小干扰RNA的细胞转染制剂、相关组合物以及制备和使用方法

摘要

含有小干扰核糖核酸(siRNA)和将siRNA和其它多核苷酸递送给细胞特别有用的某些脂质偶联的聚酰胺化合物的递送运载体的组合物。以及该组合物的制备和使用方法。

权利要求

1.一种组合物，所述组合物包含：

在药学上可接受的递送运载体中的小干扰核糖核酸(siRNA)，所述递送运载体包含脂质-阳离子类肽偶联物及其位置异构体：所述脂质-阳离子类肽偶联物选自以下化合物：类脂1，或L1 DMPE(NaeNmpeNmpe)3类脂2，或L2 DMPE(NaeNiaNia)3类脂3，或L3 NtdNhd(NaeNmpeNmpe)3类脂4，或L4 NddNol(NaeNmpeNmpe)3类胆固醇1，或C1 Chol-β-ala-(NaeNmpeNmpe)3类胆固醇3，或C3 Chol-β-ala-(NaeNiaNia)3或它们的组合。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脂质-阳离子类肽偶联物是类脂和类胆固醇的组合。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述类脂∶类胆固醇比率约为5∶1至

1∶5。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述类脂∶类胆固醇比率约为1∶1至

1∶3。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述类脂是L1，所述类胆固醇是C1。

6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述类脂∶类胆固醇比率约为1∶3。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述运载体∶siRNA摩尔比约为

3.75nmol∶100pmol。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述siRNA是含有两个核苷酸3’突出端’和全部磷酸二酯键连接的21-23聚体RNA双链体。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述siRNA包含SEQ ID NO：1代表的序列，含有两个核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯键连接。

10.权利要求1所述的组合物的用途，用于制备抑制对象中靶基因表达的药物。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述递送运载体是类脂和类胆固醇的组合。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述类脂∶类胆固醇比率约为5∶1至

1∶5。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述类脂∶类胆固醇比率约为1∶1至

1∶3。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述类脂是L1，所述类胆固醇是C1。

15.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述siRNA包含SEQ ID NO：1代表的序列，含有两个核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯键连接。

16.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述对象是哺乳动物细胞或细胞系。

17.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述对象是人。

19.一种组合物，其包含：

至少两种脂质-阳离子类肽偶联物及其位置异构体的混合物，所述所述脂质-阳离子类肽偶联物选自以下化合物：类脂1，或L1 DMPE(NaeNmpeNmpe)3类脂2，或L2 DMPE(NaeNiaNia)3类脂3，或L3 NtdNhd(NaeNmpeNmpe)3类脂4，或L4 NddNol(NaeNmpeNmpe)3类胆固醇1，或C1 Chol-β-ala-(NaeNmpeNmpe)3类胆固醇3，或C3 Chol-β-ala-(NaeNiaNia)3或它们的组合，

其中，第一种化合物是类脂，第二种化合物是类胆固醇。

20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述组合物中第一种化合物与第二种化合物之比约为5∶1至1∶5。

21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述组合物中第一种化合物与第二种化合物之比约为1∶1至1∶3。

22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述组合物中第一种化合物与第二种化合物之比约为1∶1。

23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述组合物中第一种化合物与第二种化合物之比约为1∶3。

24.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述组合物由L1和C1组成。

说明书

小干扰RNA的细胞转染制剂、相关组合物以及制备和使用

方法

发明领域

[0001] 本发明涉及含有小干扰核糖核酸(siRNA)和脂质-偶联的聚酰胺化合物的组合物，其制备方法，以及用于将siRNA递送给细胞的方法。本发明也涉及适合用于将多核苷酸，包括siRNA递送给细胞的新型脂质-偶联的聚酰胺化合物。

[0002] 相关申请的交叉参考

[0003] 本申请要求2003年12月19日提交的美国临时申请号60/530,953的优先权，将其全文纳入本文作为参考。

[0004] 发明背景

[0005] RNA干扰指细胞中双链RNA的存在消除了序列相同的基因表达，而不干扰其它无关基因表达的现象。在植物中已有一段时间注意到这种也称为“转录后基因沉默”或“RNA沉默”的现象，但最近才在动物中发现。Fire等，Nature，391，806(1998)。这种功能的发现提示，这可能是停止特定蛋白产生的有效研究工具并可通过此机制进行基因特异性治疗。

[0006] 最近阐明了RNA干扰机制的细节。细胞中存在的长dsRNA能刺激称为切酶的核糖核酸酶III的活性。切酶参与将dsRNA加工成短片段dsRNA，称为小干扰RNA(siRNA)
(Berstein等，Nature，409，363(2001))。切酶活性所产生的小干扰RNA的长度一般约为
21-23个核苷酸。RNAi反应也是含有siRNA的核酸内切酶复合物，通常称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的特征。该RISC复合物介导含有siRNA双链体的反义链的互补序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体反义链互补的区域的中部。Elbashir等，Genes Dev.，15，188(2001)。

[0007] 在哺乳动物细胞中利用该现象的一种可能阻碍是这些细胞中存在的长dsRNA也刺激干扰素反应，导致mRNA被核糖核酸酶非特异性切割。然而，已证明，化学合成的21聚体小干扰RNA(siRNA)在几株人细胞系中能有效抑制基因表达而不引起干扰素反应。Elbashir等，Nature，411，494(2001)。具体说，发现含有两个TT核苷酸3’-突出端的21个核苷酸双链体的合成性siRNA活性最高。Elbashir等，EMBO J.，20，6877(2001)。

[0008] SiRNA的高特异性、对核糖核酸酶的抗性、无免疫原性和强效特征说明，它在非常可能在研究和治疗应用中作为细胞转染制剂。已有各种方案可将核酸组合物递送给细胞。然而，将siRNA转染入细胞则遇到了技术困难。病毒载体提供相对有效的递送，但一些情况下存在安全性问题，因为给予的患者存在发生免疫并发症或有害增殖的风险。腺病毒载体显示出某些优点，它们不会整合入细胞基因组中而可转导入静止细胞中。然而，所有这些载体必须通过耗时的重组DNA技术制备。也可通过化学转染制剂将寡核苷酸递送给细胞，近年来此主题已作了许多研究。这些制剂包括聚阳离子分子如聚赖氨酸，和阳离子脂质。广泛采用的脂质体组合物Lipofectin (Felgner等，PNAS84：7413，含有阳离子脂质DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)和中性磷脂DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。其它方法，如磷酸钙介导的转染可按照报道的方法将寡核苷酸递送给细胞。
然而，需要易于使用和可应用于许多细胞类型的有效、无毒的siRNA转染制剂。

[0009] 发明概述

[0010] 为了实现上述目的，本发明提供含有小干扰核糖核酸(siRNA)和将多核苷酸包括siRNA递送给细胞特别有用的某些脂质-偶联的聚酰胺化合物的递送运载体的组合物。

[0011] 在一个方面，本发明提供含有小干扰核糖核酸(siRNA)和具有以下通式的脂质-偶联的聚酰胺化合物的组合物：

[0012] (I)Ra-[(NR1-W-CO)n]m-Rc

[0013] 通式中n是1至约48的整数，m是约2至约48的整数，

[0014] 通式中各单体单元-(NR1-W-CO)-的R1和Ra独立地选自：氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基；-SH；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0015] 通式中至少一个单体单元的R1不是氢原子，

[0016] 通式中Rc选自氢原子；羟基；氨基；肼基；磺酰基；-SH；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0017] 通式中当R1、Ra或Rc是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基时，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子，

[0018] 通式中各单体单元的W独立地选自在含有碳且在任选含有氮、氧、硫和磷的主链中具有1至约50个原子和任选的一个或多个双键或三键的任选取代的、支链或直链二价部分，所述W的任选取代基可以是任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0019] 通式中所述脂质部分是疏水性或两性部分，选自：

[0020] (i)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约14至约50个碳原子的任选取代的芳基或芳烷基部分，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和[0021] (ii)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约10至约50个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族部分，其中所述脂族部分任选地具有一个或多个双键或三键，和[0022] 通式中一个单体单元的Ra、Rc、W中至少一个和一个单体单元的R1包含脂质部分。

[0023] 在一个具体实施方式中，本发明提供在药学上可接受的运载体中包括siRNA的组合物。该组合物可用于体外或体内将siRNA递送给细胞，以抑制感兴趣基因的表达。该运载体包括一种或多种下式的脂质-阳离子类肽偶联物：

