用于治疗代谢紊乱的方法和组合物

摘要

本发明涉及一种在高苯丙氨酸血症中用于治疗性干预的新方法和组合物。更具体而言，本说明书描述了使用含有BH4的组合物来治疗各种类型苯丙酮尿症的方法和组合物。BH4与其它治疗方案的联合治疗也在预期中。

权利要求

1.四氢生物喋呤或其药学上可接受的盐在制备用于治疗对象高苯丙氨酸血症的口服药物组合物中的用途，其中所述四氢生物喋呤的给药形式为每日一次，剂量为1mg/kg-30mg/kg，且其中所述四氢生物喋呤是结晶形式的多晶型B，所述结晶形式的多晶型B在

40℃和75％相对湿度下至少稳定3个月，其中作为二盐酸盐的多晶型B显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：8.7(vs)，6.9(w)，5.90(vw)，5.63(w)，

5.07(m)，4.76(m)，4.40(m)，4.15(w)，4.00(s)，3.95(m)，3.52(m)，3.44(w)，3.32(m)，

3.23(s)，3.17(w)，3.11(vs)，3.06(w)，2.99(w)，2.96(w)，2.94(m)，2.87(w)，2.84(s)，

2.82(m)，2.69(w)，2.59(w)和2.44(w)。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述每日一次的剂量为5mg/kg-30mg/kg。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述每日一次的剂量为5mg/kg-20mg/kg。

4.四氢生物喋呤或其药学上可接受的盐在制备用于治疗对象高苯丙氨酸血症的口服药物组合物中的用途，其中所述四氢生物喋呤的给药形式为每日一次，剂量为1mg/kg-30mg/kg，其中所述四氢生物喋呤选自下组：(a)结晶形式的多晶型A，其中作为二盐酸盐的多晶型A显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：15.5(vs)，12.0(m)，6.7(m)，6.5(m)，6.3(w)，6.1(w)，

5.96(w)，5.49(m)，4.89(m)，3.79(m)，3.70(s)，3.48(m)，3.45(m)，3.33(s)，3.26(s)，

3.22(m)，3.18(m)，3.08(m)，3.02(w)，2.95(w)，2.87(m)，2.79(w)，2.70(w)；

(b)结晶形式的多晶型F，其中作为二盐酸盐的多晶型F显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：17.1(vs)，12.1(w)，8.6(w)，7.0(w)，6.5(w)，6.4(w)，

5.92(w)，5.72(w)，5.11(w)，4.92(m)，4.86(w)，4.68(m)，4.41(w)，4.12(w)，3.88(w)，

3.83(w)，3.70(m)，3.64(w)，3.55(m)，3.49(s)，3.46(vs)，3.39(s)，3.33(m)，3.31(m)，

3.27(m)，3.21(m)，3.19(m)，3.09(m)，3.02(m)和2.96(m)；

(c)结晶形式的多晶型J，其中作为二盐酸盐的多晶型J显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：14.6(m)，6.6(w)，6.4(w)，5.47(w)，4.84(w)，

3.29(vs)，和3.21(vs)；

(d)结晶形式的多晶型K，其中作为二盐酸盐的多晶型K显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：14.0(s)，9.4(w)，6.6(w)，6.4(w)，6.3(w)，6.1(w)，

6.0(w)，5.66(w)，5.33(w)，5.13(vw)，4.73(m)，4.64(m)，4.48(w)，4.32(vw)，4.22(w)，

4.08(w)，3.88(w)，3.79(w)，3.54(m)，3.49(vs)，3.39(m)，3.33(vs)，3.13(s)，3.10(m)，

3.05(m)，3.01(m)，2.99(m)，和2.90(m)；

(e)结晶形式的水合物C，其中作为二盐酸盐的水合物C显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：18.2(m)，15.4(w)，13.9(vs)，10.4(w)，9.6(w)，

9.1(w)，8.8(m)，8.2(w)，8.0(w)，6.8(m)，6.5(w)，6.05(m)，5.77(w)，5.64(w)，5.44(w)，

5.19(w)，4.89(w)，4.76(w)，4.70(w)，4.41(w)，4.25(m)，4.00(m)，3.88(m)，3.80(m)，

3.59(s)，3.50(m)，3.44(m)，3.37(m)，3.26(s)，3.19(vs)，3.17(s)，3.11(m)，3.06(m)，

3.02(m)，2.97(vs)，2.93(m)，2.89(m)，2.83(m)，和2.43(m)；

(f)结晶形式的水合物D，其中作为二盐酸盐的水合物D显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：8.6(s)，6.8(w)，5.56(m)，4.99(m)，4.67(s)，

4.32(m)，3.93(vs)，3.88(w)，3.64(w)，3.41(w)，3.25(w)，3.17(m)，3.05(s)，2.94(w)，

2.92(w)，2.88(m)，2.85(w)，2.80(w)，2.79(m)，2.68(w)，2.65(w)，2.52(vw)，2.35(w)，

2.34(w)，2.30(w)，和2.29(w)；

(g)结晶形式的水合物E，其中作为二盐酸盐的水合物E显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：15.4(s)，6.6(w)，6.5(w)，5.95(vw)，5.61(vw)，

5.48(w)，5.24(w)，4.87(w)，4.50(vw)，4.27(w)，3.94(w)，3.78(w)，3.69(m)，3.60(w)，

3.33(s)，3.26(vs)，3.16(w)，3.08(m)，2.98(w)，2.95(m)，2.91(w)，2.87(m)，2.79(w)，

2.74(w)，2.69(w)，和2.62(w)；

(h)结晶形式的水合物H，其中作为二盐酸盐的水合物H显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：15.8(vs)，10.3(w)，8.0(w)，6.6(w)，6.07(w)，

4.81(w)，4.30(w)，3.87(m)，3.60(m)，3.27(m)，3.21(m)，3.13(w)，3.05(w)，2.96(m)，

2.89(m)，2.82(w)，和2.67(m)；

(i)结晶形式的水合物O，其中作为二盐酸盐的水合物O显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：15.9(w)，14.0(w)，12.0(w)，8.8(m)，7.0(w)，6.5(w)，

6.3(m)，6.00(w)，5.75(w)，5.65(m)，5.06(m)，4.98(m)，4.92(m)，4.84(W)，4.77(w)，

4.42(w)，4.33(w)，4.00(m)，3.88(m)，3.78(w)，3.69(s)，3.64(s)，3.52(vs)，3.49(s)，

3.46(s)，3.42(s)，3.32(m)，3.27(m)，3.23(s)，3.18(s)，3.15(vs)，3.12(m)，3.04(vs)，

2.95(m)，2.81(s)，2.72(m)，2.67(m)，和2.61(m)；

(j)结晶形式的溶剂化物G，其中作为二盐酸盐的溶剂化物G显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：14.5(vs)，10.9(w)，9.8(w)，7.0(w)，6.3(w)，

5.74(w)，5.24(vw)，5.04(vw)，4.79(w)，4.41(w)，4.02(w)，3.86(w)，3.77(w)，3.69(w)，

3.63(m)，3.57(m)，3.49(m)，3.41(m)，3.26(m)，3.17(m)，3.07(m)，2.97(m)，2.95(m)，

2.87(w)，和2.61(w)；

(k)结晶形式的溶剂化物I，其中作为二盐酸盐的溶剂化物I显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：14.5(m)，14.0(w)，11.0(w)，7.0(vw)，6.9(vw)，

6.2(vw)，5.30(w)，4.79(w)，4.44(w)，4.29(w)，4.20(vw)，4.02(w)，3.84(w)，3.80(w)，

3.67(vs)，3.61(m)，3.56(w)，3.44(m)，3.27(w)，3.19(w)，3.11(s)，3.00(m)，2.94(w)，

2.87(w)，和2.80(w)；

(l)结晶形式的溶剂化物L，其中作为二盐酸盐的溶剂化物L显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：14.1(vs)，10.4(w)，9.5(w)，9.0(vw)，

6.9(w)，6.5(w)，6.1(w)，5.75(w)，5.61(w)，5.08(w)，4.71(w)，3.86(w)，3.78(w)，3.46(m)，

3.36(m)，3.06(w)，2.90(w)和2.82(w)；

(m)结晶形式的溶剂化物M，其中作为二盐酸盐的溶剂化物M显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：18.9(s)，6.4(m)，6.06(w)，5.66(w)，5.28(w)，

4.50(w)，4.23(w)，和3.22(vs)；和

(n)结晶形式的溶剂化物N，其中作为二盐酸盐的溶剂化物N显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：19.5(m)，9.9(w)，6.7(w)，5.15(w)，4.83(w)，

3.91(w)，3.56(m)，3.33(vs)，3.15(w)，2.89(w)，2.81(w)，2.56(w)，和2.36(w)。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述每日一次的剂量为5mg/kg-30mg/kg。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述每日一次的剂量为5mg/kg-20mg/kg。

7.四氢生物喋呤或其药学上可接受的盐在制备用于治疗对象高苯丙氨酸血症的口服药物组合物中的用途，其中所述组合物的给药形式为每日一次，至少给药7天，其中所述四氢生物喋呤是结晶形式的多晶型B，所述结晶形式的多晶型B在40℃和75％相对湿度下至少稳定3个月，其中作为二盐酸盐的多晶型B显示了具有以下特征峰的X射线粉末衍射图型，以d-值表示 为：8.7(vs)，6.9(w)，5.90(vw)，5.63(w)，5.07(m)，4.76(m)，4.40(m)，

4.15(w)，4.00(s)，3.95(m)，3.52(m)，3.44(w)，3.32(m)，3.23(s)，3.17(w)，3.11(vs)，

3.06(w)，2.99(w)，2.96(w)，2.94(m)，2.87(w)，2.84(s)，2.82(m)，2.69(w)，2.59(w) 和

2.44(w)。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述组合物用于至少给药2周。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述组合物用于至少给药6周。

10.如权利要求1-9中任一项所述的用途，其特征在于，所述对象不具有四氢生物喋呤体内平衡缺陷。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述对象未显示出L-多巴神经递质缺陷症状。

12.如权利要求1-9中任一项所述的用途，其特征在于，所述对象患有苯丙酮尿症。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述对象患有严重的苯丙酮尿症。

14.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述对象患有轻度的苯丙酮尿症。

15.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述对象被诊断具有苯丙氨酸羟化酶突变。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述突变是苯丙氨酸羟化酶催化域中的突变。

17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述突变是选自下组的一种或多种突变：F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S或Y414C。

18.如权利要求12所述的用途，其特征在于，接受四氢生物喋呤治疗之前，所述对象的血浆苯丙氨酸浓度大于180μM。

19.如权利要求12所述的用途，其特征在于，接受四氢生物喋呤治疗之前，所述对象的血浆苯丙氨酸浓度大于600μM。

20.如权利要求12所述的用途，其特征在于，接受四氢生物喋呤治疗之前，所述对象的血浆苯丙氨酸浓度大于1000μM。

21.如权利要求12所述的用途，其特征在于，接受四氢生物喋呤治疗之前，所述对象的血浆苯丙氨酸浓度大于1200μM。

22.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述四氢生物喋呤的给药日剂量为

5-30mg/kg。

23.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述四氢生物喋呤的给药日剂量为

5-20mg/kg。

24.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述结晶的四氢生物喋呤在40℃和75％相对湿度下至少稳定3个月。

25.如权利要求1或4所述的用途，其特征在于，所述四氢生物喋呤的结晶形式包括至少99.5％的纯(6R)-5，6，7，8-四氢生物喋呤。

26.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述对象还被给予蛋白质限制性饮食。

27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述蛋白质限制性饮食是苯丙氨酸限制性饮食，其中，将总苯丙氨酸限制在低于600mg/天。

28.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述蛋白质限制性饮食是苯丙氨酸限制性饮食，其中，将总苯丙氨酸限制在低于300mg/天。

29.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述对象是孕妇。

30.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述对象是0-3岁的婴儿。

31.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述对象是打算怀孕的育龄女性。

说明书

用于治疗代谢紊乱的方法和组合物

[0001] 对相关申请的交互参考

[0002] 本申请根据35 U.S.C.§119(e)的规定，要求序列号为60/520,767的美国临时专利申请(提交于2003年11月17日)的优先权，该专利所揭示的内容被纳入本文作为参考。

[0003] 背景

技术领域

[0004] 本发明一般涉及代谢紊乱，尤其是与氨基酸代谢相关的紊乱的治疗性干预(therapeutic intervention)。更具体而言，本发明涉及用于治疗苯丙酮尿症、血管疾病、局部缺血或炎性疾病或胰岛素抗性，或者用于治疗可获益于氧化氮合酶活性提高的病症和病人的方法和组合物。

[0005] 相关技术背景

[0006] 苯丙酮尿症(PKU)是于20世纪30年代被首次鉴别的一种遗传性代谢紊乱。在大多数病例中且直至90年代中期，认为这是由肝酶苯丙氨酸羟化酶(PAH)的缺陷所造成的一种氨基酸代谢紊乱。PAH缺陷随之导致了脑中和血浆中苯丙氨酸(Phe)过剩。PAH缺陷最终表现为作为神经递质前体的酪氨酸的缺乏。

[0007] 如果不在婴儿的早期对PKU进行检测和治疗，PKU将会导致神经系统的不可逆损伤、严重的精神发育迟缓和大脑发育不良。除了精神发育迟缓以外，未经治疗的病人的特征还包括：脑钙化、浅着色(light pigmentation)、步态、姿势和坐姿异常、湿疹和癫痫。据报道在婴儿期的第一年中婴儿的IQ值会丧失50个点，且PKU必定会伴随有一定程度的IQ丧失。一经确诊，就会给予该婴儿以及其后的儿童低Phe饮食以治疗该病症。在成人中，在严格的方案控制下，典型性PKU病人常规摄入的蛋白质补给中不含Phe(假定这些成人仍然可从饮食中获得足量的Phe)，从而使得整个饮食为低Phe饮食。同样，推荐患有此病症的孕妇采用低Phe的饮食以避免胎儿发育损伤和先天性畸形(母源性PKU综合征)的风险。 [0008] 近年来，已显示由Phe过剩而引起的病理症状(统称为高苯丙氨酸血症(HPA))可划分成多类不同的紊乱，这些不同的紊乱可根据血浆Phe浓度和对PAH辅助因子的应答性来进行诊断。在初始水平，可将HPA划分为：由辅助因子6R-L-赤式-5，6，7，8，四氢生物喋呤(BH4：恶性PKU)的缺陷引起的HPA和由PAH缺陷引起的HPA。可根据未经饮食或其它治疗性干预情况下的Phe血浆浓度(在本文中被称为“非限制性血浆Phe浓度”)，将后一类型进一步划分为至少3个类型。

[0009] 正常的血浆Phe体内平衡是被严格控制的，使得血浆Phe浓度为60μmol/L±15μmol/L。典型性PKU(Classical PKU，OMIM No.261600)是PKU中最严重的形式，它是由使得未治疗时的非限制性血浆Phe浓度高于1200μmol/L的PAH无效突变或严重突变(severe mutation)引起的。患有典型性(或严重)PKU的病人必须采用基于极低Phe饮食的严格饮食方案来进行治疗，以使他们的Phe浓度降低到安全范围内。也已鉴别出HPA较为轻度的形式。PKU中较为轻度的一种形式是症状为血浆Phe浓度为10-20mg/dL(600-1200μmol/L)的PKU，它通常被称为″轻度PKU″。这种中度形式的PKU是通过中度饮食限制来控制的，例如，无需不含Phe的低总蛋白质饮食。最后，轻度HPA(也称为良性或非-PKU HPA)的特征是血浆Phe浓度为180-600μmol/L。由于认为患有非-PKU HPA病人的血浆Phe水平在“安全”范围内，所以无需对其进行常规治疗。然而，如上文所述，这些个体中的Phe水平相对于正常个体、非PKU患者仍有明显提高，并可至少在孕妇和极年轻的病人中造成有害的后遗症。关于由PAH缺陷造成的HPA的更详细的综述，本领域的技术人员可参考2001年Scriver等的文献(高苯丙氨酸血症：苯丙氨酸羟化酶缺 陷 (Hyperphenylalaninemia：PhenylalanineHydroxylase Deficiency)，In：Scriver CR，Beaudet AL，Sly WS，Valle D，ChildsB，Vogelstein B编.遗传病的代谢和分子基础(The Metabolic and MolecularBases of Inherited Disease.)，第八版。New York：McGraw-Hill，2001：1667-1724)。NIH指南(NIH Guidelines)指出：对于患有PKU的儿童，较佳为将血浆Phe浓度降低到360-420μmol/L。

[0010] BH4代谢的缺陷也可导致HPA。BH4是酪氨酸和色氨酸羟化酶的重要辅助因子，这两种酶是生物合成神经递质多巴胺和5-羟色胺的限速酶。多巴胺和5-羟色胺缺陷的效应被统称为“非典型性”或“恶性”HPA。因此，HPA的传统诊断已涉及确定HPA究竟是由BH4缺陷引起的还是有PAH缺陷所引起的。 通常，PKU的诊断是建立在持续升高的血液Phe浓度之上的。在对升高的血液Phe进行阳性筛选后(血浆Phe＞120μmol/L；Weglage等，J.Inherit.Metab.Dis.，25：321-322，2002)，再进行差异筛选，确定该Phe提高究竟是由BH4还是PAH缺陷造成的。该差异诊断包括：确定给予BH4后升高的Phe浓度是否降低(BH4负载试验)。所述BH4负载试验通常包括对正常(即非限制性)饮食的患者施予一次性的BH4负载(例如，5-20mg/kg)，并测定患者的Phe水平是否降低(参见，例如Ponzone等人 Eur.J.Pediatr.152：655-661，1993；Weglage 等J.Inherit.Metab.Dis.，25：321-322，2002)。

