预测紫杉醇疗法副作用的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种紫杉醇疗法引起受试者粒细胞减少症发病危险性的预测方法，该方法包含对由受试者分离的基因进行以下基因多态性的鉴定的步骤：存在于CYP2C8基因中的5个SNP(IMS-JST111898(序列号1)、IMS-JST105874(序列号2)、IMS-JST082397(序列号3)、IMS-JST071852(序列号4)、IMS-JST071853(序列号5))、以及存在于BUB1b基因中的5个SNP(IMS-JST074538(序列号6)、IMS-JST079837(序列号7)、IMS-JST044164(序列号8)、IMS-JST063023(序列号9)、IMS-JST042569(序列号10)。本发明还公开了一种试剂盒，该试剂盒含有用于本发明方法的试剂。

权利要求

1.一种诊断用试剂盒，是用于预测紫杉醇疗法引起受试者粒细胞减少症的发病危险性的诊断用试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有核酸分子，所述核酸分子包含BUB1b基因中被定义为序列号6的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的诊断用试剂盒，其中还含有下述核酸分子：包含CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子。

3.一种诊断用试剂盒，是用于预测紫杉醇疗法引起受试者粒细胞减少症的发病危险性的诊断用试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有BUB1b基因中被定义为序列号6的序列的第11个碱基的区域。

4.如权利要求3所述的诊断用试剂盒，其中，所述试剂盒还含有下述引物对：为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列的第

11个碱基的区域。

说明书

预测紫杉醇疗法副作用的方法及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及通过鉴定基因多态性预测作为紫杉醇疗法副作用之一的粒细胞减少症发病的危险的方法，以及用于实施上述方法的诊断用试剂盒。

背景技术

[0002] 紫杉醇(paclitaxel)又称泰素(taxol)(注册商标)等，是一种二萜衍生物类生物碱。紫杉醇是通过促进微管蛋白聚合使微管稳定，并引起微管过剩形成，以及通过阻碍纺锤体的功能抑制细胞分裂的抗肿瘤药物(Manfredi，J.J.and Horwitz，S.B.Taxol：an antimitotic agentwith a new mechanism of action.Pharmac.Ther.，25：83-125，1984)广泛用于治疗乳腺癌、卵巢癌、胃癌和非小细胞肺癌等各种癌症。关于紫杉醇疗法的最适给药量和给药方案，目前还在进行各种临床试验。紫杉醇疗法引起的主要副作用之一是粒细胞减少症，由于该副作用的出现限制了给药量(例如，Seidman，A.D.，et al.Dose-dense therapy withweekly 1-hour paclitaxel infusions in the treatment of metastatic breastcancer.J Clin Oncol，16：3353-3361，1998)。

[0003] 作为降低紫杉醇疗法的副作用的方法，目前正在研究通过分析患者的基因预测副作用，进而确定该制剂的使用或给药量的方法。该研究明确了与药物代谢相关、或与药物活性功能性相关的基因是药物副作用出现的原因的可能性。例如，细胞色素P450家族等药物代谢相关基因中的几个cSNPs与几种药物的副作用高度相关(Relling，M.V.and Dervieux，T.Pharmacogenetics and cancer therapy.Nat Rev Cancer，1：99-108，2001)。但是，由于上述高危基因多态性的等位基因频率比较低，因此不足以说明大部分患者出现副作用的可能性。所以，有必要对紫杉醇疗法副作用发生与基因多态性的关系进行研究。

[0004] 特开2003-93068公开了通过检测代谢酶CYP2C8的多态性预测患者对紫杉醇的感受性的方法。但是，该申请公开的伴随氨基酸变异的基因变异的等位基因频率都低。例如，该申请的发明人公开了上述等位基因频率小于0.007的内容(Soyama，A.，Y.Saito，et al.(2001)“. Non-synonymous single nucleotide alterations found in the CYP2C8gene result in reduced in vitro paclitaxel metabolism.”Biol Pharm Bull24(12)，1427-1430)。

[0005] 本发明的目的是提供用于预测紫杉醇疗法中粒细胞减少症发生可能性的方法以及试剂盒。

发明内容

[0006] 本发明提供紫杉醇疗法引起受试者发生粒细胞减少症的危险性的预测方法，该方法包含对从受试者中分离的基因进行选自以下基因多态性的1个或1个以上基因多态性的鉴定的步骤，所述基因多态性包括：CYP2C8基因中被定义为序列号1的序列在第11个碱基处的基因多态性、CYP2C8基因中被定义为序列号2的序列在第11个碱基处的基因多态性、CYP2C8基因中被定义为序列号3的序列在第11个碱基处的基因多态性、CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列在第11个碱基处的基因多态性、CYP2C8基因中被定义为序列号5的序列在第11个碱基处的基因多态性、BUB1b基因中被定义为序列号6的序列在第11个碱基处的基因多态性、BUB1b基因中被定义为序列号7的序列在第11个碱基处的基因多态性、BUB1b基因中被定义为序列号8的序列在第11个碱基处的基因多态性、BUB1b基因中被定义为序列号9的序列在第11个碱基处的基因多态性、以及BUB1b基因中被定义为序列号10的序列在第11个碱基处的基因多态性。上述序列如下面的表1所示。

