麦迪霉素高产菌株

摘要

本发明涉及提高了麦迪霉素产率的麦迪霉素高产菌株以及利用该菌株生产麦迪霉素的方法，所述麦迪霉素是大环内酯抗生素的一个成员。产麦迪霉素的放线菌含有麦迪霉素生物合成基因或其同源物，其中麦迪霉素生物合成基因的聚酮合成酶基因中的至少一个组件或至少一个组件的部分序列被取代以便编码其它组件的相应氨基酸序列。

权利要求

1.产麦 迪霉 素的 放线 菌，其为 保藏 号为FERM BP-10501的 Streptomyces mycarofaciens 1149-38菌株。

2.产生基本上不含白霉素的麦迪霉素的方法，其包括：培养权利要求1所述的产麦迪霉素的放线菌；以及分离产生的麦迪霉素。

说明书

麦迪霉素高产菌株

技术领域

[0001] 本发明涉及提高麦迪霉素产率的麦迪霉素高产菌株以及利用该菌株生产麦迪霉素的方法，所述麦迪霉素是大环内酯抗生素的一个成员。

背景技术

[0002] 大环内酯抗生素是有效抗革兰氏阳性细菌，支原体，衣原体等的抗细菌剂并且由于其可以口服施用以及毒性较低被划分为临床上重要的抗细菌剂。其中，可以市售获得的16-元环大环内酯抗生素由于具有难以诱导抗性，与14-元环大环内酯抗生素相比与其它药物的相互作用较少而且也较少影响肠道的优点，所以在包括亚洲国家的世界范围内被广泛使用。

[0003] 麦迪霉素(图1)是由Streptomyces mycarofaciens(ATCC2 1454)以及放线菌的类似种产生的16-元环大环内酯抗生素。作为其酰化衍生物的米欧卡霉素(miocamycin)(Omoto，S 等，J.Antibiot.，29，536(1976)；Yoshida，T，deng，Jpn.J.Antibiot.，35，1462(1982))在临床上广泛使用并且由Streptomyces mycarofaciens的发酵产物产生。此外，由于Streptomyces mycarofaciens不产生白霉素，通过使用该菌株还具有省去经纯化等步骤除去白霉素的优点。

[0004] 放线菌长久以来在发酵工业领域作为抗生素，生理活性物质以及类似的次级代谢产物的生产菌株占据很重要的位置，而且已经通过进行多种菌株育种技术提高了其产率。也已经对由Streptomycesmycarofaciens产生麦迪霉素进行了使用多种诱变剂诱变的菌株育种。根据这种菌株育种方法，优点在于可以很方便获得具有目的表型的菌株，但是不能阐明向基因中引入了何种类型的突变。由于引入了随机突变，其后在育种中可能连带引入没有用(例如，不提高产率)的突变。

[0005] 从这个观点来看，可以通过将低产量菌株的基因组序列与高产量菌株的基因组序列进行比较提取有用的突变，并且可以利用重组DNA技术构建只聚集有用突变的高产菌株。

[0006] 在产生大环内酯抗生素的微生物中，在很多情况下大多数的大环内酯生物合成基因一同集中在基因组70到80kb的区域内(Donadio，S.等，Science，252，675(1991)；MacNeil，D，J. 等，Gene，115，119(1992)；Schwecke， 等，proc.Natl.Acad.Sci.，92，
7839(1995))。编码称作I型聚酮合成酶(此后也称作PKS)的巨大多功能蛋白的高度同源基因存在于其基因簇的中心。

[0007] PKS基因通常由3到5个基因构成，并且其蛋白形成由起始子组件和几个延伸子组件组成的复合物。其中每一个在其合成的中间向聚酮链添加特异性酰基-CoA前体并特异性修饰β-酮基。因此，通过PKS中这些组件的组成和顺序确定聚酮结构。所述组件包含几个结构域，每一个具有特定的功能。

[0008] 起始子组件包括结合前体酰基的酰基载体蛋白(此后称作ACP)结构域以及催化向ACP结构域添加酰基的酰基转移酶(此后称作AT)结构域。根据这个AT结构域的特异性，确定向其添加的酰基-CoA的种类。所有的延伸子组件含有β-酮合成酶(β-酮脂酰酰基载体蛋白合成酶，此后也称作KS)结构域以及AT结构域和ACP结构域，所述β-酮合成酶结构域通过脱羧化缩合向先前存在的聚酮链添加新的酰基-ACP。

[0009] 而且，每一延伸子组件含有一些修饰特异性β-酮基的结构域，除此之外，基于所含有的结构域的结构确定β-酮基的修饰。这些包括将β-酮基还原成羟基的β-酮还原酶(此后也称作KR)结构域，除去羟基并形成双键的脱水酶(此后也称作DH)结构域以及形成饱和碳键的烯酰基还原酶(此后也称作ER)结构域。

[0010] 最后的延伸子组件通过其从PKS的环化释放聚酮由硫酯酶(此后也称作TE)结构域完成。基于已知的PKS基因的序列信息可以估计PKS的组件，结构域和开放阅读框架(此后也称作ORF)的界限。