[0024] (VI)L-X-[N(CH2CHaNH2)CH2(C ＝ O)-N(CH2CH2R)CH2(C ＝ O)N(CH2CH2R)CH2(C ＝O)]3-NH2和位置异构体

[0025] 式中

[0026] L选自包含至少一个长度约8-24个碳原子的脂族烷基或烯基链的非类固醇脂质部分，和固醇部分；

[0027] 基团R各自独立地选自烷基、氨基烷基和芳烷基，

[0028] X选自直接键连接、寡肽、长度为2至约30个键的基本线性的烷基链，和长度为2至约30个键由烷基键和选自酯键、酰胺键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、二硫键、肽键和醚键的一个或多个键连接组成的基本线性的链。

[0029] 当L是非固醇脂质部分(即脂质部分不是或不含固醇基团如磷脂基团(即ROOCCH2CH(COOR)CH2OP(O)2O-)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类脂”。当L是固醇部分(即是或含有固醇基团如胆固醇基团的脂质部分)时，该脂质-阳离子聚酰
胺偶联物在本文中称为“类胆固醇”。本发明组合物中的脂质-阳离子类肽偶联物可以是类脂、类胆固醇或(在一个重要实施方式中)其组合。

[0030] 在具体实施方式中，R是异丙基或4-甲氧基苯基。单个类脂或类胆固醇可包括不同基团R，或者它们在分子中可以相同。

[0031] 本发明组合物可导致将生物活性siRNA有效递送给哺乳动物细胞，有效敲除靶基因的mRNA。

[0032] 在另一方面，提供了抑制对象中靶基因表达的方法，该方法包括给予对象上述组合物，其中siRNA双链体的一条链含有靶基因衍生的mRNA中的核苷酸序列。在一个具体实施方式中，siRNA双链体的一条链包括本文公开的SEQ ID NO：1代表的序列，靶基因/mRNA是Akt1。

[0033] 在另一方面，本发明提供由至少一种类脂和一种类胆固醇的混合物组成的多核苷酸递送运载体。这种组合了类脂/类胆固醇的递送运载体适合用于将各种多核苷酸如质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA以含有这些多核苷酸和组合的类脂/类胆固醇的递送运载体的组合物(方式)递送给细胞。

[0034] 考虑能提供制造本文所述化合物和组合物的方法都属于本发明范围内，用该方法制备的组合物可作为本发明方法所用的药物。

[0035] 当结合附图阅读以下本发明详述时，将更全面地明白本发明的这些和其它目的和特征。

[0036] 附图简要说明

[0037] 图1显示在本发明组合物和方法中用作siRNA运载体的脂质-阳离子类肽偶联物(“类脂”和“类胆固醇”)的选择。

[0038] 图2是显示采用本发明的转染组合物将针对Akt1 mRNA的siRNA转染入乳腺癌细胞中时Akt1表达缺失的图。

[0039] 图3是显示采用本发明针对萤火虫荧光素酶的siRNA和几种不同的递送运载体制备的转染混合物处理的细胞中荧光素酶活性的图。

[0040] 具体实施方式的描述

[0041] 现在参照几个实施方式描述本发明的材料和相关的技术和装置。在文本结构中说明所述实施方式的重要特性和特征。虽然将结合这些实施方式描述本发明，但应理解本发明不受这些实施方式的限制。相反，本发明覆盖了它们的替代方式、修改和等价形式，包括在本文所附权利要求书所限定的本发明构思和范围内。在以下描述中，列出了许多特定细节，以提供对本发明的完整理解。可在没有这些特定细节的一些或全部情况下实施本发明。在其它情况下，未详述熟知的工艺操作，以避免不必要地混淆本发明的内容。

[0042] 内容介绍

[0043] 本发明提供含有小干扰核糖核酸(siRNA)和将siRNA递送给细胞特别有用的脂质偶联的聚酰胺递送运载体的组合物。在另一方面，本发明提供了由至少一种类脂和一种类胆固醇的混合物组成的多核苷酸递送运载体。该递送运载体适合用于将各种多核苷酸，如质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA递送给细胞。

[0044] 在一个方面，本发明提供含有小干扰核糖核酸(siRNA)和具有以下通式的脂质-偶联的聚酰胺化合物的组合物：

[0045] (I)Ra-[(NR1-W-CO)n]m-Rc

[0046] 通式中n是1至约48的整数，m是约2至约48的整数，

[0047] 通式中各单体单元-(NR1-W-CO)-的R1和Ra独立地选自：氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基；-SH；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0048] 通式中至少一个单体单元的R1不是氢原子，

[0049] 通式中Rc选自氢原子；羟基；氨基；肼基；磺酰基；-SH；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0050] 通式中当R1、Ra或Rc是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基时，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子，

[0051] 通式中各单体单元的W独立地选自含有碳且在任选含有氮、氧、硫和磷的主链中具有1至约50个原子和任选的一个或多个双键或三键的任选取代的、支链或直链二价部分，其中所述W的任选取代基可以是任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0052] 通式中所述脂质部分是疏水性或两性部分，选自：

[0053] (i)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约14至约50个碳原子的任选取代的芳基或芳烷基部分，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和[0054] (ii)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约10至约50个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族部分，其中所述脂族部分任选地具有一个或多个双键或三键，和[0055] 通式中一个单体单元的Ra、Rc、W中至少一个和一个单体单元的R1包含脂质部分。

[0056] 在一个具体实施方式中，本发明提供在药学上可接受的运载体中包含siRNA的组合物。该组合物可用于体外或体内将siRNA递送给细胞，以抑制感兴趣基因的表达。该运载体包括一种或多种下式的脂质-阳离子类肽偶联物：

[0057] (VI)L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C ＝ O)-N(CH2CH2R)CH2(C ＝ O)N(CH2CH2R)CH2(C ＝O)]3-NH2和位置异构体

[0058] 式中

[0059] L选自包含至少一个长度约8-24个碳原子的脂族烷基或烯基链的非类固醇脂质部分，和一个固醇部分；

[0060] 基团R各自独立地选自烷基、氨基烷基和芳烷基，

[0061] X选自直接键连接、寡肽、长度为2至约30个键的基本线性的烷基链，和长度为2至约30个键的由烷基键和选自酯键、酰胺键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、二硫键、肽键和醚键的一个或多个键连接组成的基本线性的链。

[0062] 当L是非固醇脂质部分(即脂质部分不是或不含固醇基团如磷脂基团(即ROOCCH2CH(COOR)CH2OP(O)2O-)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类脂”。当L是固醇部分(即是或含有固醇基团如胆固醇基团的脂质部分)时，该脂质-阳离子聚酰
胺偶联物在本文中称为“类胆固醇”。本发明组合物中的脂质-阳离子类肽偶联物可以是类脂、类胆固醇或(在一个重要实施方式中)其组合。

[0063] 在具体实施方式中，R是异丙基或4-甲氧基苯基。一个类脂或类胆固醇可包括不同基团R，或者它们在分子中可以相同。

[0064] 本发明组合物可导致将生物活性siRNA有效递送给哺乳动物细胞，而有效敲除靶基因的mRNA。

[0065] 在另一方面，提供了抑制对象中靶基因表达的方法，该方法包括给予对象上述组合物，其中siRNA双链体的一条链含有靶基因衍生的mRNA中的核苷酸序列。在另一具体实施方式中，提供了制造上述用于在对象中抑制靶基因表达的组合物的方法。在一具体实施方式中，siRNA双链体的一条链包含本文公开的SEQ ID NO：1代表的具有两个核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯键连接的序列，所述靶基因/mRNA是Akt1。

[0066] 在另一方面，本发明提供由至少一种类脂和一种类胆固醇的混合物组成的多核苷酸递送运载体。这种组合了类脂/类胆固醇的递送运载体适合用于将各种多核苷酸如质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA以含有这些多核苷酸和组合的类脂/类胆固醇的递送运载体的组合物(方式)递送给细胞。

[0067] 本发明组合物和递送运载体可体外使用，例如与研究，包括药物发现、开发和测试活动结合使用，或体内用于动物，包括哺乳动物(如人)对象的治疗应用(如作为治疗疾病的药物组分中的药物)。在这些体内应用中，采用本发明的药学上可接受的运载体。

[0068] 定义

[0069] 除非另有说明，本文所用术语应具有本领域技术人员所理解的通常涵义。为了有助于理解本发明，本文中使用许多定义的术语来指代本发明的具体元素。当这样使用时，其涵义如下：

