多肽具有至少80％序列同一性。
互补原则形成碱基配对。具体地，嘌呤与嘧啶碱基配对形成组合，鸟嘌呤与胞嘧啶配对
(G:C)且腺嘌呤与胸腺嘧啶(在DNA中)(A:T)或尿嘧啶(在RNA中)(A:U)配对。应该理
解，只要两个多核苷酸各含有至少一个与另一多核苷酸基本互补的区域，即使它们并不彼
此完全互补也可以互相杂交。术语“反义核酸”包括单链RNA以及可转录产生反义RNA的
双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能够与原初转录物或编码多肽的mRNA选择性杂交的
反义RNA分子，所述多肽与序列图1a、1b或1c的多肽具有至少80％序列同一性。
[0285] 反义核酸可以与完整SRP编码链互补或只与其一部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码SRP的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指含有
翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。在另一实施方案中，反义核酸分子与编码SRP
的核苷酸序列编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”指编码区两侧不翻译成氨基酸
的5’和3’序列(即也称为5’和3’非翻译区)。反义核酸分子可以与SRP mRNA的完整编
码区互补，但更优选为只与SRP mRNA编码区或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，反
义寡核苷酸可以与PKSRP mRNA反义起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸的长度可以
为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。一般地，本发明的反义分子含有与
序列图1a、1b或1c的核酸之一的至少14个连续核苷酸具有60-100％序列同一性的RNA。
优选的序列同一性为至少70％、更优选75％、80％、85％、90％、95％、98％并最优选99％。
翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。在另一实施方案中，反义核酸分子与编码SRP
的核苷酸序列编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”指编码区两侧不翻译成氨基酸
的5’和3’序列(即也称为5’和3’非翻译区)。反义核酸分子可以与SRP mRNA的完整编
码区互补，但更优选为只与SRP mRNA编码区或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，反
义寡核苷酸可以与PKSRP mRNA反义起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸的长度可以
为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。一般地，本发明的反义分子含有与
序列图1a、1b或1c的核酸之一的至少14个连续核苷酸具有60-100％序列同一性的RNA。
优选的序列同一性为至少70％、更优选75％、80％、85％、90％、95％、98％并最优选99％。
[0286] 可以使用本领域已知的方法，利用化学合成和酶连接反应构建本发明的反义核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学 合成反义核酸(例如反
义寡核苷酸)，设计所述修饰的核苷酸是为了提高分子的生物稳定性或提高反义和有义核
酸间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶替换的核苷酸。可
以用于产生反义核酸的修饰的核苷酸实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、
5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨
基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、双氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、
次黄苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺
嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基
氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧
基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸
(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧
啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲
基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w及2，6-二氨基嘌呤。另
外，可以使用以反义方向(即从插入核酸转录产生的RNA将为目的靶核酸的反义方向，下文
有具体描述)将核酸亚克隆到其中的表达载体来生物产生反义核酸。
义寡核苷酸)，设计所述修饰的核苷酸是为了提高分子的生物稳定性或提高反义和有义核
酸间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶替换的核苷酸。可
以用于产生反义核酸的修饰的核苷酸实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、
5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨
基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、双氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、
次黄苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺
嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基
氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧
基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸
(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧
啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲
基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w及2，6-二氨基嘌呤。另
外，可以使用以反义方向(即从插入核酸转录产生的RNA将为目的靶核酸的反义方向，下文
有具体描述)将核酸亚克隆到其中的表达载体来生物产生反义核酸。
[0287] 在又一实施方案中，本发明的反义核酸分子为α-端基异构核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特异双链杂合体，其中与常规β-单元相反，两条链为互相
平行(Gautier C等，1987，Nucleic Acids Res 15：6625-6641)。反义核酸分子也可以包
含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic Acids Res 15：6131-6148)或嵌合
RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett 215：327-330)。
平行(Gautier C等，1987，Nucleic Acids Res 15：6625-6641)。反义核酸分子也可以包
含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic Acids Res 15：6131-6148)或嵌合
RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett 215：327-330)。
[0288] 本发明的反义核酸分子一般施用于细胞或原位产生，以使其与编码SRP的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，并例如通过抑制转录和/或翻译抑制多肽的表达。可
以通过常规核苷酸互补形成稳定的双链体，或者例如对于与DNA双链体结合的反义核酸分
子，通过在双螺旋的大沟中的特异相互作用进行杂交。可以修饰反义分子以使其与所选细
胞表面表 达的受体或抗原特异结合(例如通过将与细胞表面受体或抗原结合的多肽或抗
体连接到反义核酸分子上)。反义核酸分子也可以使用本文所述的载体递送到细胞。为使
反义分子达到足够的胞内浓度，优选将反义核酸分子置于强原核、病毒或真核(包括植物)
启动子控制下的载体构建体。
以通过常规核苷酸互补形成稳定的双链体，或者例如对于与DNA双链体结合的反义核酸分
子，通过在双螺旋的大沟中的特异相互作用进行杂交。可以修饰反义分子以使其与所选细
胞表面表 达的受体或抗原特异结合(例如通过将与细胞表面受体或抗原结合的多肽或抗
体连接到反义核酸分子上)。反义核酸分子也可以使用本文所述的载体递送到细胞。为使
反义分子达到足够的胞内浓度，优选将反义核酸分子置于强原核、病毒或真核(包括植物)
启动子控制下的载体构建体。
[0289] 作为反义多核苷酸的代替，可以使用核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)来降低SRP多肽的表达。“核酶”是指具有核酸酶活性的基于RNA的催化性酶，其能够切割与其
具有互补区的单链核酸(如mRNA)。核酶(例如Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：
585-591中描述的锤头状核酶)可用于催化性切割SRP mRNA转录物以抑制SRP mRNA的翻
译。可以在如本文公开的(即序列图1a、1b或1c)SRP cDNA核苷酸序列的基础上，或在根据
本文教导的方法分离的异源序列的基础上设计对SRP编码基因具有特异性的核酶。例如，
可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与将切
割的SRP编码mRNA中的核苷酸序列互补。参阅例如Cech等的U.S.Patent No.4,987,071
和5,116,742.另外，SRP mRNA可以用于从RNA分子库中选出具有特异的核酸酶活性的催
化性RNA。参阅例如Bartel，D.和Szostak，J.W.，1993，Science 261：1411-1418.在优选
的实施方案中，核酶含有与靶RNA的一部分具有100％互补性的至少7、8、9、10、12、14、16、
18或20个核苷酸，更优选7或8个核苷酸的部分。产生核酶的方法为本领域技术人员所公
知。参阅例如U.S.Patent No.6,025,167、5,773,260和5,496,698。
具有互补区的单链核酸(如mRNA)。核酶(例如Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：
585-591中描述的锤头状核酶)可用于催化性切割SRP mRNA转录物以抑制SRP mRNA的翻
译。可以在如本文公开的(即序列图1a、1b或1c)SRP cDNA核苷酸序列的基础上，或在根据
本文教导的方法分离的异源序列的基础上设计对SRP编码基因具有特异性的核酶。例如，
可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与将切
割的SRP编码mRNA中的核苷酸序列互补。参阅例如Cech等的U.S.Patent No.4,987,071
和5,116,742.另外，SRP mRNA可以用于从RNA分子库中选出具有特异的核酸酶活性的催
化性RNA。参阅例如Bartel，D.和Szostak，J.W.，1993，Science 261：1411-1418.在优选
的实施方案中，核酶含有与靶RNA的一部分具有100％互补性的至少7、8、9、10、12、14、16、
18或20个核苷酸，更优选7或8个核苷酸的部分。产生核酶的方法为本领域技术人员所公
知。参阅例如U.S.Patent No.6,025,167、5,773,260和5,496,698。
[0290] 本文使用的术语“dsRNA”指含有两条RNA链的RNA杂合体。dsRNA的结构可以是线性或环形。在优选的实施方案中，dsRNA特异于编码序列图1a、1b或1c多肽或与序列图
1a、1b或1c多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸。杂交的RNA可以是基本或
完全互补的。“基本互补”指当两条杂交的RNA如前述使用BLAST程序最佳匹配时，杂交部
分至少95％互补。优选的dsRNA长度为至少100个碱基对。一般地，杂交的RNA应为同样
长度，没有突出的5’或3’末端和缺口。然而，本发明的方法中也可以使用具有长至100个
核苷酸的5’或3’突出的dsRNA。
1a、1b或1c多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸。杂交的RNA可以是基本或
完全互补的。“基本互补”指当两条杂交的RNA如前述使用BLAST程序最佳匹配时，杂交部
分至少95％互补。优选的dsRNA长度为至少100个碱基对。一般地，杂交的RNA应为同样
长度，没有突出的5’或3’末端和缺口。然而，本发明的方法中也可以使用具有长至100个
核苷酸的5’或3’突出的dsRNA。
[0291] dsRNA可以含有核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物(如2’-O-甲基核糖基残基)或其组合。参阅例如U.S.Patent No.4,130,641和4,024,222。U.S.patent 4,283,393中描
述了dsRNA多核糖次黄苷酸：多核糖胞苷酸。产生和使用dsRNA的方法为本领域所公知。
一种方法包括在体内或在单一体外反应混合物中的同时转录两条互补DNA链。参阅例如
U.S.Patent No.5,795,715。在一个实施方案中，可以通过标准转化方法直接将dsRNA引入
植物或植物细胞。另外，可以通过转录两条互补的RNA在植物细胞中表达dsRNA。
述了dsRNA多核糖次黄苷酸：多核糖胞苷酸。产生和使用dsRNA的方法为本领域所公知。
一种方法包括在体内或在单一体外反应混合物中的同时转录两条互补DNA链。参阅例如
U.S.Patent No.5,795,715。在一个实施方案中，可以通过标准转化方法直接将dsRNA引入
植物或植物细胞。另外，可以通过转录两条互补的RNA在植物细胞中表达dsRNA。
[0292] 抑制内源基因表达的其他方法为本领域所公知，如形成三螺旋(Moser等，1987，Science 238：645-650和Cooney等，1988，Science 241：456-459)和共抑制(Napoli等，
1990，The Plant Cell 2：279-289)。局部和全长cDNA已经用于内源基因的共抑制。参阅
例如U.S.Patent No.4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等，
1990，The Plant Cell 2：291-299；Smith等，1990，Mol.Gen.Genetics 224：477-481 和
Napoli等，1990，The Plant Cell 2：279-289。
1990，The Plant Cell 2：279-289)。局部和全长cDNA已经用于内源基因的共抑制。参阅
例如U.S.Patent No.4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等，
1990，The Plant Cell 2：291-299；Smith等，1990，Mol.Gen.Genetics 224：477-481 和
Napoli等，1990，The Plant Cell 2：279-289。
[0293] 对于有义抑制，认为引入有义多核苷酸能阻断相应靶基因的转录。有义多核苷酸与靶植物基因或RNA具有至少65％的序列同一性。优选的同一性百分数为至少80％、90％、
95％或更高。引入的有义多核苷酸不需要对应于靶基因或转录物的全长。有义多核苷酸优
选与序列图1a、1b或1c的核酸之一具有至少100个连续核苷酸的至少65％序列同一性。
鉴定区域可以含有内含子和/或外显子和非翻译区。引入的有义多核苷酸可以在植物细胞
中瞬时存在，或稳定整合进植物染色体或外染色体复制子。
95％或更高。引入的有义多核苷酸不需要对应于靶基因或转录物的全长。有义多核苷酸优
选与序列图1a、1b或1c的核酸之一具有至少100个连续核苷酸的至少65％序列同一性。
鉴定区域可以含有内含子和/或外显子和非翻译区。引入的有义多核苷酸可以在植物细胞
中瞬时存在，或稳定整合进植物染色体或外染色体复制子。
[0294] 此外，本发明的范围意图包括来自相同或其他物种的编码SRP的核酸分子(如SRP类似物、直系同源物和旁系同源物)。本文使用的术语“类似物”指具有相同或相似功能，
但分别在无关物种中进化的两个核酸。本文使用的术语“直系同源物”指来源于不同物种，
从共同的祖先基因通过物种形成进化而来的两个核酸。通常，直系同源物编码具有相同或
相似功能的蛋白质。同时本文使用的术语“旁系同源物”指通过基因组中的复制 而相关的
两个核酸。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可能是相关的(Tatusov，R.L.等
1997Science 278(5338)：631-637)。天然存在的胁迫相关蛋白质的类似物、直系同源物和
旁系同源物可通过翻译后修饰、通过氨基酸序列的差异或二者区别于天然存在的胁迫相关
蛋白质。翻译后修饰包括多肽在体内和体外的化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基
化，这些修饰可以发生在多肽合成或加工过程中或用分离的修饰酶随后处理。具体而言，本
发明的直系同源物与天然存在的胁迫相关蛋白质氨基酸序列的全部或一部分表现出至少
80-85％、更优选90％、91％、92％、93％、94％、最优选95％、96％、97％、98％或甚至99％的
同一性或同源性，并表现出与胁迫相关蛋白质相似的功能。本发明的直系同源物也优选能
够在植物中参与胁迫反应。
但分别在无关物种中进化的两个核酸。本文使用的术语“直系同源物”指来源于不同物种，
从共同的祖先基因通过物种形成进化而来的两个核酸。通常，直系同源物编码具有相同或
相似功能的蛋白质。同时本文使用的术语“旁系同源物”指通过基因组中的复制 而相关的
两个核酸。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可能是相关的(Tatusov，R.L.等
1997Science 278(5338)：631-637)。天然存在的胁迫相关蛋白质的类似物、直系同源物和
旁系同源物可通过翻译后修饰、通过氨基酸序列的差异或二者区别于天然存在的胁迫相关
蛋白质。翻译后修饰包括多肽在体内和体外的化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基
化，这些修饰可以发生在多肽合成或加工过程中或用分离的修饰酶随后处理。具体而言，本
发明的直系同源物与天然存在的胁迫相关蛋白质氨基酸序列的全部或一部分表现出至少
80-85％、更优选90％、91％、92％、93％、94％、最优选95％、96％、97％、98％或甚至99％的
同一性或同源性，并表现出与胁迫相关蛋白质相似的功能。本发明的直系同源物也优选能
够在植物中参与胁迫反应。
[0295] 除了可以存在于种群中的胁迫相关蛋白质天然存在的变体以外，本领域技术人员还应理解，可以通过突变在序列图1a、1b、1c的核苷酸序列中引入变化，从而导致所编码的
胁迫相关蛋白质的不改变其功能能力或增强其功能能力的氨基酸序列改变。例如可以在图
1的序列中产生导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸替换的核苷酸替换。“非必需”氨基酸
残基是可以在胁迫相关蛋白质之一的野生型序列中被改变而不改变该蛋白质活性的残基，
而“必需”氨基酸残基是胁迫相关蛋白质活性所需要的。然而，其他氨基酸残基(例如在具
有SRP活性的结构域中不保守或仅半保守的氨基酸残基)可能不是活性必需的，因此有可
能适合在不改变SRP活性的条件下发生改变。
胁迫相关蛋白质的不改变其功能能力或增强其功能能力的氨基酸序列改变。例如可以在图
1的序列中产生导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸替换的核苷酸替换。“非必需”氨基酸
残基是可以在胁迫相关蛋白质之一的野生型序列中被改变而不改变该蛋白质活性的残基，
而“必需”氨基酸残基是胁迫相关蛋白质活性所需要的。然而，其他氨基酸残基(例如在具
有SRP活性的结构域中不保守或仅半保守的氨基酸残基)可能不是活性必需的，因此有可
能适合在不改变SRP活性的条件下发生改变。
[0296] 因此，本发明另一方面涉及编码胁迫相关蛋白质的核酸分子，所述胁迫相关蛋白质含有在胁迫相关蛋白质活性非必需的氨基酸残基处的改变。这些SRP在氨基酸序列上与
序列图1a、1b或1c的序列有差异，但仍保留至少一项本文所述的胁迫相关蛋白质活性。在
一个实施方案中，分离的核酸分子含有编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质含有与
序列图1a、1b或1c的氨基酸序列至少50％同源的氨基酸序列。核酸分子编码的蛋白质优选
与序列图1a、1b或1c的序列之一至少约50-60％同源、更优选与 序列图1a、1b或1c的序
列之一至少约60-70％同源、甚至更优选与序列图1a、1b或1c的序列之一至少约70-80％、
80-90％、更优选与序列图1a、1b或1c的序列之一90％、91％、92％、93％、94％同源，并最优
选与序列图1a、1b或1c的序列之一至少约96％、97％、98％或99％同源。本发明优选的胁
迫相关蛋白质同源物优选在植物中能够参与胁迫耐性反应。同源性(＝同一性)在完整氨
基酸范围上计算。使用的程序为PileUp(J.Mol.Evolution.，25(1987)，351-360，Higgins
等，CABIOS，51989：151-153)。
序列图1a、1b或1c的序列有差异，但仍保留至少一项本文所述的胁迫相关蛋白质活性。在
一个实施方案中，分离的核酸分子含有编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质含有与
序列图1a、1b或1c的氨基酸序列至少50％同源的氨基酸序列。核酸分子编码的蛋白质优选
与序列图1a、1b或1c的序列之一至少约50-60％同源、更优选与 序列图1a、1b或1c的序
列之一至少约60-70％同源、甚至更优选与序列图1a、1b或1c的序列之一至少约70-80％、
80-90％、更优选与序列图1a、1b或1c的序列之一90％、91％、92％、93％、94％同源，并最优
选与序列图1a、1b或1c的序列之一至少约96％、97％、98％或99％同源。本发明优选的胁
迫相关蛋白质同源物优选在植物中能够参与胁迫耐性反应。同源性(＝同一性)在完整氨
基酸范围上计算。使用的程序为PileUp(J.Mol.Evolution.，25(1987)，351-360，Higgins
等，CABIOS，51989：151-153)。
[0297] 序列图1a、1b或1c中给出的序列的同源物另外还应理解为指例如同源物、类似物、直系同源物和旁系同源物，其在衍生的氨基酸水平上具有至少30％的同源性(＝同一
性)，优选至少50％、60％、70％或80％的同源性、特别优选至少85％的同源性、尤其优选至
少90％、91％、92％、93％、94％的同源性、最优选95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
同源性(＝同一性)在完整氨基酸范围上计算。使用的程序为PileUp(J.Mol.Evolution.，
25(1987)，351-360，Higgins等，CABIOS，51989：151-153)以及作为GCG软件包[Genetics
Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)]一部分的Gap
和BestFit程序[分别是Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)以及Smith
和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))。使用如下参数：缺口权重：8、长度权重：
2，在总序列长度上用BestFit或Gap程序(优选Gap)计算前述序列同源性百分数。
性)，优选至少50％、60％、70％或80％的同源性、特别优选至少85％的同源性、尤其优选至
少90％、91％、92％、93％、94％的同源性、最优选95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
同源性(＝同一性)在完整氨基酸范围上计算。使用的程序为PileUp(J.Mol.Evolution.，
25(1987)，351-360，Higgins等，CABIOS，51989：151-153)以及作为GCG软件包[Genetics
Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)]一部分的Gap
和BestFit程序[分别是Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)以及Smith
和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))。使用如下参数：缺口权重：8、长度权重：
2，在总序列长度上用BestFit或Gap程序(优选Gap)计算前述序列同源性百分数。
[0298] 也应包括变体，特别是可以从序列图1a、1b或1c所示的序列通过核苷酸缺失、插入或替换得到，并且衍生的合成蛋白质的酶活性得到保留或增强的功能性变体。
[0299] 可以通过向序列图1a、1b或1c的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替换、添加或缺失，从而向编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸替换、添加或缺失，由此产生编码
与序列图1a、1b或1c的蛋白质序列同源的胁迫相关蛋白质的分离核酸分子。可以通过标
准技术(如定向诱变和PCR-介导的诱变)向序列图1a、1b或1c的序列之一引入突变。在
EuropeanPublication EP-A-0909821中公开的诱变酶的另一途径是使用特异的大肠杆菌
菌株XL1-Red产生突变体和改变的酶活性的方法。
与序列图1a、1b或1c的蛋白质序列同源的胁迫相关蛋白质的分离核酸分子。可以通过标
准技术(如定向诱变和PCR-介导的诱变)向序列图1a、1b或1c的序列之一引入突变。在