[0011] 由PKS形成的聚酮主链经历甲基化，酰化，氧化，还原，特异性糖加成等其它的修饰并最终合成大环内酯抗生素。这些修饰所需的大多数基因存在于PKS基因的周围。

[0012] 编码脱氧糖生物合成酶的基因已经由红霉素，泰乐霉素等(Sumers，R.G.等，Microbiology，143，3251(1997)；Gaisser，S， 等，Mol.Gen.Genet.，256，239(1997)；Merson-Davies，L.A.和Cundliffe，E，Mol.Microbiol.，13，349(1994))得以揭示。这些脱氧糖的合成包括通过添加核苷二磷酸活化葡萄糖以及随后的脱氧化，还原，表异构化，胺化，甲基化等反应。这些糖通过活化特异性糖基转移酶被引入大环内酯。

[0013] 由于麦迪霉素的结构与泰乐霉素的结构类似，因此人们认为它们经历几乎相同的生物合成途径。麦迪霉素的生物合成起始于作为聚酮主链前体的丙二酰基-CoA，甲基丙二酰基-CoA，乙基丙二酰基-CoA以及甲氧基丙二酰基-CoA的合成。这些前体通过由聚酮合成酶的逐步缩合反应进行环化，并由此合成聚酮主链。随后经糖加成，羟基化，甲酰化，乙酰化等修饰反应最终合成麦迪霉素。

[0014] 为了通过基因重组技术提高其产率，已经进行编码限速生物合成反应的基因的表达加强，调节生物合成基因表达的基因的表达加强或者基因破坏，中断不必要的次级代谢系统等(Kennedy，J.and Turner，G，Mol.Gen.Genet.，253，189(1996)；Review：Balts，R.H.，Biotechnology ofAntibiotics Second Edition，Revised and Expanded，Marcel Dekker，Inc.，New York，p.49(1997)；Review：Hutchinson，C.R.and Colombo，A.L.，Ind.Microbiol.Biotechnol.，23，647(1999)；Review：Brakhage，A.A.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，62，547(1998))。因此，当生物合成基因被确定时，可以通过基因重组技术，通过将其与合适的载体连接并导入次级代谢产物生产菌株提高其产率。

发明内容

[0015] 上述的方法是针对提高限速基因的表达量或者去除限速基因并由此提高或作为基因产物的酶蛋白的量。然而，很难通过精确掌握生物合成中间体的产率确定限速步骤。例如，有一些不能预测生物合成流程图，不能检测所预测的生物合成中间体，需要生物合成中间体的标准物等等的情况。

[0016] 本发明人已经通过利用突变处理的育种从产生麦迪霉素的Streptomyces mycarofaciens获得了高产率菌株，并将来源于这种高产菌株的麦迪霉素生物合成基因的DNA序列与野生型菌株的序列(低产菌株)进行了比较，并且检验发现了特异于高产菌株的突变，即引起高产的突变。

[0017] 也就是说，本发明人已经成功分离了一包含麦迪霉素高产菌株-来源的基因组DNA的基因组文库的麦迪霉素生物合成基因的DNA片段，所述基因组文库利用Streptomyces mycarofaciens-来源的DNA片段作为探针制备而成，所述探针已经利用与放线菌-来源的聚酮合成酶基因同源的序列作为引物通过聚合酶链式反应(在下文也称作PCR)得以扩增。通过将由此获得的高产菌株来源的麦迪霉素生物合成基因与野生型菌株来源的麦迪霉素生物合成基因(美国专利公开2004-0091975A1，JP-A-2004-49100)的DNA序列进行比较，人们发现存在聚酮合成酶基因的β酮合成酶结构域的部分取代并由此提高了麦迪霉素的产率。基于上述认识，我们已经继续了深入研究并由此完成了本发明。

[0018] 因此，本发明包含下列实施方案。

[0019] 1.产麦迪霉素的放线菌，其含有麦迪霉素生物合成基因或其同源物，其中麦迪霉素生物合成基因的聚酮合成酶基因中的至少一个组件或至少一个组件的部分序列被取代以便编码其它组件的相应氨基酸序列。

[0020] 2.根据项1的产麦迪霉素的放线菌，其中编码麦迪霉素合成酶基因的ORF2中的KS3：β-酮脂酰酰基载体蛋白合成酶的氨基酸序列的核苷酸序列被全部或部分取代以便编码ORF1中的KS2：β-酮脂酰酰基载体蛋白合成酶的相应氨基酸序列。

[0021] 3.根据项2的产麦迪霉素的放线菌，其中编码麦迪霉素合成酶基因的ORF2中KS3的第157至第420位的氨基酸序列的核苷酸序列被部分或全部取代以便编码ORF1中KS2的第2705至第2968位的部分或全部的相应氨基酸序列。

[0022] 4.根据项3的产麦迪霉素的放线菌，其中编码麦迪霉素合成酶基因的ORF2中KS3的第157至第254位的氨基酸序列的核苷酸序列被部分或全部取代以便编码ORF1中KS2的第2705至第2802位的部分或全部的相应氨基酸序列。

