一种诱导抗肿瘤免疫的方法及其在制药中的应用转让专利
申请号 : CN200610040863.7
文献号 : CN1887296B
文献日 : 2011-05-25
发明人 : 刘建宁 , 谭向阳 , 张菁
申请人 : 南京大学生物制药工程研究中心
摘要 :
本发明公开了一种诱导抗肿瘤免疫的方法及其在制药中的应用。该方法利用103～104剂量活骨髓瘤FO细胞诱导抗肿瘤免疫；或者，利用GM-CSF转染的骨髓瘤FO细胞冻干粉诱导抗肿瘤免疫；或者，利用原代人脐静脉血管内皮细胞诱导抗肿瘤免疫；或者，利用肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白提取物诱导抗肿瘤免疫的方法。该方法可用于制备抗肿瘤药物。该方法操作简单，诱导抗肿瘤免疫效果好。
权利要求 :
1.一种采用诱导抗肿瘤免疫制备抗肿瘤疫苗的方法，其特征在于：利用肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白提取物诱导抗肿瘤免疫制备抗肿瘤疫苗的方法，包括以下步骤：利用生物素标记肿瘤血管内皮细胞，将肿瘤血管内皮细胞破碎匀浆，在匀浆中加SDS溶液，离心，收集离心上清液并对PBS透析去除游离的生物素，采用单体亲和素亲和层析柱收集肿瘤血管内皮细胞膜蛋白，利用该蛋白诱导抗肿瘤免疫，对诱导的细胞免疫与体液免疫效果进行测量。
2.权利要求1所述的方法在制备抗肿瘤药物中的应用。
说明书 :
一种诱导抗肿瘤免疫的方法及其在制药中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种诱导抗肿瘤免疫的方法，本发明还涉及该方法在制药中的应用。
背景技术
[0002] 随着基因转移技术的发展[1，2]，人们发现了癌基因的存在[3]，这为我们阐明了肿瘤来源于正常细胞但又不同于正常细胞的关系。肿瘤的发生包含许多级联事件，比如无限增[4]殖、持续的血管生成和组织侵入等 。肿瘤细胞通常表达肿瘤特异性抗原或是肿瘤相关抗原，这构成了宿主免疫系统攻击的标靶。抗体可以通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒活性和补体依赖的细胞毒活性攻击肿瘤。而免疫细胞，例如自然杀伤细胞和细胞毒T细胞则可以通过细胞间相互作用裂解肿瘤细胞。同时，T辅助细胞分泌的细胞因子可以调节上述反应。尽管机体的免疫系统对细胞的异常进行着严密的监控，但是肿瘤的发生和生长并不能被完全禁止。一系列的机理已经被提出来解释免疫监视的失败，比如，肿瘤抗原的丢失，主[5，6，7，8]
要组织相容性分子和共刺激分子表达的下调，抑制性细胞因子的过量表达等等 。经过一个世纪的努力，科学家们在不断的尝试弥补肿瘤患者免疫系统的漏洞。 [0003] 自从William Cloey第一次利用大肠杆菌裂解物成功地在肿瘤患者身上诱导了系[9]
统性的抗肿瘤免疫以后，许多策略被发展出来唤醒癌症患者的免疫系统 。在对Coley毒素作用机理了解的基础之上，淋巴因子被引入肿瘤治疗，其中IL-2展现了针对肿瘤的突出[10，11，12]
疗效，尽管它存在着剂量相关的毒性 。肿瘤裂解物也被用来尝试诱导抗肿瘤活性，[13，14]
并展现出了令人鼓舞的结果 。它包含了肿瘤细胞所有的抗原，并且可以引起多克隆反应。但是，由于在裂解物中肿瘤抗原的含量有限，因此所引起的免疫反应并不强烈。用射线[15，16，
照射过的肿瘤细胞是另一种提供所有肿瘤抗原的方式，它可以提供全部的肿瘤抗原库
17]
。但是，尽管处理过的肿瘤细胞可以在细胞膜上递呈抗原并诱导细胞免疫，但是由辐射引[18，19，20，21]
起的细胞完整性和细胞膜流动性的损失会减少肿瘤细胞疫苗的免疫原性 。在此基础上，利用基因工程令肿瘤细胞表达细胞因子和共刺激分子改善肿 瘤细胞免疫原性也[22，23，24，25]
被尝试 。在肿瘤抗原鉴定工作取得突破进展的基础上，利用肿瘤相关抗原和肿瘤[26，27，28]
特异性抗原制备的肿瘤疫苗的方式也被尝试 。一系列的肿瘤抗原，比如黑色素瘤的MART-1，gp100和TRP2等被陆续鉴定出来。作为最强大的抗原递呈细胞，树突细胞近年来成为被关注的焦点。由于树突细胞表面表达大量的MHC分子和共刺激分子，用肿瘤抗原肽刺激树突细胞、向树突细胞中转染肿瘤抗原cDNA或是将树突细胞与肿瘤细胞融合制成的[29，30，31]
疫苗都可以激发抗肿瘤免疫 。但是，我们应当看到的是树突细胞的制备和树突细胞与肿瘤细胞融合疫苗的制备仍然离临床应用有一段距离。
要组织相容性分子和共刺激分子表达的下调，抑制性细胞因子的过量表达等等 。经过一个世纪的努力，科学家们在不断的尝试弥补肿瘤患者免疫系统的漏洞。 [0003] 自从William Cloey第一次利用大肠杆菌裂解物成功地在肿瘤患者身上诱导了系[9]
统性的抗肿瘤免疫以后，许多策略被发展出来唤醒癌症患者的免疫系统 。在对Coley毒素作用机理了解的基础之上，淋巴因子被引入肿瘤治疗，其中IL-2展现了针对肿瘤的突出[10，11，12]
疗效，尽管它存在着剂量相关的毒性 。肿瘤裂解物也被用来尝试诱导抗肿瘤活性，[13，14]
并展现出了令人鼓舞的结果 。它包含了肿瘤细胞所有的抗原，并且可以引起多克隆反应。但是，由于在裂解物中肿瘤抗原的含量有限，因此所引起的免疫反应并不强烈。用射线[15，16，
照射过的肿瘤细胞是另一种提供所有肿瘤抗原的方式，它可以提供全部的肿瘤抗原库
17]
。但是，尽管处理过的肿瘤细胞可以在细胞膜上递呈抗原并诱导细胞免疫，但是由辐射引[18，19，20，21]
起的细胞完整性和细胞膜流动性的损失会减少肿瘤细胞疫苗的免疫原性 。在此基础上，利用基因工程令肿瘤细胞表达细胞因子和共刺激分子改善肿 瘤细胞免疫原性也[22，23，24，25]
被尝试 。在肿瘤抗原鉴定工作取得突破进展的基础上，利用肿瘤相关抗原和肿瘤[26，27，28]
特异性抗原制备的肿瘤疫苗的方式也被尝试 。一系列的肿瘤抗原，比如黑色素瘤的MART-1，gp100和TRP2等被陆续鉴定出来。作为最强大的抗原递呈细胞，树突细胞近年来成为被关注的焦点。由于树突细胞表面表达大量的MHC分子和共刺激分子，用肿瘤抗原肽刺激树突细胞、向树突细胞中转染肿瘤抗原cDNA或是将树突细胞与肿瘤细胞融合制成的[29，30，31]
疫苗都可以激发抗肿瘤免疫 。但是，我们应当看到的是树突细胞的制备和树突细胞与肿瘤细胞融合疫苗的制备仍然离临床应用有一段距离。
[0004] 利用活肿瘤细胞诱导免疫反应已经在不同的肿瘤细胞系中进行了尝试[32，33，34]。[33]
GM-CSF在其它抗肿瘤免疫方式的增强作用也已经被探索 。
GM-CSF在其它抗肿瘤免疫方式的增强作用也已经被探索 。
[0005] 肿瘤组织的生长需要消耗大量营养，这些营养的运输又需要血管的支持，这使得肿瘤具有血管依赖性。针对肿瘤血管的抗肿瘤研究也是攻克肿瘤的方向之一。该方法具有以下优点：(1)血管是药物很容易到达的作用靶点；(2)杀伤肿瘤血管可以间接的杀伤更多数量的肿瘤细胞；(3)相对于不同肿瘤细胞间的差异，肿瘤血管有较高的同源性，针对肿瘤血管的治疗可以适用于多个肿瘤类型；(4)针对肿瘤血管内皮细胞的免疫可以导致肿瘤血管的栓塞，从而使肿瘤细胞失去营养支持。目前已有采用固定后的原代脐静脉血管内皮细[41，42]胞诱导抗肿瘤免疫 ，但没有利用活原代脐静脉血管内皮细胞和肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白提取物诱导抗肿瘤免疫的方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的是针对上述问题提供一种利用活细胞、细胞冻干粉、活原代脐静脉血管内皮细胞或肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白提取物诱导抗肿瘤免疫的方法。 [0007] 本发明另一个目的是提供上述方法在制备抗肿瘤药中的应用。
