一种药物组合物及制备方法

摘要

本发明公开的药物组合物，组份中有超细粒子与药物分子，特征是药物分子共价键合在超细粒子上，组成稳定高效的药物化超细粒子，且在每mg超细粒子上共价键合的药物分子的平均值大于20μg；组合物中未结合成药物化超细粒子的药物分子含量，小于药物分子总量的5％，非稳定高效药物化超细粒子含量，小于稳定高效药物化超细粒子含量；药物分子与超细粒子间的共价键合，是活化超细粒子与药物分子间的共价键合；活化超细粒子，是指超细粒子与偶联基团间的共价键合，以及偶联基团与活化基团间的共价键合所生成的粒子衍生物；本发明优点是提供一种能提高药效、或/和安全性、或/和降低药物分子耗量、或/和增加药物组合物选择性，具有确定化学组成的药物组合物。

权利要求

1.一种药物组合物，特征在于：其至少含药物化超细粒子，其中所述药物化超细粒子，是指超细粒子和药物分子之间以共价键结合、且每mg超细粒子上共价键合的药物分子的平均值大于20μg的颗粒；

其中所述超细粒子是指在液相中以固相形式存在的、平均粒径在1nm至10μm之间的微小粒子，包括胶体、微米粒子、或纳米粒子；

其中所述药物分子与超细粒子间的共价键合，是活化超细粒子与药物分子之间的共价键合，其中所述活化超细粒子是指经在其表面定量地共价键合有活性基团的超细粒子；

其中所述活化超细粒子中，所述活化基团共价键合在偶联基团上，偶联基团共价键合在超细粒子上；

其中所述的活化基团包括氨基和不含氨基的有机基团；

其中所述的偶联基团为有机硅偶联基团。

2.按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：在该药物组合物中，未结合在超细粒子上的药物分子的含量，小于药物分子总量的5％。

3.按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述偶联基团的平均分布密度，大2

于1.85μmol/m 超细粒子表面。

4.按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述活化基团的平均分布密度，大2

于1.85μmol/m 超细粒子表面。

5.按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述偶联基团的平均分布密度，大

2 2

于1.85μmol/m 超细粒子表面，所述活化基团的平均分布密度，大于1.85μmol/m 超细粒子表面。

6.按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述活化基团包括通式为-RNH2的基团，其中所述R为有机基团。

7.按照权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述活化基团的平均分布密度，大2

于0.5μmol/m 超细粒子表面。

8.按照权利要求1-7之一所述的药物组合物，其特征在于：该药物组合物为疫苗组合物，该组合物中的药物分子为抗原。

9.按照权利要求1-7之一所述的药物组合物，其特征在于：所述超细粒子为无机超细粒子。

10.按照权利要求1-7之一所述的药物组合物，其特征在于：所述超细粒子为纳米粒子。

11.一种权利要求1-10之一所述的药物组合物的制备方法，包括：a.提供所述超细粒子和药物分子，并使药物分子与超细粒子进行所述共价键合；

b.使每mg超细粒子共价键合的药物分子的平均值大于20μg。

12.按照权利要求11所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：该方法中至少含有所述活化超细粒子的制备。

13.按照权利要求12所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：该方法中必须使用所述的活化超细粒子。

说明书

一种药物组合物及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种药物组合物，尤其是含药物化超细粒子的药物组合物。本发明还涉及本发明药物组合物的制备方法。

背景技术

[0002] 本发明中所用术语“药物分子”，是指对生物具有特定的预防和/或治疗功能的药物分子，例如疫苗、治癌药物分子等等；术语“药物组合物”是指含药物分子和与药物分子结合的、具有特定功能的非药物分子物质(例如佐剂、输运载体、缓释介质等等)的组合物。以下以疫苗为例，陈述药物组合物的现状与尚待解决的问题。

[0003] 本发明中所用术语“超细粒子”，是指在液相中以固相形式存在的、平均粒径在1nm至10μm之间的微小粒子，包括胶体、微米粒子、或纳米粒子；所用术语“药物化超细粒子”，是指固定有药物分子的超细粒子。

