使用鞭毛蛋白防止辐射的方法转让专利
申请号 : CN200480041259.5
文献号 : CN1913915B
文献日 : 2010-12-01
发明人 : A·V·古德克夫
申请人 : 克里夫兰临床基金会
摘要 :
本发明描述了鞭毛蛋白在防止哺乳动物凋亡效果中的应用。
权利要求 :
1.一种包含鞭毛蛋白的组合物在制备用于从放射影响中保护哺乳动物体的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中该组合物进一步包含辐射防护剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其中该辐射防护剂是抗氧化剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其中该抗氧化剂选自amifostine或维生素E。
5.根据权利要求2所述的用途，其中该辐射防护剂是细胞因子。
6.根据权利要求5所述的用途，其中该细胞因子是干细胞因子。
7.根据权利要求1所述的用途，其中该组合物进一步包含生长因子。
8.根据权利要求7所述的用途，其中该生长因子是角化细胞生长因子。
9.根据权利要求1所述的用途，其中该组合物进一步包含5-雄甾烯二酮。
10.根据权利要求1所述的用途，其中该组合物进一步包含三氯代铵(二氧乙烯-O，O’-)碲酸盐。
11.根据权利要求1-10任一项所述的用途，其中该哺乳动物是人类。
12.根据权利要求1所述的用途，其中该影响是肠道和造血系统的症状。
说明书 :
技术领域
本发明涉及鞭毛蛋白在防止哺乳动物凋亡效果中的应用。更特别地，本发明涉及鞭毛蛋白在防止哺乳动物暴露于压力，如放射和癌症症治疗中的应用。
发明背景
从正常细胞进展到肿瘤细胞涉及生长调节的副性机制缺失，包括对生长抑制刺激物的对抗和缺失了对生长因子和激素的依赖。基于放射和细胞毒性药物的传统的肿瘤治疗方法依靠正常细胞和恶性细胞的生长调控的不同。传统的肿瘤治疗使细胞面对严重的基因毒性压力。在这些情况下，大部分正常细胞被捕获，因而保存下来，而肿瘤细胞持续分裂和死亡。
可是，常规肿瘤治疗方法的本质是使正常快速分裂或有凋亡倾向的组织具有风险。对这些正常快速分裂的细胞的损伤产生了肿瘤治疗中常见的副作用，(敏感组织：造血组织，小肠，毛囊)。这些组织的天然敏感性使问题复杂化了：通常肿瘤细胞获得在自杀(凋亡)机制中的缺陷，引起正常敏感组织死亡的那些治疗步骤也许不会损伤癌症细胞。常规的减少癌症治疗副作用的方法基于(a)使肿瘤细胞对治疗更敏感，(b)使癌症治疗对肿瘤细胞更特异，或(c)治疗后促进正常组织再生(如，促红细胞生成素，GM-CSF，和KGF)。
仍需要一种能够减轻与癌症治疗中的化疗和放疗相关的副作用的治疗剂。本发明完成了这种需要，并提供了其他相关的优点。
可是，常规肿瘤治疗方法的本质是使正常快速分裂或有凋亡倾向的组织具有风险。对这些正常快速分裂的细胞的损伤产生了肿瘤治疗中常见的副作用，(敏感组织：造血组织，小肠，毛囊)。这些组织的天然敏感性使问题复杂化了：通常肿瘤细胞获得在自杀(凋亡)机制中的缺陷，引起正常敏感组织死亡的那些治疗步骤也许不会损伤癌症细胞。常规的减少癌症治疗副作用的方法基于(a)使肿瘤细胞对治疗更敏感，(b)使癌症治疗对肿瘤细胞更特异，或(c)治疗后促进正常组织再生(如，促红细胞生成素，GM-CSF，和KGF)。
仍需要一种能够减轻与癌症治疗中的化疗和放疗相关的副作用的治疗剂。本发明完成了这种需要，并提供了其他相关的优点。
发明内容
本发明涉及从一种或多种诱发凋亡的治疗中保护患者的方法，其包括向患者给药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的(latent)TGFβ。治疗可以是癌症治疗，其可以是化疗或放疗。
本发明还涉及治疗患组成活性NF-kB癌症的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。该药剂可以在癌症治疗前、同癌症治疗一起、或在癌症治疗后给药。治疗可以是化疗或放疗。
