一种日本血吸虫多价DNA疫苗和制备方法

摘要

本发明公开了一种日本血吸虫抗原基因的融合基因及构成的DNA疫苗和制备方法。该日本血吸虫DNA多价疫苗是由日本血吸虫抗原基因(包括sj23、sjFABP、sj26、sjGAPDH、sjTPI、sj97)及其日本血吸虫抗原基因的融合基因与具有多个插入位点的真核表达载体所组成。30种日本血吸虫抗原基因的融合基因是由6种日本血吸虫抗原基因通过“融合PCR”制备得到。将融合基因或者抗原基因插入真核表达载体，构建日本血吸虫DNA多价疫苗。该融合基因在抗原基因基础上进行了改造，实现了多重抗原免疫保护，形成针对血吸虫多个发育阶段的持续免疫杀伤，起到良好的免疫保护效果。其减虫率达到为52.1～65.3％，肝脏减卵率达到为39.8～75.6％，是一种较为理想的疫苗，在血吸虫病的预防与防治中具有重要意义。

权利要求

1.一种日本血吸虫多价DNA疫苗，其特征在于：以pVIVO2，pcDNA3.1(+/-)，pVAC，pBOOST2，pFUSE-Fc为真核表达载体，在该真核表达载体的两个多克隆位点上分别插入一个日本血吸虫抗原基因的融合基因构成四价疫苗，或者在所述真核表达载体的一个多克隆位点上插入日本血吸虫抗原基因、另一个多克隆位点上插入日本血吸虫抗原基因的融合基因构成三价疫苗；

所述日本血吸虫抗原基因为：

脂肪酸结合蛋白 sjFABP

23kDa膜蛋白 sj23

甘油磷酸脱氢酶 sjGAPDH

谷胱甘肽转移酶 sj26

所述融合基因包括：(1)脂肪酸结合蛋白基因sjFABP与23kDa膜蛋白基因sj23融合基因；(2)甘油磷酸脱氢酶基因sjGAPDH与谷胱甘肽转移酶基因sj26融合基因；在两抗原基因间通过一段编码疏水性多肽的DNA序列(G4S)m连接，并且在翻译的过程中保持原来的阅读框，其中1＜m＜10。

说明书

一种日本血吸虫多价DNA疫苗和制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种日本血吸虫抗原基因的融合基因，及构成的日本血吸虫多价DNA疫苗，和该疫苗的制备方法。

[0002] 背景技术

[0003] 血吸虫病是一种严重危害人类及家畜健康的人畜共患寄生虫病，据WHO估计全球至少有6亿人受到感染血吸虫病威胁，约2亿人受到感染，我国仍有150万病人，耕牛感染也相当严重，是发展中国家包括中国的一个主要公共卫生问题。虽然长期以来，使用吡喹酮药物化疗安全高效，但由于其药价高，治疗后容易再感染，以及可能产生血吸虫虫株抗药性，给血吸虫病的控制带来了较大的困难。因此，人们将对血吸虫病的有效防治寄希望于有效疫苗的研制与开发。

[0004] 现有的血吸虫疫苗主要有减毒活疫苗和基因工程蛋白疫苗。血吸虫尾蚴减毒活疫苗需要特定的设备，数量来源有限，携带也不方便，存在血吸虫尾蚴的毒力回复，即存在安全性问题；基因工程蛋白疫苗流程长，制备工艺难度较大，费时费力，人力物力花费较大，成本很高，难以推广应用，且蛋白疫苗不易保存。自从1990年Wolff等首次报道肌肉注射“裸”质粒DNA可被肌肉摄取并表达目的基因多编码的蛋白质以来，DNA疫苗受到了广泛关注并得到迅速发展。与传统的减毒活疫苗和亚单位疫苗相比，DNA疫苗因具有安全、高效、经济，方便等优势而成为血吸虫疫苗研究领域的一个亮点。目前，国际卫生组织所公布的6种特异性的日本血吸虫抗原基因：

[0005] 脂肪酸结合蛋白(sjFABP，fatty acid binding protein)，sjFABP含有133个氨基酸残基，编码区片段长度为399bp，分子量约14kDa。sjFABP是血吸虫运输脂质的载体，血吸虫利用它可以从宿主体内获得其自身不能合成长链脂肪酸以及固醇类物质，并合成拮抗宿主免疫的脂肪簇衍生物，从而逃避宿主免疫攻击。现在已经证明的经过人工纯化天然或者重组表达的血吸虫脂肪酸结合蛋白，以及携带脂肪酸结合蛋白编码基因的DNA疫苗，免疫动物均能够诱发一定水平的抗血吸虫感染免疫保护性作用。

[0006] 23KDa膜内在蛋白(sj23)，sj23含有个氨基酸残基，编码区片段长度为657bp，分子量约23kDa。sj23是一个非糖基化、水溶性的膜相关蛋白，存在于日本血吸虫的体表， 作为对宿主有直接作用的主要抗原成份，对于维持血吸虫的生长和发育起着重要的作用，血吸虫23kDa膜内在蛋白由于直接暴露于宿主免疫系统，及独特的免疫学及结构特征，可以作为宿主免疫的攻击目标。现在证明日本血吸虫23kDa抗原蛋白的编码基因构成的DNA疫苗的确具有免疫效果，成为有价值的诊断抗原和候选疫苗。