[0004] 本发明中所用术语“疫苗”，是指可以诱导针对致病原的特异性抗体和细胞免疫，或其它免疫状态，从而获得保护或消灭这种致病原或消除这种病态的因子，如蛋白、多糖、核酸、活载体或感染因子。疫苗可以分为几类，一类是病毒的灭活疫苗，就是获得病毒以后经过一些方法的处理，让它完全丧失活性。第二类是减毒疫苗，也就是降低微生物对宿主的毒力，把它做成疫苗。第三类是基因工程和化学合成疫苗，即使用基因工程和化学合成的方法，生产出与免疫源相同的特异抗原片断蛋白质、多糖或表达特异抗原片断蛋白质的DNA，再将其导入机体或细胞，使之产生针对这一段免疫源的蛋白的抗体，来达到获得保护或消灭这种致病原或消除这种病态因子的目的。疫苗包括用于人和动物的DNA疫苗、蛋白质/多肽疫苗、多糖疫苗，重组疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗、减毒活疫苗、粘膜疫苗，单价或多价、单联或多联疫苗。从剂型上看，包括片剂、口含剂、栓剂、水针剂、透皮剂、滴鼻剂、气溶胶或喷雾剂型。

[0005] 为了获得疫苗更好的免疫效果，许多疫苗使用了佐剂。佐剂是一类与免疫原结合使用而能增强免疫效果的物质。随着疫苗和佐剂技术的发展，免疫接种也不再局限于用来预防感染性疾病，癌症、自身免疫性疾病、毒品依赖和其它一些疾病以及过敏、寄生虫也可通过运用对特异性抗原建立免疫的概念来进行治疗和预防，还可以运用对特异性抗原建立免疫的概念来进行避孕。

[0006] 以超细铝盐粒子为佐剂的疫苗组合物己大量用于临床。尽管铝盐佐剂已由大量的临床验证证明了其安全性，但其免疫效率却不能令人满意，尤其是各种小分子多肽抗原和多糖疫苗免疫效率尚有待提高。因此，发展出了油性佐剂、脂肪族佐剂、聚合物表面活性剂、聚微粒载体佐剂、植物佐剂、细菌佐剂、人工合成佐剂、细胞因子佐剂、核酸佐剂、纳米佐剂等等。对目前含超细粒子的疫苗组合物而言，抗原和超细粒子之间的结合形式，基本上基于物理化学吸附。这种结合形式并不稳定。然而，在以这种不稳定结合形成的含超细粒子的疫苗组合物中，这种不稳定性被赋与“缓释”的作用。这种不稳定性，有可能在体内不同的生理、生物环境中产生不确定性。对其它药物组合物而言，也有类似问题。因而，提高药物组合物的确定性，有可能是提高其安全性和效率的一条重要途径。

发明内容

[0007] 本发明的主要目的在于：提供一种具有稳定的、定量的化学组成的药物组合物，从而提高药效、或/和安全性、或/和降低药物分子耗量、或/和增加药物组合物选择性。

[0008] 本发明的另一个目的是：提供具有确定化学组成的药物组合物的制备方法。

[0009] 本发明的目的是通过实施下述技术方案来实现的：

[0010] 一种药物组合物，其特征在于：至少含高稳定、高效率药物化超细粒子，其中所述高稳定、高效率药物化超细粒子，是指超细粒子和药物分子之间以共价键结合、且每mg超细粒子上共价键合的药物分子的平均值大于20ug的颗粒。此处“共价键合”是指在高盐浓度(例如≥1.0M NaCl)下不分离的结合。

[0011] 正如本发明实施例所述，同不具备本发明技术特征的药物组合物相比，本发明的药物组合物可以有明显较高的反应效率，或/和明显较低的药物分子耗量，或/和明显较低的超细粒子耗量，从而明显增加药物组合物的安全性。

[0012] 一般而言，含药物化超细粒子的药物组合物，是含药物化超细粒子的混合物，因其可能还含有或多或少未结合成药物化超细粒子的药物分子、和或多或少基本上未结合成药物化超细粒子的超细粒子。即使纯化，也只是使某一组分比例尽可能大或小。于是，本发明药物组合物还包括有另一项方案：

[0013] 一种药物组合物，其特征在于：在该药物组合物中，未结合在超细粒子上的药物分子的含量小于药物分子总量的5％，且非稳定、高效药物化超细粒子的含量，小于稳定、高效药物化超细粒子的含量。在本发明实施例的一项方案中，非稳定、高效药物化超细粒子的含量小于稳定、高效药物化超细粒子含量的50％、优选小于药物化超细粒子的含量的30％。

[0014] 本发明中所述“非稳定、高效药物化超细粒子”是指：稳定、高效药物化超细粒子之外的超细粒子，包括未结合成药物化超细粒子的超细粒子，和虽结合成药物化超细粒子，但其组成不是稳定、高效药物化超细粒子组成的超细粒子。

[0015] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述组成稳定高效的药物化超细粒子，其药物分子与超细粒子间的共价键合，是活化超细粒子与药物分子之间的共价键合。