本发明还涉及由于治疗癌症症引发的正常组织损伤的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。该药剂可以在癌症治疗前、同癌症治疗一起、或在癌症治疗后给药。治疗可以是化疗或放疗。
本发明还涉及治疗由于压力引起的正常组织损伤的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。该药剂可以在治疗患病动物前、同治疗患病动物一起、或在治疗患病动物后给药。
本发明还涉及在哺乳动物中调节细胞年龄的方法，其包括向哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。该药剂可以在治疗患病动物前、同治疗患病动物一起、或在治疗患病动物后给药。
本发明还涉及药物组合物，其含有诱导NF-kB活性的药剂、化疗药物、以及任选地药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。
本发明还涉及筛选NF-kB诱导剂的方法，其包括向NF-kB激活的表达系统中加入猜想的诱导剂，并单独向NF-kB激活的表达系统中加入对照，由此通过增加NF-kB激活的表达水平的能力来鉴别NF-kB的诱导剂。
本发明还涉及从放射影响中保护哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白，其可以衍生自沙门氏菌种。组合物可以与射线防护剂一同给药。射线防护剂可以是抗氧化剂，其可以是氨磷汀或维生素E。射线防护剂还可以是细胞因子，其可以是干细胞因子。
本发明还涉及从诱发凋亡的一种或多种治疗或状态中保护患者的方法，其包括向所述患者投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB鞭毛蛋白的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白，其可以衍生自沙门氏菌种。治疗可以是癌症治疗，其可以是化疗或放疗。状态可以是压力，其可以是放射、受伤、中毒、感染和发烧应激。
本发明还涉及筛选凋亡调节剂的方法，其包括向以细胞为基础的凋亡系统中添加猜想的调节剂，并单独向以细胞为基础的凋亡系统中添加对照物，由此通过改变凋亡速率的能力来鉴别凋亡调节剂，其中猜想的调节剂来自哺乳动物寄生虫。
本发明还涉及筛选NF-kB调节剂的方法，其包括向NF-kB激活的表达系统中加入猜想的调节剂，并分别向NF-kB激活的表达系统中添加对照物，由此通过改变NF-kB激活的表达的能力来鉴别NF-kB调节剂，其中猜想的调节剂来自哺乳动物寄生虫。寄生虫的种可以是，但不局限于沙门氏菌、支原体和衣原体。
本发明还涉及筛选TGFβ调节剂的方法，其包括向TGFβ激活的表达系统中加入猜想的调节剂，并单独向TGFβ激活的表达系统中添加对照物，由此通过改变TGFβ激活的表达的能力来鉴别TGFβ调节剂，其中猜想的调节剂来自哺乳动物寄生虫。TGFβ可以是潜伏的TGFβ。寄生虫的种可以是，但不局限于沙门氏菌、支原体和衣原体。
本发明还涉及筛选p53调节剂的方法，其包括向p53激活的表达系统中加入猜想的调节剂，并单独向p53激活的表达系统中添加对照物，由此通过改变p53激活的表达的能力来鉴别p53调节剂，其中猜想的调节剂来自哺乳动物寄生虫。寄生虫的种可以是，但不局限于沙门氏菌、支原体和衣原体。
本发明还涉及通过本文描述的任何一种方法鉴别的调节剂。本发明还涉及含有本文描述的调节剂的组合物。该组合物可以是含有药学上可接受剂量的本文所述调节剂的药学组合物。
本发明还涉及治疗癌症症的方法，其包括向需要治疗的患者投药含有增强凋亡的调节剂的药学组合物。
本发明还涉及从一种或多种诱导凋亡的治疗中保护患者的方法，其包括向所述患者投药含有抑制凋亡的调节剂的药物组合物。一种或多种治疗可以是肿瘤治疗。肿瘤治疗可以是化疗或放疗。