[0023] 5.根据项4的产麦迪霉素的放线菌，其中编码麦迪霉素合成酶基因的ORF2中KS3的第157至第186位的氨基酸序列的核苷酸序列被部分或全部取代以便编码ORF1中KS2的第2705至第2734位的部分或全部的相应氨基酸序列。

[0024] 6.根据项1到5任一项的产麦迪霉素的放线菌，其中的放线菌为Streptomyces mycarofaciens。

[0025] 7.根据项6的产麦迪霉素的放线菌，其中的放线菌为保藏号为FERM BP-10501的Streptomyces mycarofaciens1149-38菌株。

[0026] 8.产麦迪霉素的放线菌，其是通过对项1到5任一项所述的产麦迪霉素的放线菌进一步突变获得的。

[0027] 9.产生麦迪霉素的方法，其包括：培养项1到5任一项所述的产麦迪霉素的放线菌；以及分离产生的麦迪霉素。

[0028] 10.产生基本上不含白霉素的麦迪霉素的方法，其包括：培养项6或7所述的产麦迪霉素的放线菌；以及分离产生的麦迪霉素。

[0029] 本发明提供了提高麦迪霉素产率的麦迪霉素高产菌株以及利用该菌株生成麦迪霉素的方法，所述麦迪霉素是大环内酯类抗生素的成员。

附图说明

[0030] 图1是显示麦迪霉素结构的图。

[0031] 图2是Streptomyces mycarofaciens菌株的分类图。

[0032] 图3是显示Streptomyces mycarofaciens菌株ATCC 21454的麦迪霉素聚酮合成酶的orf 1存在的KS2和ORF2中的KS3的氨基酸序列和Streptomyces mycarofaciens菌株1149-38的麦迪霉素聚酮合成酶的ORF2中存在的KS3(高KS3)的氨基酸序列比较的相似性。图中的氨基酸数目通过将每一orf的起始密码子定义为1进行表示。

具体实施方式

[0033] 以下详细描述了本发明。

[0034] 微生物的保藏

[0035] 获 白 Meiji Seika Kaisha 的 Streptomyces mycarofaciens SF8371149-38已经在2005年2月16日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心 (International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology(邮政编码305-8566；Central6，1-1-l Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本))。保藏号是FERM P-20405(在2006年2月2日转成FERM BP-10501)。

[0036] 转化有pCOMW1的大肠杆菌已经在2002年7月16日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(邮政编码305-8566；Central6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。保藏号是FERM-18935(在2002年8月21日转成FERM BP-8168)。

[0037] 转化有pCOMW2的大肠杆菌已经在2002年7月16日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(邮政编码305-8566；Central6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。保藏号是FERM-18936(在2002年8月21日转成FERM BP-8169)。

[0038] 转化有pCOMW4的大肠杆菌已经在2002年7月16日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(邮政编码305-8566；Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。保藏号是FERM-18937(在2002年8月21日转成FERM BP-8170)。

[0039] 本发明的麦迪霉素生物合成基因

[0040] 野生型菌株(Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454)-来源的麦迪 霉 素 生 物 合 成 基 因 公 开 在 美 国 专 利 2004-0091975A1 和JP-A-2004-49100中。

[0041] 根据本发明，麦迪霉素的产率可以通过更换麦迪霉素生物合成基因，聚酮合成酶基因中所含的每一组件或者其部分序列得以提高，由此使其编码其它组件的相应的氨基酸序列。置换序列没有特殊限制，条件是麦迪霉素的产率得以提高，而且聚酮合成酶(麦迪霉素的产率)的酶活性可以得以提高，例如通过利用上游β酮合成酶结构域或者其部分取代相同的下游结构域的相应部分，与麦迪霉素高产菌株-来源的聚酮合成酶的情况类似。

[0042] 待置换的氨基酸序列的长度没有特殊限制，但优选1到300个残基，更优选1到200个残基，最优选1到100个残基。

[0043] 待提高的麦迪霉素产率基于未经历置换的菌株为1.2倍或更多，优选1.4倍或更多，麦迪霉素的产率由以下实施例1到8所述的方法进行确定，可以通过将其与其他突变结合获得与野生型菌株(ATCC 21454)相比10倍或更多，优选15倍或更多，更优选18倍或更多倍的提高。

[0044] 在上述的取代中，人们希望用ORE1上KS2结构域的相应部分取代ORF2上KS3结构域的氨基酸序列或者其部分，更希望用KS2结构域(从第2705到第2968位置的部分或者全部氨基酸序列)的相应部分取代KS3结构域的第157到第420位置的部分或者全部氨基酸序列，还希望用KS2结构域的相应部分(从第2705到第2802位置的部分或者全部氨基酸序列)取代从KS3结构域第157到第254位置的部分或者全部氨基酸序列，进一步希望用KS2结构域的相应部分(从第2705到第2734位置的部分或者全部氨基酸序列)取代KS3结构域的从157到第186位置的部分或者全部氨基酸序列。氨基酸的数目通过将翻译起始密码子(atg/Met)定义为1进行计数。