[0016] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述活化超细粒子，是指超细粒子与偶联基团之间的共价键合，以及偶联基团与活化基团之间的共价键合所生成的粒子衍生物。

[0017] 于是，高稳定、高效率药物化超细粒子，是将药物分子定量地共价键合在活化超细粒子上形成的。本发明中“活化超细粒子”是指：经在其表面定量地共价键合有活性基团的超细粒子。

[0018] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述超细粒子与活化基团之间的共价键合，包括：超细粒子与偶联基团之间的共价键合，及偶联基团与活化基团之间的共价键合。偶联基团的引入，往往有利于提高活化基团的反应性。

[0019] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述活化基团包括不含氨基的有机基团。在本发明实施例的一项方案中，所述不含氨基的有机基团，包括醛基和环氧基。其它基团，例如巯基，也可应用在本方案中。

[0020] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述活化基团包括氨基。

[0021] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述超细粒子与活化基团之间的共价键合包括超细粒子与偶联基团之间的共价键合，和偶联基团与活化基团之间的共价键合；这里所2
用偶联基团的平均分布密度，大于1.85μmol/m 超细粒子表面，或/和当所述活化基团为
2
氨基或不含氨基的有机基团时，活化基团的平均分布密度，大于1.85μmol/m 超细粒子表面。

[0022] 在本发明药物组合物的一项方案中，上述偶联基团包括有机硅偶联基团。

[0023] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述活化基团包括通式为-RNH2的基团，其中R为有机基团。

[0024] 在本发明实施例的一项方案中，所述通式为-RNH2的基团包括氨基肼基团。

[0025] 在本发明实施例的一项方案中，所述通式为-RNH2的基团包括氨基酸基团。

[0026] 在本发明实施例的一项方案中，所述氨基酸基团包括精氨酸基团、天冬酰氨基团、甘氨酸基团。

[0027] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述通式为-RNH2的基团的平均分布密度，大2
于0.5μmol/m 超细粒子表面。

[0028] 在本发明药物组合物的一项方案中，所述通式为-RNH2的基团的平均分布密度，大2
于1.0μmol/m 超细粒子表面。

[0029] 在本发明药物组合物的一项方案，为疫苗组合物，该组合物中的药物分子包括抗原。

[0030] 在本发明药物组合物的一项方案中，作为药物组合物组份的超细粒子，包括无机超细粒子。

[0031] 在本发明实施例的一项方案中，所述无机超细粒子，包括金属盐超细粒子。

[0032] 在本发明实施例的一项方案中，所述金属盐超细粒子，包括铝盐超细粒子、硅盐超细粒子、钛盐超细粒子、金超细粒子。

[0033] 在本发明药物组合物的一项方案中，作为药物组合物组份的超细粒子，包括胶体。

[0034] 在本发明药物组合物的一项方案中，作为药物组合物组份的超细粒子，包括纳米粒子，这种纳米粒子是指在三维空间中至少有一维限度小于500nm的固相载体粒子。优选为小于100nm、更优选为小于50nm的固相载体粒子。在本发明药物组合物的一项方案中，所述的“活化超细粒子”包括“活化纳米粒子”。活化纳米粒子是指经在其表面定量地共价键合有活性基团的纳米粒子。

[0035] 本发明提供制备这种药物组合物的方法，其至少含：提供所述超细粒子和药物分子，并使药物分子与超细粒子进行所述共价键合；使每mg超细粒子共价键合的药物分子的平均值大于20ug。在本发明方法的一项方案中，其至少含活化超细粒子的制备，所述活化超细粒子含所述超细粒子、共价键合在超细粒子上的所述偶联基团、和共价键合在偶联基团上的所述活化基团。

[0036] 本发明还提供上述的药物组合物的制备方法中所述的活化超细粒子。

[0037] 本发明的优点在于：提供了一种能提高药效、或/和安全性、或/和降低药物分子耗量、或/和增加药物组合物选择性，具有确定化学组成的药物组合物。从实施例看出：同不具备本发明技术特征的药物组合物相比，本发明的药物组合物确实有明显较高的反应效率，或/和明显较低的药物分子耗量，或/和明显较低的超细粒子耗量，从而明显增加了药物组合物的安全性。