EuropeanPublication EP-A-0909821中公开的诱变酶的另一途径是使用特异的大肠杆菌
菌株XL1-Red产生突变体和改变的酶活性的方法。
[0300] 优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”指是用具有相似侧链的氨基酸取代氨基酸残基的替换。
[0301] 本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如门冬氨酸、谷氨
酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨
酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨
酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨
酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，
胁迫相关蛋白质中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的氨基酸取代。另
外，在另一实施方案中，可以如通过饱和诱变在胁迫相关蛋白质的全部编码序列或部分随
机引入突变，可以筛选所得突变体的本文所述的胁迫相关蛋白质活性以鉴定保留胁迫相关
蛋白质活性或表现出增强的胁迫相关蛋白质活性的突变体。对序列图1a、1b或1c的序列
之一进行诱变后，可以重组表达编码的多肽并可以如以下实施例所述通过分析表达该多肽
的植物的胁迫耐性来测定多肽的活性。
酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨
酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨
酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨
酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，
胁迫相关蛋白质中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的氨基酸取代。另
外，在另一实施方案中，可以如通过饱和诱变在胁迫相关蛋白质的全部编码序列或部分随
机引入突变，可以筛选所得突变体的本文所述的胁迫相关蛋白质活性以鉴定保留胁迫相关
蛋白质活性或表现出增强的胁迫相关蛋白质活性的突变体。对序列图1a、1b或1c的序列
之一进行诱变后，可以重组表达编码的多肽并可以如以下实施例所述通过分析表达该多肽
的植物的胁迫耐性来测定多肽的活性。
[0302] 确定基因转录水平(可用于翻译成基因产物的mRNA量的指针)的有用的方法是进行Northern印迹(参考例如Ausubel等，1988《CurrentProtocols in Molecular
Biology》，Wiley：New York)。该信息至少部分说明了基因的转录程度。可以通过本领域
所熟知的若干方法(例如Bormann，E.R.等，1992 Mol.Microbiol.6：317-326中所述)从
细胞、组织或器官中制备总细胞RNA。为评估从该mRNA翻译的蛋白质的存在或相对量，可
以使用标准技术(如Western印迹)。这些技术为本领域普通技术人员所熟知(参阅例如
Ausubel等，1988《Current Protocols in Molecular Biology》， Wiley：New York)。
Biology》，Wiley：New York)。该信息至少部分说明了基因的转录程度。可以通过本领域
所熟知的若干方法(例如Bormann，E.R.等，1992 Mol.Microbiol.6：317-326中所述)从
细胞、组织或器官中制备总细胞RNA。为评估从该mRNA翻译的蛋白质的存在或相对量，可
以使用标准技术(如Western印迹)。这些技术为本领域普通技术人员所熟知(参阅例如
Ausubel等，1988《Current Protocols in Molecular Biology》， Wiley：New York)。
[0303] 本发明还涉及含有SRP编码核酸的植物表达盒，所述核酸选自与调节序列和/或靶向序列有效连接的SEQ IDs No.XXX序列和/或其同源物或部分。
[0304] 另外，本发明的目的为含有SRP编码核酸的表达载体，所述核酸选自序列图1a、1b或1c的核酸序列和/或其同源物或部分或如前述的植物表达盒，由此SRP编码核酸在宿主
细胞中的表达导致与相应未转化野生型宿主细胞相比对环境胁迫提高的耐性，所述提高优
选通过改变代谢活性实现。
细胞中的表达导致与相应未转化野生型宿主细胞相比对环境胁迫提高的耐性，所述提高优
选通过改变代谢活性实现。
[0305] 本发明另外提供含有如前述的胁迫相关蛋白质编码核酸的分离的重组表达载体，其中载体或胁迫相关蛋白质编码核酸在宿主细胞中的分别表达导致与未转化野生型宿主
细胞相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性，所述提高优选通过改变代谢活性实现。本文
使用的术语“载体”指能够转运与其相连的其他核酸分子的核酸分子。一种类型的载体为
“质粒”，指可在其中连接进额外DNA片段的环形双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，
其中可以将额外的DNA片段连接进病毒基因组中。其他类型的载体可以为线性核酸序列
(例如转座子，其是可以将自身复制和插入的DNA片段)。已经发现了两种类型的转座子：
已知为插入序列的简单转座子和具有若干基因及转座所需基因的复合转座子。
细胞相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性，所述提高优选通过改变代谢活性实现。本文
使用的术语“载体”指能够转运与其相连的其他核酸分子的核酸分子。一种类型的载体为
“质粒”，指可在其中连接进额外DNA片段的环形双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，
其中可以将额外的DNA片段连接进病毒基因组中。其他类型的载体可以为线性核酸序列
(例如转座子，其是可以将自身复制和插入的DNA片段)。已经发现了两种类型的转座子：
已知为插入序列的简单转座子和具有若干基因及转座所需基因的复合转座子。
[0306] 某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起始点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细
胞后整合进宿主细胞基因组，因而可以随宿主基因组复制。另外，某些载体能够指导与其有
效连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使
用的表达载体常为质粒形式。由于质粒是最普遍使用的载体形式，因此在本说明书中“质
粒”和“载体”可以互换使用。然而本发明旨在包括这些提供相同功能的其他形式的表达载
体，如病毒载体(例如复制缺损型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
胞后整合进宿主细胞基因组，因而可以随宿主基因组复制。另外，某些载体能够指导与其有
效连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使
用的表达载体常为质粒形式。由于质粒是最普遍使用的载体形式，因此在本说明书中“质
粒”和“载体”可以互换使用。然而本发明旨在包括这些提供相同功能的其他形式的表达载
体，如病毒载体(例如复制缺损型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0307] 植物表达盒优选含有能在植物细胞中驱动基因表达并通过有效连接而 使每一序列能执行其功能(例如通过多腺苷酸化信号的转录终止)的调节序列。优选的多腺苷
酸化信号为来源于根瘤农杆菌T-DNA，例如已知为是Ti-质粒pTiACH5章鱼碱合酶的基因
3(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)或其功能等效物，但所有其他在植物中有功能活性的终
止子也都是合适的。由于植物基因表达常常不仅限于转录水平，植物表达盒优选包含其他
有效连接的序列，如翻译增强子(例如含有来源于烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列并提
高多肽/RNA比率的超驱动序列(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch 15：8693-8711)。
酸化信号为来源于根瘤农杆菌T-DNA，例如已知为是Ti-质粒pTiACH5章鱼碱合酶的基因
3(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)或其功能等效物，但所有其他在植物中有功能活性的终
止子也都是合适的。由于植物基因表达常常不仅限于转录水平，植物表达盒优选包含其他
有效连接的序列，如翻译增强子(例如含有来源于烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列并提
高多肽/RNA比率的超驱动序列(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch 15：8693-8711)。
[0308] 植物基因的表达必须与使基因以适时的、细胞或组织特异性的方式表达的适当启动子连接。优选驱动组成型表达的启动子(Benfey等，1989EMBO J.8：2195-2202)如
来自植物病毒的启动子，如35S CaMV(Franck等，1980Cell 21：285-294)、19S CaMV(参阅
U.S.Patent No.5352605和PCT Application No.WO8402913)或植物启动子，如U.S.Patent
No.4,962,028中所述的核酮糖二磷酸羧化-加氧酶小亚基的启动子。
来自植物病毒的启动子，如35S CaMV(Franck等，1980Cell 21：285-294)、19S CaMV(参阅
U.S.Patent No.5352605和PCT Application No.WO8402913)或植物启动子，如U.S.Patent
No.4,962,028中所述的核酮糖二磷酸羧化-加氧酶小亚基的启动子。
[0309] 其他有利的调节序列包括例如植物启动子，如CaMV/35S(Franck等，Cell21(1980)285-294)、PRP1(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993))、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、
B33、LEB4、nos或泛素、油菜籽蛋白或菜豆蛋白启动子。这一连接中同样有利的是诱导型启
动子，如EP-A-0388186(苯磺胺诱导)、Plant J.2，1992：397-404(Gatz等，四环素诱导)、
EP-A-0335528(脱落酸诱导)或WO93/21334(乙醇或环己烯醇诱导)中所述的启动子。另
外有用的植物启动子为马铃薯胞质FBPase启动子或ST-LS1启动子(Stockhaus等，EMBO
J.8，1989，2445)、大豆磷核糖焦磷酸氨基转移酶启动子(gene bank登录号U87999)或
EP-A-0249676中描述的noden特异性启动子。其他特别有利的启动子为可以用于单子叶植
物或双子叶植物的种子特异性启动子，描述于US5,608,152(油菜籽来源的油菜籽蛋白启
动子)、WO98/45461(拟南芥来源的菜豆蛋白启动子)、US5,504,200(菜豆来源的菜豆蛋白
启动子)、WO91/13980(芸苔来源的Bce4启动子)和Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：
233-239(豆科来源的LEB4 启动子)。所述启动子可用于双子叶植物。以下用于单子叶植
物的启动子为例如大麦来源的Ipt-2或Ipt-1启动子(WO95/15389和WO95/23230)或大麦
来源的大麦蛋白启动子。其他有用的启动子描述于WO99/16890。
B33、LEB4、nos或泛素、油菜籽蛋白或菜豆蛋白启动子。这一连接中同样有利的是诱导型启
动子，如EP-A-0388186(苯磺胺诱导)、Plant J.2，1992：397-404(Gatz等，四环素诱导)、
EP-A-0335528(脱落酸诱导)或WO93/21334(乙醇或环己烯醇诱导)中所述的启动子。另
外有用的植物启动子为马铃薯胞质FBPase启动子或ST-LS1启动子(Stockhaus等，EMBO
J.8，1989，2445)、大豆磷核糖焦磷酸氨基转移酶启动子(gene bank登录号U87999)或
EP-A-0249676中描述的noden特异性启动子。其他特别有利的启动子为可以用于单子叶植
物或双子叶植物的种子特异性启动子，描述于US5,608,152(油菜籽来源的油菜籽蛋白启
动子)、WO98/45461(拟南芥来源的菜豆蛋白启动子)、US5,504,200(菜豆来源的菜豆蛋白
启动子)、WO91/13980(芸苔来源的Bce4启动子)和Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：
233-239(豆科来源的LEB4 启动子)。所述启动子可用于双子叶植物。以下用于单子叶植
物的启动子为例如大麦来源的Ipt-2或Ipt-1启动子(WO95/15389和WO95/23230)或大麦
来源的大麦蛋白启动子。其他有用的启动子描述于WO99/16890。
[0310] 原则上可以和前述新方法中提到的那些一样使用所有天然启动子及其调节序列。另外使用合成启动子也是可能并有利的。
[0311] 基因构建体还可以舍有用于插入生物的并例如与胁迫抗性相关的其他基因。在宿主生物中插入并表达调节基因是可能并有利的，调节基因为例如诱导子、阻抑子或通过其
酶活性介入调节的酶的基因，或生物合成途径的全部基因中的一个或多个。这些基因在来
源上可以是异源或同源的。插入的基因可以具有其自身的启动子或与序列图1a、1b或1c
的核酸序列或其同源物置于同一启动子的控制之下。
酶活性介入调节的酶的基因，或生物合成途径的全部基因中的一个或多个。这些基因在来
源上可以是异源或同源的。插入的基因可以具有其自身的启动子或与序列图1a、1b或1c
的核酸序列或其同源物置于同一启动子的控制之下。
[0312] 为了表达存在的其他基因，基因构建体有利的含有额外的3’和/或5’端调节序列，以增强表达。取决于所选宿主生物和基因，为最佳表达而选择调节序列。
[0313] 这些调节序列旨在可以实现如前述的基因特异性表达和蛋白质表达。取决于宿主生物，这可以指例如基因只在诱导后表达或过表达，或立即表达和/或过表达。
[0314] 另外优选调节序列或因子对引入基因的表达具有有利的影响，并因而提高表达。以这种方式可以通过使用强转录信号(如启动子和/或增强子)在转录水平有利的增强调
节元件。然而，另外也可以通过例如提高mRNA的稳定性增强翻译。
节元件。然而，另外也可以通过例如提高mRNA的稳定性增强翻译。
[0315] 植物基因表达盒中使用的其他优选序列为引导基因产物到其适当的细胞区室所必需的靶向序列(可参阅Kermode，1996 Crit.Rev.Plant Sci.15(4)：285-423的综述及
其引用的参考文献)，所述区室如液泡、细胞核、所有类型的质体(如造粉体、叶绿体、色质
体)、胞外空间、线粒体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞中的其他区室。
其引用的参考文献)，所述区室如液泡、细胞核、所有类型的质体(如造粉体、叶绿体、色质
体)、胞外空间、线粒体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞中的其他区室。
[0316] 也可以通过诱导型启动子促进植物基因表达(可参阅Gatz，1997Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.48：89-108的综述)。当基因需要以时间 特异性方式表达时，化
学诱导型启动子特别合适。
学诱导型启动子特别合适。
[0317] 表1列出了可以用于调节胁迫相关蛋白质核酸编码序列转录的若干启动子实例。
[0318] 表1：植物中组织特异性和胁迫诱导的启动子的实例
[0319]表达 参考文献
Cor78-冷、干旱、盐、 ABA、创伤诱导 Ishitani等，Plant Cell 9： 1935-1949(1997). Yamaguchi-Shinozaki 和 Shinozaki，Plant Cell 6：251-264 (1994)
Rci2A-冷、脱水诱导 Capel等Plant Physiol 115： 569-576(1997)
Rd22-干旱、盐 Yamaguchi-Shinozaki 和 Shinozaki，Mol Gen Genet 238： 17-25(1993)
Cor15A-冷、脱水、ABA Baker等，Plant Mol.Biol.24： 701-713(1994)
GH3-生长素诱导 Liu等，Plant Cell 6：645-657 (1994)
ARSK1-根，盐诱导 Hwan和Goodman，Plant J 8： 37-43(1995).
PtxA-根，盐诱导 GenBank登录号X67427
SbHRGP3-根特异 Ahn等，Plant Cell 8： 1477-1490(1998)
KST1-保卫细胞特异性 Plesch等，Plant Journal.28 (4)：455-64，(2001)
KAT1-保卫细胞特异性 Plesch等，Gene 249：83-89
Cor78-冷、干旱、盐、 ABA、创伤诱导 Ishitani等，Plant Cell 9： 1935-1949(1997). Yamaguchi-Shinozaki 和 Shinozaki，Plant Cell 6：251-264 (1994)
Rci2A-冷、脱水诱导 Capel等Plant Physiol 115： 569-576(1997)
Rd22-干旱、盐 Yamaguchi-Shinozaki 和 Shinozaki，Mol Gen Genet 238： 17-25(1993)
Cor15A-冷、脱水、ABA Baker等，Plant Mol.Biol.24： 701-713(1994)
GH3-生长素诱导 Liu等，Plant Cell 6：645-657 (1994)
ARSK1-根，盐诱导 Hwan和Goodman，Plant J 8： 37-43(1995).
PtxA-根，盐诱导 GenBank登录号X67427
SbHRGP3-根特异 Ahn等，Plant Cell 8： 1477-1490(1998)
KST1-保卫细胞特异性 Plesch等，Plant Journal.28 (4)：455-64，(2001)
KAT1-保卫细胞特异性 Plesch等，Gene 249：83-89
[0320](2000) Nakamura等，Plant Physiol. 109：371-374(1995)
水杨酸诱导 PCT Application No.WO 95/19443
四环素诱导 Gatz等Plant J.2：397-404 (1992)
乙醇诱导 PCT Application No.WO 93/21334
病原体诱导的PRP1 Ward等，1993Plant.Mol. Biol.22：361-366
热诱导的hsp80 U.S.Patent No.5187267
冷诱导的α淀粉酶 PCT Application No.WO 96/12814
创伤诱导的pinll European Patent No.375091
RD29A-盐诱导 Yamaguchi-Shinozalei 等， (1993)Mol.Gen.Genet.236： 331-340
质体特异性病毒RNA 聚合酶 Application No.WO 95/16783和WO97/06250
水杨酸诱导 PCT Application No.WO 95/19443
四环素诱导 Gatz等Plant J.2：397-404 (1992)
乙醇诱导 PCT Application No.WO 93/21334
病原体诱导的PRP1 Ward等，1993Plant.Mol. Biol.22：361-366
热诱导的hsp80 U.S.Patent No.5187267
冷诱导的α淀粉酶 PCT Application No.WO 96/12814
创伤诱导的pinll European Patent No.375091
RD29A-盐诱导 Yamaguchi-Shinozalei 等， (1993)Mol.Gen.Genet.236： 331-340
质体特异性病毒RNA 聚合酶 Application No.WO 95/16783和WO97/06250
[0321] 其他启动子例如超级启动子(Ni等，Plant Journal 7，1995：661-676)、泛素启动 子 (Callis 等，J.Biol.Chem.，1990，265：12486-12493；US5,510,474；US6,020,190；
Kawalleck等，Plant.Molecular Biology，1993，21：673-684)或34S启动子(GenBank登录
号M59930和X16673)可相似的用于本发明，并为本领域技术人员所公知。
Kawalleck等，Plant.Molecular Biology，1993，21：673-684)或34S启动子(GenBank登录
号M59930和X16673)可相似的用于本发明，并为本领域技术人员所公知。
[0322] 发育阶段优先的启动子在发育的某些阶段优先表达。组织和器官优先的启动子包括在某些组织或器官(如叶、根、种子或木质部)优先表达的 启动子。组织特异性和器官
特异性优先的启动子实例包括但不仅限于果实优先的、胚珠优先的、雄性组织优先的、种子
优先的、珠被优先的、块茎优先的、柄优先的、果皮优先的和叶优先的、气孔优先的、花粉优
先的、花药优先的、花瓣优先的、萼片优先的、花梗优先的、角果优先的、茎优先的、根优先的
启动子等。种子优先的启动子优先在种子发育和/或发芽中表达。例如，种子优先的启动
子可以是胚胎优先的、胚乳优先的和种皮优先的。参阅Thompson等，1989，BioEssays 10：
108。种子优先的启动子的实例包括(但不限于)纤维素合酶(celA)、Cim1、γ玉米醇溶蛋
白、球蛋白1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。
特异性优先的启动子实例包括但不仅限于果实优先的、胚珠优先的、雄性组织优先的、种子
优先的、珠被优先的、块茎优先的、柄优先的、果皮优先的和叶优先的、气孔优先的、花粉优
先的、花药优先的、花瓣优先的、萼片优先的、花梗优先的、角果优先的、茎优先的、根优先的
启动子等。种子优先的启动子优先在种子发育和/或发芽中表达。例如，种子优先的启动
子可以是胚胎优先的、胚乳优先的和种皮优先的。参阅Thompson等，1989，BioEssays 10：
108。种子优先的启动子的实例包括(但不限于)纤维素合酶(celA)、Cim1、γ玉米醇溶蛋
白、球蛋白1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。
[0323] 其他可用于本发明表达盒的启动子包括但不仅限于主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集
素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋
白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、shrunken1、shrunken2、青铜色启动子、Zm13
启动子(U.S.PatentNo.5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(U.S.Patent
No.5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(U.S.Patent No.5,470,359)以及合成的或其
他天然启动子。
素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋
白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、shrunken1、shrunken2、青铜色启动子、Zm13
启动子(U.S.PatentNo.5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(U.S.Patent
No.5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(U.S.Patent No.5,470,359)以及合成的或其
他天然启动子。
[0324] 可以通过使用异种来源的DNA结合域和反应元件(即非植物来源的DNA结合域)获得在植物中控制异源基因表达的额外灵活性。这种异源DNA结合域的实例为LexADNA结
合域(Brent和Ptashne，1985，Cell 4-3：729-736)。
合域(Brent和Ptashne，1985，Cell 4-3：729-736)。
[0325] 本发明还提供含有按反义方向克隆进表达载体的本发明SRP DNA分子的重组表达载体。即DNA分子以能够(通过DNA分子的转录)表达与SRP mRNA反义的RNA分子的方
式与调节序列有效连接。与反义方向克隆的核酸分子有效连接的调节序列可以选择指导
反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达的。例如，可以选择指导反义RNA组成型、组织
特异性或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子或调节序列。反义表达载体可
以为重组质粒、嗜菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸在高效 调节区的控制下表达。调
节区的活性可以通过引入载体的细胞类型决定。为讨论使用反义基因的基因表达调节，参
阅Weintraub，H等，1986，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis，
Reviews-Trends inGenetics，第1卷(1)和Mol等，1990，FEBS Letters 268：427-430。
式与调节序列有效连接。与反义方向克隆的核酸分子有效连接的调节序列可以选择指导
反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达的。例如，可以选择指导反义RNA组成型、组织
特异性或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子或调节序列。反义表达载体可
以为重组质粒、嗜菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸在高效 调节区的控制下表达。调
节区的活性可以通过引入载体的细胞类型决定。为讨论使用反义基因的基因表达调节，参
阅Weintraub，H等，1986，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis，