[0008] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
[0009] 一种诱导抗肿瘤免疫的方法，该方法是利用103～104剂量活骨髓瘤FO细胞诱导抗肿瘤免疫；或者，利用GM-CSF转染的骨髓瘤FO细胞冻干粉诱导抗肿瘤免疫；或者，利用原代人脐静脉血管内皮细胞诱导抗肿瘤免疫；或者，利用肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白提取物诱导抗肿瘤免疫的方法。
[0010] 所述的方法，其中利用103～104数量级的活骨髓瘤FO细胞诱导抗肿瘤免疫的方法的步骤是：
[0011] a.培养活骨髓瘤FO细胞；
[0012] b.通过最大安全剂量的试验来保留其免疫原性并降低致瘤性，
[0013] c.采取确定的最大安全剂量诱导抗肿瘤免疫，
[0014] d.对其所诱导的体液免疫与细胞免疫效果进行测量。
[0015] 所述的方法，其中利用GM-CSF转染的骨髓瘤冻干粉诱导抗肿瘤免疫的方法，包括通过利用重组GM-CSF基因的腺病毒制备分泌GM-CSF的骨髓瘤，该细胞直接冻干为冻干粉，利用该冻干粉诱导抗肿瘤免疫，对所诱导的体液免疫与细胞免疫效果进行测量。 [0016] 所述的方法，其中利用活原代脐静脉血管内皮细胞诱导抗肿瘤免疫的方法包括活原代脐静脉血管内皮细胞的制备，利用该细胞诱导抗肿瘤免疫，对所诱导的细胞免疫与体液免疫效果进行测量。
[0017] 所述的方法，其中利用肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白提取物诱导抗肿瘤免疫的方法，包括利用生物素标记肿瘤血管内皮细胞，将肿瘤血管内皮细胞破碎匀浆，采用单体亲和素亲和层析柱收集肿瘤血管内皮细胞膜蛋白，利用该蛋白诱导抗肿瘤免疫，对诱导的细胞免疫与体液免疫效果进行测量。
[0018] 上述任一方法在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 1.本发明第一次提出了采用低剂量(103-104)活骨髓瘤FO细胞诱导自身抗肿瘤免疫，且活骨髓瘤FO细胞与树突-骨髓瘤融合细胞均显著地提高了小鼠的生存率。因为没有诸如抗原递呈细胞、细胞因子、共刺激分子等外来调节因素涉及，所以该保护性反应展现的是自体抗肿瘤机制。我们进一步的实验证明了供体免疫小鼠的淋巴细胞在过继免疫实验中可以抑制骨髓瘤的生长，而血清则未见明显效果。同时，体外CTL实验也证明了免疫小鼠的T细胞具有裂解骨髓瘤的能力。在免疫小鼠T细胞体外激活时，其分泌的IFN-γ也上升了10倍之多，表明细胞免疫在抑制肿瘤生长过程中起着关键作用。本发明通过低剂量活骨髓瘤诱导了强大的细胞免疫，并且该免疫反应可以充分的预防和抑制骨髓瘤生长。 [0021] 2.与前人发现树突肿瘤融合细胞疫苗没有致瘤性不一致的是[30]，本发明发现
6
BALB/c小鼠注射10 树突-骨髓瘤FO细胞可以导致小鼠肿瘤生长。虽然树突-骨髓瘤融合疫苗的致瘤性可通过照射γ射线得到了抑制，但是其所激发的保护性免疫也有所减弱。
为了避免肿瘤发生并能够达到较好的抗肿瘤免疫效果，本发明提供了活骨髓瘤FO细胞和树突-骨髓瘤融合细胞的安全注射剂量。
6
BALB/c小鼠注射10 树突-骨髓瘤FO细胞可以导致小鼠肿瘤生长。虽然树突-骨髓瘤融合疫苗的致瘤性可通过照射γ射线得到了抑制，但是其所激发的保护性免疫也有所减弱。
为了避免肿瘤发生并能够达到较好的抗肿瘤免疫效果，本发明提供了活骨髓瘤FO细胞和树突-骨髓瘤融合细胞的安全注射剂量。
[0022] 3.由于肿瘤细胞的免疫原性很差，所以将机体的免疫耐受转变为保护性的免疫反应 存在着一定难度。本发明则展示了活的骨髓瘤FO细胞诱导出与活树突-骨髓瘤融合细胞一样强大的抗肿瘤免疫。这是由于骨髓瘤FO细胞保留了部分免疫原性并减少了部分致瘤性所致。首先，作为骨髓瘤特殊性之一，免疫球蛋白被表达于细胞表面，其互补决定区是[35，36]宿主攻击的绝佳标靶 。其次，骨髓瘤FO细胞衍生于骨髓细胞，这是一群高表达共刺激[37，38]
分子的细胞群，骨髓瘤FO细胞也保留了表达ICAM-1的能力 。第三，骨髓瘤FO细胞具[39，40]
有异质性，并且只有其中一小部分具有强烈的致瘤性 。因此，强致瘤性肿瘤的移植可以通过降低骨髓瘤的注射剂量来避免。我们的实验证明了骨髓瘤的致瘤性在低剂量注射时有所下降。因此，本发明从免疫原性的保留和致瘤性的降低两方面使得利用低剂量骨髓瘤诱导保护性的免疫反应成为可能。
分子的细胞群，骨髓瘤FO细胞也保留了表达ICAM-1的能力 。第三，骨髓瘤FO细胞具[39，40]
有异质性，并且只有其中一小部分具有强烈的致瘤性 。因此，强致瘤性肿瘤的移植可以通过降低骨髓瘤的注射剂量来避免。我们的实验证明了骨髓瘤的致瘤性在低剂量注射时有所下降。因此，本发明从免疫原性的保留和致瘤性的降低两方面使得利用低剂量骨髓瘤诱导保护性的免疫反应成为可能。
[0023] 4.本发明采用直接冻干的方法制备肿瘤裂解物，与传统的制备方法有所不同。经典的肿瘤裂解物是将肿瘤细胞机械破碎或反复冻融再冻干获得，其蛋白抗原会因降解为小分子而导致免疫原性下降。但是本文所采用的直接冻干的方法，不但避免了这种风险而且还保持了蛋白质相互交联的结构，有利于更好的激活宿主的免疫系统。本发明采用转染GM-CSF的骨髓瘤FO细胞冻干粉免疫小鼠，产生了较好的抗肿瘤效果，并证明针对骨髓瘤的抗体在其中发挥了关键作用。
[0024] 5.在发现肿瘤的血管生成在肿瘤的发展中起着重要作用后，包括单克隆抗体在内的多种血管生成抑制因子被用于抑制肿瘤的生长和转移。但是，诱导针对血管内皮细胞的细胞免疫反应的方案则少见报导。前人采用3％多聚甲醛固定的血管内皮细胞诱导了针对[41]肿瘤血管的体液免疫，并取得了一定的疗效 。也有科研工作者利用0.025％戊二醛固定[42]
的血管内皮细胞诱导抗肿瘤免疫，发现细胞免疫也被激活 。这样的差别可能是由于固定带来的免疫原性及细胞活性的变化引起的。本发明所描述的利用活血管内皮细胞诱导的抗肿瘤免疫中，细胞免疫与体液免疫均被激活。
的血管内皮细胞诱导抗肿瘤免疫，发现细胞免疫也被激活 。这样的差别可能是由于固定带来的免疫原性及细胞活性的变化引起的。本发明所描述的利用活血管内皮细胞诱导的抗肿瘤免疫中，细胞免疫与体液免疫均被激活。
[0025] 6.本发明提供了利用肿瘤血管膜表面蛋白诱导抗肿瘤免疫的方法。本方案不涉及细胞的培养，周期更短。相对于全细胞蛋白，膜表面蛋白中可诱导抗肿瘤免疫的有效抗原含量更高，效果更强。此外，采用细胞膜蛋白提取物相对于采用细胞本身具有更高的安全性。 附图说明
[0026] 图1树突细胞的表型
[0027] 在无血清RPMI1640的环境中贴壁的小鼠单核细胞在含有10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的培养基中培养4天，并分化为树突细胞。其形态表现出明显的树状突起。 本图的原始放大倍数为200倍。
[0028] 图2树突细胞表面分子的表达情况
[0029] 树突细胞收获以后，分别与PE(藻红素)偶联的抗ICAM-1和抗B7-1单抗以及FITC(荧光素)标记的抗B7-2和抗MHC-II单抗于室温保温1h。所有的样品用PBS洗涤后，用流式细胞仪检测荧光。结果表明，树突细胞表面的共刺激分子和MHC-II分子皆大量表达。
[0030] 图3树突-骨髓瘤融合细胞表面分子的表达情况
[0031] 树突-骨髓瘤融合细胞收获以后，分别与PE偶联的抗ICAM-1和抗B7-1单抗以及FITC标记的抗B7-2和抗MHC-II单抗于室温保温1h。所有的样品用PBS洗涤后，用流式细胞仪检测荧光。结果表明，与树突细胞相似，树突-骨髓瘤融合细胞表面的共刺激分子和MHC-II分子均大量表达。