[0070] 本文所用术语“脂质偶联的聚酰胺”指具有低聚酰胺部分和一个或多个脂质部分的化合物。脂质-偶联的聚酰胺化合物中的聚酰胺组分可能是，例如类肽，在这种情况下脂质偶联的聚酰胺可称为“脂质偶联的类肽”，如果具体是阳离子类肽，在这种情况下脂质偶联的聚酰胺可称为“脂质-阳离子类肽偶联物”。

[0071] 本文所用术语“脂质”指疏水性或两性部分。脂质部分可直接偶联于低聚酰胺部分，或任选地通过接头部分间接偶联于低聚酰胺部分。脂质偶联的聚酰胺的脂质部分可以是或含有非固醇或固醇的部分。

[0072] 本文所用术语“类脂”指下式的脂质偶联的类肽：

[0073] (VI)L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C ＝ O)-N(CH2CH2R)CH2(C ＝ O)N(CH2CH2R)CH2(C ＝O)]3-NH2

[0074] 其中脂质部分L是非固醇脂质部分。无论用于本文的说明书和权利要求书，该式均覆盖其位置异构体或类肽部分，位置异构体是该式类肽部分的任何重复的三倍基序。

[0075] 本文所用术语“类胆固醇”指下式的脂质偶联的类肽：

[0076] L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C＝O)-N(CH2CH2R)CH2(C＝O)N(CH2CH2R)CH2(C＝O)]3-NH2[0077] 其中脂质部分L是固醇脂质部分。无论用于本文的说明书或权利要求书，该式均覆盖其位置异构体和类肽部分，位置异构体是该式类肽部分的任何重复的三倍基序。

[0078] 术语“低聚”和“低聚酰胺”在本文中可互换使用，指通过酰胺键连接在一起的两个或多个单体单元，

[0079] 即-[(NR1-W-CO)n]m-。

[0080] 本文所用术语“单体”或“单体”单元指下式定义的单元：

[0081] -(NR1-W-CO)-。

[0082] 本文所用术语“低聚反应物”、“低聚反应物”、“低聚酰胺反应物”和“脂质反应物”指合成的本发明脂质偶联的聚酰胺化合物产生的反应性物质。

[0083] 本文所用术语“递送运载体”指脂质-偶联的聚酰胺化合物，如本文进一步描述，它与多核苷酸形成复合物而有助于将多核苷酸通过细胞膜递送至靶位点。本发明的递送运载体是“药学上可接受的”，本文所用“药学上可接受的”指该递送运载体与生物物质相容，以用于药物剂型和其它体内或体外应用，在这些应用中它们与生物物质如活细胞相接触。

[0084] 本文所用术语“复合物”指两种或多种化合物或结构之间通过相互作用所形成的结构。这些相互作用可通过化学相互作用，例如共价键、离子键或次级键(如氢键)等，或通过物理相互作用，例如包裹、截留等。

[0085] 根据本发明的一个方面，脂质-偶联的聚酰胺化合物可通过与位于中间的易受内源性蛋白水解酶降解的氨基酸序列的共价键与siRNA形成复合物。因此，例如，该复合物接触降解酶会导致切割，然后从该复合物中释放出siRNA。本发明的脂质-偶联的聚酰胺化合物也可通过离子或次级键，或者通过包裹或截留与siRNA形成复合物。

[0086] 术语“多核苷酸”和“多聚核酸”在本文中可互换使用，指DNA、RNA及其类似物、肽-核酸，以及具有不含磷酸的核苷酸的DNA或RNA。siRNA特别用于本发明。用于实施本发明一些方面的其它多核苷酸可以是单链、双链或嵌合单链或嵌合双链分子。具体实施例包括质粒DNA和反义寡核苷酸。

[0087] 本文所用“取代”指有机官能团上的一个或多个悬垂的氢被取代基，优选被选自卤素、低级烷基或低级烷氧基、卤代甲基或卤代乙基所取代。

[0088] 将本文所提及的所有出版物纳入本文作为参考，用于公开和描述本发明特征的目的，这就是引用这些出版物的目的。

[0089] 组合物

[0090] 在一个方面，本发明提供了含有小干扰核糖核酸(siRNA)和基于脂质偶联的聚酰胺的递送运载体的组合物。这些组合物在将siRNA递送给细胞时特别有用。

[0091] 1.SiRNA

[0092] 本发明组合物中掺入了有效地特异性抑制感兴趣基因的表达而不会诱导对正常细胞功能有害的任何其它活性，如干扰素反应的siRNA。有效siRNA通常(但不一定)是化学合成的。在具体实施方式中，可采用含有具有两个核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯连接的序列CAUAGUGAGGUUGCAUCUGGUG(SEQ ID No：1)、针对Akt1信使RNA的siRNA。在一种情况下，这两个核苷酸3’-突出端是TT(DNA)核苷酸。在另一种情况下，这两个核苷酸
3’-突出端是O-甲基UU(RNA)核苷酸。

[0093] 当转染入细胞时，如以下实施例1和3所述，这些siRNA显示能非常有效地降解内源性Akt1 mRNA，导致相应的Akt1基因的活性消失。应理解，本文所述Akt1 siRNA序列只是可与本发明组合物中的脂质-偶联的聚酰胺化合物递送运载体联用的许多其它可能的siRNA序列的代表。

[0094] 本领域技术人员从本文所提供的内容将会明白，其它siRNA序列可以相同或相似的易于确定的方式应用而取得对相应mRNA和基因的相同效果。

[0095] 2.脂质-偶联的聚酰胺化合物

[0096] 本发明提供掺入了以脂质-偶联的聚酰胺为基础的化合物的递送运载体的组合物。用于或用作这些递送运载体的合适的脂质偶联的聚酰胺偶联物见根据美国专利序列号60/023,867、60/054,743和09/132,808的共同拥有的PCT公开WO 98/06437和WO
99/08711(Zuckermann等)；以及根据美国专利序列号60/151,246的共同拥有的PCT公开WO 01/16306和美国专利序列号09/648,254(Innis等)中所述；以全文纳入本文作为参考用于所有目的。这些脂质偶联的聚酰胺偶联物具有以下通式：

[0097] (I)Ra-[(NR1-W-CO)n]m-Rc

[0098] 通式中n是1至约48的整数，m是约2至约48的整数，

[0099] 通式中各单体单元-(NR1-W-CO)-的R1和Ra独立地选自：氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基；-SH；含任选有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0100] 通式中至少一个单体单元的R1不是氢原子，

[0101] 通式中Rc选自：氢原子；羟基；氨基；肼基；磺酰基；-SH；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，式中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0102] 通式中当R1、Ra或Rc是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基时，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子，

[0103] 通式中各单体单元的W独立地选自含有碳且在任选含有氮、氧、硫和磷的主链中具有1至约50个原子和任选的一个或多个双键或三键的任选取代的、支链或直链二价部分，其中所述W的任选取代基可以是任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0104] 通式中所述脂质部分是疏水性或两性部分，选自：

[0105] (i)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约14至约50个碳原子的任选取代的芳基或芳烷基部分，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和[0106] (ii)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约10至约50个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族部分，其中所述脂族部分任选地具有一个或多个双键或三键，和[0107] 通式中一个单体单元的Ra、Rc、W中至少-个和一个单体单元的R1包含脂质部分。

[0108] 本发明的脂质偶联的聚酰胺可以是随机聚合物，其中R1和W各自从一种单体随机地变化为另一种单体(即n是1，m是约2至约48的整数)。或者，该脂质偶联的聚酰胺可以是具有m个n聚体(即n大于1，m是约2至约48的整数)的聚合物，或是重复(即各n
聚体相同)序列或随机变体(即各n聚体单体组成的随机单体组合物)。

[0109] 整数n一般不大于约40，更常不大于约20，甚至更常不大于约6。n优选约3。整数m一般不大于约40更常不大于约25。通常，整数m不大于约15，一般不大于约12，甚至更常不大于约8。

[0110] 当R1、Ra和Rc是脂族时，它们的主链结构中一般含有至少2个碳原子，主链结构中更常含有至少约3个碳原子。芳基和芳烷基R1、Ra和Rc可以是线性或环状。主链结构中碳原子少于5个的芳基和芳烷基R1、Ra和Rc在主链结构中也可含有一个或多个杂原子，如氮和/或氧。芳基和芳烷基R1、Ra和Rc的主链结构中一般具有至少约5个碳原子。

[0111] Ra一般是-OH、-H、-SH、-COOH、磺酰基或任选地偶联有接头部分的脂质部分。Rc一般是-OH、-H、-SH、-NH2、磺酰基、肼或任选地偶联有接头部分的脂质部分。Ra或Rc优选为任选地偶联有接头部分的脂质部分。