Reviews-Trends inGenetics，第1卷(1)和Mol等，1990，FEBS Letters 268：427-430。
[0326] 本发明另一方面涉及引入了本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应该理解这些术语不仅指特定的受试细胞，而
且适用于这些细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响，后续世代中可能出现某些
修饰，因此这些后代事实上可能与亲本细胞不完全相同，但仍包括在本文使用术语的范围
内。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如SRP可以在细菌细胞(如谷氨酸棒杆菌
(C.glutamicum))、酵母、大肠杆菌、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵
巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其他微生物(如谷氨酸棒杆菌)
中表达。其他合适的宿主细胞为本领域技术人员所公知。
且适用于这些细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响，后续世代中可能出现某些
修饰，因此这些后代事实上可能与亲本细胞不完全相同，但仍包括在本文使用术语的范围
内。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如SRP可以在细菌细胞(如谷氨酸棒杆菌
(C.glutamicum))、酵母、大肠杆菌、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵
巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其他微生物(如谷氨酸棒杆菌)
中表达。其他合适的宿主细胞为本领域技术人员所公知。
[0327] 本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)SRP。因此本发明另外提供使用本发明的宿主细胞产生SRP的方法。在一个实施方案中，该方法
包括在合适的培养基中培养(引入了编码SRP的重组表达载体、或其基因组引入了编码野
生型或改变的SRP基因的)本发明的宿主细胞直至产生SRP。在另一个实施方案中，该方法
还包括从培养基或宿主细胞中分离SRP。
包括在合适的培养基中培养(引入了编码SRP的重组表达载体、或其基因组引入了编码野
生型或改变的SRP基因的)本发明的宿主细胞直至产生SRP。在另一个实施方案中，该方法
还包括从培养基或宿主细胞中分离SRP。
[0328] 本发明另一方面涉及分离的SRP及其生物活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分不含有通过重组DNA技术产生时的某些细胞物质或化学合成时的化学
前体或其他化学物质。“基本不含有细胞物质”的术语包括SRP的制剂，其中多肽从天然或
重组产生它的细胞的某些细胞物质中分离。在一个实施方案中，“基本不含有细胞物质”的
说法包括含有低于约30％(干重)非SRP物质(本文也称为“污染多肽”)的SRP制剂，更
优选低于约20％的非SRP物质、还更优选低于约10％的非SRP物质、并最优选低于约5％的
非PKSRP物质。
前体或其他化学物质。“基本不含有细胞物质”的术语包括SRP的制剂，其中多肽从天然或
重组产生它的细胞的某些细胞物质中分离。在一个实施方案中，“基本不含有细胞物质”的
说法包括含有低于约30％(干重)非SRP物质(本文也称为“污染多肽”)的SRP制剂，更
优选低于约20％的非SRP物质、还更优选低于约10％的非SRP物质、并最优选低于约5％的
非PKSRP物质。
[0329] 重组产生SRP或其生物活性部分时，还优选基本不含有培养基，即培养基小于多肽制剂总体积的20％、更优选小于10％、并最优选小于5％。“基本不含有化学前体或其他
化学物质”的术语包括SRP的制剂，其中多肽从多肽合成中相关的化学前体或其他化学物
质中分离。在一个实施方案中“基本不含有化学前体或其他化学物质”包括含有低于30％
(干重)的前体或非SRP化学物质的SRP制剂，优选低于20％的前体或非SRP化学物质、还
更优选低于10％的前体或非SRP化学物质、并最优选低于5％的前体或非SRP化学物质。在
优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分没有来源于产生SRP的同一生物的污染
多肽。通常，通过在其它植物或微生物(如谷氨酸棒杆菌、纤毛虫、藻类或真菌)中而不是
在酿酒酵母、大肠杆菌、芸苔、大豆、或稻中重组表达酿酒酵母、大肠杆菌、芸苔、大豆、或稻
的SRP，来产生这些多肽。
化学物质”的术语包括SRP的制剂，其中多肽从多肽合成中相关的化学前体或其他化学物
质中分离。在一个实施方案中“基本不含有化学前体或其他化学物质”包括含有低于30％
(干重)的前体或非SRP化学物质的SRP制剂，优选低于20％的前体或非SRP化学物质、还
更优选低于10％的前体或非SRP化学物质、并最优选低于5％的前体或非SRP化学物质。在
优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分没有来源于产生SRP的同一生物的污染
多肽。通常，通过在其它植物或微生物(如谷氨酸棒杆菌、纤毛虫、藻类或真菌)中而不是
在酿酒酵母、大肠杆菌、芸苔、大豆、或稻中重组表达酿酒酵母、大肠杆菌、芸苔、大豆、或稻
的SRP，来产生这些多肽。
[0330] 本文所述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可以用于一项或多项以下方法：酿酒酵母、大肠杆菌、芸苔、大豆或稻及相关生物的鉴定；酿酒酵
母、大肠杆菌、芸苔、大豆或水稻相关生物的基因组作图；酿酒酵母、大肠杆菌、芸苔、大豆或
稻目的序列的鉴定和定位；进化研究；功能所需的SRP区域的确定；SRP活性的调控；一种
或多种细胞功能代谢的调控；一种或多种跨膜转运的调控；胁迫抗性的调控以及SRP核酸
表达的调控。
母、大肠杆菌、芸苔、大豆或水稻相关生物的基因组作图；酿酒酵母、大肠杆菌、芸苔、大豆或
稻目的序列的鉴定和定位；进化研究；功能所需的SRP区域的确定；SRP活性的调控；一种
或多种细胞功能代谢的调控；一种或多种跨膜转运的调控；胁迫抗性的调控以及SRP核酸
表达的调控。
[0331] 本发明的SRP核酸分子也可用于进化和多肽结构研究。本发明分子参与的代谢和转运过程被多种原核和真核细胞所利用。通过将本发明核酸分子的序列与其他生物来源的
编码相似酶的序列比较，可以评估生物间的进化关系。类似地，这种比较能够评估序列的哪
些区域是保守的，而哪些不是，这有助于确定酶功能所必需的多肽区域。这种类型的鉴定对
于多肽工程研究是有价值的，并可以指示多肽能在不失去功能的条件下承受怎样的诱变。
编码相似酶的序列比较，可以评估生物间的进化关系。类似地，这种比较能够评估序列的哪
些区域是保守的，而哪些不是，这有助于确定酶功能所必需的多肽区域。这种类型的鉴定对
于多肽工程研究是有价值的，并可以指示多肽能在不失去功能的条件下承受怎样的诱变。
[0332] 本发明SRP核酸分子的操作可能导致产生与野生型SRP有功能性区别的SRP。这些多肽可能提高了效率或活性、可能在细胞中以比平常更多 的数目存在、或者可能降低了
效率或活性。
效率或活性。
[0333] 本发明SRP的改变可以通过多种机制影响胁迫反应和/或胁迫耐性。对于表达SRP的植物，提高转运可能导致植物组织和器官中提高的盐和/或溶质分配。通过提高从细
胞中运出离子分子的转运体分子的数目或活性可能影响细胞的盐耐性。
胞中运出离子分子的转运体分子的数目或活性可能影响细胞的盐耐性。
[0334] 可以通过在次于合适的条件以下培养修饰的生物或植物然后分析植物的生长特性和/或代谢，评估植物、谷氨酸棒杆菌、真菌、藻类或纤毛虫中遗传修饰对胁迫耐性的影
响。这些分析技术为本领域技术人员所熟知，包括干重、湿重、多肽合成、碳水化合物合成、
脂类合成、蒸腾率、一般植物和/或农作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸率、光合作
用率等。(《Applications of HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniquesin
Biochemistry and Molecular Biology》，第17卷；Rehm等，1993《Biotechnology》，第
3卷，第 III章：《Product recovery and purification》，469-714 页，VCH：Weinheim；
Belter，P.A.等，1988，《Bioseparations：downstream processing for biotechnology》，
John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，《Recovery processes for
biologicalmaterials》，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A. 和 Henry，J.D.，1988，
《Biochemical separations，in：Ulmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry》，
B3 卷， 第 11 章，1-27 页，VCH：Weinheim； 和 Dechow，F.J.，1989，《Separation and
purification techniques in biotechnology》，NoyesPublications)。
响。这些分析技术为本领域技术人员所熟知，包括干重、湿重、多肽合成、碳水化合物合成、
脂类合成、蒸腾率、一般植物和/或农作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸率、光合作
用率等。(《Applications of HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniquesin
Biochemistry and Molecular Biology》，第17卷；Rehm等，1993《Biotechnology》，第
3卷，第 III章：《Product recovery and purification》，469-714 页，VCH：Weinheim；
Belter，P.A.等，1988，《Bioseparations：downstream processing for biotechnology》，
John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，《Recovery processes for
biologicalmaterials》，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A. 和 Henry，J.D.，1988，
《Biochemical separations，in：Ulmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry》，
B3 卷， 第 11 章，1-27 页，VCH：Weinheim； 和 Dechow，F.J.，1989，《Separation and
purification techniques in biotechnology》，NoyesPublications)。
[0335] 例如，可以构建含有本文公开的核酸或其片段的酵母表达载体，并使用标准操作转化进酿酒酵母中。随后可测试产生的转基因细胞对干旱、盐和温度胁迫耐性的失去或改
变。类似地，可以构建含有本文公开的核酸或其片段的植物表达载体，并使用标准操作转化
进适当的植物细胞，如拟南芥、大豆、油菜、玉米、小麦、截形苜蓿(Medicago truncatula)等
的细胞。随后可测试产生的转基因细胞和/或来自它的植物对干旱、盐、温度胁迫和倒伏的
耐性的失去或改变。
变。类似地，可以构建含有本文公开的核酸或其片段的植物表达载体，并使用标准操作转化
进适当的植物细胞，如拟南芥、大豆、油菜、玉米、小麦、截形苜蓿(Medicago truncatula)等
的细胞。随后可测试产生的转基因细胞和/或来自它的植物对干旱、盐、温度胁迫和倒伏的
耐性的失去或改变。
[0336] 对一个或多个本发明SRP基因的操作也可能得到具有改变的活性的SRP，所述活性间接影响真菌、植物、纤毛虫或真菌或其他微生物(如谷氨酸棒杆菌)的胁迫反应和/或
胁迫耐性的SRP。例如，代谢的正常生化过程导致多种能积极影响同一代谢过程的产物(例
如过氧化氢和其他活性氧簇)的产生。例如，已知过亚硝酸盐可以硝化酪氨酸侧链，从而使
在活性位点含有酪氨酸的某些酶失活(Groves，J.T.，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3(2)：
226-235)。尽管这些产物通常被排泄掉，可以遗传改变细胞使其比野生型细胞的一般情况
转运更多的产物。通过优化一个或多个本发明PKSRP的活性可能提高细胞的胁迫耐性，所
述PKSRP与运出特定分子(如盐分子)有关。
胁迫耐性的SRP。例如，代谢的正常生化过程导致多种能积极影响同一代谢过程的产物(例
如过氧化氢和其他活性氧簇)的产生。例如，已知过亚硝酸盐可以硝化酪氨酸侧链，从而使
在活性位点含有酪氨酸的某些酶失活(Groves，J.T.，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3(2)：
226-235)。尽管这些产物通常被排泄掉，可以遗传改变细胞使其比野生型细胞的一般情况
转运更多的产物。通过优化一个或多个本发明PKSRP的活性可能提高细胞的胁迫耐性，所
述PKSRP与运出特定分子(如盐分子)有关。
[0337] 另外，本文公开的序列或其片段可以用于产生多种生物(如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞)基因组中的敲除突变(Girke，T.，1998，The Plant Journal
15：39-48)。然后可以评估产生的敲除细胞耐受多种胁迫条件的能力或容量、其对
多种胁迫条件的反应和突变的表型和/或基因型的影响。其他基因失活的方法参阅
U.S.Patent No.6,004,804″Non-Chimeric Mutational Vectors″和Puttaraju 等，
1999，Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy，Nature
Biotechnology 17：246-252。
15：39-48)。然后可以评估产生的敲除细胞耐受多种胁迫条件的能力或容量、其对
多种胁迫条件的反应和突变的表型和/或基因型的影响。其他基因失活的方法参阅
U.S.Patent No.6,004,804″Non-Chimeric Mutational Vectors″和Puttaraju 等，
1999，Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy，Nature
Biotechnology 17：246-252。
[0338] 导致提高的胁迫抗性的前述SRP诱变策略并不仅限于此，这些策略的变更对于本领域技术人员是显而易见的。使用这些策略结合本文公开的机制，本发明的核酸和多肽分
子可以用于产生表达突变的PKSRP核酸和多肽分子以提高胁迫耐性的藻类、纤毛虫、植物、
真菌或其他微生物(如谷氨酸棒杆菌)。
子可以用于产生表达突变的PKSRP核酸和多肽分子以提高胁迫耐性的藻类、纤毛虫、植物、
真菌或其他微生物(如谷氨酸棒杆菌)。
[0339] 本发明还提供由本文所述核酸编码、与SRP特异结合的抗体或其部分。抗体可以通过多种熟知的方法产生(参阅例如Harlow和Lane，《Antibodies；A Laboratory
Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1988))。简
言之，可以将纯化的抗原以足以引发免疫反应的剂量和间隔注射进动物中。可以直接纯化
抗体或从动物 中获得脾细胞。然后将细胞与不死细胞系融合并筛选抗体分泌。抗体可以
用于从核酸克隆文库中筛选分泌抗原的细胞。接着可以对阳性克隆进行测序。参阅例如
Kelly等，1992，Bio/Technology 10：163-167；Bebbington等，1992，Bio/Technology 10：
169-175.
Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1988))。简
言之，可以将纯化的抗原以足以引发免疫反应的剂量和间隔注射进动物中。可以直接纯化
抗体或从动物 中获得脾细胞。然后将细胞与不死细胞系融合并筛选抗体分泌。抗体可以
用于从核酸克隆文库中筛选分泌抗原的细胞。接着可以对阳性克隆进行测序。参阅例如
Kelly等，1992，Bio/Technology 10：163-167；Bebbington等，1992，Bio/Technology 10：
169-175.
[0340] 与多肽“选择性结合”和“特异结合”一语是指由异源多肽群和其他生物制品中存在的多肽决定的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，与特定多肽结合的特异性抗
体不与样品中存在的其他多肽大量结合。这种条件下抗体的选择性结合可能需要根据对
特定多肽的特异性选出的抗体。可以使用多种免疫测定形式选择与特定多肽选择性结合的
抗体。例如，固相ELISA免疫测定用于常规选择与多肽选择性免疫反应的抗体。对于可用
于测定选择性结合的免疫测定形式和条件的描述，可参阅Harlow和Lane，《Antibodies，A
LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)。
体不与样品中存在的其他多肽大量结合。这种条件下抗体的选择性结合可能需要根据对
特定多肽的特异性选出的抗体。可以使用多种免疫测定形式选择与特定多肽选择性结合的
抗体。例如，固相ELISA免疫测定用于常规选择与多肽选择性免疫反应的抗体。对于可用
于测定选择性结合的免疫测定形式和条件的描述，可参阅Harlow和Lane，《Antibodies，A
LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)。
[0341] 在某些情况下，需要从不同的宿主中制备单克隆抗体。制备这些单克隆抗体的技术的描述于Stites等编，《Basic and Clinical Immunology》，(Lange Medical
Publications，Los Altos，Calif.，第四版)及其引用的参考文献，以及Harlow和Lane，
《Antibodies，A LaboratoryManual》，Cold SpringHarbor Publications，New York，
(1988)。
Publications，Los Altos，Calif.，第四版)及其引用的参考文献，以及Harlow和Lane，
《Antibodies，A LaboratoryManual》，Cold SpringHarbor Publications，New York，
(1988)。
[0342] 植物中的基因表达通过蛋白质转录因子与基因调节区中特定核苷酸序列的相互作用来调节。通用型转录因子含有锌指(ZF)基序。每个锌指模块是沿锌离子周围折叠的
约30个氨基酸。ZF蛋白的DNA识别结构域是插入DNA双螺旋大沟的α螺旋结构。该模
块含有三个与DNA结合的氨基酸，每个氨基酸接触靶DNA序列的一个碱基对。ZF基序以模
块重复的形式排列，形成识别连续DNA序列的一套锌指。例如，三指锌指基序识别DNA的
9bp。已经发现数百种蛋白质含有ZF基序，每个蛋白质具有2到37个ZF模块(Isalan M等，
1998Biochemistry 37(35)：12026-33；Moore M等，2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(4)：
1432-1436和1437-1441；US专利US6007988和US6013453)。
约30个氨基酸。ZF蛋白的DNA识别结构域是插入DNA双螺旋大沟的α螺旋结构。该模
块含有三个与DNA结合的氨基酸，每个氨基酸接触靶DNA序列的一个碱基对。ZF基序以模
块重复的形式排列，形成识别连续DNA序列的一套锌指。例如，三指锌指基序识别DNA的
9bp。已经发现数百种蛋白质含有ZF基序，每个蛋白质具有2到37个ZF模块(Isalan M等，
1998Biochemistry 37(35)：12026-33；Moore M等，2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(4)：
1432-1436和1437-1441；US专利US6007988和US6013453)。
[0343] 植物基因的调节区含有许多作为转录因子(包括ZF蛋白)识别结构域的短DNA序列(顺式作用元件)。不同基因中相似的识别结构域使得编码代谢途径中酶的若干基因
通过通用转录因子协同表达。基因家族中识别结构域的变化促进同一基因家族的基因在例
如组织和发育阶段和对环境条件的反应中基因表达的差异。
通过通用转录因子协同表达。基因家族中识别结构域的变化促进同一基因家族的基因在例
如组织和发育阶段和对环境条件的反应中基因表达的差异。
[0344] 通常ZF蛋白不只含有DNA识别结构域，还含有使ZF蛋白能激活或抑制特定基因转录的功能结构域。激活结构域已经实验性的用于激活靶基因的转录(US专利5789538和
专利申请书W09519431)，但也可以使ZF与转录阻抑物结构域连接从而抑制转录(专利申请
书WO00/47754和WO2001002019)。已有报道酶功能(如核酸切割)可以与ZF连接(专利
申请书WO00/20622)。
专利申请书W09519431)，但也可以使ZF与转录阻抑物结构域连接从而抑制转录(专利申请
书WO00/47754和WO2001002019)。已有报道酶功能(如核酸切割)可以与ZF连接(专利
申请书WO00/20622)。
[0345] 本发明提供使本领域技术人员可从植物细胞基因组中分离一种或多种胁迫相关蛋白质编码基因的调节区的方法，以及设计与基因调节区相互作用的功能结构域连接的锌
指调节区的方法。可以以改变基因表达的方式设计锌指蛋白和植物基因的相互作用，并优
选从而改变代谢活性以提高(或降低)对非生物胁迫(如干旱)的耐性。本发明提供产生转
基因植物的方法，所述转基因植物带有编码该设计的转录因子的转基因，或天然转录因子，
其修饰胁迫相关蛋白质，特别是提高(优选通过改变代谢活性实现)对环境胁迫耐性的胁
迫相关蛋白质的转录。这类通过人工多指锌指的植物基因调节已由Ordiz等(Regulation
of transgene Expression in plants withpolydactyl zinc finger transcription
factors，Ordiz等，PNAS，99(20)13290-13295，2002)或Guan等(Hertiable endogenous
gene regulation inplants with designed polydactyl zinc finger transcription
factos，PNAS，Vol.99(20)，13296-13301(2002))描述。
指调节区的方法。可以以改变基因表达的方式设计锌指蛋白和植物基因的相互作用，并优
选从而改变代谢活性以提高(或降低)对非生物胁迫(如干旱)的耐性。本发明提供产生转
基因植物的方法，所述转基因植物带有编码该设计的转录因子的转基因，或天然转录因子，
其修饰胁迫相关蛋白质，特别是提高(优选通过改变代谢活性实现)对环境胁迫耐性的胁
迫相关蛋白质的转录。这类通过人工多指锌指的植物基因调节已由Ordiz等(Regulation
of transgene Expression in plants withpolydactyl zinc finger transcription
factors，Ordiz等，PNAS，99(20)13290-13295，2002)或Guan等(Hertiable endogenous
gene regulation inplants with designed polydactyl zinc finger transcription
factos，PNAS，Vol.99(20)，13296-13301(2002))描述。
[0346] 具体而言，本发明提供产生带有胁迫相关蛋白质编码核酸的转基因植物的方法，其中核酸在植物中的表达导致与野生型植物相比对环境胁迫提高的耐性(优选通过改变
代谢活性实现)，所述方法包括：(a)用含有胁迫相关蛋白质编码核酸的表达载体转化植
物细胞，和(b)从植物细胞产生 与野生型植物相比对环境胁迫具有提高的耐性的转基因
植物。二元载体(如pBinAR)可以用于此类植物转化(Hofgen和Willmitzer，1990Plant
Science66：221-230)。其他合适的二元载体为例如pBIN19、pBI101、pGPTV或pPZP(Haj
ukiewicz，P等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994)。
代谢活性实现)，所述方法包括：(a)用含有胁迫相关蛋白质编码核酸的表达载体转化植
物细胞，和(b)从植物细胞产生 与野生型植物相比对环境胁迫具有提高的耐性的转基因
植物。二元载体(如pBinAR)可以用于此类植物转化(Hofgen和Willmitzer，1990Plant
Science66：221-230)。其他合适的二元载体为例如pBIN19、pBI101、pGPTV或pPZP(Haj
ukiewicz，P等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994)。
[0347] 可以通过将cDNA连接进T-DNA构建二元质粒。植物启动子在cDNA5’激活cDNA的转录。多腺苷酸化序列位于cDNA3’。可以通过使用上文列出的组织特异性启动子实现组
织特异性表达。也可以使用任何其他启动子元件。对于整个植物中的组成型表达，可以使
用CaMV35S启动子。可以使用信号肽将表达的蛋白质导向细胞区室，例如质体、线粒体或内
质网(Kermode，1996Crit.Rev.Plant Sci.4(15)：285-423)。信号肽框内克隆到cDNA 5’，
以实现融合蛋白的亚细胞定位。另外，可以使用反应于非生物胁迫的启动子，如拟南芥启动
子RD29A。本领域技术人员会认识到，使用的启动子应与核酸有效连接，从而启动子引起核
酸的转录，从而导致合成编码多肽的mRNA。
织特异性表达。也可以使用任何其他启动子元件。对于整个植物中的组成型表达，可以使
用CaMV35S启动子。可以使用信号肽将表达的蛋白质导向细胞区室，例如质体、线粒体或内
质网(Kermode，1996Crit.Rev.Plant Sci.4(15)：285-423)。信号肽框内克隆到cDNA 5’，
以实现融合蛋白的亚细胞定位。另外，可以使用反应于非生物胁迫的启动子，如拟南芥启动
子RD29A。本领域技术人员会认识到，使用的启动子应与核酸有效连接，从而启动子引起核
酸的转录，从而导致合成编码多肽的mRNA。
[0348] 转染的替代方法包括通过电穿孔或农杆菌介导的基因转移将DNA直接转移到发育的花中。可以使用根瘤农杆菌菌株例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986Mol.