[0045] 本发明的麦迪霉素的制备方法

[0046] 可以例如通过以下方法获得产生包含如下成分的麦迪霉素的放线菌：麦迪霉素生物合成基因或者其同源物，其中麦迪霉素生物合成基因，聚酮合成酶基因，或者其部分序列中所含的一或两个或更多组件被其它组件的相应的氨基酸序列取代。

[0047] 提高麦迪霉素产率的菌株通过对麦迪霉素生产菌株Streptomycesmycarofaciens施加紫外线辐射或者诱变剂(例如，亚硝基胍)处理获得。制备这种菌株的麦迪霉素生物合成基因并与已经确定的生物合成基因相比较寻找引入突变的位置。为了确定突变的效果，通过同源重组将由此获得的突变基因转入没有突变的麦迪霉素生产菌株中(例如，Bierman等人的方法，Gene，116，46(1992))，并验证产率的改变。

[0048] 聚酮合成酶具有上述的KS，AT以及ACP结构域，但其酶活性(反应速度)被认为是不规则的，人们因此认为代谢中间产物得以聚集。因此，人们认为聚酮合成能力通过明确低反应速度组件，以及用高反应速度组件对其进行置换得以提高。示范性的置换方法可以利用基因操作领域所通常使用的方法进行构建，其实例包括引入限制性内切酶识别序列以及在其中插入目的置换位点，或者通过PCR以及连接扩增目的位点的方法。

[0049] 根据本发明，麦迪霉素产率提高的麦迪霉素生物合成基因除了每一组件或者其部分的上述的氨基酸序列的取代，可以包含一或者多个选自缺失，添加，插入以及取代的突变(在下文具有这种突变的基因称作“类似物”)，在所述麦迪霉素生物合成基因中对应于麦迪霉素生物合成基因，聚酮合成酶基因或者其部分序列中所含的每一组件的氨基酸序列被对应于其它组件的氨基酸序列取代。一或者多个选自缺失，插入，添加以及取代的突变的数目没有特殊限制，条件是保持麦迪霉素的产率，而且优选突变从1到10，更优选从1到6，最优选从1到4个氨基酸残基。

[0050] 可以例如根据下列方法制备这种进一步添加了突变的菌株。

[0051] 通过引入随机突变或者位点特异性突变有可能获得本发明天然酶的氨基酸序列中实现缺失，添加，插入以及取代一或两个或更多氨基酸残基至少之一的基因。由此，也可以获得编码具有本发明酶活性，但是在诸如最适温度，稳定温度，最适pH值，稳定pH，底物特异性等特性稍有不同的本发明的酶的基因。

[0052] 对于引入随机突变的方法，例如在亚硫酸氢钠作用下引起胞嘧啶转化成尿嘧啶的转换性突变的方法[Weiher，H.等人，Proceedings of theNational Academy of Sciences ofthe USA，vol.79，1408-1412(1982)]可用作化学处理DNA的方法，在合成双链过程中在[α-S]dNTP存在下产生碱基取代的方法[Shiraishi，H.等人，Gene，vol.64，313-319(1988)]可用作生化法，以及通过向反应系统添加锰实施PCR降低核苷酸掺入的准确度的方法[Analytical Biochemistry，vol.224，347-353(1995))可用作采用PCR的方法。

[0053] 对于引入位点特异性突变的方法，例如可以采用如下方法：利用琥珀突变的方法[缺口双链体方法，Nucleic Acids Research，vol.12，no.24，pp.9441-9456(1984)]，利用限制性内切酶识别位点的方法[AnalyticalBiochemistry，vol.200，81-88(1992)，Ito，W.等人，Gene，vol.102，pp.67-70(1991)]，利用dut(duTpase)以及ung(尿嘧啶DNA糖基化酶)突变的方法[Kunkel method，Kunkel，A.T.，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences ofthe USA，vol.82，pp.488-492(1985)]，利用使用DNA聚合酶以及DNA连接酶的琥珀突变的方法[寡核苷酸-指导的双重琥珀(ODA)方法的方法，Hashimoto-Goto，T.等人，Gene，vol.152，pp.271-275(1995)，JP-A-7-289262]，利用诱导DNA修复系统的宿主的方法(JP-A-8-70874)，利用催化DNA链交换反应的蛋白的方法(JP-A-8-140685)，利用用于添加限制性内切酶识别位点的突变诱导应用的两个引物的PCR方法(USPS，512，463)，利用具有灭活耐药性基因以及两个引物的双链DNA载体的PCR方法[Shen，T.等人，Gene，vol.103，pp.73-77(1991)]，利用琥珀突变[WO98/02535]等的PCR方法。

