一株植物乳杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株植物乳杆菌及其应用。本发明所公开的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329分离自中国孕妇阴道分泌物，对妇女阴道常见的致病菌如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌和阴道加德纳菌有较强的抑菌作用，产酸和产H202的能力均高于其它乳酸杆菌，培养96小时，培养液的pH可达3.96；该菌株表面具有厚厚的非菌毛黏附素，对阴道上皮细胞有较好的黏附作用，并且在室温适宜的保存液中放置，活菌数增加3×104倍。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329可用于制备阴道微生态制剂，用以预防和/或治疗妇女阴道感染性疾病。

权利要求

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329。

2.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329在制备预防和/或治疗妇女阴道感染性疾病药物中的应用。

说明书

一株植物乳杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株乳酸杆菌及其应用，特别涉及一株植物乳杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 一、乳酸杆菌和妇女阴道病

[0003] 乳酸杆菌(Lactobacillus)是健康妇女阴道内主要的、也是最重要的正常菌群，阴道内乳酸杆菌不但无致病性，而且能自洁阴道微生态环境，制约其它致病菌定植生长。因此，临床上将阴道涂片可见大量(高倍镜下每个视野数个)乳酸杆菌，未察见或仅有少量革兰氏阴性杆菌作为正常、无阴道感染的标准，而阴道内乳酸杆菌缺失或减少是阴道感染的重要指标(Robert P.Nugent，Marijane A.Krohn，and Sharon L.Hillier Reliability of diagnosing bacterial vaginosisis improved by a standardized method of Gram stain interpretation Journalof Clincal Microbiology 1991，29(2)：297-301)。

[0004] 妇女细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis，简称BV)主要是指由细菌、霉菌、滴虫等微生物引起的阴道炎，临床一般使用抗生素治疗，但抗生素治疗有较高的复发率，尤其对于一些老年性阴道炎和多发性阴道炎患者，抗生素治疗往往效果不佳，因为在使用抗生素杀灭致病微生物的同时也破坏了体内的正常菌群，尤其是抑制了阴道内乳酸杆菌的生长，从而失去了对微生态环境中致病微生物的制约作用，使其它致病微生物定植生长。另外，妇女怀孕期间由于免疫调节紊乱易发阴道感染，而孕妇的特殊性使其不能使用抗生素治疗。

[0005] 二、乳酸杆菌阴道制剂的应用情况

[0006] 乳酸杆菌作为微生态制剂治疗妇女阴道病在国外已得到广泛应用(Nigel W.Mclean and Isobel J.Rosenstein Characterisation and selection of aLactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrentbacterial vaginosis L Med Microbiol 2000，49：543-552；Elmer GM.Probiotics：”living drugs”Am J Health Syst Pharm 2001，58(12)：1101-9)，该药属非处方制剂，患者可自行购买。制剂中的乳酸杆菌一般自正常妇女阴道中分离，常见的有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等。由于人种和个体的差异，国外同类制剂不一定适宜包括中国人在内的亚洲人，国内已开始研制同类制剂乳杆菌。

[0007] 应用微生态制剂治疗疾病，肯定是抗生素辉煌时代后的又一灿烂亮点，是抗生素无法取代的又一制药方向，蕴藏着巨大的经济效益和社会效益。

[0008] 乳酸杆菌作为阴道内微生态制剂适合于以下人群：

[0009] (1)老年阴道炎患者

[0010] 老年阴道炎既萎缩性阴道炎，是老年妇女常见病之一，在绝经妇女中阴道炎发病率国内报道为30-50％，国外报道为30％。专家认为老年阴道炎的主要病因是阴道微环境中乳酸杆菌缺乏，其它致病微生物定植所致。抗生素治疗老年阴道炎效果不佳，而定期植入乳酸杆菌制剂可抑制其它致病菌生长，是改善老年患者阴道炎症状，使其处于健康状态，从而提高老年妇女生活质量的根本途径(Reid G，Bruce AW.Urogenital infections in women：can probiotics help？PostgradMed J.2003 Aug；79(934)：428-32)。