[0007] 谷胱甘肽S转移酶(sj26)，sj26含有217个氨基酸残基，编码区片段长度为657bp，分子量约26kDa。存在于雄虫的实质组织及雌虫卵黄腺质间的实质细胞内，表膜并没有发现sj26的存在。sj26也是一种存在于人体中的酶，但是与正常的人蛋白无交叉反应，使用sj26作为疫苗，不会引起人类自身免疫性疾病。从日本血吸虫中提取的sj26蛋白免疫小鼠，能够获得一定的免疫保护力。

[0008] 3-磷酸甘油醛脱氢酶(sjGAPDH)，sjGAPDH含有338个氨基酸残基，编码区片段长度为1017bp，分子量36589Da。sjGAPDH具有糖酵解作用，以及在脑组织中微血管的聚合与解聚作用，还具有蛋白激酶的活力。一般认为sjGAPDH作为日本血吸虫疫苗候选抗原主要起着可逆的氧化作用，sjGAPDH作为细胞内蛋白主要促使巯基-二硫化物的转化，在氧化剂存在下sjGAPDH酶迅速减少氧化诱导的细胞毒作用，因此sjGAPDH能够保护血吸虫对抗巨噬细胞等的氧介质的攻击。

[0009] 磷酸丙糖异构酶(sjTPI)，sjTPI含有252个氨基酸残基，编码区片段长度为759bp，分子量约28kDa。sjTPI作为酶性抗原，sjTPI是近年日本血吸虫疫苗研究中较为活跃的一个领域，sjTPI是一糖酵解酶，糖酵解在血吸虫糖代谢过程中具有重要作用，催化磷酸二羟丙酮与3-磷酸甘油醛之间的可逆反应，它存在于成虫所有细胞，如：肠、肌肉和表膜。

[0010] 副肌球蛋白(Paramyosin Sj97)，sj97含有869个氨基酸残基，编码区片段长度为2607bp，分子量约97kDa。sj97是无脊椎动物所特有的副肌球蛋白，副肌球蛋白作为血吸虫疫苗候选抗原的研究逐渐深入，它是一种糖蛋白。它于血吸虫的肌肉组织中，也位于日本血吸虫的腹吸盘后的腺体内。Sj97原核表达的蛋白能够特异性与免疫动物和日本血吸虫病患者的抗血清抗体反应。

[0011] 就目前国内外研究现状来看，日本血吸虫病DNA疫苗针对这6种日本血吸虫抗原基因的单价疫苗研究较多，但是免疫力普遍较低，而且免疫保护力不稳定。究其原因，可能是由于血吸虫感染后保护性免疫机制复杂多样，不同的抗原分子所提供的保护性机制不同，免疫保护力也高低不一，单一分子很难针对体内不同虫期的虫体产生完全保护力。因而，需要不同的抗原分子协同作用，利用不同抗原表位的不同免疫作用，协同诱导多种免疫杀虫机制，杀灭多个发育期的血吸虫，以克服单个分子抗原诱导的免疫保护水平偏低的问题来提高免疫保护力。所以，复合多价疫苗成为目前DNA疫苗研究的新方向和应用热点。

[0012] 融合PCR技术是一种新型的基因工程技术，它是PCR技术的一种延伸应用。PCR技术(多聚酶链式反应)是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操作繁杂，而有时为了构建限制性位点还会影响解读三联密码的正确性。1989年，Horton等人提出了SOE法(Gene splicing by over lap extension)，即通过复制时DNA链的交错延伸实现基因拼接的融合PCR技术。分四步进行：(1)引物设计：序列I的引物a和b，a是常规引物，b的左半段为常规引物，右半段为铰链区(-)序列和基因II的部分引物序列；序列I的引物c和d，c右半段为常规引物，左半段为铰链区(+)序列和基因I的部分引物序列，则b和c的铰链区部分碱基可互补配对；(2)引物a，b扩增I片段，引物c，d扩增II片段；(3)两种PCR产物I，II混合，经变性及退火处理，I的下游部分和II的上游部分的碱基互补配对形成铰链区，在DNA聚合酶作用下，I和II链互为引物和模板，重叠延伸；(4)加入引物a和d，在DNA聚合酶作用下，合成“I-铰链-II”的融合基因片段。

[0013] 通过融合PCR的手段，任意两个血吸虫抗原基因通过中间的疏水性柔韧性多肽编码基因连接，能够一定程度上避免了单个抗原基因的抗原表位在融合蛋白折叠后被封闭，抗原表位无法与T细胞和B细胞有效结合，以致产生无效免疫。