[0038] 下面将通过实施例详细地说明本发明的内容。

[0039] 实施例1：活化超细粒子的制备方法

[0040] 本实施例中，活化超细粒子制备方法一般包括：

[0041] 1).提供超细粒子、偶联剂和活化剂

[0042] 本实施例中，所用超细粒子如表1所示。其中氧化铝超细粒子按公知的铝佐剂的制备方法制备。简言之：以三氯化铝和氢氧化钠为原料制备，在搅拌下于5％三氯化铝100ml中慢慢加入5％NaOH至反应完全完成，在室温放置半小时，去上清液，以蒸馏水洗沉淀3次，配制成1.5mg/ml的悬液，低温保存备用。超细氧化铝粒子通常具有约10nm-3μm
2
的颗径，比表面积约100m/g。金超细粒子按公知的胶体金的制备方法制备，通常具有约
2
10nm-1μm的颗径，比表面积约100m/g。

[0043] 表1

[0044]

[0045]

[0046] 本实施例中，所用偶联剂如表2所示。本发明中，偶联剂为含偶联基团的试剂。

[0047] 表2

[0048]化学名称 提供者
3-氨丙基三甲氧基硅烷 国泰华荣化工新材料公司
氨丙基三乙氧基硅烷 国泰华荣化工新材料公司
3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷 华盛化学有限公司

[0049] 2).进行超细粒子、偶联基团和活化基团间的共价键合反应

[0050] 本实施例中，超细粒子、偶联基团和活化基团间的共价键合反应一般包括：

[0051] (1).去离子处理

[0052] 本实施例中，先制备超细粒子悬浮液，其中超细粒子浓度(w/v)在5-30％之间。如有必要，可进行去离子处理，例如：选用己知的离子交换层析方法，将超细粒子悬浮液中的阴、阳离子分别去除，然后对悬浮液进行离心(2-8℃，20000g)并获得超细粒子沉积物。本实施例中，新制备的超细粒子(氧化铝超细粒子或金超细粒子)未经此步骤处理，而直接进行化学改性。

[0053] (2).在超细粒子表面共价键合偶联剂

[0054] 将上述超细粒子沉积物制成超细粒子悬浮液，并与偶联剂溶液混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间等等)可以控制反应。本实施例中共价键合反应时，超细粒子的浓度(w/v)在5％至5‰之间调节；偶联剂浓度(v/v)在1％至5％之间调节；反应介质为含水的甲醇；反应温度在室温至反应介质沸点以下5℃之间调节；反应时间在0.5至2小时之间调节。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。要强调的是，偶联剂与超细粒子间的键合反应，是能否获得本发明的药物组合物的关键步骤之一。

[0055] 反应完成后，对悬浮液进行多次离心(2-8℃，20000g)以去除未结合在超细粒子上的反应物和反应介质，然后获得以DMF为分散介质的超细粒子悬浮液。

[0056] 本实施例中，通过调节偶联反应参数获得不同的结合有偶联基团的超细粒子。一些超细粒子在元素分析中的氮含量在0.25-0.65N％之间变动，理论上相当于1g超细粒子2
上固定的偶联基团在179-464μmol之间变动，或1m 超细粒子表面上固定的偶联基团在
1.3-3.4μmol之间变动。本实施例中，只有当偶联基团含量超过一个最低含量时，超细粒子才能满足本发明的方法的要求，被用以进一步制备本发明的活化超细粒子。具体而言，这个最低含量是指元素分析中的氮含量大于0.35N％、优选大于0.5N％(或1g超细粒子上固定
2
的偶联基团大于250μmol、优选大于357μmol，或1m 超细粒子表面上固定的偶联基团大于1.85μmol、优选大于2.64μmol)。此外，偶联基团的含量也用其它方法(例如元素分析中的碳含量)测定、计算，但本质上是一样的。

[0057] (3).将活化基团共价键合至偶联基团上

[0058] 本实施例中，当偶联剂中不含活化基团时，活化超细粒子的制备还包括将活化基团共价键合至偶联基团上。方法为：将超细粒子悬浮液与活化剂溶液(例如以DMF为溶剂)混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。此一共价键合反应，也是能否获得本发明药物组合物的关键步骤之一。

[0059] 反应完成后，对悬浮液进行多次离心(2-8℃，20000g)以去除未结合在超细粒子上的反应物和反应介质，然后获得超细粒子的悬浮液。若活化剂含保护基团(例如Fmoc)，还要脱去这些保护基团。脱保护方法选自己知的肽合成中的脱保护方法。

[0060] 本发明的方法的另一方案，是先将活化剂(例如氨基肼)与偶联剂(例如3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷)反应，使活化基团共价键合至偶联基团上，再将此一键合有活化基团的偶联基团共价键合至无机物超细粒子表面上。制备键合有活化基团的偶联基团的方法是公知方法。