[0054] 此外，位点特异性突变可以通过利用市售的试剂盒被轻易地引入。作为市售的试剂盒，可以使用如下的试剂盒：例如利用缺口双链体方法的Mutan(注册商标)-G(由Takara Bio制造)，利用Kunkel法的Mutan(注册商标)-K(由Takara Bio制造)，利用ODA方法的Mutan(注册商标)-Express Km(由Takara Bio制造)，利用用于突变诱导应用的引物以及Pyrococcus furiosus-来源的DNA聚合酶的QuikChangeTM Site-DirectedMutagenesis Kit(由STRATAGENE制造)等等，并且可以使用作为应用PCP方法的试剂盒的如下试剂盒：TaKaRa LA PCR体外诱变试剂盒(由Takara Bio制造)，Mutan(注册商标)-Super Express Km(由Takara Bio制造)等。

[0055] 由麦迪霉素产率提高的菌株制备麦迪霉素产率提高的麦迪霉素生物合成基因的方法描述在例如从Streptomyces mycarofaciens菌株1149-38进行制备的例子中。

[0056] 本发明的麦迪霉素生物合成基因可以例如通过下列方法分离白Streptomyces mycarofaciens菌株1149-38。因为该序列如本发明公开中所揭示，可以人工合成相关的基因，但是可以从Streptomycesmycarofaciens菌株1149-38高效地制备。

[0057] 基因组DNA通过Kieser，T.等人在Practical Streptomyces Genetics，The John Innes Foundation，Norwick，UK(2000)中描述的常规方法由Streptomyces mycarofaciens strain1149-38的细胞提取而来。由Streptomyces mycarofaciens的基因组DNA组成的基因组文库由用合适的限制性内切酶消化基因组DNA然后用合适的载体连接所述产物进行制备。

[0058] 作为载体，例如可以使用质粒载体，噬菌体载体，粘粒载体，BAC载体以及类似的多种载体和质粒。

[0059] 可以通过使用合适的探针杂交由基因组文库获得包含目的麦迪霉素生物合成基因的DNA片段的制备物。例如，基于通常已知的聚酮合成酶的氨基酸序列的保守区域合成合适的引物，利用它们以及利用Streptomyces mycarofaciens的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增的DNA片段可被用作探针。此外，因为麦迪霉素生物合成基因的序列如本发明公开所揭示，基于序列信息合成合适的引物，利用Streptomyces mycarofaciens的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增的DNA片段也可以被用作探针。利用由此获得的DNA片段作为探针进行基因组文库的筛选。

[0060] 此外，因为麦迪霉素生物合成基因的序列如本发明公开被揭示，基于序列信息合成用于目的基因扩增的引物，利用Streptomycesmycarofaciens的基因组DNA作为模板进行PCR，然后由此扩增的DNA片段可通过将其与合适的载体连接被分离。

[0061] 由此，对于提高麦迪霉素生物合成能力的聚酮合成酶基因，有可能通过在分离之前直接利用突变株产生麦迪霉素，或者可以将麦迪霉素生物合成能力提高的聚酮合成酶基因转入麦迪霉素生产菌株中，但是也可以通过连同总长度的麦迪霉素生物合成簇转化到任选的宿主中获得目的麦迪霉素。

[0062] 应宿主种类的需要确定所用的载体，但是没有特别限制，例如pBR322系统以及pUC系统的载体可以被引作大肠杆菌载体，pUB110系统，pPL603系统以及pC194系统的载体可作为枯草芽胞杆菌载体，pYC系统以及pYE系统的载体作为酵母载体，pIJ101系统，pSET152系统，pSG5系统，pSCP2*系统，SAM2系统，pKC1139系统以及 C31系统的载体可作为放线菌载体(Kieser，T.等，Practical Streptomyces Genetics，The John Innes Foundation，Norwick，UK(2000))。

[0063] 然后，利用由此获得的质粒将基因转入宿主。宿主应所用载体的种类的需要可任选自放线菌，大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，酵母，丝状真菌及其他微生物。

[0064] 当载体用于放线菌应用时作为宿主的尤其优选的实例包括Streptomyces mycarofaciens，Streptomyces coelicolor，吸水链霉菌(Streptomyces hydroscopicus)，弗 雷 德 氏 链 霉 菌 (Streptomycesfradiae)，Streptomyces lividans，Streptomyces kitasatoensis，Streptomycesambofaciens以及Streptomyces themotolerans。

[0065] 作为将载体转入宿主菌株的方法，最有效方法的选择取决于宿主以及载体的类型。当应用放线菌载体时，可以进行结合大肠杆菌的转移，用放线菌噬菌体感染，向宿主菌株引入原生质体等(Kieser，T.等人，Practical Streptomyces Genetics，The John Innes Foundation，Norwick，UK(2000))。由所应用的载体具有的遗传指标，诸如抗生素抗性，痘痕(pock)形成，黑色素生物合成等等可被用于选择由转化获得的重组体。

