桑黄4.6302菌株菌质多糖及其制备方法转让专利
申请号 : CN200610040976.7
文献号 : CN1908181B
文献日 : 2010-09-01
发明人 : 沈业寿 , 史新强 , 郑立军 , 李宜明 , 赵根海 , 郑媛
申请人 : 安徽大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种保藏编号为CCTCC NO：M 206075的桑黄4.6302菌株菌质多糖的制备方法，包括以桑黄4.6302菌株为出发菌株经固态发酵培养制备桑黄菌质和自桑黄菌质中提取多糖，其特征在于：(1)、所述固态发酵培养是桑黄4.6302菌种接种在灭菌的pH5～9的固态培养基上于22～30℃条件下培养10～20天，所述的固态培养基各组分有以下重量份数：米糠 60～80份， 玉米粉 8～12份，大豆粉 8～12份， 葡萄糖 0.8～2.2份，牛肉膏 0.8～2.2份，硫酸锰 0.04～0.06份，水 80～120份；
(2)、所述的自桑黄菌质中提取多糖就是将菌质匀浆后用70～80℃的水浸提，分离得到水浸提液，浓缩后于15～25℃条件下加入乙醇使多糖沉淀，分离后将沉淀干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：(1)、固态发酵培养基各组份有以下重量份数：米糠 70份， 玉米粉 10份，大豆粉 10份， 葡萄糖 1.5份，牛肉膏 1.5份，硫酸锰 0.05份，水 100份；
(2)、将菌质匀浆后用70～80℃水浸提、15～25℃条件下醇沉得到多糖沉淀并干燥。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：固态培养基pH6～8，培养温度24～28℃，培养时间12～18天。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：固态培养基pH7，培养温度25～27℃，培养时间15～16天。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：菌质匀浆后水提醇沉的工艺条件为75℃水浸提、20℃时醇沉。
说明书 :
一、技术领域
本发明涉及一种微生物活性成分及其制备方法，特别涉及一种药用真菌活性成分及其制备方法，确切地说是一种桑黄4.6302菌株菌质多糖及其制备方法。
二、背景技术
桑黄属担子菌门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科的药用真菌。因通常生长在桑属植物上，且子实体为黄褐色的缘故而得名。桑黄具有极高的药用价值，在增强人体免疫力、抗肝纤维化、抗脂质过氧化、抗炎等方面有显著作用，尤其在抗肿瘤方面效果极为显著，是目前已知的抗癌效果最好的真菌。
桑黄多糖可以应用于抗肿瘤、抗突变、抗氧化、抗肝纤维化、抗衰老和抑制HepG-2、乳腺癌细胞株MCF-7和Hela、SMMC-7721等细胞生长的生物学效应，且在一定浓度范围内成剂量效应关系，对化疗物环磷酰胺(CP)有明显的增效减毒作用，而且对CP造成的小鼠细胞免疫功能下降有一定的改善作用，如促进小鼠白细胞数增加，增加脾细胞增殖转化能力；能明显提高细胞因子IL-2、TNF-a的水平；并可以延长果蝇寿命，提高衰老小鼠血清、脑、肝组织中超氧物歧化酶(SOD)活性，降低小鼠血清、脑、肝中丙二醛(MDA)的含量，增加胸腺的重量和改善小鼠学习记忆行为，具有抗脂质过氧化和抗衰老等方面的作用。
桑黄主要分布在我国西北、东北和西南等地区，子实体在野外一般要2～3年才能长成。目前桑黄野生资源已遭灭绝性开采，价格昂贵，供不应求。由于受到气候、环境等诸多因素的影响，人工栽培桑黄周期长成功率低。
桑黄菌丝体可以采用液态发酵法生产，但此方法生产桑黄菌丝体投资巨大，短时间难以实现。
野生桑黄菌因品种、寄主、产地等不同导致其药用效果差异显著。为避免开发这一珍稀药用真菌的盲目性，申请人从全国各地采集的十几种桑黄子实体中分离、筛选、驯化出具有较好药理活性的桑黄4.6302(phellinus igniarius 4.6302)菌株，其与野生桑黄子实体药理活性相同，比液态发酵得到的菌丝体有更高的多糖产量和更好的药理活性。本菌株已于2006年8月7日送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M 206075。