[0032] 图4转染GM-CSF的骨髓瘤FO细胞
[0033] 用无血清RPMI1640稀释10倍的重组GM-CSF腺病毒悬液孵育细胞。37℃培养1小时后，分别加入小牛血清和无血清RPMI1640，调整血清浓度至10％，并于孵箱培养24小时。收集转染和未转染的骨髓瘤FO细胞，用2％多聚甲醛固定15分钟，再用含0.5％Triton6
X-100及0.5％BSA的PBS渗透细胞膜。用PE偶联的抗小鼠GM-CSF的抗体(0.5μg/10 个细胞)室温染色1小时并在荧光显微镜下观察。(A、转染骨髓瘤FO细胞可见光照片；B、未转染骨髓瘤FO细胞可见光照片；C、转染骨髓瘤FO细胞荧光照片；D、未转染骨髓瘤FO细胞荧光照片。)
X-100及0.5％BSA的PBS渗透细胞膜。用PE偶联的抗小鼠GM-CSF的抗体(0.5μg/10 个细胞)室温染色1小时并在荧光显微镜下观察。(A、转染骨髓瘤FO细胞可见光照片；B、未转染骨髓瘤FO细胞可见光照片；C、转染骨髓瘤FO细胞荧光照片；D、未转染骨髓瘤FO细胞荧光照片。)
[0034] 图5大鼠肺血管内皮的生物素标记
[0035] 生物素标记和未标记的大鼠肺用HRP-Streptavidin染色，用苏木精复染，以检测生物素标记情况。A：生物素标记肺。大血管(粗箭头所示)和肺泡毛细血管(细箭头所示)的内皮膜蛋白因为被生物素标记而呈阳性。B：在生物素标记肺中，支气管(▲所示)因为未被生物素标记而呈阴性，而毛细血管呈阳性(细箭头所示)。C：未经生物素标记的大鼠肺呈阴性。Scale bar：100μm。
[0036] 图6生物素标记的内皮膜蛋白的分离纯化
[0037] EP指单价亲和素亲和柱的洗脱蛋白(Eluted Proteins)；LH指肺匀浆液蛋白(LungHomogenate)。两个电泳道上样等量的蛋白质。A：银染的聚丙烯酰胺凝胶。两个泳道显示了不同的蛋白质条带。有些蛋白质在EP中富集(用 表示)，而有些蛋白质在EP中减少或者消失(用 表示)。B：用HRP-Streptavidin检测的免疫印迹。尽管两个泳道上样了 等量的蛋白质，但是EP所含的生物素标记蛋白是LH的10倍以上。说明通过亲和层析，生物素标记被有效分离纯化了。
[0038] 图7低剂量活骨髓瘤FO细胞对骨髓瘤的预防效果
[0039] BALB/c小鼠分别用103活骨髓瘤、104活树突-骨髓瘤融合细胞和106γ射线照射的树突-骨髓瘤融合细胞免疫，每组5只。每两周免疫一次，共免疫三次。在末次免疫后一6
周接种10 骨髓瘤并每天观测肿瘤生长情况，直至60天。结果表明，全部对照小鼠长出了肿瘤，并于44天内全部死亡。相比之下，免疫组小鼠的生存率有不同程度的提高。其中，低剂量活骨髓瘤和树突-骨髓瘤融合细胞避免了80％的小鼠肿瘤发生，而照射处理的树突-骨髓瘤融合细胞只保护了60％的小鼠不生成肿瘤。
周接种10 骨髓瘤并每天观测肿瘤生长情况，直至60天。结果表明，全部对照小鼠长出了肿瘤，并于44天内全部死亡。相比之下，免疫组小鼠的生存率有不同程度的提高。其中，低剂量活骨髓瘤和树突-骨髓瘤融合细胞避免了80％的小鼠肿瘤发生，而照射处理的树突-骨髓瘤融合细胞只保护了60％的小鼠不生成肿瘤。
[0040] 图8低剂量活骨髓瘤针对异源肿瘤的预防效果
[0041] 用103骨髓瘤FO细胞免疫C57BL/6小鼠，每两周免疫一次，共免疫三次，每组5只。6
在末次免疫后一周接种10LLC肿瘤，并每天观测肿瘤生长情况直至小鼠全部死亡。结果表明，与对照组相比，免疫组小鼠的生存率及生存时间均无显著差异。
在末次免疫后一周接种10LLC肿瘤，并每天观测肿瘤生长情况直至小鼠全部死亡。结果表明，与对照组相比，免疫组小鼠的生存率及生存时间均无显著差异。
[0042] 图9活血管内皮细胞对骨髓瘤和LLC的预防免疫效果
[0043] C57BL/6J与BALB/c小鼠每周一次连续4周接受106活血管内皮细胞免疫后，分别6
于末次免疫一周后接种10LLC(A)或FO(B)肿瘤细胞(n＝5)。肿瘤的生长状况被持续观测一个月。“*”表示两组肿瘤体积间有显著差异(P＜0.05)。
于末次免疫一周后接种10LLC(A)或FO(B)肿瘤细胞(n＝5)。肿瘤的生长状况被持续观测一个月。“*”表示两组肿瘤体积间有显著差异(P＜0.05)。
[0044] 图10活血管内皮细胞免疫延长肿瘤切除小鼠的寿命
[0045] 接种106LLC肿瘤细胞的C57BL/6J小鼠在切除肿瘤后每周一次连续3次免疫活血管内皮细胞，其肿瘤大小(A)和生存时间(B)被观测。“*”表示两组之间的生存时间存在显著差异(P＜0.05)。
[0046] 图11肿瘤血管膜表面蛋白诱导的抗肿瘤免疫效果
[0047] 6-8周龄的雄性C56BL/6J小鼠用于肿瘤免疫预防实验。免疫组5只，每次免疫使用纯化的肿瘤肺血管内皮膜蛋白100μg和等体积的弗氏完全佐剂混合免疫；对照组5只，注射等体积PBS。两组小鼠均腹腔注射，共免疫4次。末次免疫后第七天给两组小鼠皮下植5
入LLC肿瘤细胞，均为5×10 个细胞/只。记录肿瘤小鼠生存率。
入LLC肿瘤细胞，均为5×10 个细胞/只。记录肿瘤小鼠生存率。
[0048] 图12活血管内皮细胞免疫血清对血管内皮细胞的生长抑制
[0049] 梯度浓度(10μl、20μl、30μl)的活血管内皮细胞免疫小鼠的血清被加入血管内皮细胞和SPC-A-1的培养上清中。结果表明，血管内皮细胞的生长收到抑制，而SPC-A-1的生长则未受影响。
[0050] 图13低剂量活骨髓瘤FO细胞过继免疫实验
[0051] 供体BALB/c小鼠接受103骨髓瘤FO细胞免疫，每两周免疫一次，共免疫三次，并6
于末次免疫后一周提取淋巴细胞和制备血清。受体小鼠在接种10 骨髓瘤FO细胞后一周
7
于尾静脉分别注射免疫小鼠的100μl血清或7×10 淋巴细胞。实验结果表明，骨髓瘤的生长受到了淋巴细胞的抑制，而血清则未见明显效果。
于末次免疫后一周提取淋巴细胞和制备血清。受体小鼠在接种10 骨髓瘤FO细胞后一周
7
于尾静脉分别注射免疫小鼠的100μl血清或7×10 淋巴细胞。实验结果表明，骨髓瘤的生长受到了淋巴细胞的抑制，而血清则未见明显效果。
[0052] 图14活血管内皮细胞过继免疫实验
[0053] 将活血管内皮细胞免疫小鼠的血清和T淋巴细胞分别注射于接种106SPC-A-1的6
nude小鼠及接种10FO的BALB/c小鼠，肿瘤生长情况被观测。结果表明，免疫小鼠的血清和T淋巴细胞均表现出抗肿瘤活性。“*”表示不同组间小鼠肿瘤的大小具有显著性差异(P＜0.05)。
nude小鼠及接种10FO的BALB/c小鼠，肿瘤生长情况被观测。结果表明，免疫小鼠的血清和T淋巴细胞均表现出抗肿瘤活性。“*”表示不同组间小鼠肿瘤的大小具有显著性差异(P＜0.05)。
[0054] 图15活血管内皮细胞免疫诱导肿瘤坏死
[0055] 接种106FO细胞的肿瘤小鼠在接受注射活血管内皮细胞免疫小鼠的T淋巴细胞后，其肿瘤组织被制成切片观测。结果表明，与注射PBS的肿瘤小鼠切片相比，注射T淋巴细胞的小鼠肿瘤组织中出现出血(箭头)、坏死(大箭头)和炎症浸润(小箭头)的现象。 [0056] 图16肿瘤冻干粉疫苗预防免疫模型生存曲线
[0057] 收获未转染与转染的骨髓瘤FO细胞，用PBS洗涤三次，计数，离心去上清并冻干。6
将冻干粉用PBS溶解，与弗氏完全佐剂1∶1混匀。每组含5只小鼠，每只皮下注射1×10
6
个细胞的冻干粉。小鼠每两周免疫一次，共免疫两次。末次免疫后一周背部皮下接种1×10个骨髓瘤FO细胞，持续观察肿瘤生长55天。
将冻干粉用PBS溶解，与弗氏完全佐剂1∶1混匀。每组含5只小鼠，每只皮下注射1×10
6