Gen.Genet.204：383-396) 或 LBA4404(Ooms 等，Plasmid，1982，7：15-29；Hoekema 等，
Nature，1983，303：179-180)实施农杆菌介导的植物转化。可以通过标准转化和再生技术
进行转化(Deblaere等，1994Nucl.Acids.Res.13：4777-4788；Gelvin和Schilperoort，
《PlantMolecular Biology Manual》 第 二 版，Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，
1995.-in Sect.，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick，B
R和Thompson，J E，《Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology》，Boca
Raton：CRC Press，1993.-360S.，ISBN 0-8493-5164-2)。例如可以通过子叶或胚轴转化来
转化油菜籽(Moloney等，1989Plant Cell Reports 8：238-242；De Block等，1989Plant
Physio.91：694-701)。农杆菌抗生素的使用和植物的选择取决于用于转化的二元载体和
农杆菌菌株。油菜籽的选择通常使用卡那霉素作为可选择的植物标记。 农杆菌介导的
向亚麻的基因转移可以使用例如Mlynarova等，1994PlantCell Report 13：282-285所述
的技术进行。另外，大豆的转化可以使用例如European Patent No.0424047、U.S.Patent
No.5,322,783、EuropeanPatent No.0397687、U.S.Patent No.5,376,543 或 U.S.Patent
No.5,169,770所述的技术进行。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取
或通过碳化硅技术实现(参阅例如Freeling和Walbot《The maizehandbook》，Springer
Verlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)。玉米转化的具体实例可见于U.S.专利号
5,990,387，小麦转化的具体实例可见于PCT Application No.WO93/07256。
Gen.Genet.204：383-396) 或 LBA4404(Ooms 等，Plasmid，1982，7：15-29；Hoekema 等，
Nature，1983，303：179-180)实施农杆菌介导的植物转化。可以通过标准转化和再生技术
进行转化(Deblaere等，1994Nucl.Acids.Res.13：4777-4788；Gelvin和Schilperoort，
《PlantMolecular Biology Manual》 第 二 版，Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，
1995.-in Sect.，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick，B
R和Thompson，J E，《Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology》，Boca
Raton：CRC Press，1993.-360S.，ISBN 0-8493-5164-2)。例如可以通过子叶或胚轴转化来
转化油菜籽(Moloney等，1989Plant Cell Reports 8：238-242；De Block等，1989Plant
Physio.91：694-701)。农杆菌抗生素的使用和植物的选择取决于用于转化的二元载体和
农杆菌菌株。油菜籽的选择通常使用卡那霉素作为可选择的植物标记。 农杆菌介导的
向亚麻的基因转移可以使用例如Mlynarova等，1994PlantCell Report 13：282-285所述
的技术进行。另外，大豆的转化可以使用例如European Patent No.0424047、U.S.Patent
No.5,322,783、EuropeanPatent No.0397687、U.S.Patent No.5,376,543 或 U.S.Patent
No.5,169,770所述的技术进行。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取
或通过碳化硅技术实现(参阅例如Freeling和Walbot《The maizehandbook》，Springer
Verlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)。玉米转化的具体实例可见于U.S.专利号
5,990,387，小麦转化的具体实例可见于PCT Application No.WO93/07256。
[0349] 本发明的胁迫相关蛋白质编码核酸分子具有多种用途。最重要的是，本发明的核酸和氨基酸序列可以用于转化植物细胞或植物，从而诱导对胁迫如干旱、高盐度和冷的耐
性。本发明因此提供转化了胁迫相关蛋白质编码核酸(编码或反义)的转基因植物，其中
核酸序列在植物中的表达导致与野生型植物相比对环境胁迫提高的耐性。提高的胁迫耐性
表现为植物提高的产量或质量。转基因植物可以是单子叶或双子叶或裸子植物。本发明还
设想转基因植物可选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、
红花、亚麻子、报春花、油菜籽、芸苔(canola)和turnip rape、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、
茄科植物(如马铃薯、烟草、茄子和番茄)、蚕豆、豌豆、苜蓿、灌木植物(如咖啡、可可、茶、柳
属)、树木如(棕榈、椰子)、多年生草本植物(如黑麦草和羊茅草)、饲料作物(如苜蓿和三
叶草和拟南芥)。其他转基因植物可以选自例如云杉、松树或冷杉。
性。本发明因此提供转化了胁迫相关蛋白质编码核酸(编码或反义)的转基因植物，其中
核酸序列在植物中的表达导致与野生型植物相比对环境胁迫提高的耐性。提高的胁迫耐性
表现为植物提高的产量或质量。转基因植物可以是单子叶或双子叶或裸子植物。本发明还
设想转基因植物可选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、
红花、亚麻子、报春花、油菜籽、芸苔(canola)和turnip rape、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、
茄科植物(如马铃薯、烟草、茄子和番茄)、蚕豆、豌豆、苜蓿、灌木植物(如咖啡、可可、茶、柳
属)、树木如(棕榈、椰子)、多年生草本植物(如黑麦草和羊茅草)、饲料作物(如苜蓿和三
叶草和拟南芥)。其他转基因植物可以选自例如云杉、松树或冷杉。
[0350] 具体而言，本发明描述了利用胁迫相关蛋白质的表达来获得干旱耐受、盐耐受和/或低温耐受的植物。本文已经对针对拟南芥、黑麦草、苜蓿、油菜籽/芸苔(canola)、大豆、
玉米和小麦的该策略进行了说明，但其应用不限于这些植物。因此本发明提供含有胁迫相
关蛋白质编码基因的转基因植物，所述基因选自序列图1a、1b或1c的核酸和/或前述序列
的同源物，其中环境胁迫为干旱、盐度增加或温度升高或降低，但其应用不限于这些 不利
环境。例如，可以获得对其他不利条件(如热、空气污染、重金属和化学毒素)的保护。在
优选的实施方案中，环境胁迫为干旱。
玉米和小麦的该策略进行了说明，但其应用不限于这些植物。因此本发明提供含有胁迫相
关蛋白质编码基因的转基因植物，所述基因选自序列图1a、1b或1c的核酸和/或前述序列
的同源物，其中环境胁迫为干旱、盐度增加或温度升高或降低，但其应用不限于这些 不利
环境。例如，可以获得对其他不利条件(如热、空气污染、重金属和化学毒素)的保护。在
优选的实施方案中，环境胁迫为干旱。
[0351] 本发明还提供修饰植物胁迫耐性的方法，包括修饰胁迫相关蛋白质编码基因在植物中的表达。本发明设想可以实施该方法来提高胁迫耐性。这可以通过例如使用转录因子
来实现。具体而言，本发明提供制备由于植物中胁迫相关基因的表达提高而与野生型植物
相比对环境胁迫具有提高耐性的转基因植物的方法。
来实现。具体而言，本发明提供制备由于植物中胁迫相关基因的表达提高而与野生型植物
相比对环境胁迫具有提高耐性的转基因植物的方法。
[0352] 在胁迫条件下生长修饰的植物并筛选和分析生长特性和/或代谢活性，以评估植物中遗传修饰对胁迫耐性和/或抗性的影响。这些分析技术为本领域技术人员所
熟知。它们包括筛选(Rompp Lexikon Biotechnologie，Stuttgart/New York：Georg
Thieme Verlag 1992，″screening″701页)干重、湿重、蛋白质合成、碳水化合物合
成、脂类合成、蒸腾率、普通植物和/或农作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸率、光
合作用率等。(《Applications of HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques
inBiochemistry and Molecular Biology》，第17 卷；Rehm 等，1993《Biotechnology》，
第3卷，第III章：《Product recovery and purification》，469-714页，VCH：Weinheim；
Belter，P.A.等，1988，《Bioseparations：downstream processing for biotechnology》，
John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，《Recovery processes for
biologicalmaterials》，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A. 和 Henry，J.D.，1988，
《Biochemical separations，in：Ulmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry》，
B3 卷， 第 11 章，1-27 页，VCH：Weinheim； 和 Dechow，F.J.，1989，《Separation and
purification techniques in biotechnology》，NoyesPublications)。
熟知。它们包括筛选(Rompp Lexikon Biotechnologie，Stuttgart/New York：Georg
Thieme Verlag 1992，″screening″701页)干重、湿重、蛋白质合成、碳水化合物合
成、脂类合成、蒸腾率、普通植物和/或农作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸率、光
合作用率等。(《Applications of HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques
inBiochemistry and Molecular Biology》，第17 卷；Rehm 等，1993《Biotechnology》，
第3卷，第III章：《Product recovery and purification》，469-714页，VCH：Weinheim；
Belter，P.A.等，1988，《Bioseparations：downstream processing for biotechnology》，
John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，《Recovery processes for
biologicalmaterials》，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A. 和 Henry，J.D.，1988，
《Biochemical separations，in：Ulmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry》，
B3 卷， 第 11 章，1-27 页，VCH：Weinheim； 和 Dechow，F.J.，1989，《Separation and
purification techniques in biotechnology》，NoyesPublications)。
[0353] 一种或多种本发明胁迫相关蛋白质编码基因的改造也可能产生具有改变的特性并间接影响植物胁迫反应和/或胁迫耐性的胁迫相关蛋白质。例如，代谢的正常生化过程
导致多种能积极影响同一代谢过程的产物(例如过氧化氢和其他活性氧簇)的产生。例
如，已知过亚硝酸盐可以硝化酪氨 酸侧链，从而使在活性位点含有酪氨酸的某些酶失活
(Groves，J.T.，1999，Curr,Opin.Chem.Biol.3(2)：226-235)。通过优化一种或多种本发明
的胁迫相关蛋白质(酶)，可能使细胞的胁迫耐性提高。
导致多种能积极影响同一代谢过程的产物(例如过氧化氢和其他活性氧簇)的产生。例
如，已知过亚硝酸盐可以硝化酪氨 酸侧链，从而使在活性位点含有酪氨酸的某些酶失活
(Groves，J.T.，1999，Curr,Opin.Chem.Biol.3(2)：226-235)。通过优化一种或多种本发明
的胁迫相关蛋白质(酶)，可能使细胞的胁迫耐性提高。
[0354] 本申请全文中引用了多种出版物。所有这些出版物的公开内容以及这些出版物中引用的参考以其全文引入本申请中作为参考，以更详细的描述本发明所属领域的状况。
[0355] 还应该理解前文涉及本发明优选的实施方案，可以在不脱离本发明范围的情况下产生众多的变化和改变。本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应以任何方式
解释为限制性的。相反，应该清楚的理解，在阅读本文的描述后，可以在不脱离本发明的精
神和/或权利说明书的范围的情况下提示本领域技术人员多种其他实施方案、改变和其等
效方案。
解释为限制性的。相反，应该清楚的理解，在阅读本文的描述后，可以在不脱离本发明的精
神和/或权利说明书的范围的情况下提示本领域技术人员多种其他实施方案、改变和其等
效方案。
[0356] 本发明还涉及选自序列图1a、1b、或1c的核酸和/或前述序列的同源物的SRP编码核酸用于制备具有对环境胁迫提高耐性的植物细胞的用途，所述提高优选通过改变代谢
活性实现。所述序列也可以用于制备具有对环境胁迫提高耐性的植物。
活性实现。所述序列也可以用于制备具有对环境胁迫提高耐性的植物。
[0357] 本发明的目的还在于改变的代谢活性和/或选自序列图1a、1b或1c的核酸序列和/或前述序列的同源物的SRP编码核酸作为标记的用途，所述标记用于选择对环境胁迫
具有提高耐性的植物或检测植物或植物细胞中的胁迫。
具有提高耐性的植物或检测植物或植物细胞中的胁迫。
[0358] 实施例1
[0359] 通过过表达胁迫相关蛋白质基因获得胁迫耐受的拟南芥植物
[0360] 拟南芥的基因克隆和转化
[0361] 扩增
[0362] 扩增过程使用Pfu DNA聚合酶或Pfu/Taq DNA聚合酶混合物(Herculase)的标准方案。通过凝胶电泳分析扩增的ORF片段。每条引物由通用5’端和ORF特异的3’端组成，
其中正向和反向引物的通用序列的不同(正向引物含有EcoRI(用于酵母)或SmaI(用于
大肠杆菌)、反 向引物序列含有SmaI(用于酵母)或SacI(用于大肠杆菌)限制性位点)
使得单向克隆一般可以成功的进行。
其中正向和反向引物的通用序列的不同(正向引物含有EcoRI(用于酵母)或SmaI(用于
大肠杆菌)、反 向引物序列含有SmaI(用于酵母)或SacI(用于大肠杆菌)限制性位点)
使得单向克隆一般可以成功的进行。
[0363] 使用Pfu或Herculase聚合酶程序的扩增。条件：1×PCR缓冲液、0.2mM dNTP、100ng酿酒酵母(S288C)基因组DNA或60ng大肠杆菌K-12(MG1655)基因组DNA、25pmol正
向引物、25pmol反向引物、2.5u Pfu或Herculase DNA聚合酶。第一个循环为94℃3分钟
(对于酵母)或2分钟(对于大肠杆菌)，接着是94℃30秒、55℃(对于酵母)或60℃(对
于大肠杆菌)30秒以及72℃5-6分钟的25个循环，接着是72℃6-10分钟的一个循环，最
后是4℃不限时间。
向引物、25pmol反向引物、2.5u Pfu或Herculase DNA聚合酶。第一个循环为94℃3分钟
(对于酵母)或2分钟(对于大肠杆菌)，接着是94℃30秒、55℃(对于酵母)或60℃(对
于大肠杆菌)30秒以及72℃5-6分钟的25个循环，接着是72℃6-10分钟的一个循环，最
后是4℃不限时间。
[0364] 表2：用于ORF扩增的正向和反向引物序列
[0365]基因 正向序列
YGL263W GGAATTCCAGCTGACCACCATGGATGGAGCCAAATTTGAAAATAC
YGR004W GGAATTCCAGCTGACCACCATGAGCGAAATAAATAATGAAAATCTAG
YGR014W GGAATTCCAGCTGACCACCATGCAGTTTCCATTCGCTTGTCTC
YGL239C GGAATTCCAGCTGACCACCATGAAATTTTTGAAGAACAAAGCACC
YBL060W GGAATTCCAGCTGACCACCATGTGCGCCAGTTTAAACGAGGTA
YGL166W GGAATTCCAGCTGACCACCATGGTCGTAATTAACGGGGTCAAAT
YDL202W GGAATTCCAGCTGACCACCATGTTGCAGCTAAGGTTTATGCCT
YAL046C GGAATTCCAGCTGACCACCATGAAGCTCCCACAGACCATGCT
YDR101C GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCTCTAGCTATCTCCCACGA
YDR108W GGAATTCCAGCTGACCACCATGGTTTTTTCTTATGAGCACTATATG
YAL064W GGAATTCCAGCTGACCACCATGCGATATACTGCAACTTTTCGG
YDR134C GGAATTCCAGCTGACCACCATGCAATTCTCTACCGTCGCTTCT
YFL031w GGAATTCCAGCTGACCACCATGAATAGCGAGTACGATTACCTGT
YFL052W GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCCCGCAATAGACAAGCGT
YFL042C GGAATTCCAGCTGACCACCATGTCGGATGTAGATAACTGGGAA
YBR025C GGAATTCCAGCTGACCACCATGCCTCCAAAGAAGCAAGTCGAA
YER174C GGAATTCCAGCTGACCACCATGACTGTGGTTGAAATAAAAAGCC
YBR051W GGAATTCCAGCTGACCACCATGCACATTCTTTTCTTGTTTATTTTC
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YMR2l0W GGAATTCCAGCTGACCACCATGCGTCTAAAAGAATTGTTACCTAA
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YMR069W GGAATTCCAGCTGACCACCATGCGTTCTTCGGTATATAGTGAGA
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YNL334C GGAATTCCAGCTGACCACCATGACCGTCGTTATCGGAGTCTT
YNR018W GGAATTCCAGCTGACCACCATGAAGATTTTAACCCAAGACGAAAT
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YGR054W GGAATTCCAGCTGACCACCATGTCATCTCAGTTTTTCCTGAAAAC
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b2796 TTGCTCTTCCATGGAAACGACTCAAACCAGCAC
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b0124 TTGCTCTTCCATGGCAATTAACAATACAGGCTCG
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b1830 TTGCTCTTCCATGAACATGTTTTTTAGGCTTACC
b1453 TTGCTCTTCCATGTTCATGGCAACTTATATGACTTTT
b2664 TTGCTCTTCCATGATCAGGAGTCACACCATGA
b2799 TTGCTCTTCCATGATGGCTAACAGAATGATTCTGA
b3327 TTGCTCTTCCATGAATTATCGCTATCGCGCCA
b0970 TTGCTCTTCCATGGATCGTATTGTTAGTTCTTCAC
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YNL090W GGAATTCCAGCTGACCACCATGTCTGAAAAGGCCGTTAGAAGG
YGR161C GGAATTCCAGCTGACCACCATGATCGCTACCTCCAGAGCCG
YDR071C GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCCTCCTCAAGTAGCACGC
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YGR161C GGAATTCCAGCTGACCACCATGATCGCTACCTCCAGAGCCG
YDR071C GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCCTCCTCAAGTAGCACGC
[0369]基因 反向序列
YGL263W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACACATCATTGCAAGCTGATTGT
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YAL046C GATCCCCGGGAATTGCCATGTCATGATGATGCCGGACCCTTC
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YDR134C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACAACAATAAAGCGGCAGCACC
YFL031w GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAACAGCAGCCCCCACCGGT
YFL052W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAAGGAAGCGCATCTACATCTTCT
[0370]YFL042C GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAACCATACCTTTGATCCAACTG
YBR025C GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAATTCTTACCAGCACCAGCTCT
YER174C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACTGTAGAGCATGTTGGAAATATT
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YER175C GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAGACCCTTTTGCCAAGTTTGTAA
YDR521W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACTCACCATTAAAACATCTTTCCC
YER167W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGTTGCTATTATCAAAATAAAAAGAC
YER123W GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAAAAAAAAAAAGGAAAAAGAGAAAAG
YDR415C GATCCCCGGGAATTGCCATGTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCAC
YEL052W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGTATGTAGGCTTAGTAACCCAA
YDR536W GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAACCCTCAAAATTTGCTTTATCG
YDR513W GATCCCCGGGAATTGCCATGCTATTGAAATACCGGCTTCAATATTT
YEL045C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTAGGAAAGGAGGTGGTTACGAA
YEL041W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGATTGCAAAATGAGCCTGACGA
YDL238C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTAAATCTGGTAGACTTGCTGGC
YBR282W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATCCACGCTCCTTATAACATGAA
YBR258C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACGTACTTCCATTTGCTTCCTCT
YCL001W-A GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAGTTCATCAAAATTGAAATTTCTAACCA
YBR274W GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAGTTGGGAATTAGGATAATATCC
YHR090C GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAGTTACGTTTTCTTTTCAGTTTGT
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YKL051W GATCCCCGGGAATTGCCATGTCATACGACTACTTGAATAGATTCG
YKL120W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAATTATGGCCTAAAACTCTCGAC
YKL011C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGTCATTGTTGTAAGTGTTCTGC
YKL017C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACAAATAATCGTCAATGTTGGGG
YKL049C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTAAATAAACTGTCCCCTGATTCTT
YKL132C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTATACTGGCAAGTGACAGTTGTG
YGR126W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAATCGAAAATTCTATGAAAAAACCC
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YHR113W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGACAACAATTTCAGATTCTATGG
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YGR126W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAATCGAAAATTCTATGAAAAAACCC
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YHR195W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGTATCTAAATGGTTGAGAGTATG
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YGR180c GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGAAGTCATCATCAAAGTTAATTTC
YJL179W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAATTCTTCATCAATGCCTTTAGATT
[0371]YJL001W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATAGTTGTTCATATTCATCAGGGT
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YJL152W GATCCCCGGGAATTGCCATGTCACGCAGACATGCGACTGCG