[0112] R1在生理相关pH下可以是阳离子、阴离子或中性的侧链。生理pH一般为至少约5.5，一般至少约6.0。生理pH更常为至少约6.5。通常，生理pH小于约8.5，一般小于约
8.0。生理pH更常小于约7.5。

[0113] 合适的阳离子侧链包括例如：氨基烷基(如氨基乙基、氨基丙基、氨基丁基等)及其衍生物；(S)-α-甲基乙烯二氨基及其衍生物；三甲基氨基乙基及其衍生物；胍基烷基(如胍基乙基、胍基丙基、胍基丁基、胍基戊基等)及其衍生物；氨基苄基及其衍生物；吡啶及其衍生物；以及本领域普通技术人员已知的其它类似的阳离子部分。

[0114] 合适的中性侧链包括例如：(S)或(R)-α-甲基苄基及其衍生物；苄基及其衍生物；苯乙基及其衍生物；萘甲基及其衍生物；(S)或(R)-α-甲基萘基及其衍生物；N-丙基吡咯烷酮及其衍生物；环己基甲基及其衍生物；糠基及其衍生物；3，4，5-三甲氧基苄基及其衍生物；甲氧基乙基及其衍生物；对甲氧基苯乙基及其衍生物；异戊基(“IsoA”)及其衍生物；以及本领域普通技术人员已知的其它类似的中性部分。

[0115] 合适的阴离子侧链包括例如：羧甲基、羧乙基等及其衍生物；苯甲酸及其衍生物；磷酸酯及其衍生物；硫酸酯及其衍生物；以及本领域普通技术人员已知的其它类似的阴离子部分。

[0116] 任选地，R1可以是天然产生的或非天然产生氨基酸上发现的部分，或者R1可以是任选地连接有接头部分的脂质部分。本文所用术语“天然产生的氨基酸”指Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr)。术语“非天然产生的氨基酸”指一般在大自然中未发现的氨基酸，包括例如：天然产生的氨基酸的D-异构体。

[0117] R1一般在至少两个单体单元中不是氢，更通常，如果n×m是3或更大，R1在至少三个单体单元中不是氢。一般不到75％的单体单元的R1是氢。更通常，不到50％的单体单元的R1是氢。甚至更通常，不到25％的单体单元的R1是氢。甚至更通常，任何一种单体单元的R1都不是氢。

[0118] W一般是-CH2CH2-、-CH2-C6H4-C(＝O)O-(即甲苯酸)、-CH2CH2-O-、-CH2-CH＝CH-或[0119] (II)-CR2R3-

[0120] 通式中各单体单元的R2和R3独立地选自：氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基；-SH；在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，

[0121] 其中当R2或R3是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子。

[0122] 当R2和R3是脂族时，它们的主链结构中一般含有至少2个碳原子，它们的主链结构中更常含有至少约3个碳原子。芳基和芳烷基R2和R3基团可以是线性或环状。芳基和芳烷基R2和R3的主链结构中的碳原子少于5个，其主链结构中也可含有一个或多个杂原子，如氮和/或氧。芳基和芳烷基R2和R3的主链结构中一般至少含有约5个碳原子。

[0123] R2和R3一般是天然产生的和非天然产生的氨基酸上发现的部分。通常，至少R2和R3之一是氢原子。最通常，在所有单体单元中R2和R3二者都是氢，故化合物(I)是脂质偶联的、N-取代的聚甘氨酸化合物。

[0124] 在一个或多个单体中脂质部分可位于Ra、Rc、R1，或在一个或多个单体中位于W中的取代位置。脂质部分可直接连接于单体单元，或可通过接头部分间接连接于单体单元。

[0125] 本文所用术语“接头”指一种部分，其作用为将低聚酰胺和脂质部分偶联在一起，使脂质和低聚酰胺部分二者之间的分子距离大于直接互相偶联时的距离。接头部分可以相对较小，主链中含有1至约20个原子，或者是聚合体。小接头部分是任选取代的，一般其主链中含有1至约20个原子(如碳、氮、氧、硫、磷等)。小接头部分的主链中一般含有不到约18个原子，更通常，其主链中含有不到约15个原子。通常，小接头部分的主链中含有不到约10个原子，其主链中任选地含有不到约5个原子。

[0126] 接头部分可衍生自能够与低聚反应物和脂质反应物反应的双功能分子如6-氨基己酸，2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸等)。接头部分也可衍生自一些基因，例如能促进脂质部分与低聚物部分偶联的在化学合成期间采用的基团如酰基和取代的酰基，磺酰基和取代的磺酰基等反应活性部分。

[0127] 聚合接头部分是任选取代的(如羟基-、羧基-、磷-、氨基-等)、基本线性的聚合物，它的主链含有碳，和任选地含有氮、氧、硫、磷等。聚合接头部分的平均分子量约为300道尔顿-15,000道尔顿，一般小于约10,000道尔顿，更常小于约5,000道尔顿，甚至更常小于约3000道尔顿，任选地小于约1000道尔顿。合适的聚合接头部分包括例如：聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。

[0128] 脂质部分是中性(即没有电荷或净电荷为零)或带电的、天然或合成产生的疏水部分或脂族部分。本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物的脂质部分一般为两性。

[0129] 合适的脂质部分包括：(1)在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有约14-50个碳原子的任选芳基或芳烷基部分，其中芳烷基部分任选地具有一个或多个双键或三键；(2)在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有约10-50个碳原子的任选支链或直链脂族部分，并任选地具有一个或多个双键或三键。

[0130] 芳基和芳烷基脂质部分一般含有至少约16个碳原子，更常含有至少约20个碳原子，甚至更常含有至少约30个碳原子。

[0131] 用于本发明化合物的脂族脂质部分一般具有至少约12个碳原子，更常具有至少约14个碳原子。通常，脂族脂质部分具有至少约18个碳原子，更通常至少约24个碳原子，甚至更通常至少约30个碳原子。

[0132] 本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物中脂质部分的数量取决于所需疏水性程度而不同，也随低聚物长度(即n×m)和脂质部分大小而不同。例如，当脂质部分长约30个碳原子或更少时，本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物一般与其偶联，脂质部分少于单体基团总数(即n×m)的90％(即如果n是3、m是3，那么偶联于脂质-偶联的聚酰胺化合物的脂质部分的数量一般小于约8)。更通常，当脂质部分长约30个碳原子或更少时，本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物与其偶联，脂质部分少于单体基团总数的约80％，更常少于单体基团总数的约75％，甚至更常少于约单体基团总数的约60％。

[0133] 当脂质部分长大于约30个碳原子时，本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物一般与其偶联，脂质部分少于单体基团总数的50％。

[0134] 合适的脂质部分包括具有一个或多个疏水尾的脂质部分，所述疏水尾是任选取代的脂族直链部分，各自的主链中独立地长约8-30个碳原子，此外，主链中任选地含有氮、氧、硫、磷等。疏水尾的主链中一般长至少约10个碳原子，其主链中更通常具有至少约12个碳原子。用于本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物的疏水尾的主链一般不多于约26个碳原子，其主链更通常不多于约24个碳原子。

[0135] 用于实施本发明的天然脂质部分可衍生自例如：磷脂，包括例如：磷酸甘油酯(包括磷酸甘油酰基酯(例如磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇磷酸酯、磷脂酰肌醇双磷酸酯、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油等)和醚磷酸甘油酯)；甘油糖基酯(例如二酰甘油、二半乳糖基二酰甘油、磺基奎诺糖基二酰甘油、二甘露糖基二酰甘油、呋喃半乳糖基二酰甘油、半乳糖基葡糖基二酰甘油、半乳糖基葡糖基二酰甘油、葡糖基半乳糖基葡糖基二酰甘油等)；鞘脂(例如鞘氨醇、糖基神经节苷脂等)；饱和和不饱和的固醇(例如胆固醇、麦角固醇、豆固醇、谷固醇等)；和其它类似的天然脂质。

[0136] 合适的合成脂质部分可衍生自例如：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)TM
(GenzymeCorp.，Cambridge)、DMRIE-C (GibcoBRL，Gaithersburg，MD)、2，3- 二 油 酰TM
氧-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵二氟乙酸(DOSPA)(Lipofectamine ，GibcoBRL，Gaithersburg，MD)、3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇、Tfx-50(Promega Corp.，Madison，WI)，N，N1，N2，N3-四甲基-N，N1，N2，N3-四棕榈酰精胺(TM-TPS)(Cellfectin，GibcoBRL，Gaithersburg，MD)、二棕榈酰磷脂酰乙醇氨基精胺等。