[0011] (2)孕妇

[0012] 孕妇与正常妇女比较，由于激素水平的变化引起T抑制淋巴细胞亢进，从而造成免疫力低下，易发生生殖泌尿系感染。治疗孕妇感染一般不使用抗生素，因为大多数抗生素对胎儿有影响，例如用于治疗滴虫和厌氧菌性阴道炎的药物“灭滴灵”，动物实验中显示有致癌和致畸作用，用于治疗非特异性阴道炎的大环内酯类药物影响胎儿骨骼发育。而乳酸杆菌是正常菌群，无致病性，对阴道微环境有自洁作用。因此对于患有阴道炎的孕妇阴道内植入乳酸杆菌制剂，可使其安全渡过孕期以及围产期。孕妇感染BV容易引起子宫内膜炎和早产，英国最新的调查表明，妊娠20周时，阴道内克隆有产H2O2的乳酸杆菌的孕妇，其患BV的危险性大大低于无产H2O2的乳酸杆菌的孕妇，其子宫内膜炎的患病率和早产率也大大低于后者(Wilks M，Wiggins R，Whiley A，Hennessy E，Warwick S，Porter H，CorfieldA，Millar M.Identification and H(2)O(2)production of vaginal lactobacillifrom pregnant women at high risk of preterm birth and relation with outcome.J Clin Microbiol.2004 Feb；42(2)：713-7)。因此，有人利用产H2O2的乳酸杆菌菌液为22名患有BV，年龄在20-34岁、妊娠3个月的孕妇冲洗阴道，每天冲洗1次，冲洗7天为1个疗程，隔1周后开始第2疗程。结果治疗3天后全部孕妇症状得到改善，2个疗程后90％孕妇阴道状况恢复正常(Tasdemir M，Tasdemir I，Tasdemir S，Tavukcuoglu S.Alternative treatment for bacterial vaginosisin pregnant patients；restoration of vaginal acidity and flora.Arch AIDSRes.1996；10(4)：239-41)。

[0013] (3)慢性病患者

[0014] 对于慢性病患者，如糖尿病患者，红斑狼疮、风湿病、器官移植等长期使用免疫抑制剂和广普抗生素的人群，常常会出现正常菌群失调；一些肢体残疾、长期坐卧的女性阴道容易感染厌氧菌；对于这类妇女，植入乳酸杆菌阴道制剂，将会为她们解除痛苦，起到有效的“保洁”作用。

[0015] 三、用作乳酸杆菌阴道制剂菌株的来源和应具有的条件

[0016] 1、用作乳酸杆菌阴道制剂菌株的来源

[0017] 用作乳酸杆菌阴道微生态制剂的菌株一般均来源于健康妇女阴道正常菌群，而分离自阴道清洁度极好的孕妇阴道正常菌群的乳酸杆菌将会有更好的效果。1999年英国报道从孕妇分离乳酸杆菌用于研制阴道微生态制剂。

[0018] 孕妇在孕期，尤其是在孕前期，由于激素水平的变化引起机体免疫系统絮乱，常常是T抑制细胞亢进造成免疫力低下，因而易发生生殖泌尿系感染。但在免疫力低下的状态下，有些孕妇仍能保持较好的阴道清洁度，说明其阴道正常菌群，既乳酸杆菌，具有较强抑制致病菌生长的能力。

[0019] 2、用作乳酸杆菌阴道微生态制剂的菌株一般应具有以下几个方面的条件：

[0020] (1)黏附占位性

[0021] 乳酸杆菌对阴道上皮细胞的黏附性对于用作微生态制剂非常重要，体外试验表明，乳酸杆菌在硅胶表面生长，可以干扰尿道致病菌在该硅胶表面的吸附(Velraeds MM Interference in initial adhesion of uropathogenic bacteriaand yeasts to silicone rubber by a Lactobacillus acidophilus J MedMicrobiol 1998，47(12)：1081-5)。

[0022] 乳酸杆菌在生长过程中不断向胞外分泌一种非菌毛黏附素，形态学观察可见细菌外周一层厚厚的、致密的、参差不齐、锯齿状物质，又称为毛发样突出物(fibritlae)，其化学成分是脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)，起与宿主细胞的黏附作用。LTA与宿主细胞的黏附作用的机制被认为，一方面作为配体与宿主细胞受体相结合，另一方面通过LTA游离部分所带电荷与宿主细胞间相互作用(Otero MC，Ocana VS，Elena Nader-Macias M.Bacterial surfacecharacteristics applied to selection of probiotic microorganisms.MethodsMol Biol.2004；268：435-40)。因此，革兰氏阳性细菌的毛发样突出物越多，对宿主细胞的黏附作用越强。