[0061] 更具体的制备方法由以下实施例补充。

[0062] 实施例1.1：活化超细粒子(活化基团为-RNH2)的制备方法

[0063] 本实施例中，所用活化剂如表3所示。本发明中，活化剂为含活化基团的试剂，活化基团为用以特征性地固定药物分子的基团，尽管其它基团(例如偶联基团)上也可能固定药物分子。活化剂可有、也可没有活性基团的保护基团(例如Fmoc)。

[0064] 表3

[0065]

[0066] 本实施例中，通过调节活化反应参数获得不同的结合有活化基团的活化超细粒子。一些活化超细粒子在元素分析中的氮含量在0.58-1.50N％之间变动。减去结合有偶联基团的超细粒子的元素分析氮含量后，与活化基团有关的氮含量在0.10-0.85N％之间变2
动，理论上相当于1g超细粒子上固定的活化基团在35-245μmol之间变动，或1m 超细粒子表面上固定的活化基团在0.26-1.8μmol之间变动。本实施例中，只有当活化基团含量超过一个最低含量时，超细粒子才能满足本发明的方法的要求，被选作进一步制备本发明药物组合物的活化超细粒子。具体而言，这个最低含量是指，与活化基团有关的元素分析氮含量大于0.20N％、优选大于0.40N％(或1g超细粒子上固定的活性基团大于70μmol、优选
2
大于140μmol，或1m 超细粒子表面上固定的活化基团大于0.5μmol、优选大于1μmol)。
此外，活化基团的含量也可用元素分析中的碳含量表征，但本质上是一样的。所含活化基团量小于此一最低含量的超细粒子，被称作非活化超细粒子，用以与活化超细粒子进行比较研究。本实施例中，非活化超细粒子包括未活化超细粒子(共价键合活化基团量为0)和弱
2
活化超细粒子(1m 超细粒子表面上固定的活化基团小于0.5μmol)。

[0067] 表4列出了实施例1.1中制备的部份活化超细粒子的组成。

[0068] 表4

[0069]

[0070] *：偶联后元素分析中的N百分比

[0071] **：与活化基团有关的元素分析氮含量(N％)＝活化超细粒子元素分析中的N百分比-未活化前含偶联基团的超细粒子的元素分析中的N百分比

[0072] 实施例1.2：活化超细粒子(活化基团为氨基)的制备方法

[0073] 本实施例中，对于以氨基(-NH2)为活化基团的活化超细粒子，在使用3-氨丙基三甲氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷时，偶联基团与活化基团同时固定在超细粒子上，偶联基团与活化基团在超细粒子上的分布密度相同。本实施例中，只有当氨基密度超过一个最低含量时，超细粒子才能满足本发明的方法的要求，被选作活化超细粒子。具体而言，这个最低含量是指元素分析中的氮含量大于0.38N％、优选大于0.5N％(或1g超细粒子上固定2
的偶联基团大于270μmol、优选大于357μmol，或1m 超细粒子表面上固定的偶联基团大于2.0μmol、优选大于2.6μmol)。

[0074] 实施例1.3：活化超细粒子(活化基团为不含-NH2的有机基团)的制备方法[0075] 本实施例中，所用活化剂分别为戍二醛和1，4-丁二醇二缩水甘油醚。本实施例的方法，也适于其它含有不含-NH2的活化基团(例如羰基、-SH基等等)的活化剂。

[0076] 超细粒子上固定的偶联剂中含氨基时，超细粒子与1，4-丁二醇二缩水甘油醚反应，在偶联基团上共价键合带有碳原子链的环氧基；超细粒子与戍二醛反应，在偶联基团上共价键合醛基。

[0077] 本实施例中，只有用所固定的偶联剂大于1.85μmol/1m2粒子表面的超细粒子，结合活化基团制成的制备物，才被选作活化超细粒子。

[0078] 需要说明的是，元素分析(Microanalysis)也许不一定是最佳方法，但在其误差范围内并不影响本发明的成立，既只有当活化超细粒子表面固定的功能基团、尤其是活化基团数目达到一定值时，用其与抗原一起制备的药物组合物才具有特定的性质，从而达到本发明的目的。专业人员应当知道，尽管利用其它分析方法可能得出不同的数值，但其原则仍在本发明的权利要求之内。