[0014] 日本血吸虫抗原基因的融合基因所构成的DNA疫苗与原核表达多种抗原蛋白及多聚物进行混合相比较，有其独到的好处。将日本血吸虫抗原基因进行融合后克隆入真核表达载体，然后导入动物体内，利用机体自身的真核表达系统，表达翻译日本血吸虫抗原基因的融合基因，进入内质网的蛋白质发生化学修饰有：糖基化、羟基化、酰基化与二硫键的形成。原核细胞中没有内质网，这些化学修饰在原核表达中自然无法进行，所以，原核表达的产物并不是真正天然的日本血吸虫抗原，自然不是最有效的抗原形式。

[0015] 发明内容

[0016] 本发明的第一个目的是提供一种日本血吸虫多价DNA疫苗，该日本血吸虫多价DNA疫苗减虫率和减卵率显著高于单价疫苗，免疫效果持久；本发明的第二个目的是提供该日本血吸虫多价DNA疫苗的制备方法，该制备方法具有生产简便、分离效率高、分离速度快、制备规模可放大，产品为高浓度的日本血吸虫多价DNA疫苗超螺旋形式，无有毒化学试剂污染、内毒素含量极低，且具有无宿主细菌基因组DNA、RNA污染的优点。

[0017] 本发明提供的日本血吸虫多价DNA疫苗，其特征在于：以pVIVO2，pcDNA3.1(+/-)，pVAC，pBOOST2，pFUSE-Fc为真核表达载体，在该真核表达载体的多克隆位点上插入有至少一个日本血吸虫抗原基因的融合基因；

[0018] 在所述真核表达载体的另一个多克隆位点上还插入有日本血吸虫抗原基因或日本血吸虫抗原基因的融合基因；

[0019] 所述融合基因由日本血吸虫抗原基因：

[0020] 脂肪酸结合蛋白 sjFABP

[0021] 23kDa膜蛋白 sj23

[0022] 甘油磷酸脱氢酶 sjGAPDH

[0023] 谷胱甘肽转移酶 sj26

[0024] 磷酸丙糖异构酶 sjTPI

[0025] 副肌球蛋白 sj97

[0026] 两两之间任意组合，在两抗原基因间通过一段编码疏水性多肽的DNA序列(G4S)m连接，并且在翻译的过程中保持原来的阅读框，其中1＜m＜10。

[0027] 上述日本血吸虫多价DNA疫苗的制备方法，其步骤包括：

[0028] (1)提取日本血吸虫总RNA；

[0029] (2)RT-PCR获得日本血吸虫抗原基因，克隆基因并测序验证；

[0030] (3)利用“融合PCR”的手段获得融合日本血吸虫抗原基因的融合基因，克隆基因并测序验证；

[0031] (4)将日本血吸虫抗原基因的融合基因或者日本血吸虫抗原基因插入真核表达载体的多克隆位点，构建若干种日本血吸虫多价DNA疫苗，酶切测序验证，挑取阳性克隆子保种；

[0032] (5)发酵阳性克隆菌，收取菌体，利用标准碱裂解法获得日本血吸虫多价DNA疫苗粗提物；

[0033] (6)按照下述过程对日本血吸虫多价DNA疫苗粗提物进行纯化：

[0034] (6.1)利用硫酸铵沉淀法初步去除日本血吸虫多价DNA疫苗粗提物中的蛋白质； [0035] (6.2)采用凝胶过滤柱除去日本血吸虫多价DNA疫苗粗提物中的RNA和残余的蛋白质；

[0036] (6.3)利用离子交换柱层析从步骤(6.2)得到的产物中纯化超螺旋质粒DNA； [0037] (6.4)采用亲和吸附法去除内毒素，获得达到医用级疫苗纯度水平的日本血吸虫多价DNA疫苗样品。

[0038] 融合基因是通过融合PCR的重叠延伸技术，通过一段柔韧的疏水性氨基酸多肽编码的核苷酸序列作为铰链区，将两两血吸虫抗原基因进行融合，删除血吸虫抗原基因的融合基因中的终止密码子保证血吸虫抗原基因的融合基因序列通读。本发明通过设计融合PCR的铰链引物，成功地融合30种日本血吸虫抗原基因的融合基因。DNA疫苗最大的弱点之一就是不能多价抗原共同保护，大多数的单价DNA疫苗都是将单个抗原基因插入到真核表达的载体的多克隆位点，这样的免疫保护力度很有限。然而，将两个基因融合为一个基因，使得一个基因具有两个基因的免疫原性和抗原决定簇，单个疫苗载体上能够容纳和表达更多的抗原基因，从根本上解决原来单价DNA疫苗的缺陷。