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YLR029C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATTTTCTGTATCTCCACAAGGAC
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YLR321C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTACATTCTCATTGTGGTTTCTAAG
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YMR100W GATCCCCGGGAATTGCCATGCTATTGATTGTTTGTTCCACGGACT
YMR210W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG
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YPL011C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGCGTTTTTTTTTGCCCTTCTTC
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YMR210W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG
YMR318C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACATGAGGTTCATGTTCATGTTAG
YMR069W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATTTTTTACTTAATTTCATCCATTTAG
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YNL024C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAATCTCTTTCAAAACAGACAGCAA
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YNL029C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAACTCTCTTGTCCCGATTTCTC
YMR115W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGTTTCTCAAGTGACTATTGTGAA
YNL244C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACGAATCAGTCCGATTGGACTT
YNL334C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAAGCTGGAAGAGCCAATCTCTT
YNR018W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATTTCAAAGTCTTCAACAATTTTTCT
YNL277W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGTCTTCATGCTTATCACAGAAC
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YOL123W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATTCGTCTTCTTCCAAAGTTTGAG
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[0372]YOR260W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATTTAAGCTCGAAATGGCTATTGA
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b0019 TTGCTCTTCGTTAAACTGATGGACGCAAACGAACG
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b2796 TTGCTCTTCGTTAGCTGAACAGAGAGTAGAAGATT
b2082 TTGCTCTTCGTTACATCCACATAATTTGCTGCCC
b0124 TTGCTCTTCGTTACTTCACATCATCCGGCAGCG
b3116 TTGCTCTTCGTTAAAACAGTTTGTATACGATGTTCAG
b1830 TTGCTCTTCGTTACTTGACGGGAGCGGGTTGT
b1453 TTGCTCTTCGTTAACTCGCCGTTTCAGGCTTAAA
b2664 TTGCTCTTCGTTAATTGCCAGCCATCGCCTG
b2799 TTGCTCTTCGTTACCAGGCGGTATGGTAAAGCT
b3327 TTGCTCTTCGTTAATTAATCATTGAGTTAAGTTGAAGA
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YGR161C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTATTTCAATGAACCAGTTTGGAATC
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YDL005C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTATATATTGAAGCCGCTGAGGTC
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YBR064W GATCCCCGGGAATTGCCATGCTAAAATATGGAGGAACTAGGTTTAA
b0019 TTGCTCTTCGTTAAACTGATGGACGCAAACGAACG
b2148 TTGCTCTTCGTTATTTCTTACGCGCGTATTTCAGTG
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b2082 TTGCTCTTCGTTACATCCACATAATTTGCTGCCC
b0124 TTGCTCTTCGTTACTTCACATCATCCGGCAGCG
b3116 TTGCTCTTCGTTAAAACAGTTTGTATACGATGTTCAG
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b2664 TTGCTCTTCGTTAATTGCCAGCCATCGCCTG
b2799 TTGCTCTTCGTTACCAGGCGGTATGGTAAAGCT
b3327 TTGCTCTTCGTTAATTAATCATTGAGTTAAGTTGAAGA
b0970 TTGCTCTTCGTTAATCGCGGCTAGCGAAGCCC
YER003C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTAATTTGGTTCCACAAAGGCTCTA
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YBR112C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGTCGTCGTAGTTTTCATCTTCT
YNL079C GATCCCCGGGAATTGCCATGTCACAAGTTTTCCAGAGATGCAGC
YFR042W GATCCCCGGGAATTGCCATGTCATTTTGTTAATAGTTTTTTGTATGCT
YER137C GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATTTCTTGGGTATAACTGTCAGTC
YKL103C GATCCCCGGGAATTGCCATGTCACAACTCGCCGAATTCATCGTA
YNL090W GATCCCCGGGAATTGCCATGTTATAAAATTATGCAACAGTTAGCCC
YGR161C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTATTTCAATGAACCAGTTTGGAATC
YDR071C GATCCCCGGGAATTGCCATGCTAGTTGTCGTATTCTTCCTTAATTA
[0373] 载体制备
[0374] 基于修饰的二元载体pPZP主链(含有用于细菌选择的卡那霉素基因；Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol. Biol.，25：989-994) 的 优 选 的 二 元 载 体
1bxbigResgen(用于酵母)和1bxSuperCoLic(用于大肠杆菌)在其T-DNA携带了由
masl’启动子(Velten等，1984，EMBO J.3，2723-2730；Mengiste，Amedeo和Paszkowski，
1997，Plant J.，12，945-948)驱动的选择标记bar基因(De Block等，1987，EMBO J.6，
2513-2518)。此外T-DNA还含有克隆盒前的强启动子35S(用于酵母)(Kay等，1987，
Science 236，1299-1302)或超级启动子(用于大肠杆菌)(Ni等，1995，Plant Journal
7，661-676)和克隆盒后的nos终止子(Depicker A.Stachel S.Dhaese P.Zambrys ki
P.Goodman HM.Nopaline synthase：transcript mapping and DNA sequence.Journal of
Molecular&Applied Genetics.1(6)：561-73，1982.)。克隆盒分别由以下序列组成：
1bxbigResgen(用于酵母)和1bxSuperCoLic(用于大肠杆菌)在其T-DNA携带了由
masl’启动子(Velten等，1984，EMBO J.3，2723-2730；Mengiste，Amedeo和Paszkowski，
1997，Plant J.，12，945-948)驱动的选择标记bar基因(De Block等，1987，EMBO J.6，
2513-2518)。此外T-DNA还含有克隆盒前的强启动子35S(用于酵母)(Kay等，1987，
Science 236，1299-1302)或超级启动子(用于大肠杆菌)(Ni等，1995，Plant Journal
7，661-676)和克隆盒后的nos终止子(Depicker A.Stachel S.Dhaese P.Zambrys ki
P.Goodman HM.Nopaline synthase：transcript mapping and DNA sequence.Journal of
Molecular&Applied Genetics.1(6)：561-73，1982.)。克隆盒分别由以下序列组成：
[0375] 酵母：5′-GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCAATTCCCGGGGATC-3或
[0376] 大肠杆菌：5′-TTGCTCTTCCATGGCAATGATTAATTAACGAAGAGCAA-3′。
[0377] 其他选择标记系统(如AHAS标记)或其他启动子，例如超级启动子(见前文)、35S启动子(见前文)、泛素启动子(Callis等，J.Biol.Chem.，1990，265：12486-12493；
US5,510,474；US6,020,190；Kawalleck 等 .，Plant.Molecular Biology，1993，21：
673-684)或34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)也可类似的用于本发明，并为
本领域技术人员所公知。使用由供应商(MBI Fermentas，德国)提供的标准方案用EcoR
和SmaI(用于酵母)或SmaI和SacI(用于大肠杆菌)将载体线性化，并使用Qiagen柱
(Qiagen，Hilden，德国)纯化。
US5,510,474；US6,020,190；Kawalleck 等 .，Plant.Molecular Biology，1993，21：
673-684)或34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)也可类似的用于本发明，并为
本领域技术人员所公知。使用由供应商(MBI Fermentas，德国)提供的标准方案用EcoR
和SmaI(用于酵母)或SmaI和SacI(用于大肠杆菌)将载体线性化，并使用Qiagen柱
(Qiagen，Hilden，德国)纯化。
[0378] 连接和转化
[0379] 使用由供应商(MBI Fermentas，德国)提供的标准方案用EcoR和SmaI(用于酵母)或SmaI和SacI(用于大肠杆菌)消化ORF片段(～100ng)，使用Qiagen柱(Qiagen，
Hilden，德国)纯化，并使用标准方案(Maniatis等)连接进二元载体系统(～30ng)的克
隆盒中。
Hilden，德国)纯化，并使用标准方案(Maniatis等)连接进二元载体系统(～30ng)的克
隆盒中。
[0380] 对于内部的EcoRI、SmaI和SacI限制性位点应用了平末端克隆操作。直接纯化未消化的ORF片段并连接进二元载体的克隆盒中。这种情况下EcoR I位点通过Klenow反应
和钝化Sac I位点的Pfu DNA聚合酶补平。
和钝化Sac I位点的Pfu DNA聚合酶补平。
[0381] 使用标准热激程序(Maniatis等)将连接产物转化进大肠杆菌(DH5α)中。转化菌落在LB培养基上培养并在37℃用各自的抗生素(Km)选择16h。通过结合使用载体特异
引物和各自ORF特异引物的对照PCR鉴定阳性克隆。
引物和各自ORF特异引物的对照PCR鉴定阳性克隆。
[0382] 质粒的制备
[0383] 使用标准方案(Qiagen，Hilden，德国)从阳性克隆中制备质粒DNA。
[0384] 农杆菌的转化
[0385] 使用热激或电穿孔方案将质粒转化进根瘤农杆菌(GV3101pMP90；Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)。转化的菌落在YEP培养基上培养并通过各自
的抗生素在28℃选择2天。用这些农杆菌培养物进行植物转化。
的抗生素在28℃选择2天。用这些农杆菌培养物进行植物转化。
[0386] 根据标准条件：Bechtold 1993(Bechtold，N.，Ellis，J.，Pelletier，G.1993.In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration ofArabidopsis
thaliana plants C.R.Acad.Sci.Paris.316：1194-1199)；Bent 等 .1994(Bent，A.，
Kunkel，B.N.，Dahlbeck，D.，Brown，K.L.，Schmidt，R.，Giraudat，J.，Leung，J.， 和
Staskawicz，B.J.1994；PPCS2 of Arabidopsisthaliana：Aleucin-rich repeat class of
plant disease resistant genes；Science265：1856-1860)培养和转化拟南芥。
thaliana plants C.R.Acad.Sci.Paris.316：1194-1199)；Bent 等 .1994(Bent，A.，
Kunkel，B.N.，Dahlbeck，D.，Brown，K.L.，Schmidt，R.，Giraudat，J.，Leung，J.， 和
Staskawicz，B.J.1994；PPCS2 of Arabidopsisthaliana：Aleucin-rich repeat class of
plant disease resistant genes；Science265：1856-1860)培养和转化拟南芥。
[0387] 转基因拟南芥植物在York培养室中在含有4∶1(体积/体积)的土壤和石英砂混合物的盆中分别培养。标准培养条件为：16小时光照和8小时黑暗的光周期、20℃、60％
相对湿度和150uE光子通量密度。将播下的种子在黑暗中于4℃保持3天以诱导萌发。每
天对植物浇水直至约3周龄时通过停止浇水施加干旱。同时，以每隔一天10％的增量降低
相对湿度至20％。停止浇水约12天后，大多数植物显示出可见的损伤症状(如萎蔫和叶变
为褐色)，而耐性植物鉴定为可见的饱满且颜色为健康的绿色。接 下去的三天将植物与相
邻植物作比较对干旱损伤的症状进行评分。
相对湿度和150uE光子通量密度。将播下的种子在黑暗中于4℃保持3天以诱导萌发。每
天对植物浇水直至约3周龄时通过停止浇水施加干旱。同时，以每隔一天10％的增量降低
相对湿度至20％。停止浇水约12天后，大多数植物显示出可见的损伤症状(如萎蔫和叶变
为褐色)，而耐性植物鉴定为可见的饱满且颜色为健康的绿色。接 下去的三天将植物与相
邻植物作比较对干旱损伤的症状进行评分。
[0388] 进行了三个相继的实验。第一个实验中，为每个测试基因播种10个独立的T2株系。测定未显示出可见的损伤症状的植物的百分数。第二个实验中，在第一个实验中评分
为耐受的株系以同样的实验程序进行确认筛选。在该实验中，每个耐受株系的植物如前
培养和处理。第三个实验中，如前培养和处理最耐受株系的至少7个复本。在野生型对
照可见死亡后，测定平均和最大的干旱存活天数。另外使用Mini-PAM(Heinz Walz GmbH，
Effeltrich，德国)在胁迫和非胁迫植物中进行叶绿素荧光测定。
为耐受的株系以同样的实验程序进行确认筛选。在该实验中，每个耐受株系的植物如前
培养和处理。第三个实验中，如前培养和处理最耐受株系的至少7个复本。在野生型对
照可见死亡后，测定平均和最大的干旱存活天数。另外使用Mini-PAM(Heinz Walz GmbH，
Effeltrich，德国)在胁迫和非胁迫植物中进行叶绿素荧光测定。
[0389] 第一个实验中，在干旱12天后，测试中的对照非转基因拟南芥和表达其他转基因的大多数转基因株系显示出极端的可见胁迫症状，包括坏死和细胞死亡。若干表达该基因
的植物通过其饱满外观和保持为绿色显示其保持了存活力。
的植物通过其饱满外观和保持为绿色显示其保持了存活力。
[0390] 第二个实验比较了每个基因较少的独立转基因株系，但是比较了每个独立转基因事件中更大量的后代。该实验确证了前面的结果。含有特定SRP编码酵母基因的株系比对
照存活更长时间。某些情况下，转基因株系在对照死亡后存活超过3天。
照存活更长时间。某些情况下，转基因株系在对照死亡后存活超过3天。
[0391] 根据第一个和第二个实验的结果鉴定了含有特定酵母SRP编码基因的一些主要株系，所述株系对于野生型后的平均存活天数和/或命中百分比(hit percentage)显示出
最佳的结果。
最佳的结果。
[0392] 在第三个实验中，用多个复本(每株系4-80植株)对这些主要株系进行了测试。测定了主要株系植物比野生型多存活的平均天数，即数字“1”指平均而言，过表达该ORF的
植物比野生型平均多存活1天。WT该列的值为“0”。结果总结于表3。
植物比野生型平均多存活1天。WT该列的值为“0”。结果总结于表3。
[0393] 表3：在使用来源于一个转基因株系的若干植物的第三个实验中，3周龄植物受到干旱胁迫后，表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌的多种SRP编码基因的转基因拟南芥的干旱
耐性(实验3)。以指出数量的转基因植物(测试的植物)在对照(未转化的野生型)之后
生存的平均天数(WT之后生存的平均天数)来衡量干旱抗性。命中百分比表示主要株系的
测试植物中确实具有抗性的部分，即数字“50”表示测试植物的一半具有抗性(较WT存活
更久)。对于WT该列的值为“0”。
耐性(实验3)。以指出数量的转基因植物(测试的植物)在对照(未转化的野生型)之后
生存的平均天数(WT之后生存的平均天数)来衡量干旱抗性。命中百分比表示主要株系的
测试植物中确实具有抗性的部分，即数字“50”表示测试植物的一半具有抗性(较WT存活
更久)。对于WT该列的值为“0”。
[0394]Sequ.ID No. 基因 测试的植物 WT之后的 平均存活天数
1 YGL263W 12 1.17
3 YGR004W 11 1.36
5 YGR014W 11 0.82
7 YGL239C 13 2.4
9 YBL060W 14 1.6
11 YGL166W 14 1.07
13 YDL202W 15 0.47
15 YAL046C 14 1.9
17 YDR101C 14 3.57
19 YDR108W 14 0.5
21 YAL064W 33 2.29
23 YDR134C 13 0.8
26 YFL031w 13 1.3
28 YFL052W 14 1.1
30 YFL042C 11 1.3
32 YBR025C 11 1.4
34 YER174C 22 1.05
36 YBR051W 10 1.2
38 YER175C 11 1.7
40 YDR521W 14 0.5
42 YER167W 35 0.66
44 YER123W 11 2.2
46 YDR415C 7 2.71
48 YEL052W 4 1.5
50 YDR536W 14 1.5
52 YDR513W 7 3.14
54 YEL045C 14 1.64
56 YEL041W 13 1.77
58 YDR415C 7 2.71
60 YDL238C 35 1.2
62 YBR282W 14 1.79
64 YBR258C 9 3.4
66 YCL001W-A 36 1.78
68 YBR274W 14 2
70 YHR090C 8 4.5
72 YGR121C 40 1.6
74 YGR127W 8 1.4
1 YGL263W 12 1.17
3 YGR004W 11 1.36
5 YGR014W 11 0.82
7 YGL239C 13 2.4
9 YBL060W 14 1.6
11 YGL166W 14 1.07
13 YDL202W 15 0.47
15 YAL046C 14 1.9
17 YDR101C 14 3.57
19 YDR108W 14 0.5
21 YAL064W 33 2.29
23 YDR134C 13 0.8
26 YFL031w 13 1.3
28 YFL052W 14 1.1
30 YFL042C 11 1.3
32 YBR025C 11 1.4
34 YER174C 22 1.05
36 YBR051W 10 1.2
38 YER175C 11 1.7
40 YDR521W 14 0.5
42 YER167W 35 0.66
44 YER123W 11 2.2
46 YDR415C 7 2.71
48 YEL052W 4 1.5
50 YDR536W 14 1.5
52 YDR513W 7 3.14
54 YEL045C 14 1.64
56 YEL041W 13 1.77
58 YDR415C 7 2.71
60 YDL238C 35 1.2
62 YBR282W 14 1.79
64 YBR258C 9 3.4
66 YCL001W-A 36 1.78
68 YBR274W 14 2
70 YHR090C 8 4.5
72 YGR121C 40 1.6
74 YGR127W 8 1.4
[0395]76 YGR150C 12 2.6
78 YKL037W 14 0.79
80 YKL051W 16 2.4
82 YKL120W 14 0.64
84 YKL011C 12 1.9
86 YKL017C 10 1.8
88 YKL049C 80 1.92
90 YKL132C 33 1.82
92 YGR126W 8 2.3
94 YKL070W 14 2.1
96 YKL058W 9 1.44
98 YHR130C 9 1.8
100 YIL070C 13 0.69
102 YHR195W 14 1.9
104 YIR022W 14 1.07
106 YJL089W 14 0.86
108 YJL172W 11 0.82
110 YHR113W 15 2
112 YHR175W 9 0.78
114 YJL024C 13 0.69
116 YGR180c 14 2.9
118 YJL179W 18 1.3
120 YJL001W 14 1.6
122 YJL208C 12 1.4
124 YJL152W 13 1.3
126 YJL131C 14 0.6
128 YJL151C 14 1.9
130 YLR441C 10 2
132 YLR415C 14 1.6
134 YLR212C 13 0.64
136 YLR029C 14 1.56
137 YLL041C 13 0.92
139 YLR105C 14 0.86
141 YIL136W 8 2.25
143 YLR215C 13 1.77
145 YLR321C 14 1.29
147 YMR260C 11 2.09
149 YNL120C 7 2
151 YLR407W 12 1.17
153 YMR197C 14 0.57
155 YMR100W 12 1.25
157 YMR210W 10 1.1
78 YKL037W 14 0.79
80 YKL051W 16 2.4
82 YKL120W 14 0.64
84 YKL011C 12 1.9
86 YKL017C 10 1.8
88 YKL049C 80 1.92
90 YKL132C 33 1.82
92 YGR126W 8 2.3
94 YKL070W 14 2.1
96 YKL058W 9 1.44
98 YHR130C 9 1.8
100 YIL070C 13 0.69
102 YHR195W 14 1.9
104 YIR022W 14 1.07
106 YJL089W 14 0.86
108 YJL172W 11 0.82
110 YHR113W 15 2
112 YHR175W 9 0.78
114 YJL024C 13 0.69
116 YGR180c 14 2.9
118 YJL179W 18 1.3
120 YJL001W 14 1.6
122 YJL208C 12 1.4
124 YJL152W 13 1.3
126 YJL131C 14 0.6
128 YJL151C 14 1.9
130 YLR441C 10 2
132 YLR415C 14 1.6
134 YLR212C 13 0.64
136 YLR029C 14 1.56
137 YLL041C 13 0.92
139 YLR105C 14 0.86
141 YIL136W 8 2.25
143 YLR215C 13 1.77
145 YLR321C 14 1.29
147 YMR260C 11 2.09
149 YNL120C 7 2
151 YLR407W 12 1.17
153 YMR197C 14 0.57
155 YMR100W 12 1.25
157 YMR210W 10 1.1
[0396]159 YMR318C 13 0.85
161 YMR069W 8 1.25
163 YNL076W 13 1.31
165 YNL024C 13 1.08
167 YNL125C 4 1.75
169 YNL029C 13 1.92
171 YMR115W 12 0.75
173 YNL244C 11 1.55
175 YNL334C 14 1.5
177 YNR018W 14 1.29
179 YNL277W 14 1.14
181 YOL118C 14 1.71
183 YOL123W 14 0.71
185 YOR020C 12 1.83
187 YOL116W 13 1.08
189 YOR305w 15 1.2
191 YPL267W 6 2.5
193 YPL229w 5 2
195 YPL038W 10 1.3
197 YPR047W 11 1
199 YPL011C 12 0.75
201 YPR148C 10 1.1
203 YOL103W 12 0.75
205 YOR016C 14 0.79
207 YPL079W 15 1.33
209 YOR260W 7 1.29
211 YOR360C 15 1.53
213 YDL060W 15 0.67
215 YDL005C 15 1
217 YPL210C 15 1.13
219 YMR118C 14 1.14
221 YPR052C 14 1.07
223 YLR224W 10 2.1
225 YLR275W 9 2.44
227 YMR154C 15 1.27
229 YDR205w 12 1.08
231 YPR037C 12 2.17
233 YNR008W 14 2.29
235 YOR084W 10 2.2
237 YGR054W 14 1.5
239 YGL106W 13 3.46
241 YAL067C 13 1.62
161 YMR069W 8 1.25
163 YNL076W 13 1.31
165 YNL024C 13 1.08
167 YNL125C 4 1.75
169 YNL029C 13 1.92
171 YMR115W 12 0.75
173 YNL244C 11 1.55
175 YNL334C 14 1.5
177 YNR018W 14 1.29
179 YNL277W 14 1.14
181 YOL118C 14 1.71
183 YOL123W 14 0.71
185 YOR020C 12 1.83
187 YOL116W 13 1.08
189 YOR305w 15 1.2
191 YPL267W 6 2.5
193 YPL229w 5 2
195 YPL038W 10 1.3
197 YPR047W 11 1
199 YPL011C 12 0.75
201 YPR148C 10 1.1
203 YOL103W 12 0.75
205 YOR016C 14 0.79
207 YPL079W 15 1.33
209 YOR260W 7 1.29
211 YOR360C 15 1.53
213 YDL060W 15 0.67
215 YDL005C 15 1
217 YPL210C 15 1.13
219 YMR118C 14 1.14
221 YPR052C 14 1.07
223 YLR224W 10 2.1
225 YLR275W 9 2.44
227 YMR154C 15 1.27
229 YDR205w 12 1.08
231 YPR037C 12 2.17
233 YNR008W 14 2.29
235 YOR084W 10 2.2
237 YGR054W 14 1.5
239 YGL106W 13 3.46
