生产伽马-羧化的蛋白的方法

摘要

本发明涉及生产大量的伽马-羧化的蛋白的方法和工具，包括：(i)培养细胞，所述细胞被改造来以至少10∶1的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。

权利要求

1.一种包含至少一种表达载体的真核宿主细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中第一启动子选自人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子，pEF-1α，pRSV或pUbC，并且第二启动子选自SV40即时早期启动子，最小化的FIX启动子或HSV胸苷激酶启动子。

2.如权利要求1中所要求的真核宿主细胞，其中所述核酸分子在单个表达载体中。

3.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述第一启动子是人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子，和所述第二启动子是SV40早期启动子。

4.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白选自由凝结因子VII、凝结因子IX、凝血酶原(凝结因子II)、凝结因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基质Gla蛋白、生长停滞-特异性蛋白6和Acanthophiinae FXa-样蛋白构成的组。

5.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是维生素K依赖性凝结因子。

6.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子IX。

7.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子X。

8.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是凝血酶原。

9.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是蛋白C。

10.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子VII。

11.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是人类蛋白。

12.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中γ-谷氨酰羧化酶是人类蛋白。

13.如权利要求1或2中所要求的真核宿主细胞，其中所述细胞选自由哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞构成的组。

14.如权利要求13所要求的真核宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

15.一种载体，包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中第一启动子选自人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子，pEF-1α，pRSV或pUbC，并且第二启动子选自SV40即时早期启动子，最小化的FIX启动子或HSV胸苷激酶启动子。

16.如权利要求15中所要求的载体，其中所述第一启动子是人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子，和所述第二启动子是SV40早期启动子。

17.如权利要求15或16中所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白选自由凝结因子VII、凝结因子IX、凝血酶原(凝结因子II)、凝结因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基质Gla蛋白、生长停滞-特异性蛋白6和Acanthophiinae FXa-样蛋白构成的组。

18.如权利要求15或16中所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子IX。

19.如权利要求15或16中所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子X。

20.如权利要求15或16中所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是凝血酶原。

21.如权利要求15或16中所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是蛋白C。

22.如权利要求15或16中所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子VII。

23.一种生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括：

(i)培养包含至少一种表达载体的真核细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中第一启动子选自人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子，pEF-1α，pRSV或pUbC，并且第二启动子选自SV40即时早期启动子，最小化的FIX启动子或HSV胸苷激酶启动子，和(ii)分离所述伽马-羧化的蛋白。

24.如权利要求23所要求的方法，其中所述伽马-羧化的蛋白选自由凝结因子VII、凝结因子IX、凝血酶原(凝结因子II)、凝结因子X、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基质Gla蛋白、生长停滞-特异性蛋白6和Acanthophiinae FXa-样蛋白构成的组。

25.如权利要求23或24所要求的方法，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是维生素K依赖性凝结因子或其活化形式。

26.如权利要求23或24所要求的方法，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子IX或其活化形式。

27.如权利要求23或24所要求的方法，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子X或其活化形式。

28.如权利要求23或24所要求的方法，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是凝血酶原或其活化形式。

29.如权利要求23或24所要求的方法，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是蛋白C或其活化形式。

30.如权利要求23或24所要求的方法，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子VII或其活化形式。

31.一种生产适合于诱导血液凝固或促进增加的凝结或促进减少的凝结的药物组合物的方法，包括纯化从包含至少一种表达载体的真核宿主细胞表达的活性羧化蛋白，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中第一启动子选自人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子，pEF-1α，pRSV或pUbC，并且第二启动子选自SV40即时早期启动子，最小化的FIX启动子或HSV胸苷激酶启动子，和将所述纯化的羧化蛋白与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合。

说明书

生产伽马-羧化的蛋白的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列。本发明进一步涉及以高产量生产需要γ-羧化作用的蛋白的方法。

[0002] 发明背景

[0003] 出血是常见的临床问题。它是疾病、外伤、手术和药物治疗的结果。机械性地阻止出血是必要的。由于出血的位置或由于从许多(小)脉管散开，这是非常困难的或甚至是不可能的。因而出血的病人可能需要用支持止血的试剂治疗。这可以是血液衍生产品(血治疗，heamotherapy)、引起内源止血剂的释放的试剂、重组凝结因子(F)或延迟血液凝块分解的试剂。

[0004] 通常从地方医院获得的血液衍生产品之中第一线的治疗(first linetreatment)是用于容量置换和支持止血的全血，包装的红细胞用于改善氧转运容量，血小板浓缩物以提高血小板数量(如果数量低或有缺陷)和新鲜的冷冻血浆用于支持止血(血液凝结和血小板聚集)。支持止血的第二线的血浆衍生产品是血浆冷沉淀物、凝血酶原复合物浓缩物、活化的凝血酶原复合物浓缩物和纯化的凝结因子。作为人类重组蛋白，无活性的(凝结因子VIII和IX)和活化的(凝结因子VIIa)，一些凝结因子当今是可获得的。

[0005] 血友病是遗传的或后天的出血失调，有异常的或缺陷的凝结因子或抑制促凝血功能的针对凝结因子的抗体。最常见的血友病是血友病A(缺乏凝结因子VIII)和血友病B(因子IX)。提纯的或重组的单独的凝结因子是血友病病人的主要治疗手段。有抑制性抗体的病人遇到了治疗难题，因为抗体也可以中和向该病人施用的凝结因子。通过降解活化的凝结因子Va和VIIIa，蛋白C的活性形式(APC)是血浆凝结的抑制物。已经显示重组的APC是败血症病人中不适当的血浆凝结的有效治疗手段。

[0006] 尽管纯化过程并不简单和需要许多步骤，某些步骤目的在于消除污染的病毒，用于治疗用途的凝结因子可以从人类血浆获得。但是尽管有血液衍生产品的大量的安全性测量和测试，也无法排除感染性病毒或朊病毒的污染。由于这种风险，非常期望从无动物衍生成分的培养基中生长的重组细胞中产生人类治疗性蛋白。这不总是简单的，因为许多蛋白需要哺乳动物宿主来以完全功能性的形式产生，即，被正确地翻译后修饰。在重组细胞中商业化生产的凝结因子有FVII(NovoSeven)、FVIII(Kogenate，Recombinate，Refacto)和FIX(BeneFix)(Roddie and Ludlam.Blood Rev.11：169-177，1997)和Active Protein C(Xigris)。在获取大量的全功能重组人凝结因子时的一个主要障碍在于FII、FVII、FIX、FX和蛋白C中存在的Gla结构域。这个结构域含有通过添加羧基基团翻译后修饰的谷氨酸残基。这些因子的生产受到如下事实的妨碍，即它们的过量表达引起羧化不足，由此产生无活性的蛋白。Gla修饰是被称为γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)的维生素K依赖性酶的作用的结果。许多科学家，特别是那些致力于凝结因子研究的科学家已经对这个酶进行了广泛的研究(WO-A-8803926；Wu et al.Science 254(5038)：1634-1636，1991；Rehemtulla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 90：4611-4615，1993；StanleyJ.Biol.Chem.274(24)：16940-16944，1999；Vo et al.，FEBS letters445：256-260，1999；Begley et al..The Journal of Biological Chemistry275(46)：36245-36249，2000；Walker et al.，The Journal of BiologicalChemistry 276(11)：7769-7774，2001；Bandyopadhyay，et al.Proc NatlAcad Sci USA 99(3)：1264-1269，2002；Czerwiec et al.，Eur J Biochem269：6162-6172，2002；Hallgren et al.，Biochemistry 41(50)：15045-15055，
2002；Harvey et al.，The Journal of Biological Chemistry 278(10)：8363-8369，
2003)。至少两个科学团队已经进行了通过与凝结因子FIX共表达GGCX来提高产量的尝试，但是没有成功(Rehemtulla，et al.1993，ibid；Hallgren et al.2002，ibid)。考虑到在γ-羧化蛋白方面的巨大兴趣，可以推测有更多的共表达试验失败了并因此没有被报道。