三、发明内容
本发明旨在挽救这一濒危的药用真菌并满足市场需求，所要解决的技术问题是由出发菌株培养得到桑黄菌质，然后提取多糖。
本发明所称的桑黄菌质多糖以是桑黄菌株4.6302菌株为出发菌株、经固态发酵培养制备桑黄菌质，再自该桑黄菌质中提取得到的多糖类化合物。
所述的桑黄4.6302菌株固态发酵培养就是桑黄4.6302菌种接种在灭菌的pH5～9的固态培养基上于22～30℃条件下培养10～20天。所述的固态培养基各组分有以下重量份数：
米糠 60～80份，
玉米粉 8～12份，
大豆粉 8～12份，
葡萄糖 0.8～2.2份，
牛肉膏 0.8～2.2份，
硫酸锰 0.04～0.06份，
水 80～120份。
优选培养基各组份重量份数为：
米糠 70份，
玉米粉 10份，
大豆粉 10份，
葡萄糖 1.5份，
牛肉膏 1.5份，
硫酸锰 0.05份，
水 100份。
固态培养基的pH值优选pH6～8，最佳pH7。
发酵培养的温度优选24～28℃，最佳25～27℃，培养时间优选12～18天，最佳15～16天。
固体发酵培养结束后便得到桑黄菌质。
所述的自桑黄菌质中提取多糖就是将桑黄菌质匀浆后用水提醇沉法进行提取，首先用70～80℃的水浸提，分离得到水浸提液，浓缩水浸提液以提高多糖的浓度，然后在15～25℃条件下加入乙醇使多糖沉淀析出，当无沉淀析出时，乙醇的终浓度约为70％，分离，将沉淀干燥即得桑黄菌质多糖，无定形淡黄色粉末。优选75℃水浸提，20℃时醇沉。
本桑黄多糖，无毒，安全性好。
急性毒性试验：取健康昆明小鼠30只，雌雄各半，体重18～22g，禁食(自由饮水)12h，次日上午、下午各灌胃给药一次，桑黄多糖浓度200mg/ml，容量0.25ml/10g体重，连续7d，正常饲养并观察给药间隔及给药动物反应和死亡情况。给药后小鼠在30min内活动减少，随后恢复正常，摄食、粪便、毛发等均无明显异常，亦无一小鼠死亡。结果显示桑黄菌质多糖给小鼠灌胃的最大耐受量＞10g/kg，提示桑黄菌质多糖安全性良好。
长期毒性实验：设三个剂量组灌胃给药，每天一次，连续180天。结果高(5g/kg)、中(2.5g/kg)、低(1g/kg)剂量组的大鼠健康状况、生长发育、外围血象、肝肾功能均无影响，病理检查亦无明显变化。这说明桑黄菌质多糖在大于人临床用药剂量，连续给药6个月时，对大白鼠安全可靠。
本培育方法得到的桑黄菌质其药理活性与长白山、大别山等地野生桑黄子实体相当，与液态发酵法生产的菌丝体相比，有更高的桑黄多糖含量和显著的抑制肿瘤、抗突变等药理活性。自本桑黄菌质提取的桑黄多糖具有以下药理活性：
体外抑瘤实验证明桑黄菌质多糖(60-300ug/ml)对肝癌细胞株HepG-2和乳腺癌细胞株MCF-7有明显的抑制作用，抑制率达到60％以上，对Hela、SMMC-7721抑制率在50％以上，且在一定浓度范围内成剂量效应关系；体内抑瘤实验(50-200mg/kg)证明对小鼠S180抑制率达60％以上。
实验还表明，桑黄菌质多糖对化疗药物环磷酰胺(CP)有明显的增效减毒作用，而且对CP造成的小鼠细胞免疫功能下降有一定的改善作用。50、100、200mg/kg PIIP-1与CP组联合用药对S180的抑制率分别为71.93％、79.51％、73.25％，较单纯用CP有明显增加(CP抑制率为67.98％)，且可明显减少CP致死现象；50、100、200mg/kg PIIP-1与CP组联合用药组较CP组比较，白细胞数明显增加。CP为4.90×109/ml，联合用药组分别为6.86×109/ml、7.98×109/ml、7.38×109/ml；联合用药组较CP组相比，脾细胞增殖能力也有显著增加，0D值分别为0.075±0.026、，0.077±0.009、0.079±0.006，CP组为0.039±0.005；实验表明CP组小鼠IL-2，TNF-α的诱生水平均明显下降，而桑黄菌质多糖可明显改变这一现象。CP组IL-2为29.78±7.63pg/ml，100、200mg/kgPIIP-1与CP组联合用药组的IL-2水平可达43.03±7.90、55.69±4.76pg/ml；CP组TNF-α为47.33±7.63pg/ml，而50、100、200mg/kg PIIP-1与CP组联合用药组的TNF-α水平分别达到111.61±18.57、146.86±27.97、123.69±14.61pg/ml，有明显增加。