[0011] 通常，对BH4负载试验有血浆Phe水平降低应答的个体被诊断为在BH4体内平衡中存在缺陷。然而，对于BH4应答型的PAH缺陷病人已有多个报道(Kure等，J.Pediatr.135：375-378，1999；Lassker 等，J.Inherit.Metablo.Dis.25：65-70，2002；Linder等，Mol.Genet.Metab.73：104-106，2001；Spaapen等，Mol.Genet.andMetabolism，
78：93-99，2003；Trefz等，2001)。这些患者具有中度PKU的典型血浆Phe水平，低于
1000μmol/L且通常低于600μmol/L。患有严重典型性PKU的病人对常规的24小时BH4负载试验无应答(Ponzone等，N.Engl.J.Med 348(17)：1722-1723，2003)。

[0012] 有人建议对于应答BH4的个体无需饮食干预治疗，而只需用BH4来治疗。同样，对于诊断出对BH4负载试验无应答的个体则提出了相反的建议，即应对这些患者采取饮食限制而不是用BH4来治疗。Ponzone等特别指出患有严重苯丙酮尿症的个体将不能对BH4治疗应答，这种治疗不应用于这些病人(Ponzone等，N.Engl.J Med 348(17)：1722-1723，2003)。因此，目前根据个体是否应答BH4而存在不同的治疗HPA的治疗方案。此外，已表明极少数的病人可获益于BH4治疗。事实上，有人认为可获益于BH4治疗的患有PAH-缺陷型HPA的病人是那些轻度PKU病人。由于这些个体的Phe水平通常处于安全范围(即，低于
600μM)，这一病情可通过中度的饮食限制来控制(参见Hanley，N.Engl.J.Med 348(17)：
1723，2003)。因此，并不把单独的BH4治疗或与其它治疗性干预的联合治疗看作是可用于绝大多数HPA病人的可行的治疗性干预。

[0013] BH4是一种生物源性胺，属于天然存在的蝶呤族。蝶呤以还原和氧化形式存在于生理性体液和组织中，然而，只有5，6，7，8，四氢生物喋呤具有生物活性。这是一种手性分子，已知该辅助因子的6R对映体是生物活性对映体。关于BH4的合成和病症的详细综述，可参见2001年Blau等的文献(四氢生物蝶呤及相 关生物源性胺的疾病(Disorders of tetrahydrobiopterin and related biogenicamines.)，In：Scriver CR，Beaudet AL，Sly WS，Valle D，Childs B，VogelsteinB编.遗传病的代谢和分子基础第8版New York：McGraw-Hill，2001：1275-1776)。除了阐明BH4缺陷在HPA中的作用以外，还没有建议采用BH4进行治疗，这是因为与每个青少年或成人通过苯丙氨酸限制性饮食治疗所需的$6,000/年相比，高达$30,000/年的BH4治疗费用相当昂贵(Hanley，N.Engl.J.Med348(17)：1723，2003)。采用BH4的另一个重要问题在于这种化合物不稳定且易于在室温下发生有氧氧化(Davis等，Eur.J.Biochem.，173卷，345-351，1988；美国专利4,701,455)以及室温下其半衰期仅为8小时(Berneggar和Blau，Mol.Genet.Metabol.77：304-313，
2002)。

[0014] 因此，直到目前为止，饮食干预是用于所有患有严重典型PKU病人和许多患有中度PKU病人的代表性治疗性干预。这种饮食干预通常必须将病人的食物限制在由天然食物组成的不含或含有低Phe的食物中。然而，在减少Phe之外，这种饮食方案也减少了其它必需氨基酸、维生素和矿物质的许多来源。由此，如果不进行补充，这种饮食将不能提供足以支持正常生长和发育的蛋白质、能量、维生素和矿物质。由于PKU是由苯丙氨酸羟化缺乏所引起的酪氨酸缺乏的一种表现，酪氨酸就成为了必需氨基酸，而PKU的饮食补充必须含有酪氨酸补充物。因此，通常对PKU病人使用营养配方来进行饮食补充。对于婴儿同样通常使用具有低Phe含量的婴儿配方来作为唯一或主要的食物源。

[0015] 然而，在许多类型的病人中，饮食蛋白质限制最多是一种用于控制PKU的无效方法。例如，由于高Phe会导致脑发育迟缓，怀孕期间的治疗是至关重要的。然而，怀孕期间的低蛋白质饮食会导致肾脏发育迟缓，并被认为会继而导致肾单位数量的减少并可能会导致成人期的高血压。(D′Agostino，N.Engl.J.Med.348(17)1723-1724，2003)。 [0016] 蛋白质限制性饮食的病人顺应性不佳也是一个问题。市售的不含Phe的蛋白质制剂带有苦味，这就使其难以确保病人食用了足量的蛋白质来维持日常所需摄入的蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等。这对于较大的儿童来说更成问题，他们每天需要高达70g干重的此类制剂。例如，Schuett，V.E.；1990；DHHSPublication No HRS-MCH-89-5，报道了在美国超过40％的8岁或8岁以上的PKU病人不再坚持饮食治疗(美国专利6,506,422)。许多青少年病人由于害怕受到注意(peer attitude)而未能严格遵守蛋白质限制性饮食。 [0017] 因此，仍然需要用于替代或补充并缓解PKU病人所处的饮食限制境地的治疗药物。本发明正是致力于解决这一需求。

[0018] 发明概述

[0019] 本发明描述了对代谢紊乱，尤其是涉及氨基酸代谢的紊乱的干预。更具体而言，本发明涉及用于治疗显示出升高的苯丙氨酸水平的病人，例如患有高苯丙氨酸血症、轻度苯丙酮尿症或典型性严重苯丙酮尿症的病人的方法和组合物；以及用于治疗患有可获益于氧化氮合酶活力提高的病症的病人的方法和组合物；以及用于治疗患有血管疾病、局部缺血或炎性疾病、糖尿病或胰岛素抗性的病人的方法和组合物。

[0020] 在一方面，本发明描述了治疗患者典型性严重苯丙酮尿症(PKU)的方法，该方法包括给予该患者蛋白质限制性饮食并联合使用含有四氢生物喋呤(BH4)或其前体或衍生物的组合物，其中蛋白质限制性饮食和BH4的联用相对于非联用而言可有效降低患者血浆中的苯丙氨酸浓度。在具体实施方式中，所述患者是不显现出BH4体内平衡缺陷的患者。所述患者可为不显现出L-多巴神经递质缺陷的症状的患者。

[0021] 被选择用本发明方法治疗的患者具有升高的血浆Phe浓度，在未经治疗的情况下该浓度可高于1800μM/L。其它实施方式包括在未采用治疗方案的情况下血浆苯丙氨酸浓度高于1000μM/L的患者。在优选的实施方式中，本发明的联合施予方法使患者的血浆苯丙氨酸浓度下降到了低于600μM。更优选地，其下降到低于500μM。更为优选地，该联合施予使患者的血浆苯丙氨酸浓度下降到360μM±15μM。

[0022] 优选以约1-30mg/kg的量给予BH4，更优选约5-30mg/kg。BH4可以单一日剂量或在日基础上(daily basis)的多剂量给药。在有些实施方式中，BH4治疗是非连续的，而是在日剂量基础上给予BH4直至患者的血浆苯丙氨酸浓度降到低于360μM。优选地，其中在日基础上监测所述患者的血浆苯丙氨酸浓度，且当观察到血浆苯丙氨酸浓度有10％的升高时给予BH4。优选地，所施予的BH4是BH4的稳定结晶形式，其具有高于非结晶稳定形式BH4的稳定性。更优选地，所述稳定结晶形式的BH4包括至少99.5％的纯6R BH4。也可给予前体，例如二氢生物蝶呤(BH2)和墨蝶呤。可口服给予BH4。

[0023] 在本文的方法中施予的蛋白质限制性饮食是一种苯丙氨酸限制性饮食，其 中将患者的总苯丙氨酸摄入限制在低于600mg/天。在其它实施方式中，所述蛋白质限制性饮食是苯丙氨酸限制性饮食，其中总苯丙氨酸被限制在低于300mg/天。在其它实施方式中，所述蛋白质限制性饮食是补充氨基酸的饮食，例如酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。在某些实施方式中，蛋白质限制性饮食包括蛋白质补充物，而BH4与该蛋白质补充物在相同的组合物中提供。

[0024] 在具体实施方式中，所述患者是被诊断为具有苯丙氨酸羟化酶(PAH)突变的患者。该PAH突变体可包括在PAH催化域中发生突变。示例性的此类突变包括一种或多种选择下组的突变：F39L、L48S，I65T、R68S、A104D，S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M E390G、A395P、P407S和Y414C。 [0025] 本文中还包括一种用于治疗患有高苯丙氨酸血症(HPA)的怀孕女性的方法，该方法包括给予该患者蛋白质限制性饮食并联合给予包含四氢生物喋呤(BH4)或其前体或衍生物的化合物，其中蛋白质限制性饮食和BH4的联合施用相对于非联合施用而言可有效降低患者血浆中的苯丙氨酸浓度。在某些实施方式中，所述患者的非限制性血浆苯丙氨酸浓度高于180μM而低于600μM。在其它实施方式中，所述患者的非限制性血浆苯丙氨酸浓度高于500μM但低于1200μM。在其它实施方式中，所述患者的非限制性血浆苯丙氨酸浓度高于1000μM。

[0026] 本文中还包括一种用于治疗具有高于正常血浆苯丙氨酸浓度(例如，高于180μM/L，更优选高于360μM/L)的患者的方法，该方法包括给予该患者有效量的使得该患者血浆苯丙氨酸浓度降低的稳定化的BH4组合物。优选地，所述稳定化的BH4组合物可在室温下稳定8小时以上。在施予所述BH4之前，病人的血浆苯丙氨酸浓度可能高于180μM。
更优选地，所述病人的血浆苯丙氨酸浓度为120-200μM。在另一实施方式中，病人的血浆苯丙氨酸浓度为200-600μM。在另一实施方式中，病人的血浆苯丙氨酸浓度为600-1200μM。
被治疗的另一类病人是那些非限制性血浆苯丙氨酸浓度高于1200μM的病人。在其它实施方式中，所述病人是怀孕的，且该怀孕病人的血浆苯丙氨酸浓度约为200-600μM。血浆苯丙氨酸浓度高于1200μM的怀孕病人是这类治疗中尤为可取的受试者，打算怀孕的育龄女性病人同样尤为可取。在病人的血浆苯丙氨酸浓度高于1200μM的那些实施方式中，该方法还包括给予该病人蛋白质限制性饮食。

[0027] 本发明还包括一种用于治疗患有高苯丙酮尿症的病人的方法，该方法包括给予该病人有效量的使得该病人血浆苯丙氨酸浓度降低的稳定化的BH4组合物，其中所述病人已被诊断对单剂BH4负载试验无应答。优选地，所述病人对BH4负载在24小时内无应答。 [0028] 在本发明的另一相关方面中提供了一种多剂量负载试验，所述试验包括给予一剂以上的BH4。本文描述的数据显示，被认为对于单剂量BH4负载试验“无应答”的患者可对多剂量BH4应答使苯丙氨酸水平显著降低。在一个实施方式中，在大于1天，优选7天的时间段中将约5-40mg的至少两剂BH4给予患者。

[0029] 本发明的治疗方法可包括在约10-200mg BH4/kg体重范围内给药。可通过任何实践中常用的途径来给予所述BH4，例如口服、皮下给药、舌下给药、经胃肠道给药、经直肠给药、经鼻腔给药(per andnares)。所述BH4可每日给药或以其它间隔给药，例如每隔一天或每周给药。所述BH4优选与蛋白质限制性饮食联合施予，并任选地与叶酸盐(包括叶酸盐的前体、叶酸和叶酸盐的衍生物)同时使用。

[0030] 试图将BH4作为治疗性蛋白质制剂的组分的一部分来给药。该蛋白质限制性饮食可包括含低蛋白质的食品的正常饮食。或者，所述蛋白质限制性饮食可包括不含苯丙氨酸的蛋白质饮食的蛋白质制剂摄入，而患者可从极低蛋白质饮食的其它组分中获得他所需量的Phe。在某些实施方式中，用不含苯丙氨酸的蛋白质补充物来对所述蛋白质限制性饮食进行补充。更具体而言，不含苯丙氨酸的蛋白质补充物包括酪氨酸或其它必需氨基酸。在其它实施方式中，所述蛋白质补充物也可含有叶酸盐，包括叶酸盐的前体、叶酸和叶酸盐的衍生物。

[0031] 本发明包括治疗患有苯丙酮尿症的婴儿的方法，该方法包括给予该病人有效量的使得该婴儿血浆苯丙氨酸浓度降低的稳定化的BH4组合物，其中，所述婴儿的年龄为0-3岁且所述婴儿的血浆苯丙氨酸浓度为约360-4800μM。在给予BH4之前，所述婴儿的苯丙氨酸浓度为约1200μM，而给予BH4使其血浆苯丙氨酸浓度降低到约1000μM。在其它实施方式中，在给予BH4之前，所述婴儿的苯丙氨酸浓度为约800μM，而给予BH4使其血浆苯丙氨酸浓度降低到约600μM。在其它实施方式中，在给予BH4之前，所述婴儿的苯丙氨酸浓度为约400μM，而给予BH4使其血浆苯丙氨酸浓度降低到约300μM。本文所包含的治疗方法应优选使得所述婴儿的血浆苯丙氨酸浓度降低到360±15μ M。

[0032] 本发明还包括一种组合物，所述组合物包括可在室温下稳定8小时以上的稳定化的、结晶形式的BH4，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所述组合物还可包括医用蛋白质补充物。在其它实施方式中，所述BH4组合物是婴儿制剂(formula)中的一部分。在其它实施方式中，所述蛋白质补充物不含苯丙氨酸。所述蛋白质补充物优选以以下物质强化：浓度为20mg/100g补充物的L-卡尼汀、L-酪氨酸、L-谷氨酸、浓度为40mg/100g补充物的L-牛磺酸和硒。它还可包括推荐日剂量的矿物质，例如钙、磷和镁。所述补充物还可包括推荐日剂量的一种或多种选自下组的氨基酸：L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸乙酸酯(L-lysine acetate)、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、一水合L-天冬酰胺、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸。此外还可用推荐日剂量的维生素A、D、E来强化所述补充物。所述补充物优选包括为所述补充物提供至少40％能量的脂肪成分。这种补充物可以粉末形式补充物或以蛋白质条形式提供。

[0033] 本发明的其它特征和优点在以下的详细描述后将十分明显。应当理解的是，由于基于详细的说明，各种本发明精神和范围内的变化和改良对于本领域的技术人员而言变得很明显，虽然在阐明本发明优选实施方式时给出详细的说明和具体的实施例，它们仅是为了说明。

[0034] 优选实施方式的描述

[0035] 饮食干预是用于所有严重典型性PKU病人和许多中度PKU病人的治疗性干预。然而，此类饮食性蛋白质限制导致了支持正常生长和发育所需的蛋白质、能量、维生素和矿物质的供应不足。因此，在很多类型的病人中饮食性蛋白质限制最多是一种控制PKU的无效方法，尤其是在孕妇和幼儿中，这两种类型的患者与正常成人相比都需要更高量的蛋白质。饮食限制的使用也受到蛋白质限制性饮食病人顺应性不佳的阻碍。2000年10月，国立卫生研究院(the NationalInstitutes of Health)发表了对PKU筛选和治疗的一致声明，其中“大力鼓励关于PKU治疗的非饮食性替代疗法的研究”。因此，本领域认同，需要用于替代和/或补充并缓解PKU病人所处的饮食限制境地的治疗药物。

[0036] 本申请首次描述了基于给予稳定形式BH4的PKU药物干预。在实施例2中对用于生产这种稳定化的BH4组合物的方法和组合物进行了更详细的描述。 本发明的稳定化的BH4组合物包括在室温下可稳定8小时以上的BH4晶体。本发明的方法和组合物包括单独的稳定化的BH4的药物组合物，其可以任何常规的给药途径进行递送，包括但不限于口服、肌内注射、皮下注射、静脉内注射等。本发明的组合物还可包括与用于延长BH4组合物稳定性的抗氧化剂联合使用的BH4组合物。此外，在下文中更多的讨论中，本发明还包括含有BH4的食品。例如，本发明包括常规的蛋白质粉组合物，例如已添加了BH4来改良的PHENEX、LOFENALAC、PHENYL-FREE等。

[0037] 本发明还包括对不同表型PKU的治疗性干预，所述治疗是通过联合给予BH4和蛋白质限制性饮食来进行的。与所述饮食联合给予的BH4可为(但非必须为)本文所述的稳定化的BH4组合物。本领域的技术人员知晓在室温下和光照中不稳定的BH4组合物的生产方法。虽然使用此种组合物进行的治疗会受到该BH4组合物不稳定性的影响，其使用仍然包括在某些联合治疗中，在这些联合治疗中，使用BH4治疗和饮食性蛋白质限制的疗程来治疗患有严重典型性PKU的BH4非应答型病人。

[0038] 在下文中对实现代谢紊乱(包括PKU)治疗的方法和组合物进行更详细的描述。 [0039] I.待治疗的病人

[0040] 本发明涉及采用单用或与其它治疗方案联用稳定化的BH4组合物或非稳定化的BH4组合物的方法治疗各种HPA患者群以控制HPA和/或PKU。具体而言，任何种类的BH4，以稳定化形式或其它形式，均可用于治疗其苯丙氨酸浓度低至无需采用正常饮食干预的患者群(即，中度HPA病人)。这类对BH4组合物改善中度HPA影响的所有形式的治疗具有顺从性的病人包括血清浓度低于200μM的孕妇和婴儿。在这一部分中对不同的患者群和他们的不同治疗需要进行更详细的描述。