[0007] 对于人类FII(凝血酶原)，为了获得全功能的凝血酶原，10个Glu残基中的至少8个必需被正确地修饰(Malhotra，et al.，J.Biol.Chem.260：279-287，1985；Seegers and Walz′Prothrombin and othervitamin K proteins′，CRC Press，1986)。获得rhFII的高生产水平的广泛的努力已经利用了几种不同的系统，例如，CHO细胞、BHK细胞、293细胞和牛痘病毒表达系统，但是都失败了或产生了羧化不足的产物，因而是功能上无活性的凝血酶原(Jφgensen et al.，J.Biol.Chem.262：6729-6734，1987；Russo et al.，Biotechnol Appl Biochem 14(2)：222-233，1991；Fischer et al.，J Biotechnol 38(2)：129-136，
1995；Herlitschka et al. Protein Expr.Purif.8(3)：358-364，1996；Russo et al.，Protein Expr.Purif.10：214-225，1997；Vo et al.1999，ibid；Wu and SuttieThromb Res
96(2)：91-98，1999)。较早报道的羧化的重组人类凝血酶原的生产能力很低；突变凝血酶原20 mg/L(Cote et al.，J.Biol.Chem269：11374-11380，1994)，在CHO细胞中表达的人类凝血酶原0.55mg/L(完全羧化的，Jφrgensen et al. 1987，同上)，在CHO细胞中的25mg/L(羧化的程度未显示，Russo et al.1997，同上)。

[0008] WO 92/19636公开了人类和牛的维生素K依赖性羧化酶的克隆和序列鉴定。该申请建议在适合的宿主细胞中共表达维生素K依赖性羧化酶和维生素K依赖性蛋白来制备维生素K依赖性蛋白。没有例举羧化酶和维生素K依赖性蛋白的共表达。

[0009] 需要改进的方法来以高产量生产活化的凝血因子。本发明要解决这种需求。

[0010] 发明概述

[0011] 根据本发明的第一个方面，提供了包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的(associated)包含第一启动子的表达控制序列，和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中所述第一启动子比所述第二启动子更强，足以使得需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶以至少10∶1的比例表达。

[0012] 根据本发明的另一个方面，提供了细胞，其被工程化以表达(i)需要伽马-羧化作用的蛋白，和(ii)γ-谷氨酰羧化酶，其中所述蛋白(i)和(ii)以10∶1到500∶1之间的比例表达。

[0013] 根据本发明的另一个方面，提供了遗传地修饰的真核宿主细胞，其包含：

[0014] (i)编码γ-谷氨酰羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述γ-谷氨酰羧化酶蛋白编码序列可操作地与表达控制序列连接，所述表达控制序列允许所述细胞表达γ-谷氨酰羧化酶蛋白；和

[0015] (ii)编码需要所述γ-谷氨酰羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地与表达控制序列连接，所述表达控制序列允许所述细胞表达所述需要羧化作用的蛋白；

[0016] 其中所述细胞能够以至少1∶10的比例表达所述γ-谷氨酰羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。

[0017] 根据本发明的进一步的方面，提供了载体，所述载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包括第一启动子的表达控制序列，和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中所述第一启动子比所述第二启动子更强，足以使得需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶以至少10∶1的比例表达。

[0018] 根据本发明的又另一个方面，提供了生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括：(i)培养细胞，所述细胞被改造(adapted)来以至少10∶1的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。在一个实施方式中，该方法用于生产伽马-羧化的人类因子IX，在另一个实施方式中该方法用于生产伽马-羧化的人类凝血酶原。在另一个实施方式中，所述生产的伽马-羧化的蛋白是人类伽马-羧化的因子X。

[0019] 根据本发明的另一个方面，提供了在哺乳动物细胞系中生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳动物细胞系中使所述需要伽马-羧化作用的蛋白与γ-谷氨酰羧化酶共表达的步骤，其中表达的需要伽马-羧化作用的蛋白的数量至少是表达的γ-谷氨酰羧化酶的数量的10倍，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。在一个实施方式中，该方法用于生产伽马-羧化的人类因子IX，在另一个实施方式中该方法用于生产伽马-羧化的人类凝血酶原。在另一个实施方式中，所述生产的伽马-羧化的蛋白是人类伽马-羧化的因子X。

[0020] 根据本发明的进一步的方面，提供了根据上述方法生产的分离的伽马-羧化的蛋白，根据上述方法生产的分离的伽马-羧化的蛋白在凝结治疗中的用途，或根据上述方法生产的分离的伽马-羧化的蛋白用于制造用于凝结治疗(coagulation therapy)的药物的用途。

[0021] 根据本发明的再进一步的方面，提供了生产适合于诱导血液凝固或促进增加的或减少的凝结的药物组合物的方法，包括纯化从宿主细胞表达的活性羧化的蛋白，所述宿主细胞被改造来以10∶1到500∶1之间的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，和将所述纯化的羧化蛋白与一种或多种药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂混合，以及可从该方法获得的药物组合物。在一个实施方式中，所述活性羧化的蛋白是伽马-羧化的人类因子IX，在另一个实施方式中所述活性羧化的蛋白是伽马-羧化的人类凝血酶原。在另一个实施方式中，所述活性羧化的蛋白是人类伽马-羧化的因子X。

[0022] 附图的简要说明

[0023] 附图1a说明了PN32(凝血酶原+GGCX)共表达载体的质粒图。

[0024] 附图1b表示了Ptext5(凝血酶原)表达载体的质粒图。

[0025] 附图2表示了PP6(凝血酶原+GGCX)共表达载体的质粒图。

[0026] 附图3a表示了F9NopA(因子IX+GGCX)共表达载体的质粒图。

[0027] 附图3b表示了F9hglx(因子IX+GGCX)共表达载体的质粒图。

[0028] 发明的详细说明

[0029] 我们设计了高水平表达适当羧化的重组维生素K依赖性凝血因子的不同方法，包括以不同的比例共表达维生素K依赖性凝结因子和γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)。作为一个实例，我们表达了人类凝血酶原(rhFII)和人类GGCX。与其他人(Rehemtulla et al.，1993，同上；Hallgren et al.，2002，同上)已经尝试的对rhFII和GGCX都使用强启动子不同，我们使用一种策略，旨在强表达FII结合弱或极弱表达GGCX，使得表达的GGCX的数量是表达的rhFII的1/10以下。出乎我们意料，这种策略引起了高水平的、分泌的正确修饰的rhFII和宿主细胞的良好生存力，即使是细胞在无动物成分的化学成分明确的培养基中生长时。

[0030] 我们已经以这样的方式将GGCX和人类凝血酶原克隆到表达载体中，以使凝血酶原mRNA水平超过GGCX mRNA水平的至少9倍。这引起了与GGCX蛋白相比产生大量过剩的凝血酶原蛋白。

[0031] 作为进一步的实例，我们使用相同的GGCX共表达载体表达了rhFIX。这产生了细胞系，在一种情况中细胞系产生因子IX mRNA的水平超过GGCX mRNA水平的至少9倍。在另一个细胞系中，因子IX：GGCX mRNA比例大约4-5∶1。仅有产生至少10∶1的比例的细胞系显示了显著提高的rhFIX生产力(表1)。

[0032] 表1.生产力和羧化的蛋白：GGCX mRNA比例的总览

[0033]

[0034] ＊生产力是在类似生长条件下从旋转培养物测量的。

[0035] ¤数据来自Rehemtulla 1993和美国专利No.5,460,950。

[0036] 通过与GGCX共表达的当前方法产生的维生素K依赖性凝血因子(FII、FVII、FIX、FX和它们的活化形式FIIa或凝血酶、FVIIa、FIXa、FXa)可以预期在预防和治疗外伤、手术后的出血或肝、肾、血小板或血液凝结因子(血友病)的疾病方面是有用的。同样地，凝结因子蛋白C和它的活化形式APC可以预期在预防和治疗有或没有蛋白C水平降低的升高的凝结失调方面是有用的。该方法还适合于需要翻译后羧化作用的其他蛋白。

[0037] 根据本发明的第一个方面，提供了包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中所述第一启动子比所述第二启动子更强，足以使得需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶以至少10∶1的比例表达。

[0038] 在优选的实施方式中，表达的蛋白的比例在10∶1到1000∶1之间，更优选的10∶1到500∶1之间，再更优选的在25∶1到250∶1之间。特别适合的比例是约
200∶1。

[0039] 在独立的实施方式中，两种表达的蛋白的比例可以是至少10∶1，30∶1，45∶1，50∶1，100∶1，200∶1，250∶1，300∶1，400∶1，500∶1和1000∶1。

[0040] 在一个特定的实施方式中，编码需要伽马-羧化作用的蛋白和相连的表达控制序列的核酸分子，和编码γ-谷氨酰羧化酶和相连的表达控制序列的核酸分子，位于相同的表达载体上。在另一个实施方式中，这两个核酸分子位于独立的表达载体上。

[0041] 根据本发明的进一步的方面，提供了根据SEQ ID NO：14和SEQID NO：15的核酸。

[0042] 根据本发明的进一步的方面，提供了宿主细胞，所述宿主细胞用包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的序列的载体转染或转化了，用于表达人类因子IX。