[0007] 表1

[0008]JSNP ID 序列 序列号
IMS-JST111898 CAGAGCAAGGRCAACTGTTTC 1
IMS-JST105874 TACTTTTACCYTAAATATGAG 2
IMS-JST082397 GAGATCAGTARAAACAGTATG 3
IMS-JST071852 GAAATTTCCAWAGTGCTGGTT 4
IMS-JST071853 ATTGCTATTTRTCCATGATCA 5
IMS-JST074538 GGAGTCGTGTRCGTGCCTTGG 6
IMS-JST079837 GACTGACACAKAATTATTATT 7
IMS-JST044164 AACTGGCTGTYGTGCAGTCTC 8
IMS-JST063023 AGGAAGGCAAYCTGTTTTTTT 9
IMS-JST042569 GGGTACATCTYAGCTATGCCA 10

[0009] R＝A/G；Y＝T/C；W＝T/A；K＝T/G

[0010] 在本发明的一个实施方案中，CYP2C8基因中被定义为序列号1的序列在第11个碱基处的基因型为G/G时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为A/G或A/A时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0011] 在本发明的其他实施方案中，CYP2C8基因中被定义为序列号2的序列在第11个碱基处的基因型为T/T时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为C/T或C/C时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0012] 在本发明的其他实施方案中，CYP2C8基因中被定义为序列号3的序列在第11个碱基处的基因型为G/G时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为A/G或A/A时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0013] 在本发明的其他实施方案中，CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列在第11个碱基处的基因型为T/T时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为A/T或A/A时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0014] 在本发明的其他实施方案中，CYP2C8基因中被定义为序列号5的序列在第11个碱基处的基因型为G/G时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为A/G或A/A时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0015] 在本发明的其他实施方案中，BUB1b基因中被定义为序列号6的序列在第11个碱基处的基因型为A/A时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为A/G或G/G时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0016] 在本发明的其他实施方案中，BUB1b基因中被定义为序列号7的序列在第11个碱基处的基因型为T/T时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为G/T或G/G时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0017] 在本发明的其他实施方案中，BUB1b基因中被定义为序列号8的序列在第11个碱基处的基因型为C/C时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为C/T或T/T时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0018] 在本发明的其他实施方案中，BUB1b基因中被定义为序列号9的序列在第11个碱基处的基因型为C/C时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为C/T或T/T时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0019] 在本发明的其他实施方案中，BUB1b基因中被定义为序列号10的序列在第11个碱基处的基因型为T/T时，预测粒细胞减少症发病的危险性高，基因型为C/T或C/C时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0020] 在本发明中，任意组合1个或1个以上经本发明鉴定的SNPs，能以更高的精确度预测粒细胞减少症发病的危险性。如后面的实施例所示，特定的SNPs的组合与粒细胞减少症的发病率的相关性特别高。即，本发明提供紫杉醇疗法引起受试者发生粒细胞减少症的危险性的预测方法，该方法包含对从受试者分离的基因鉴定CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列在第11个碱基处的基因多态性以及BUB1b基因中被定义为序列号6的序列在第11个碱基处的基因多态性的步骤。

[0021] 优选当CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列在第11个碱基处的基因型为T/T、并且BUB1b基因中被定义为序列号6的序列在第11个碱基处的基因型为A/A或G/G时，预测粒细胞减少症发病的危险性高。而且，优选当CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列在第11个碱基处的基因型为A/T或A/A、并且BUB1b基因中被定义为序列号6的序列在第11个碱基处的基因型为A/G时，预测粒细胞减少症发病的危险性低。

[0022] 另外，本发明提供用于预测紫杉醇疗法引起受试者发生粒细胞减少症的危险性的诊断用试剂盒。该试剂盒的特征在于，含有用于对从受试者分离的基因进行选自下列基因多态性的1个或1个以上基因多态性的鉴定的试剂，所述基因多态性包括：CYP2C8基因中被定义为序列号1的序列在第11个碱基处的基因多态性、CYP2C8基因中被定义为序列号2的序列在第11个碱基处的基因多态性、CYP2C8基因中被定义为序列号3的序列在第11个碱基处的基因多态性、CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列在第11个碱基处的基因多态性、CYP2C8基因中被定义为序列号5的序列在第11个碱基处的基因多态性、BUB1b基因中被定义为序列号6的序列在第11个碱基处的基因多态性、BUB1b基因中被定义为序列号7的序列在第11个碱基处的基因多态性、BUB1b基因中被定义为序列号8的序列在第11个碱基处的基因多态性、BUB1b基因中被定义为序列号9的序列在第11个碱基处的基因多态性、以及BUB1b基因中被定义为序列号10的序列在第11个碱基处的基因多态性。