[0041] 本发明的某些实施方式涉及通过联合给予患者蛋白质限制性饮食和包含BH4或其前体或衍生物的组合物来治疗典型性严重PKU，其中联合给予蛋白质限制性饮食和BH4相对于未进行所述联合给药可有效降低所述患者血浆中的苯丙氨酸浓度。此外，本发明还涉及通过联合给予患有HPA的怀孕女性蛋白质限制性饮食和包含BH4或其前体或衍生物的组合物来治疗该患有HPA的怀孕女性，其中联合给予蛋白质限制性饮食和BH4相对于未进行所述联合给药可有 效降低所述孕妇血浆中的苯丙氨酸浓度。在具体实施方式中，所述治疗包括对显示出Phe水平高于420μM的病人进行治疗。

[0042] 本发明的其它实施方式包括给予在给予BH4之前血浆Phe浓度高于180μM的患有HPA的任何个体稳定化BH4组合物，给药量可有效降低该患者的血浆Phe浓度。本发明的方法还可用于治疗已被诊断为对BH4负载试验无应答的那些PKU患者。本发明的方法可用于使用本文所述的稳定化BH4组合物来治疗以升高的血浆Phe浓度高于300μM为特征的患有PKU的婴儿。本申请中所用的“婴儿”是指，0-约36月龄的患者。

[0043] 本文所述的数据证明被认为对单剂量BH4负载试验“无应答”的患者事实上可对多剂量BH4产生应答并伴有苯丙氨酸水平的显著降低。因此，在本发明的其它方面提供了一种包括给予一剂以上BH4的多剂量负载试验。示例性的多剂量负载试验包括：在至少1天、或至少2天、或至少3、4、5、6、7、10或14天，优选2-14天、3-14天或5-10天，最优选7天的时间段中，给予5-40mg/kg或更优选10-20mg/kg的四氢生物蝶呤。

[0044] 本发明提供了使用本文所述的任何四氢生物蝶呤多晶型物、或包括任何此类多晶型物的稳定药物制剂治疗与苯丙氨酸水平上升或酪氨酸水平下降相关的病症(这些病症可能是由例如苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶或色氨酸羟化酶活性的降低所引起的)的方法。与苯丙氨酸水平上升相关的病症具体包括如本文其它部分所描述的中度和典型苯丙酮尿症以及高苯丙氨酸血症，示例性的患者群包括本文所述的病人亚群和显示出高于正常水平的苯丙氨酸水平的任何其它病人。

[0045] 本发明提供了使用本文所述的任何多晶型物、或包括任何此类多晶型物的稳定药物制剂治疗患有可获益于氧化氮合酶活性增强的疾病的患者和患有血管疾病、局部缺血或炎性疾病、或胰岛素抗性的患者的方法。该治疗可，例如减轻氧化氮合酶活性的缺陷，或可例如使得氧化氮合酶活性提高到高于正常水平。已提出患有氧化氮合酶活性缺陷的患者可获益于使用叶酸盐的治疗，包括叶酸盐前体、叶酸或叶酸盐的衍生物。因此，本文所述的组合物和方法还包括与叶酸盐(包括叶酸盐前体、叶酸或叶酸盐衍生物)进行共同治疗。示例性的叶酸盐在美国专利6,011,040和6,544,994(两者均纳入本文作为参考)中有所揭示，包括叶酸(蝶酰谷氨酸)、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸、5，10-亚胺甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸 (亚叶酸)、10-甲酰基四氢叶酸、10-甲基四氢叶酸、一种或多种叶酰聚谷氨酸、叶酸或叶酰聚谷氨酸的蝶呤部分的蝶呤环被还原而产生二氢叶酸盐或四氢叶酸或(6S)-四氢叶酸的化合物、或N-5或N-10位置负载有不同氧化水平的一个碳单元的所有前述化合物的衍生物、或它们药学上可接受的盐、或其中2种或多种的组合。示例性的四氢叶酸包括：5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、5，10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸、5，10-次甲基-(6R)-四氢叶酸、
10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5-亚胺甲基-(6S)-四氢叶酸或(6S)-四氢叶酸以及它们的盐。同样还用同时包含四氢生物喋呤多晶型物和叶酸盐的药物组合物或食品来进行治疗。 [0046] 氧化氮由血管内皮细胞组成性产生，它在内皮细胞血压和血管张力的调节中起着关键的生理作用。已提出氧化氮生物活性的缺陷涉及血管机能障碍的发病机理，这些机能障碍包括冠状动脉疾病、任何动脉的动脉粥样硬化(包括冠状动脉、颈动脉、脑动脉或外周血管动脉)、缺血-再灌注损伤、高血压、糖尿病、糖尿病性血管病变、心血管疾病、外周血管疾病、或由局部缺血和/或炎症引起的神经变性病症，例如中风，并且此类发病机理包括内皮组织受损、流向器官和组织的氧气不足、全身性血管阻力提高(高血压)、血管平滑肌增殖、血管狭窄发展(收缩)和炎症。因此，本发明的方法包括对任何这些病症的治疗。 [0047] 也已提出氧化氮合酶活性的提高也可使得上升的过氧化物水平降低、提高胰岛素敏感性并降低与胰岛素抗性相关的血管机能障碍，这些在美国专利6,410,535中有所描述(纳入本文作为参考)。因此，本发明包括对糖尿病(I型或II型)、高胰岛素血症或胰岛素抗性的治疗。具有与胰岛素抗性相关的血管机能障碍的疾病包括由胰岛素抗性引起或因胰岛素抗性而加重的疾病、或治愈因胰岛素抗性而迟缓的疾病，例如高血压、高脂血症、动脉硬化、冠状动脉血管收缩性心绞痛、劳累性心绞痛(effort angina)、脑血管狭窄损伤脑血管、脑血管机能不全、脑血管痉挛、外周循环紊乱、冠状动脉硬化后的经皮穿腔冠状动脉血管形成术(PTCA)或冠状动脉旁路移植术(CABG)、肥胖症、非胰岛素依赖性糖尿病、高胰岛素血症、脂代谢异常、冠状动脉硬化性心脏疾病等，只要它们与胰岛素抗性相关。预期当给予患有这些疾病的患者BH4时，可通过激活NOS功能、提高NO产生和抑制活性氧类的产生来改善血管内皮细胞的失调，从而预防或治疗这些疾病。

[0048] A.严重典型性PKU的特征以及根据本发明对其进行治疗的方法

[0049] 如上文背景部分中所述，严重PKU表现为血浆Phe浓度高于1200μM/L并可能会高达4800μM/L。患有这种紊乱的病人必须用不含Phe的饮食来进行治疗以使他们的血浆Phe浓度降至临床上可接受的水平(通常为低于600μM/L，优选低于300μM/L)。这些病人最高仅可耐受250-350mg饮食Phe/天(Spaapen等，Mol.Genet and Metab.78：93-99，2003)。因此，这些病人在出生后7-10天中开始进行Phe限制性制剂饮食，并且在其余生都将背负这种饮食限制。对这些受严格的饮食限制所累的个体，任何对这种限制的缓解都是有益的。

[0050] 在下文部分III中将就用于对典型性Phe个体进行诊断的试验进行更详细的描述。这些试验揭示了患有典型性严重PKU的患者对BH4无应答性并需要低苯丙氨酸饮食(Lucke等，Pediatr.Neurol.28：228-230，2003)。然而在本发明中，预期可用BH4来对此类PKU病人进行治疗，从而缓解对严格不含苯丙氨酸饮食的要求。

[0051] 因此，预期本发明的方法将包括通过监测个体的血浆Phe浓度来确定所述病人患有典型性PKU。然后通过给予低蛋白质饮食和BH4的联合方案来对所述病人进行治疗，从而使得病人的血浆Phe浓度发生至少25％的降低。优选地，所述方法可使血浆Phe浓度发生30％的降低。更为优选地，所述方法可使个体的血浆Phe浓度降低40％、50％、60％、70％、
80％、90％或更多(例如，当患有严重典型性PKU的病人的Phe浓度为4800μM/L时，Phe浓度90％降低将使血浆Phe浓度为480μM/L，这一浓度低得足以几乎不需要饮食限制)。当然，应当理解的是本发明的治疗方法(不论是用于治疗严重典型性PKU或其它本文所述的HPA)，应尽可能地使所述病人的血浆Phe浓度降低到接近360μM/L±15μM/L的水平。 [0052] 在优选的实施方式中，所述被治疗的PKU病人的血浆Phe浓度从高于1000μM/L的任何非限制性血浆Phe浓度降低到低于600μM/L的任何血浆Phe水平。当然，即便联合使用BH4和蛋白质限制性饮食使得血浆Phe浓度略为降低(例如，降低到约800-1200μM/L的水平)，这仍可被视为是临床上有效的治疗结果，这是因为血浆Phe浓度在这一范围中的病人可通过简单限制饮食中蛋白质的量而无需食用Phe限制性制剂来控制病情，从而使得所述个体的生活质量显著提高并使得病人对饮食限制的顺应性提高。

[0053] 作为治疗结果，病人对饮食中Phe水平可耐受量的提高被认为是一种治疗 上有效的结果。例如，预期作为进行基于BH4的治疗的结果，病人将能将他/她的饮食Phe摄入从250-350mg/天提高到350-400mg/天(即，病人的Phe耐受表型从典型性PKU患者转变到中度PKU患者)。当然，将优选本文所述的治疗性干预可使他/她的饮食Phe摄入从250-350mg/天提高到400-600mg/天(即，病人的Phe耐受表型从典型性PKU患者转变到中度PKU患者)，或更为优选地，使病人可摄入高于600mg Phe/天(即，正常的饮食摄入)。 [0054] B.非BH4应答型PKU病人的特征及根据本发明对其进行治疗的方法

[0055] 可用本发明的方法进行治疗的第二类病人是被确定为血浆Phe浓度升高(即，任何高于200μM/L的浓度)的但被诊断为对BH4治疗无应答的病人(经下文所述的BH4负载试验确定)。此类病人可包括患有轻度PKU的个体(即，血浆Phe浓度最高达到600M/L)、患有中度PKU的个体(即，血浆Phe浓度为600-约1200μM/L)、以及患有典型性PKU的病人(即，血浆Phe浓度高于1200μM/L)。

[0056] 对BH4治疗无应答性的病人给予BH4并联合在他们的饮食中减少蛋白质的量以降低这些病人的血浆Phe浓度。相对于食用相同饮食计划但不给予BH4治疗而言，本发明的方法使得给予BH4治疗的病人的血浆Phe浓度产生了更大的下降。

[0057] 在优选的实施方式中，给予所述病人在下文所述的实施例2中有所表征的包含稳定化、结晶形式的BH4的组合物。这种BH4组合物与本领域先前可获得的那些组合物的不同之处在于，其在室温下比本领域技术人员先前所知的制剂(例如，可从BH4负载试剂盒中获得的那些制剂，Schircks Laboratories，Jona，Switzerland)更为稳定。因此，所述BH4制剂可室温储存或者冷藏，并能保持比先前可获得的BH4组合物更高的功效。因此，期望这种形式的BH4可比类似浓度的先前可获得的BH4组合物具有更大的治疗效力。这一更大的效力甚至可用于在先前被诊断为对BH4无应答性的病人中产生治疗有效结果。

[0058] 对于上述IA部分中所述的病人亚群，可单独使用稳定化的BH4组合物或将其与饮食限制联合使用来治疗该部分中所述的BH4非应答型病人。所述饮食限制可以是通过提供具有减量Phe的合成的药用蛋白质制剂来限制Phe摄入的饮食，或者所述饮食限制可以是仅要求病人限制他/她的总蛋白质摄入但可允许病人使用限制量的正常食品的饮食。 [0059] IA部分中关于典型性PKU病人优选治疗结果的讨论被纳入本部分中作为 参考。对于中度PKU病人(即非限制性血浆Phe浓度为600-1200μM/L的病人)优选的治疗结果为使得病人的血浆Phe浓度降低至少25％。优选地，所述方法可使血浆Phe浓度降低30％。
更为优选地，所述方法可使个体的血浆Phe浓度降低40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，当患有中度典型性PKU的病人的Phe浓度为1000μM/L时，Phe浓度降低90％产生100μM/L的血浆Phe浓度，这一浓度低得足以几乎不需要饮食限制)。

[0060] 在优选的实施方式中，接受治疗的中度PKU病人的血浆Phe浓度从600-1200μM/L的任何非限制性血浆Phe浓度量降低到低于300μM/L的任何血浆Phe水平。采用BH4进行的尤为优选的治疗中(单独或与饮食限制联合)降低了血浆Phe浓度，例如降至200μM/L-约400μM/L的水平，可被视为是临床上有效的治疗结果，这是因为血浆Phe浓度在这一范围中的病人可通过简单限制饮食中蛋白质的量(而无需食用Phe限制性制剂)来控制病情。事实上，在许多研究中都表明了这些病人甚至可使用普通的饮食。

[0061] 作为治疗结果，病人对饮食Phe水平可耐受量的提高被认为是一种治疗上有效的结果。例如，预期作为进行基于BH4的治疗(单独或与饮食限制联合)的结果，病人将能将他/她的饮食Phe摄入从350-400mg/天提高到400-600mg/天(即，病人的Phe耐受表型从中度PKU患者转变到轻度PKU患者)。当然，优选本文所述的治疗性干预可使他/她的饮食Phe摄入从350-400mg/天提高到400，以使得病人可摄入高于600mg Phe/天(即，正常的饮食摄入)。

[0062] 即使接受治疗的病人是仅表现出轻度PKU的病人(即饮食容许量为400-600mg Phe/天)，也可获益于本发明的基于BH4的治疗，这是因为需要产生尽可能接近360μM/L±15μM/L的标准化血浆Phe浓度。对于此类病人，优选的治疗结果将包括使所述病人的血浆Phe浓度至少降低25％。优选地，所述方法可使血浆Phe浓度降低30％。更为优选地，所述方法可使个体的血浆Phe浓度降低40％、50％、60％或更多(例如，当患有轻度典型性PKU的病人的Phe浓度为600μM/L时，Phe浓度降低60％会产生360μM/L的血浆Phe浓度，即可接受的正常血浆Phe浓度)。

[0063] 在优选的实施方式中，接受治疗的轻度PKU病人的血浆Phe浓度从400-600μM/L的任何非限制性血浆Phe浓度量降低到低于100μM/L的任何血浆Phe水平。当然，即便采用BH4治疗(单独或与饮食限制联合)产生了轻微的血浆Phe浓度降低，例如降至200μM/L-约400μM/L的水平，这仍可被视为是 临床上有效的治疗结果。

[0064] 作为治疗结果，病人对饮食中Phe水平可耐受量的提高被认为是一种治疗上有效的结果。例如，预期作为进行基于BH4的治疗(单独或与饮食限制联合)的结果，病人将能将他/她的饮食Phe摄入从400-600mg/天提高(即，病人的Phe耐受表型从轻度PKU患者转变到轻度HPA患者)以使得病人可摄入高于600mgPhe/天(即，正常的饮食摄入)。 [0065] 此外，即便所述病人是仅表现出非PKU HPA症状的病人(即，上升的血浆Phe浓度最高为600μM/L但可食用普通蛋白质饮食的病人)也可获益于本发明的BH4治疗，这是因为已显示上升的Phe浓度会显著影响此类个体的IQ。而且，如下所述，即便病人的血浆Phe水平处于公认的“安全”水平(低于200μM/L)，基于BH4的治疗性干预对于具有特殊需要的患者(例如孕妇和婴儿)仍是尤为重要的。

[0066] C.母源性PKU及根据本发明对其的治疗方法

[0067] 对打算怀孕和怀孕的PKU妇女的血浆Phe水平的代谢控制尤为重要，这是由于不论胎儿的PAH情况如何，胎儿在子宫中暴露于甚至只是中度提高的Phe水平就会造成严重的后果。在怀孕的头三个月，对于血浆Phe浓度的治疗性控制尤为重要，如果不能获得适当的控制将会导致包括小头畸形、心智缺陷和心脏疾病在内的病症。

[0068] 例如，关于苯丙酮尿症的NIH Consensus Statement(第17#3卷，2000年10月)报道了胎儿暴露于3-10mg/dL母源性Phe水平中会导致24％的小头畸形发生率，而暴露在高于20mg/dL(即，高于1200μM/L)中会导致73％的小头畸形发生率。类似地，发现暴露在高于20mg/dL的母源性Phe水平中的儿童中超过10％患有先天性心脏病。重要的是，已注意到高于6mg/dL的Phe水平会显著降低儿童的IQ。因此，急需确保患有所有形式苯丙酮尿症的妇女(甚至于那些仅表现出最轻度的HPA的妇女)的血浆Phe浓度必须被牢牢控制以避免发生母源性PKU综合征的风险。然而，已用于美国临床的PKU妇女可接受的血浆Phe浓度目标水平为10mg/dL-15mg/dL，这一水平远高于英国和德国临床上用于降低母源性PKU综合征风险的1-4mg/dL或2-6mg/dL的对孕妇推荐的水平。

[0069] 对于孕妇另一重要的考虑是她们的总蛋白质摄入。在怀孕期间，孕妇摄入充足的蛋白质是十分重要的，这是因为已指出怀孕期间的低蛋白质饮食会导致 肾脏发育迟缓并继而导致肾单位数量的减少，且有可能导致成人期的高血压(D′Agostino，N.Engl.R Med.348(17)1723-1724，2003)。下表提供了对不同个体来说推荐的总饮食蛋白摄入的示例性指导方针。

[0070] 表：美国关于饮食蛋白质需求的指导方针

[0071]年龄 推荐的总蛋白质摄入量(g)
婴儿 六个月或以下 13
6个月-1岁 14
1-3岁 16
儿童 4-6岁 24
7-10岁 28
男性 11-14岁 45
15-18岁 59
19-24岁 58
25-50岁 63
51岁以上 63
女性 11-14岁 46
15-18岁 44
19-24岁 46
25-50岁 50
51岁以上 50
孕妇 60
哺乳期妇女 65