[0043] 根据本发明的进一步的方面，提供了能表达人类凝结因子IX和人类伽马羧化酶的宿主细胞，其中编码人类凝结因子IX的核酸和编码伽马羧化酶的核酸分别可操作地与控制序列连接，所述控制序列能够以至少10∶1的比例表达两种蛋白。

[0044] 根据本发明的进一步的方面，提供了非人类真核宿主细胞，所述宿主细胞被改造来以至少10∶1的比例表达人类凝结因子IX和人类伽马羧化酶。在特定的实施方式中，编码人类凝结因子IX的核酸和编码伽马羧化酶的核酸分别可操作地与控制序列连接，所述控制序列能以至少10∶1的比例表达两种蛋白。

[0045] 根据本发明的进一步的方面，提供了携带外源核酸的宿主细胞，所述外源核酸包含在hCMV启动子控制下的人类凝结因子IX编码核酸和在SV40启动子控制下的人类羧化酶编码核酸。

[0046] 根据本发明的进一步的方面，提供了根据SEQ.ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ.ID NO：3的核酸。

[0047] 根据本发明的进一步的方面，提供了宿主细胞，所述宿主细胞用包含SEQ.ID NO：1、SEQ.ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列的载体转染或转化了，用于表达人类凝血酶原。

[0048] 根据本发明的进一步的方面，提供了能表达人类凝血酶原和人类伽马羧化酶的宿主细胞，其中编码人类凝血酶原的核酸和编码伽马羧化酶的核酸分别可操作地与控制序列连接，所述控制序列能够以至少10∶1的比例表达两种蛋白。

[0049] 根据本发明的进一步的方面，提供了非人类真核宿主细胞，所述宿主细胞被改造来以至少10∶1的比例表达人类凝血酶原和人类伽马羧化酶。在特定的实施方式中，编码人类凝血酶原的核酸和编码伽马羧化酶的核酸分别可操作地与控制序列连接，所述控制序列能以至少10∶1的比例表达两种蛋白。

[0050] 根据本发明的进一步的方面，提供了携带外源核酸的宿主细胞，所述外源核酸包含在hCMV启动子控制下的人类凝血酶原编码核酸和在SV40启动子控制下的人类羧化酶编码核酸。

[0051] 本申请使用凝血酶原和凝结因子IX作为需要羧化作用的蛋白进行了例证。然而，除了凝血酶原和因子IX以外的一些蛋白，它们的完全生物学活性取决于正确的γ-羧化作用。在人们已知的这些蛋白之中有凝结因子FVII，当前它仅以相对低的水平在重组哺乳动物细胞中商业化生产(约10mg/L或更低)。本发明适用于改善依赖于γ-羧化作用的任何蛋白的生产率，这种蛋白包括，但不限于：凝血酶原、凝结因子II(FII)、凝结因子VII(FVII)、凝结因子IX(FIX)、凝结因子X(FX)、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白(也称为：BGP或骨钙蛋白)、基质Gla蛋白(MGP)、富脯氨酸Gla多肽1(prolinerich Gla polypeptide 1)(PRRG1)、富脯氨酸Gla多肽2(PRRG2)、生长停滞-特异性蛋白6(Growth arrest-specific protein 6)(Gas 6)。其他适合的蛋白是：在毒蛇(Acanthophiina亚科)的毒液和锥形蜗牛(Conus textile)毒液中的FXa样蛋白。

[0052] 这些蛋白的每一种，包括它们的核酸和氨基酸序列，都是公知的。表2列出了可用于本发明的各种蛋白的野生型和突变形式的代表性序列。

[0053] 表2.

[0054]CDNA GENE
EMBL 剪接变体 EMBL
说明 ACC# (蛋白) 突变 ACC#
谷氨酸伽马羧化酶 2；BC013979； 1 SNP(EMBL#U65896)；2
BC013979 AF253530 SNPs(OMIM#137167) U65896
approx.100 SNP′s(EMBL#
凝血酶原 V00595 1；V00595 AF478696) AF478696
4；AF466933；
AF272774；AR030786；
因子VII AF466933 AAN60063 21 SNPs(OMIM#277500) J02933
5SNPs(EMBL#
3；A01819；A34669； AF536327)；108SNPs
因子IX A01819 M19063 OMIM#306900) AF536327
118 SNPs(EMBL#
4；BC040125；M57285； AF503510)；14 SNPs
因子X BC046125 AR095306；AB005892 (MIM# 227600) AF503510
7；AB083690； 57SNPs(EMBL#
AB083693；109623； AF378903)；25SNPs
蛋白C BC034377 S50739；S72338 (OMIM#176860) AF378903
5；AF141310；
AF141310；BC033656；
骨钙蛋白 AF141310 X04143；X51699 X04143
基质GLA蛋白 BC005272 1；BC005272
生长停滞特异性6；
AXL刺激因子 BC038984 1；BC038984
2；AB033749；
蛋白Z M55670 AB033749
富脯氨酸G1a
(G-羧基谷氨酸) 2；
多肽1 AF009242 AP009242；BC030786
富脯氨酸G1a 2；AF009243；
(G-羧基谷氨酸) AF009243 BC026032

[0055]多肽2
approx.100SNPs
维生素K依赖性 (EMBL#AY308744)；8
蛋白S前体 BC015801 1；BC015801 SNPs(OMIM#176880) AY308744

[0056] 需要理解的是，本发明不限于特定蛋白或有待共表达的这些蛋白之一的蛋白编码序列。此外，特别对于血液凝结因子，本领域中已经公开了蛋白的许多突变形式。本发明同样的适合于这些突变形式，包括蛋白的天然发生的等位变体，就象适合野生型序列一样。在一个实施方式中，本发明可以采取任何野生型蛋白或与其具有至少90％、优选的至少95％的序列同一性的蛋白。

[0057] 两个序列之间的序列同一性可以通过配对方式的计算机比对分析，使用例如BestFit、PILEUP、Gap或FrameAlign的程序来确定。优选的比对工具是BestFit。在实践中，当从序列数据库中搜索查询检索的相似/相同序列时，一般必需使用适合的算法，例如Blast、Blast2、NCBI Blast2、WashU Blast2、FastA或Fasta3和计分矩阵例如Blosum62来进行相似序列的初步鉴定。这些算法力图紧密地接近Smith-Waterman的“金标准(gold-standard)”比对算法。因而，用于评定相似性，即，两种原始多肽序列如何排列的优选的软件/搜索引擎程序是Smith-Waterman。同一性是指直接匹配，相似性容许保守性替换。

[0058] 在此使用的术语“γ-谷氨酰羧化酶”或“GGCX”是指催化谷氨酸残基的羧化作用的维生素K依赖性酶。

[0059] GGCX酶是广泛分布的，已经从许多不同的物种，例如白鲸DelPhinapterus leucas、蟾鱼Opsanus tau、鸡(Gallus gallus)、盲鳗(Myxine glutinosa)、鲎(Limulus polyphemus)和锥形蜗牛Conus textile(Begley et al.，2000，ibid；Bandyopadhyay et al.2002，ibid)克隆出来。来自圆锥蜗牛的羧化酶类似于牛羧化酶，已经在COS细胞中表达(Czerwiec et al.2002，ibid)。类似于GGCX的其他蛋白可以在昆虫和原核生物中发现，例如Anopheles gambiae、Drosophila melanogaster和Leptospira，NCBI登记号分别为：gi 31217234、gi 21298685、gi24216281、gi 24197548和(Bandyopadhyay et al.，2002，ibid)。羧化酶显示了显著的的进化保守性。一些非人类酶已经显示了、或预测具有类似于我们使用的人类GGCX的活性，因而可被用作人类酶的替代物。

[0060] 表3列出了可被用于本发明中、与人类GGXC同源的(按物种来源分类的)预测的蛋白的代表性序列。

[0061] 表3.