[0023] 本发明的试剂盒中含有的试剂优选为选自下列核酸分子的1种或1种以上核酸分子：

[0024] 包含CYP2C8基因中被定义为序列号1的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0025] 包含CYP2C8基因中被定义为序列号2的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0026] 包含CYP2C8基因中被定义为序列号3的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0027] 包含CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0028] 包含CYP2C8基因中被定义为序列号5的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0029] 包含BUB1b基因中被定义为序列号6的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0030] 包含BUB1b基因中被定义为序列号7的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0031] 包含BUB1b基因中被定义为序列号8的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0032] 包含BUB1b基因中被定义为序列号9的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子；

[0033] 包含BUB1b基因中被定义为序列号10的序列的第11个碱基或具有与其相邻的至少10个连续核苷酸序列、或与其互补的核苷酸序列的核酸分子。

[0034] 此处，核酸分子“包含”碱基是指核酸分子序列中含有对应于作为靶的SNP部位的碱基，该碱基可以位于核酸分子的内部，也可以位于5’末端或3’末端。上述核酸分子在SNP分型中可以作为杂交探针、TaqMan探针等使用。而且，本发明的核酸分子还可以含有与SNP部位的周围区域无关的序列。该核酸分子在SNP分型中可以作为侵入(invader)法中的一级(primary)探针使用。另外，核酸分子与碱基“相邻”是指核酸分子不含有与作为靶的SNP部位对应的碱基，但是含有与SNP部位相邻的上游或下游的连续的核苷酸序列。与被定义为序列号1的序列的第11个碱基“相邻”的序列的例子，可以是包含被定义为序列号1的序列的第1-10个碱基的序列，还可以是包含第12-21个碱基的序列。该核酸分子在SNP分型中可以作为侵入法中的侵入探针(invader probe)或MALDI-TOF/MS法以及引物扩增法中的引物使用。上述探针可以根据本发明的说明，并参照CYP2C8基因序列或BUB1b基因序列进行设计。

[0035] 另外，本发明的试剂盒中含有的试剂优选为选自下列引物核酸分子中的1种或1种以上核酸分子：

[0036] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有CYP2C8基因中被定义为序列号1的序列的第11个碱基的区域；

[0037] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有CYP2C8基因中被定义为序列号2的序列的第11个碱基的区域；

[0038] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有CYP2C8基因中被定义为序列号3的序列的第11个碱基的区域；

[0039] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有CYP2C8基因中被定义为序列号4的序列的第11个碱基的区域；

[0040] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有CYP2C8基因中被定义为序列号5的序列的第11个碱基的区域；

[0041] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有BUB1b基因中被定义为序列号6的序列的第11个碱基的区域；

[0042] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有BUB1b基因中被定义为序列号7的序列的第11个碱基的区域；

[0043] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有BUB1b基因中被定义为序列号8的序列的第11个碱基的区域；

[0044] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有BUB1b基因中被定义为序列号9的序列的第11个碱基的区域；

[0045] 为扩增DNA而设计的PCR引物对，该DNA对应于含有BUB1b基因中被定义为序列号10的序列的第11个碱基的区域。

[0046] 上述引物对可以在各种分型法中用于扩增靶基因。上述引物对可以根据本发明的说明，并参照CYP2C8基因序列或BUB1b基因序列进行设计。用于扩增的优选引物对的设计方法在本技术领域内是熟知的。具体实施方案

[0047] 在本发明中，为了探索与紫杉醇疗法引起的副作用相关的基因多态性，首先选定298个与药物代谢相关的基因以及与紫杉醇的药理作用机理相关的基因。然后，利用JSNP数据库检索存在于上述298个基因内的SNPs，共检索出2727个SNPs。从给予紫杉醇的54名乳腺癌患者的末梢血中提取DNA，进行SNPs的分型，如后面的实施例所示，发现以下基因序列与粒细胞减少症的发病相关，所述基因序列包括存在于CYP2C8基因中的5个SNP(IMS-JST111898(序列号1)、IMS-JST105874(序列号2)、IMS-JST082397(序列号3)、IMS-JST071852(序列号4)、IMS-JST071853(序列号5))、以及存在于BUB1b基因中的5个SNP(IMS-JST074538(序列号6)、IMS-JST079837(序列号7)、IMS-JST044164(序列号8)、IMS-JST063023(序列号9)、IMS-JST042569(序列号10)。