[0072] 摄入蛋白质的实际量取决于蛋白质中的Phe含量。植物蛋白的氨基酸谱与动物蛋白的不同。例如，集中于淀粉和蔬菜而言，一般规律下可满足45-50mg/Phe每克蛋白质。然而，用于评估蛋白质中氨基酸组成的已接受的标准是鸡蛋白，它含有3.5克蛋白质，其中的204mg为Phe。

[0073] 由以上的示例性指导方针可见，在美国，对于育龄妇女(例如，51岁以下)的推荐蛋白质摄入为约44-50g/天，然而孕妇需求则推荐为摄入约60g/天。在加 拿大和英国，对于孕妇的推荐蛋白质摄入量依次为约70g/天和52g/天。因此，确保孕妇的血浆Phe浓度水平被紧密控制的需要由于这类PKU病人群体比相同年龄的非怀孕PKU妇女需要更多的蛋白质这一事实而变得更为复杂。

[0074] 从以上的角度而言，本发明基于BH4的治疗可对孕妇尤为有效。预期，对患有任何形式的HPA的孕妇或打算怀孕的妇女进行BH4治疗疗程以确保她的血浆Phe浓度水平尽可能保持在接近180μM/L-约360μM/L。这样的治疗疗程应优选可使该妇女提高她的正常蛋白质摄入水平。

[0075] 在上文IA和IB部分中所讨论的关于血浆Phe浓度水平的讨论和此Phe浓度应降低到何种程度的讨论被纳入针对孕妇的本部分中。

[0076] D.控制婴儿的PKU和根据本发明对其的治疗方法

[0077] 如本文全文所述，已确定婴儿血浆Phe浓度的提高(0-3岁)可导致该儿童IQ的显著下降。然而，在本说明其它部分的讨论中，其它具有上升至最高达400μM/L的血浆Phe浓度的患者通常不必接受任何饮食干预。因此，在目前的疗法中，0-3岁年龄的婴儿受到明显的有害作用。本申请包括对非限制性血浆Phe浓度高于360μM/L±15μM/L的任何婴儿施予含有BH4的治疗性组合物以使该患者的血浆Phe浓度发生有益的降低。

[0078] 在优选的实施方式中，所述婴儿的年龄为0-3岁且在给予BH4之前非限制性血浆Phe浓度为约1200μM/L，而给予BH4能降低所述血浆Phe浓度。优选地，所述血浆Phe浓度在给药后从高于1800下降到约1500μM/L、约1200μM/L、约1100μM/L、约1000μM/L、约900μM/L、约800μM/L、约700μM/L、约600μM/L、约550μM/L、约500μM/L、约450μM/L、约400μM/L、约350μM/L、约300μM/L、约275μM/L、约250μM/L。在另一实施方式中，所述婴儿的年龄为0-3岁且在给予BH4之前非限制性血浆Phe浓度高于1200μM/L，在单独给予BH4或与饮食联合给予BH4后，优选能将所述血浆Phe浓度降低到约800μM/L、或更优选降至约500μM/L、或更为优选降至约360μM/L。本领域技术人员可理解本发明包括给予非限制性血浆Phe浓度高于360μM/L的婴儿BH4以降低该血浆Phe浓度。上文IA和IB部分中关于血浆Phe浓度的治疗性降低的讨论纳入此处作为参考。此外，相对于初始非限制性血浆Phe浓度的任何超过10％的下降将被认为是对婴儿的治疗方案的治疗性结果。应当理解BH4治疗可于饮食限制相结合以在此类婴儿中引起血浆Phe浓度 的治疗性下降。 [0079] II.用于治疗的组合物

[0080] 本发明包括对PKU/HPA的治疗性干预。这种干预最初基于BH4的使用。所述BH4可单独使用或与饮食限制联合使用。而且，所述BH4和/或饮食限制可进一步联合其它所需的治疗组合物(例如设计用于对抗PKU的其它表现，例如用于防止Phe在脑中积累的大的中性氨基酸(参见Koch等Mol.Genet.Metabol.79：110-113，2003)或酪氨酸补充物。本部分讨论可用于本文所包含的治疗的组合物进行讨论。

[0081] A.BH4组合物

[0082] BH4是Phe羟化中的辅助因子，在本发明之前已显示，少于2％的出生时就患有Phe上升的病人在BH4合成中存在缺陷。对于被鉴别为BH4应答型的那些病人，已指出所述病人对饮食干预无应答性，因此给这些个体食用普通的饮食而只单独给予BH4治疗。因此，在本发明之前，本领域中对于给予PKU/HPA病人BH4的治疗益处抱有颇多怀疑。然而，如此处全篇所讨论，可施用BH4来对被诊断为非BH4应答性的病人进行治疗性干预。此外，发明人指出BH4治疗可与饮食限制联合以在对BH4负载试验应答的个体和对BH4负载非应答的个体中产生治疗性结果。

[0083] 美国专利5,698,408；2,601,215；3505329；4,540,783；4,550,109；4,587,340；4,595,752；4,649,197；4,665,182；4,701,455；4,713,454；4,937,342；5,037,981；
5,198,547；5,3 50,851；5,401,844；5,698,408和加拿大申请CA2420374中(各自纳入本文作为参考)分别描述了可用作本发明的组合物的二氢生物蝶呤、BH4及其衍生物的制备方法。任何此类方法均可用于制备本发明治疗方法中的BH4组合物。

[0084] 美 国 专 利 4,752,573；4,758,571；4,774,244；4,920,122；5,753,656；5,922,713；5,874,433；5,945,452；6,274,581；6,410,535；6,441,038；6,544,994；和 美国专利公开US20020187958；US20020106645；US2002/0076782；US20030032616(各自纳入本文作为参考)各自描述了用于非PKU治疗的BH4组合物的给药方法。将那些专利中的各篇作为参考纳入本文从而为本领域的技术人员提供已知的BH4组合物给药方法的大体教导，其可适用于本文所述的PKU/HPA治疗。

[0085] 除了上文所述的制备BH4的大致方法以外，本发明还具体包括制备和使用BH4组合物，所述组合物是稳定化的BH4组合物。优选稳定化的BH4组合物为结晶形式。制备用于本发明的稳定化的BH4组合物的方法在实施例2中有所描述。这种结晶形式在作为用于治疗PKU的常规蛋白质制剂的添加剂时可证明是有用的。该结晶形式还可方便地制成胶囊、粉末或其它用于口服给药的固体形式。BH4的剂型和给药途径在下文的药物组合物部分将有更详细的描述。

[0086] 在优选的实施方式中，本发明的方法包括为需要该方法的病人提供约10mg/kg-20mg/kg日剂量的BH4。当然，本领域的技术人员可根据给药要获得的效力来提高或降低该剂量。可以单剂量给予所述日剂量或者可以多剂量在适当间隔的间期中给予所述剂量。在示例性的实施方式中，所述日剂量可为5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg，19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg、24mg/kg、26mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、32mg/kg、34mg/kg、36mg/kg、
38mg/kg、40mg/kg、42mg/kg、44mg/kg、46mg/kg、48mg/kg、50mg/kg或更多mg/kg。 [0087] 不考虑BH4的给药量的话，理想的是通过给药使得病人的血浆Phe浓度降低到I部分中关于各种类型病人所述的那些浓度。

[0088] B.饮食蛋白质

[0089] 除了给予HPA/PKU病人BH4和相关类似物以外，还包括对所述病人的饮食蛋白质进行限制或改良。本领域的技术人员已知各种用于治疗PKU的市售蛋白质制剂。此类制剂包括MAXIMAID、PHENEX 1、PHENEX 2(RossLaboratories，Liverpool，UK)、LOFENALAC、PHENYL-FREE(Mead-Johnson)等。

[0090] 本领域的技术人员可使用所述的蛋白质制剂，它们一般不具有Phe浓度。所述蛋白质制剂常补充有PKU病人不足的氨基酸。此类氨基酸包括，例如L-酪氨酸和L-谷氨酸。已建议较为理想的是在PKU病人的饮食中补充缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(参见美国专利
4,252,822)。在某些临床表现中，PKU的毒副作用是由Phe阻碍了脑对其它氨基酸(例如酪氨酸和色氨酸)的吸收而引起的。已发现在PKU病人的饮食中补充过量的此类大的中性氨基酸能阻断Phe吸收入脑部并降低脑Phe水平。因此，本发明的方法包括：所述饮食方案还可补充入含有一种或多种此类氨基酸的组合物(Koch等，Mol.Genet.Metabol.79：
110-113，2003)。

[0091] 此外，已知在人乳和其它动物来源的食品中普遍存在的L-卡尼汀和牛磺酸也可补充入所述蛋白质限制配方。在某些实施方式中，可以20mg/100g蛋白质补充物的量添加L-卡尼汀，并以40mg/100g蛋白质补充物的量添加牛磺酸以辅助提供一定量在人乳和动物来源食品中普遍存在的这些因子。

[0092] 此外，本领域的技术人员可参考2000年国家科学院-国家研究委员会饮食推荐摄入(National Academy of Sciences-National Research Council DietaryReference Intakes)中对其它成分的进一步罗列，例如除了饮食蛋白质限制以外，应供给病人以确保其它补充物提供的必需的维生素和矿物质。

[0093] 参考上文IC部分中关于总蛋白质量的表和I部分中关于理想血浆Phe浓度的大致数字，本领域技术人员应能确定所需饮食性蛋白质限制的量，并由此对病人的饮食进行相应调整。以年龄为约11-14岁的男性为例，其优选应接受45g蛋白质/天。如果该个体患有严重典型性PKU(即他的非限制性血浆Phe浓度很可能会高于1200μM/L)，所述个体的大部分(若非全部)饮食蛋白质来源将可能会来自粉末状的蛋白质补充物，该补充物优选可将其血浆Phe浓度降低到低于600μM/L。通过给予该患者BH4，治疗性结果将会是病人血浆Phe浓度更大的下降，或者治疗性结果将会是所述个体的血浆Phe浓度下降类似的程度，但该个体可耐受来自普通饮食的蛋白质而不是来自饮食制剂的蛋白质。

[0094] 类似地，可使用本发明的方法使年龄约为11-14岁的患有中度PKU的男性通过普通蛋白质摄入而不是通过限制性制剂摄入配给的45g蛋白质/天。要确认本发明的方法是否有效，就必须规律性地测定病人的血浆Phe浓度以确保血浆Phe浓度保持至少低于400μM/L。下文描述了用于测定这些浓度的试验。优选地，获得低于或约360μM/L的浓度。

[0095] III.鉴别和监测患者群

[0096] 如此处通篇所述，在本发明的各种实施方式中，必须确定给定的病人是否对BH4治疗应答，还必须测定所述病人的苯丙氨酸浓度，以在起始时鉴别待治疗的PKU病人类型并且在治疗方案进行时监测该方案的效力。下文描述了示例性的此类方法。

[0097] A.BH4负载试验

[0098] 本领域的技术人员进行“BH4负载”试验来鉴别病人是否应答BH4。已采 用两种类型的负载试验来获得HPA的差异诊断。第一类是单纯口服BH4负载试验，第二类是苯丙氨酸/BH4联合负载试验。

[0099] 最简单的BH4负载试验是给予外源性BH4并测定给药对于降低血浆Phe浓度的影响。Danks等最先提出了静脉负载2mg/kg BH4(Lancet 1：1236，1976)，由于已可获得更高纯度的BH4，使用约2.5mg/kg体重的BH4进行口服给药成为可能。Niederwieser等最终提出了标准化的方法：给予7.5mg/kg单一口服剂量的BH4(Eur.J Pediatr.138：441，1982)，尽管有些实验室仍在使用20mg BH4/kg体重以上的剂量。可通过该试验鉴别患有因BH4缺陷或因PAH缺陷而造成的HPA的病人。

[0100] 为使单纯BH4负载试验产生可信的结果，病人的血液Phe水平需高于400μM/L。因此，按常例通常在进行该负载试验前，病人需停止PKU饮食2天。BH4试验试剂盒可购自和分发自Dr.Schircks Laboratories(Jona，Switzerland)。该试剂盒推荐在普通饮食摄入约30分钟后使用20mg BH4/kg体重的剂量。

[0101] 如上文所指出，理想化的病人Phe浓度需高于400μM/L以获得确切的BH4读数。在苯丙氨酸/BH4联合负载试验中，口服给予Phe(100mg/kg体重)加上BH4(20mg/kg体重)允许了对所有BH4缺陷的选择性筛选。通常，在口服制剂中给予Phe，然后在约1小时后给予BH4。在给予Phe之前和在给予Phe之后方便的时间间隔中(例如，1、3、5、9、13和25小时)监测血浆Phe水平。

[0102] 在单纯BH4负载试验或Phe/BH4联合负载试验中，均已指出负载后24小时内，血浆Phe比BH4对抗前的血浆Phe值下降30％以上指示了对BH4的应答性(Spaapen等，Mol.Genet.and Metabol.，78：93-99，2003)。

[0103] 进行BH4负载试验的其它方法也可使用。示例性的此类试验在以下文献中有所描述：例如，Muntau等，(N.Engl.J.Med.347(26)：2002)以及Berneggar和Blau(Mol.Genet.Metabol.77：304-313，2002)。

[0104] 在Berneggar和Blau的文献中，所述BH4负载试验使用了20mg/kg BH4，在0、4、8和24小时时采集血样分析苯丙氨酸和酪氨酸以区分BH4应答者和非应答者。该试验是在禁食至少3小时后进行的。在试验前对新蝶呤和生物蝶呤尿样进行测试。在口服给予6R BH4(20mg.kg体重)后，在整个试验阶段中允许进行普通食物摄入。0、4、8和24小时时分析血样中的Phe和Tyr。在4-8小时时收集另一尿样。在试验中的任何时间也可测定二氢蝶呤还原酶的活性。在血浆苯丙氨酸水平低于400μM/L的病人或已经进行低苯丙氨酸饮食的病人 中，Berneggar和Blau推荐在口服给予100mg Phe/kg体重3小时后给予BH4的联合苯丙氨酸-BH4测试。

[0105] Berneggar和Blau在负载后4和8小时时以“苯丙氨酸羟化作用”计算了BH4应答性，并将之表示为苯丙氨酸消除百分比。将不同BH4产品和不同患者群0，4和8小时时的“羟化率”图的斜率相比较。该斜率区分出了非应答者、缓慢应答者和应答者。所述缓慢应答者(参见Berneggar和Blau中的图5)需要更长的时间来达到360μM/L的截断值，且给予BH4的有效性取决于初始苯丙氨酸水平。这些作者推荐：对于那些血浆Phe低于800μM/L的病人和大多数血浆Phe高于1200μM/L的病人，Phe测定应在21小时进行。Phe/S对时间曲线可用于评估达到低于360μM/L的治疗性“安全”血浆Phe值所需的时间。 [0106] Muntau等(2002年)也提供了示例性的BH4负载试验，其可用于计算时间和BH4给药浓度。这些作者再次采用了给予病人含有100mg Phe/kg体重膳食的Phe/BH4联合负载试验。在进食1小时后，给予该病人20mg/kg BH4的口服剂量(Schirks Laboratories)。通过电喷射离子化质谱法(electrospray ionizationmass spectrometry)，在Phe负载前以及BH4负载后4、8和15小时时测定血液苯丙氨酸浓度。BH4负载后6-8小时间，可对新生儿进行母乳喂养，而较大的病人则被给予标准化的蛋白质摄入(10mg Phe/kg)。Muntau还描述了使Phe氧化的方法。在4小时的禁食和过夜禁食后，经口服给予总共6mg/kg溶于
13
葡萄糖溶液中的 C标记的Phe。然后在180分钟的时间段中收集呼气样品，并储存于真空玻璃管中。然后使用同位素比质谱(isotope ration mass spectrometry)分析这些样品，并计算回收的碳13(Treacy等，Pediat.Res.42：430-5，1997)。

[0107] Muntau等将BH4对抗后15小时血液Phe水平比给予BH4之前获得的值下降30％以上的病人划分为BH4应答型。当补充BH4使Phe氧化作用的值上升至少15％时，则认为Phe氧化率(通过测定180分钟内所获得的二氧化碳而测得)的提高是显著的。

[0108] 本领域的技术人员应能够使用上文供参考的任何方法来确定个体是否应答BH4。然而，本领域的技术人员还可能知道确定BH4应答性的其它等价和相关的方法，这些方法也可用于替代上述的方法。

[0109] B.Phe浓度的测定

[0110] 有多种方法可用于测定血液中存在的Phe(Shaw等，苯丙酮尿症-临床生物 化学中的分析方法(Analytical Methods in Phenylketonuria-Clinical Bio-chemistry.)，Bickett等编的苯丙酮尿症和氨基酸代谢的其它一些先天缺陷(Pheraylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism)，Stuttgart，Georg Thiem Verlag，47-561971，)。通常，采用荧光测定法从病人的血清中测定苯丙氨酸和酪氨酸浓度。这种测定法依赖于在亮氨酰基丙氨酸存在下加热苯丙氨酸与茚三酮而形成的荧光物质(McCaman等，J：Lab.Clin.Med.59：885-890，1962.)。

[0111] 用于测定Phe浓度的最常用方法是Guthrie试验，该试验中在用病人的血样饱和的滤纸上打出圆片。将均匀的圆片置于接种有枯草杆菌并含有特殊的枯草杆菌生长抑制剂的琼脂浅盘中培养。当苯丙氨酸从均匀圆片转移到琼脂中，Phe使得细菌生长抑制得到逆转，从而获得细菌生长区域，可通过将该区域与使用含有已知量Phe的圆片进行的相似测试相比较来得出苯丙氨酸浓度。