[0137] 合适的脂质部分也包括衍生自有约8-24个碳原子的主链的脂肪酸和脂肪醇的脂质部分。脂肪酸和脂肪醇主链一般具有至少约10个碳原子，主链更通常至少约12个碳原子。通常，产生脂质部分的脂肪酸和脂肪醇的主链不到约20个碳原子。

[0138] Ra一般是脂质部分或偶联有接头部分的脂质部分。特别有用的含有脂质部分的Ra基团是磷脂酰烷氨基-取代的酰基部分，具有下式，

[0139] (III)R4-CO-O-CH2CH(O-CO-R4)-CH2-O-PO3--(CH2)p-NH2+-CH2-CO-

[0140] 式中p是选自2或3的整数，R4各自独立地选自有约6-25个碳原子的主链的烷基或烯基部分。R4的主链一般含有多达约22个碳原子，更通常多达约20个碳原子，甚至更通常多达约18个碳原子。R4的主链一般含有至少约8个碳原子，更通常至少约10个碳原子，甚至更通常至少约12个碳原子。示范性R4部分包括十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等。p优选2。

[0141] 可任选地将本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物进一步偶联于或复合于赋予其(例如)靶向能力、结构特征、生物学活性，或引入降解位点等的物质。合适的物质包括例如：单糖、二糖和多糖、聚乙二醇、氨基酸、肽、多肽、蛋白质(包括例如：脂蛋白、糖蛋白、抗体等)、32
交联剂、标记物(如荧光素、生物素、P等)等。

[0142] 本领域普通技术人员将理解，不难改变R1、Rc、Ra、W和所采用的具体脂质部分，以优化脂质-偶联的聚酰胺化合物递送某具体类型多核苷酸的性能。例如，适合用于将siRNA递送给细胞的本发明低聚部分带有正净电荷，能够凝缩多核酸，使其尺寸更加紧凑，因而有助于将其递送给细胞。

[0143] 适合用于将siRNA递送给细胞的式(I)化合物包括具有重复的n聚体单元(即当n大于1时)的脂质-偶联的聚酰胺化合物。例如，当n是3时，式(I)的脂质-偶联的聚
酰胺化合物具有重复的3聚体单元，即

[0144] (IV)Ra-[(NR11-W1-CO)-(NR12-W2-CO)-(NR13-W3-CO)]m-Rc

[0145] 及其位置异构体，其中Ra、Rc、m、各W和各R1的定义如式(I)。适用于将siRNA递1 2 3
送给细胞的具有式(IV)的化合物包括R1 是阳离子侧链、R1 和R1 都是中性侧链的化合物，各W是CH2，Rc是NH2，Ra由式(III)定义。

[0146] 本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物一般在溶液中形成浓度依赖性、有序的二维或三维结构。这种结构包括二维阵列如带电单层或脂质双层表面，和三维结构如微团、小泡和脂质体。有序结构一般可由本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物本身形成，通常足够小以致它们不会散射光。由脂质偶联化合物与多核苷酸形成的复合物制备的微团、小泡和脂质体平均粒度一般小于约1μm，更通常小于约500nm，甚至更通常小于约200nm。

[0147] 在具体实施方式中，本发明的以脂质-偶联的聚酰胺化合物为基础的递送运载体可包括一种或多种下式的脂质-阳离子类肽偶联物：

[0148] (VI)L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C ＝ O)-N(CH2CH2R)CH2(C ＝ O)-N(CH2CH2R)CH2(C ＝O)]3-NH2

[0149] 和其位置异构体

[0150] 式中

[0151] L选自含有至少一个长约8-24个碳原子的脂族烷基或烯基链的非类固醇脂质部分，和固醇部分；

[0152] 各基团R独立地选自烷基、氨基烷基和芳烷基，

[0153] X选自直接键连接、寡肽、长度为2至约30个键的基本线性的烷基链，和长度为2至约30个键由烷基键和选自酯键、酰胺键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、二硫键、肽键和醚键的一个或多个键连接组成的基本线性的链。

[0154] 当L是非固醇脂质部分(即脂质部分不是或不含固醇基团如磷脂基团(即ROOCCH2CH(COOR)CH2OP(O)2O-)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类脂”。当L是固醇部分(即是或含有固醇基团如胆固醇基团的脂质部分)时，该脂质-阳离子聚酰
胺偶联物在本文中称为“类胆固醇”。本发明组合物中的脂质-阳离子类肽偶联物可以是类脂、类胆固醇或(在一个重要实施方式中)其组合。

[0155] 在具体实施方式中，R是异丙基或4-甲氧基苯基。单个类脂或类胆固醇可包括不同基团R，或者它们在分子中可以相同。

[0156] 这些运载体可通过常规的溶液或固相合成来制备，如上面引用的Zuckermann等所述，并在下面进一步详述。在这种方法之一中，树脂-结合的类肽的N-末端有例如Fmoc-氨基己酸或Fmoc-β-丙氨酸酰化的间隔物。去除Fmoc基团后，伯氨基与脂质部分如氯甲酸胆固醇酯反应形成氨基甲酸酯连接键，如图1的类胆固醇1和3所示。然后，用三氟乙酸从树脂上切下产物，用反相HPLC纯化。脂肪酸衍生的脂质部分，如磷脂可用于代替该类固醇部分，以形成本文所述的类脂，见图1。

[0157] 脂质部分也可通过专业技术人员容易地获得的有效长度的其它连接键连接于聚酰胺如类肽部分。接头是长约30个键的链，更优选长约15个键，但可采用任何有效长度。该链一般是线性或基本线性的，但也可采用间隔有环状基团的支链(包括寡肽)和接头。该接头通常包含烷基(C-C)键和一个或多个官能团，如酯键、酰胺键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、二硫键、肽键或醚键。该接头可包含多个官能团，如琥珀酸酯或聚醚中的官能团，或者可以是寡肽，优选2聚体～10聚体，更优选2聚体～5聚体。类固醇或脂质部分和类肽节段也可通过直接键相连接。

[0158] 在某些实施方式中，接头中掺入了在体内合适条件下易受切割的一个或多个键；例如，可水解的酯，碳酸酯，氨基甲酸酯，或肽键；二硫键，它们在具有充分还原的微环境的细胞区室中可被切断；以及肽键，它可被内源性肽酶切断。关于后者，考虑了具有十个或更少，或者(在其它实施方式中)五个或更少的肽键连接的多肽接头，但也可采用较长的接头。

[0159] 此类接头的代表性结构见图1，给出以下名称：

[0160] 类脂1，或L1 DMPE(NaeNmpeNmpe)3

[0161] 类脂2，或L2 DMPE(NaeNiaNia)3

[0162] 类脂3，或L3 NtdNhd(NaeNmpeNmpe)3

[0163] 类脂4，或L4 NddNol(NaeNmpeNmpe)3

[0164] 类胆固醇1，或C1 Chol-β-ala-(NaeNmpeNmpe)3

[0165] 类胆固醇3，或C3 Chol-β-ala-(NaeNiaNia)3

[0166] 其中“Ntd”是N-十四烷基甘氨酸；“Nhd”是N-十六烷基甘氨酸；“Ndd”是N-十二烷基甘氨酸；“Nol”是N-油酰甘氨酸。

[0167] 上面结构中出现的类肽单体如下：

[0168]

[0169] 在一个方面，本发明提供了由至少一种类脂和一种类胆固醇组成的生物物质递送运载体。该递送运载体适合用于将各种多核苷酸，如质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA递送给细胞，其中该递送运载体与多核苷酸组合在本发明组合物中。

[0170] 本发明组合物可导致将siRNA有效递送给哺乳动物细胞以有效敲除靶基因mRNA。本发明的组合物和递送运载体可体外使用，例如用于研究，包括药物发现、开发和活性测试，或在动物，包括哺乳动物(如人)对象的体内作治疗应用(如作为治疗疾病的药物组分中的药物)。对于这些体内应用而言，可采用本发明的药学上可接受的运载体。