个细胞的冻干粉。小鼠每两周免疫一次，共免疫两次。末次免疫后一周背部皮下接种1×10个骨髓瘤FO细胞，持续观察肿瘤生长55天。
[0058] 图17低剂量活骨髓瘤FO细胞免疫小鼠血清抗体滴度检测
[0059] 将骨髓瘤FO细胞分别与1∶100稀释的骨髓瘤FO(A)或树突-骨髓瘤融合细胞(B)免疫的小鼠血清保温，之后再与FITC标记的兔抗小鼠二抗保温。洗涤后，于流式细胞仪检测样品荧光。结果表明，与对照组小鼠血清相比，免疫小鼠血清对骨髓瘤的抗体滴度无显著差异。
[0060] 图18 T细胞纯度鉴定
[0061] 采用经典尼龙毛柱法从小鼠淋巴细胞中提取T细胞。将重悬于含有5％小牛血清RPMI1640培养基的淋巴细胞通过37℃预热的尼龙毛柱，收集穿过的细胞即为T淋巴细胞。将T细胞与其特异性的PE偶联的抗小鼠CD3抗体保温，并用流式细胞仪检测荧光计算T细胞纯度。结果表明，T细胞纯度达到了78.46±8.01％。
[0062] 图19低剂量活骨髓瘤FO细胞免疫小鼠T细胞CTL功能检测
[0063] 采用尼龙毛柱法从免疫小鼠(A、低剂量骨髓瘤，B、树突-骨髓瘤融合细胞)脾脏中提取的T细胞按照5∶1的比例与50μg/ml丝裂霉素C预处理的骨髓瘤FO细胞或树突-骨髓瘤融合细胞共同孵育72小时。T细胞被收获后与目标骨髓瘤FO细胞分别以图示的效靶比孵育6小时。裂解细胞释放在上清中的乳酸脱氢酶含量被测定并计算出裂解百分比。结果表明，免疫小鼠的T淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤FO细胞的能力，并与效靶比呈正相关。
[0064] 图20低剂量活骨髓瘤FO细胞诱导分泌的细胞因子检测
[0065] 提纯的T细胞与50μg/ml丝裂霉素C预处理的骨髓瘤FO细胞或树突-骨髓瘤融合细胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/mlIL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培养基中孵育72小时，其上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夹心ELISA试剂盒测量。结果表明，与细胞免疫相关的Th1类细胞因子IFN-γ的表达有大幅上升，而与体液免疫相关的Th2类细胞因子IL-4的表达则未见明显变化。
[0066] 图21转染GM-CSF骨髓瘤冻干粉免疫小鼠血清抗体的检测
[0067] 将末次免疫后一周的小鼠取血，制备血清。将骨髓瘤FO细胞分别与1∶100稀释的转染的骨髓瘤冻干粉免疫小鼠血清及对照组小鼠血清保温。之后与PE标记的抗小鼠二抗保温，并用流式细胞仪检测荧光。
[0068] 图22转染GM-CSF的骨髓瘤冻干粉诱导的CTL功能检测
[0069] 末次免疫后一周取小鼠脾脏细胞，并用尼龙毛柱法提纯T细胞作为效应细胞。将骨髓瘤FO细胞与50μg/ml丝裂霉素C在37℃保温1小时，再与T细胞以1∶10的比例在含有10％胎牛血清、50U/mlIL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培养基中共同孵育3天进行体外激活。之后，将T细胞与骨髓瘤FO细胞按照效靶比40∶1、20∶1、10∶1、
5∶1的比例保温4小时，按照试剂盒说明书对其上清释放的LDH含量进行测定并计算杀伤率。
5∶1的比例保温4小时，按照试剂盒说明书对其上清释放的LDH含量进行测定并计算杀伤率。
[0070] 图23活血管内皮细胞诱导的CTL功能检测
[0071] 活血管内皮细胞免疫小鼠的T淋巴细胞被提取并在体外激活后分别与血管内皮细胞(A)和骨髓瘤FO细胞(B)培养。结果表明，该T细胞具有裂解血管内皮细胞的能力，并呈现T细胞剂量相关性，但不具备裂解骨髓瘤FO细胞的能力。
[0072] 图24活血管内皮细胞诱导分泌的细胞因子检测
[0073] 活血管内皮细胞免疫小鼠的血清(A)及其T淋巴细胞体外激活释放的上清(B)被用来 检测细胞因子的释放。结果表明，其血清和细胞上清中的IFN-γ和IL-4均显著的升高。这说明活血管内皮细胞免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫均被激活。
具体实施方式
[0074] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
[0075] 一般性说明：
[0076] 实施例中未注明具体条件的实验方法，均为本领域普通技术人员公知的方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行。
[0077] 本申请中提及的生物材料及试剂均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的生物材料和试剂来代替。 [0078] 发明材料
[0079] 1.小鼠品系：6至8周雌性BALB/c、C57BL/6和Nu/Nu BALB/c小鼠，购自上海实验动物中心。
[0080] 2.细胞系及其培养：BALB/c同源的骨髓瘤细胞系FO和C57BL/6同源的肺癌细胞系LLC均购自ATCC(美国模式培养物收集中心)。人肺癌细胞SPC-A-1购于上海细胞库。FO、LLC及SPC-A-1细胞均使用含有10％热灭活新生牛血清(GIBCO，Grand Island，NY)、
2mM L-谷胺酰胺(Hyclone，Logan，Utah)、2mg/ml碳酸氢钠(Amersco，Cleveland，OH)、
25mM HEPEs(Promega，Madison，WI)、100U/ml青霉素(华北制药集团公司，石家庄，中国)和100μg/ml链霉素(鲁抗制药，济宁，中国)的RPMI1640培养基培养。新提取的原代T细胞则培养于含有10％热灭活的胎牛血清、50U/ml重组人白介素-2(北京四环制药，北京，中国)，5μg/ml伴刀豆球蛋白(Promega，Madison，WI)、2mML-谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氢钠、25mM HEPEs、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中。人原代脐静脉血管内皮细胞培养于含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)90μg/ml肝素钠(Sigma，St.Louis，MO)、2ng/ml bFGF(R&D，USA)、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素的IMDM培养液中。
2mM L-谷胺酰胺(Hyclone，Logan，Utah)、2mg/ml碳酸氢钠(Amersco，Cleveland，OH)、
25mM HEPEs(Promega，Madison，WI)、100U/ml青霉素(华北制药集团公司，石家庄，中国)和100μg/ml链霉素(鲁抗制药，济宁，中国)的RPMI1640培养基培养。新提取的原代T细胞则培养于含有10％热灭活的胎牛血清、50U/ml重组人白介素-2(北京四环制药，北京，中国)，5μg/ml伴刀豆球蛋白(Promega，Madison，WI)、2mML-谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氢钠、25mM HEPEs、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中。人原代脐静脉血管内皮细胞培养于含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)90μg/ml肝素钠(Sigma，St.Louis，MO)、2ng/ml bFGF(R&D，USA)、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素的IMDM培养液中。