[0023] 乳酸杆菌利用非菌毛黏附素，即毛发样突出物可以很好地附着在阴道壁上，所形成的生物屏障使其它致病菌无法在阴道中形成克隆，起到了占位效应。乳酸杆菌体积越大，占位效应越好。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，在乳杆菌属中为体积最大的种，因而具有更好的占位性。关于植物乳杆菌用于微生态制剂以及其对阴道上皮细胞具有较好的黏附性和占位性，国外文献和专利已有报道(Bonetti A，Morelli L，Campominosi E，Ganora E，Sforza F.Adherenceof Lactobacillus plantarum P 17630 in soft-gel capsule formulation versusderlein’s bacillus in tablet formulation to vaginal epithelial cells.Minerva Ginecol.2003 Jun；55(3)：279-84，284-7)。

[0024] (2)产酸

[0025] 由于乳酸杆菌的嗜酸性，使其适于在酸性环境中生长，其发酵糖类所产生的谢产物几乎全部为乙酸，使阴道内环境pH降低，从而不利于其它致病菌生长。年妇女由于其阴道表皮细胞糖元化程度降低，大量乳酸杆菌丢失，因此阴道内微环境pH升高，使得老年妇女容易患阴道炎。因此，许多研究认为，乳酸杆菌的存在所形成的酸性微生态环境，是防止阴道病的最主要因素(E.R.Boskey，K.M.Telsch Acid production gyvaginal flora in vitro is consistent withthe rate and extent of vaginal acidification Infection and Immunity 1999，67(10)：5170-5)。

[0026] (3)产过氧化氢(H2O2)

[0027] 有些妇女阴道内寄生的乳酸杆菌数量并不算少，但仍然有炎症发生，这是因为这些乳酸杆菌不产H2O2，而清洁度好的妇女阴道寄生的乳酸杆菌大多产H2O2。如加利亚2003年分别调查了40名健康妇女和72名感染BV妇女阴道菌群的情况，发现健康妇女92.5％(37/40)阴道菌群中克隆有产H2O2的乳酸杆菌，而感染BV妇女仅有4.1％(3/72)阴道菌群中克隆有产H2O2的乳酸杆菌。作者认为，乳酸杆菌所产H2O2非特异性地起到保护阴道微环境的作用(Shopova E.Hydrogenperoxide-producing Lactobacillus species in healthy women and in women withbacterial vaginosis Akush Ginekol(Sofiia).2003；42 Suppl1：12-5)。H2O2可以抑制某些好氧细菌和霉菌的生长。文献报道，缺乏产H2O2的乳酸杆菌，是大肠杆菌引起的阴道炎、尿道炎复发的主要因素(Juarez Tomas MS，Ocana VS，WieseB，Nader-Macias ME.Growth and lactic acid production by vaginalLactobacillus acidophilus CRL 1259，and inhibition of uropathogenicEscherichia coli.J Med Microbiol.2003 Dec；52(Pt 12)：1117-24)。有人应用H2O2液冲洗阴道治疗BV感染，并与灭滴灵和氯洁霉素治疗进行比较：58名年龄在18-42岁感染BV的女性患者临床用
30ml 3％H2O2液冲洗阴道，每天1次，共冲洗7天。3个月后与灭滴灵和氯洁霉素治疗进行比较，BV的主要症状得以清除，包括98％患者消除恶臭，98％阴道pH＜4.5，97.7％胺试验阴性，100％阴道分泌物中未检出线索细胞并建立起含有产H2O2乳酸杆菌的正常菌群(Cardone A，Zarcone R，Borrelli A，Di Cunzolo A，Russo A，Tartaglia E.Utilisation of hydrogenperoxide in the treatment of recurrent bacterial vaginosis.Minerva Ginecol.2003 Dec；55(6)：483-92)。