[0171] 合成脂质-偶联的聚酰胺化合物

[0172] 适用于本发明组合物的脂质-偶联的聚酰胺化合物可通过固相和溶液相方法合成。本发明也提供合成脂质-偶联的聚酰胺化合物的方法，所述方法包括：

[0173] a)使(1)脂质反应物与

[0174] (2)低聚反应物

[0175] 接触，

[0176] 其中所述低聚反应物具有以下通式：

[0177] (V)Ta-[(NR1-W-CO)n]m-Tc

[0178] 通式中n是选自1至约48的整数，m是约2-48的整数，

[0179] 通式中Ta和Tc各自独立地选自能够与所述脂质反应物进一步反应的末端基团和反应活性部分，

[0180] 通式中所述低聚反应物中各单体单元-(NR1-W-CO)-的R1选自氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基，-SH；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和能够与所述脂质反应物进一步反应的反应活性部分，

[0181] 通式中当R1、Ra或Rc是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子，

[0182] 通式中至少一个单体单元的R1不是氢原子，

[0183] 通式中各单体单元的W选自含碳并在任选含有氮、氧、硫和磷和任选地含有一个或多个双键或三键的主链结构中含有1至约50个原子的任选取代的、支链或直链二价部分，其中所述W的任选取代基可以是能够与所述脂质反应物进一步反应的反应活性部分，[0184] 其中至少一个单体单元的Ta、Tc、W之一，或一个单体单元的R1含有能够与所述脂质反应物进一步反应的反应活性部分；然后

[0185] b)使所述脂质反应物与所述低聚反应物反应，而将脂质反应物偶联于低聚反应物。

[0186] 本文所用术语“脂质反应物”指具有能够参与化学反应如亲核置换、缩合等的脂质部分的反应活性物质。具有官能团如-NH2、-COOH、-SH、-OH、-SO2Cl和-CHO的脂质反应物可具体用于合成本发明脂质偶联的化合物。适合用于实施本发明的脂质反应物包括具有可与或经修饰后可与低聚反应物或接头起反应的本文所述脂质部分的任何一种的脂质反应物。脂质反应物一般是伯胺、仲胺或叔胺。适合本文使用的特定脂质反应物是磷脂酰乙醇胺。

[0187] 本文所用术语“低聚反应物”指能够参与化学反应如亲核置换、缩合等的低聚酰胺。低聚反应物一般可用易被亲核试剂(如胺)亲核置换的离去基团酰化。适合用于实施本发明的低聚反应物包含本文式(I)所述的所有低聚酰胺取代基(即-[(NR1-W-CO)n]m-)。

[0188] 本文所用术语“反应活性部分”指能够参与与脂质反应物相反应的部分。一般的反应活性部分包括例如：-NH2、-OH、-H、-SH、-COOH、酰基(如乙酰基)、苯甲酰基、磺酰基(如丹磺酰基)、酰胺、肼(一般是Tc基团)和它们的衍生物(包括烷基取代的衍生物)等。反应活性部分一般是用易被亲核试剂(如胺)亲核置换的离去基团取代的酰基部分。

[0189] 示范性末端基团包括可作为生物学活性物质、靶向物质(如细胞受体配体、抗体等)、标记物、和可用作(例如)内源性蛋白水解酶的降解位点的氨基酸残基等部分。这些末端基团一般不与脂质反应物进一步反应。

[0190] 低聚反应物和脂质反应物可任选地通过接头部分(可任选地衍生自反应活性部分)互相连接。

[0191] 或者，脂质和低聚反应物反应之前，可将衍生自能够与低聚和脂质反应物反应的分子的接头部分任选地偶联于脂质或低聚反应物。因此，脂质反应物可直接或通过接头部分间接地偶联于低聚反应物。

[0192] 本文所用术语“反应”指导致在脂质反应物和低聚反应物之间直接或通过接头部分间接形成化学键的一种或多种化学反应。合适的反应包括例如：缩合(如酰化等)和亲核置换。

[0193] 可根据Zuckermann等，PCT WO94/06451(1994年3月31日公开，纳入本文作为参考)所述的固相法通过(例如)一系列亲核置换反应制备具有通式(IV)的低聚反应物。可用自动化肽合成仪进行该方法，以快速合成感兴趣的低聚反应物。这些仪器可购自例如，Applied Biosystems。

[0194] 具体说，通过将“亚单体”单元依次加入生长的链而实现从单体组装成低聚反应物。在单体组装的一个方法中，加入单体的每轮循环由以下两步组成：

[0195] (1)用含有离去基团(即易被亲核试剂亲核置换的基团，如胺)和羰基(如羧基)的酰化剂酰化结合于固体支持物上的仲胺(即“酰化步骤”)；然后，

[0196] (2)用足量具有伯氨基、仲氨基或叔氨基的亚单体亲核置换该离去基团，以引入侧链(即“亲核置换步骤”)。

[0197] 示范性酰化剂包括卤代乙酸、卤代甲基苯甲酸等。离去基团的置换效率受所用酰化剂类型的调节。例如，当采用卤代乙酸时，观察到与氯相比，碘能更有效地置换离去基团。合适的亚单体包括烷基胺、烯基胺、芳基胺、烷氧基胺、氨基脲、酰基氢氧化物和它们的衍生物等。

[0198] 按羧基至氨基方向以亚单体方法合成低聚物。精心制作低聚物，直到所需长度，然后(例如)用溴化乙酰胺基团封端。用固相亚单体组装构建本发明低聚反应物的一个优点是不需要N-α-保护的单体，因为只有反应性侧链官能团需要保护。

[0199] 一般将低聚反应物合成为一系列重复的2聚体或4聚体单元。示范性的3聚体阳离子低聚物沿氨基末端(Ta)至羧基末端(Tc)方向上含有以下序列：

[0200] (1)带正电的单体

[0201] (2)中性单体，和

[0202] (3)中性单体。

[0203] 本文所用术语“中性单体”和“带正电的单体”指单体单元的净电荷。如上所述，在本发明的其它实施例中，可采用其它位置性异构体基序，例如中性-正电-中性；或中性-中性-正电。

[0204] 可通过进一步酰化亲核置换使低聚反应物与脂质反应物进一步反应。例如，卤代酰化(如Ta是溴代乙酰基时)的低聚反应物可与伯胺、仲胺或叔胺的脂质反应物反应。从而，通过溴的亲核置换而偶联，形成脂质-偶联的聚酰胺化合物。

[0205] 根据本发明的具体实施方式，在以下用于脂质-阳离子类肽(包括类脂和类胆固醇)偶联物的固相亚单体合成方法中提供了更具体的细节：

[0206] 通用实验。试剂级溶剂无需进一步纯化即可使用。溴代乙酸可购自Aldrich(99％级)，DIC可购自Cheminplex International。所有反应和洗涤在35℃进行，除非另有说明。洗涤树脂指将洗涤溶剂(通常是DMF或DMSO)加入树脂，搅拌该树脂形成均一的浆液(一
般约20秒)，然后彻底排尽树脂中的溶剂。最好通过反应容器的烧结底部真空抽滤去除溶剂，直到树脂看起来干燥(一般约10秒)。通过烧结容器的底部鼓泡通入氩气搅拌树脂浆液。用于溶解试剂的溶剂应在使用前通过真空下超声处理5分钟脱气。对于洗涤溶剂，采用装有可调整体积(1-5mL)的含有DMF、DMSO和二氯甲烷的分配器会非常方便。

[0207] 如果停止合成，树脂要储存一段时间(过夜)，推荐在储存前用二氯甲烷彻底冲洗树脂。可在高真空下进一步干燥树脂后储存。建议在二聚体阶段不要停止合成，因为二聚体长时间储存后会环化形成二酮哌嗪。

[0208] 初始树脂膨胀和Fmoc脱保护。在烧结的反应容器中装入100mg Fmoc-Rink酰胺树脂(0.50mmol/g树脂)。将2mL DMF加入树脂，搅拌该溶液5分钟使树脂膨胀。如果需要，可用玻璃棒研碎树脂块。然后排尽DMF。将2mL 20％哌啶的DMF溶液加入树脂中去除Fmoc基团。搅拌1分钟后排尽。再将2mL 20％哌啶的DMF溶液加入树脂，搅拌20分钟后
排尽。用DMF(5*2mL)洗涤树脂。

[0209] 亚单体合成循环。通过将850μl 1.2 M溴代乙酸的DMF溶液加入树脂使脱封闭的胺酰化，然后加入175μl纯净的N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)。35℃搅拌该溶液20分钟后排尽。然后用DMF(3×2mL)和DMSO(1×2mL)洗涤该树脂。

[0210] 酰化步骤(步骤1)，然后是用伯胺亲核置换(步骤2)。将0.85mL 2M胺的DMSO溶液加入洗涤的树脂中35℃搅拌该溶液30分钟后排尽。然后用DMSO(3×2mL)和
DMF(1×2mL)洗涤该树脂。这样就完成了一个反应循环。