[0081] 主要试剂：重组GM-CSF的腺病毒Adv-1/GM-CSF(购自南京大学分子医学研究所)；定量GM-CSF的夹心ELISA所用捕捉抗体和检测抗体均购于biolegend公司，HRP偶联的亲和素购于Pharmingen公司。显色底物TMB购于KPL公司。藻红素(PE)标记的抗小鼠GM-CSF抗体购于eBioscience公司。藻红素标记的抗ICAM-1和抗B7-1单抗以及荧光素(FITC)标记的抗B7-2单抗购于Pharmingen公司。荧光素标记的抗MHC-II单抗购于Southern Biotechnology公司。CTL实验所用CytoTox 96non radioactive cytotoxicity assay试剂盒购于Promega公司。检测IFN-γ和IL-4的夹心ELISA试剂盒购于Pharmingen公司。提纯T细胞所用尼龙毛购于Polysciences公司。
[0082] 3统计方法：统计学显著性差异用学生t检验计算。
[0083] 实施例1：低剂量活骨髓瘤FO细胞诱导抗肿瘤免疫
[0084] 1、疫苗的制备：
[0085] 1.1脾细胞衍生的树突细胞：小鼠脾脏中的红细胞采用溶于0.01M Tris-HCl的8.3g/ml的氯化铵溶液裂解。未裂解脾脏细胞培养于含有2mM谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氢钠、25mM HEPEs、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无血清RPMI1640中。在5％CO2孵箱中培养1小时后，未贴壁细胞被洗去。贴壁脾脏细胞则继续在含有10％胎牛血清、
2mM谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氢钠、25mM HEPEs、10ng/ml IL-4(PeproTech，UK)、10ng/ml GM-CSF(PeproTech，UK)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中培养，并分化为树突细胞。培养4天后，贴壁和松散贴壁的树突细胞通过轻轻吹打收获，细胞表面展现出典型的树状突起(见图1)。同时，一些共刺激分子，比如ICAM-1、B7-1、B7-2和MHC-II等的表达也急剧上调(见图2)。
2mM谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氢钠、25mM HEPEs、10ng/ml IL-4(PeproTech，UK)、10ng/ml GM-CSF(PeproTech，UK)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中培养，并分化为树突细胞。培养4天后，贴壁和松散贴壁的树突细胞通过轻轻吹打收获，细胞表面展现出典型的树状突起(见图1)。同时，一些共刺激分子，比如ICAM-1、B7-1、B7-2和MHC-II等的表达也急剧上调(见图2)。
[0086] 1.2细胞融合：树突细胞与骨髓瘤FO细胞的混合比例为1∶2.5。融合过程使用预热的50％(w/v)的聚乙二醇(Sigma)。
[0087] 1.3树突细胞和树突-骨髓瘤融合细胞表面抗原鉴定：树突细胞和采用PEG(聚乙二醇)制备的树突-骨髓瘤融合细胞在用PBS洗涤后，分别与藻红素(PE)偶联的抗ICAM-1(Pharmingen)和抗B7-1(Pharmingen)单抗以及荧光素(FITC)标记的抗B7-2(Pharmingen)和抗MHC-II(Southern Biotechnology，Alabama)单抗于室温保温1h。所有的样品用PBS洗涤后，用流式细胞仪(Becton Dickinson，Moutain View，CA)检测荧光。
[0088] 1.4融合细胞筛选：在洗涤之后，融合细胞被培养于含有10％特级胎牛血清(Hyclone)，2mM谷胺酰胺，25mM HEPEs，2mg/ml碳酸氢钠，10ng/ml GM-CSF，10ng/mlIL-4，5％(v/v)克隆因子(OriGen，Austin，Texas)，2％(v/v)HAT(氨基喋呤-胸苷-次黄嘌呤)(Sigma)，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中。由于树突细胞不能在体外无限增殖，HAT又限制了骨髓瘤FO细胞的生长，而树突-骨髓瘤融合细胞则不然，在该培养基培养一周后则获得单一的树突-骨髓瘤融合细胞。经流式细胞仪检测发现，树突-骨髓瘤融合细胞表面共刺激分子表达与树突细胞相似(见图3)。
[0089] 2活骨髓瘤FO细胞免疫最大安全剂量：骨髓瘤FO细胞与树突-骨髓瘤融合细胞在洗涤后重悬于无血清RPMI-1640培养基中。BALB/c小鼠注射骨髓瘤FO及树突-骨髓瘤融2 3 4 5 6
合细胞剂量梯度共设5组，每组5只，分别在背部皮下分别注射10、10、10、10 和10 个骨
6
髓瘤FO细胞。之后每天观察小鼠肿瘤生长状况，持续观察两周。结果显示小鼠接种10 树
6
突-骨髓瘤融合细胞和接种10 骨髓瘤FO细胞都可以导致肿瘤形成。为了确定疫苗的安全
3
剂量，我们在小鼠皮下接种了一系列的剂量。结果表明，在每只小鼠注射10 骨髓瘤FO细胞
4
和每只小鼠注射10 树突-骨髓瘤融合细胞的剂量组未见有肿瘤形成，但是在更高的剂量
3 4
组中都有肿瘤出现(见表1)。因此，每只小鼠接种10 活骨髓瘤FO细胞或10 活树突-骨髓瘤融合细胞被确定为免疫时采用的最大安全剂量。小鼠共免疫三次，每两周免疫一次。 [0090] 表1活细胞疫苗的最大安全剂量
合细胞剂量梯度共设5组，每组5只，分别在背部皮下分别注射10、10、10、10 和10 个骨
6
髓瘤FO细胞。之后每天观察小鼠肿瘤生长状况，持续观察两周。结果显示小鼠接种10 树
6
突-骨髓瘤融合细胞和接种10 骨髓瘤FO细胞都可以导致肿瘤形成。为了确定疫苗的安全
3
剂量，我们在小鼠皮下接种了一系列的剂量。结果表明，在每只小鼠注射10 骨髓瘤FO细胞
4
和每只小鼠注射10 树突-骨髓瘤融合细胞的剂量组未见有肿瘤形成，但是在更高的剂量
3 4
组中都有肿瘤出现(见表1)。因此，每只小鼠接种10 活骨髓瘤FO细胞或10 活树突-骨髓瘤融合细胞被确定为免疫时采用的最大安全剂量。小鼠共免疫三次，每两周免疫一次。 [0090] 表1活细胞疫苗的最大安全剂量
[0091]
[0092] a肿瘤发生率被表示为在整个组中肿瘤发生小鼠的数目。
[0093] b活树突-骨髓瘤融合细胞的最大安全剂量为每只小鼠注射104个细胞。 [0094] c活骨髓瘤融合细胞的最大安全剂量为每只小鼠注射103个细胞。 [0095] 3、疫苗抗肿瘤效果的评价：
[0096] 3.1活细胞预防免疫抗肿瘤模型：
[0097] 小鼠骨髓瘤FO模型：骨髓瘤FO细胞、树突-骨髓瘤融合细胞、经20Gyγ射线照射过的树突-骨髓瘤融合细胞被收获并分别重悬在无血清RPMI1640培养基中。雌性BALB/3 4 6
c小鼠分别被10 活骨髓瘤FO细胞、10 活树突-骨髓瘤融合细胞、10γ射线照射过的树突-骨髓瘤融合细胞免疫。细胞免疫一共进行三次，每两周免疫一次。在最后一次免疫后
6
一周皮下接种10 活骨髓瘤FO细胞。之后每天观察肿瘤生长状况，直到用RPMI1640培养
6