[0112] Phe浓度定量的其它方法包括：HPLC、质谱、薄层色谱等。这些方法可用于在治疗前测定病人的血浆Phe浓度，并在治疗方案中测定Phe浓度以确定所述方案的效力。 [0113] 期望在整个治疗方案时间进程中的适宜间隔(例如，每天、隔天或每周)监控病人的血浆Phe水平。通过这种有规律地监控血浆Phe水平，临床医师将可评估所述治疗的效力并相应调节对BH4和/或饮食蛋白质的需求。

[0114] IV.联合治疗

[0115] 本发明的某些方法涉及联合使用BH4和饮食性蛋白质限制以在患有不同形式HPA的病人产生治疗性结果。为了在本文所包含的联合治疗中达到适合的治疗性结果，通常将给予患者联合的有效量的BH4组合物和饮食限制以产生所需的治疗性结果(即，血浆Phe浓度的降低和/或病人能够耐受更大量的Phe/蛋白质摄入而不伴随血浆Phe浓度的上升)。该过程可包括同时给予BH4组合物和饮食蛋白质治疗性组合物。可通过给予单一组合物或药理性蛋白质制剂来获得此效果，所述蛋白质制剂包括所有所需的饮食蛋白质，并且在所述蛋白质制剂中还包含BH4。或者，在施用BH4药理性制剂(片剂、注射或饮用)的大致同时食用所述饮食蛋白质(补充物或普通蛋白质餐)。还可将所述BH4调配入适于摄取的蛋白质条或其它食品中，例如核仁巧克力饼、薄煎饼、蛋糕。

[0116] 在另一种选择中，可在饮食性蛋白质疗法之前或之后的从数分钟到数小时 的间隔中进行BH4治疗。在分别给予蛋白质和BH4组合物的实施方式中，一般应确保每次给药不间隔太久，从而使得BH4仍可对病人发挥有利的效果。在这种情况下，期望在摄入饮食蛋白质之前或之后的约2-6小时中施用BH4，最为优选是延迟时间仅为约1小时。在某些实施方式中，期望所述BH4治疗为不定时地给予病人日剂量的BH4的连续治疗。在另一种情况下，例如仅患有较轻形式的PKU和HPA的孕妇中，所述BH4治疗可仅在该妇女怀孕和/或哺乳时持续进行。

[0117] 此外，除了基于单独地递送BH4和饮食蛋白质调节以外，本发明的方法还包括与特异性靶向一种或多种HPA症状的第三种组合物的联合治疗。例如，已知由HPA引起的酪氨酸缺乏导致了神经递质多巴胺和5-羟色胺的缺陷。因此，在本发明中，还包括了将基于BH4和饮食蛋白质的方法进一步与给予L-多巴、卡比多巴和5-羟色氨酸神经递质联合以校正由饮食中酪氨酸量下降导致的缺陷。

[0118] 此外，本领域的技 术人员已尝试了用 PAH(Christensen等，Mol.Gent.AndMetabol.76：313-318，2002；Christensen等，Gene Therapy，7：1971-1978，2000)和苯丙氨酸氨裂解酶(PAL Liu等，Arts.Cell.Blood.Subs and Immob.Biotech.30(4)243-257，2002)进行基因治疗。也可将此类基因治疗技术与本发明基于BH4/饮食蛋白质限制的联合治疗相联合。在进一步的联合治疗中，期望将苯裂解酶(phenylase)作为注射用酶来破坏降低病人的Phe浓度。由于给予苯裂解酶不会产生酪氨酸(与给予PAH不同)，这种治疗仍会使得酪氨酸成为这些病人的必需氨基酸。因此，对于接受苯裂解酶和BH4联合治疗的病人，可能需要以酪氨酸进行饮食补充。

[0119] V.药物组合物

[0120] 用于根据本发明来给药的药物组合物可包括第一组合物，所述第一组合物包括以药学上可接受的形式存在并任选地与药学上可接受的载体相结合的BH4。可以用可获得预期目的的任何方式来给予这些组合物。用于治疗PKU的根据本发明的组合物的给药量和给药方案可由本领域技术人员很容易地确定。如上文所述，本领域的技术人员可先采用目前在医学领域中提出的BH4量和方案，例如，如上文II部分中列出的专利中所述建议用于调节NOS活性、或用于治疗疼痛或抑郁的那些组合物。已用于在负载试验中给予BH4的所述任何给 药计划、制剂和给药途径均可很容易地经改良以用于本发明。

[0121] 本文所述的组合物和方法并不限于对具体形式的BH4、或BH4类似物或衍生物形式的使用。事实上，本发明范围内的组合物和方法包括所有包含有效量的可获得预期目的的任何形式BH4、任何形式BH4类似物或衍生物的组合物。用于本文所述的组合物和方法的类似物的非限制性例子包括：蝶啶、蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤、7，8-二氢生物蝶呤、6-甲基四氢蝶呤、和其它6-取代的四氢蝶呤以及其它6-取代的四氢蝶呤类、墨蝶呤、6，7-二甲基四氢蝶呤、6-甲基生物蝶呤和其它6-取代的生物蝶呤，以及在本领域中有描述的其它类似物。用于本文所述的组合物和方法的衍生物的非限制性例子包括美国专利4,758,571；4,774,244；6,162,806；5,902,810；2,955,110；2,541,717；2,603,643；和4,371,514中所描述的那些衍生物，这些内容被纳入本文作为参考。

[0122] 本发明的某些治疗方法包括联合疗法，其中除给予改良的蛋白质饮食以外还给予基于BH4的组合物，本发明的药物组合物还包括至少含有基于BH4的治疗剂、其类似物或同系物的所有组合物，其中所述基于BH4的治疗剂、其类似物或同系物的量是在与改良的蛋白质饮食联合使用时能获得一种或多种PKU症状改善的有效量。当然，可被缓解的最为明显的症状是联合治疗使得血浆Phe浓度下降，然而也可监测其它症状例如IQ、执行功能、浓度、情绪、行为稳定工作表现(behavioral stability job performance)中的变化等。可使用本领域技术人员已知的技术来监测这些指数

[0123] (6R)L-四氢生物喋呤二盐酸盐的晶体多晶型物

[0124] 已发现BH4，具体而言是BH4二盐酸盐表现出晶体多晶型。BH4的结构如下所示： [0125]

[0126] BH4的(6R)形式是已知的生物活性形式，然而，还已知BH4在室温中不温定。已发现BH4的一种晶体多晶型物更稳定，且在室温条件下对分解作用稳定。

[0127] 对BH4难以进行处理，因此将其二盐酸盐(Schircks Laboratories，Jona， Switzerland)在氮气下密封在安瓿中来生产和提供，以防止由于其吸湿性质和对氧化敏感而造成的降解。美国专利4,649,197揭示到：由于6(R，S)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的结晶性不良，而难以将(6R)-和6(S)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐分离成其非对映体。欧洲专利第0 079 574描述了四氢生物喋呤的制备，其中获得了作为中间体的固体四氢生物喋呤二盐酸盐。S.Matsuura等(Chemistry Letters 1984，第735-738页以及Heterocycles，卷23，No.12,1985，第3115-3120页)描述了以无色针状形式存在的6(R)-四氢生物喋呤二盐酸盐结晶固体，以J.Biochem.98，1341-1348(1985)中揭示的X射线分析来表征。发现结晶产物的旋光度为6.81°，这与EP-A2-0 191 335的实施例6中所报道的白色晶体形式的晶状固体所具有的6.51 °的旋光度十分类似。

[0128] 在(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐形成中获得的结果表明所述化合物可以不同的结晶形式存在，包括多晶型形式和溶剂化物。对这一领域中持续的兴趣需要一种有效且可靠的方法来制备单一晶体形式的(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐并控制结晶条件以提供结晶形式，所述结晶形式优选为稳定且在制造和制剂过程中易于操作和处理的结晶形式，并且提供在该物质的形式或作为制剂产物时的高储存稳定性，或者提供稳定性较差的形式(适于作为制备稳定的结晶形式的受控制的结晶作用中的中间体)。 [0129] B型多晶型物

[0130] 在本文中将已发现的最为稳定的晶体多晶型物称为“B型”或者“多晶型物B”。在研究和产生(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐中获得的结果揭示已制备了几种已知的晶状固体，但没有人验证到多晶型及其对BH4晶体稳定性的影响。

[0131] 多晶型物B是一种轻度吸湿的无水物，它在约20℃以上具有最高的热力学稳定性。此外，由于B型的热稳定性、在目标条件下制备的可能性及其合适的形态和粒径使其可容易地被加工和处理。其熔点接近260℃(ΔHf＞140J/g)，但由于熔化前和熔化中的分解而不能测得确切的熔点。这些出色的特性使得B型多晶型物在制药用途(在升高的温度中进行制备)中尤为可取。可获得细粉状的多晶型物B，其粒径可为0.2-500μm。 [0132] B型显示了X射线粉末衍射图型，以d-值表示( )为：8.7(vs)，6.9(w)，5.90(vw)，5.63(m)，5.07(m)，4.76(m)，4.40(m)，4.15(w)，4.00(s)，3.95(m)， 3.52(m)，
3.44(w)，3.32(m)，3.23(s)，3.17(w)，3.11(vs)，3.06(w)，2.99(w)，2.96(w)，2.94(m)，
2.87(w)，2.84(s)，2.82(m)，2.69(w)，2.59(w)，2.44(w)。图1所示为B型(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐所显示的特征性X射线衍射图型。

[0133] 如本文所用，以下括号中的缩写表示：(vs)＝非常高的强度；(s)＝高强度；(m)＝中等强度；(w)＝弱强度；以及(vw)＝非常弱的强度。图1中展示了特征性X射线粉末衍射图型。

[0134] 已发现BH4的其它多晶型物具有用于在制造和配制中安全操作的令人满意的化学和物理稳定性，并提供了其纯化形式或制剂形式的高储存稳定性。此外，已发现可以极大的量(例如，100千克级别)制备B型和BH4的其它多晶型物并可储存很长的一段时间。 [0135] 包括晶体B型在内的所有的晶体形式(多晶型物、水合物和溶剂化物)均可用于制备最稳定的多晶型物B。可通过非晶态或非B型多晶型物的其它形式(例如多晶型物A)在适宜的极性和非水性溶剂中悬液的相平衡来获得多晶型物B。因此，本文所述的药物制备是指(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的B型多晶型物的制备。

[0136] 可将其它形式的BH4转变为B型，转变方法如下：在室温下将另一种形式的BH4分散在溶剂中，在室温下将所述悬液搅拌足以产生B型多晶型物的一段时间，然后分离结晶的B型并从分离的B型中去除溶剂。如本文所用，室温是指从0-60℃，优选15-40℃的温度。可在处理和搅拌中通过逐步或连续降低温度来改变使用的温度。用于将其它形式转变为B型的适宜溶剂包括但不限于：甲醇、乙醇、异丙醇、其它C3-和C4-醇、醋酸、乙腈、四氢呋喃、甲基-叔丁基醚、1，4-二氧六环、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、其它C3-C6-乙酸酯、甲基乙基酮和其它甲基-C3-C5烷基-酮。完成相平衡的时间最多可为30小时，优选最多为20小时或少于20小时。

[0137] 也可通过从最多包含约5％水的溶剂混合物中结晶来获得多晶型物B，尤其是从乙醇、乙酸和水的混合物中结晶获得。已发现可通过以下方法来制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐B型多晶型物：任选地在提高的温度下，将优选为比B型(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐能量低的固体或B型溶于包含乙醇、乙酸和水的混合溶剂中，在溶液中加入晶种，冷却所得的悬液并分离形成的晶体。溶解可在室温或最高70℃，优选最高50℃的温度下进行。可将最终的溶剂混合物用于溶解或可先将原料溶于水然后同时或依次加入其它 溶剂。溶剂混合物的组合物可包括体积比为1∶3∶2-1∶9∶4优选1∶5∶4的水∶乙酸∶四氢呋喃。优选对溶液进行搅拌。冷却是指将温度降低到-40-0℃，优选降至
10-30℃。适合的晶种是另一批次的B型多晶型物，或是具有类似或相同形态的晶体。分离后，可用非溶剂(例如丙酮或四氢呋喃)洗涤B型晶体，并用常规的方法将其干燥。 [0138] 也可通过加入非溶剂(例如甲醇、乙醇和乙酸)从水溶液中结晶获得多晶型物B。
可有利地在室温下进行结晶和分离步骤，而无需冷却该溶液。因此该方法非常适于以工业化规模实施。

[0139] 在本文所述组合物和方法的一个实施方式中，通过乙酰胺方法制备了包含(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的B型多晶型物的组合物：室温下将除(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐B型以外的固体形式或B型溶于水中，加入足以形成悬液的非溶剂，任选地搅拌该悬液一定时间，然后分离形成的晶体。如下文所述将该组合物进一步加工为药物组合物。

[0140] 水溶液中的(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐相对于溶液的浓度可为10-80重量％，更优选20-60重量％。优选的非溶剂(即，可用于制备BH4悬液的溶剂)是甲醇、乙醇和乙酸。可将非溶剂加入水溶液中。更优选地，将所述水溶液加入到非溶剂中。配成悬液后的搅拌时间最多为30小时，优选最多为20小时或少于20小时。采用如上文所述已知的方法来通过过滤和干燥进行分离。

[0141] B型多晶型物是一种非常稳定的结晶形式，它可很容易地被滤出、干燥和研磨成药物配制所需的粒径。这些出色的特性使B型多晶型物尤为适用于制药用途。

[0142] A型多晶型物

[0143] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种晶体多晶型物是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“A型”或“多晶型物A”。多晶型物A轻度吸湿并可吸收约3重量％的水，当以10℃/分钟的速率加热时，在50-200℃间连续释放出水。该多晶型物A是一种吸湿无水物，其相对于B型而言是一种亚稳定(meta-stable)形式；然而，如果保存在密封容器中，它可在室温条件下稳定数月以上。A型尤为适于在生产稳定多晶型物形式中作为中间物和原料。可将A型多晶型物制备为具有所需中等粒径的固体粉末，该粒径通常为1-约500μm。

[0144] 多晶型物A显示出具有用以下d-值( )表示的特征峰的特征X射线粉末衍射图型：15.5(vs)，12.0(m)，6.7(m)，6.5(m)，6.3(w)，6.1(w)，5.96(w)，5.49(m)，4.89(m)，3.79(m)，3.70(s)，3.48(m)，3.45(m)，3.33(s)，3.26(s)，3.22(m)，3.18(m)，3.08(m)，
3.02(w)，2.95(w)，2.87(m)，2.79(w)，2.70(w)。图2所示为A型(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐显示的特征性X射线衍射图型。

[0145] 多晶型物A显示出用波数(cm-1)表示的特征性拉曼光谱带：2934(w)，2880(w)，1692(s)，1683(m)，1577(w)，1462(m)，1360(w)，1237(w)，1108(w)，1005(vw)，881(vw)，
813(vw)，717(m)，687(m)，673(m)，659(m)，550(w)，530(w)，492(m)，371(m)，258(w)，-1
207(w)，101(s)，87(s)cm 。

[0146] 可通过冷冻干燥或从(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐水溶液中除去水来得到A型多晶型物。可通过以下方法制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的A型多晶型物：室温下将(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于水，(1)将溶液冷却至低温以使溶液凝固，并减压除水，或(2)从所述水溶液中去除水。

[0147] 可通过过滤分离A型晶体，然后干燥以蒸发产物中所吸收的水。已知干燥条件和方法，且干燥分离的产物或依照本文所述的可选方法(2)来去除水可在真空下或在升温且真空下应用升高的温度(例如高达80℃，优选30-80℃)来进行。在分离从可选方法(2)中获得的析出物之前，可将所述悬液搅拌一定时间以进行相平衡。以溶液为基准，水溶液中(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的浓度可为5-40重量％。

[0148] 优选通过快速冷却来获得固体溶液作为原料。减压直至完全去除该溶剂。冷冻干燥是本领域中众所周知的技术。完成溶剂去除的时间取决于所采用的真空度(其可为0.01-1毫巴)、所用的溶剂和冷冻温度。

[0149] 通过相平衡试验证明了A型多晶型物在室温或低于室温下在基本不含水的条件下是稳定的，所述相平衡试验是将四氢呋喃或叔丁基甲基醚中的悬液在室温和氮气下分别搅拌5天和18小时进行的。通过过滤和室温下的自然干燥获得不变的A型多晶型物。 [0150] F型多晶型物

[0151] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种晶体多晶型物是可用于本文所述的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“F型”或“多晶型物F”。多晶型物F轻度吸湿并可吸收约3重量％的水，当以10℃/ 分钟的速率加热时，在50-200℃间连续释放出水。该多晶型物F是一种亚稳定形式且为吸湿无水物，其在较低环境温度下比A型更稳定而在较高温度下稳定性弱于B型，F型尤为适于在生产稳定多晶型物形式中作为中间物和原料。而言是一种代谢稳定形式；然而，如果保存在密封容器中，它可在室温条件下稳定数月以上。F型尤为适于在生产稳定多晶型物形式中作为中间物和原料。可将F型多晶型物制备为具有所需中等粒径的固体粉末，该粒径通常为1-约500μm。 [0152] 多晶型物F显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：17.1(vs)，12.1(w)，8.6(w)，7.0(w)，6.5(w)，6.4(w)，5.92(w)，5.72(w)，5.11(w)，4.92(m)，4.86(w)，4.68(m)，4.41(w)，4.12(w)，3.88(w)，3.83(w)，3.70(m)，3.64(w)，
3.55(m)，3.49(s)，3.46(vs)，3.39(s)，3.33(m)，3.31(m)，3.27(m)，3.21(m)，3.19(m)，
3.09(m)，3.02(m)和2.96(m)。图3所示为F型(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐显示的特征性X射线衍射图型。