[0048] 需要说明的是，上述IMS-JST编号是JSNP数据库(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/)中的进入号，可以从以NCBI的dbSNP数据库为代表的各种数据库中进行检索。在本说明书中，为了更明确地表示本发明中发现的上述SNPs的位置，将基因组序列中的包含该SNP部位以及其前后各10个碱基的序列分别表示成序列号1-10，参照上述序列号表示SNPs。对本领域技术人员而言，因以后发现错误序列(sequence error)或新的多态性而改变上述序列号表示的碱基序列中的一部分是显而易见的。

[0049] CYP2C8(细胞色素p450，科2，亚科C，多肽8)是与各种药物代谢相关的细胞色素P450，位于染色体位置10q23.33。紫杉醇的代谢主要在肝细胞中进行，代谢物被排泄到胆汁中。CYP2C8水解紫杉醇的能力对紫杉醇的解毒发挥重要的作用，利用该水解能力，紫杉醇被分解成解毒化的6α-羟基紫杉醇(Rahman，A.，et al.Selective biotransformation oftaxol to 6α-hydroxytaxol by human cytochrome P450 2C8.Cancer Res，54：5543-5546，1994)。因此，CYP2C8蛋白质对紫杉醇血药浓度的确定具有重要的作用。由此暗示了CYP2C8可能也与副作用相关。已知CYP2C8基因中存在几个cSNP。例如，伴随氨基酸取代的5个cSNP中的一个(416G-＞A)能使紫杉醇的代谢速度低于野生型(Bahadur，N.，et al.CYP2C8 polymorphisms in Caucasians and their relationship with paclitaxel6alpha-hydroxylase activity in human liver microsomes.Biochem.Pharmacol.，64：1579-1589，2002；Dai，D.，et al.Polymorphisms in humanCYP2C8 decrease metabolism of the anticancer drug paclitaxel andarachidonic acid.Pharmacogenetics，11：597-607，2001)。但是，在以日本人为对象的等位基因频率的解析研究中，上述cSNPs的频率极低。实际上，即使在本发明中实施的分型中，54个检体中也只发现一个1196A＞G的变异等位基因。由此暗示了存在于CYP2C8基因中的已知cSNPs基本上与紫杉醇引起的粒细胞减少症无关。本发明中发现的SNPs以未知的机理与粒细胞减少症相关。

[0050] BUB1b基因是与酿酒酵母有丝分裂的关卡相关的BUB基因的同源染色体(homologue)，位 于 染 色 体 位 置 15q15(Cahill，D.P.，et al.Mutationsof mitotic checkpoint genes in human cancers.Nature，392：300-303，1998；Hoyt，M.A.，et al.S.cerevisiae genes required for cell cycle arrest inresponse to loss of microtubule function.Cell，66：507-517，1991.；Li，R.andMurray，A.W.Feedback control of mitosis in budding yeast.Cell，66：519-531，1991)。紫杉醇的抗肿瘤效果是通过促进微管聚合实现的，微管是紫杉醇的靶分子。由此暗示BUB1b基因与紫杉醇的药理作用在功能上相关。

[0051] 本发明发现的与紫杉醇疗法引起的副作用相关的SNPs的位置以及多态性的信息如下表所示。

[0052] 表2

[0053]IMS-JST111898
一般信息
JSNP ID：IMS-JST111898
dbSNP ID(rs#)：1557044
dbSNP ID(ss#)：4944611
HGVbase ID：SNP000830254
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：11)
5’检测：AAAAAGAAAG GTCAAGGCAG GAGCCTCAGC TCAGGAGAAG
AAACAAGGAG CAGAGCAAGG
观察结果：A/G
3’检测：CAACTGTTTC TCAAGGAATA AAATTATTGC TCTAAAGAGA
GAAAGTGAAC TTATTTTATC

[0054] 表3

[0055]IMS-JST105874
一般信息
JSNP ID：IMS-JST105874
dbSNP ID(rs#)：3752988
dbSNP ID(ss#)：4939017
HGVbase ID：
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：12)
5’检测：CAAATTCCCC ATGTGTCCAA AAAAAATCAG CATGGATGAA
ATAAACACAT TACTTTTACC
观察结果：T/C
3’检测：TAAATATGAG TTGAGCATTA CAGGCTAGCT AAACAATGTC
ATTTCGCATG TGGTTATTCA

[0056] 表4

[0057]IMS-JST082397
一般信息
JSNP ID：IMS-JST082397
dbSNP ID(rs#)：1891071
dbSNP ID(ss#)：4923304
HGVbase ID：
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：13)
5’检测：TTGATGACAC AATTTAAAAT GACATCTTTG TACAATGGAG
GAGGATGACA GAGATCAGTA
观察结果：A/G
3’检测：AAACAGTATG GCAGTAGCAA AATAAGTAAA GCACTGATGA
AGTGTCTGGA TTTCAGCAAA