[0062]物种 数据库登记号#/ID
Homo sapiens(人) NM_00821.2
HUMGLUCARB
HUMHGCA
BC004422
HSU65896
AF253530.1
Papio hamadryas(红狒狒) AC116665.1
Delphinapterus leucas(白鲸) AF278713
Bos taurus(牛) NM_174066.2
BOVCARBOXG
BOVBGCA
Ovis aries(家养绵羊) AF312035
Rattus norvegicus(褐鼠) NM_031756.1
AF065387
Mus musculus(小鼠) NM_019802.1
AF087938

[0063]Opsanus tau(有骨鱼) AF278714.1
Conus textile(软体动物) AY0044904.1
AF382823.2
Conus imperialis(软体动物) AF448234.1
Conus episcopatus(软体动物) AF448233.1
Conus omaria(软体动物) AF448235.1
Drosophila melanogaster(果蝇) NM_079161.2
Anopheles gambiae(蚊子) XM_316389.1
Secale cereale(单子叶植物) SCE314767
Triticum aestivum(普通小麦) AF280606.1
Triticum urartu(单子叶植物) AY245579.1
Hordeum vulgare(大麦) BLYHORDCA
Leptospira interrogans(螺旋体) AE011514.1
Streptomyces coelicolor(高GC Gram+细菌) SCO939109
SCO939124
AF425987.1
Streptomyces lividans(高GC Gram+细菌) SLU22894
Streptomyces viginiae(高GC Gram+细菌) SVSNBDE
Micrococcus luteus(高GC Gram+细菌) MLSPCOPER
Chlamydomonas reinhardii(绿藻) AF479588.1
Dictyostelium discoideum(粘菌) AC115612.2
Coturnix coturnix(鸟) AF364329.1
Bradyrhizobium japonicum(α-蛋白细菌 ) AP005937.1
Rhodobacter sphaeroides(α-蛋白细菌) RSY14197
Sinorhizobium meliloti(α-蛋白细菌) RME603647
AF119834
Mesorhizobium loti(α-蛋白细菌) AP003014.2
Chromobacterium violaceum(β-蛋白细菌) AE016910.1
AE016918.1
Pseudomonas aeruginosa(γ-蛋白细菌) AE004613.1
AF165882

[0064]Xanthomonas axonopodis(γ-蛋白细菌) AE011706.1
Human herpesvirus 8 KSU52064
KSU75698
AF305694
AF360120
AF192756

[0065] 以上确定的每种GGCX蛋白和来自其他物种的GGCX蛋白可被用作本发明中的羧化酶。

[0066] 实现差别表达两种共表达的蛋白的一种途径是使用不同的启动子作为各自的表达控制序列的部分。本领域有大量能以不同程度或幅度表达异源蛋白的不同启动子和其他表达控制序列的实例。已经适当地发展了重组表达技术使得蛋白表达领域的技术人员能够选择启动子和其他控制序列来以期望的比例共表达需要羧化作用的蛋白和羧化酶。选择使用哪些特定的启动子和其他表达控制序列是各人的选择问题。

[0067] 在一个实施方式中，与需要伽马-羧化作用的蛋白相连的控制序列包含强启动子。在一个实施方式中，这个启动子是人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期(immediate-early)启动子。强启动子在此被定义为产生超过1000个转录产物/细胞的启动子。弱启动子在此被定义为产生少于1000个转录产物/细胞的启动子。

[0068] 在另一个实施方式中，与γ-谷氨酰羧化酶相连的控制序列包含弱启动子。在一个实施方式中，这个启动子是SV40早期启动子。在另一个实施方式中，需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶处于不同的启动子元件的控制之下，控制γ-谷氨酰羧化酶表达的启动子比控制需要伽马-羧化作用的蛋白表达的启动子更弱。

[0069] 在另一个实施方式中，γ-谷氨酰羧化酶处于SV40早期启动子的控制之下，需要伽马-羧化作用的蛋白处于人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子的控制之下。在根据本发明的这个特定方面的一个实施方式中，需要伽马-羧化作用的蛋白是人类因子X。在另一个实施方式中，需要伽马-羧化作用的蛋白是人类凝血酶原。在另一个实施方式中，需要伽马-羧化作用的蛋白是人类因子IX。

[0070] 已经使用强CMV启动子(Boshart et al.Cell 41：521-530，1985)来过量表达因子IX或凝血酶原，和更弱的SV40启动子(Wenger et al.Anal Biochem 221：416-418，1994)来控制GGCX表达，例证了本发明。能根据本发明使用的其他强启动子包括，但不限于，pEF-1α[人类延伸因子1α亚基基因)(Mizushima and Nagata，Nuc Acids Res 18：
5322，1990；Goldman et al.，Bio Techniques 21：1013-1015，1996)、pRSV[劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(Gorman et al.，Proc Natl Acad Sci USA79：6777-6781，1982)]和pUbC[人类遍在蛋白(Schorpp et al.，Nuc AcidsRes 24：1787-1788，1996)]。

[0071] 确保生产的蛋白(需要羧化作用的蛋白)与修饰酶相比是过量的，产生至少10∶1的比例，是很重要的。实现低水平表达修饰酶(γ-谷氨酰羧化酶)的途径包括：

[0072] 1)使用弱启动子来控制修饰酶的表达，包括、但不限于，SV40即时早期启动子、最小化的FIX启动子(Rouet et al.，The Journal ofBiological Chemistry 267：20765-20773，1992)或HSV胸苷激酶启动子(Wenger et al.，1994，ibid)。

[0073] 2)对启动子、或强启动子的增强子序列进行突变来降低启动子强度。

[0074] 3)移除或改变Kozak序列(翻译起始信号)来降低翻译效率(Kozak.Nuc Acids Res 15：8125-8148.1987；Kozak.Proc Natl Acad Sci USA87：8301-8305，1987，1990)。

[0075] 4)将编码待生产的蛋白(需要羧化作用的蛋白)的核酸和编码GGCX的核酸克隆到独立的载体上，用大量过剩的含待生产蛋白的构建体转染，以产生具有含待生产蛋白的构建体的多个拷贝的细胞。

[0076] 5)将编码待生产的蛋白的DNA和编码GGCX修饰载体的DNA克隆到独立的载体上，共转染或单独转染，使用放大系统来放大待生产蛋白的表达。

[0077] 6)分离重组表达低水平(但高于内源水平)的GGCX的稳定的细胞系，用作表达需要γ-羧化作用的蛋白的宿主细胞系。

[0078] 7)向GGCX中导入突变来降低GGCX底物亲合性。

[0079] 除了这些之外，重组蛋白表达领域的技术人员知道能够用于产生宿主细胞的其他的方法，所述宿主细胞以至少10∶1的比例表达需要羧化作用的蛋白和羧化酶蛋白。

[0080] 根据本发明的进一步的方面，提供了细胞，其被工程化或被改造以表达(i)需要伽马-羧化作用的蛋白，和(ii)γ-谷氨酰羧化酶，其中所述蛋白(i)和(ii)以10∶1到500∶1之间的比例表达。在特定的实施方式中，γ-谷氨酰羧化酶在内源水平(即，在未工程化或改造的细胞中的水平)的2到5倍之间被表达。

[0081] 根据本发明的进一步的方面，提供了重组细胞，其被改造以表达(i)γ-谷氨酰羧化酶蛋白，高于在相当的未改造细胞中的组成性水平，和(ii)需要羧化作用的蛋白，其中表达的γ-谷氨酰羧化酶蛋白和需要羧化作用的蛋白的数量处于至少1∶10的比例中。

[0082] 根据本发明的进一步的方面，提供了遗传地修饰的真核宿主细胞，其包含：

[0083] (i)编码γ-谷氨酰羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述γ-谷氨酰羧化酶蛋白编码序列可操作地与表达控制序列连接，所述表达控制序列允许所述细胞表达γ-谷氨酰羧化酶蛋白；和

[0084] (ii)编码需要所述γ-谷氨酰羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地与表达控制序列连接，所述表达控制序列允许所述细胞表达所述需要羧化作用的蛋白；

[0085] 其中所述细胞能够以至少1∶10的比例表达所述γ-谷氨酰羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。

[0086] 根据本发明的进一步的方面，提供了细胞，其被改造以表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，其中编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸和编码γ-谷氨酰羧化酶的核酸处于调节序列的控制之下，所述调节序列适合于确保表达的需要伽马-羧化作用的蛋白的数量是γ谷氨酰羧化酶蛋白的数量的至少10倍。

[0087] 在一个实施方式中，需要伽马羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶中的至少一个是从已经通过重组技术导入到细胞中的核酸表达的。进行本发明的一个替换性途径是表达内源蛋白(需要羧化作用的蛋白或羧化酶)，但是用异源序列替换内源控制序列(启动子等等)来实现期望的表达水平。

[0088] 宿主细胞优选的是真核细胞。典型的宿主细胞包括，但不限于昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞是特别优选的。适合的哺乳动物细胞系包括，但不限于，CHO、HEK、NS0、293、Per C.6、BHK和COS细胞，和它们的衍生物。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞系CHO-S。

[0089] 早先，羧化作用依赖性蛋白的过量表达一般产生羧化不足的产物。这是由于内源性宿主细胞羧化作用能力是有限的。另一方面，GGCX活性的极大(16到70倍)过量表达没有改善产物产率(Rehemtulla etal.，Proc Natl Acad Sci USA 90：4611-4615，1993)，(Berkner and Pudota，Proc Natl Acad Sci USA.95：446-471，1998)，(Hallgren et al.，Biochemistry 41(50)：15045-15055，2002)。这一点的原因还未完全了解。我们的发明需要GGCX的中度过量表达。这确保了高于内源水平的GGCX从细胞中表达出来，例如，GGCX活性水平仅升高1.5到5倍。在这种适度升高的水平之下，如在实施例1中所示，获得了令人惊讶的高水平的完全羧化的rhFII。