基免疫的对照组小鼠全部死亡，记录其生存率。在接种10 骨髓瘤FO细胞之后，对照组中全部小鼠都长出肿瘤并在44天内陆续死亡，而免疫组则表现出不同程度升高的生存率(见图7)。并且，活的骨髓瘤FO细胞和树突-骨髓瘤融合细胞比γ射线照射过的树突-骨髓瘤融合细胞更加有效。有80％经活细胞免疫的小鼠避免了肿瘤发生，而照射过的树突-骨髓瘤融合细胞只保护了60％的小鼠。同时，被保护的小鼠在其整个 寿命中保持了无肿瘤的状态。
c小鼠分别被10 活骨髓瘤FO细胞、10 活树突-骨髓瘤融合细胞、10γ射线照射过的树突-骨髓瘤融合细胞免疫。细胞免疫一共进行三次，每两周免疫一次。在最后一次免疫后
6
一周皮下接种10 活骨髓瘤FO细胞。之后每天观察肿瘤生长状况，直到用RPMI1640培养
6
基免疫的对照组小鼠全部死亡，记录其生存率。在接种10 骨髓瘤FO细胞之后，对照组中全部小鼠都长出肿瘤并在44天内陆续死亡，而免疫组则表现出不同程度升高的生存率(见图7)。并且，活的骨髓瘤FO细胞和树突-骨髓瘤融合细胞比γ射线照射过的树突-骨髓瘤融合细胞更加有效。有80％经活细胞免疫的小鼠避免了肿瘤发生，而照射过的树突-骨髓瘤融合细胞只保护了60％的小鼠。同时，被保护的小鼠在其整个 寿命中保持了无肿瘤的状态。
[0098] 小鼠肺肿瘤LLC模型：为了评估低剂量骨髓瘤诱导的免疫是否能够抵抗异源肿瘤，C57BL/6小鼠被用活骨髓瘤FO细胞免疫并接种LLC肿瘤细胞。收集骨髓瘤FO细胞重3
悬于无血清RPMI1640培养基中。雌性C57BL/6于背部皮下接种10 活骨髓瘤FO细胞进行免疫。骨髓瘤FO细胞每两周免疫一次，共免疫三次。在末次免疫一周后，给小鼠背部皮下
6
接种10LLC细胞。每天观测小鼠肿瘤生长情况直至全部小鼠死亡。没有明显证据表明该肿瘤受到了抑制(见图8)，这揭示着活骨髓瘤诱导的免疫可能是骨髓瘤特异性的。 [0099] 3.2活细胞过继免疫抑制肿瘤生长实验：
悬于无血清RPMI1640培养基中。雌性C57BL/6于背部皮下接种10 活骨髓瘤FO细胞进行免疫。骨髓瘤FO细胞每两周免疫一次，共免疫三次。在末次免疫一周后，给小鼠背部皮下
6
接种10LLC细胞。每天观测小鼠肿瘤生长情况直至全部小鼠死亡。没有明显证据表明该肿瘤受到了抑制(见图8)，这揭示着活骨髓瘤诱导的免疫可能是骨髓瘤特异性的。 [0099] 3.2活细胞过继免疫抑制肿瘤生长实验：
[0100] 活骨髓瘤免疫：BALB/c供体小鼠用103活骨髓瘤FO细胞免疫三次，每两周免疫6
一次。其淋巴细胞和血清在末次免疫后7天收获。受体小鼠则接种10 骨髓瘤FO细胞或
7
SPC-A-1细胞，并在接种后一周于尾静脉分别注射末次免疫后一周供体免疫小鼠的7×10脾细胞或100μl血清治疗。受体小鼠每三天注射一次，共注射4次。用游标卡尺测量肿瘤
2
长径和垂直径，其大小由下列公式计算：肿瘤体积＝0.5×肿瘤长径×肿瘤垂直径 ，持续观测直至所有对照组小鼠死亡为止。实验结果表明，活骨髓瘤FO细胞免疫的淋巴细胞有抑瘤活性，而血清则未见明显效果(见图13)；
一次。其淋巴细胞和血清在末次免疫后7天收获。受体小鼠则接种10 骨髓瘤FO细胞或
7
SPC-A-1细胞，并在接种后一周于尾静脉分别注射末次免疫后一周供体免疫小鼠的7×10脾细胞或100μl血清治疗。受体小鼠每三天注射一次，共注射4次。用游标卡尺测量肿瘤
2
长径和垂直径，其大小由下列公式计算：肿瘤体积＝0.5×肿瘤长径×肿瘤垂直径 ，持续观测直至所有对照组小鼠死亡为止。实验结果表明，活骨髓瘤FO细胞免疫的淋巴细胞有抑瘤活性，而血清则未见明显效果(见图13)；
[0101] 3.3免疫小鼠血清中抗体的检测：
[0102] 低剂量骨髓瘤免疫：将骨髓瘤FO细胞与1∶100稀释的低剂量活骨髓瘤免疫小鼠血清或对照小鼠血清保温，之后再与FITC标记的兔抗鼠二抗(Southern Biotechnology)保温。洗涤后，于流式细胞仪检测样品荧光。结果见其荧光强度与对照组血清结果相比无显著差异(见图17)。这说明免疫血清中针对骨髓瘤的抗体滴度不高。这些数据表明，经免疫致敏的淋巴细胞而非血清在抑制肿瘤生长的过程中发挥着主要的作用。 [0103] 3.4T细胞提取及纯度鉴定：采用经典尼龙毛柱法从小鼠淋巴细胞中提取T细胞。将重悬于5％小牛血清RPMI1640的淋巴细胞通过37℃预热的尼龙毛柱，收集穿过的细胞即为T淋巴细胞。将T细胞与PE偶联的抗小鼠CD3抗体保温，并用流式细胞仪检测荧光计算T细胞纯度。结果表明，T细胞的纯度达到了78.46±8.01％(见图18)。
[0104] 3.5CTL功能检测：利用尼龙毛柱从小鼠脾脏中提取的T细胞培养于24孔板中，并按照5∶1的比例与50μg/ml丝裂霉素C预处理的骨髓瘤FO或树突-骨髓瘤融合细胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培养基中共同孵育72小时。之后T细胞被收获并与目标骨髓瘤FO细胞以不同的效靶比在U形底96 孔板中孵育6小时。裂解细胞释放在上清中的乳酸脱氢酶(LDH)含量使用CytoTox 96cytotoxicity assay kit(Promega)测定。LDH特异性的释放百分比由下列公式计算：特异性释放百分比＝(实验组释放-T细胞自发释放-骨髓瘤自发释放)/(最大骨髓瘤释放-骨髓瘤自发释放)×100。结果证明，与对照组T细胞相比，提取自低剂量骨髓瘤或树突-骨髓瘤融合细胞免疫小鼠的T细胞具有裂解骨髓瘤的能力(见图19)。同时，裂解百分比也呈现出效靶比相关性。
[0105] 3.6细胞因子分析：提纯的T细胞与50μg/ml丝裂霉素C预处理的骨髓瘤FO细胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培养基中孵育72小时，T辅助细胞(Th)分泌于培养上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夹心ELISA试剂盒(BD Pharmingen)测量。结果表明，与对照组相比，IFN-γ的分泌量提高了10倍多，而IL-4则未见明显改变(见图20)。因为Th1细胞与Th2细胞分别特异性的分泌IFN-γ或IL-4等细胞因子，上述数据表明，作为细胞免疫反应的一部分，Th1相关细胞因子表达明显上升，而Th2相关的细胞因子则没有显著改变。
[0106] 实施例2：转染GM-CSF的骨髓瘤FO细胞诱导抗肿瘤免疫
[0107] 1、疫苗的制备：
[0108] 1.1将重组GM-CSF的腺病毒转染骨髓瘤FO细胞：用无血清RPMI-1640稀释10倍的重组GM-CSF腺病毒悬液孵育细胞。37℃培养1小时后，分别加入小牛血清和无血清RPMI-1640，调整血清浓度至10％，并于孵箱培养24小时。
[0109] 1.2转染效率及GM-CSF分泌量的测定：收集转染和未转染的骨髓瘤FO细胞，用2％(v/v)多聚甲醛固定15分钟，再用含0.5％(v/v)Triton X-100及0.5％(w/v)BSA的
6
PBS渗透细胞膜。用PE偶联的抗小鼠GM-CSF的抗体(0.5μg/10 个细胞)室温染色1小时并在荧光显微镜下观察。由图4可见，与可见光照片及未转染骨髓瘤照片比较，90％以上的骨髓瘤FO细胞被重组腺病毒转染。分泌的GM-CSF采用夹心ELISA法定量。用抗小鼠GM-CSF的捕获抗体(1μg/ml)铺板，用含1％BSA，0.1％Tween 20的PBS封闭，再依次与转染细胞上清、生物素标记的抗小鼠GM-CSF的检测抗体(2μg/ml)及偶联HRP的亲合素保温，并用TMB底物显色，于450nm检测。夹心ELISA测得转染后骨髓瘤FO细胞培养上清中
6
分泌GM-CSF的量为240ng/24小时/10 个细胞。
6