[0153] 可通过A型多晶型物在适合的极性和非水性溶剂的悬液中的相平衡来获得多晶型物F，所述溶剂对所述较低能量形式几乎不溶，尤其是醇类例如甲醇、乙醇，正丙醇和异丙醇。也可通过以下方法制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的F型多晶型物：将固体A型(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐颗粒分散在非水性溶剂中，所述溶剂在低于室温时对所述(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐几乎不溶，在所述低于室温的温度下将该悬液搅拌足以产生F型多晶型物的一段时间，然后分离结晶F型并从分离的F型中去除溶剂。溶剂的去除和干燥可在空气、干燥空气或干燥保护气(例如氮气、惰性气体)下，在室温下或低于室温下(例如低至0℃)下进行。相平衡时的温度优选为5-15℃，更优选约10℃。

[0154] J型多晶型物

[0155] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种晶体多晶型物是可用于本文所述的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“J型”或“多晶型物J”。多晶型物J轻度吸湿并可在空气湿度下处理时吸收水份。该多晶型物J是一种亚稳定形式且为吸湿无水物，且其可转变回下文所述的E型，E型暴露于高相对湿度条件下(例如75％以上相对湿度)即得到J型。J型尤为适于在生产稳定多晶型物形式中作为中间物和原料。
可将J型多晶型物制备 为具有所需中等粒径的固体粉末，该粒径通常为1-约500μm。 [0156] 多晶型物J显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：14.6(m)，6.6(w)，6.4(w)，5.47(w)，4.84(w)，3.29(vs)，和3.21(vs)。图4所示为J型(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐显示的特征性X射线衍射图型。

[0157] 可通过在真空下适当温度中使E型失水来获得多晶型物J。具体而言，可通过以下方法来制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的J型多晶型物：获得E型并在适合温度下通过在真空干燥器中处理E来从E中去除水，从而获得J型，所述适合温度是指25-70℃的温度，最优选30-50℃。

[0158] K型多晶型物

[0159] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种晶体多晶型物是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“K型”或“多晶型物K”。多晶型物K轻度吸湿并可吸收约2.0重量％的水，当以10℃/分钟的速率加热时，在50-200℃间连续释放出水。该多晶型物K是一种亚稳定形式且为吸湿无水物，它在较高温度下的稳定性弱于B型，K型尤为适于在生产稳定多晶型物形式(尤其是B型)中作为中间物和原料。可将K型多晶型物制备为具有所需中等粒径的固体粉末，该粒径通常为1-约500μm。 [0160] 多晶型物K显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特 征峰：14.0(s)，9.4(w)，6.6(w)，6.4(w)，6.3(w)，6.1(w)，6.0(w)，5.66(w)，5.33(w)，5.13(vw)，4.73(m)，4.64(m)，4.48(w)，4.32(vw)，4.22(w)，4.08(w)，3.88(w)，3.79(w)，
3.54(m)，3.49(vs)，3.39(m)，3.33(vs)，3.13(s)，3.10(m)，3.05(m)，3.01(m)，2.99(m)，和
2.90(m)。图5所示为K型(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐显示的特征性X射线衍射图型。

[0161] 可从含有少量水的极性溶剂混合物中在少量抗坏血酸的存在下通过结晶获得多晶型物K。用于溶剂混合物中的溶剂可选自乙酸和醇，例如甲醇、乙醇、正或异丙醇。具体而言，可通过以下方法制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的K型多晶型物：在升高的温度下将(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于乙酸和含有少量水和少量抗坏血酸的醇或四氢呋喃中，将温度降低到低于室温以使所述二盐酸盐结晶，分离析出物并在升高的温度和任选真空下干燥分离的析出物。适合的醇为例如甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇，其中优选乙醇。乙 酸对醇或四氢呋喃的比例可为2∶1-1∶2，优选约1∶1。(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的溶解可在较高水含量的存在下进行，并可加入更多抗溶剂混合物以获得完全析出。最终组合物中的含水量可为0.5-5重量％，而抗坏血酸的量可为0.01-0.5重量％，两者均以溶剂混合物为基准。溶解温度可为30-100℃，优选35-70℃，干燥温度可为30-50℃。分离(例如过滤)后可用醇(例如乙醇)洗涤析出物。可通过在高于室温(例如30-40℃)的温度下，在例如异丙醇中进行相平衡并任选地种入B型晶体很容易地将多晶型物K转变为最稳定的B型。

[0162] (6R)L-四氢生物喋呤二盐酸盐的水合形式

[0163] 如下文中进一步所述，已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐存在多种结晶水合物，将对它们进行描述并在本文中定义为C、D、E、H、和O型。这些水合物形式可用作本文所述的用于药物制剂中的BH4稳定形式，以及用于包括BH4稳定晶体多晶型物的组合物的制备中。

[0164] C型水合物

[0165] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的水合晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“C型”或“水合物C”。水合物C轻度吸湿并含有约5.5重量％的水，这表明C型是一水合物。水合物C的熔点约94℃(ΔHf为约为31J/g)且C型水合物尤为适于在生产稳定多晶型形式中作为中间物和原料。可将C型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。 [0166] C型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：18.2(m)，15.4(w)，13.9(vs)，10.4(w)，9.6(w)，9.1(w)，8.8(m)，8.2(w)，8.0(w)，6.8(m)，
6.5(w)，6.05(m)，5.77(w)，5.64(w)，5.44(w)，5.19(w)，4.89(w)，4.76(w)，4.70(w)，
4.41(w)，4.25(m)，4.00(m)，3.88(m)，3.80(m)，3.59(s)，3.50(m)，3.44(m)，3.37(m)，
3.26(s)，3.19(vs)，3.17(s)，3.1 1(m)，3.06(m)，3.02(m)，2.97(vs)，2.93(m)，2.89(m)，
2.83(m)，和2.43(m)。图6所示为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的C型水合物所显示的特征性X射线衍射图型。

[0167] 可在室温下将多晶型物(例如多晶型物B)在含有优选为约5重量％(以溶剂为基准)的水的非溶剂的悬液中的相平衡来获得C型水合物。可通过下述方法制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的C型水合物：将(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐悬浮在非溶剂中，所述非溶剂为例如，庚烷；C1-C4-醇，如甲 醇、乙醇、1-或2-正丙醇；乙酸酯，如乙酸乙酯；乙腈；乙酸；或醚，如四氢呋喃、二氧六环、叔丁基甲基醚；或这些非溶剂的二元或三元混合物。在所述非溶剂中加入足量的水以形成一水合物，将悬液在室温或低于室温下(例如，0-30℃)搅拌足以形成一水合物的一段时间。足量的水可指以溶剂的量为基准，1-10重量％，优选3-8重量％的水。可滤出所述固体并在室温下空气干燥。该固体可吸收一定的水，从而具有比理论值5.5重量％高的水含量。C型水合物相对于D型和B型不稳定，并易于在约40℃的温度下在空气中和较低相对湿度下转变为B型多晶型物。可通过室温下的悬液平衡，将C型转变为更稳定的水合物D。

[0168] D型水合物

[0169] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种水合晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“D型”或“水合物D”。水合物D轻度吸湿并含有约5.0-7.0重量％的水，这表明D型是一水合物。水合物C的熔点约153℃(ΔHf约为111J/g)，它的稳定性比C型高出很多，甚至在室温下暴露于空气湿度时也是稳定的。因此，D型水合物可用于制备制剂或作为生产稳定多晶型形式的中间物和原料。可将D型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约
500μm。

[0170] D型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：8.6(s)，6.8(w)，5.56(m)，4.99(m)，4.67(s)，4.32(m)，3.93(vs)，3.88(w)，3.64(w)，3.41(w)，3.25(w)，3.17(m)，3.05(s)，2.94(w)，2.92(w)，2.88(m)，2.85(w)，2.80(w)，
2.79(m)，2.68(w)，2.65(w)，2.52(vw)，2.35(w)，2.34(w)，2.30(w)，和2.29(w)。图7所示为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的D型水合物所显示的特征性X射线衍射图型。 [0171] 可通过下述方法制备D型水合物：在约室温下将浓缩的(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐水溶液加入到过量的非溶剂中，所述非溶剂为例如，己烷、庚烷、二氯甲烷、
1-或2-正丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或醚(例如，四氢呋喃、二氧六环、叔丁基甲基醚)或这些非溶剂的混合物，并在室温下搅拌该悬液。可滤出该结晶固体，然后在室温下以干燥的氮气干燥。优选的非溶剂是异丙醇。所述水溶液的加入可逐滴进行以防止突然析出。可通过以下方法来制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的D型水合物：室温下将浓缩的(6R)-L- 赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐水溶液加入到过量的非溶剂中，并在室温下搅拌该悬液。过量的非溶剂是指水对非溶剂的比例为1∶10-1∶1000。相对于一水合物而言，D型包含少许过量的水，据信是由于该结晶水合物的轻度吸湿性质，它吸收了水。D型水合物被视为是室温下和低于70％的相对湿度下，在已知水合物中最稳定的一种。可使用D型水合物在该水合物稳定的条件下制备制剂。室温是指20-30℃。

[0172] E型水合物

[0173] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种水合晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“E型”或“水合物E”。水合物E的水含量约为10-14重量％，这表明E型是二水合物。水合物E是在低于室温的温度下形成的。E型水合物尤为适于作为生产稳定多晶型形式的中间物和原料。它特别适于通过在氮气下或任选地在真空下干燥来生产不含水的J型。E型是非吸湿性的且在相当高的相对湿度(即相对湿度高于约60％且最高为85％)下稳定。可将E型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。

[0174] E型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：15.4(s)，6.6(w)，6.5(w)，5.95(vw)，5.61(vw)，5.48(w)，5.24(w)，4.87(w)，4.50(vw)，4.27(w)，3.94(w)，3.78(w)，3.69(m)，3.60(w)，3.33(s)，3.26(vs)，3.16(w)，3.08(m)，
2.98(w)，2.95(m)，2.91(w)，2.87(m)，2.79(w)，2.74(w)，2.69(w)，和2.62(w)。图8所示为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的E型水合物所显示的特征性X射线衍射图型。 [0175] 可通过下述方法制备E型水合物：室温下将浓缩的(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐水溶液加入到冷却到10到-10℃，优选0-10℃的过量非溶剂中，并在所述温度下搅拌该悬液。可滤出该结晶固体，然后在室温下以干燥的氮气干燥。非溶剂为例如：己烷、庚烷、二氯甲烷、1-或2-正丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或醚(例如四氢呋喃、二氧六环、叔丁基甲基醚)、或这些非溶剂的混合物。优选的非溶剂是异丙醇。所述水溶液的加入可逐滴进行以防止突然析出。可通过以下方法来制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的E型水合物：室温下将浓缩的(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐水溶液加入到过量的非溶剂中(所述非溶剂被冷却到10到-10℃)，并在室温下搅拌该悬液。过量的非溶剂是指水对非溶剂的比例为1∶10-1∶1000。优选的非溶剂是四氢呋喃。另一制备过程包括将B型多晶型物暴露于相对湿度为70-90％，优选为约80％的大气气氛中。E型水合物被视为是二水合的，其可吸收更多量的水。可在适宜温度下通过真空干燥(指20-50℃，
0-100毫巴的压强)，将E型多晶型物转变为多晶型物J。由于E型在高相对湿度下稳定，而尤为适合于半固体形式的制剂。

[0176] H型水合物

[0177] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种水合晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“H型”或“水合物H”。水合物H的水含量为约5.0-7.0重量％，这表明H型是吸湿性一水合物。水合物H是在低于室温的温度下形成的。H型水合物尤为适于作为生产稳定多晶型形式的中间物和原料。可将H型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。 [0178] H型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：15.8(vs)，10.3(w)，8.0(w)，6.6(w)，6.07(w)，4.81(w)，4.30(w)，3.87(m)，3.60(m)，3.27(m)，3.21(m)，3.13(w)，3.05(w)，2.96(m)，2.89(m)，2.82(w)，和2.67(m)。图9所示为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的H型水合物所显示的特征性X射线衍射图型。 [0179] 可通过下述方法制备H型水合物：室温下将(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于乙酸和水的混合物中，然后加入非溶剂以使结晶固体析出，冷却所得的悬液，并将冷却的悬液搅拌一定时间。滤出结晶固体，然后在室温下真空干燥。非溶剂为例如：己烷、庚烷、二氯甲烷、1-或2-正丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或醚(例如四氢呋喃、二氧六环、叔丁基甲基醚)、或这些非溶剂的混合物。优选的非溶剂为四氢呋喃。可通过下述方法制备H型水合物：室温下将(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于乙酸和少于乙酸量的水的混合物中，加入非溶剂，将所得的悬液冷却到-10到10℃，优选-5到5℃，并将悬液在所述温度下搅拌一定时间。一定时间是指1-20小时。乙酸对水的重量比可为2∶1-25∶1，优选5∶1-15∶1。乙酸/水对非溶剂的重量比可为1∶2-1∶5。由于H型水合物吸湿的性质，它似乎为吸收有稍许过量水的一水合物。

[0180] O型水合物

[0181] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种水合晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“O型”或“水合物O”。水合物O是在接近室温的温度下形成的。O型水合物尤为适于作为生产稳定多晶型形式的中间物和原料。可将H型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。

[0182] O型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：15.9(w)，14.0(w)，12.0(w)，8.8(m)，7.0(w)，6.5(w)，6.3(m)，6.00(w)，5.75(w)，5.65(m)，
5.06(m)，4.98(m)，4.92(m)，4.84(W)j4.77(w)，4.42(w)，4.33(w)，4.00(m)，3.88(m)，
3.78(w)，3.69(s)，3.64(s)，3.52(vs)，3.49(s)，3.46(s)，3.42(s)，3.32(m)，3.27(m)，
3.23(s)，3.18(s)，3.15(vs)，3.12(m)，3.04(vs)，2.95(m)，2.81(s)，2.72(m)，2.67(m)，和
2.61(m)。图10所示为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的O型水合物所显示的特征性X射线衍射图型。

[0183] 可通过下述方法制备O型水合物：将F型多晶型物在含有水蒸气从而得到的相对湿度约为52％的氮气气氛中暴露约24小时。可在52％的相对湿度下用轻度吸湿的无水F型制备O型这一事实表明，O型是一种水合物，其在室温和潮湿条件下比F型更稳定。 [0184] (6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的溶剂化物形式

[0185] 如下文中进一步所述，已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐存在多种结晶溶剂化物形式，将对它们进行描述并在本文中定义为G、I、L、M和N型。这些溶剂化物形式可用作本文所述的用于药物制剂中的BH4稳定形式，以及用于包括BH4稳定晶体多晶型物的组合物的制备中。

[0186] G型溶剂化物

[0187] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的乙醇溶剂化物晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“G型”或“水合物G”。G型乙醇溶剂化物的乙醇含量为约8.0-12.5重量％，这表明G型是吸湿性单乙醇溶剂化物。G型溶剂化物是在低于室温的温度下形成的。G型水合物尤为适于作为生产稳定多晶型形式的中间物和原料。可将G型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。

[0188] G型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征 峰：14.5(vs)，10.9(w)，9.8(w)，7.0(w)，6.3(w)，5.74(w)，5.24(vw)，5.04(vw)，4.79(w)，4.41(w)，4.02(w)，3.86(w)，3.77(w)，3.69(w)，3.63(m)，3.57(m)，3.49(m)，3.41(m)，
3.26(m)，3.17(m)，3.07(m)，2.97(m)，2.95(m)，2.87(w)，和 2.61(w)。 图 11 所 示 为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的G型溶剂化物所显示的特征性X射线衍射图型。 [0189] 可通过下述方法制备G型乙醇溶剂化物：将结晶的L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于水中并加入大大过量的乙醇，在室温或室温下搅拌所得悬液，并在约室温下以空气或氮气干燥分离的固体。此处，大大过量的乙醇是指所得的乙醇和水的混合物中含有少于10％的水，优选约3-6％。可通过下述方法制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的乙醇化G型：在约室温至75℃的温度下将(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于水或水和乙醇的混合物中，将经过加热的溶液冷却到室温，并降至5-10℃，任选地加入乙醇以完全析出，在20-5℃的温度下搅拌所得悬液，滤出白色结晶固体并在约室温的温度下在空气或保护气下(例如氮气)干燥该固体。该过程可以第一种选择方式进行：在约室温下将(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于较少量的水中，然后加入过量的乙醇，再将所得的悬液搅拌足以进行相平衡的一段时间。在第二种选择方式中：可将(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐悬浮在乙醇中，任选地加入较少量的水，加热该悬液并溶解(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐，将溶液冷却到约5-15℃的温度，将额外的乙醇加入到悬液中，然后搅拌所得悬液足以相平衡的一段时间。

[0190] I型溶剂化物

[0191] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的乙酸溶剂化物晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“I型”或“水合物I”。I型乙酸溶剂化物的乙酸含量为约12.7重量％，这表明I型是吸湿性乙酸单溶剂化物。溶剂化物I是在低于室温的温度下形成的。I型水合物尤为适于作为生产稳定多晶型形式的中间物和原料。可将I型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。

[0192] I型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：14.5(m)，14.0(w)，11.0(w)，7.0(vw)，6.9(vw)，6.2(vw)，5.30(w)，4.79(w)，4.44(w)，4.29(w)，4.20(vw)，4.02(w)，3.84(w)，3.80(w)，3.67(vs)，3.61(m)，3.56(w)， 3.44(m)，
3.27(w)，3.19(w)，3.11(s)，3.00(m)，2.94(w)，2.87(w)，和 2.80(w)。 图 12 所 示 为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的I型溶剂化物显示的特征性X射线衍射图型。 [0193] 可通过下述方法制备I型乙酸溶剂化物：在升高的温度下，将L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于乙酸和水的混合物中，在溶液中进一步加入乙酸，将温度降至约10℃，然后将所形成的悬液加温到约15℃，然后将所得的悬液搅拌足以达到相平衡的最长可达3天的一段时间。然后滤出结晶固体并在室温下以空气或保护气(例如氮气)干燥。 [0194] L型溶剂化物