[0090] 因此应当理解的是，使本发明与上述共表达教导相区分的、需要羧化作用的蛋白和羧化酶的表达比例，不包括内源性产生的GGCX的水平。为了满足所需要的高产量，必需以高于普通细胞中存在的水平来表达羧化酶和需要羧化作用的蛋白。

[0091] 在优选的实施方式中，使用的细胞或细胞系具有很少的或没有组成性表达的羧化酶和/或需要羧化作用的蛋白。

[0092] 在一个实施方式中，γ-谷氨酰羧化酶以低于或等于需要伽马-羧化作用的蛋白的数量的10％表达。在替换性的、进一步的实施方式中，γ-谷氨酰羧化酶以低于或等于需要伽马-羧化作用的蛋白的数量的5％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％表达。

[0093] 可以使用本领域技术人员熟知的技术来测量两种蛋白的表达程度。这包括直接测量，例如，测量蛋白的生物学活性、或蛋白的数量(例如，使用抗体)，或间接测量，例如通过测量mRNA转录产物水平(例如，如实施例3中的Taqman分析)。以下参考文献公开了测量GGCX酶活性的途径(Lingenfelter et al.，Biochemistry 35：8234-8243，1996；Berkner et al.，Proc Natl Acad Sci USA 95：446-471，1998；Hallgren et al.，Biochemistry 41(50)：15045-15055，2002；and，Berkner etal.，Proc Natl Acad Sci USA
89：6242-6246，1992)。

[0094] 对于本发明，两种蛋白的表达比例通过mRNA转录产物水平(例如，通过Taqman分析)来间接地确定。

[0095] 在一个实施方式中，需要伽马羧化作用的蛋白是维生素K依赖性凝结因子。在进一步的实施方式中，需要伽马-羧化作用的蛋白优选的选自由凝血酶原、凝结因子II、凝结FII、凝结因子VII、凝结FVII、凝结因子IX、凝结FIX、凝结因子X、凝结FX、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基质Gla蛋白、生长停滞-特异性蛋白6和Acanthophiinae FXa-样蛋白构成的组。

[0096] 在一个特定的实施方式中，需要伽马-羧化作用的蛋白是因子IX。在另一个特定的实施方式中，需要伽马-羧化作用的蛋白是凝血酶原。在另一个实施方式中，需要伽马-羧化作用的蛋白是因子X。

[0097] 本发明对于任何来源的需要羧化作用的蛋白具有普通的应用。然而，如果表达的蛋白将用于人类治疗目的，人类蛋白是特别优选的。

[0098] 在一个实施方式中，γ-谷氨酰羧化酶是小鼠、大鼠、牛或锥形蜗牛(conus snail)来源的。在另一个实施方式中，γ-谷氨酰羧化酶是人类蛋白。

[0099] 根据本发明的进一步的方面，提供了生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括：(i)培养细胞，所述细胞被改造来以至少10∶1的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。

[0100] 根据本发明的进一步的方面，提供了在哺乳动物细胞系中生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳动物细胞系中使所述需要伽马-羧化作用的蛋白与γ-谷氨酰羧化酶共表达的步骤，其中表达的需要伽马-羧化作用的蛋白的数量至少是表达的γ-谷氨酰羧化酶的数量的10倍；和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。

[0101] 生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括：

[0102] a)遗传修饰真核细胞，来导入编码需要羧化作用的蛋白和伴随的表达控制序列的第一多核苷酸，和编码γ-谷氨酰羧化酶和伴随的表达控制序列的第二多核苷酸，来产生真核宿主细胞，所述真核宿主细胞能以至少10∶1的比例共表达需要羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶蛋白；

[0103] b)在容许第一和第二多核苷酸序列表达的条件下在适合的培养基中培养所述细胞；和c)从培养基或宿主细胞分离羧化的蛋白。

[0104] 表达载体通常包括复制起点、启动子、翻译起始位点、任选的信号肽、多聚腺苷酸位点和转录终止位点。这个载体通常还含有用于选择的一个或多个抗生素抗性标记基因。适合的表达载体可以是质粒、粘粒或病毒，例如噬菌体或逆转录病毒。将多肽的编码序列置于适合的启动子(即，HSV、CMV、TK、RSV、SV40等等)、控制元件和转录终止子(这些是相连的表达控制序列)的控制下，使得在被该表达载体构建体转化或转染的宿主细胞中，编码所述多肽的核酸序列被转录成RNA。编码序列可以，或可以不含有用于将多肽分泌出宿主细胞的信号肽或前导序列。优选的载体通常包含至少一个多克隆位点。在某些实施方式中，克隆位点或多克隆位点处于启动子和要表达的基因之间。通过将第二核酸序列克隆到克隆位点中使得其是连续的并且是符合基因序列的读码框的，从而这些克隆位点可以用于产生N-末端融合蛋白。在其他实施方式中，可以有克隆位点或多克隆位点位于基因的紧接着的下游，以与如上所述的N-末端融合物类似的方式，来便于C-末端融合物的生成。

[0105] 可以通过本领域技术人员公知的很多种方法，例如转染、转化和电穿孔，来遗传地修饰宿主细胞(导入额外核酸)。

[0106] 本发明还扩展到通过本发明的方法生产的纯化的伽马羧化的蛋白，和它们在凝结治疗中的用途。

[0107] 根据本发明的再另一个方面，提供了一种在受试者中促进提高或降低的凝结的方法，包括向需要的病人施用药理学上有效量的、通过以上描述的方法获得的分离的伽马-羧化的蛋白。

[0108] 根据本发明的进一步的方面，提供了生产适合于诱导血液凝固的药物组合物的方法，包括纯化从宿主细胞表达的活性羧化的蛋白，所述宿主细胞被改造来以至少10∶1的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，和将所述纯化的羧化蛋白与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合。

[0109] 基于蛋白的治疗剂通常是冷冻保存的、冷藏保存的、在室温下保存的，和/或处在冻干的状态。

[0110] 本发明的组合物可以通过本领域公知的常规步骤、使用常规的药物赋形剂来获得，但是最可能的是处于适合于注射的形式，胃肠外地注射或直接注射到受伤部位。

[0111] 水性悬浮液一般含有细粉状形式的活性成分和一种或多种悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如卵磷脂或环氧烷(alkylene oxide)与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷(ethylene oxide)与长链脂族醇的缩合产物，例如heptadecaethyleneoxycetanol，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如heptadecaethyleneoxycetanol，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯单油酸山梨醇酐酯。水性悬浮液也可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯)、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、着色剂、调味剂、和/或甜味剂(例如蔗糖、糖精或阿斯巴甜)。

[0112] 油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液也可含有稠化剂，例如蜂蜡、固体石蜡或十六醇。可以添加甜味剂，例如以上列出的，和调味剂来提供适口的口服制品。可以通过添加抗氧化剂，例如抗坏血酸来保存这些组合物。

[0113] 适合于通过添加适合的稀释剂来制备用于注射的水性制品的粉未，一般地含有活性成分和适合的载体和赋形剂、悬浮剂和一种或多种稳定剂或防腐剂。稀释剂可含有其他适合的赋形剂，例如防腐剂、渗透压调节剂和稳定剂。

[0114] 本发明的药物组合物也可处于水包油乳化剂(oil-in-wateremulsions)的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或任何这些的混合物。
适合的乳化剂可以是，例如，天然发生的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然发生的磷脂例如大豆、卵磷脂，来源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如单油酸山梨醇酐酯)和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯单油酸山梨醇酐酯。

[0115] 本发明的药物组合物也可以处于无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌溶液或悬浮液形式，其可以根据已知步骤使用一种或多种适合的分散或润湿剂和悬浮剂来配制，这些已经在上文记载了。无菌可注射制品也可以是无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，1，3-丁二醇溶液。

[0116] 关 于 制 剂 的 进 一 步 的 信 息，读 者 可 参 考 Comprehensive MedicinalChemistry(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board)，PergamonPress1990 的 卷 5 的 25.2 章；或 者 Drugs and the pharmaceutical sciences；Protein formulation and delivery(Eugen J.McNally，executiveeditor)，Marcel Dekker Inc
2000的卷99。