[0079] 实施例2药物分子/活化超细粒子混合物的制备

[0080] 本发明中，药物分子/活化超细粒子混合物，是指含药物化超细粒子的制备物。其制备方法一般包括：

[0081] 1).提供药物分子和本发明的活化超细粒子

[0082] 本实施例中，所用活化超细粒子选自实施例1制备的合乎要求的活化超细粒子；所用药物分子如表5所示。

[0083] 表5

[0084]药物分子 来源
EBV-VCA-P18抗原 自制*
丙肝病毒抗原(HCV AG) 北京大学人民医院肝病研究所
基因工程重组乙肝疫苗 天坛生物制品股分有限公司
狂犬病纯化抗原 武汉生物制品研究所
破伤风类毒素 成都生物制品研究所

[0085] *：制作方法参考：Tranchand-Bunel，D.，Auriault，C.，Diesis，E.，Gras-Masse，H.(1998)Detection of human antibodies using “convergent”combinatorial peptide libraries or“mixotopes”designed form a nonvariable antigen：Application to the EBV viral capsid antigen p18，J.Peptide Res.52，1998，495-508。

[0086] 本实施例的方法也适于其它药物分子，例如：抗原、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链DNA、RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。

[0087] 本实施例的方法也适于其它药物分子，例如：药物、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链DNA、RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。

[0088] 2).制备药物化超细粒子

[0089] 制备方法为：通过离心分离获得活化超细粒子沉积物，再将其均匀分布在缓冲液中制成活化超细粒子悬浮液，并与药物分子溶液混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间等等)可以调节反应产物的组成。本实施例中：反应时超细粒子的浓度(w/v)在0.1‰至1‰之间调节，药物分子浓度在1μg/ml至1mg/ml之间调节。反应介质为缓冲液(例如PBS)；反应温度在室温至40℃之间调节；反应时间在0.5至24小时之间调节。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得满足本发明的药物组合物的优选条件。要强调的是，活化超细粒子和药物分子之间的反应，也是能否获得本发明药物组合物的关键步骤之一。

[0090] 反应完成后，对悬浮液进行离心(2-8℃，20000g)，取上清液测定药物分子浓度，以测定未结合在超细粒子上的药物分子量。其中，上清液蛋白质浓度的测定使用常规测定方法。如有必要，也可再离心(2-8℃，20000g)，以减少药物分子/活化超细粒子混合物中未结合药物分子。

[0091] 药物分子/活化超细粒子混合物中，也可能含非高稳定、高效率药物化超细粒子。本实施例中，药物分子/活化超细粒子混合物中非高稳定、高效率药物化超细粒子的比例，可以通过公知的亲和层析法来测定。例如，在乙肝疫苗/活化纳米粒子混合物的情况下，用特异性乙肝抗体(成都生物制品研究所)作配基固定至活化层析胶上，再将混合物加入亲和层析柱中，收集流过液，将流过液和药物分子/活化超细粒子混合物悬浮液分别离心(20000g，60分钟)，比较离心沉淀量，可得此比例。亲和层析胶的制备方法及亲和层析的进行方法为常规方法。如有必要，亲和层析法也是获得高稳定、高效率药物化超细粒子的一种方法。

[0092] 如有必要，还可对混合物中活化超细粒子表面进行钝化处理。

[0093] 如有必要，还加入其它添加剂。其它添加剂的例子包括：糖类物质(例如葡萄糖、蔗糖、山梨醇等等)、盐(例如氯化钠)、氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸等等)。

[0094] 这样，就制备出了本实施例的药物组合物。

[0095] 本实施例中，通过调节反应参数获得不同的药物分子/活化超细粒子混合物。利用实施例1制备的活化超细粒子，在优化条件下制备的药物分子/活化超细粒子混合物中：1).用1.0M NeCl不能将药物分子从超细粒子分离；2).每mg超细粒子共价键合的药物分子的平均值大于20μg、甚至大于35μg、个别达到50μg。更进一步(如有必要，通过离心分离)，未结合药物分子的含量小于5％。更进一步(如有必要，通过例如亲和层析分离的分离)，非高稳定、高效率药物化超细粒子的含量小于50％、甚至接近于0。

[0096] 然而，利用弱活化超细粒子或非活化超细粒子，在相同条件下的制备中，药物分子/活化超细粒子混合物则有与上述组成非常不同的组成。

[0097] 使用表1中未经化学改性的超细粒子，与相应药物分子制备的药物分子/超细粒子混合物中，药物分子也可固定在超细粒子上(本实施中称为第一类非高稳定、高效率药物化超细粒子)。这是一种基于物理化学吸附(例如离子吸附)的固定，并不稳定，在1.0M NaCl中大多解吸。