[0039] 本发明通过发酵生产编码日本血吸虫抗原基因的融合基因的日本血吸虫多价DNA疫苗的宿主菌，碱裂解法大规模粗提取质粒。采用色谱纯化的手段，对日本血吸虫多价DNA疫苗粗提物进行纯化。本发明采用的融合表达方式，将两种日本血吸虫抗原基因融合在一起表达；同时选用具有两个多克隆插入位点的载体，在一个位点插入一个融合抗原基因之后，可在另一个多克隆位点插入另一个融合抗原基因或单基因，可同时利用多个日本血吸虫抗原基因表达的抗原蛋白的不同免疫保护作用，显著提高免疫效果，而且明显优于两个日本血吸虫抗原基因单个表达的多价疫苗的免疫效果。本发明日本血吸虫多价DNA疫苗不仅具有单价疫苗生产简便、安全高效、使用方便、价格低廉、利于贮运等优点，而且减虫率和减卵率显著高于单价疫苗，免疫效果持久，在目前血吸虫DNA疫苗研究中具有更广阔的开发应用前景。下面通过药理学实验，评价了各种疫苗的药效。

[0040] 本发明制备方法采用凝胶排阻色谱、离子柱层析和亲和吸附联用的色谱纯化手段，对日本血吸虫多价DNA疫苗的粗提物进行纯化，获得达到医用级疫苗纯度水平的日本血吸虫多价DNA疫苗样品。本工艺具有生产简便、分离效率高、分离速度快、制备规模可放大，产品为高浓度的日本血吸虫多价DNA疫苗超螺旋形式，无有毒化学试剂污染、内毒素含量低，且具有无宿主细菌基因组DNA、RNA污染的优点。

[0041] 经实验证明，本发明的日本血吸虫多价DNA疫苗通过融合表达的日本血吸虫抗原基因能通过表达抗原免疫产生较好的保护力。WHO指出疫苗诱导肌体抗血吸虫的保护力能达到50％，即可认为疫苗诱导的保护程度较高。

[0042] 免疫方案如下：190只8周龄的雄性BALB/c小鼠购自武汉生物制品研究所，随机分到18个实验组和1个对照组经股四头肌肌肉注射0.75％盐酸布比卡因，35μl/只。1天后在相同部位根据分组分别注射18种日本血吸虫多价DNA疫苗，100μg/只，免疫1次，对照组注射生理盐水。

[0043] 免疫后4周，每只实验鼠经腹部皮肤人工感染40±2条日本血吸虫尾蚴。攻击后6周剖 杀，肝门静脉灌注收集成虫计数。称右叶肝组织重量，加入5％KOH 20ml，于37℃孵箱中消化12h(过夜)，虫卵计数，算出虫卵数/g肝组织(EPG)。减虫率和肝组织减卵率的计算公式为：

[0044] 减虫率(％)＝(对照组平均虫数-免疫组平均虫数)×100％/(对照组平均虫数)；

[0045] 减卵率(％)＝(对照组平均肝内虫卵数-免疫组平均肝内虫卵数)×100％/(对照组平均肝内虫卵数)；

[0046] 剖杀后，取肝片组织于10％福尔马林中固定，常规石蜡连续切片，厚度为5μm，苏木素-伊红染色，在光镜下观察鼠肝病变。用目镜网状测微器(Olympus，日本)观察，虫卵肉芽肿面积的测量，按照方格数切割拼接，计算肉芽肿截面积，并求出虫卵肉芽肿的平均面积，每组以20个单卵肉芽肿面积计算。

[0047] 本实验的观察指标如下：

[0048] 1.减虫率：

[0049]

[0050]

[0051] (1)△与生理盐水组比较；(2)★与pVIVO2sj23组比较；(3)※与pVIVO2组比较；(4) #与pVIVO2sjFABP-23组比较

[0052] 2.减卵率：

[0053]

[0054] (1)△与生理盐水组比较；(2)★与pVIVO2sj23组比较；(3)※与pVIVO2组比较；(4)#与pVIVO2sjFABP-23组比较

[0055] 3.虫卵肉芽肿面积的比较

[0056]

[0057] ※与pVIVO2组比较

[0058] 本发明日本血吸虫多价DNA疫苗的减虫率达到为52.1％～65.3％，肝脏减卵率达到为39.8％～75.6％。按照WHO制定的血吸虫疫苗标准，本发明效果明显，能高效诱导抗血吸虫的免疫保护作用。

附图说明

[0059] 图1为pVIVO2真核表达载体；

[0060] 图2为日本血吸虫总RNA电泳图；

[0061] 图3为血吸虫抗原基因sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26；血吸虫抗原基因的融合基 因sj23-FABP、sjFABP-23、sj26-GAPDH、sjGAPDH-26的PCR产物鉴定电泳图；

[0062] 图4为pVIVO2/sjFABP-23构建策略图；

[0063] 图5为pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26构建策略图；

[0064] 图6为pVIVO2/sjFABP-23单酶切、双酶切鉴定电泳图；

[0065] 图7为pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26单酶切、双酶切、四酶切鉴定电泳图； [0066] 图8为第一步分离样品电泳图和色谱收集曲线；