[0117] 与一种或多种赋形剂组合产生单个剂量形式的活性成分的数量可以取决于治疗的宿主和施用的特定途径而变化。例如，打算向人类注射的制剂一般含有，例如，0.5mg到2g的活性试剂，与适合的和方便数量的赋形剂复合，赋形剂可以从总组合物重量的约百分之5到约百分之98变化。剂量单位形式一般含有约1mg到约500mg的活性成分。蛋白性的治疗剂通常是冷冻保存的或是冻干的。关于施用途径和剂量方案的进一步信息，读者可参考Comprehensive Medicinal Chemistry(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press 1990的卷5的25.3章。

[0118] 用于治疗或预防目的的化合物的剂量大小将根据状况的性质和严重度、动物或病人的年龄和性别和施用途径，根据医学的公知原则自然地改变。在使用化合物用于治疗或预防目的时，一般地这样施用，使得日剂量在例如每公斤体重接受0.5mg到75mg的范围内，如果需要，以分开的剂量给药。一般地，当采用胃肠外途径时，施用更低的剂量。因而，例如，对于静脉内施用，一般使用在例如每公斤体重0.5mg到30mg的范围内的剂量。类似地，例如，对于通过吸入的施用，使用在例如每公斤体重0.5mg到25mg的范围内的剂量。

[0119] 通过以下非限制性的实施例进一步描述本发明：

[0120] 除非另有陈述，本发明的实施将采用本领域技术人员能力之内的分子生物学和重组DNA技术的常规方法。这些技术已经在文献中完整地说明了。参见，例如，Sambrook rdet al.，eds.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(3 ed.)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Ausubel et al.，eds.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，NY(2002)；Glover&Hames，eds.，DNA Cloning 3：A Practical Approach，Vols.I，II，& III，IRL Press，Oxford(1995)；Colowick & Kaplan，eds.，Methods inEnzymology，Academic Press；Weir th
et al.，eds.，Handbook ofExperimental Immunology，5 ed.，Blackwell Scientific Publications，Ltd.，Edinburgh，(1997)。

[0121] 实施例1

[0122] 编码人类FII(hPT)和人类GGCX的cDNA的扩增

[0123] 人类肝脏mRNA从Clontech购买，使用来自Invitrogen的Superscript系统进行cDNA合成。获得的cDNA用作扩增人类FII的模板，使用：

[0124] 引物PTFO 5’-ATTCCTCAGTGACCCAGGAGCTGACA-3’，(SEQ ID NO：3)和[0125] 引 物 PTEXT 5’-CTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTTCTGTATCCACTTCTT-3’，(SEQ ID NO：4)。

[0126] 扩增人类GGCX，使用：

[0127] 引物hglx5，5’-TCCGCAGAGCAATGGCGGTGTCT-3’，(SEQ ID NO：5)和[0128] hglx3，5’-CCAACATCTGGCCCCTTCAGAACT-3’，(SEQ ID NO：6)。

[0129] 将编码FII的PCR产物直接克隆到用TA-TOPO处理的载体pCDNA3.1V5/His(Invitrogen)中。选择按正确方向插入hFII cDNA的克隆，得到Ptext5对照构建体(附图1b)。在SV40启动子的控制下的GGCX编码cDNA通过使用限制性内切酶BamH1和NotI，将GGCX编码片段从pCDNA3.1V5/His TA-TOPO转移到pZeoSV2+载体(Invitrogen)来获得。除去GGCX插入物下游的EcoRV-NotI限制性位点。然后将来自产生的pZeoSV2-GGCX质粒的平端ClaI-BclI片段(含有SV40启动子和含有GGCX的插入物，但不含GGCX编码序列下游的多聚腺苷酸位点和多聚腺苷酸信号)克隆到pCDNA3.1+(Invitrogen)的平端DraIII限制性位点中。选择相对于CMV启动子具有串联插入的(相同的转录方向)pSV40-GGCX片段的克隆，将来自Ptext5的平端KpnI-NotI FII编码片段克隆到EcoRV位点中，来获得PN32构建体(附图1a)。PN32和Ptext5的DNA序列在附录2中。所有的克隆方法是根据标准方法和/或厂商推荐的步骤。

[0130] PN32构建体包括以下关键特征：

[0131] -人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子控制人类凝血酶原cDNA的转录，后面是牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号用于有效的转录终止，和mRNA的多聚腺苷酸化。

[0132] -SV40早期启动子控制人类γ-羧化酶cDNA(GGCX)的转录，没有明显的多聚腺苷酸位点或信号。

[0133] -其他特征如附图1a)所示。

[0134] 为了比较，使用无GGCX的PText5构建体(附图1b)。PTEXT5的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中示出。PN32的核苷酸序列在SEQ IDNO：2中示出。

[0135] 获得凝血酶原生产细胞系

[0136] 将附图1中的两个构建体转染到CHO-S细胞(Invitrogen)中。选择稳定的转染子，使用商业上可获得的凝血酶原活性化验(Chromogenix)筛选高产的克隆。在这个化验中，首先用蛇毒毒素(Ecarin，可从Sigma获得)处理含凝血酶原的样品来产生凝血酶。然后通过添加生色底物(S-2238)化验凝血酶活性，生色底物在被凝血酶处理时产生颜色。两种构建体并行地进行转染和克隆的选择。在含有9％热钝化的胎牛血清的DMEM培养基中进行细胞培养。然后改造获得的克隆以在无动物成分的培养基中生长。获得的最好的生产克隆来自用PN32(FII+GGCX)的转染，当在无动物成分的化学成分明确的培养基中培养时，其产生了多达400mg/L的人类重组凝血酶原(远远超过任何已公开的水平)。纯化重组生产的rhFII(根据Josic et al.，Journal of Chromatography B，790：183-197，2003中公开的方法)，根据标准技术通过使用Q-Sepharose柱的离子交换层析来分级，获得纯的完全羧化的rhFII。达到78mg/L的发酵罐生产的rhFII是完全羧化的，与从人类血浆纯化的凝血酶原具有相同的生物学活性。通过蛋白的N-末端测序和通过凝血酶原酶化验(Mao et al.JBC，273：30086-30091，1998)分析羧化作用。在人类乏血小板血浆(platelet-poorplasma)中通过添加组织因子触发凝血酶产生，基本上如Stig等描述的(Blood Coagulation and Fibrinolysis，14：457-462，2003)测量内源凝血酶潜力(potential)。

[0137] 在无动物成分的化学成分明确培养基中，用PText5构建体获得的最好的克隆得到达10mg/L的生产率，这与文献中报道的处在相同的范围。从PText5克隆获得的完全羧化的凝血酶原的部份估计约50％。因而，使用含γ-羧化酶的低表达水平配置的PN32构建体，最终获得的完全活性rhFII至少要十倍高。对于每种构建体，鉴定了具有类似表达水平的几个克隆。

[0138] 实施例2

[0139] 在CHO细胞系中ggcx活性的测量

[0140] 分别通过用PN32构建体(共表达人类GGCX)和PTEXT5(没有共表达GGCX)转染获得的两个生产rhFII的CHO-S细胞系，使用补充有5μg/ml维生素K的无蛋白培养基在旋转瓶中生长。每天替换十分之一的生长培养基。培养7天后收获细胞，如Berkner等(Proc NatlAcad Sci USA 89：6242-6246 1992)描述的制备微体(microsomes)。从收获的细胞的培养物上清液纯化人类重组FII。如Berkner和Pudota(Proc Natl Acad Sci USA 95：446-471 1998)以及Lingenfelter和Berkner(Biochemistry 35：8234-8243，1996)描述的测量GGCX活性。我们的测量显示，使用相同的生长条件，在人类GGCX共表达CHO细胞系中，GGCX活性是仅表达rhFII的CHO细胞系的1.5倍。

[0141] 实施例3

[0142] 在CHO-S细胞系中γ-羧化酶和凝血酶原的mRNA表达的实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析

[0143] 通过用PN32(FII+GGCX)和Ptext5(仅FII)构建体分别稳定转染获得的两个CHO-S细胞系，使用补充有维生素K的无蛋白培养基在旋转瓶中培养。培养4、5和6天后抽取培养物样品来覆盖(cover)mRNA产生方面的估计的峰值水平。根据卖主InvitrogenTM TM提供的方案，用Trizol 分离RNA。用来自Ambion的DNA-free 试剂盒对分离的RNA进TM
行DNaseI处理。使用随机的六聚引物和来自用于RT-PCR的Superscript First-Strand Synthesis System，Invitrogen的试剂盒内容物，进行cDNA合成。

[0144] 使用软件Primer ExpressTM，Applied Biosystems选择用于实时RT-PCR的引物和Vic标记的探针。

[0145] 人类γ-羧化酶寡核苷酸

[0146] 5′ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3′ 正向引物(SEQ ID NO：7)

[0147] 5′AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3′ 反向引物(SEQ ID NO：8)

[0148] 5′CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3′探针(SEQ ID NO：9)