[0028] (4)抑菌作用

[0029] 有些乳酸杆菌在生长过程中，可向体外分泌乳酸杆菌菌素，这些菌素对许多阴道致病微生物可产生抑制其生长的作用，这些菌素的成份和作用机理还不清楚，有研究证明乳酸杆菌菌素是一种具有抗菌作用的蛋白质成分的物质，也有人认为所谓乳酸杆菌菌素，即是乳酸杆菌的酸性代谢产物。但是无论乳酸杆菌菌素是何种成分的物质，用作阴道微生态制剂的乳酸杆菌菌株必须要有抑菌作用(Aroutcheva AA.Simoes JA，Faro S.Antimicrobial protein produced byvaginal Lactobacillus acidophilus that inbibits Gardnerella vaginalisInfect Dios Obstet gynecol 2001，9(1)：33-9；Tomas MS，Claudia Otero M，OcanaV，Elena Nader-Macias M.Production of antimicrobial substances by lacticacid bacteria I：determination of hydrogen peroxide.Methods Mol Biol.2004.268：337-46)。

[0030] (5)生长条件和稳定性

[0031] 乳酸杆菌生长对营养的需求差异很大，大多数乳酸杆菌营养需求苛刻，需要高成本的营养添加剂，并且生长缓慢，不适合用于制剂生产。用作阴道微生态制剂的乳酸杆菌菌株要能够适应普通生长条件，在普通生长条件下可以大量繁殖；另外，该菌株在适宜的保存液中可以长期存活也是用作阴道微生态制剂菌株的必备条件。

发明内容

[0032] 本发明的目的是提供一株新的植物乳杆菌。

[0033] 本发明所提供的植物乳杆菌是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323，该菌株已于2005年03月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1329。

[0034] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323CGMCC No.1329分离自阴道清洁度高、微环境好的人体，对妇女阴道常见的致病菌如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌和阴道加德纳菌显示有较强的抑菌作用，产酸和产H2O2的能力均高于其它乳酸杆菌，培养96小时，培养液的pH可达3.96；该菌株表面具有厚厚的非菌毛黏附素，对阴道上皮细胞有
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较好的黏附作用，并且在适宜的保存液中室温放置半年，活菌数增加3×10 倍。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323CGMCC No.1329可用于制备阴道微生态制剂，用以预防和/或治疗妇女阴道感染性疾病。

附图说明

[0035] 图1为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的革兰氏染色照片

[0036] 图2A为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329对金黄色葡萄球菌ATCC6035的抑菌作用

[0037] 图2B为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329对白色念珠菌ATCC1023的抑菌作用

[0038] 图2C为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329对大肠杆菌ATCC25922的抑菌作用

[0039] 图2D为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329对阴道加德纳菌ATCC14018的抑菌作用

[0040] 图3为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329产H2O2呈蓝绿色菌落的平板照片

[0041] 图4为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的电镜照片具体实施方式

[0042] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0043] 实施例1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的分离及鉴定

[0044] 1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的分离[0045] 首先采集在301医院妇产科定期进行孕期检查的300余位健康中国孕妇阴道后穹窿部位分泌物，在用MRS培养基进行细菌分离的同时，进行以下几方面的试验：(1)直接涂片，根据乳酸杆菌和革兰氏阴性细菌的数量进行清洁度评价(0-2分，正常；4-6分，轻度炎症；8-10分，重度炎症)，其中，阴道清洁度的评价标准参照文献(Robert P.Nugent，Marijane A.Krohn，and Sharon L.HillierReliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardizedmethod of Gram stain interpretation Journal of Clincal Microbiology1991，29(2)：297-301)；(2)阴道分泌物pH测定；(3)定量测定阴道分泌物中乳酸杆菌的数量。结果得到一株分离自阴道清洁度评价为0-2分，阴8
道分泌物中乳酸杆菌数量大于1×10CFU/ml，pH值为3.25的阴道分泌物的乳酸杆菌，菌株号为L323。

[0046] 2、细菌鉴定

[0047] 菌体形态观察按常规法进行革兰氏染色镜检。革兰氏染色可见L323株乳酸杆菌为革兰氏阳性粗大杆菌，大小约为1×3-8um(图1)。

[0048] 生化反应采用法国梅里埃生物公司API 50细菌鉴定系统，包括API 50培养基、试验条、McFarland标准点、矿物油、培养盒和API Plus软件等。API 50细菌鉴定系统鉴定结果表明L323株乳酸杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，其生化反应结果如表1所示。