PBS渗透细胞膜。用PE偶联的抗小鼠GM-CSF的抗体(0.5μg/10 个细胞)室温染色1小时并在荧光显微镜下观察。由图4可见，与可见光照片及未转染骨髓瘤照片比较，90％以上的骨髓瘤FO细胞被重组腺病毒转染。分泌的GM-CSF采用夹心ELISA法定量。用抗小鼠GM-CSF的捕获抗体(1μg/ml)铺板，用含1％BSA，0.1％Tween 20的PBS封闭，再依次与转染细胞上清、生物素标记的抗小鼠GM-CSF的检测抗体(2μg/ml)及偶联HRP的亲合素保温，并用TMB底物显色，于450nm检测。夹心ELISA测得转染后骨髓瘤FO细胞培养上清中
6
分泌GM-CSF的量为240ng/24小时/10 个细胞。
[0110] 1.3肿瘤细胞冻干粉的制备：分别收获未转染与转染的骨髓瘤FO细胞，用PBS洗涤三次，计数，离心去上清并直接冻干。
[0111] 2、疫苗抗肿瘤效果的评价：
[0112] 2.1免疫小鼠血清中抗体的检测：
[0113] 转染GM-CSF的骨髓瘤冻干粉免疫：将骨髓瘤FO细胞与1∶100稀释的转染骨髓瘤冻干粉免疫小鼠血清或对照小鼠血清保温，之后再与FITC标记的兔抗鼠二抗(Southern Biotechnology)保温。洗涤后，于流式细胞仪检测样品荧光。结果见图21，与对照小鼠相比，免疫小鼠的血清中存在可识别骨髓瘤的抗体。
[0114] 2.2T细胞提取及纯度鉴定：采用经典尼龙毛柱法从小鼠淋巴细胞中提取T细胞。将重悬于5％小牛血清RPMI1640的淋巴细胞通过37℃预热的尼龙毛柱，收集穿过的细胞即为T淋巴细胞。将T细胞与PE偶联的抗小鼠CD3抗体保温，并用流式细胞仪检测荧光计算T细胞纯度。结果表明，T细胞的纯度达到了78.46±8.01％(见图18)。
[0115] 2.3CTL功能检测：利用尼龙毛柱从小鼠脾脏中提取的T细胞培养于24孔板中，并按照5∶1的比例与50μg/ml丝裂霉素C预处理的目标细胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培养基中共同孵育72小时。之后T细胞被收获并与目标骨髓瘤FO细胞以不同的效靶比在U形底96孔板中孵育6小时。裂解细胞释放在上清中的乳酸脱氢酶(LDH)含量使用CytoTox 96 cytotoxicity assay kit(Promega)测定。LDH特异性的释放百分比由下列公式计算：特异性释放百分比＝(实验组释放-T细胞自发释放-骨髓瘤自发释放)/(最大骨髓瘤释放-骨髓瘤自发释放)×100。由图22可见，小鼠经转染GM-CSF的骨髓瘤冻干粉免疫后，其T细胞裂解骨髓瘤的能力与对照小鼠无显著差异，未见针对骨髓瘤的细胞免疫。
[0116] 2.4冻干粉疫苗的体内抗瘤活性：本发明采用小鼠骨髓瘤预防免疫模型检测冻干粉疫苗的抗肿瘤活性。将冻干粉用PBS溶解，与弗氏完全佐剂1∶1混匀。对照组、骨髓瘤冻干粉组和转染骨髓瘤冻干粉组小鼠分别用PBS、骨髓瘤冻干粉或转染GM-CSF的骨髓瘤冻6
干粉免疫，每组含5只小鼠，每只皮下注射1×10 个细胞的冻干粉。小鼠每两周免疫一次，
6
共免疫两次。末次免疫后一周背部皮下接种1×10 个骨髓瘤FO细胞，持续观察肿瘤生长55天。由图16可见，未经免疫的5只BALB/c小鼠于接种肿瘤细胞后40天全部死亡。单独的骨髓瘤冻干粉免疫的5只BALB/c小鼠全部出现肿瘤，并于接种后第51天全部死亡。相比之下，转染GM-CSF的骨髓瘤冻干粉则抑制了3只BALB/c小鼠的肿瘤发生。这些数据表明，与对照组相比，单纯的骨髓瘤冻干粉没有显著的抑瘤效果，但转染GM-CSF的骨髓瘤冻干粉则可以预防肿瘤的发生。
干粉免疫，每组含5只小鼠，每只皮下注射1×10 个细胞的冻干粉。小鼠每两周免疫一次，
6
共免疫两次。末次免疫后一周背部皮下接种1×10 个骨髓瘤FO细胞，持续观察肿瘤生长55天。由图16可见，未经免疫的5只BALB/c小鼠于接种肿瘤细胞后40天全部死亡。单独的骨髓瘤冻干粉免疫的5只BALB/c小鼠全部出现肿瘤，并于接种后第51天全部死亡。相比之下，转染GM-CSF的骨髓瘤冻干粉则抑制了3只BALB/c小鼠的肿瘤发生。这些数据表明，与对照组相比，单纯的骨髓瘤冻干粉没有显著的抑瘤效果，但转染GM-CSF的骨髓瘤冻干粉则可以预防肿瘤的发生。
[0117] 实施例3：活原代脐静脉血管内皮细胞诱导抗肿瘤免疫
[0118] 1、疫苗的制备：
[0119] 1.1原代人血管内皮细胞的制备：我们根据Jaffe EA等人的分离血管内皮细胞的[43]方法进行制备 。新鲜的人脐静脉血管被II型胶原酶消化，得到的人脐静脉内皮细胞用含有10％FBS的IMDM培养基培养于1％明胶包被的培养皿中。
[0120] 2、疫苗抗肿瘤效果的评价：
[0121] 2.1活细胞预防免疫抗肿瘤模型：
[0122] 小鼠骨髓瘤FO模型：原代人脐静脉内皮细胞被收获并重悬在无血清RPMI1640培6
养基中。雌性BALB/c小鼠被10 原代人脐静脉内皮细胞免疫。每周免疫一次共免疫四次。
6
在最后一次免疫后一周皮下接种10 活骨髓瘤FO细胞。之后每天观察肿瘤生长状况，直到用RPMI 1640培养基免疫的对照组小鼠全部死亡，记录其生存率。
养基中。雌性BALB/c小鼠被10 原代人脐静脉内皮细胞免疫。每周免疫一次共免疫四次。
6
在最后一次免疫后一周皮下接种10 活骨髓瘤FO细胞。之后每天观察肿瘤生长状况，直到用RPMI 1640培养基免疫的对照组小鼠全部死亡，记录其生存率。
[0123] 小鼠肺肿瘤LLC模型：收集原代人脐静脉血管内皮细胞并重悬于无血清RPMI16406
培养基中。雌性C57BL/6于背部皮下接种10 原代人脐静脉内皮细胞进行免疫。每周免疫
6
一次共免疫四次。在末次免疫一周后，给小鼠背部皮下接种10LLC细胞。每天观测小鼠肿瘤生长情况直至全部小鼠死亡。
培养基中。雌性C57BL/6于背部皮下接种10 原代人脐静脉内皮细胞进行免疫。每周免疫
6
一次共免疫四次。在末次免疫一周后，给小鼠背部皮下接种10LLC细胞。每天观测小鼠肿瘤生长情况直至全部小鼠死亡。
[0124] 活血管内皮细胞对骨髓瘤及LLC肿瘤的预防免疫效果：活血管内皮细胞显著的减2 7
缓了骨髓瘤以及LLC肿瘤的生长(见图9)，同时，免疫10 到10 剂量的小鼠均未出现不良反应。
缓了骨髓瘤以及LLC肿瘤的生长(见图9)，同时，免疫10 到10 剂量的小鼠均未出现不良反应。
[0125] 2.2活血管内皮细胞免疫抑制黑色素瘤转移：6周龄C57BL/6小鼠被皮下接种5 3
5×10 LLC细胞。当肿瘤生长至800mm 后，小鼠被深度麻醉并切除肿瘤。并于肿瘤切除3
5
天后治疗组小鼠用5×10 个活血管内皮细胞免疫，每周免疫一次，连续免疫3周。对照组小鼠则用PBS代替。检测小鼠的生存状况。结果表明，小鼠的肿瘤转移并未被抑制，但生存周期被显著的延长。其生存周期从肿瘤接种后48.9天延长到59.5天，或是从肿瘤切除后
30.9天延长到41.5天(见图10)。
5×10 LLC细胞。当肿瘤生长至800mm 后，小鼠被深度麻醉并切除肿瘤。并于肿瘤切除3
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天后治疗组小鼠用5×10 个活血管内皮细胞免疫，每周免疫一次，连续免疫3周。对照组小鼠则用PBS代替。检测小鼠的生存状况。结果表明，小鼠的肿瘤转移并未被抑制，但生存周期被显著的延长。其生存周期从肿瘤接种后48.9天延长到59.5天，或是从肿瘤切除后
30.9天延长到41.5天(见图10)。
[0126] 2.3活细胞过继免疫实验：
[0127] 活血管内皮细胞免疫：BALB/c供体小鼠用106活血管内皮细胞免疫三次，每周免6
疫一次。其淋巴细胞和血清在末次免疫后7天收获。受体BALB/c小鼠接种10 骨髓瘤FO
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细胞，并在接种后一周尾静脉注射100μl血清或10T淋巴细胞治疗。受体小鼠每三天注射一次，共注射4次。每两天观测一次小鼠肿瘤生长情况，直至所有对照组小鼠开始死亡为