241 YAL067C 13 1.62
[0397]243 YIL023c 15 1.73
245 YBR064W 15 1.13
247 b0020 13 0.78
249 b2148 15 3.13
251 b2796 15 2.33
253 b2082 14 2.43
255 b0124 15 2.87
257 b3116 15 1.07
259 b1830 15 2.07
261 b1453 14 2.29
263 b2664 13 1.85
265 b2799 15 1.87
267 b3327 15 1.47
269 b0970 15 1.33
271 YER003C 5 1
273 YCL027W 9 0.56
275 YBR112C 10 0.5
277 YNL079C 9 0.67
279 YFR042W 9 0.78
281 YER137C 3 0
283 YKL103C 9 1
285 YNL090W 6 0.83
287 YGR161C 7 0.86
289 YDR071C 9 0.78
245 YBR064W 15 1.13
247 b0020 13 0.78
249 b2148 15 3.13
251 b2796 15 2.33
253 b2082 14 2.43
255 b0124 15 2.87
257 b3116 15 1.07
259 b1830 15 2.07
261 b1453 14 2.29
263 b2664 13 1.85
265 b2799 15 1.87
267 b3327 15 1.47
269 b0970 15 1.33
271 YER003C 5 1
273 YCL027W 9 0.56
275 YBR112C 10 0.5
277 YNL079C 9 0.67
279 YFR042W 9 0.78
281 YER137C 3 0
283 YKL103C 9 1
285 YNL090W 6 0.83
287 YGR161C 7 0.86
289 YDR071C 9 0.78
[0398] 在另一实施方案中，对于个别的主要株系，测试了含有同一基因构建体但由不同的转化事件产生的其他株系。在这些株系中，特定的酵母SRP编码基因整合到植物基因组
的不同位点。结果对应表3总结于表4。结果证明植物中的胁迫耐性和/或抗性依赖于SRP
的表达而不是插入事件。
的不同位点。结果对应表3总结于表4。结果证明植物中的胁迫耐性和/或抗性依赖于SRP
的表达而不是插入事件。
[0399] 表4：在使用来源于若干转基因株系每株系一株的植物的第三个实验中，3周龄植物受到干旱胁迫后，表达选定的来源于酿酒酵母或大肠杆菌的SRP编码基因的转基因拟南
芥的干旱耐性(实验3)。以指出数量的转基因植物(测试的植物)在对照(未转化的野生
型)之后生存的平均天数(WT之后生存的平均天数)来衡量干旱抗性。命中百分比表示主
要株系的测试植物中确实具有抗性的部分，即数字“50”表示测试植物的一半具有抗性(较
WT存活更久)。对于WT该列的值为“0”。
芥的干旱耐性(实验3)。以指出数量的转基因植物(测试的植物)在对照(未转化的野生
型)之后生存的平均天数(WT之后生存的平均天数)来衡量干旱抗性。命中百分比表示主
要株系的测试植物中确实具有抗性的部分，即数字“50”表示测试植物的一半具有抗性(较
WT存活更久)。对于WT该列的值为“0”。
[0400]Sequ. ID N0. 基因 测试的其它 株系数量 WT之后的平均存活 天数
1 YGL263W 7 1.43
3 YGR004W 8 1
5 YGR014W 8 0.75
7 YGL239C 5 1
9 YBL060W 8 2
11 YGL166W 8 0.63
13 YDL202W 8 0.25
15 YAL046C 7 1.3
17 YDR101C 9 1.1
19 YDR108W 9 0.22
21 YAL064W 8 3
23 YDR134C 6 2.2
26 YFL031w 9 2.3
28 YFL052W 5 1.4
32 YBR025C 5 1.2
34 YER174C 9 0.5
36 YBR051W 6 1.3
38 YER175C 4 1.4
40 YDR521W 3 0.7
44 YER123W 6 0.3
46 YDR415C 7 1.4
48 YEL052W 3 1.33
50 YDR536W 8 1.25
52 YDR513W 4 1.5
54 YEL045C 5 1.2
56 YEL041W 8 0.88
60 YDL238C 6 0.17
62 YBR282W 9 2.2
64 YBR258C 7 1.7
66 YCL001W-A 7 0.57
68 YBR274W 9 0.78
70 YHR090C 6 2.7
72 YGR121C 9 0.8
74 YGR127W 6 2.5
76 YGR150C 5 3
78 YKL037W 9 0.78
80 YKL051W 5 1.8
82 YKL120W 8 0.63
84 YKL011C 5 1.4
86 YKL017C 5 0.6
88 YKL049C 9 1.4
90 YKL132C 7 0.7
92 YGR126W 6 1.3
1 YGL263W 7 1.43
3 YGR004W 8 1
5 YGR014W 8 0.75
7 YGL239C 5 1
9 YBL060W 8 2
11 YGL166W 8 0.63
13 YDL202W 8 0.25
15 YAL046C 7 1.3
17 YDR101C 9 1.1
19 YDR108W 9 0.22
21 YAL064W 8 3
23 YDR134C 6 2.2
26 YFL031w 9 2.3
28 YFL052W 5 1.4
32 YBR025C 5 1.2
34 YER174C 9 0.5
36 YBR051W 6 1.3
38 YER175C 4 1.4
40 YDR521W 3 0.7
44 YER123W 6 0.3
46 YDR415C 7 1.4
48 YEL052W 3 1.33
50 YDR536W 8 1.25
52 YDR513W 4 1.5
54 YEL045C 5 1.2
56 YEL041W 8 0.88
60 YDL238C 6 0.17
62 YBR282W 9 2.2
64 YBR258C 7 1.7
66 YCL001W-A 7 0.57
68 YBR274W 9 0.78
70 YHR090C 6 2.7
72 YGR121C 9 0.8
74 YGR127W 6 2.5
76 YGR150C 5 3
78 YKL037W 9 0.78
80 YKL051W 5 1.8
82 YKL120W 8 0.63
84 YKL011C 5 1.4
86 YKL017C 5 0.6
88 YKL049C 9 1.4
90 YKL132C 7 0.7
92 YGR126W 6 1.3
[0401]94 YKL070W 6 2
96 YKL058W 8 0.88
98 YHR130C 9 2.1
100 YIL070C 7 0.71
102 YHR195W 9 2.1
104 YIR022W 9 1.22
106 YJL089W 7 0.6
108 YJL172W 4 1
110 YHR113W 7 1.6
112 YHR175W 3 1
114 YJL024C 6 1.33
116 YGR180c 8 2.7
118 YJL179W 8 1.8
120 YJL001W 9 0.7
122 YJL208C 6 1.7
124 YJL152W 8 0.3
126 YJL131C 6 1
128 YJL151C 8 1.6
130 YLR441C 7 2.6
132 YLR415C 9 0.3
134 YLR212C 7 2.14
136 YLR029C 8 0.25
137 YLL041C 7 0.86
139 YLR105C 7 0.29
141 YIL136W 9 1.75
143 YLR215C 8 1.25
145 YLR321C 7 0.86
147 YMR260C 8 0.88
149 YNL120C 9 1.56
151 YLR407W 5 0.4
153 YMR197C 9 1.22
155 YMR100W 8 0.88
157 YMR210W 8 0.88
159 YMR318C 8 0.63
161 YMR069W 9 0.44
163 YNL076W 4 1.75
165 YNL024C 9 1.78
167 YNL125C 7 2.14
169 YNL029C 9 1.88
171 YMR115W 9 1.44
173 YNL244C 8 0.25
175 YNL334C 9 1.33
177 YNR018W 9 1.22
179 YNL277W 8 1
181 YOL118C 9 0.89
96 YKL058W 8 0.88
98 YHR130C 9 2.1
100 YIL070C 7 0.71
102 YHR195W 9 2.1
104 YIR022W 9 1.22
106 YJL089W 7 0.6
108 YJL172W 4 1
110 YHR113W 7 1.6
112 YHR175W 3 1
114 YJL024C 6 1.33
116 YGR180c 8 2.7
118 YJL179W 8 1.8
120 YJL001W 9 0.7
122 YJL208C 6 1.7
124 YJL152W 8 0.3
126 YJL131C 6 1
128 YJL151C 8 1.6
130 YLR441C 7 2.6
132 YLR415C 9 0.3
134 YLR212C 7 2.14
136 YLR029C 8 0.25
137 YLL041C 7 0.86
139 YLR105C 7 0.29
141 YIL136W 9 1.75
143 YLR215C 8 1.25
145 YLR321C 7 0.86
147 YMR260C 8 0.88
149 YNL120C 9 1.56
151 YLR407W 5 0.4
153 YMR197C 9 1.22
155 YMR100W 8 0.88
157 YMR210W 8 0.88
159 YMR318C 8 0.63
161 YMR069W 9 0.44
163 YNL076W 4 1.75
165 YNL024C 9 1.78
167 YNL125C 7 2.14
169 YNL029C 9 1.88
171 YMR115W 9 1.44
173 YNL244C 8 0.25
175 YNL334C 9 1.33
177 YNR018W 9 1.22
179 YNL277W 8 1
181 YOL118C 9 0.89
[0402]183 YOL123W 8 0.88
185 YOR020C 9 0.44
187 YOL116W 9 1.67
189 YOR305w 7 0.28
191 YPL267W 4 0.75
193 YPL229w 5 1.6
195 YPL038W 5 0.4
197 YPR047W 2 1
199 YPL011C 6 0.5
201 YPR148C 9 0.33
203 YOL103W 9 0.33
205 YOR016C 9 0.56
211 YOR360C 8 0.38
213 YDL060W 8 0.5
215 YDL005C 9 0.44
217 YPL210C 8 1.5
219 YMR118C 10 1.1
221 YPR052C 7 0.86
223 YLR224W 9 1.22
225 YLR275W 8 1.75
227 YMR154C 9 1.11
229 YDR205w 4 1
231 YPR037C 5 3.4
233 YNR008W 8 0.75
235 YOR084W 6 0.5
239 YGL106W 7 2.14
241 YAL067C 6 1.83
243 YIL023c 1 3
245 YBR064W 7 0.71
247 b0020 4 1.5
249 b2148 10 0.1
251 b2796 11 0.72
253 b2082 9 1.22
255 b0124 9 3.3
257 b3116 8 1
259 b1830 7 1.71
261 b1453 8 1.13
263 b2664 9 1
267 b3327 10 0.8
269 b0970 8 1.5
271 YER003C 12 2.08
273 YCL027W 14 2.14
275 YBR112C 11 3.3
277 YNL079C 13 2.69
279 YFR042W 7 2.3
185 YOR020C 9 0.44
187 YOL116W 9 1.67
189 YOR305w 7 0.28
191 YPL267W 4 0.75
193 YPL229w 5 1.6
195 YPL038W 5 0.4
197 YPR047W 2 1
199 YPL011C 6 0.5
201 YPR148C 9 0.33
203 YOL103W 9 0.33
205 YOR016C 9 0.56
211 YOR360C 8 0.38
213 YDL060W 8 0.5
215 YDL005C 9 0.44
217 YPL210C 8 1.5
219 YMR118C 10 1.1
221 YPR052C 7 0.86
223 YLR224W 9 1.22
225 YLR275W 8 1.75
227 YMR154C 9 1.11
229 YDR205w 4 1
231 YPR037C 5 3.4
233 YNR008W 8 0.75
235 YOR084W 6 0.5
239 YGL106W 7 2.14
241 YAL067C 6 1.83
243 YIL023c 1 3
245 YBR064W 7 0.71
247 b0020 4 1.5
249 b2148 10 0.1
251 b2796 11 0.72
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255 b0124 9 3.3
257 b3116 8 1
259 b1830 7 1.71
261 b1453 8 1.13
263 b2664 9 1
267 b3327 10 0.8
269 b0970 8 1.5
271 YER003C 12 2.08
273 YCL027W 14 2.14
275 YBR112C 11 3.3
277 YNL079C 13 2.69
279 YFR042W 7 2.3
[0403]281 YER137C 13 2.2
283 YKL103C 10 2.8
285 YNL090W 12 4.33
287 YGR161C 12 2.7
289 YDR071C 11 3
283 YKL103C 10 2.8
285 YNL090W 12 4.33
287 YGR161C 12 2.7
289 YDR071C 11 3
[0404] 光合产量的叶绿素荧光测定证实了严酷的干旱胁迫在对照植物中完全抑制了光合作用，但转基因主要株系能更长时间的维持光合作用的功能(表5)。
[0405] 表5：在使用来源于一个转基因株系的若干植物的第三个实验中，3周龄植物受到干旱胁迫后，表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌的多种SRP编码基因的转基因拟南芥的干旱
耐性(实验3)。以光合产量报告干旱耐性，所述产量通过在干旱胁迫实验中在三个不同的
时间点测量的叶绿素荧光来衡量，并与未转化的野生型对照进行比较。对于每种转基因株
系，平均指定5株复本植物，野生型的值为同一实验中测量的20-25株植物的平均值。
耐性(实验3)。以光合产量报告干旱耐性，所述产量通过在干旱胁迫实验中在三个不同的
时间点测量的叶绿素荧光来衡量，并与未转化的野生型对照进行比较。对于每种转基因株
系，平均指定5株复本植物，野生型的值为同一实验中测量的20-25株植物的平均值。
[0406] 表5
[0407]Sequ.ID 基因 停止浇水6天后的光合野 生 停止浇水10天后的光合野生型 停止浇水14天后的光野 生
No. 产量 型 产量 合产量 型
1 YGL263W 751 766 765 654 264 106
3 YGR004W 759 766 755 654 246 106
5 YGR014W 759 766 752 654
7 YGL239C 782 757 786 610
9 YBL060W 743 757 782 610 108 16
11 YGL166W 752 736 747 709
13 YDL202W 790 766 508 548
15 YAL046C 788 760 756 549 216 20
19 YDR108W 756 736 739 709 0 20
23 YDR134C 757 760 765 549 273 20
26 YFL031w 763 760 766 549 784 20
28 YFL052W 757 757 753 610
30 YFL042C 743 757 780 610
32 YBR025C 763 760 762 549 631 20
36 YBR051W 741 760 696 549 456 20
38 YER175C 749 757 627 610 140 16
No. 产量 型 产量 合产量 型
1 YGL263W 751 766 765 654 264 106
3 YGR004W 759 766 755 654 246 106
5 YGR014W 759 766 752 654
7 YGL239C 782 757 786 610
9 YBL060W 743 757 782 610 108 16
11 YGL166W 752 736 747 709
13 YDL202W 790 766 508 548
15 YAL046C 788 760 756 549 216 20
19 YDR108W 756 736 739 709 0 20
23 YDR134C 757 760 765 549 273 20
26 YFL031w 763 760 766 549 784 20
28 YFL052W 757 757 753 610
30 YFL042C 743 757 780 610
32 YBR025C 763 760 762 549 631 20
36 YBR051W 741 760 696 549 456 20
38 YER175C 749 757 627 610 140 16
[0408]44 YER123W 767 757 780 610 147 16
48 YEL052W 750 736 773 710 177 20
50 YDR536W 753 736 772 709 293 20
52 YDR513W 782 794 660 413 411 54
54 YEL045C 755 736 553 709 147 20
56 YEL041W 758 736 769 709 129 20
62 YBR282W 759 760 724 549 221 20
64 YBR258C 759 757 772 610 144 16
68 YBR274W 749 736 769 709 146 20
70 YHR090C 749 760 765 549 620 20
74 YGR127W 740 549 576 20
76 YGR150C 771 760 742 549 618 20
78 YKL037W 761 736 760 709 134 20
80 YKL051W 733 760 740 549 153 20
82 YKL120W 759 736 518 709
84 YKL011C 750 760 694 549 434 20
86 YKL017C 744 549 734 549 754 20
92 YGR126W 784 760 750 549 159 20
94 YKL070W 774 760 734 549 244 20
96 YKL058W 752 766 765 654 495 20
98 YHR130C 772 760 756 549 147 20
100 YIL070C 768 766 755 654
102 YHR195W 753 757 693 610 141 16
104 YIR022W 761 736 771 709
108 YJL172W 756 766 758 654 293 20
110 YHR113W 749 760 754 549 142 20
112 YHR175W 768 766 758 654 465 106
114 YJL024C 762 766 758 654 736 106
116 YGR180c 763 757 779 610
118 YJL179W 744 760 606 549 310 20
120 YJL001W 748 757 519 610 135 16
122 YJL208C 685 549 49 20
124 YJL152W 754 757 726 610
126 YJL131C 750 757 758 610
128 YJL151C 755 760 764 549 152 20
130 YLR441C 745 760 762 549 277 20
132 YLR415C 739 757 503 610 144 16
134 YLR212C 740 736 759 709 103 20
136 YLR029C 746 736 780 709 292 20
139 YLR105C 751 736 764 709
141 YIL136W 749 736 779 710 422 20
143 YLR215C 752 736 774 709 151 20
145 YLR321C 749 736 767 709 145 20
147 YMR260C 774 766 763 654 691 106
149 YNL120C 764 766 740 654 298 20
48 YEL052W 750 736 773 710 177 20
50 YDR536W 753 736 772 709 293 20
52 YDR513W 782 794 660 413 411 54
54 YEL045C 755 736 553 709 147 20
56 YEL041W 758 736 769 709 129 20
62 YBR282W 759 760 724 549 221 20
64 YBR258C 759 757 772 610 144 16
68 YBR274W 749 736 769 709 146 20
70 YHR090C 749 760 765 549 620 20
74 YGR127W 740 549 576 20
76 YGR150C 771 760 742 549 618 20
78 YKL037W 761 736 760 709 134 20
80 YKL051W 733 760 740 549 153 20
82 YKL120W 759 736 518 709
84 YKL011C 750 760 694 549 434 20
86 YKL017C 744 549 734 549 754 20
92 YGR126W 784 760 750 549 159 20
94 YKL070W 774 760 734 549 244 20
96 YKL058W 752 766 765 654 495 20
98 YHR130C 772 760 756 549 147 20
100 YIL070C 768 766 755 654
102 YHR195W 753 757 693 610 141 16
104 YIR022W 761 736 771 709
108 YJL172W 756 766 758 654 293 20
110 YHR113W 749 760 754 549 142 20
112 YHR175W 768 766 758 654 465 106
114 YJL024C 762 766 758 654 736 106
116 YGR180c 763 757 779 610
118 YJL179W 744 760 606 549 310 20
120 YJL001W 748 757 519 610 135 16
122 YJL208C 685 549 49 20
124 YJL152W 754 757 726 610
126 YJL131C 750 757 758 610
128 YJL151C 755 760 764 549 152 20
130 YLR441C 745 760 762 549 277 20
132 YLR415C 739 757 503 610 144 16
134 YLR212C 740 736 759 709 103 20
136 YLR029C 746 736 780 709 292 20
139 YLR105C 751 736 764 709
141 YIL136W 749 736 779 710 422 20
143 YLR215C 752 736 774 709 151 20
145 YLR321C 749 736 767 709 145 20
147 YMR260C 774 766 763 654 691 106
149 YNL120C 764 766 740 654 298 20
[0409]151 YLR407W 774 766 640 654 138 106
153 YMR197C 751 736 723 709 63 20
155 YMR100W 770 766 596 654 171 20
157 YMR210W 753 766 755 654 733 20
159 YMR318C 761 736 780 709 135 20
161 YMR069W 756 766 750 654 519 20
163 YNL076W 765 766 757 654 244 20
165 YNL024C 767 766 761 654 279 20
167 YNL125C 761 766 750 654 283 20
169 YNL029C 764 766 758 654
171 YMR115W 755 736 739 709
173 YNL244C 774 766 696 654 94 20
175 YNL334C 751 736 756 709
177 YNR018W 756 736 749 709
181 YOL118C 727 736 756 709 280 20
183 YOL123W 747 736 140 20
185 YOR020C 764 766 748 654 207 20
187 YOL116W 774 766 735 654 135 20
189 YOR305w 773 769 565 245
191 YPL267W 757 767 756 548
193 YPL229w 781 769 752 245
197 YPR047W 761 769 597 245
199 YPL011C 766 769 582 245
201 YPR148C 771 769 401 245
203 YOL103W 789 769 237 245
205 YOR016C 770 769 523 245
211 YOR360C 771 769 651 245
215 YDL005C 782 769 702 245
217 YPL210C 794 769 735 245
219 YMR118C 777 768 499 272
221 YPR052C 772 768 298 272
223 YLR224W 767 768 434 272
225 YLR275W 741 768 780 272
227 YMR154C 760 768 734 272
229 YDR205w 787 768 241 272
231 YPR037C 759 768 740 272
233 YNR008W 746 768 782 272
235 YOR084W 758 768 765 272
237 YGR054W 766 768 140 272
239 YGL106W 760 768 477 272
241 YAL067C 759 768 681 272
243 YIL023c 769 814
245 YBR064W 745 750 770 576 117 31
249 b2148 736 768 740 272
251 b2796 761 768 319 272
153 YMR197C 751 736 723 709 63 20
155 YMR100W 770 766 596 654 171 20
157 YMR210W 753 766 755 654 733 20
159 YMR318C 761 736 780 709 135 20
161 YMR069W 756 766 750 654 519 20
163 YNL076W 765 766 757 654 244 20
165 YNL024C 767 766 761 654 279 20
167 YNL125C 761 766 750 654 283 20
169 YNL029C 764 766 758 654
171 YMR115W 755 736 739 709
173 YNL244C 774 766 696 654 94 20
175 YNL334C 751 736 756 709
177 YNR018W 756 736 749 709
181 YOL118C 727 736 756 709 280 20
183 YOL123W 747 736 140 20
185 YOR020C 764 766 748 654 207 20
187 YOL116W 774 766 735 654 135 20
189 YOR305w 773 769 565 245
191 YPL267W 757 767 756 548
193 YPL229w 781 769 752 245
197 YPR047W 761 769 597 245
199 YPL011C 766 769 582 245
201 YPR148C 771 769 401 245
203 YOL103W 789 769 237 245
205 YOR016C 770 769 523 245
211 YOR360C 771 769 651 245
215 YDL005C 782 769 702 245
217 YPL210C 794 769 735 245
219 YMR118C 777 768 499 272
221 YPR052C 772 768 298 272
223 YLR224W 767 768 434 272
225 YLR275W 741 768 780 272
227 YMR154C 760 768 734 272
229 YDR205w 787 768 241 272
231 YPR037C 759 768 740 272
233 YNR008W 746 768 782 272
235 YOR084W 758 768 765 272
237 YGR054W 766 768 140 272
239 YGL106W 760 768 477 272
241 YAL067C 759 768 681 272
243 YIL023c 769 814
245 YBR064W 745 750 770 576 117 31
249 b2148 736 768 740 272
251 b2796 761 768 319 272
[0410]253 b2082 756 768 706 272
255 b0124 756 768 571 272