[0049] 表1 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323的生化反应

[0050]七叶灵ESC + 木糖醇XLT -
甘油GLY - 龙胆二糖GEN +
赤癣醇ERY - D-松二糖TUR +
D-阿拉伯糖DARA - D-来苏糖LYX -
L-阿拉伯糖LARA + D-塔格糖TAG -
核糖RIB + D-岩糖DFUC -
D-木糖DXYL - L-岩糖LFUC -
L-木糖LXYL - D-阿拉伯糖醇DARL +
阿东糖ADO - L-阿拉伯糖醇LARL -
β-甲基-D-木糖甙MDX - 葡萄糖酸盐GNT +
半乳糖GAL + 2-酮基-葡萄糖酸盐2KG -
葡萄糖GLU + 5-酮基-葡萄糖酸盐5KG +
果糖FRU + 肝糖GLYG -
甘露糖MNE + 淀粉AMD -
山梨糖SBE - 棉子糖RAF +
鼠李糖RHA - 松叁糖MLZ +
卫茅醇DUL - 菊糖INU -
肌醇INO - 海藻糖TRE +
甘露醇MAN + 蔗糖SAC +
山梨醇SOR + 蜜二糖MEL +
α-甲基-D-甘露甙MDM + 乳糖LAC +
七叶灵ESC + 木糖醇XLT -
α-甲基-D-葡萄糖甙 - 麦芽糖MAL +
MDG
N-乙酰-葡萄胺NAG + 纤维二糖CEL +
苦杏仁甙AMY + 柳醇SAL +
熊果甙ARB +

[0051] 注：“+”为反应阳性，“-”为反应阴性。

[0052] 实施例2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的特性[0053] 材料

[0054] 菌株金黄色葡萄球菌ATCC6035、白色念珠菌ATCC1023、大肠杆菌ATCC25922、阴道加德纳菌ATCC14018

[0055] 试剂

[0056] MRS培养基、LM肉汤培养基，购自法国梅里埃生物公司；

[0057] 胰蛋白胨、酵母抽提物、琼脂粉，购自Oxide；

[0058] 四甲基联苯胺(TMB)、二甲基甲酰胺、辣根过氧化物酶(HRP)，购自Sigma公司。

[0059] 1、抑菌试验

[0060] 将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329菌株接种于MRS培养基，37℃、5％CO2培养24小时，用无菌生理盐水洗下菌苔，比浊并稀释成1×108CFU/ml浓度菌液，将直径为5mm的圆形灭菌滤纸片浸满菌液后备用。

[0061] 将金黄色葡萄球菌ATCC6035、白色念珠菌ATCC1023、大肠杆菌ATCC25922分别接种于普通营养琼脂培养基(牛肉膏3.0克/L，蛋白胨10.0克/L，NaCl 5.0克/L，琼脂15克/L，pH 7.0)上，37℃培养24小时，阴道加德纳菌ATCC14018接种于GC血琼脂，37℃5％CO2培养24小时，分别用无菌生理盐水洗下菌体，比浊并稀释成1×108CFU/ml浓度菌液，各取0.1ml涂布普通营养琼脂平板，将上述浸有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323CGMCC No.1329的圆形滤纸片分别放在涂布有上述细菌的平板中间位置，贴紧，做好标记，将涂有金黄色葡萄球菌ATCC6035、白色念珠菌ATCC1023、大肠杆菌ATCC25922的平板分别放入普通培养箱，将涂有阴道加德纳菌ATCC14018的平板分别放入5％CO2孵箱，37℃培养48小时，测量记录抑菌圈直径并照相。

[0062] 抑 菌 试 验 的 结 果 如 表2 和 图2A-图 2D所 示，表 明 植 物 乳 杆 菌(Lactobacillusplantarum)L323 CGMCC No.132对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌和阴道加德纳菌(金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌和阴道加德纳菌均是引起阴道炎常见致病菌)具有抑菌作用。说明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.132对妇女阴道常见的致病菌有较好的抑菌效果。

[0063] 表2 L323株乳酸杆菌对常见致病菌的抑菌效果

[0064]

[0065] 2、产酸酸度和成分分析试验

[0066] 将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329接种于MRS培养8
基，37℃5％CO2培养24小时后，用生理盐水洗下菌苔，制成1×10CFU/ml菌悬液，取0.1ml菌悬液接种于5ml LM肉汤培养基中，37℃5％CO2分别培养24小时、48小时、72小时、96小时，用pH酸度仪测定不同时间培养菌液的pH值。