[0067] 图9为第二步分离样品电泳图和色谱收集曲线。

具体实施方式

[0068] 本发明以WHO/TDR推荐的血吸虫最具潜力的疫苗候选分子为血吸虫抗原基因，包括sj23(23kDa膜蛋白)，sjFABP(脂肪酸结合蛋白)，sj26(谷胱甘肽转移酶)，sjGAPDH(甘油磷酸脱氢酶)，sj97(副肌球蛋白)，sjTPI(磷酸丙糖异构酶)。这6种日本血吸虫抗原基因编码区核苷酸序列通过查找GenBank数据库而获得。上述基因的克隆方案均采用反转录PCR的方法进行，即根据各基因两端的序列设计PCR引物，然后以组织来源的RNA为模板，采用RT-PCR反转录扩增相应基因，将扩增产物克隆测序加以验证。然后通过“融合PCR的重叠延伸技术”实验手段，人工构建含有sj23、sjFABP、sj26、sjGAPDH、sjTPI、sj97的日本血吸虫抗原基因的融合基因。

[0069] 该融合基因由sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97这6种日本血吸虫抗原基因两两之间任意组合，在两抗原基因间通过一段编码疏水性多肽(G4S)m(1＜m＜10)的DNA序列连接，并且在翻译的过程中保持原来的阅读框。该编码疏水性多肽：(ggnggnggnggnagy)m，其中，其中y＝(c或t)，n＝(a或g或c或t)。30种日本血吸虫抗原基因的融合基因编码区核苷酸序列，如表一所示。

[0070] 本发明以pVIVO2，pcDNA3.1(+/-)，pVAC，pBOOST2，pFUSE-Fc为真核表达载体(例如附图1)，将日本血吸虫抗原基因的融合基因或者日本血吸虫抗原基因插入真核表达载体的多克隆位点，构建了若干种日本血吸虫多价DNA疫苗。

[0071] 在下面的实施例中，进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。 [0072] 〔实例1〕日本血吸虫抗原基因sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97的克隆 [0073] 1.成虫总RNA的提取

[0074] 1)用生理盐水主动脉灌注法从感染42天的家兔门静脉收集成虫；

[0075] 2)取新鲜成虫100mg，加入1ml Trizol，以玻璃匀浆器于冰上快速碾磨使成匀浆，室温下放置5min；

[0076] 3)加入0.2ml氯仿，振摇15S，室温放置3min；

[0077] 4)4℃，12000rpm离心15min，将上清转移至另一EP管中；

[0078] 5)加入0.5ml异丙醇，涡旋混匀，室温静置10min；

[0079] 6)4℃，12000rpm离心10min，沉淀RNA，弃上清；

[0080] 7)加入75％乙醇1ml，4℃，7500rpm离心5min，弃上清；

[0081] 8)空气中干燥RNA 10min，加DEPC水50μl悬浮，55℃静置10min使之完全溶解，于-70℃保存；

[0082] 9)取2μlRNA溶液，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，电泳检测图片见附图2；

[0083] 10)取2μlRNA溶液，用DEPC水作50倍稀释，以核酸蛋分析仪测定标定浓度，RNA浓度(μg/μl)＝40×OD260值×稀释倍数/1000。

[0084] 2.cDNA第一链制备

[0085] 按Promega逆转录试剂盒说明书，于PCR管中加入下列成分：

[0086]

[0087] 总反应体系为20μl，瞬时离心混匀后25℃退火5min，37℃逆转录60min，70℃15min终止反应，得到cDNA，-20℃保存。以上述cDNA为模板分别以相应的引物进行PCR扩增得到含有不同酶切位点的目的单基因片段。

[0088] 3.RT-PCR扩增抗原基因片段

[0089] 根据sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97的碱基序列以及表达载体的特征设计八对特异性引物P1～P12。

[0090]

[0091]

[0092] 反应体系：

[0093]

[0094] 反应条件：

[0095]

[0096] 4.血吸虫抗原基因sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97的PCR产物进行电泳鉴定，0.7％琼脂糖凝胶电泳，电泳图片见图3。

[0097] 5.血吸虫单价抗原基因sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97的基因克隆 [0098] 1)将经过电泳鉴定的PCR产物，用胶带回收试剂盒(Omega公司)进行目的条带回收；

[0099] 2)回收产物用加A试剂盒(申能博采公司)对PCR产物加A尾；

[0100] 3)用pGEM T(Promega公司)试剂盒进行连接，4℃连接过夜；

[0101] 4)连接产物转化感受态大肠杆菌GT110，涂布于LB固体培养基平板上(Amp100μg/ml，X-Gal 20μg/ml，IPTG 200μg/ml)，37℃培养16h；

[0102] 5)进行兰白斑筛选，PCR、酶切鉴定阳性克隆子；

[0103] 6)测序鉴定阳性克隆子插入序列，获得插入sj23的阳性克隆子(pGEM-sj23)，插入sjFABP的阳性克隆子(pGEM-sjFABP)，插入sjGAPDH的阳性克隆子(pGEM-sjGAPDH)，插入sj26的阳性克隆子(pGEM-sj26)，插入sjTPI的阳性克隆子(pGEM-sjTPI)，插入sj97的阳性克隆子(pGEM-sj97)。