[0098] 使用弱活化超细粒子(参考实施例1)，与相应药物分子制备的药物分子/超细粒子混合物中，药物分子也可固定在超细粒子上(本实施中称为第二类非高稳定、高效率药物化超细粒子)。这是一种主要基于物理化学吸附(例如离子吸附)、包括部份共价键合的固定，稳定也不算高，在1.0M NaCl中解吸后，每mg超细粒子上固定的药物分子的平均值小于20μg、甚至小于10μg。

[0099] 更进一步，对含上述第一类或第二类非高稳定、高效率药物化超细粒子的药物组合物而言，未结合药物分子的含量可以大于5％、甚至大于10％；而非高稳定、高效率药物化超细粒子的含量可以大于50％。

[0100] 从而，本发明的药物组合物具有特别的组成，使其具有高的稳定性。下面我们将看到，它还具有高的效率。

[0101] 本实施例中，更具体的制备方法由以下实施例补充。

[0102] 实施例2.1：药物分子/活化超细粒子混合物的制备方法(活化超细粒子含-RNH2活化基团)

[0103] 本实施例中，所用活化超细粒子含-RNH2活化基团，其选自实施例1.1制备的活化超细粒子。

[0104] 本实施例中：每mg超细粒子共价键合的药物分子的平均值大于20μg、甚至大于35μg、个别达到50μg。更进一步(如有必要，通过离心分离)，未结合药物分子的含量小于5％。更进一步(如有必要，通过例如亲和层析分离的分离)，非高稳定、高效率药物化超细粒子的含量小于50％、甚至接近于0。

[0105] 表6列出了实施例2.1中制备的部份药物分子/活化超细粒子混合物的组成。

[0106] 表6

[0107]

[0108]

[0109] *：参考表4

[0110] **：(离心上清液中药物分子含量/药物分子总加入量)×100％

[0111] ***：(亲和层析透过液的离心沉淀量/药物分子/活化超细粒子混合物的等体积液的离心沉淀量)×100％

[0112] 实施例2.2：药物分子/活化超细粒子混合物的制备方法(活化超细粒子含-NH2活化基团)

[0113] 本实施例中，所用活化超细粒子含-NH2活化基团，其选自实施例1.2制备的活化超细粒子。

[0114] 实施例2.3：药物分子/活化超细粒子混合物的制备方法(活化超细粒子含有不含NH2的活化基团)

[0115] 本实施例中，所用活化超细粒子中的活化基团不含NH2，其选自实施例[0116] 1.3制备的活化超细粒子。

[0117] 实施例3：本发明的药物组合物的比较研究

[0118] 本实施例中，用作比较研究的药物组合物包括：

[0119] (1).不含超细粒子的药物(I类对照物)

[0120] 选自表5。

[0121] (2).基于未活化超细粒子制备的药物组合物(II类对照物)

[0122] 其为实施例2中所述的含第一类非高稳定、高效率药物化超细粒子的药物组合物。

[0123] (3)基于弱活化超细粒子制备的药物组合物(III类对照物)

[0124] 其为实施例2中所述的含第二类非高稳定、高效率药物化超细粒子的药物组合物。

[0125] (4)实施例2.1制备的药物组合物(IV类对照物)

[0126] (5)实施例2.2和2.3制备的药物组合物(V类对照物)

[0127] 本实施例中，未见实验动物的死亡。

[0128] 实施例3.1：乙肝疫苗组合物的免疫效果比较研究

[0129] 本实施例中，药物组合物(上述I-V类对照物)含基因工程重组乙肝疫苗(天坛生物制品股份有限公司)。上述I类对照药物组合物中，重组乙肝疫苗抗原浓度为20μg/ml。上述II-V类对照物中，重组乙肝疫苗抗原浓度为1-10μg/ml，超细粒子浓度为20-200μg/ml。

[0130] 本实施例中，实验小鼠为5周龄、重18-20g的balb/c小鼠。每实验组各8只小鼠。在0周和3周进行免疫，每只小鼠腹腔内注射0.1ml药物组合物。第1针后7天第一次抽血、第21天第二次抽血、第42天第三次抽血、第63天第四次抽血。检测免疫血样中的HBsAb滴度。抗体检测使用公知的ELlSA方法(厦门科创生物技术有限公司)。

[0131] 第一次抽血检测结果为：

[0132] (1).当药物组合物中抗原浓度、超细粒子浓度较低时(例如，重组乙肝疫苗抗原浓度为4μg/ml、超细粒子浓度为80μg/ml)，免疫血样中的HBsAb滴度，以使用本发明的药物组合物(IV或V类对照物)者为最高，以使用基于弱活化超细粒子制备的药物组合物(III类对照物)者次之(比前者平均低300％以上)，又以使用未活化超细粒子制备的药物组合物(II类对照物)者更次之(比前者平均低180％以上)；