[0067] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的不同培养时间培养液的pH值的变化情况如表3所示。

[0068] 表3.植物乳杆菌L323不同时间产酸试验结果

[0069]

[0070] 取上述培养24小时的乳酸杆菌LM肉汤培养基10ml，8000rpm离心15分钟，弃菌体沉淀，收集上清，对细菌代谢产物中的短碳有机酸：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸进行气相色谱分析。结果如表4所示，表明植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L323 CGMCC No.1329产生的短碳有机酸主要为乙酸，培养24小时生产乙酸可达1160ug/ml。

[0071] 表4.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329产酸的成分和产量分析

[0072]有机酸成分 产量(ug/ml)
乙酸 1160
丙酸 ＜50
丁酸 ＜50
戊酸 ＜20

[0073] 3、产过氧化氢(H2O2)试验

[0074] 称取四甲基联苯胺(TMB)12.5mg溶于1ml二甲基甲酰胺中，与50ml MRS培养基混匀，121℃15分钟灭菌后铺平板，得到TMB-MRS培养基平板，4℃避光放置备用。

[0075] 按0.01mg/ml浓度配制辣根过氧化物酶(HRP)溶液，0.45μm滤膜过滤除菌，菌株接种前取0.1ml均匀涂布TMB-MRS培养基平板，晾干，4℃避光放置。

[0076] 将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329接种于上述涂布有HRP的TMB-MRS培养基，37℃5％CO2孵箱避光培养24小时，取出培养板，暴露光线3分钟后，观察培养板上菌落颜色变化并记录结果。结果判读：在有H2O2存在的情况下，HRP会氧化TMB形成蓝绿色氧化物。因此，如果乳酸菌产H2O2，生长于含有TMB、并涂布有HRP的培养基上的菌落将会变为蓝绿色，而不产生H2O2的乳酸菌株的菌落为灰白色。结果如图3所示，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L323 CGMCC No.1329产H2O2呈蓝绿色菌落。乳酸杆菌产生H2O2可使阴道微环境缺氧，从而抑制好氧致病菌生长。有试验表明，由大肠杆菌引起的复发性阴道炎和尿道炎患者阴道和尿道内缺乏产H2O2的乳酸杆菌(Wilks M，Wiggins R，Whiley A，Hennessy E，Warwick S，Porter H，Corfield A，Millar M.Identification and H(2)O(2)production of vaginal lactobacilli frompregnant women at high risk of preterm birth and relation with outcome.J Clin Microbiol.2004 Feb；42(2)：713-717)。

[0077] 4、菌株超微结构的电镜观察

[0078] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329接种MRS培养基37℃5％CO2培养24h，用无菌棉拭子拭取菌苔接种于5ml LM肉汤培养基，37℃5％CO2培养24小时，5000rpm/min离心10分钟，弃上清，正常小鼠眼球取血后立即分离血清，取新鲜分离的小鼠血清1滴滴入菌体沉淀中，室温放置10分钟使菌块固定，加入戊二醛固定液
1ml，放置4℃用于电镜标本的制备。电镜观察结果如图4所示，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329菌体表面具有厚厚的毛发样突出物，即非菌毛黏附素，该物质是细菌黏附上皮细胞的基础。

[0079] 5、菌株保存的稳定性试验

[0080] 观察乳酸杆菌在不同保存液中细菌的存活情况。

[0081] 保存液的配制：

[0082] 保存液1：MRS培养基+5％(质量百分含量)脱脂牛奶

[0083] 保存液2：MRS培养基+5％(质量百分含量)脱脂牛奶+海藻糖3.78g[0084] 保存液3：MRS培养基

[0085] 将24小时培养的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.13295
以4800rpm/min离心5分钟，以不同保存液悬浮沉淀菌体，菌体计数为2.2×10CFU/ml，分别分装保存管0.5ml/支，分别放置不同温度(37℃，室温)环境中避光保存，每月各取保存管1支，吸出菌液0.1ml，用1ml LB肉汤稀释成不同浓度，涂布MRS培养基平板，37℃5％CO2培养24小时后计数，观察并记录不同保存液保存效果，即细菌存活情况。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCCNo.1329的存活情况如表5所示。

[0086] 表5.不同保存液中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCCNo.1329的存活数(CFU/ml)

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