[0066] 通过通常已知的方法培养获得的重组体，可以检验它们新近获得的特性。

[0067] 麦迪霉素的产生

[0068] 可以通过培养上述包含提高麦迪霉素生物合成能力的麦迪霉素合成基因，或者转入了提高麦迪霉素生物合成能力的麦迪霉素合成基因的重组体的突变株产生麦迪霉素。

[0069] 对于介质，可以使用通常应用的组分诸如葡萄糖，蔗糖，淀粉糖浆，糊精，淀粉，甘油，糖浆，动植物油等作为碳源。同样，大豆粉，麦芽，玉米浆，棉子粉，肉汁，多聚蛋白胨，麦芽汁，酵母抽提物，硫酸铵，硝酸钠，尿素等可用作氮源。除了这些组分，需要时也可以添加钠，钾，钙，镁，钴，氯，磷酸(磷酸氢二钠等)，硫酸(硫酸镁等)及其他可以形成离子的无机盐。同样，需要时还可以添加硫胺素(盐酸硫胺素等等)等多种维生素，谷氨酸(谷氨酸钠等等)，天门冬酰胺(DL-天门冬酰胺等等)等氨基酸，核苷酸等微量养分以及抗生素等选择药物。此外，可以任选添加能够有助于菌株生长以及促进麦迪霉素产生的有机物以及无机物。

[0070] 介质pH例如为大约从pH5.5到pH8。对于培养法，可以采用需氧条件下的固体培养，振荡培养，有氧搅拌培养或者沉浸有氧培养(submerged aeration culture)，其中沉浸有氧培养尤其合适。适合于培养的温度为从15℃到40℃，但是在大多数情况下菌株生长在大约从22℃到30℃的温度下。虽然麦迪霉素的产量依赖于培养基以及培养条件或者所使用的宿主的不同而不同，通过任何一种培养法通常在2天到10天内其累积达到最大。当培养期间麦迪霉素的量达到最大时，中止培养并分离目的物质并由培养的混合物进行纯化。

[0071] 为了从培养的混合物收集麦迪霉素，可以利用诸如溶剂萃取，离子交换树脂法，吸附或者分配柱层析，凝胶过滤，渗析，沉淀，结晶等可单独或者任选组合使用的特性，由常规分离方式进行提取和纯化。例如，用丙酮，甲醇，丁醇，乙酸乙酯，乙酸丁酯等由培养的混合物提取。

[0072] 为了更进一步纯化麦迪霉素，利用硅胶，氧化铝等吸附剂，Sephadex LH-20(由Amersham Bioscience制造)，Toyopearl HW-40(由Tosoh制造)等实施层析是非常有效的。

[0073] 通过这种方法或者其任选组合获得纯的麦迪霉素。

[0074] 实施例

[0075] 以下基于实施例示范性描述了本发明，虽然这些并不限制本发明。

[0076] 实施例1-1

[0077] 分离Streptomyces mycarofaciens(ATCC 21454)-来源的基因组DNA以及制备基因组文库

[0078] 将冷冻的Streptomyces mycarofaciens(ATCC 21454)菌种接种到50ml的S#14培养基(2％葡萄糖，1％多聚蛋白胨，0.05％K2HPO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.3％NaCl，pH7.0)中并在28℃培养20小时。利用0.22μm的Bottle top过滤器(由Corning制造)过滤培养液体然后用10mMEDTA洗涤过滤器上的细胞两次回收细胞。用液氮冷冻由此获得的细胞然后利用研钵和研杵研磨。利用ISOPLANT(由Nippon Gene制造)并根据附装的说明书从研磨的细胞分离基因组DNA。

[0079] 用Sau3AI部分消化由此分离的基因组DNA，然后对其末端脱去磷酸。用已经用BamHI和XbaI(单独XbaI位点的脱磷酸)消化的SuperCosI(由Stratagene制造)连接这种DNA片段制备重组体粘粒载体。利用MaxPlax Packaging Extract(由Epicentre Technologies制造)并根据附装说明书在这种重组体粘粒载体上进行体外包装。其后，用这种重组噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue MR菌株并在板上培养实现集落的形成。

[0080] 实施例1-2

[0081] 探针的制备

[0082] 下列引物由PKS基因的保守区域制备而来。

[0083] KS-F：5′-CGGTSAAGTCSAACATCGG-3′(SEQ ID NO：1)

[0084] KS-R：5′-GCRATCTCRCCCTGCGARTG-3′(SEQ ID NO：2)

[0085] 使用KS-F和KS-R，利用基因组DNA作为模板进行PCR。使用ExTaqDNA聚合酶(由Takara Bio制造)进行PCR。使用TOPO TA克隆试剂盒(由Invitrogen制造)并根据其附装的说明书将由此扩增的DNA片段插入pCR2.1-TOPO质粒载体。

[0086] 使 用 DNA 测 序 试 剂 盒 dRhodamine Terminator Cycle SequencingReady Reaction(由Applied Biosystems制造)以及ABI PRISM GeneticAnalyzer(由Applied Biosystems制造)并根据其附装的说明书进行所插入DNA片段的测序。由此证实分离的DNA片段是PKS基因的一部分。