[0149] 扩增子长度86bp

[0150] 人类凝血酶原寡核苷酸

[0151] 5′TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3′ 正向引物(SEQ ID NO：10)

[0152] 5′CATCCGAGCCCTCCACAA 3′ 反向引物(SEQ ID NO：11)

[0153] 5′CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3′探针(SEQ ID NO：12)

[0154] 扩增子长度69bp

[0155] 通过Operon/Qiagen制造引物，探针从Applied Biosystems订购。还使用了啮齿动物GAPDH对照引物和探针(Applied Biosystems；ABI#4308318 TaqMan Rodent TMGAPDH Control Reagents Protocol)-扩增子长度177bp。在ABI Prism 7700 Sequence detector，AppliedBiosystems上进行实时RT-PCR反应。在琼脂糖凝胶上确认预期长度的扩增的PCR产物。对所有三个基因进行稀释系列(dilution series)来研究PCR反应的效率。相对于对照基因啮齿动物GAPDH的表达，表示了γ-羧化酶和凝血酶原的表达水平。

[0156] 凝血酶原

[0157]

[0158] γ-羧化酶

[0159]

[0160] 根据检测的rhFII：GGCX的相对表达水平，取决于采样的天数计算出约74-232∶1的比例。对于用PN32转染的细胞系，共表达rhFII和GGCX，每个细胞的转录产物数目计算为GGCX mRNA是大约8，rhFIImRNA是大约2000，因而得出rhFII：GGCX比例大约250∶1。对于相同的样品，GAPDH对照mRNA转录产物/细胞大约4000。

[0161] 实施例4

[0162] 人类FII的生产

[0163] 与实施例1中类似地，将实施例1中克隆的人类FII和GGCX cDNA插入到pCDNA3.1中。为了得到更高的GGCX水平，将来自pZeoSV2+的多聚腺苷酸信号包括在被克隆入pCDNA3.1的平端化DraIII位点中的pSV40-GGCX-pA片段中。与实施例1相比，选择具有反向的含GGCX的片段的克隆。然后按与实施例1相同的方法进行FII片段的克隆。最终的构建体PP6在附图2中示出，PP6的核苷酸序列在SEQ IDNO：13中示出。

[0164] 如实施例1中描述的通过转染CHO-S获得两个凝血酶原生产细胞系，B2F4和H3B10。如实施例1中一样从这两个细胞系中纯化和表征凝血酶原。B2F4的培养物得到了30-70mg/L的生产率，完全羧化的部分为55-87％(rhFII越多，完全羧化的越少)。添加丁酸盐得到了稍高一些的生产率，但是降低了完全羧化的rhFII的部分，被认为不是有益的。
H3B10生长缓慢，得到约50mg/L的生产率，相对于培养物中的细胞数目来说是很高的，完全羧化的rhFII的部分是约60％。与在实施例1中获得的细胞系相比，对CHO细胞系使用PP6构建体产生了较少的完全羧化的rhFII。然而，完全活性的重组凝血酶原的产生仍然远高于早先公开的水平。

[0165] 实施例5

[0166] 通过测量mRNA的数量在CHO-S细胞系中γ-羧化酶和凝血酶原的表达的实时RT-PCR分析

[0167] 通过与实施例3相同的方法和相同的引物，通过实时PCR分析，分析了实施例4的B2F4和H3B10细胞系。在峰值生产率收集10ml的培养物样品，以与实施例3中的样品相当。由于这个克隆的缓慢生长，克隆H3B10的样品来自第10天，对于克隆B2F4，样品来自第6天。

[0168] 表4，共表达GGXC的凝血酶原生产细胞系的实时RT-PCR分析结果。对每个B2F4和H3B10的两个独立100ml旋转器培养物取样用于实时RT-PCR分析。

[0169]总细胞 产生的总 RT-PCR使 RT-PCR中 RT-PCR中的 mRNA/细
转录物 RNA数 用的总RNA 的mRNA数 细胞数 Ct mRNA拷贝数 胞拷贝数
P1E2*第6天
PT 2.00E+07 2.39E-04 1.25E-08 2.50E-09 1.05E+03 19 2.10E+06 2005
GGCX 2.00E+07 2.39E-04 1.25E-08 2.50E-09 1.05E+03 27 8.19E+03 8
GAPDH 2.00E+07 2.39E-04 1.25E-08 2.50E-09 1.05E+03 18 4.19E+06 4010B2F4-1第6天
PT 1.30E+07 2.20E-04 1.25E-08 2.50E-09 7.39E+02 19.2 1.83E+06 2472GGCX 1.30E+07 2.20E-04 1.25E-08 2.50E-09 7.39E+02 24.1 6.11E+04 83GAPDH 1.30E+07 2.20E-04 1.25E-08 2.50E-09 7.39E+02 19.8 1.20E+06 1631B2F4-2第6天
PT 1.10E+07 1.40E-04 1.25E-08 2.50E-09 9.82E+02 19.2 1.83E+06 859GGCX 1.10E+07 1.40E-04 1.25E-08 2.50E-09 9.82E+02 24.1 6.11E+04 62GAPDH 1.10E+07 1.40E-04 1.25E-08 2.50E-09 9.82E+02 19 2.10E+06 2135H3B10-1
第10天
PT 1.10E+07 2.90E-04 1.25E-08 2.50E-09 4.74E+02 17.774.92E+06 1.0375GGCX 1.10E+07 2.90E-04 1.25E-08 2.50E-09 4.74E+02 23.4 9.93E+04 210GAPDH 1.10E+07 2.90E-04 1.25E-08 2.50E-09 4.74E+02 17.964.31E+06 9095H3B10-2.
第10天
PT 8.90E+06 3.10E-04 1.25E-08 2.50E-09 3.59E+02 19.2 1.83E+06 5087GGCX 8.90E+06 3.10E-04 1.25E-08 2.50E-09 3.59E+02 25.3 2.66E+04 74GAPDH 8.90E+06 3.10E-04 1.25E-08 2.50E-09 3.59E+02 18.9 2.25E+06 6263[0170] ＊来自实施例3的P1E2数据用于对比。

[0171] 对于克隆H3B10，计算的rhFII mRNA：GGCX mRNA比例大约是30∶1，对于克隆B2F4大约50∶1，对于克隆P1E2大约250∶1。

[0172] 实施例6

[0173] 人类凝结因子IX(FIX)的生产

[0174] 从购自Invitrogen的人类基因库肝脏cDNA扩增人类凝结因子(human coagulation factor)IX cDNA。寡核苷酸引物为：5’-末端；F9f.ampl.：5′-CACCATGCAGCGCGTGAACATGAT-3′(SEQ ID NO：16)，和3’末端；F9r.ampl.：5′CCTTGGAAATCCATCTTTCATTA-3′(SEQ ID NO：17)。

[0175] 通过DNA测序确认正确序列的克隆。使用Pfx聚合酶(Invitrogen)和克隆引物PCR扩增人类FIX片段来产生平端片段。使用T4多核苷酸激酶将平端片段磷酸化，克隆到来自实施例1和实施例4的、EcoRV消化的和去磷酸化的pCDNA-GGCX载体中。这样，获得了类似于用于生产人类凝血酶原的共表达构建体(实施例1和实施例4)的、用于共表达人类FIX和GGCX的构建体。通过DNA测序和在COS-7细胞中的瞬时表达确认正确序列的克隆。载体构建体F9NopA可以在附图3a中看到，载体构建体F9hglx在附图3b中示出。载体F9NopA和F9hglx之间的差异是GGCX基因的转录方向。F9NopA的核苷酸序列在SEQ ID NO：14中示出，F9hglx的核苷酸序列在SEQID NO：15中示出。

[0176] 生产rhFIX的细胞系的建立

[0177] 使用实施例1中描述的步骤将rhFIX构建体转染到CHO-S细胞中。通过细胞上清液的ELISA对每个FIX构建体根据rhFIX表达筛选约3000个克隆。使用的抗体来自Haemathology Technology Inc.和DakoCytomation。选择克隆，进行改造以在无蛋白的化学成分明确的CHO培养基上生长。细胞在T-烧瓶中37℃生长，或在旋转瓶中32-37℃生长。两种培养物的CO2浓度都是5％。通过在pH 7.0进行Q-Sepharose阴离子交换色谱将产生的rhFIX纯化到同质。通过使用FIX缺陷血浆(Precision Biologic)的凝结化验，测定重组hFIX活性。获得的最好的生产rhFIX的克隆是N4D5，其是使用F9NopA构建体获得的，在T-烧瓶中无蛋白的化学成分明确培养基中生长产生多达4μg/ml的活性rhFIX。相同的克隆在旋转瓶中生长产生达7.1μg/ml的rhFIX。总的生产率，还包括不完全羧化的、非活性的rhFIX，通过Western印迹分析估计至少30μg/ml。用rhFIX构建体F9hglx获得的最好的生产克隆是P1G9，在相似条件下产生0.7(T-烧瓶)-1.3(旋转)μg/ml的rhFIX。结果指明，通过使用F9NopA构建体以低水平共表达GGCX改进了rhFIX生产率，而使用构建体F9hglx共表达GGCX没那么有益。还注意到，在细胞系发育过程期间在同时的生产率筛选中，产生N4D5克隆的F9NopA构建体，一般地得出比产生P1G9克隆的F9hglx构建体更高的ELISA信号。