[0058] 表5

[0059]IMS-JST071852
一般信息
JSNP ID：IMS-JST071852
dbSNP ID(rs#)：2275620
dbSNP ID(ss#)：3211768
HGVbase ID：SNP001282389
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：14)
5’检测：CTCATCCCCA AGGTAAGCTT GTTTCTCTTA CACTATATTT
CTGTACTTCT GAAATTTCCA
观察结果：T/A
3’检测：AGTGCTGGTT TGGTTCCAAC CCTCTAACAA CACAAGATGA
GAGAAGTGCA AAACTCATAC

[0060] 表6

[0061]IMS-JST071853
一般信息
JSNP ID：IMS-JST071853
dbSNP ID(rs#)：1934951
dbSNP ID(ss#)：3211769
HGVbase ID：SNP001276002
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：15)
5’检测：TTTTTGGAAT TAGTTGGAAT TTACATGGCA CCTCCTCTGG
GGCTGGTAGA ATTGCTATTT
观察结果：G/A
3’检测：TCCATGATCA AGAGCACCAC TCTTAACACC CATGTGCTCC
ACCCTCACAA TACACCATCA

[0062] 表7

[0063]IMS-JST074538
一般信息
JSNP ID：IMS-JST074538
dbSNP ID(rs#)：2277559
dbSNP ID(ss#)：3214454
HGVbase ID：SNP001383307
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：16)
5’检测：TTTGAAACTT GGCGGCTAGG GGTGTGGGCT TGAGGTGGCC
GGTTTGTTAG GGAGTCGTGT
观察结果：A/G
3’检测：CGTGCCTTGG TCGCTTCTGT AGCTCCGAGG GCAGGTTGCG
GAAGAAAGCC CAGGCGGTCT

[0064] 表8

[0065]IMS-JST079837
一般信息
JSNP ID：IMS-JST079837
dbSNP ID(rs#)：3214012
dbSNP ID(ss#)：4474916
HGVbase ID：
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：17)
5’检测：TAAATGTCTT CCGAAAGGTG ATTATTCATG GTCTTGGGTT
GAATATAGTG GACTGACACA
观察结果：T/G
3’检测：AATTATTATT ATTATTATAT GCCTAAGCTT CTTTGTTAGC
TGTTTTTCAA GTTTATGGCT

[0066] 表9

[0067]IMS-JST044164
一般信息
JSNP ID：IMS-JST044164
dbSNP ID(rs#)：1801376
dbSNP ID(ss#)：3234079
HGVbase ID：
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：18)
5’检测：CCCACCCTTA ATAATTCCCA CTTCAAAATA TCCAAAAACC
ACACTCACAT AACTGGCTGT
观察结果：C/T
3’检测：GTGCAGTCTC TTCCACATAT GGAGTGAAAC TGGGAAGCAC
AGCGGGTACA GCTATCAGTG

[0068] 表10

[0069]IMS-JST063023
一般信息
JSNP ID：IMS-JST063023
dbSNP ID(rs#)：2305653
dbSNP ID(ss#)：3252938
HGVbase ID：SNP001383945
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：19)
5’检测：TCTTCAAGAC AACCAGATAA ATTAATCAAT ATTTTGTGTT
GTTTGAAAGC AGGAAGGCAA
观察结果：C/T
3’检测：CTGTTTTTTT AATAACAAAA AGCTTCAAAC ATATAAAAGG
TCATTAAACA ATTTACCAAT

[0070] 表11

[0071]IMS-JST042569
一般信息
JSNP ID：IMS-JST042569
dbSNP ID(rs#)：2290551
dbSNP ID(ss#)：3232484
HGVbase ID：SNP001383051
组织来源：人
分子类型：基因组
等位基因序列
变异类型：SNP
侧翼序列信息(SEQ ID NO：20)
5’检测：AGGCCATGAA AGAAGCTGCA TAGCTGGTCT TTAAAAAAAA
AAGGTACCTT GGGTACATCT
观察结果：T/C
3’检测：AGCTATGCCA ACAACTCCCT CCAGTGGTTA ATTTTGAAAA
TGCACCTGTA AGACAGAGCA

[0072] 在本发明的方法中，采集计划利用紫杉醇进行治疗或正给予紫杉醇的受试者的末梢血液、其他体液、细胞、组织等，根据常规方法，利用上述实验材料调制基因组DNA。在需要的情况下，可以扩增应该分型的部位的序列。基因多态性的分型可以使用本技术领域已知的或正在开发的各种方法中的任一种容易地进行。作为分型方法的例子，可以举出直接序列分析法、侵入法、TaqMan法、MALDI-TOF/MS法、引物扩增法以及杂交法等，但并不限定于此。