[0104] (实例2)融合抗原基因的制备

[0105] 1.构建30种日本血吸虫抗原基因的融合基因所需的融合PCR铰链区引物，以及上下游引物，如表二所示。

[0106] 2.融合PCR制备30种日本血吸虫抗原基因的融合基因(以sj23-FABP为例，其他29种依此类推)

[0107] 1)第一步PCR反应

[0108]

[0109]

[0110]

[0111] 2)重叠延伸PCR反应

[0112] 将上述PCR产物获得的目的基因sj23和sjFABP片段电泳后，用胶带回收试剂盒(Omega公司)进行目的条带混合回收，以如下反应条件进行重叠延伸：

[0113]

[0114] 3)第三步PCR反应

[0115] 将上述重叠延伸PCR反应产物进行第三步PCR反应，以如下反应条件合成融合抗原基因sj23-FABP：

[0116]

[0117] 3.日本血吸虫抗原基因sj23，sjFABP的融合基因sj23-FABP的基因克隆 [0118] 1)将经过电泳鉴定的PCR产物，用胶带回收试剂盒(Omega公司)进行目的条带回收；

[0119] 2)用pGEM T(Promega公司)试剂盒进行连接，4℃连接过夜；

[0120] 3)连接产物转化感受态大肠杆菌GT110，涂布于LB固体培养基平板上(Amp100μg/ml，X-Gal 20μg/ml，IPTG 200μg/ml)，37 ℃培养16h；

[0121] 4)进行兰白斑筛选，PCR、酶切鉴定阳性克隆子；

[0122] 5)测序鉴定阳性克隆子插入序列，获得插入sj23-FABP的阳性克隆子。 [0123] 5．日本血吸虫抗原基因的融合基因PCR产物电泳鉴定

[0124] 将已经获得的30种日本血吸虫抗原基因的融合基因sj23-FABP，sj23-26，sj23-GAPDH，Sj23-97，sj23-TPI，sjFABP-23，sjFABP-26，sjFABP-GAPDH，SjFABP-97，sjFABP-TPI，sj26-23，sj26-FABP，sj26-GAPDH，sj26-97，sj26-TPI，sjGAPDH-23，sjGAPDH-FABP，sjGAPDH-26，sjGAPDH-97，sjGAPDH-TPI，sj97-23，sj97-FABP，sj97-26，sj97-GAPDH，sj97-TPI，sjTPI-23，sjTPI-FABP，sjTPI-26，sjTPI-GAPDH，sjTPI-97的PCR产物进行电泳鉴定，0．7％琼脂糖凝胶电泳，其中sj23-FABP，sjFABP-23，sjGAPDH-26，sj26-GAPDH电泳图片，日本血吸虫抗原基因，日本血吸虫抗原基因的融合基因电泳图片见图3：Lane l，6，11，16：DL2000；Lane21：lkb Ladder：Lane2：sj23；Lane3：sjFABP：Lane4：sj23-FABP；Lane5：sjFABP-23；Lane7：sj26；Lane8：sjGAPDH；Lane9：s{26-GAPDH；Lanel0：
siGAPDH-26；Lanel2：sjTPI；Lanel3：sjFABP；Lanel4：sjTPI-FABP；Lanel5：sjFABP-TPI；
Lanel7：sjGAPDH；Lanel8：Sj97；Lanel9：sjGAPDH-97；Lane20：sj97-GAPDH。 [0125] (实例3)日本血吸虫DINA多价疫苗pVIVO2/sjFABP-23，pVIVO2/sjFABP-23/sjGAPDH-26的构建

[0126] 融合抗原基因片段sjFABP-23，其5’端含有BamHI酶切位点 ；其3’端含有EcoRI酶切位点 。将以上含sjFABP-23融合抗原基因的T载体用BamHI和EcoRI双酶切，回收sjFABP-23基因。用BamHI和EcoRI双酶切pVIVO2，回收pVIVO2片段。
将sjFABP-23基因插入pVIVO2的BamHI和EcoRI之间，构建策略见附图4。具体操作如下： [0127] 1．构建pVIVO2sjFABP-23的重组质粒：

[0128] 用限制型内切酶EcoRI和BamHI对sjFABP-23片段DNA进行双酶切。反应体系为：10×(Y+TangoTM)buffer 5μl，质粒5μg，BamHI IOU；EcoRI 1OU，补水至50μl。混匀后37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收sjFABP-23片段。同时用EcoRI和BamHI双酶切pVIVO2载体。反应体系：10×(Y+TangoTM)buffer 5μl，质粒5μg，BamHI 1OU，EcoRI IOU，补水至50μl。混匀后37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVIVO2片段。

[0129] 将上述的pVIVO2酶切片段与sjFABP-23片段混合，以T4 DNA ligase(MBI)进行连接。连接体系为：pVIVO2酶切片段0.1μg，sjFABP-23片段3μg，10×Ligation Buffer1μl，Ligase 0.2U，补水至10μl。连接反应条件定为12℃10小时。