257 b3116 765 768 600 272
259 b1830 757 768 772 272
261 b1453 750 768 648 272
263 b2664 764 768 521 272
265 b2799 763 768 615 272
267 b3327 766 768 499 272
269 b0970 764 768 560 272
271 YER003C 758 760 769 549 729 20
273 YCL027W 749 760 770 549 145 20
275 YBR112C 760 760 760 549 731 20
277 YNL079C 763 766 762 654 216 20
279 YFR042W 789 760 739 549 232 20
281 YER137C 760 760 728 549 458 20
283 YKL103C 747 760 763 549 791 20
285 YNL090W 757 760 783 549 403 20
287 YGR161C 742 760 753 549 225 20
289 YDR071C 737 757 793 610 707 16
255 b0124 756 768 571 272
257 b3116 765 768 600 272
259 b1830 757 768 772 272
261 b1453 750 768 648 272
263 b2664 764 768 521 272
265 b2799 763 768 615 272
267 b3327 766 768 499 272
269 b0970 764 768 560 272
271 YER003C 758 760 769 549 729 20
273 YCL027W 749 760 770 549 145 20
275 YBR112C 760 760 760 549 731 20
277 YNL079C 763 766 762 654 216 20
279 YFR042W 789 760 739 549 232 20
281 YER137C 760 760 728 549 458 20
283 YKL103C 747 760 763 549 791 20
285 YNL090W 757 760 783 549 403 20
287 YGR161C 742 760 753 549 225 20
289 YDR071C 737 757 793 610 707 16
[0411] 转基因植物的代谢分析
[0412] 使用以下实验操作鉴定转基因植物中的所述代谢改变：
[0413] a)植物的培养和处理
[0414] 植物于标准条件下在气候室中以盆栽土培养三周(见前文)。收获前八 天对部分植物停止浇水(8天处理)。收获前四天，对另一组植物停止浇水(4天处理)。“对照处理”
的植物在整个生长期中正常浇水。相邻培养在同一分析序列中分析的植物，以避免环境影
响。
的植物在整个生长期中正常浇水。相邻培养在同一分析序列中分析的植物，以避免环境影
响。
[0415] b)样品的采样和储存
[0416] 采样在气候室中进行。用剪刀剪下绿色部分，迅速称重并立即放入用液氮预冷的提取筒(extraction thimble)中。提取筒和架台在提取前在-80℃储存。
[0417] c)冻干
[0418] 植物在接触溶剂或通过冻干除去水分以前禁止融化或达到＞-40℃的温度。
[0419] 将样品架和提取筒放进预冷(-40℃)的冰冻干燥器中。主要干燥相的起始温度是-35℃，压力为0.120mbar。对于干燥过程，参数根据压力和温度程序而改变，最终(12小
时后)温度为+30℃，压力为0.001-0.004mbar。关闭真空泵和制冷机以后，系统通以干燥
的空气或氩气。
时后)温度为+30℃，压力为0.001-0.004mbar。关闭真空泵和制冷机以后，系统通以干燥
的空气或氩气。
[0420] d)提取
[0421] 冻干后立即将带有植物材料的提取筒转移到ASE(带有溶剂控制器和自动ASE软件(DIONEX)的加速溶剂提取器ASE200)的5mL提取室中。
[0422] 用约10mL甲醇/水(80/20，体积/体积)，以T＝70℃、p＝140bar、5分钟加热相的1分钟静置提取来提取极性物质。用约10mL甲醇/水(40/60，体积/体积)，以T＝
70℃、p＝140bar、5分钟加热相的1分钟静置提取来提取脂类物质。在一个提取瓶(离心
管，50mL，带有螺口盖和用于ASE(DIONEX)的膜)中收集两种提取物。
70℃、p＝140bar、5分钟加热相的1分钟静置提取来提取脂类物质。在一个提取瓶(离心
管，50mL，带有螺口盖和用于ASE(DIONEX)的膜)中收集两种提取物。
[0423] 将 以 下 内 标 物 加 入 提 取 物 中：LC- 标 准 物、L-甲 硫 氨 酸 -d3、13 15
Boc-Ala-Gly-Gly-Gly-OH、L-色氨酸-d5、精氨酸 C6 N4、辅酶Q1、2、4和核糖醇、L-甘氨
酸-2，2-d2、L-丙氨酸-2，3，3，3-d4、α甲基吡喃葡萄糖苷、十九烷酸甲酯、十一烷酸甲酯、
十三烷酸、十五烷酸、二十九烷酸。在产生的混合物中加入8mL水。丢弃植物的固体残渣和
提取筒。
Boc-Ala-Gly-Gly-Gly-OH、L-色氨酸-d5、精氨酸 C6 N4、辅酶Q1、2、4和核糖醇、L-甘氨
酸-2，2-d2、L-丙氨酸-2，3，3，3-d4、α甲基吡喃葡萄糖苷、十九烷酸甲酯、十一烷酸甲酯、
十三烷酸、十五烷酸、二十九烷酸。在产生的混合物中加入8mL水。丢弃植物的固体残渣和
提取筒。
[0424] 将提取物在1400g离心5-10分钟以加速相分离。从无色的甲醇/水上 层(极性)相中各取出1mL用于GC和LC分析。丢弃剩余的上层相。从深绿色的有机下层相中分
别取出0.5mL用于GC和LC分析。使用IR-Dancer红外真空蒸发器(Hettich)在最高温度
40℃和最大压力10mbar下蒸发所有的样品部分。
别取出0.5mL用于GC和LC分析。使用IR-Dancer红外真空蒸发器(Hettich)在最高温度
40℃和最大压力10mbar下蒸发所有的样品部分。
[0425] e)LC/MS和LC/MS/MS分析
[0426] 分别在脂类和极性残留物中加入HPLC流动相(根据样品重量调整体积)，并使用梯度洗脱进行HPLC分析。
[0427] f)用于GC/MS分析的脂类相的衍生
[0428] 向残留物中加入140μl氯仿、38μl盐酸(37％的HCl水溶液)、320μl甲醇和20μl甲苯的混合物以分解甲醇。小心关上样品容器，在100℃反应2小时。接着蒸发溶液
并彻底干燥沉淀物。
并彻底干燥沉淀物。
[0429] 通过在密封管中与100μl盐酸甲氧胺(5mg/mL于嘧啶中)在60℃反应1.5小时使羰基集团甲氧胺化。加入20μl线性奇数脂肪酸混合物以提供时间标准。最后，在密封
管中与100μl N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)于60℃反应30
分钟进行衍生。用于GC注射的最终体积为220μl。
管中与100μl N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)于60℃反应30
分钟进行衍生。用于GC注射的最终体积为220μl。
[0430] g)用于GC/MS分析的极性相的衍生
[0431] 通过在密封管中与50μl盐酸甲氧胺(5mg/mL于嘧啶中)在60℃反应1.5小时使羰基集团甲氧胺化。加入10μl线性奇数脂肪酸混合物以提供时间标准。最后，在密封管
中与50μl N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)于60℃反应30分钟
进行衍生。用于GC注射的最终体积为110μl。
中与50μl N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)于60℃反应30分钟
进行衍生。用于GC注射的最终体积为110μl。
[0432] h)不同植物样品的分析。
[0433] 样品以20个序列进行测量。每个序列包括对照条件下的5株野生型和5株转基因植物以及4天或8天干旱处理的5株野生型和5株转基因植物。
[0434] 用每种分析物(代谢物)的峰高或峰面积除以各自内标物的峰面积。用各自样品的鲜重将数据标准化。用得到的值除以在对照条件下培养并在同一序列中分析的野生型植
物的平均值，得到所谓的X倍数或比值(见表 7-14)，它代表不依赖于分析序列的值。这些
比值表示与野生型对照植物中的浓度相比靶植物中代谢物浓度的状态。
物的平均值，得到所谓的X倍数或比值(见表 7-14)，它代表不依赖于分析序列的值。这些
比值表示与野生型对照植物中的浓度相比靶植物中代谢物浓度的状态。
[0435] 表6中显示了转化了基因YCL027W、YBR112C、YNL079C、YER137C、YKL103C、YNL090W、YGR161C、YDR071C的植物中代谢物筛选的结果
[0436] 表6：代谢活性筛选的结果
[0437]
[0438]
[0439]
[0440]
[0441]
[0442]
[0443]
[0444]
[0445]
[0446]
[0447]
[0448]
[0449]
[0450]
[0451]
[0452]
[0453]
[0454]
[0455]
[0456]
[0457]
[0458]
[0459]
[0460]
[0461]
[0462]
[0463]
[0464]
[0465] 实施例2
[0466] 通过使用胁迫诱导型或组织特异性启动子过表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌或欧洲油菜、大豆和稻的胁迫相关蛋白质编码基因来获得胁迫耐性拟南芥植物
[0467] 如实施例1产生转基因拟南芥植物，以在组织特异或胁迫诱导型启动子控制下表达编码胁迫相关蛋白质的转基因。转基因的组成型表达可引起有害的副作用。使用选自上
文表1中列出的启动子得到胁迫诱导型表达。
文表1中列出的启动子得到胁迫诱导型表达。
[0468] 产生T2代的植物并在两个实验中用干旱胁迫处理。对于第一个干旱实验，使植物丧失水分直到植物和土壤干燥。在停止浇水后的不同时间，继续正常的浇水计划并培养植
物至成熟。以每株植物的种子测定种子产量。在同等程度的干旱胁迫下，耐性植物可以继
续正常生长，并比非转基因对照植物产生更多的种子。叶片中脯氨酸含量和气孔孔径也在
干旱胁迫中的多个时间进行测量。耐性植物与非转基因对照植物相比保持了更低的脯氨酸
含量以及更大的气孔孔径。
物至成熟。以每株植物的种子测定种子产量。在同等程度的干旱胁迫下，耐性植物可以继
续正常生长，并比非转基因对照植物产生更多的种子。叶片中脯氨酸含量和气孔孔径也在
干旱胁迫中的多个时间进行测量。耐性植物与非转基因对照植物相比保持了更低的脯氨酸
含量以及更大的气孔孔径。
[0469] 对转基因植物施加水分胁迫的另一方法为用含有特定水势的渗透物(如聚乙二醇(PEG))的水处理。由于PEG可能有毒性，植物只经短时间处理，然后恢复正常的浇水。如
上文，从成熟植物中测定种子产量。在胁迫时期通过物理测量(如气孔孔径或渗透压)或
生物化学测量(如脯氨酸的积累)来衡量反应。耐性植物有更高的种子产量，保持其气孔
孔径并且渗透压和脯氨酸水平只表现出微小的变化，而易感的非转基因对照植物关 闭其
气孔并表现出提高的渗透压和脯氨酸水平。
上文，从成熟植物中测定种子产量。在胁迫时期通过物理测量(如气孔孔径或渗透压)或
生物化学测量(如脯氨酸的积累)来衡量反应。耐性植物有更高的种子产量，保持其气孔
孔径并且渗透压和脯氨酸水平只表现出微小的变化，而易感的非转基因对照植物关 闭其
气孔并表现出提高的渗透压和脯氨酸水平。
[0470] 将带有控制转基因转录的组成型启动子的转基因植物与带有干旱诱导型启动子的植物在无胁迫时进行比较。结果表明当带有胁迫诱导型启动子的植物无胁迫培养时，代
谢产物和基因表达未发生变化。这些植物与带有组成型启动子的植物相比仍然具有更高的
种子产量。
谢产物和基因表达未发生变化。这些植物与带有组成型启动子的植物相比仍然具有更高的
种子产量。
[0471] 实施例3
[0472] 来源于酿酒酵母或大肠杆菌或欧洲油菜、大豆和稻的胁迫相关基因的过表达提供对多种非生物胁迫的耐性。
[0473] 对一种非生物胁迫表现出耐性的植物通常对另一种环境胁迫或产生氧自由基的除草剂表现出耐性。这种交叉耐性的现象在机理水平上尚不清楚(McKersie和Leshem，
1994)。但是，有理由期望由于转基因表达而表现出增强的干旱耐性的植物可能还表现
出对低温、冰冻、盐、空气污染物(如臭氧)以及其他非生物胁迫的耐性。作为对该假
说的支持，多重非生物胁迫因子(包括冷、盐、渗压剂、ABA等)上调或下调了若干基因
的表达(例如Hong等(1992)Developmental and organ-specific expression of an
ABA-and stress-induced protein in barley.Plant Mol Biol 18：663-674；Jagendorf
和Takabe(2001)Induces of glycinebetaine synthesis in barley.PlantPhysiol 127：
1827-1835)；Mizoguchi等(1996)A gene encoding amitogen-activated protein kinase
is induced simultaneously with genes fora mitogen-activated protein kinase and
an S6 ribosomal protein kinase bytouch，cold，and water stress in Arabidopsis
thaliana.Proc Natl Acad Sci USA 93：765-769；Zhu(2001)Cell signaling under salt，
water and coldstresses.Curr Opin Plant Biol 4：401-406)。
1994)。但是，有理由期望由于转基因表达而表现出增强的干旱耐性的植物可能还表现
出对低温、冰冻、盐、空气污染物(如臭氧)以及其他非生物胁迫的耐性。作为对该假
说的支持，多重非生物胁迫因子(包括冷、盐、渗压剂、ABA等)上调或下调了若干基因
的表达(例如Hong等(1992)Developmental and organ-specific expression of an
ABA-and stress-induced protein in barley.Plant Mol Biol 18：663-674；Jagendorf
和Takabe(2001)Induces of glycinebetaine synthesis in barley.PlantPhysiol 127：
1827-1835)；Mizoguchi等(1996)A gene encoding amitogen-activated protein kinase
is induced simultaneously with genes fora mitogen-activated protein kinase and
an S6 ribosomal protein kinase bytouch，cold，and water stress in Arabidopsis
thaliana.Proc Natl Acad Sci USA 93：765-769；Zhu(2001)Cell signaling under salt，
water and coldstresses.Curr Opin Plant Biol 4：401-406)。
[0474] 为了测定盐耐性，将拟南芥的种子消毒(100％漂白剂、0.1％TritonX进行两次5分钟的处理，然后用ddH2O漂洗5分钟)。将种子铺在非选择性培养基上(1/2MS，0.6％
phytagar，0.5g/L MES，1％蔗糖，2μg/ml benamyl)。允许种子萌发约十天。在4-5片叶子
的时期，将转基因 植物栽入5.5cm直径的盆中使其生长(22℃，持续光照)约七天，按需要
浇水。开始实验时，将两升100mM NaCl和1/8MS加入盆下的盘子中。在放置对照植物的盘
子中加入三升1/8MS。NaCl补充的浓度以每四天50mM逐步提高直至200mM。200mM盐处理
后测定植物的鲜重和干重以及种子产量。
phytagar，0.5g/L MES，1％蔗糖，2μg/ml benamyl)。允许种子萌发约十天。在4-5片叶子
的时期，将转基因 植物栽入5.5cm直径的盆中使其生长(22℃，持续光照)约七天，按需要
浇水。开始实验时，将两升100mM NaCl和1/8MS加入盆下的盘子中。在放置对照植物的盘
子中加入三升1/8MS。NaCl补充的浓度以每四天50mM逐步提高直至200mM。200mM盐处理
后测定植物的鲜重和干重以及种子产量。
[0475] 为测定冷耐性，如上文使转基因和冷株系的种子萌发并培养约十天至4-5片叶子的时期。然后将植物移至低温(5℃)并培养经过开花和结籽的发育时期。使用叶绿素荧光
作为光系统的光合适应性和完整性的指针来衡量光合作用。测定作为植物生物量生产指针
的种子产量和植物干重。
作为光系统的光合适应性和完整性的指针来衡量光合作用。测定作为植物生物量生产指针
的种子产量和植物干重。
[0476] 对盐度或冷具有耐性的植物比易感植物有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
[0477] 实施例4
[0478] 通过过表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌或欧洲油菜、大豆和稻的胁迫相关基因获得胁迫耐性苜蓿植物
[0479] 使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(紫苜蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植物。获得再生植
物的方法已有描述。例如，它们可以选自Rangelander(Agriculture Canada)栽培种或如
Brown DCW和AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)所述的
任何其他商品苜蓿变种。另外，选择RA3变种(威斯康辛大学)用于组织培养(Walker等，
1978Am J Bot 65：654-659)。
物的方法已有描述。例如，它们可以选自Rangelander(Agriculture Canada)栽培种或如
Brown DCW和AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)所述的
任何其他商品苜蓿变种。另外，选择RA3变种(威斯康辛大学)用于组织培养(Walker等，
1978Am J Bot 65：654-659)。
[0480] 将叶柄外植体与根瘤农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 PlantPhysiol 119：839-847)或含有二元载体的LBA4404的过夜培养物共同培养。已经描述了许多不同的
用于植物转化的二元载体系统(例如An，G.inAgrobacterium Protocols.《Methods in
Molecular Biology》第44卷，47-62页，Garland KMA和MR Davey编，Humana Press，
Totowa，New Jersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)
所述的 pBIN19载体，它包括两侧与来源于根瘤农杆菌Ti质粒的左侧和右侧边界序列相连
的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基
因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙
酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子
可用于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。在本实施例中，使
用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。
用于植物转化的二元载体系统(例如An，G.inAgrobacterium Protocols.《Methods in
Molecular Biology》第44卷，47-62页，Garland KMA和MR Davey编，Humana Press，
Totowa，New Jersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)
所述的 pBIN19载体，它包括两侧与来源于根瘤农杆菌Ti质粒的左侧和右侧边界序列相连
的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基
因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙
酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子
可用于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。在本实施例中，使
用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。
[0481] 外植体在含有288mg/L脯氨酸，53mg/L硫代脯氨酸，4.35g/LK2SO4，以及100μM乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在暗处共同培养三天。在半强度Murashige-Skoog培养基
(Murashige和Skoog，1962)中洗涤外植体并铺在不舍有乙酰丁香酮而含有合适的选择剂
及抑制农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培养基上。数周后，将体细胞胚移至不含
有生长调节物质和抗生素的50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后体细胞胚在半强度
Murashige-Skoog培养基上发育。将生根的苗移植到盆中并在温室中培养。
(Murashige和Skoog，1962)中洗涤外植体并铺在不舍有乙酰丁香酮而含有合适的选择剂
及抑制农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培养基上。数周后，将体细胞胚移至不含
有生长调节物质和抗生素的50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后体细胞胚在半强度
Murashige-Skoog培养基上发育。将生根的苗移植到盆中并在温室中培养。
[0482] 通过结节切除并在Turface生长培养基中生根来繁殖T0转基因植物。除去植物的叶子并培养至大约10cm的高度(除叶后约两周)。然后使植物在两个实验中受到干旱胁
迫。
迫。
[0483] 在第一个干旱实验中，使苗断水(可达3周)至植物和土壤干燥。在停止浇水后不同时间恢复正常的浇水计划。在恢复浇水后一周测定新枝的鲜重和干重。在同等程度的
干旱胁迫下，耐性植物能够恢复正常生长而易感植物已经死亡或受到显著伤害导致较少的
干物质。还在干旱胁迫中的不同时间测定了叶的脯氨酸含量以及气孔孔径。耐性植物与非
转基因对照植物相比保持较低的脯氨酸含量以及更大的气孔孔径。
干旱胁迫下，耐性植物能够恢复正常生长而易感植物已经死亡或受到显著伤害导致较少的
干物质。还在干旱胁迫中的不同时间测定了叶的脯氨酸含量以及气孔孔径。耐性植物与非
转基因对照植物相比保持较低的脯氨酸含量以及更大的气孔孔径。
[0484] 对转基因植物施加水分胁迫的另一方法为用含有特定水势的渗透物(如聚乙二醇(PEG))的水处理。对离脱叶(例如Djilianov等，1997PlantScience 129：147-156)或
根(Wakabayashi等，1997Plant Physiol 113： 967-973)进行PEG处理。由于PEG可能有
毒性，只对植物进行短时间处理。通过物理测量法(如气孔孔径或渗透压)或生物化学测
量方法(如脯氨酸积累)来衡量反应。耐性植物保持了其气孔孔径并且渗透压只表现出微
小的变化，而易感的非转基因对照植物关闭其气孔并表现出提高的渗透压。另外耐性植物
中的脯氨酸和其他代谢物的变化小于非转基因对照植物。
根(Wakabayashi等，1997Plant Physiol 113： 967-973)进行PEG处理。由于PEG可能有
毒性，只对植物进行短时间处理。通过物理测量法(如气孔孔径或渗透压)或生物化学测
量方法(如脯氨酸积累)来衡量反应。耐性植物保持了其气孔孔径并且渗透压只表现出微
小的变化，而易感的非转基因对照植物关闭其气孔并表现出提高的渗透压。另外耐性植物
中的脯氨酸和其他代谢物的变化小于非转基因对照植物。
[0485] 使用如实施例3中所述的方法测量盐度和冷耐性。对盐度或冷具有耐性的植物与易感植物相比有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
[0486] 实施例5
[0487] 通过过表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌或欧洲油菜、大豆和稻的胁迫相关基因来获得胁迫耐性黑麦草植物
[0488] 可以使用若干不同黑麦草变种的种子作为用于转化的外植体源，包括可从SvalofWeibull种子公司得到的商品变种Gunne或变种Affinity。种子依次用1％Tween201分
钟，100％漂白剂60分钟表面消毒，漂洗三次，每次都用去离子水和蒸馏水进行5分钟，然后
在潮湿的无菌滤纸上在黑暗中萌发3-4天。然后再用1％Tween201分钟，75％漂白剂5分
钟消毒，用ddH2O洗涤三次，每次5分钟。
钟，100％漂白剂60分钟表面消毒，漂洗三次，每次都用去离子水和蒸馏水进行5分钟，然后
在潮湿的无菌滤纸上在黑暗中萌发3-4天。然后再用1％Tween201分钟，75％漂白剂5分
钟消毒，用ddH2O洗涤三次，每次5分钟。
[0489] 将表面消毒的种子置于含有Murashige和Skoog基础盐分和维生素、20g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺、500mg/l酪蛋白水解物、3g/l Phytagel、10mg/l BAP和5mg/l二氯甲氧
苯酸的愈伤组织诱导培养基上。在黑暗中于25℃孵育培养皿4周，以使种子萌发并诱导胚
胎发生的愈伤组织。
苯酸的愈伤组织诱导培养基上。在黑暗中于25℃孵育培养皿4周，以使种子萌发并诱导胚
胎发生的愈伤组织。
[0490] 在愈伤组织诱导培养基上四周后，剪掉苗的嫩枝和根，将愈伤组织移至新鲜培养基上，再持续培养四周，然后转移至MSO培养基在光下两周。将数片愈伤组织(11-17周龄)
用10目网筛损伤，然后置于愈伤组织诱导培养基上，或者在250mL三角瓶里于100mL液体
黑麦草愈伤组织诱导培养基(与用于愈伤组织诱导的含琼脂的培养基相同)中培养。三角
瓶用膜包好并于暗处在23℃以175rpm摇一周。用40目的网筛筛分液体培养物并收集细
胞。筛网上收集的成分铺于固体黑麦草愈伤组织诱导培养基上， 并在黑暗中于25℃培养一
周。然后将愈伤组织转移至含有1％蔗糖的MS培养基上并培养2周。
用10目网筛损伤，然后置于愈伤组织诱导培养基上，或者在250mL三角瓶里于100mL液体
黑麦草愈伤组织诱导培养基(与用于愈伤组织诱导的含琼脂的培养基相同)中培养。三角
瓶用膜包好并于暗处在23℃以175rpm摇一周。用40目的网筛筛分液体培养物并收集细
胞。筛网上收集的成分铺于固体黑麦草愈伤组织诱导培养基上， 并在黑暗中于25℃培养一
周。然后将愈伤组织转移至含有1％蔗糖的MS培养基上并培养2周。
[0491] 可通过农杆菌或粒子轰击法完成转化。制备的表达载体包含pUC载体中的组成型植物启动子和基因cDNA。根据生产商的说明书使用Qiagen试剂盒从大肠杆菌细胞中制备
质粒DNA。在培养皿中无菌滤纸的中央涂布大约2g胚胎发生的愈伤组织。在滤纸上加入含
有10g/l蔗糖的液体MSO的等分试样。根据Sanford等，1993的方法用质粒DNA包裹金颗
粒(1.0μm大小)并按如下参数将其递送给胚胎发生的愈伤组织：每次轰击500μg颗粒和
2μgDNA、1300psi、从停止盘到愈伤组织盘的靶距离为8.5cm、每盘愈伤组织轰击一次。
质粒DNA。在培养皿中无菌滤纸的中央涂布大约2g胚胎发生的愈伤组织。在滤纸上加入含
有10g/l蔗糖的液体MSO的等分试样。根据Sanford等，1993的方法用质粒DNA包裹金颗
粒(1.0μm大小)并按如下参数将其递送给胚胎发生的愈伤组织：每次轰击500μg颗粒和
2μgDNA、1300psi、从停止盘到愈伤组织盘的靶距离为8.5cm、每盘愈伤组织轰击一次。
[0492] 轰击后将愈伤组织转移回新鲜的愈伤组织发育培养基，并在黑暗中室温保持1周时间。然后将愈伤组织转移至光下25℃的生长条件，以在合适选择剂(如250nM Arsenal，
5mg/l PPT或50mg/L卡那霉素)下起始胚胎分化。出现对选择剂具有抗性的枝，一旦生根
便转移到土壤中。
5mg/l PPT或50mg/L卡那霉素)下起始胚胎分化。出现对选择剂具有抗性的枝，一旦生根
便转移到土壤中。
[0493] 通过PCR分析原始转基因植物(T0)的样品以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche
Diagnostics)上。按照生产商的推荐使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)
通过PCR制备地高辛(digoxigenin)标记探针。
Diagnostics)上。按照生产商的推荐使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)
通过PCR制备地高辛(digoxigenin)标记探针。
[0494] 转基因T0黑麦草植物通过切除分蘖进行营养繁殖。移植的分蘖在温室中维持两个月直至良好建立。除去嫩枝并使其生长两周。
[0495] 第一个干旱实验以与实施例3中所述相似的方式进行。使苗断绝水分(可达三周)直至植物和土壤干燥。在停止浇水后的不同时间恢复正常的浇水计划。恢复浇水后一
周测定叶片的长度、嫩枝的鲜重和干重。在同等程度的干旱胁迫下，耐性植物能够继续正常
的生长而易感植物已经死亡或受到显著伤害引起较短的叶片和较少的干物质。还在干旱胁
迫中的不同时间测定了叶的脯氨酸含量以及气孔孔径。耐性植物与非转基因对照植物相比
保持了较低的脯氨酸含量以及更大的气孔孔径。
周测定叶片的长度、嫩枝的鲜重和干重。在同等程度的干旱胁迫下，耐性植物能够继续正常
的生长而易感植物已经死亡或受到显著伤害引起较短的叶片和较少的干物质。还在干旱胁
迫中的不同时间测定了叶的脯氨酸含量以及气孔孔径。耐性植物与非转基因对照植物相比