[0073] 使用直接序列法的情况下，利用PCR扩增含有SNP部位的区域的DNA，可以利用直接序列法分析该PCR产物的序列，鉴定SNP。

[0074] 使用侵入法的情况下，准备在从SNP部位至3’端含有特异序列的侵入探针、及在从模板的SNP部位至5’端含有特异序列和无关的翼序列(flap sequence)的一级探针。使上述探针在FRET探针和模板的存在下，与裂解酶作用，所述FRET探针含有与翼(flap)互补的序列和自身互补序列，并利用荧光色素和猝灭剂标记。如果一级探针与模板杂交，则侵入探针的3’末端侵入SNP部位，该结构被裂解酶裂解，翼游离出来。翼与FRET探针结合，利用裂解酶切断荧光色素部分，产生荧光。准备2组Flap-FRET探针，利用不同的荧光色素标记，由此可以经一次检测区别各纯合体和杂合体。

[0075] 利用TaqMan法的情况下，使利用荧光色素和猝灭剂标记的等位特异探针与靶部位杂交，并利用为扩增含有该部位的区域而设计的引物进行PCR反应。在利用引物进行延长反应的同时，利用TaqDNA聚合酶的5′核酸外切酶活性切断杂交的探针。荧光色素与猝灭剂分离产生荧光，通过检测该荧光可以鉴定SNP。

[0076] 利用MALDI-TOF/MS法的情况下，制备与SNP部位相邻的引物，以PCR扩增样品DNA为模板，利用ddNTP将引物只延长1个碱基。利用MALDI-TOF/MS对延长反应产物进行质量分析，鉴别掺入的ddNTP。

[0077] 使用杂交法的情况下，利用PCR扩增含有SNP部位的区域的DNA，通过使用特异的探针与SNP部位杂交来检测扩增产物。而且，除以上方法以外，还开发了RFLP法、DNA芯片法、分子信标(beacon)法、连接(ligation)法等各种方法，在本发明中可以使用上述任一种方法。

[0078] 按照本发明的方法对本发明中鉴定的1个或1个以上SNP部位进行分型，参照后面的实施例所示的统计数据，可以预测紫杉醇疗法引起的副作用的发病危险性。本发明的方法适用于蒙古人种(mongoloid)，特别适用于日本人。较优选对本发明中鉴定的CYP2C8基因中的SNP和BUB1b基因中的SNP进行分型，通过组合上述结果，预测紫杉醇疗法引起的副作用的发病危险性。作为组合例可以举出：