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止。小鼠的肿瘤组织被制为切片观察。在nude小鼠中接种10SPC-A-1细胞， 于接种一周后连续两周每周3次注射免疫小鼠的血清，观测肿瘤的生长情况。实验结果表明，活血管内皮细胞免疫的淋巴细胞与血清则均有抑瘤活性(见图14)。同时，活血管内皮细胞过继免疫免疫治疗的小鼠肿瘤切片也可见严重的出血、坏死和炎症现象(见图15)。活血管内皮细胞免疫小鼠的血清可以有效的抑制血管内皮细胞的生长，而对肿瘤细胞SPC-A-1没有明显作用(见图12)。
疫一次。其淋巴细胞和血清在末次免疫后7天收获。受体BALB/c小鼠接种10 骨髓瘤FO
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细胞，并在接种后一周尾静脉注射100μl血清或10T淋巴细胞治疗。受体小鼠每三天注射一次，共注射4次。每两天观测一次小鼠肿瘤生长情况，直至所有对照组小鼠开始死亡为
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止。小鼠的肿瘤组织被制为切片观察。在nude小鼠中接种10SPC-A-1细胞， 于接种一周后连续两周每周3次注射免疫小鼠的血清，观测肿瘤的生长情况。实验结果表明，活血管内皮细胞免疫的淋巴细胞与血清则均有抑瘤活性(见图14)。同时，活血管内皮细胞过继免疫免疫治疗的小鼠肿瘤切片也可见严重的出血、坏死和炎症现象(见图15)。活血管内皮细胞免疫小鼠的血清可以有效的抑制血管内皮细胞的生长，而对肿瘤细胞SPC-A-1没有明显作用(见图12)。
[0128] 2.4免疫小鼠血清中抗体的检测：
[0129] 活血管内皮细胞：将血管内皮细胞以106每孔的浓度培养于96孔板中过夜。分别将10μl、20μl、30μl活血管内皮细胞免疫小鼠的血清与血管内皮细胞孵育2天，用MTT法检测血清作用。
[0130] 2.5T细胞提取及纯度鉴定：采用经典尼龙毛柱法从小鼠淋巴细胞中提取T细胞。将重悬于5％小牛血清RPMI1640的淋巴细胞通过37℃预热的尼龙毛柱，收集穿过的细胞即为T淋巴细胞。将T细胞与PE偶联的抗小鼠CD3抗体保温，并用流式细胞仪检测荧光计算T细胞纯度。结果表明，T细胞的纯度达到了78.46±8.01％(见图18)。
[0131] 2.6CTL功能检测：利用尼龙毛柱从小鼠脾脏中提取的T细胞培养于24孔板中，并按照5∶1的比例与50μg/ml丝裂霉素C预处理的骨髓瘤FO或树突-骨髓瘤融合细胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培养基中共同孵育72小时。之后T细胞被收获并与目标骨髓瘤FO细胞以不同的效靶比在U形底96孔板中孵育6小时。裂解细胞释放在上清中的乳酸脱氢酶(LDH)含量使用CytoTox 96cytotoxicity assay kit(Promega)测定。LDH特异性的释放百分比由下列公式计算：特异性释放百分比＝(实验组释放-T细胞自发释放-骨髓瘤自发释放)/(最大骨髓瘤释放-骨髓瘤自发释放)×100。结果表明，活血管内皮细胞免疫小鼠的T淋巴细胞展现了裂解血管内皮细胞的能力，并与T淋巴细胞剂量成相关性，但没有发现其裂解肿瘤细胞FO的能力(见图23)。由此可见，活血管内皮细胞免疫小鼠的细胞免疫均被激活。
[0132] 2.7细胞因子分析：提纯的T细胞与50μg/ml丝裂霉素C预处理的活血管内皮细胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培养基中孵育72小时，T辅助细胞(Th)分泌于培养上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夹心ELISA试剂盒(BD Pharmingen)测量。结果显示，在免疫小鼠的血清中IL-4与IFN-γ分别从30.3pg/ml和28.2pg/ml提高到152.5pg/ml和125.2pg/ml，而免疫小鼠T细胞体外激活后IL-4和IFN-γ的释放量也从32.4和30.2上升到493.5pg/ml和257.2pg/ml(见图24)。由此可见，活血管内皮细胞免疫小鼠的体液免疫被激活。
[0133] 实施例4：肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白提取物诱导抗肿瘤免疫
[0134] 1、肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白的制备：
[0135] 肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白的制备：将SD大鼠乳腺癌细胞13762培养至对数期(培养的方法是本领域普通技术人员公知技术)。用不含血清的McCoy’s 5A培养基悬6 5
浮细胞，并调节细胞浓度至1×10 细胞/ml。每只SD大鼠尾静脉注射1×1013762细胞，记录大鼠体重。注射细胞10天后每天称重大鼠，如果连续三天体重下降且超过10克，将大鼠麻醉进行肺灌流，用生物素标记大鼠肺肿瘤血管内皮细胞，并用HRP-streptavidin染色检验标记效果(图5)。将肺组织剪为小块后匀浆。在匀浆液中加入1/10体积的10％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)溶液，并混匀1h。4℃20,000rpm离心2h后，收集离心上清并对PBS(磷酸缓冲盐水)透析24小时去除游离的生物素。再次于4℃20,000rpm离心1h，收集上清。用固定化的单体亲和素亲和柱对标记的肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白进行提纯，并用银染SDS-PAGE和Western-Blot检验蛋白的富集效果(见图6)。
浮细胞，并调节细胞浓度至1×10 细胞/ml。每只SD大鼠尾静脉注射1×1013762细胞，记录大鼠体重。注射细胞10天后每天称重大鼠，如果连续三天体重下降且超过10克，将大鼠麻醉进行肺灌流，用生物素标记大鼠肺肿瘤血管内皮细胞，并用HRP-streptavidin染色检验标记效果(图5)。将肺组织剪为小块后匀浆。在匀浆液中加入1/10体积的10％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)溶液，并混匀1h。4℃20,000rpm离心2h后，收集离心上清并对PBS(磷酸缓冲盐水)透析24小时去除游离的生物素。再次于4℃20,000rpm离心1h，收集上清。用固定化的单体亲和素亲和柱对标记的肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白进行提纯，并用银染SDS-PAGE和Western-Blot检验蛋白的富集效果(见图6)。
[0136] 2、疫苗抗肿瘤效果的评价：
[0137] 肿瘤血管内皮细胞膜表面蛋白免疫抑瘤实验：6-8周龄的雄性C56BL/6J小鼠被分为免疫组和对照组，每组5只，免疫组每次免疫使用肿瘤肺血管内皮膜蛋白100μg和等体积的弗氏完全佐剂混合免疫；对照组注射等体积PBS。两组小鼠均腹腔注射，共免疫4次。5
末次免疫后第七天给两组小鼠皮下植入LLC肿瘤细胞，均为5×10 细胞/只。记录肿瘤小鼠生存率(见图11)。
末次免疫后第七天给两组小鼠皮下植入LLC肿瘤细胞，均为5×10 细胞/只。记录肿瘤小鼠生存率(见图11)。
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