[0133] (2).即使使用重组乙肝疫苗抗原浓度为4μg/ml、超细粒子浓度为80μg/ml的II类对照物，与使用重组乙肝疫苗抗原浓度为20μg/ml的I类对照物相比，其免疫血样中的HBsAb滴度也更高(平均高380％以上)；

[0134] (3)当药物组合物中抗原浓度、超细粒子浓度较低时(例如，重组乙肝疫苗抗原浓度为4μg/ml、超细粒子浓度为80μg/ml)，免疫血样中的HBsAb滴度，使用本发明的药物组合物(IV类对照物)者，比使用本发明的药物组合物(V类对照物)者高(平均高150％以上)。

[0135] 免疫血样中的HBsAb滴度的第二次抽血检测结果为：以组成含4μg重组乙肝疫苗抗原/ml和80μg超细粒子/ml的本发明药物组合物免疫者，比以组成含10μg重组乙肝疫苗抗原/ml和200μg超细粒子/ml的基于弱活化超细粒子制备的药物组合物免疫者高，后者又比以组成含20μg重组乙肝疫苗抗原/ml和400μg超细粒子/ml的基于未活化超细粒子制备的药物组合物免疫者高，后者又比以组成仅含20μg重组乙肝疫苗抗原/ml免疫者高450％以上。

[0136] 免疫血样中的HBsAb滴度的第三次抽血检测结果为：以组成含4μg重组乙肝疫苗抗原/ml和80μg超细粒子/ml的本发明药物组合物免疫者，与以组成含10μg重组乙肝疫苗抗原/ml和200μg超细粒子/ml的基于弱活化超细粒子制备的药物组合物免疫者近似，后者又与以组成含20μg重组乙肝疫苗抗原/ml和400μg超细粒子/ml的基于未活化超细粒子制备的药物组合物免疫者近似，而后者又比以组成仅含20μg重组乙肝疫苗抗原/ml免疫者高450％以上。

[0137] 第四次抽血检测结果与第三次抽血检测结果相似。

[0138] 实施例3.2：狂犬病纯化疫苗组合物的免疫效果比较研究

[0139] 本实施例中，药物组合物(上述I-V类对照物)含狂犬病纯化抗原(武汉生物制品研究所)。上述I类对照药物组合物中，疫苗抗原浓度为5IU/ml。上述II-V类对照物中，疫苗抗原浓度为2.5IU/ml，超细粒子浓度为20-200μg/ml。

[0140] 本实施例中，实验小鼠与实施例3.1相同，实验方法与实施例3.1相同。检测免疫血样中的抗狂犬病毒抗体滴度。抗体检测使用公知的ELISA方法，所用ELISA试剂盒选自北京兰伯瑞生物技术有限公司。

[0141] 抽血检测结果与实施例3.1中抽血检测结果一致：

[0142] 使用较低抗原浓度、超细粒子浓度的本发明的药物组合物(IV或V类对照物)，与使用较高抗原浓度、超细粒子浓度的III类对照物和II类对照物比较，可获得至少相似(甚至更快)的免疫效果。

[0143] 实施例3.3：破伤风类毒素组合物的免疫效果比较研究

[0144] 本实施例中，药物组合物(上述I-V类对照物)含破伤风类毒素(成都生物制品研究所)。上述I类对照药物组合物中，破伤风类毒素浓度为80IU/ml。上述II-V类对照物中，破伤风类毒素浓度为10-80IU/ml，超细粒子浓度为25-200μg/ml。

[0145] 本实施例中，实验小鼠与实施例3.1相同，实验方法与实施例3.1相同。

[0146] 血样中的抗破伤风类毒素的抗体滴度：抗体检测使用公知的ELISA方法，所用ELISA试剂盒选自商业试剂盒(上海贝西公司)。

[0147] 抽血检测结果与实施例3.1中抽血检测结果一致：

[0148] 使用较低破伤风类毒素浓度、超细粒子浓度(例如破伤风类毒素浓度为20IU/ml和超细粒子浓度为50μg/ml)的本发明的药物组合物(IV或V类对照物)，与使用较高抗原浓度、超细粒子浓度(例如破伤风类毒素浓度为40IU/ml和超细粒子浓度为100μg/ml)的III类对照物和II类对照物比较，可获得至少相似(甚至更快)的免疫效果。而后者又比仅使用破伤风类毒素80IU/ml者的免疫效率高。

[0149] 实施例3.4：丙肝抗原组合物的免疫效果比较研究