桑黄菌质多糖对环磷酰胺致损伤小鼠的血清和肝组织中SOD活性有明显的增强作用，对MDA水平有明显的降低作用。对照组小鼠血清和肝组织里的SOD分别为为219.56NU/ml、112.35NU/mg protein；MDA含量为15.33nmol/ml、26.38nmol/mg protein。而给予100mg/kg桑黄菌质多糖之后，其血清和肝组织的SOD活力可达325.94NU/ml、155.63NU/mg protein；MDA含量分别降至12.09nmol/ml、16.94nmol/mg protein。200mg/kg和50mg/kg的剂量也有显著增强SOD活力，降低对MDA水平的作用。
小鼠骨髓细胞微核实验证明50、100、200mg/kg剂量的桑黄菌质多糖对环磷酰胺诱发的微核抑制率分别为25.37％、42.42％和52.61％，且成量效关系；小鼠精子畸变实验结果显示，CP所诱发的小鼠精子畸形率(CP为94.8‰，正常组为28‰)明显升高，并出现了胖头、双头、双尾等严重畸形精子。当桑黄菌质多糖与CP同时给予小鼠时，可使CP诱发的小鼠精子畸形率显著降低(50、100、200mg/kg剂量分别为49‰、56.5‰、64.5‰)，而且胖头、双头、双尾等严重畸形精子明显减少，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明桑黄菌质多糖对化疗药物所引起的体细胞和生殖细胞诱变起保护作用。
桑黄菌质多糖能显著延长果蝇寿命(平均延长27.5％)，提高衰老小鼠血清、脑、肝组织中超氧物歧化酶(SOD)活性(均提高15％以上)，降低小鼠血清、脑、肝中丙二醛(MDA)的含量(50、100、200mg/kg剂量分别比模型组降低了21.3％、25.9％、46.6％)，增加胸腺的重量(平均增加了模型组的15.9％)和改善小鼠学习记忆行为(走迷津的时间平均比模型组缩短了73.5％)。这些说明桑黄菌质多糖具有一定的抗氧化、抗衰老作用。
本培育方法实现了桑黄的人工繁殖，工艺简单，操作稳定，周期短，有利于实现产业化，规模化。用提取的桑黄多糖用于临床，有利于质量控制、稳定疗效，有力地推动了桑黄应用的现代化。
申请人选育的桑黄4.6302菌株已于2006年8月7日送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M 206075。
四、具体实施方式
(一)、固态培养基的配制
表1 单位：克
按表1配方量称取各组分并混合均匀，用NaOH和HCl或有机酸、碱调pH6～8，灭菌备用。
(二)、桑黄菌株4.6302固态发酵培养
1、桑黄4.6302菌株试管菌种斜面母种培养
培养基：PDA综合培养基
培养条件：23～29℃于暗光照下培养6～9天，pH自然。
2、摇瓶种子培养
将步骤(1)活化好的菌种用接种环挑出2～3块大小为1cm×1cm菌种块接种于500ml三角瓶液态种子培养基中，每瓶装有下列培养基150ml，瓶口用棉塞塞住，外层用牛皮纸包扎。
培养基组分(重量)：蔗糖20～30g，酵母膏3～4g，蛋白胨3～4g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.1g，水1000ml。
培养条件：温度25～28℃，pH6，摇床转速120r/min，培养7～8天。
3、固态发酵培养
将步骤(2)培养好的菌种破碎后用吸取5ml接种到灭过菌的表1所示的任一固态培养基(500ml罐头瓶，其中装有2/3的固态培养基)中，瓶口用食用菌专用塑料膜包扎，外层用牛皮纸包扎。
培养条件：温度24～28℃，pH6～8，时间12～18天，培养结束后得到桑黄菌质。
(三)、桑黄菌质多糖的提取
1、水提：浆桑黄菌质匀浆后加75℃热水浸提3～4小时，水料比5～10∶1，浸提2～4次，分离合并水浸提液。
2、浓缩：负压脱水，浓缩至原体积的20～30％。
3、醇沉：于20℃加入95％的乙醇使多糖沉淀至完全。分离、干燥沉淀即是桑黄菌质多糖，无定形淡黄色粉末。