[0087] 实施例1-3

[0088] 粘粒文库的筛选

[0089] 使用包含一部分麦迪霉素PKS基因作为模板以及使用引物KS-F以及KS-R由PCR扩增DNA片段，并用作杂交的探针。

[0090] 将Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotech)置于形成基因组文库的菌落的板上，由此实现集落对其的附着力。通过将这种膜进行碱处理，实现细胞溶解并由此同样将膜上的重组体粘粒DNA变性成单链并粘附到膜上。使用ECL指导的核酸标记和检测系统(由AmershamBioscience制造)并根据其附装的说明书检测膜上的阳性克隆。用这种方式，分离包含与探针同源的区域的粘粒克隆pCOMW1(FERMP-18935)和pCOMW2(FERM P-18936)。经PCR由部分分析的pCOMW1(FERMP-18935)末端序列新近制备探针。使用这种探针再次进行基因组文库的筛选，并分离pCOMW4(FERM P-18937)。

[0091] 实施例1-4

[0092] 核苷酸序列的测定

[0093] 用 HaeIII 部 分 消 化 克 隆 pCOMW1(FEPMP-18935) 和pCOMW2(FERMP-18936)，然后由电泳纯化约2kb的片段并与已经用SmaI消化的pUC19连接。
将这种质粒引入大肠杆菌XL1-blue菌株，由任选的菌落提取粒，使用-21M13正向引物和M13反向引物作为引物由ABI3700(由Applied Biosystems制造)并根据其附装的说明书进行测序。从由此获得的结果，将未充分分析的区域再次由基于已经分析的核苷酸序列新设计的引物进行测序。其后，基于该分析结果，由引物waking确定pCOMW4(FERM P-18937)的部分序列。

[0094] 实施例1-5

[0095] Streptomyces mycarofaciens菌株1251-2麦迪霉素生物合成基因簇的克隆以及序列分析

[0096] Streptomyces mycarofaciens菌株1251-2是其麦迪霉素产率由亚硝基胍处理得以提高的菌株(图2)。因为人们认为这种菌株的产率的提高应归于麦迪霉素生物合成基因的突变，所以克隆该基因簇并与ATCC21454-来源的生物合成基因相比较。

[0097] 与克隆ATCC　21454-来源的基因同样的方法进行Streptomycesmycarofaciens菌株1251-2来源的基因组DNA的分离，制备粘粒文库并克隆。

[0098] 筛选Streptomyces mycarofaciens菌株1251-2-来源的粘粒文库获得pCOM1和pCOM2。由其序列分析的结果，显示在其中含有麦迪霉素生物合成基因中的orf36到11。

[0099] 实施例1-6

[0100] 各菌株之间比较麦迪霉素生物合成基因簇

[0101] 对于以上述方式获得的2种麦迪霉素生物合成基因簇的各翻译区，比较其DNA序列。Streptomyces mycarofaciens菌株ATCC21454的麦迪霉素聚酮合成酶的orf1的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：3中，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：4中，ORF2的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：5中，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：6中，Streptomyces mycarofaciens菌株1251-2的麦迪霉素聚酮合成酶的ORF2的核苷酸序列显示在SEQ IDNO：7中，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：8中。

[0102] 结果显示在Streptomyces mycarofaciens菌株1251-2来源的麦迪霉素生物合成基因簇中，与苷元生物合成有关的ORF2的KS3结构域被突变并具有与存在于ORF1中的KS2结构域部分相同的序列(图3)。

[0103] 实施例1-7

[0104] 检测具有突变体麦迪霉素生物合成基因的麦迪霉素高产菌株

[0105] 为了判断引入上述特异于Streptomyces mycarofaciens菌株1251-2的聚酮合成酶的突变的继代培养的菌株的阶段，通过PCR法进行突变的检测。使用W-ORF2-U与ORF2-L以及H-ORF2-U与ORF2-L的组合作为引物并使用Takara Bio生产的LA-PCR试剂盒，在94℃热变性3分钟然后重复由94℃1分钟以及68℃2.5分钟组成的步骤的25个循环，由此扩增ORF2的KS3结构域。

[0106] W-ORF2-U：5′-GTGATGTATGACGACTACGG-3′(SEQ ID No：9)

[0107] H-ORF2-U：5′-AAACCTCGGAAGTGTGGTCT-3′(SEQ ID No：10)

[0108] ORF2-L：5′-ATCGAGGGCGTCGGCGGTAC-3′(SEQ ID No：11)