[0178] N4D5细胞系的生产率是早先公开的、在可比较的状况下获得的水平的4-6倍，其中IC4、IG8、r-FIX BHK和r-FIX 293是在参考文献中提及的克隆的名称(表5)。

[0179] 表5.人类FIX生产细胞系的生产率的比较

[0180]

[0181]

[0182] 实施例7

[0183] 通过测量mRNA的数量在CHO-S细胞系中γ-羧化酶和因子IX的表达的实时RT-PCR分析

[0184] 重组hFIX生产克隆在32-37℃在旋转瓶子中、在100ml补充有维生素K的无蛋白的化学成分明确培养基中生长。在峰值rhFIX浓度收集5-10ml样品，分析人类FIX和GGCX转录产物，以及GAPDH对照(持家，house-keeping)基因的转录产物的含量。步骤和实施例3中一样。rhFIX的引物如下：

[0185] 人类因子IX引物

[0186] 5′AATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTG 3′ 正向引物(SEQ ID NO：18)[0187] 5′CACTGCTGGTTCACAGGACTTCT 3′ 反向引物(SEQ ID NO：19)[0188] 5′TCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAAC 3′探针(SEQ ID NO：20)[0189] 扩增子长度84bp

[0190] 取决于培养物温度和培养物接种量，在不同的天数信使RNA水平出现峰值。发现mRNA的峰值水平与培养基中rhFIX的峰值浓度符合得很好。

[0191] 表6.rhFIX生产克隆的实时RT-PCR分析的结果

[0192]细胞系-批次 培养天数 2^-delta Ct 2^-delta Ct mRNA比例
FIX GGCX FIX：GGCX
N4D5-100 11 0.255253 0.005461 47∶1
N4D5-2 14 0.264866 0.006201 43∶1
P1G9-A 6 0.022982 0.005601 4∶1
P1G9-B 8 0.04181 0.007687 5∶1

[0193] 根据实时RT-PCR分析我们还发现，尽管2^-delta Ct-值随培养时间和条件变化，对于每个克隆FIX：GGCX mRNA比例大约是相同的。对于最好的rhFIX生产克隆N4D5，该比例是大约45∶1。另一个克隆P1G9的分析得出了大约4.5∶1的更低的比例。P1G9克隆仅生产了N4D5生产的rhFIX数量的20％。

[0194] 序列表：

[0195] SEQ ID NO：1

[0196] GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGAT[0197] GCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTG[0198] CGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATC[0199] TGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGA[0200] CATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCAT[0201] ATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC[0202] GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGAC[0203] TTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCA[0204] AGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCT[0205] GGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTAT[0206] TAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAG[0207] CGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTT[0208] TTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGC[0209] AAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAAC[0210] TAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC[0211] AAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATT[0212] GCCCTTATTCCTCAGTGACCCAGGAGCTGACACACTATGGCGCACGTCCGAGGCTTGC[0213] AGCTGCCTGGCTGCCTGGCCCTGGCTGCCCTGTGTAGCCTTGTGCACAGCCAGCATGT[0214] GTTCCTGGCTCCTCAGCAAGCACGGTCGCTGCTCCAGCGGGTCCGGCGAGCCAACAC[0215] CTTCTTGGAGGAGGTGCGCAAGGGCAACCTGGAGCGAGAGTGCGTGGAGGAGACGTG[0216] CAGCTACGAGGAGGCCTTCGAGGCTCTGGAGTCCTCCACGGCTACGGATGTGTTCTGG[0217] GCCAAGTACACAGCTTGTGAGACAGCGAGGACGCCTCGAGATAAGCTTGCTGCATGTC[0218] TGGAAGGTAACTGTGCTGAGGGTCTGGGTACGAACTACCGAGGGCATGTGAACATCAC[0219] CCGGTCAGGCATTGAGTGCCAGCTATGGAGGAGTCGCTACCCACATAAGCCTGAAATC[0220] AACTCCACTACCCATCCTGGGGCCGACCTACAGGAGAATTTCTGCCGCAACCCCGACA[0221] GCAGCACCACGGGACCCTGGTGCTACACTACAGACCCCACCGTGAGGAGGCAGGAAT[0222] GCAGCATCCCTGTCTGTGGCCAGGATCAAGTCACTGTAGCGATGACTCCACGCTCCGA[0223] AGGCTCCAGTGTGAATCTGTCACCTCCATTGGAGCAGTGTGTCCCTGATCGGGGGCAG[0224] CAGTACCAGGGGCGCCTGGCGGTGACCACACATGGGCTCCCCTGCCTGGCCTGGGCC[0225] AGCGCACAGGCCAAGGCCCTGAGCAAGCACCAGGACTTCAACTCAGCTGTGCAGCTGG[0226] TGGAGAACTTCTGCCGCAACCCAGACGGGGATGAGGAGGGCGTGTGGTGCTATGTGG[0227] CCGGGAAGCCTGGCGACTTTGGGTACTGCGACCTCAACTATTGTGAGGAGGCCGTGGA[0228] GGAGGAGACAGGAGATGGGCTGGATGAGGACTCAGACAGGGCCATCGAAGGGCGTAC[0229] CGCCACCAGTGAGTACCAGACTTTCTTCAATCCGAGGACCTTTGGCTCGGGAGAGGCA[0230] GACTGTGGGCTGCGACCTCTGTTCGAGAAGAAGTCGCTGGAGGACAAAACCGAAAGAG[0231] AGCTCCTGGAATCCTACATCGACGGGCGCATTGTGGAGGGCTCGGATGCAGAGATCGG[0232] CATGTCACCTTGGCAGGTGATGCTTTTCCGGAAGAGTCCCCAGGAGCTGCTGTGTGGG[0233] GCCAGCCTCATCAGTGACCGCTGGGTCCTCACCGCCGCCCACTGCCTCCTGTACCCGC[0234] CCTGGGACAAGAACTTCACCGAGAATGACCTTCTGGTGCGCATTGGCAAGCACTCCCG[0235] CACCAGGTACGAGCGAAACATTGAAAAGATATCCATGTTGGAAAAGATCTACATCCACC[0236] CCAGGTACAACTGGCGGGAGAACCTGGACCGGGACATTGCCCTGATGAAGCTGAAGAA[0237] GCCTGTTGCCTTCAGTGACTACATTCACCCTGTGTGTCTGCCCGACAGGGAGACGGCA[0238] GCCAGCTTGCTCCAGGCTGGATACAAGGGGCGGGTGACAGGCTGGGGCAACCTGAAG[0239] GAGACGTGGACAGCCAACGTTGGTAAGGGGCAGCCCAGTGTCCTGCAGGTGGTGAAC[0240] CTGCCCATTGTGGAGCGGCCGGTCTGCAAGGACTCCACCCGGATCCGCATCACTGACA[0241] ACATGTTCTGTGCTGGTTACAAGCCTGATGAAGGGAAACGAGGGGATGCCTGTGAAGG[0242] TGACAGTGGGGGACCCTTTGTCATGAAGAGCCCCTTTAACAACCGCTGGTATCAAATGG[0243] GCATCGTCTCATGGGGTGAAGGCTGTGACCGGGATGGGAAATATGGCTTCTACACACA[0244] TGTGTTCCGCCTGAAGAAGTGGATACAGAAGGTCATTGATCAGTTTGGAGAGTAGAAGG[0245] GCAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGCGGTT[0246] CGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATC[0247] ATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGC[0248] CAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC[0249] CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTC[0250] TATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAG[0251] CAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTG[0252] GGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGT[0253] GGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTC[0254] GCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCG[0255] GGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTG[0256] ATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTG[0257] ACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAAC[0258] CCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAA[0259] AAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTA[0260] GGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTC[0261] AATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGC[0262] AAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCG[0263] CCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATT[0264] TATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCT[0265] TTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGAT[0266] CTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCA[0267] GGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAA[0268] TCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTT[0269] TGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTA[0270] TCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAG[0271] 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