[0130] 将上述连接反应产物以CaCl2法转化至感受态大肠杆菌GT110中(详见：分子克隆手册实验指南，第三版，科学出版社，2002)；连接产物10μl与GT110(1～2×109细菌/ml)感受态细胞200μl混合，冰浴30分钟，42℃ 2分钟，冰浴10分钟，加入0.6ml 2YT液体培养基(16g蛋白胨/L，10g酵母提取物/L，5g NaCl/L)，37℃培养45分钟后铺于含有潮霉素B(50μg/ml)的琼脂平板。37℃培养12小时后在琼脂平板上出现转化子。挑选转化子接种在含有100μg/ml潮霉素B的3ml 2YT培养基中37℃培养过夜，6000rpm/分钟离心收集菌体，以质粒小抽试剂盒(Promega)提取质粒DNA。然后用EcoRI和BamHI进行双酶切鉴定。反应体系为：10×(Y+TangoTM)buffer 5μl，重组质粒1μg，BamHI 10U，EcoRI 10U，补水至50μl。37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。之后将消化的样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果可见约1000bp的sjFABP-23片段和5.89kb的pVIVO2载体片段。说明筛选到的该阳性转化子为日本血吸虫DNA多价疫苗pVIVO2sjFABP-23。

[0131] 日本血吸虫DNA多价疫苗pVIVO2sjGAPDH-26的构建采取类似的方法：

[0132] 融合抗原基因片段sjGAPDH-26，其5’端含有BspHI酶切位点 其3’端含有XbaI酶切位点 将以上含sjGAPDH-26融合抗原基因的T载体用BspHI
和XbaI双酶切，回收sjGAPDH-26基因。用BspHI和XbaI双酶切pVIVO2sjFABP-23，回收pVIVO2sjFABP-23片段。将sjGAPDH-26基因插入pVIVO2sjFABP-23的BspHI和XbaI之间，构建策略见附图5。

[0133] 2.构建pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26的重组质粒：

[0134] 用限制型内切酶BspHI和XbaI对sjGAPDH-26片段DNA进行双酶切。反应体系+为：10×(O)buffer 5μl，质粒5μg，BspHI 10U，XbaI 10U，补水至50μl。混匀后37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收+
sjGAPDH-26片段。同时用BspHI和XbaI双酶切pVIVO2sjFABP-23载体。反应体系：10×(O)buffer 5μl，质粒5μg，BspHI 10U，XbaI10U，补水至50μl。混匀后37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVIVO2sjFABP-23片段。

[0135] 将上述的pVIVO2sjFABP-23酶切片段与sjGAPDH-26片段混合，以T4 DNA igase(MBI)进行连接。连接体系为：pVIVO2sjFABP-23酶切片段0.1μg，sjGAPDH-26片 段3μg，10×Ligation Buffer 1μl，Ligase 0.2U，补水至10μl。连接反应条件为12℃10小时。

[0136] 将上述连接反应产物以CaCl2法转化至感受态大肠杆菌GT110中(详见：分子克9
隆手册实验指南，第三版，科学出版社，2002)；连接产物10μl与GT110(1～2×10 细菌/ml)感受态细胞200μl混合，冰浴30分钟，42℃ 2分钟，冰浴10分钟，加入0.6ml 2YT液体培养基(16g蛋白胨/L，10g酵母提取物/L，5gNaCl/L)，37℃培养45分钟后铺于含有潮霉素B(50μg/ml)的琼脂平板，37℃培养12小时后在琼脂平板上出现转化子。挑选转化子接种在含有100μg/ml潮霉素B的3ml 2YT培养基中37℃培养过夜，6,000rpm/分钟离心收集菌体，以质粒小抽试剂盒(Promega)提取质粒DNA。然后用BspHI和XbaI进行双酶+
切鉴定。反应体系为：10×(O)buffer 5μl，重组质粒1μg，BspHI 10U，XbaI 10U，补水至
50μl。37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。之后将消化的样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果可见越1700bp的sjGAPDH-26片段和6.89kbpVIVO2sjFABP-23载体片段。说明筛选到的该阳性转化子为重组pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26。

[0137] 3.日本血吸虫多价DNA疫苗pVIVO2sjFABP-23，pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26酶切电泳验证：

[0138] 用限制型内切酶EcoRI和BamHI对pVIVO2sjFABP-23质粒DNA进行双酶切。反应+ TM体系为：10×(YTango )buffer 5μl，质粒5μg，BamHI 10U，EcoRI 10U，补水至50μl。混匀后37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。0.7％琼脂糖凝胶进行电泳检测，见附图6：Lane1，
4：1kb Ladder；Lane2：EcoRI和BamHI对pVIVO2/sjFABP-23质粒双酶切；Lane3：pVIVO2/sjFABP-23质粒。