[0195] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的混合的乙醇溶剂化物/水合物晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“L型”或“水合物I”。F型可含有4％但最高为13％的乙醇和0-约6％的水。将L型在约0-20℃的温度下在乙醇中处理可将其转变为G型。此外，将L型在室温下(10-60℃)在有机溶剂中处理可将其转变为B型。可将L型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。

[0196] L型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：14.1(vs)，10.4(w)，9.5(w)，9.0(vw)，6.9(w)，6.5(w)，6.1(w)，5.75(w)，5.61(w)，5.08(w)，
4.71(w)，3.86(w)，3.78(w)，3.46(m)，3.36(m)，3.06(w)，2.90(w)，和2.82(w)。图13所示为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐L型溶剂合物所显示的特征性X射线衍射图型。 [0197] 可通过下述方法制备F型：室温下，将E型水合物悬浮在乙醇中，并在0-10℃，优选约5℃的温度下将该悬液搅拌足以达到相平衡的一段时间(可为10-20小时)。然后滤出该结晶固体，并优选在30℃减压或在氮气下进行干燥。经TG-FTIR分析表明L型可包含可变量的乙醇和水，即，其可作为多晶型物(无水)、作为混合的乙醇溶剂化物/水合物、或甚至作为水合物存在。

[0198] M型溶剂化物

[0199] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的乙醇溶剂化物晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“M型”或“水合物M”。M型可含有4％但最高为13％的乙醇和0-约6％的水，这表 明M型是轻度吸湿的乙醇溶剂化物。M型溶剂化物是在室温下形成的。M型尤为适于作为生产稳定多晶型形式的中间物和原料，这是由于将M型在约-10到15℃的温度下在乙醇中处理可将其转变为G型，而将M型在有机溶剂(例如乙醇、C3和C4醇、或环醚如THF和二氧六环)中处理可将其转变为B型。可将M型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。

[0200] M型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：18.9(s)，6.4(m)，6.06(w)，5.66(w)，5.28(w)，4.50(w)，4.23(w)，和3.22(vs)。图14图1所示为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的M型溶剂化物所显示的特征性X射线衍射图型。

[0201] 可通过下述方法制备M型乙醇溶剂化物：室温下，将L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶解在乙醇中，并在室温下(即10-40℃)在氮气中蒸发溶剂。也可通过下述方法获得M型：在流速为约20-100ml/分钟的干燥氮气轻流下干燥G型。所余的乙醇量可根据氮气下的干燥程度而不同，即，从约3％-13％。

[0202] N型溶剂化物

[0203] 已发现(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的另一种溶剂化物晶体形式是可用于本发明的药物制剂中的稳定的优选BH4形式，其在本文中被称为“N型”或“水合物N”。N型可含有总量最高为10％的异丙醇和水，这表明N型是轻度吸湿的异丙醇溶剂化物。可通过用异丙醇洗涤D型，然后约30℃在真空中干燥来获得N型。N型尤为适于作为生产稳定多晶型形式的中间物和原料。可将N型多晶型物制备为具有所需中等粒径范围的固体粉末，该粒径范围通常为1-约500μm。

[0204] N型显示出特征性X射线粉末衍射图型，具有用以下d-值( )表示的特征峰：19.5(m)，9.9(w)，6.7(w)，5.15(w)，4.83(w)，3.91(w)，3.56(m)，3.33(vs)，3.15(w)，2.89(w)，2.81(w)，2.56(w)，和2.36(w)。图15所示为(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的N型溶剂化物所显示的特征性X射线衍射图型。

[0205] 可通过下述方法制备异丙醇N型：将L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐溶于4.0ml异丙醇和水的混合物中(混合体积比为例如4∶1)。向该溶液中缓慢加入异丙醇(IPA，例如约4.0ml)，并将所得悬液冷却到0℃，在该温度下搅拌数小时(例如，约10-18小时)。过滤该悬液，并在室温下用异丙醇洗涤固体残留物。然后 在室温下(例如，约20-30℃)和减压(约2-10毫巴)下将所得结晶材料干燥数小时(例如，约5-20小时)。TG-FTIR显示在25-200℃间失重9.0％，这是由异丙醇和水共同造成的。此结果表明N型可以异丙醇溶剂化物形式、或混合的异丙醇溶剂化物/水合物的形式、或作为含有少量水的非溶剂化形式存在。

[0206] 为了制备所述多晶型形式，可使用本领域已知的结晶技术，例如悬液搅拌法(相平衡)、析出法、重结晶法、蒸发法、溶剂(如水)吸收法或溶剂化物分解法。可将稀释、饱和或过饱和溶液用于结晶，种入或不种入适合的成核剂。可采用最高为100℃的温度来形成溶液。可采用降至-100℃，优选-30℃的冷却温度来引发结晶和析出。可使用亚稳定的多晶型物或假多晶型物形式来制取用于制备更稳定形式的溶液或悬液以及获得溶液中的更高浓度。

[0207] 令人吃惊地发现D型水合物为水合物中最为稳定的形式，而B型和D型是尤为适用于药物制剂的形式。B型和D型表现出一些优点，如有目标性的生产、由于适宜的结晶粒度和形态而具有良好的加工性，在不同制剂类型的生产条件下有非常良好的稳定性、储存稳定性、较高的溶解性和高生物利用度。因此，在本文说揭示的方法和/或组合物中，混合物中存在的BH4形式优选为稳定化的BH4晶体形式，并选自下组：A型晶体多晶型物、B型晶体多晶型物、F型晶体多晶型物、J型晶体多晶型物、K型晶体多晶型物、C型晶体水合物、D型晶体水合物、E型晶体水合物、H型晶体水合物、O型晶体水合物、G型晶体溶剂化物、I型晶体溶剂化物、L型晶体溶剂化物、M型晶体溶剂化物、N型晶体溶剂化物以及它们的组合。更优选地，用于本文所揭示的用于组合物和方法中的BH4形式为药物组合物，所述组合物中包含(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的B型多晶型物和/或D型水合物，以及药学上可接受的载体或稀释剂。

[0208] (6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的晶体形式可与：叶酸或四氢叶酸或它们药学上可接受的盐(例如钠盐、钾盐、钙盐或铵盐)一起使用，可各自独立或添加有精氨酸。晶体形式∶叶酸或其盐∶精氨酸的重量比可为约1∶10∶10-约10∶1∶1。

[0209] VI.药物制剂

[0210] 本文所述的制剂优选作为口服制剂给药。口服制剂优选为固体制剂，例如胶囊、片剂、丸剂和含片，或液体制剂，例如水性悬液、酏剂和糖浆剂。本文 所述的不同形式的BH4可直接作为粉末(微粉化颗粒)、细粒、悬液或溶液使用，或者也可将其与其它药学上可接受的成分混合来与这些成分联合，可任选地将它们细分然后灌入胶囊(由例如硬胶或软胶组成的胶囊)、压制成片剂、丸剂或含片、或将它们悬浮或溶解于载体中成为悬液、酏剂和糖浆剂。在压制形成丸剂后，可进行包衣。

[0211] 对于各种不同类型的制剂，其药学上可接受的成分是已知的，这些成分可为例如：粘合剂(如天然或合成聚合物)、赋形剂、润滑剂、表面活性剂、甜味剂和调味剂、包衣材料、防腐剂、染料、增稠剂、佐剂、抗微生物剂、抗氧化剂以及用于不同制剂类型的载体。可用于本文所述的组合物的粘合剂的非限制性例子包括：西黄蓍胶；阿拉伯胶；明胶；以及生物可降解的聚合物，例如二羧酸、烷基乙二醇、聚烷基乙二醇和/或脂族羟基羧酸的均聚或共聚聚酯，二羧酸、烷基二胺、和/或脂族氨基羧酸的均聚或共聚聚酰胺，相应的聚酯-聚酰胺共聚物、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈和聚碳酸酯。生物可降解的聚合物可为直链、直链或交联的。
具体的例子是：聚乙醇酸、聚乳酸和聚-d，l-丙交酯/乙交酯。聚合物的其它例子是：水溶性聚合物，例如聚氧杂烯烃(聚氧杂乙烯、聚氧杂丙烯及其混合聚合物)、聚丙烯酰胺和羟基烷基化的聚丙烯酰胺、聚马来酸及其酯或酰胺、聚丙烯酸及其酯或酰胺、聚乙烯醇及其酯或酰胺、聚乙烯咪唑、聚乙烯吡咯酮、以及天然聚合物，如壳聚糖。

[0212] 可用于本文所述的组合物的赋形剂的非限制性例子包括：磷酸盐，如磷酸二钙。可用于本文所述的组合物的润滑剂的非限制性例子包括：天然或合成的油、酯、蜡或脂肪酸盐，例如硬脂酸镁。

[0213] 可用于本文所述的组合物的表面活性剂可为：阴离子型、阴离子型、两性或中性表面活性剂。可用于本文所述的表面活性剂型的非限制性例子包括：卵磷脂、磷脂、辛基硫酸盐、癸基硫酸盐、十二烷基硫酸盐、十四烷基硫酸盐、十六烷基硫酸盐和十八烷基硫酸盐、油酸钠、癸酸钠、1-酰基氨基乙烷-2-磺酸(例如1-辛酰基氨基乙烷-2-磺酸，1-癸酰基氨基乙烷-2-磺酸，1-十二烷酰基氨基乙烷-2-磺酸，1-十四烷酰基氨基乙烷-2-磺酸，1-十六烷酰基氨基乙烷-2-磺酸和1-十八烷酰基氨基乙烷-2-磺酸)、以及牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸、胆汁酸以及它们的盐，例如盐酸盐、脱氧胆酸和甘氨胆酸钠、癸酸钠或月桂酸钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、硫酸化蓖麻油和二辛基琥珀酰磺酸钠、cocamidopropylbetaine和十二烷基甜菜碱、脂肪醇、胆固醇、单-或二-硬脂酸甘 油酯、单-或二-油酸甘油酯和单-或二-棕榈酸甘油酯。

[0214] 可用于本文所述的甜味剂的非限制性例子包括：蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦。可用于本文所述的调味剂的非限制性例子包括：薄荷、冬青油或水果香料，例如樱桃或桔子香料。可用于本文所述的包衣材料的非限制性例子包括：明胶、蜡、虫胶、糖或生物可降解的聚合物。可用于本文所述的防腐剂的非限制性例子包括：尼泊金甲酯或丙酯、山梨酸、三氯叔丁醇、苯酚和柳硫汞。

[0215] 也可将本文所述的D型水合物配制为泡腾片或粉末，其可在水性环境中分解以提供饮用溶液。糖浆剂或酏剂中也可含有本文所述的多晶型物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、防腐剂(如尼泊金甲酯)、染料和调味剂。

[0216] 也可用本文所述的多晶型物来制备缓释制剂，从而在与胃肠道中的体液接触时获得活性剂的控释，并在血液血浆中提供基本稳定和有效水平的活性剂。出于此目的，可将所述结晶形式包埋在聚合物基质中，所述基质可包括生物可降解的聚合物、水溶性聚合物或两者的混合，以及任选地适合的表面活性剂。此处，包埋是指将微粒掺入聚合物基质中。也可通过已知的分散或乳化包衣技术将分散的微粒或乳化的微粒进行包囊化来获得控释制剂。

[0217] 虽然个体对各成分所需的量是变化的，但各成分有效量的最优范围的确定在本领域的技术范围内。BH4常用剂量包括约每天1-20mg/kg体重，其通常总计为约5(1mg/kg×5kg体重)-3000mg/天(30mg/kg×100kg体重)。这一剂量可以单剂量给予，或可将其分为多剂量。虽然预期为连续、每日给药，但当Phe水平这一症状降低到低于某一阈值水平时，可能应停止BH4治疗。当然，如果Phe水平再次上升时，可再次开始治疗。 [0218] 应理解本发明组合物的适宜剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、目前治疗的类别(如果有的话)、治疗的频度以及所需结果的性质(即，血浆Phe浓度所需降低的量)。给药的频度也取决于对Phe水平的药效学效果。假设单剂量的药效可持续24小时。然而，最为优选的剂量可根据个体患者定制，这可为本领域的技术人员所理解并确定而无需进行过多的试验。这通常涉及对标准剂量的调整，例如如果病人体重偏低则应减少剂量。

[0219] 如上所述，对每一治疗所需的总剂量可以多剂量或单剂量给予。可将BH4和蛋白质组合物单独给予或与其它针对该疾病或针对该疾病其它症状的疗法相结合。 [0220] 从本文的揭示中可明确得出：本申请在一个广泛的方面包括了联合治疗的 临床应用，该联合治疗包括：含有结晶化的BH4制剂的第一组合物，含有药用蛋白质制剂的第二组合物(例如，PHENEX等)。因此，该组合物应配制为适合的药物组合物，即在该联合治疗中可体内应用的形式。通常，这就要求制备基本上不含热原的组合物，且不含其它可能会对人类或动物有害的其它杂质。优选地，该结晶化的BH4组合物可以直接加入用于治疗PKU的已存在的蛋白质制剂。

[0221] 通常需要使用适当的盐或缓冲剂以使BH4适于摄入。本发明水性组合物包括有效量的溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中的BH4。可口服给予或通过注射给予这种组合物。

[0222] 短语“药学或药理学上可接受的”是指当给予动物或人时，分子实体或组合物不会产生不利、过敏或其它不良反应。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这些介质和试剂的用途在本领域是已知的。除非某一常用的介质或试剂与治疗组合物不相容，否则仍期望其在治疗性组合物中的使用。也可将补充性的活性成分加入该组合物。在示例性的实施方式中，药用蛋白质制剂可包括玉米糖浆剂固体、高油红花油、椰子油、豆油、L-亮氨酸、磷酸三钙、L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸乙酸酯、DATEM(一种乳化剂)、L-谷氨酸、L-缬氨酸、磷酸二钾、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-天冬酰胺一水合物、L-丝氨酸、柠檬酸钾、L-色氨酸、柠檬酸钠、氯化镁、L-组氨酸、L-蛋氨酸、抗坏血酸、碳酸钙、L-谷氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐、L-色氨酸、L-天冬氨酸、氯化胆碱、牛磺酸、间肌醇、硫酸亚铁、抗坏血酸棕榈酸盐、硫酸锌、L-卡尼汀、α-生育酚乙酸酯、氯化钠、烟酰胺、混合生育酚、泛酸钙、硫酸铜、盐酸氯化硫胺素、棕榈酸维生素A酯、硫酸镁、核黄素、维生素B6、叶酸、β-胡萝卜素、碘化钾、叶绿醌、生物素、硒酸钠、氯化铬、钼酸钠、维生素D3和维生素B12。补充物中的氨基酸、矿物质和维生素应以可提供各成分推荐日剂量的量提供。

[0223] 如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这些介质和试剂的用途在本领域是已知的。除非某一常用的介质或试剂与治疗组合物不相容，否则仍期望其在治疗性组合物中的使用。也可将补充性的活性成分加入该组合物。

[0224] 本发明的活性组合物包括本文所述的BH4标准药物制剂，也包括本领域技术人员已知的那些。蛋白质配方，例如，Phenex，也是本领域技术人员已知的。可通过用于食品添加的任何常规途径来给予根据本发明的这些组合物。优选口服给予蛋白质，BH4也是如此。 [0225] 可将活性化合物制备成用于作为适宜地与表面活性剂相混合(例如羟丙纤维素)的游离碱水溶液或药学上可接受的盐的水溶液的给药形式。还可在甘油、液态聚乙二醇、及其混合物和油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

[0226] 可将BH4组合物制备成适于注射用的药物剂型。此类组合物包括用于即时配制无菌注射用溶液或分散体的粉末、无菌水溶液或分散体。在所有情况下，该剂型必须为无菌且必须具备易于注射程度的流动性。在制造和储存条件下，它必须是稳定的，且必须能防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，其中含有，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、它们适宜的混合物和植物油。可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)、在分散体的情况下保持所需的粒径、以及使用表面活性剂来保持适宜的流动性。可使用各种抗菌剂、抗真菌剂(例如尼泊金类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、柳硫汞等)来防止微生物的作用。在很多情况下，优选包括等渗剂例如，糖类或氯化钠。可通过在注射用组合物中使用可延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长该组合物的吸收。

[0227] 通过以下方法来制备无菌注射用溶液：按照要求将适宜溶剂中的所需量的活性化合物与上述列出的各种其它成分混合，然后过滤除菌。通常，分散体的制备是通过：将各种灭菌的活性成分混合入无菌媒介物中，所述无菌媒介物包含碱性分散介质和上文所列出的所需的其它成分。在无菌粉末是用于制备无菌注射用溶液时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，通过该方法从预先过滤除菌的活性成份和其它所需成分的溶液中得到活性成份加上其它所需成分的粉末。

[0228] 优选用于本文所述的组合物中的BH4制成二盐酸盐，然而具有所需生物活性的BH4的其它盐的形式也包含在内，因此，也可使用BH4的其它盐形式。

[0229] 可与金属或胺(例如碱金属和碱土金属或有机胺类)形成药学上可接受的碱加成盐。可与药学上可接受的阳离子制备成化合物的药学上可接受的盐。适合的药学上可接受的阳离子是本领域技术人员已知的，包括：碱、碱土、铵和季 铵阳离子。也可为碳酸盐或碳酸氢盐。用作阳离子的金属的例子是：钠、钾、镁、铵、钙、铁等。适宜的胺的例子包括：异丙胺、三甲胺、组氨酸、N，N′-二苄基乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。