[0211] 重复酰化/置换循环，直到获得所需低聚物。亚单体合成反应方案见下：

[0212]

[0213] 切割(50μmol树脂)。合成反应和树脂洗涤后，用二氯甲烷(2×2mL)洗涤树脂，真空干燥2小时。准备三氟乙酸溶液(95％，水溶液)。将干燥的树脂置入装有特氟龙微搅拌棒的玻璃闪烁瓶中，加入约5mL 95％TFA水溶液。将闪烁瓶放在通风橱中的摇动板上。一个摇动板可同时容纳4瓶或五瓶。摇动搅拌该溶液20分钟。将各样品的切割混合物通过8mL装有20μm聚亚乙烯基玻璃料的固相抽提(SPE)柱过滤到50mL聚丙烯尖底离心管
中。切割时间可能需要延长，这取决于具体文库中存在的是哪一种保护基团。然后用1mL
95％TFA洗涤树脂，合并滤出液。然后在离心管中用等体积的水稀释滤出液。

[0214] 然后冷冻该溶液并冻干。在瓶盖上戳小孔，可直接冻干聚丙烯管中内容物。然后将干燥产物溶于10mL冰醋酸中，再冻干。然后将干燥两次的产物溶于3mL 1∶1的乙腈/水中，转移到配衡的5mL冻存小瓶中(优选有硅树脂O型环)，然后冻干，通常产生白色絮状粉末。然后可计算质量回收，产物可保留在冻存小瓶中冷储存。为了计算产率，可假定产物是三氟乙酸盐。在最后一次冻干之前，应准备HPLC和质谱样品。

[0215] 如果该材料将用于生物试验作测定，那么加入DMSO以制成浓缩的储存液。优选浓度为100μM/化合物或更高的溶液。此100x DMSO储存液可以用缓冲液1∶100稀释，产生含有1％DMSO的试验溶液，其中样品分子的浓度为1μM/化合物(一般的筛选浓度)。
DMSO是一个良好选择，因为它能很好地溶解类肽，当稀释到与大多数生物试验相容时(浓度≤1％)。

[0216] 低聚物特征分析。用反相HPLC在C18柱(Vydac，5μm，300 ，4.5×250mm)上分析了各个类肽低聚物。以1mL/分钟的流速(溶剂A＝0.1％TFA的水溶液，溶剂B＝0.1％TFA的乙腈溶液)在40分钟内用线性梯度0-80％B液。收集主峰，提交给电喷MS分析，测定分子量。

[0217] 类脂合成(50μmol规模)。类脂1和2(L1和L2)是最终(N-末端)残基是伯胺磷脂酰乙醇胺的标准类肽。L1和L2用二肉豆蔻基磷脂酰乙醇胺(DMPE)作为N-末端脂质
部分。为了安置此基团，使N-末端溴代乙酰化，用标准的亚单体条件洗涤(同上)。然后用甲醇/氯苯(2×2mL)洗涤树脂。

[0218] 然后，如下所述制备0.2 M DMPE溶液。将DMPE(Genzyme)溶解于15％甲醇/氯苯中，使浓度为0.2M。由于该化合物是两性离子形式，必须中和该化合物以获得胺游离碱。
这是通过在快速搅拌下加入0.92当量的50％KOH水溶液完成的。碱的加入可遗留小体积水成为分离相，所以应离心样品(台式离心机，最大rpm离心1分钟)并去除任何水相。在此阶段，应用TLC核查DMPE溶液的纯度(TLC溶剂：80/20/0.5，CH2Cl2/CHaOH/NH4OH，用茚三酮染色)。产物的Rf应该是～0.6。

[0219] 然后将DMPE(2mL)溶液加入树脂。由于该溶液具有潜在起泡性，所以非常温和地搅拌该反应(通常间歇性鼓入氩气或旋转振荡)。35℃孵育该反应过夜。然后排尽反应混合物，用15％甲醇/氯苯(6×3mL)、DCE(2×3mL)和DCM(1×3mL)洗涤。在标准类肽条件(见上)下进行切割。由于该类脂的亲脂性增加，HPLC分析应在C4柱上进行。

[0220] 类脂3和4(L3和L4)是N-末端最后2个残基由疏水胺构成的标准类肽。将这些胺溶解于15％甲醇/氯苯中，浓度1M。用1mL该溶液50℃进行置换反应2小时，然后用
15％甲醇/氯苯(3×2mL)和DMF(3×2mL)洗涤。

[0221] 类胆固醇合成(50μmol规模)。胆固醇部分通过两步程序加入，其中首先将β-丙氨酸接头加到所需类肽的N-末端((NaeNmpeNmpe)3用于C1，(NaeNiaNia)3用于C3)，然后用胆固醇氯甲酸酯偶联。加入2.0mL Fmoc-β-丙氨酸(0.4M)和HOBt(0.4M)的DMF溶液将Fmoc-β-丙氨酸(NovaBiochem)偶联于N-末端，然后加入1.1当量纯净的DIC。搅拌反应混合物1小时，然后排尽反应混合物，用DMF(2×3mL)洗涤树脂。再重复β-丙氨酸偶联后用DMF(3×3mL)和DCE(1×3mL)洗涤树脂。去除Fmoc后，如上所述，加入2.0mL 0.4 M
胆固醇氯甲酸酯(Aldrich)的DCE溶液再加入1当量纯净的二异丙基乙基胺(DIEA)反应
而加入胆固醇部分。35℃温和混合反应混合物过夜。然后用DCE(5×3mL)和DCM(2×3mL)
洗涤树脂。

[0222] 由于形成的氨基甲酸酯对酸轻微不稳定，所以在切割和处理该化合物时应注意。加入TFA/DCE 1∶1(5mL)切割10分钟。收集滤出液，再用2mL切割混合液洗涤树脂。然
后抽真空快速干燥合并的滤出液，将油重悬于1∶1的乙腈/水中。立即冷冻(-80℃)并
冻干。然后再冻干样品一次去除乙腈/水(1∶1)。

[0223] 类脂和类胆固醇纯化。类脂和类胆固醇在用前用反相HPLC纯化。可采用C4柱。在一个实施例中，将化合物溶解于小量25％乙腈/水中，在50×20mm ID DuraGel HSC4柱(Peeke Scientific)上纯化。流速30mL/分钟(溶剂A＝0.1％TFA的水溶液，溶剂B＝
0.1％TFA的乙腈溶液)在40分钟内用线性梯度35-85％B纯化。混合合并的产物组分，冻干成为白色粉末。

[0224] 脂质偶联的聚酰胺组合物的制备方法

[0225] 为了制备转染组合物，将脂质偶联的聚酰胺化合物运载体，如类脂或类胆固醇或混合物的水溶液与siRNA配制在一起，如实施例1所述。每个siRNA负电荷至少对应1.5个，优选至少对应2-4个运载体正电荷宜为所用组分的相对量。对于各种细胞类型宜凭经验确定siRNA与运载体的准确比率，但通常范围是1.5-2nmol运载体/μg反义寡核苷酸。
用实施例1所述的本发明组合物转染细胞。涉及本发明组合物的应用的进一步细节见下。

[0226] 脂质偶联的聚酰胺组合物的应用

[0227] 在另一方面，提供了抑制细胞中靶基因表达的方法，该方法包括将上述组合物给予细胞，其中siRNA双链体的一条链具有靶基因产生的mRNA所含的核苷酸序列。所述细胞可以是“对象”所含细胞，如本文定义所述。

[0228] 含有脂质-偶联的聚酰胺化合物的本发明组合物能够将有效量的多核苷酸(如siRNA)递送给细胞。本文所用术语“有效量”指足以可检测地诱导或参与生物反应如信号转导、转录、翻译、淋巴细胞活化(包括例如抗体产生等)的多核苷酸量。

[0229] 脂质-偶联的聚酰胺化合物与多核酸(如siRNA)的相对量一般选择能使组合物中脂质-偶联的聚酰胺化合物与多核苷酸的+/-电荷比至少约为1.5和小于约10的量。更通常，该±电荷比率小于约8，甚至更通常小于约4。可按以下公式计算电荷比：