[0139] 用限制型内切酶BspHI和XbaI对pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26质粒DNA进行双+酶切。反应体系为：10×(O)buffer 5μl，质粒5μg，BspHI 10U，XbaI 10U，补水至50μl。
混匀后37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。0.7％琼脂糖凝胶进行电泳检测，见附图7。 [0140] 用限制型内切酶EcoRI和BamHI对pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26质粒DNA进行双+ TM
酶切。反应体系为：10×(YTango )buffer 10μl，质粒10μg，BamHI 20U，EcoRI20U，补水至100μl。混匀后37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。0.7％琼脂糖凝胶进行电泳检测，见附图7。

[0141] 取50μl用EcoRI和BamHI对pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26质粒DNA进行双酶切酶切后的混合液，用等体积酚/氯仿(V/V＝1∶1)混合液抽提，上清转移到另外一只干净EP管中，加入等体积氯仿抽提，上清转移到另外一只干净EP管中，用两倍体积的 冰冷无水乙醇沉淀，置于-70℃冰箱30min。4℃，15000rpm离心15min，用75％乙醇脱盐两次，稍稍凉干，再用适量超纯水融解沉淀。再用用限制型内切酶BspHI和XbaI对已经经过限制型内切酶EcoRI和BamHI双酶切的pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26质粒DNA再次进行双酶+切。反应体系为：10×(O)buffer 5μl，质粒5μg，BspHI 10U，XbaI 10U，补水至50μl。
混匀后37℃水浴中反应8-9小时或者过夜。0.7％琼脂糖凝胶进行电泳检测，见附图7：
Lane1：DL2000；Lane2：BspHI和XbaI对pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26质粒双酶切；Lane3：
EcoRI和BamHI对pVIVO2sjFABP-23/sj GAPDH-26质粒双酶切；Lane4：EcoRI，BamHI，BspHI和XbaI对pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26质粒四酶切；Lane5：EcoRI对pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26质粒单酶切；Lane6：1kb Ladder。

[0142] 〔实例4〕日本血吸虫DNA多价疫苗pVIVO2sjFABP-23/sj26大规模制备 [0143] 本发明的日本血吸虫DNA多价疫苗使用上述的重组菌落大规模发酵制备的。培养方式为液体培养。采用细菌发酵罐进行悬浮培养，选用LB液体培养基(5g酵母膏/L；10g蛋白胨/L；10gNaCl/L)作为种子培养基，选用发酵培养基配方(30g酵母膏/L，10gNaCl/L；灭菌前调整pH到7)。发酵时添加矿物油作为消泡剂。培养温度37℃，培养时间24h。繁殖之后的菌体中分离日本血吸虫DNA多价疫苗，采用常规方法(分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002)，纯化步骤如下：

[0144] 1.样品溶解：将碱裂解法最后得到的异丙醇沉淀样品称重，然后用玻棒轻轻搅碎以便充分溶解，按照25ml/g的量加入TE溶液在摇床上4℃回旋5h。

[0145] 2.样品初步去蛋白：溶解的样品按9.9g/g的量加入固体(NH4)2SO4，然后再用TE定容到30ml/g，使最终(NH4)2SO4的浓度为2.5M。样品12000rpm离心20min，收集上清，然后用0.45μm微孔滤膜进行过滤。

[0146] 3.粗样品去除RNA，去蛋白：用硫酸铵粗提后的大提质粒样品，经凝胶过滤柱Sepharose 6FF(Pharmacia制造)除去RNA。线速度：1cm/min；缓冲液：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，0.2M(NH4)2SO4，pH8.0。见图8，分离样品电泳图：Lane1：质粒DNA和宿主RNA混合物；Lane2：纯化后的质粒DNA；Lane3：被除去的杂质RNA，和第一步分离样品的色谱收集曲线。

[0147] 4.经过去除RNA的样品，经Plasmid Select(Pharmacia制造)以不同离子强度洗脱，从超螺旋DNA、开环DNA中纯化超螺旋DNA。经凝胶过滤除去RNA的样品(V1ml)，加入固体硫酸铵(132.FABP×2.5×1.2×V1ml)，溶解后，用TE缓冲液定容到1.2×V1ml， 按100：1的体积比加入无水乙醇，0.45μm过滤。线速度：0.5cm/min；平衡缓冲液：2.0M(NH4)2SO4，
10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0，按100：1的体积比加入无水乙醇；洗脱缓冲液：
1.4M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0。见图9，分离样品电泳图：Lane1：从样品中除去的开环质粒DNA；Lane 2：从样品中纯化的超螺旋质粒DNA；Lane3：样品(开环质粒DNA和超螺旋质粒DNA的混合物)，和第二步分离样品的色谱收集曲线。

[0148] 5.通过Source30Q(Pharmacia制造)去除内毒素：将纯化好的超螺旋DNA加入四倍体积无菌水。线速度：3cm/min，平衡缓冲液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH8.0；洗脱缓冲液：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0。电泳检测，收集第二峰。

[0149] 表一30种日本血吸虫抗原基因的融合基因的核苷酸序列和它们在NCBI的GenBank所对应的各自的Accession Number

[0150]

[0151]

[0152] 表二为30种日本血吸虫抗原基因的融合基因的铰链区(-)、(+)链引物 [0153]

[0154]

[0155]

[0156]

[0157]