[0230] 药学上可接受的酸加成盐包括无机或有机酸盐。适宜酸盐的例子包括盐酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、硝酸盐、磷酸盐。其它适宜的药学上可接受的盐是本领域技术人员已知的，包括例如：醋酸、柠檬酸、草酸、酒石酸或杏仁酸、盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸；与有机羧酸、磺酸、磺基或膦酸或N取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、羟乙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡萄糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、双羟萘酸、烟酸或异烟酸；和与氨基酸，例如蛋白质合成中的天然的20种α-氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸，以及与苯乙酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、乙烷1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、N-环己基氨基磺酸(伴有环磺酸盐的生成)；或与其它酸性有机化合物，例如抗坏血酸形成的盐。

[0231] 特别地，优选BH4与无机酸或有机酸形成的盐。可选的BH4的盐形式的非限制性例子包括BH4的乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、富马酸和扁桃酸盐。

[0232] BH4剂量的频度取决于药剂的药代动力学参数和给药途径。本领域技术人员可根据给药途径和所需剂量确定最优的药物制剂。参见例如纳入本文作为参考的Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publ.Co，EastonPA 18042)第1435-1712页。这些制剂可影响所给药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率、体内清除速率。可根据给药途径，按体重、人体表面积或器官大小来计算合适的剂量。确定合适的治疗剂量所必需的进一步精确计算可由本领域技术人员常规地进行而无需过多的试验，尤其是在本文所揭示的剂量信息和测定、以及在动物或人临床试验中所得到的药代动力学数据的指明下。 [0233] 可通过使用已建立的测定Phe血液水平的测定法结合相应剂量响应数据来确定适当的剂量。最终的剂量方案可由主治医师考虑到影响药物作用的因素来确定，这些因素为例如，药物的特异(specific)活性、损伤的严重度和病人的应答性、年龄、病情、体重、性别和病人的饮食、任何感染的严重度、给药时间 和其它临床因素。随着研究的进行，将获得更多针对具体疾病和病情的关于适当剂量水平和治疗持续时间的信息。

[0234] 应理解本发明的药物组合物和治疗方法可用于人类药物和兽医学领域。因此待治疗的患者可为哺乳动物，优选为人或其它动物。出于兽医学目的，患者包括例如：畜养动物，包括牛、绵羊、猪、马和山羊；宠物，如狗和猫；引进种和/或动物园动物；实验动物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠；以及家禽，例如鸡、火鸡和鹅。

[0235] VII.实施例

[0236] 纳入以下实施例是为了对本发明优选的实施方式进行展示。本领域的技术人员应理解实施例中所揭示的技术是代表了本发明人所发现的、在本发明的实践中发挥优良功能的技术，并因此可被看作是在其实践中构成优选的模式。然而，在本发明揭示内容的指明下，本领域的技术人员应理解对所揭示的具体实施方式可进行许多改变，且仍能在不脱离本发明的精神和范围的同时，获得同样或相似的结果。

[0237] 实施例1

[0238] 6R-四氢生物喋呤的临床评估

[0239] 以下实施例提供了对本发明治疗方法中用于BH4临床评估的参数的指导。如本文通篇所述，BH4将被用于治疗HPA，包括HPA、轻度苯丙酮尿症(PKU)和典型性PKU。将进行可提供BH4日口服剂量评估的临床试验，该评估包括对安全性、药代动力学、和对代用品和限定的临床终末点的初始响应的评估。所述试验最少进行(但不必限于)6周以收集30个可评估病人的充足的安全性信息。

[0240] 试验的初始剂量可在约10-20mg/kg间变化。如果该剂量不能使病人过量的血浆苯丙氨酸(Phe)水平降低或不能产生明显的直接临床益处(判断为可提高口服Phe摄入但不提高血浆Phe水平)，应按需要提高该剂量，并保持另一最短时间段(但不必限于)6周以建立安全性并评估进一步的效力。也可包括较低的剂量，例如，5-10mg/kg的剂量。 [0241] 安全性测定可包括不良事件、过敏反应、完全临床化学小组(completeclinical chemistry panel)(肾和肝功能)、尿分析和分型CBC。此外，还可监测其 它参数，这些参数包括：血液Phe水平的降低水平、神经精神学和认知测试和总体评估。本实施例还包括确定循环中的药物药代动力学参数，以及血液中6R-BH4的总体分布和半衰期。预期这些测定将有助于将剂量与临床应答相关联。

[0242] 方法

[0243] 对具有升高的血浆Phe水平的病人进行以下测定或试验以确定基线：医学病史和物理测验、神经精神学和和认知测试、一套标准的临床实验室测试(CBC、Panel 20、CH50、UA)、尿蝶呤水平、二氢蝶啶还原酶(DHPR)水平、血清氨基酸的禁食血液(血浆)小组(panel)。将计划的10-约20mg/kg的BH4人用剂量分1-3次日剂量给予。将通过每周就诊对所述病人进行密切追踪。在完成治疗阶段后一周，对病人进行复诊以进行完全评估。如果需要按比例增大剂量，病人将遵循与上文列出相同的时间表。在试验中对安全性进行全程监测。

[0244] 参与的病人将随机接受BH4或安慰剂。在初始的2-4周后，将对所有研究参与者进行总时间为4-6周的限制Phe摄入的饮食控制。在完成第一个2-4周的饮食限制后，对所有研究参与者的随机性进行交叉，然后再经过2-4周。在每阶段结束时密切追踪Phe血液水平和其它生化参数。神经精神学结果的评估将包括以下的测定：持续的注意力；工作记忆力；以及进行复杂操作的能力。将对完成试验并从治疗中获益(显示血浆Phe水平的有益降低)的病人通过一个延长的治疗方案提供持续的BH4治疗，只要安全性和效力情况确保，或直至BLA认可。

[0245] 诊断和包含/排除标准

[0246] 病人可为男性或女性、年龄为12岁或以上、患有通过遗传测试和根据血液中升高的Phe水平确诊的HPA或轻度PKU。该研究将包括未精确进行饮食控制的HPA或PKU病人。有怀孕可能的女性病人在每次给药前必须进行阴性怀孕测试(尿β-hCG)，且必须建议其在整个研究中采用医学上可接受的避孕方法。具有以下情况的病人将从本研究中排除：病人有原发性BH4缺陷的迹象且之前接受了超过1周的多剂量BH4治疗；怀孕或哺乳中；在参与研究前的30天内接受过调查药物；或具有可显著降低研究顺应性的医学病症、严重间发性疾病、或其它情有可原的情况。

[0247] 剂量、途径和方案

[0248] 病人将每天接受5-10mg/kg剂量的BH4。如果Phe血液水平未降低合理的量且未观察到临床效果，则按需要提高剂量。仅在所有病人都经过了至少2周的治疗后进行剂量的增大。将以液体、粉末、片剂或胶囊的形式口服给予BH4日剂量。可将总日剂量作为单剂量或可分成2或3个日剂量给药。对病人进行临床监测并监测任何不良反应的发生。如果观察到任何不寻常的症状，将立即停止给予研究药物，并对是否继续进行研究做出决定。 [0249] 饮食干预

[0250] 在初始随机化和2周的治疗阶段之后，对所有研究参与者进行饮食咨询，并随后进行总时间为4-6周的补充有Phe特异性医疗食物的标准Phe限制性饮食。在家中进行饮食，并以日对数记录饮食摄入。将在各治疗组中比较对医疗食物和营养素的摄入以及推荐饮食摄入(RDI)百分比的分析。

[0251] BH4安全性

[0252] 如果在研究期间没有发生显著的急性或慢性药物反应，则确定BH4治疗是安全的。如果在临床测验、临床试验或其它适当的研究中没有观察到显著的异常，则确定长期给药是安全的。

[0253] 实施例2

[0254] 稳定结晶形式BH4的制备

[0255] 序列号为60/520,377的美国临时专利申请(名称为“(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的多晶型物”(Polymorphs of(6R)-L-erythro-tetrahydrobiopterin dihydrochloride)，提交于2003年11月17日，申请人为瑞士Schaffhausen的Rudolf MOSER和瑞士Dachsen的Viola GROEHN，转让的Merck-Eprova内部参考编号为216)和美国专利申请序列号_________(名称为“(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐多晶型物”(Polymorphs of(6R)-L-erythro-tetrahydrobiopterin dihydrochloride)，同时提交于2004年11月17日，申请人为瑞士Schaffhausen的Rudolf MOSER和瑞士Dachsen的Viola GROEHN，且转让的Merck-Eprova内部参考编号216/US CIP)(这两篇 Moser等的专利申请在本文中统称为“Moser申请”，并以其全文纳入本文作为参考)。在其说明书的实施例中描述了表征BH4多晶型物的X射线和拉曼光谱研究。该申请中的各BH4组合物均可用于本文所述的治疗方法中。以下描述提供了其它背景和一些示例性组合物的简要表征。 [0256] 形成(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐过程中的结果(参见Moser申请)表明该化合物可具有多晶型形式。对这一领域中持续的兴趣需要一种有效且可靠的方法来制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐的个别多晶型物并控制条件以提供优选为稳定且在制造和制剂过程中易于操作和处理的多晶型物。

[0257] 为了制备所述多晶型形式，可使用本领域已知的结晶技术。这些技术包括但不限于例如：悬液法、析出法、重结晶法、蒸发法、溶剂(如水)吸收法或溶剂化物分解法。可将稀释、饱和或过饱和的BH4溶液用于结晶，种入或不种入适合的成核剂。可采用最高为150℃的温度来形成药物溶液。可采用降至-100℃，优选-30℃的冷却温度来引发结晶和析出。可使用亚稳定的多晶型物或假多晶型物形式来制备用于制取更稳定形式的溶液或悬液和获得溶液中的更高浓度。

[0258] 如Moser申请中所述，可通过从极性溶剂混合物中结晶BH4来获得多晶型形式。Moser申请还描述了用于制备(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐多晶型形式的方法，该方法包括：任选地在升高的温度下，将较低能量(低于请求保护的(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐形式)形式的固体溶于极性溶剂混合物中，将晶种加入溶液中，冷却所得的悬液并分离形成的晶体。

[0259] 溶解可在室温下或最高为70℃的温度下进行，更优选该溶解在最高为50℃的温度下进行。可将原料加入最终溶剂混合物进行溶解，或可先将原料溶于水然后同时或依次加入其它溶剂。优选对BH4溶液进行搅拌。冷却是指将温度降低到-80℃，优选为-40到0℃。在以下实施方式中，为了起始BH4多晶型物的结晶，可在溶液中加入晶种。适合的晶种可包括另一批次的部分多晶型物，或是具有类似或相同形态的晶体。分离后，可用丙酮或四氢呋喃洗涤结晶物，并用用于干燥药物晶体的常规方法将其干燥。

[0260] Moser申请中描述的多晶型形式是一种非常稳定的药物结晶形式。该多晶型形式可很容易地滤出、干燥并制成药物制剂所需的粒径。这些出色的特性使得这一多晶型物在制药用途中尤为可取。将BH4×2HCl(多晶型形式)在自封袋(minigrip)中于40℃和75％相对湿度下保存8个月后，测定该BH4多晶型形式 的稳定性。在8个月中以HPLC检查不同时间间隔的质量。8个月后，多晶型物的质量和稳定性令人惊奇地类似于0时间时的稳定性：

[0261]0个月(开始时)1周后 1个月后 3个月后 8个月后
HPLC[％面积] 98.4 99.4 98.3 99.1 98.1

[0262] 因此，Moser申请提供了对含有(6R)-L-赤式-四氢生物喋呤二盐酸盐多晶型形式和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的描述。这种组合物可用于本文所述的治疗方法中。

[0263] 除了Moser申请外，本领域的技术人员还可参考美国专利6,596,721；6,441,168；和6271,374，它们描述了用于制造稳定的5-甲基四氢叶酸结晶盐的各种方法和组合物、用于制造稳定形式的6R四氢叶酸的方法和组合物、用于制造稳定形式的6S和6R四氢叶酸的方法和组合物。这些专利被各自以其全文纳入本文作为参考，以总体上教授制造结晶形式制剂的方法和用于表征这些试剂的技术。这些方法可用于生产用作本文所教授的治疗方法中的药物组合物的稳定形式的BH4。

[0264] 可根据目前揭示的内容来制造和执行本文所揭示和要求的所有组合物和/或方法，而无需过多的试验。虽然已通过优选的实施方式描述了本发明的组合物和方法，很显然对于本领域的技术人员而言，可在不脱离本发明观念、精神和范围情况下，对所述组合物和/或方法、以及本文所述的方法的步骤中或步骤的顺序中进行变化。更具体而言，很明显既是化学相关又是生理相关的某些试剂可用于取代本文所述的试剂，同时获得相同或类似的结果。对于本领域的技术人员而言显而易见的所有这种类似取代和修改被视为在如所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和观念之内。

[0265] 实施例3

[0266] 将四氢生物喋呤给予具有升高的血清Phe水平的人

[0267] 在总共20名病人中进行了开放标记(open label)、单和多剂量研究以证实四氢生物喋呤在具有升高的苯丙氨酸血液水平的人(＞600μmol/L)中的安全性和效力。本研究中的包含标准包括：(1)基线血液Phe水平为＞600μmol/L，(2)年龄至少为8岁。本研究中的排除标准包括：(1)怀孕或哺乳中，(2)同时还患有需 要药物处理或治疗的疾病或病症，(3)同时采用了已知会抑制叶酸盐合成的任何药物进行治疗，和(4)在30天内用任何调研药物治疗过。还鉴定了各病人在苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因中是否带有突变。研究对象经基线评定，包括在参与本研究前评估：参与本研究前的医学病史(包括对苯丙酮尿症(PKU)或高苯丙氨酸血症(HPA)相关的体征和症状的评估)、物理测验、生命特征(vital sign)、血清氨基酸(即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)血液水平以及常规的实验室测试(化学、血液学和尿分析)。

[0268] 进行试验的药物是(6R)-5，6，7，8-四氢生物喋呤，也称为2-氨基-6-(1，2-二羟丙基)-5，6，7，8-四氢-3H-蝶呤-4-酮四氢生物喋呤、或沙丙蝶呤(BH4或6R-BH4。该药物是获自Schircks Laboratories(瑞士)的10mg或50mg的口服片剂(生产批号11.212的(6R)-5，6，7，8-四氢-L-生物蝶呤二盐酸盐)。Schircks 6R-BH4二盐酸盐的半衰期约为3.5小时。

[0269] 在研究中，不允许施用已知用于抑制叶酸盐合成的药物例如复方新诺明、甲氨蝶呤或5-FU。在开始6R-BH4给药前，需要经过对已知可抑制叶酸盐合成的任何药物的7天的清洗期。在参与研究中或参与研究前的30天内不允许使用调研药物。

[0270] 在基线测试完成后的最多4周内，对适宜的患者开始进行第一阶段的研究。通过口服给予10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg单上升剂量的6R-BH4，在各剂量间至少间隔7天的清洗期，在每一剂量后对患者进行24小时监测。在给予各6R-BH4剂量之前和24小时之后，对患者进行安全性评估和血液氨基酸(即，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)水平测定。在每一剂量后的30分钟和1小时时测定血压。安全性评估包括物理测验、生命特征、与PKU或HPA相关的体征和症状的系列评估、记录不良事件并监测实验室参数(化学、血液学和尿分析)的变化。让患者继续他们的常规饮食而不进行任何改变，并在研究中全程记录日食物和饮料摄入。

[0271] 在研究第一阶段完成后，患者进入研究的第二阶段，在该阶段中他们将每天接受10mg/kg的6R-BH4口服剂型，共服用7天。在至少7天的清洗期后，各患者每天接受20mg/kg的6R-BH4，共服用7天。在第二阶段的研究中，在两种剂量水平的给药前、第一剂后的24和72小时、以及给药的第7天对患者进行监测。监测包括如上所述的安全性评估，测定血清血液氨基酸(即，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)水平以及评估苯丙氨酸和酪氨酸口服摄入。
让患者继续他 们的常规饮食而不进行任何改变，并在研究中全程记录日食物和饮料摄入。 [0272] 在单剂量6R-BH4(10mg/kg)之后，血液Phe从基线下降了10％±0.26％。20mg/kg和40mg/kg的单剂量6R-BH4分别显示出17％±0.28％和27％±0.25％的下降。血液Phe水平的下降看来是剂量依赖型的。

[0273] 图16所示为20名病人中的14名对治疗应答的病人在每日给药10和20mg/kg6R-BH47天后的平均血液苯丙氨酸水平。出于本研究的目的，血液Phe水平下降30％被认为是“应答的”，尽管显示出较少降低的病人也是可获益于BH4治疗的。为期7天的试验显示在70％(14/20)服用20mg/kg的病人中血液Phe浓度的持续下降。在那14名病人中，有
10名(71％)对10mg/kg/天有效应答。在某些但不是全部病人中观察到血液酪氨酸的上升；某些病人从基线酪氨酸水平上升了＞80％。11名成人(图17)和9名儿童(图19)显示出个体血液Phe对10mg/kg多剂量BH4的应答。11名成人(图18)和9名儿童(图20)显示出个体血液Phe对20mg/kg多剂量BH4的应答。

[0274] 因此，单剂量负载试验不足以鉴别出血液Phe水平降低30％或更多的对BH4治疗应答的病人。7天负载试验成功地鉴别出了高百分比的应答病人。使用20mg/kg 6R-BH4的7天负载试验鉴别出了70％的对20mg/kg BH4应答的PKU病人。在这14名应答者中，71％使用10mg/kg较低剂量6R-BH4的病人也在血液Phe水平中显示出了30％或更大的降低。 [0275] 将本文全文中引用的可提供对本文所阐明内容的示例性方法或其它细节补充的参考文献，全部纳入本文作为参考。