[0230] 电荷比＝(nL×ML)/(3.03×MsiRNA)，

[0231] 其中nL是脂质-偶联的聚酰胺化合物的摩尔数，ML＝净电荷数/摩尔脂质偶联的聚酰胺，MsiRNA＝siRNA的微克数。

[0232] 本发明组合物可以是液体或固体形式，可任选地包括药学上可接受的赋形剂。这种赋形剂可用作填充剂、加工助剂、递送增强剂和调节剂等。合适的赋形剂包括例如：磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、单糖、二糖、多糖、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂等，以及上述任何两种或多种的组合。药学上可接受的赋形剂的深入讨论见《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，NJ 1991)。

[0233] 可在该组合物中包括其它物质，例如标记试剂、营养物等。例如，当生物活性物质是多核苷酸时，可将能促进所需核酸胞吞或有助于核酸结合于细胞表面，或二者的物质掺入到本发明组合物中。

[0234] 本发明的液体组合物可以是含有液体运载体的溶液、悬浮液或乳液形式。合适的液体运载体包括例如：水、盐水、药学上可接受的有机溶剂、药学上可接受的油或脂肪、它们的混合物等。该液体运载体可含有其它合适的药学上可接受的添加剂，如增溶剂、乳化剂、营养物、缓冲液、防腐剂、悬浮剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂等。合适的有机溶剂包括例如：一元醇如乙醇，和多元醇如甘油。合适的油包括例如：大豆油、椰子油、橄榄油、红花油、棉花籽油等。对于胃肠道外给药而言，该运载体也可以是油性酯如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯等。

[0235] 适合用于实施本发明的细胞包括例如：获自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，ATCC)的哺乳动物细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、人胚肾细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠塞尔托利细胞、犬肾细胞、buffalo大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、其它哺乳动物(包括人)细胞(如干细胞、具体是造血细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、肿瘤细胞等)等。

[0236] 适合用作本发明样品的合适组织包括例如：获自哺乳动物的组织，如肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、血液、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、骨、软骨、胰、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺、结缔组织等。

[0237] 样品给予方式包括例如：离体给予获自对象的样品和体外给予样品。进行这些给予方式的方法是本领域普通技术人员熟知的。例如，离体递送和将转化细胞再植入对象中可如国际公开号WO 93/14778(1993年8月5日)中所述进行。

[0238] 本文所用术语“对象”指细胞、细胞系(包括哺乳动物细胞和细胞系)、无脊椎动物和脊椎动物包括鸟和哺乳动物如啮齿类和人。一般可通过皮下、腹膜内，静脉内或肌肉内注射或递送至组织间隙直接给予对象。也可将该组合物给予肿瘤或病损处。其它给予方式包括口服和肺部给药、栓剂和透皮应用，针和基因枪或无针注射。

[0239] 除了将siRNA(或其它多核苷酸)递送给细胞外，也可将本发明脂质偶联的聚酰胺化合物应用于，如筛选肽样化合物的生物学活性，掺入到生物传感器中使低聚部分能够结合于靶配体等。在药物筛选应用中，例如，可按照PCT公开WO 91/19735(1991年12月26日公开)(纳入本文作为参考)所述的合成和筛选修饰的肽文库的方法，合成具有各种R1基团的脂质-偶联的聚酰胺化合物文库，然后筛选其生物学活性。

[0240] 实施例

[0241] 以下实施例说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0242] 实施例1.SiRNA抑制靶mRNA

[0243] A.制备转染混合物

[0244] 对于各转染混合物(它们是本发明组合物的例子)来说，制备类脂或类脂/类胆固醇组合递送运载体，使其水溶液工作浓度为0.5mM，混合产生均一溶液。制备siRNA使其成为含有siRNA的缓冲液，工作浓度为20μM。在本实施例中，siRNA针对Akt1mRNA，序列为CAUAGUGAGGUUGCAUCUGGUG(SEQID No：1)，具有两个2’0-甲基UU(RNA)核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯键连接(获自Integrated DNA Technologies)。在微量离心管中用TM TMOptiMEM (Gibco/BRL)稀释siRNA至1μM，或约15μg寡核苷酸/mlOptiMEM 。在单独的
微量离心管中，将用量一般约为3.75nmol运载体/100pmolsiRNA的运载体稀释于相同体积TM
的用于稀释siRNA的OptiMEM 中。在本实施例中，所用siRNA和运载体的起始浓度，可导致使用约1.5μl运载体/μl siRNA。注意对于各细胞类型的siRNA与运载体的准确比率必须凭经验确定，但通常约为此量。将稀释的siRNA立即加入稀释的运载体中，通过移液器上下吹打混合。室温培育该混合物10分钟。

[0245] B.转染

[0246] 在转染前一天将细胞接种于含血清生长培养基的组织培养皿上，使转染密度为60-90％。混合和培育后立即将siRNA/运载体混合物加入细胞，使正常生长培养基体积一半中的siRNA终浓度为50-100nM。用该转染混合物37℃、5％CO2培育细胞4-24小时。培育后，用含血清的正常生长培养基将转染混合物稀释2倍。

[0247] 图2显示当用如上所述制备的转染组合物将针对Akt1 mRNA的siRNA转染到MDA435乳腺癌细胞中时Akt1表达缺失。比较了三种不同类脂(L2、L3)或类脂/类胆固醇组合(L1/C1)运载体与一系列市售递送运载体(X＝lipofectamine2000，获自Invitrogen；
Y＝siPORTamine，获自Ambion；Z＝siPORTlipid，获自Ambon)的有效性，在转染期间有或没有血清。对照是用相同运载体和条件以100nM浓度转染到细胞中的eg5 siRNA。该eg5 siRNA是双链，所有RNA包含加入的两个TT核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯键连接，其序列对应于DNA序列AGAAACTAAATTACAACTTGTTA。用Roche高纯度RNA分离试剂盒按厂商
说明抽提总RNA。

[0248] 结果(标准化；HPRT和GUSB的平均值；将Akt1的信使水平标准化到持家基因(HPRT和GUSB)水平的平均值以补偿样品间总RNA水平的小差异)显示，本发明的转染试剂和组合物基本不受血清存在与否的影响，它们非常有效地降低了靶基因/mRNA表达。

[0249] 实施例2.siRNA转染后荧光素酶活性丧失

[0250] 用抗萤火虫荧光素酶的siRNA(CGUACGCGGAAUACUUCGA(SEQ ID No：2)；来自Elbashir等，Nature，411，494(2001))和本文所述的本发明的几种不同递送运载体(L1、L2、L1/C1、L4 1L1/3C1)(基本如实施例1所述)制备转染混合物。用Promega双-荧光素酶报道测定系统根据说明书定量荧光素酶活性。如图3所示，在稳定表达荧光素酶的MDA231中转染抗荧光素酶的siRNA后荧光素酶活性大大降低。对照是未转染的细胞系。此结果进一步说明，本发明组合物能够有效将siRNA递送给细胞。

[0251] 实施例3：用siRNA转染的细胞中敲除Akt1信使

[0252] 表1显示了在用含有本发明组合的类脂/类胆固醇递送运载体的组合物和用市售转染试剂(Fugene6，购自Roche)转染siRNA的细胞中，比较敲除Akt1信使效果的实验数据。基本按照实施例1所述的转染混合物制备和转染程序，用含有组合的类脂/类胆固醇递送运载体(1L1/3C3)的组合物以100nM两种不同的siRNA(针对Akt1信使RNA的siRNA，其序列(SEQ ID No：1)含有两个TT核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯键连接，或含有两个UU(RNA)核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯键连接)转染HT1080细胞。观察到本发明
组合物使mRNA水平降低约69-83％。结果表明本发明组合物在Akt1 mRNA敲除中比市售
Fugene6试剂有效得多。

[0253] 表1

[0254]100 nM 人肌动蛋白pp akt1 pp 与肌动蛋白之比 mRNA敲除％
1∶1 L1/C3 1∶3 akt1#1 0.94 0.64 0.6795 69.3
1∶1 L1/C3 1∶3 akt1#3 0.89 0.48 0.5406 82.6
1∶5 Fugene6 akt1#1 0.40 0.66 1.6500 28.1
1∶5 Fugene6 akt1#3 0.40 0.79 1.9628 9.0
HT1080 wt 0.80 1.97 2.4625 0.0

[0255] 虽然为了清楚地理解，详细描述了上述发明，但显然可在所附权利要求书的范围内进行某些改变和修改。应注意，可采用许多替代方法来实施本发明方法和组合物。因此，认为本发明的实施方式是说明性而非限制性，本发明不受本文详述的哪些内容的限制，但可在所附权利要求书的范围和等价形式内进行修改。

[0256] 将上面引用的专利、专利申请和期刊文献各自的内容纳入本文作为参考用于所有目的，就好像它们的全文在此完全列出的那样。