[0079] IMS-JST111898(序列号1)和IMS-JST074538(序列号6)、

[0080] IMS-JST111898(序列号1)和IMS-JST079837(序列号7)、

[0081] IMS-JST111898(序列号1)和IMS-JST044164(序列号8)、

[0082] IMS-JST111898(序列号1)和IMS-JST063023(序列号9)、

[0083] IMS-JST111898(序列号1)和IMS-JST042569(序列号10)、

[0084] IMS-JST105874(序列号2)和IMS-JST074538(序列号6)、

[0085] IMS-JST105874(序列号2)和IMS-JST079837(序列号7)、

[0086] IMS-JST105874(序列号2)和IMS-JST044164(序列号8)、

[0087] IMS-JST105874(序列号2)和IMS-JST063023(序列号9)、

[0088] IMS-JST105874(序列号2)和IMS-JST042569(序列号10)、

[0089] IMS-JST082397(序列号3)和IMS-JST074538(序列号6)、

[0090] IMS-JST082397(序列号3)和IMS-JST079837(序列号7)、

[0091] IMS-JST082397(序列号3)和IMS-JST044164(序列号8)、

[0092] IMS-JST082397(序列号3)和IMS-JST063023(序列号9)、

[0093] IMS-JST082397(序列号3)和IMS-JST042569(序列号10)、

[0094] IMS-JST071852(序列号4)和IMS-JST074538(序列号6)、

[0095] IMS-JST071852(序列号4)和IMS-JST079837(序列号7)、

[0096] IMS-JST071852(序列号4)和IMS-JST044164(序列号8)、

[0097] IMS-JST071852(序列号4)和IMS-JST063023(序列号9)、

[0098] IMS-JST071852(序列号4)和IMS-JST042569(序列号10)、

[0099] IMS-JST071853(序列号5)和IMS-JST074538(序列号6)、

[0100] IMS-JST071853(序列号5)和IMS-JST079837(序列号7)、

[0101] IMS-JST071853(序列号5)和IMS-JST044164(序列号8)、

[0102] IMS-JST071853(序列号5)和IMS-JST063023(序列号9)、

[0103] IMS-JST071853(序列号5)和IMS-JST042569(序列号10)。

[0104] 本发明还提供包含上述分型法中使用的试剂、用于预测紫杉醇疗法副作用发病的危险性的试剂盒。试剂的例子为探针和引物。用于扩增包含本发明中鉴定的SNP部位的基因区域的引物，优选15-30个碱基长度，设计成含有靶SNP部位并能够利用PCR反应得到所希望长度的扩增产物。侵入法中使用的一级探针在从SNP部位到5’端的靶区域含有特异序列，而且含有无关系的翼序列。另外，侵入法中使用的侵入探针以及MALKI-TOF/MS法和引物扩增法中使用的引物不含有与靶SNP部位对应的碱基，但含有与SNP部位相邻的上游或下游的连续核苷酸序列。上述探针和引物的设计方法与合成方法在本技术领域内都是熟知的。

[0105] 本说明书中明确引用的全部专利和参考文献的内容都作为本说明书的一部分加以引用。另外，作为本申请的优先权基础的日本专利申请2003-375369号的说明书以及附图中记载的内容全部作为本说明书的一部分加以引用。

[0106] 实施例

[0107] 下面利用实施例更详细地说明本发明，但该实施例并不是用来限定本发明的范围。

[0108] 临床样品

[0109] 在紫杉醇术前化学疗法的临床试验中登记了54名乳腺癌患者。患者的选择条件为1)70岁或70岁以下、病理组织学上被确认为阶段II或IIIa的乳腺癌患者，2)生理机3 3
能适合(WBC＞4000mm，血小板数＞10000mm，血红蛋白水平＞10g/dl，血清肌酸酐浓度＜1.2mg/dl，血清总胆红素水平＜1.5mg/dl，GOT/GPT＜60/70)。在本治疗前未进行过化学治疗或放射疗法等。即，进行紫杉醇术前化学疗法临床试验的54名患者在临床上或组织学上几乎处于相同的阶段，上述病例都未进行过化学疗法。患者每周一次滴注给药，每次
2
80mg/m 的紫杉醇，滴注1小时。连续给药12周。在上述患者中观察到的频率最高的副作用是粒细胞减少症，确认有24名患者。

[0110] 副作用的定义

[0111] 为确认有无副作用，每周对各患者测定白细胞数、红细胞数、血红蛋白量、血小板数。治疗中出现的副作用是基于美国国家癌症研究所(National Cancer Institute(NCI))的普通毒性标准(Common ToxicityCriteria(CTC))进行评价，并进行级别分类(参见Trotti，A.，et al.Commontoxicity criteria：version 2.0.an improved reference for grading the acuteeffects of cancer treatment：impact on radiotherapy.Int J Radiat Oncol BiolPhys，47：13-47，2000)。所有的临床信息都使用SCTS21系统(三井信息开发)被匿名化，用于以后的解析。按照NCI-CTC的分类，粒细胞减少症被分为级别1～4，将显示上述级别的患者视为出现粒细胞减少症，级别0的患者没有出现粒细胞减少症。
粒细胞减少症出现组与未出现组之间，未见与年龄、发病年龄的相关性。

[0112] SNPs的分型

[0113] 为了检索与紫杉醇的副作用相关的基因多态性，首先选定298个药物代谢相关基因以及与紫杉醇的药理作用机理相关的基因。然后利用JSNP数据库检索存在于上述298个基因内的SNPs，抽取2727个SNPs。

[0114] 使用侵入法对本研究中的54个病例进行存在于298个基因中的2727个SNP的分型。从54名患者中抽取末梢血14ml。从末梢血中提取DNA的方法可以使用标准方法。在利用侵入法进行分型前，利用PCR法扩增作为靶的SNP部位的附近约500bp。此时，以10ng的DNA作为模板或使用48个引物组进行多重PCR，由此同时扩增48个DNA片段。用于扩增各SNP部位附近的引物使用基于JSNP数据库记载的序列制作的引物。PCR反应利用如下的组成进行：6.7mM MgCl2，67mM TrisHCl，16.6mM NH4SO4，10mM 2-巯基乙醇，6.7μM EDTA，1.5mM dNTPs，10％DMSO，1pmol的各引物，以及0.05U Ex-Taq。PCR反应如下进行：最初的变性反应是在94℃下进行2分钟，然后将94℃下15秒、60℃下15秒、72℃下2分钟三个步骤反复进行35次。利用Multimek96反应自动仪器，将PCR产物用灭菌蒸馏水稀释，然后利用TANGO分注机分注到侵入反应用卡上。接下来，利用Cartesian分注机向侵入反应用卡上分注侵入反应试剂。侵入反应试剂中含有等位基因特异寡核苷酸、CleavaseVII、以及利用FAM或Redmond Red标记的FRET盒(cassette)。上述试剂购于Third Wave社。利用TECAN Ultra检测荧光信号，利用将FAM和Redmond Red的信号强度在2维图上展开得到的信息确认基因型。