[0109] 结果，在菌株938-15和菌株1149-38之间引入了突变。

[0110] 实施例1-8

[0111] 比较Streptomyces mycarofaciens菌株938-15和菌株1149-38(FERMBP-10501)的麦迪霉素的产率。

[0112] 将 每 一 Streptomyces mycarofaciens 菌 株 938-15 和 菌 株1149-38(FERMBP-10501)的0.1ml份的冷冻菌种接种在内径2cm的试管中所含的10ml种子培养基(2％可溶性淀粉，1％葡萄糖，0.5％多聚蛋白胨，0.3％酵母抽提物，0.6％麦芽，
0.2％脱脂大豆饼，0.2％CaCO3，0.02％消泡剂(Silicon KM-72，由Shin-Etsu Chemical制造)灭菌之前pH7.0，2个6mm直径的小珠)中并在振荡器上28℃培养22小时，并用作种子培养物。其后，将1.0的种子培养物接种在250ml容量锥形烧瓶中所含的30ml的生产培养基(1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％肉汁，0.4％植物蛋白胨，3％大豆原油，0.2％NaCl，
0.3％CaCO3，0.08％乳化剂(Nikkol CO-20TX，由Nikko Chemical制造)，pH7.0)中并在振荡器上28℃培养67到77小时。用50％硫酸将培养液体调节到pH4.0或者更少然后过滤，并将其用作分析样品。对于分析法，在以下条件下进行检测：柱；YMC-PackODS-AM(S-5μm，
6.0×150mm，YMC)，流动相；缓冲剂(0.01MCH3COONH4，0.0001MK2HPO4，pH6.05):CH3CN:C2H5OH＝3:3:2，柱温；35℃，流速；1.20ml/min，检测波长：232nm和280nm。

[0113] 结果，在菌株938-15的情况下总麦迪霉素量为798μg/ml，在菌株1149-38(FERM BP-10501)情况下为1127μg/ml。

[0114] 本 申 请 是 基 于 2005年3月31日 提 交 的 日 本 专 利 申 请 JP2005-101836，其全部内容在此处引入作为参考，无异于详细的陈述。

[0115] 序列表

[0116] <110>明治制菓株式会社(Meiji Seika Kaihsa，Ltd)

[0117] <120>麦迪霉素高产菌株(Midecamycin hyper producing strain)

[0118] <130>SPI060897-66

[0119] <150>P2005-101836

[0120] <151>2005-03-31

[0121] <160>11

[0122] <170>PatentIn version3.1

[0123] <210>1

[0124] <211>19

[0125] <212>DNA

[0126] <213>Artificial

[0127] <220>

[0128] <223>Synthetic primer

[0129] <400>1

[0130]

[0131] <210>2

[0132] <211>20

[0133] <212>DNA

[0134] <213>Artificial

[0135] <220>

[0136] <223>Synthetic primer

[0137] <400>2

[0138]

[0139] <210>3

[0140] <211>13536

[0141] <212>DNA

[0142] <213>Streptomyces mycarofaciens

[0143] <220>

[0144] <221>CDS

[0145] <222>(1)..(13533)

[0146] <223>

[0147] <400>3

[0148]

[0149]

[0150]

[0151]

[0152]

[0153]

[0154]

[0155]

[0156]

[0157]

[0158]

[0159]

[0160]

[0161]

[0162]

[0163]

[0164]

[0165]

[0166]

[0167]

[0168]

[0169]

[0170]

[0171]

[0172]

[0173] <210>4

[0174] <211>4511

[0175] <212>PRT

[0176] <213>Streptomyces mycarofaciens

[0177] <400>4

[0178]

[0179]

[0180]

[0181]

[0182]

[0183]

[0184]

[0185]

[0186]

[0187]

[0188]

[0189]

[0190]

[0191]

[0192]

[0193]

[0194]

[0195]

[0196]

[0197]

[0198]

[0199]

[0200]

[0201]

[0202] <210>5

[0203] <211>5835

[0204] <212>DNA

[0205] <213>Streptomyces mycarofaciens

[0206] <220>

[0207] <221>CDS

[0208] <222>(1)..(5832)

[0209] <223>

[0210] <400>5

[0211]

[0212]

[0213]

[0214]

[0215]

[0216]

[0217]

[0218]

[0219]

[0220]

[0221]

[0222] <210>6

[0223] <211>1944

[0224] <212>PRT

[0225] <213>Streptomyces mycarofaciens

[0226] <400>6

[0227]

[0228]

[0229]

[0230]

[0231]

[0232]

[0233]

[0234]

[0235]

[0236]

[0237]

[0238] <210>7

[0239] <211>5847

[0240] <212>DNA

[0241] <213>Streptomyces mycarofaciens

[0242] <220>

[0243] <221>CDS

[0244] <222>(1)..(5844)

[0245] <223>

[0246] <400>7

[0247]

[0248]

[0249]

[0250]

[0251]

[0252]

[0253]

[0254]

[0255]

[0256]

[0257] <210>8

[0258] <211>1948

[0259] <212>PRT

[0260] <213>Streptomyces mycarofaciens

[0261] <400>8

[0262]

[0263]

[0264]

[0265]

[0266]

[0267]

[0268]

[0269]

[0270]

[0271]

[0272] <210>9

[0273] <211>20

[0274] <212>DNA

[0275] <213>Artificial

[0276] <220>

[0277] <223>Synthetic primer

[0278] <400>9

[0279]

[0280] <210>10

[0281] <211>20

[0282] <212>DNA

[0283] <213>Artificial

[0284] <220>

[0285] <223>Synthetic primer

[0286] <400>10

[0287]

[0288] <210>11

[0289] <211>20

[0290] <212>DNA

[0291] <213>Artificial

[0292] <220>

[0293] <223>Synthetic primer

[0294] <400>11

[0295]