保持了较低的脯氨酸含量以及更大的气孔孔径。
[0496] 给转基因植物施加干旱胁迫的第二个实验是如前面实施例所述通过PEG溶液处理。使用如实施例3中所述方法衡量盐度和冷耐性。对盐度或冷具有耐性的植物与易感植
物相比有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
物相比有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
[0497] 实施例6
[0498] 通过过表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌或欧洲油菜、大豆和稻的胁迫相关基因来获得胁迫耐性大豆植物
[0499] 根据下文Texas A&M专利US5,164,310中所述方法的修改转化大豆。若干商品大豆变种可以通过该方法转化。通常用栽培种Jack(可从Illinois Seed Foundation获
得)进行转化。种子通过在70％(v/v)乙醇中浸泡六分钟并在添加了1％(v/v)Tween的
25％商品漂白剂(NaOCL)中浸泡20分钟来消毒，然后用无菌双蒸馏水漂洗四次。通过从每
个苗上取下胚根、胚轴和一个子叶来繁殖七天苗。然后，将带有一片子叶的上胚轴转移至培
养皿中新鲜的萌发培养基上，并在25℃16小时光周期(大约100FE-m-2s-1)下孵育三周。
从3-4周龄植物上切下叶腋节(长度约4mm)。切除叶腋节并在农杆菌LBA4404培养物中孵
育。
得)进行转化。种子通过在70％(v/v)乙醇中浸泡六分钟并在添加了1％(v/v)Tween的
25％商品漂白剂(NaOCL)中浸泡20分钟来消毒，然后用无菌双蒸馏水漂洗四次。通过从每
个苗上取下胚根、胚轴和一个子叶来繁殖七天苗。然后，将带有一片子叶的上胚轴转移至培
养皿中新鲜的萌发培养基上，并在25℃16小时光周期(大约100FE-m-2s-1)下孵育三周。
从3-4周龄植物上切下叶腋节(长度约4mm)。切除叶腋节并在农杆菌LBA4404培养物中孵
育。
[0500] 已经描述了许多不同的用于植物转化的二元载体系统(例如An，G.inAgrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology 44卷，47-62页，Garland
KMA和MR Davey编，Humana Press，Totowa，New Jersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid
Research.1984.12：8711-8721)所述的pBIN19载体，它包括两侧与来源于根瘤农杆菌Ti
质粒的左侧和右侧边界序列相连的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组
成——选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多
种选择标记基因，包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利57673666和6225105)
的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境
调节的基因转录。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以
提供性状 基因的组成型表达。
KMA和MR Davey编，Humana Press，Totowa，New Jersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid
Research.1984.12：8711-8721)所述的pBIN19载体，它包括两侧与来源于根瘤农杆菌Ti
质粒的左侧和右侧边界序列相连的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组
成——选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多
种选择标记基因，包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利57673666和6225105)
的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境
调节的基因转录。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以
提供性状 基因的组成型表达。
[0501] 共同培养处理后，洗涤外植体并转移至添加了500mg/L特美汀的选择培养基。切除嫩枝并置于枝伸长培养基(shoot elongation medium)上。长于1cm的枝在移植进土壤
前置于生根培养基上2到4周。
前置于生根培养基上2到4周。
[0502] 原始转基因植物(T0)通过PCR分析以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳并转移至 带正电荷的尼龙膜(Roche
Diagnostics)上。依照生产商的推荐使用PCRDIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)
通过PCR制备地高辛(digoxigenin)标记的探针。
Diagnostics)上。依照生产商的推荐使用PCRDIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)
通过PCR制备地高辛(digoxigenin)标记的探针。
[0503] 耐性植物有更高的种子产量，保持其气孔孔径并且渗透压和脯氨酸水平只表现出微小的变化，而易感的非转基因对照植物关闭其气孔并显示提高的渗透压和脯氨酸水平。
[0504] 使用如实施例3中所述的方法衡量干旱、盐度和冷耐性。对盐度或冷具有耐性的植物与易感植物相比有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
[0505] 实施例7
[0506] 通过过表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌或欧洲油菜、大豆和稻的胁迫相关基因来获得胁迫耐性油菜籽/芸苔植物
[0507] 使用5-6天龄幼苗的子叶叶柄和下胚轴作为进行组织培养的外植体并根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商品栽培种Westar(Agriculture
Canada)是用于转化的标准变种，但可使用其他变种。
Canada)是用于转化的标准变种，但可使用其他变种。
[0508] 使用含有二元载体的根瘤农杆菌LBA4404转化芸苔。已经描述了许多不同的用于植物转化的二元载体系统(例如An，G.in AgrobacteriumProtocols.Methods in
Molecular Biology 44卷，47-62页，Garland KMA和MR Davey编，Humana Press，Totowa，
New Jersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)所述的
pBIN19载体，它包括两侧与来源于根瘤农杆菌Ti质粒的左侧和右侧边界序列相连的植物
基因 表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基因的
cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变型乙酰羟
酸合酶(AHAS)酶(US专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用
于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。在本实施例中，使用34S
启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。
Molecular Biology 44卷，47-62页，Garland KMA和MR Davey编，Humana Press，Totowa，
New Jersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)所述的
pBIN19载体，它包括两侧与来源于根瘤农杆菌Ti质粒的左侧和右侧边界序列相连的植物
基因 表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基因的
cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变型乙酰羟
酸合酶(AHAS)酶(US专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用
于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。在本实施例中，使用34S
启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。
[0509] 通过在70％乙醇中浸泡两分钟，然后在含有一滴Tween20的30％Clorox中浸泡10分钟来表面消毒芸苔种子，随后用无菌的蒸馏水漂洗三次。然后使种子在不含激素含
1％蔗糖、0.7％Phytagar的半强度MS培养基中于23℃16小时光照下体外萌发5天。从
体外苗上切下带有子叶的子叶柄外植体，并通过将柄外植体的切除端浸入细菌悬液来接种
农杆菌。然后将外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％Phytagar的MSBAP-3培养基上
于23℃16小时光照下培养两天。与农杆菌共同培养两天后，将叶柄外植体移至含有3mg/
l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7天，然后在含
有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀以及选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到枝再生。当枝
长5-10mm时将其切下并移至枝伸长培养基(含有0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)上。将长约
2cm的枝移至生根培养基(MSO)上进行根诱导。
1％蔗糖、0.7％Phytagar的半强度MS培养基中于23℃16小时光照下体外萌发5天。从
体外苗上切下带有子叶的子叶柄外植体，并通过将柄外植体的切除端浸入细菌悬液来接种
农杆菌。然后将外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％Phytagar的MSBAP-3培养基上
于23℃16小时光照下培养两天。与农杆菌共同培养两天后，将叶柄外植体移至含有3mg/
l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7天，然后在含
有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀以及选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到枝再生。当枝
长5-10mm时将其切下并移至枝伸长培养基(含有0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)上。将长约
2cm的枝移至生根培养基(MSO)上进行根诱导。
[0510] 原始转基因植物(T0)的样品通过PCR分析确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche
Diagnostics)上。依照生产商的推荐使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)
通过PCR制备地高辛(digoxigenin)标记的探针。
Diagnostics)上。依照生产商的推荐使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)
通过PCR制备地高辛(digoxigenin)标记的探针。
[0511] 根据实施例3中描述的方法评估转基因植物提高的胁迫耐性。耐性植物有更高的种子产量，保持其气孔孔径并且渗透压和脯氨酸水平只表现出微小的变化，反之敏感的非
转基因对照植物关闭其气孔并表现出提高的渗透压和脯氨酸水平。
转基因对照植物关闭其气孔并表现出提高的渗透压和脯氨酸水平。
[0512] 使用如实施例3中所述的方法衡量干旱、盐度和冷耐性。对盐度或冷 具有耐性的植物与敏感植物相比有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
[0513] 实施例8
[0514] 通过过表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌或欧洲油菜、大豆和稻的胁迫相关基因来获得胁迫耐性玉米植物
[0515] 使用Ishida等(1996.Nature Biotech14745-50)所述方法的修改来转化玉蜀黍。在玉米中，转化是基因型依赖性的且只有特殊的基因型才可用于转化和再生。自交系
A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是转化供体材料的优良来源(Fromm等，
1990Biotech8：833-839)，但是其他基因型也可成功地使用。授粉后大约11天(DAP)，当未
成熟胚大约1到1.2mm时，从玉米植物采集穗。将未成熟胚与携带“超级二元”载体的根瘤
农杆菌共同培养，并通过器官发生来再生转基因植物。Japan Tobacco的超级二元载体系
统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中有所描述。按所描述的构建载体。可使用包括
编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利6025541)的玉米基因在内的多种选择标记基
因。类似地，可使用多种启动子调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因
转录。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因
的组成型表达。
A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是转化供体材料的优良来源(Fromm等，
1990Biotech8：833-839)，但是其他基因型也可成功地使用。授粉后大约11天(DAP)，当未
成熟胚大约1到1.2mm时，从玉米植物采集穗。将未成熟胚与携带“超级二元”载体的根瘤
农杆菌共同培养，并通过器官发生来再生转基因植物。Japan Tobacco的超级二元载体系
统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中有所描述。按所描述的构建载体。可使用包括
编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利6025541)的玉米基因在内的多种选择标记基
因。类似地，可使用多种启动子调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因
转录。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因
的组成型表达。
[0516] 在愈伤组织诱导培养基上培养离体胚，然后在含有作为选择剂的咪唑啉酮的玉米再生培养基上培养。培养皿在25℃光下孵育2-3周，或直到枝发育。将绿色的枝从每个胚
移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周直到根发育。将生根的枝移植到温室土壤中。从
对咪唑啉酮除草剂显示耐性以及转基因PCR检测为阳性的植物中产生T1种子。
移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周直到根发育。将生根的枝移植到温室土壤中。从
对咪唑啉酮除草剂显示耐性以及转基因PCR检测为阳性的植物中产生T1种子。
[0517] 然后根据实施例3所述方法评估T1转基因植物提高的胁迫耐性。单一位点插入T-DNA的T1世代以3∶1的比例分离转基因。包含一个或两个转基因拷贝的后代对咪唑啉
酮除草剂耐受，而且与缺少转基因的后代相比对干旱胁迫表现出更大的耐性。耐性植物有
更高的种子产量，保持其气孔 孔径并且渗透压和脯氨酸水平只表现出微小的变化，而易感
的非转基因对照植物关闭其气孔并显示提高的渗透压和脯氨酸水平。纯合的T2植物表现
出相似的表型。纯合转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1后代)也显示出提高的环
境胁迫耐性。
酮除草剂耐受，而且与缺少转基因的后代相比对干旱胁迫表现出更大的耐性。耐性植物有
更高的种子产量，保持其气孔 孔径并且渗透压和脯氨酸水平只表现出微小的变化，而易感
的非转基因对照植物关闭其气孔并显示提高的渗透压和脯氨酸水平。纯合的T2植物表现
出相似的表型。纯合转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1后代)也显示出提高的环
境胁迫耐性。
[0518] 使用如实施例3中所述方法衡量盐度和冷耐性。对干旱、盐度或冷具有耐性的植物与易感植物相比有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
[0519] 实施例9
[0520] 通过过表达来源于酿酒酵母或大肠杆菌或欧洲油菜、大豆或稻的胁迫相关基因来获得胁迫耐性小麦植物
[0521] 通过如Ishida等(1996Nature Biotech.14745-50)所述的方法进行小麦转化。通常使用栽培种Bobwhite(可从CYMMIT，Mexico获得)进行转化。将未成熟胚与载有“超级
二元”载体的根瘤农杆菌共同培养并通过器官发生再生转基因植物。Japan Tobacco的超
级二元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中有所描述。按所描述的构建载体。
可使用包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利6025541)的玉米基因在内的多种
选择标记基因。类似地，可使用多种启动子调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境
调节的基因转录。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以
提供性状基因的组成型表达。
二元”载体的根瘤农杆菌共同培养并通过器官发生再生转基因植物。Japan Tobacco的超
级二元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中有所描述。按所描述的构建载体。
可使用包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利6025541)的玉米基因在内的多种
选择标记基因。类似地，可使用多种启动子调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境
调节的基因转录。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以
提供性状基因的组成型表达。
[0522] 与农杆菌一起孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基上培养，然后在含有作为选择剂的咪唑啉酮的再生培养基上培养。培养皿在25℃光下培养2-3周，或直到枝发育。将绿色
的枝从每个胚移至生根培养基并在25℃培养2-3周直到根发育。将生根的枝移植到温室土
壤中。从对咪唑啉酮除草剂显示耐性以及转基因PCR检测为阳性的植物中产生T1种子。
的枝从每个胚移至生根培养基并在25℃培养2-3周直到根发育。将生根的枝移植到温室土
壤中。从对咪唑啉酮除草剂显示耐性以及转基因PCR检测为阳性的植物中产生T1种子。
[0523] 然后根据实施例3所述方法评估T1转基因植物提高的胁迫耐性。单一位点插入T-DNA的T1世代以3∶1的比例分离转基因。包含一个或两个转基因拷贝的后代对咪唑啉
酮除草剂耐受，而且与缺少转基因的后代相比对干旱胁迫表现出更大的耐性。耐性植物有
更高的种子产量，保持其气孔 孔径并且渗透压和脯氨酸水平只表现出微小的变化，而易感
的非转基因对照植物关闭其气孔并显示提高的渗透压和脯氨酸水平。纯合的T2植物表现
出相似的表型。纯合转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1后代)也显示出提高的环
境胁迫耐性。使用如前文实施例中所述方法衡量盐度和冷耐性。对干旱、盐度或冷具有耐
性的植物与易感植物相比有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
酮除草剂耐受，而且与缺少转基因的后代相比对干旱胁迫表现出更大的耐性。耐性植物有
更高的种子产量，保持其气孔 孔径并且渗透压和脯氨酸水平只表现出微小的变化，而易感
的非转基因对照植物关闭其气孔并显示提高的渗透压和脯氨酸水平。纯合的T2植物表现
出相似的表型。纯合转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1后代)也显示出提高的环
境胁迫耐性。使用如前文实施例中所述方法衡量盐度和冷耐性。对干旱、盐度或冷具有耐
性的植物与易感植物相比有更高的种子产量、光合作用和干物质生产。
[0524] 实施例14
[0525] 相同和异源基因的鉴定
[0526] 可使用基因序列从cDNA或基因组文库中鉴定相同或异源基因。相同基因(如全长cDNA克隆)可使用例如cDNA文库通过核酸杂交来分离。根据目的基因的丰度，涂布
100,000至1,000,000的重组噬菌体并转移至尼龙膜。用碱变性后，通过例如UV交联将DNA
固定在膜上。在高严格条件下进行杂交。在水溶液中，在1M NaCl的离子强度和68℃的温
32
度下实施杂交和洗涤。通过例如放射性( P)切口转录标记(High Prime，Roche，Mannheim，
德国)产生杂交探针。通过放射自显影技术检测信号。
100,000至1,000,000的重组噬菌体并转移至尼龙膜。用碱变性后，通过例如UV交联将DNA
固定在膜上。在高严格条件下进行杂交。在水溶液中，在1M NaCl的离子强度和68℃的温
32
度下实施杂交和洗涤。通过例如放射性( P)切口转录标记(High Prime，Roche，Mannheim，
德国)产生杂交探针。通过放射自显影技术检测信号。
[0527] 可以通过类似于前述使用低严格杂交和洗涤条件的方法的方式来鉴定相关但不相同的部分相同或异源基因。对于水溶液中杂交，离子强度通常控制在1M NaCl，而温度从
68℃逐渐降低至42℃。
68℃逐渐降低至42℃。
[0528] 可通过使用合成的放射性标记寡核苷酸探针来分离只在特殊结构域(例如10-20氨基酸)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列。通过用T4多核苷酸激酶将
两条互补的寡核苷酸5’末端磷酸化来制备放射性标记的寡核苷酸。互补的寡核苷酸退火
并连接形成多联体。然后通过例如切口转录来放射性标记双链的多联体。通常在低严格条
件下使用高浓度寡核苷酸进行杂交。
两条互补的寡核苷酸5’末端磷酸化来制备放射性标记的寡核苷酸。互补的寡核苷酸退火
并连接形成多联体。然后通过例如切口转录来放射性标记双链的多联体。通常在低严格条
件下使用高浓度寡核苷酸进行杂交。
[0529] 寡核苷酸杂交溶液：
[0530] 6xSSC
[0531] 0.01M磷酸钠
[0532] 1mM EDTA(pH8)
[0533] 0.5％SDS
[0534] 100μg/ml变性的鲑精DNA
[0535] 0.1％脱脂奶粉
[0536] 杂交过程中，逐渐降低温度至低于预计的寡核苷酸Tm5-10℃或者低至室温，然后洗涤并放射自显影。以低严格性(如使用4xSSC的3个洗涤步骤)实施洗涤。进一
步的细节在Sambrook，J.等，1989，《MolecularCloning：A Laboratory Manual》，Cold
Spring Harbor Laboratory Press或Ausubel，F.M.等，1994，《Current Protocols in
MolecularBiology》，JohnWiley Sons中有所描述。
步的细节在Sambrook，J.等，1989，《MolecularCloning：A Laboratory Manual》，Cold
Spring Harbor Laboratory Press或Ausubel，F.M.等，1994，《Current Protocols in
MolecularBiology》，JohnWiley Sons中有所描述。
[0537] 实施例15
[0538] 通过用抗体筛选表达文库来鉴定相同的基因
[0539] 可使用cDNA克隆在例如大肠杆菌中(例如Qiagen QIAexpress pQE系统中)制备重组多肽。然后一般通过Ni-NTA亲和层析(Qiagen)来亲和纯化重组多肽。然后通过例
如使用兔免疫接种标准技术，用重组多肽制备特定的抗体。如Gu等，1994，BioTechniques
17：257-262中所述使用以重组抗原饱和的Ni-NTA柱亲和纯化抗体。然后可以通过免疫
筛选使用抗体筛选表达cDNA文库来鉴定相同的或异源的基因(Sambrook，J.等，1989，
《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory Press或
Ausubel，F.M.等，1994，《Current Protocols inMolecular Biology》，John Wiley&Sons)。
如使用兔免疫接种标准技术，用重组多肽制备特定的抗体。如Gu等，1994，BioTechniques
17：257-262中所述使用以重组抗原饱和的Ni-NTA柱亲和纯化抗体。然后可以通过免疫
筛选使用抗体筛选表达cDNA文库来鉴定相同的或异源的基因(Sambrook，J.等，1989，
《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory Press或
Ausubel，F.M.等，1994，《Current Protocols inMolecular Biology》，John Wiley&Sons)。
[0540] 实施例16
[0541] 体内诱变
[0542] 可以通过将质粒(或其他载体)DNA转入保持遗传信息完整性能力受损的大肠杆菌或其他微生物(例如芽孢杆菌属或酵母如酿酒酵母)来实施微生物体内诱变。通常，增变
株在DNA修复系统的基因中含有突变(如 mutHLS、mutD、mutT等；参考可见《Escherichia
coli and Salmonella》Rupp，W.D.，1996，ASM：Washington.中2277-2294页“DNA repair
mechanisms”)。这些株系为本领域技术人员所熟知。这些株系的使用在例如Greener，A.和
Callahan，M.，1994，Strategies 7：32-34中有所说明。优选在微生物中进行选择和测试后
再将突变的DNA分子转入植物。根据本文件范例中的各实施例制备转基因植物。
株在DNA修复系统的基因中含有突变(如 mutHLS、mutD、mutT等；参考可见《Escherichia
coli and Salmonella》Rupp，W.D.，1996，ASM：Washington.中2277-2294页“DNA repair
mechanisms”)。这些株系为本领域技术人员所熟知。这些株系的使用在例如Greener，A.和
Callahan，M.，1994，Strategies 7：32-34中有所说明。优选在微生物中进行选择和测试后
再将突变的DNA分子转入植物。根据本文件范例中的各实施例制备转基因植物。
[0543] 实施例17
[0544] YNL090W同源物的鉴定和分析
[0545] 过表达YNL 090W(ORF 3165)的转基因拟南芥植物在干旱条件下比野生型对照多存活4.33天。使用YNL090W的蛋白质序列鉴定表达序列标签(ESTs)专利文库的相关基
因序列，所述文库通过Blast分析建立自稻、Noppon-Brarre(一种日本稻)、欧洲油菜、“AC
Excel”、“Quantum”和“Cresor”(canola)和大豆(Altschul SF，Gish W，Miller W，Myers
EW，Lipman DJ.1990J Mol Biol 21593：403-10)。
因序列，所述文库通过Blast分析建立自稻、Noppon-Brarre(一种日本稻)、欧洲油菜、“AC
Excel”、“Quantum”和“Cresor”(canola)和大豆(Altschul SF，Gish W，Miller W，Myers
EW，Lipman DJ.1990J Mol Biol 21593：403-10)。
[0546] 植物cDNA序列翻译为预计的氨基酸序列，通过使用Vector NTI第7版的clustalW算法进行序列比对来测定氨基酸序列间的关系(图1)。它们总体上具有75％的相似性。
通常，具有称为I(GXXXGKT)、II(DXXG)、III(VGTK)、IV(EXSS)和E(FXXXYXX)的保守结构域
的蛋白质被归类为小GTPases。图1中蛋白质的全部五个结构域比在其他已知小GTPases
中更为保守，特别是结构域I(KXVXXGDXXXGKT)、结构域E(FXXXYXXTV)、结构域II(WDTAGQE)
和结构域III(VGTKXDL)。另外，图1显示了C端的多个氨基酸，以及作为翻译后被牻牛儿基
转移酶1修饰的信号序列的C端CAAL结构域(其中A为脂肪族氨基酸)。图1中大多数蛋
白质显示出的另一个Rho特异性特征是结构域II和结构域III之间的高度保守氨基酸。
通常，具有称为I(GXXXGKT)、II(DXXG)、III(VGTK)、IV(EXSS)和E(FXXXYXX)的保守结构域
的蛋白质被归类为小GTPases。图1中蛋白质的全部五个结构域比在其他已知小GTPases
中更为保守，特别是结构域I(KXVXXGDXXXGKT)、结构域E(FXXXYXXTV)、结构域II(WDTAGQE)
和结构域III(VGTKXDL)。另外，图1显示了C端的多个氨基酸，以及作为翻译后被牻牛儿基
转移酶1修饰的信号序列的C端CAAL结构域(其中A为脂肪族氨基酸)。图1中大多数蛋
白质显示出的另一个Rho特异性特征是结构域II和结构域III之间的高度保守氨基酸。