[0115] 在进行基因分型的2727个SNPs中，2123个SNPs能在80％或80％以上的病例中确定分型。为了研究基因分型的正确率，将随机选择的3个SNPs的分型与利用RFLP法确定的基因分型比较，进行检测的约1000以上的基因型利用两种分型法得到的结果都一致。由此暗示分型的正确率非常高。另外，利用卡方检验检测各SNP是否处于Hardy-Weinberg平衡状态，结果显示检测的全部SNPs都处于Hardy-Weinberg平衡状态。

[0116] 与副作用相关的SNPs的检索以及相关分析

[0117] 首先，在各基因上构建单倍型片段结构。对存在于同一基因内的SNP的所有组合，推测任意2个SNP之间的连锁不平衡系数|D’|，将其制作成按照SNP的位置顺序排列的矩阵。如果2个SNP之间的|D’|大于或等于0.9，则推测2个基因之间形成单倍型片段。结果进行分型的298个基因被分成419个单倍型片段。

[0118] 然后，为了鉴定与副作用相关的SNP，进行2个阶段的筛选。在第一阶段对出现副作用的组和未出现副作用的组的基因型的分布进行利用2×3分割表的独立性鉴定。通过第一阶段的筛选发现了与粒细胞减少症相关的2个单倍型片段。上述单倍型片段分别包含存在于CYP2C8基因内的5个SNP、以及存在于BUB1b基因内的5个SNP。p值的最小值在含有CYP2C8基因的单倍型片段中为0.0065，在含有BUB1b基因的单倍型片段中为0.010。

[0119] 将在第一阶段中存在于同一单倍型片段内或同一基因内的所有SNP中p值小于或等于0.05的SNP用于第2阶段解析。在第2阶段制作假设为显性遗传模型或隐性遗传模型的2×2分割表，利用Fisher’s exacttest进行独立性鉴定。

[0120] 表12CYP2C8基因与粒细胞减少症的相关

[0121]

[0122] 表13BUB1b基因与粒细胞减少症的相关

[0123]

[0124] 确认在第2阶段的解析中将存在于2个基因中的SNP中都假设为隐性基因的情况下具有更高的相关性。具有最高相关性的SNP是存在于CYP2C8基因内的SNP中的IMS-JST071852(p＝0.0020，比数比为10.7)、存在于BUB1b基因内的SNP中的IMS-JST074538(p＝0.0062，比数比为5.11)。为了确定存在于CYP2C8基因内的3个已知cSNP是否与本研究中使用的SNPs相关，利用RFLP法确定上述3个cSNPs的基因型。结果只在一个病例中发现1196A＞G部位的杂合体，在其他病例中3个cSNP都是野生型。由此推测存在于CYP2C8基因内的3个cSNPs的频率非常低。另外，存在于BUB1b基因内的一个SNP(IMS-JST044164)处的多态性是伴随氨基酸取代(Arg-＞Gln)的cSNP。在本研究中发现在同点(homo)处含有作为野生型的具有Arg的等位基因的比例在出现粒细胞减少症的患者中多。

[0125] 利用基因型的组合推测副作用的出现频率

[0126] 分别对CYP2C8基因上的一个SNP与BUB1b基因上的一个SNP的基因型的组合，计算副作用出现的概率。利用逻辑回归模型进行计算。此时，使用4个变量，分别对应于CYP2C8基因上的2种SNP的等位基因型，以及BUB1b基因上的2种SNP的等位基因型。利用likelihood ratiotest检索最适SNP的组合，结果选择了CYP2C8基因上的IMS-JST071852和BUB1b基因上的IMS-JST074538的组合(p＜0.000532)。上述两个SNPs的基因型各自的副作用出现概率如表13所示。等位基因频率是利用由JSNP数据库得到的各SNP的等位基因频率推断的。

[0127] 表14各基因型引起的粒细胞减少症的概率

[0128]*

[0129] 括号内的数字表示日本人集团的等位基因频率预测

[0130] 本发明显示如果利用2个基因的2个SNP就能可靠地预测粒细胞减少症发病的可能性。CYP2C8基因上的IMS-JST071852和BUB1b基因上的IMS-JST074538的基因型的组合如果是T/T和A/A、或T/T和G/G的组合，则粒细胞减少症的发病概率非常高。根据JSNP数据库中公开的等位基因频率，上述2个基因型的组合在日本人中的频率分别为0.12和0.04。另外，认为粒细胞减少症发病概率低的基因型组合为A/T和A/G、或A/A和A/G的组合，上述组合在日本人中的频率分别为0.23和0.14。由此可知，组合以上结果就能对约半数日本人在紫杉醇疗法中是否出现粒细胞减少症进行预测。