本发明还涉及治疗患组成活性NF-kB癌症的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。该药剂可以在癌症治疗前、同癌症治疗一起、或在癌症治疗后给药。治疗可以是化疗或放疗。
本发明还涉及由于治疗癌症症引发的正常组织损伤的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。该药剂可以在癌症治疗前、同癌症治疗一起、或在癌症治疗后给药。治疗可以是化疗或放疗。
本发明还涉及治疗由于压力引起的正常组织损伤的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。该药剂可以在治疗患病动物前、同治疗患病动物一起、或在治疗患病动物后给药。
本发明还涉及在哺乳动物中调节细胞年龄的方法，其包括向哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。该药剂可以在治疗患病动物前、同治疗患病动物一起、或在治疗患病动物后给药。
本发明还涉及药物组合物，其含有诱导NF-kB活性的药剂、化疗药物、以及任选地药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体。该药剂可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潜伏的TGFβ。
本发明还涉及筛选NF-kB诱导剂的方法，其包括向NF-kB激活的表达系统中加入猜想的诱导剂，并单独向NF-kB激活的表达系统中加入对照，由此通过增加NF-kB激活的表达水平的能力来鉴别NF-kB的诱导剂。
本发明还涉及从放射影响中保护哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白，其可以衍生自沙门氏菌种。组合物可以与射线防护剂一同给药。射线防护剂可以是抗氧化剂，其可以是氨磷汀或维生素E。射线防护剂还可以是细胞因子，其可以是干细胞因子。
本发明还涉及从诱发凋亡的一种或多种治疗或状态中保护患者的方法，其包括向所述患者投药含有药学上可接受剂量的诱导NF-kB鞭毛蛋白的药剂的组合物。该药剂可以是鞭毛蛋白，其可以衍生自沙门氏菌种。治疗可以是癌症治疗，其可以是化疗或放疗。状态可以是压力，其可以是放射、受伤、中毒、感染和发烧应激。
本发明还涉及筛选凋亡调节剂的方法，其包括向以细胞为基础的凋亡系统中添加猜想的调节剂，并单独向以细胞为基础的凋亡系统中添加对照物，由此通过改变凋亡速率的能力来鉴别凋亡调节剂，其中猜想的调节剂来自哺乳动物寄生虫。
本发明还涉及筛选NF-kB调节剂的方法，其包括向NF-kB激活的表达系统中加入猜想的调节剂，并分别向NF-kB激活的表达系统中添加对照物，由此通过改变NF-kB激活的表达的能力来鉴别NF-kB调节剂，其中猜想的调节剂来自哺乳动物寄生虫。寄生虫的种可以是，但不局限于沙门氏菌、支原体和衣原体。
本发明还涉及筛选TGFβ调节剂的方法，其包括向TGFβ激活的表达系统中加入猜想的调节剂，并单独向TGFβ激活的表达系统中添加对照物，由此通过改变TGFβ激活的表达的能力来鉴别TGFβ调节剂，其中猜想的调节剂来自哺乳动物寄生虫。TGFβ可以是潜伏的TGFβ。寄生虫的种可以是，但不局限于沙门氏菌、支原体和衣原体。
本发明还涉及筛选p53调节剂的方法，其包括向p53激活的表达系统中加入猜想的调节剂，并单独向p53激活的表达系统中添加对照物，由此通过改变p53激活的表达的能力来鉴别p53调节剂，其中猜想的调节剂来自哺乳动物寄生虫。寄生虫的种可以是，但不局限于沙门氏菌、支原体和衣原体。
本发明还涉及通过本文描述的任何一种方法鉴别的调节剂。本发明还涉及含有本文描述的调节剂的组合物。该组合物可以是含有药学上可接受剂量的本文所述调节剂的药学组合物。
本发明还涉及治疗癌症症的方法，其包括向需要治疗的患者投药含有增强凋亡的调节剂的药学组合物。
本发明还涉及从一种或多种诱导凋亡的治疗中保护患者的方法，其包括向所述患者投药含有抑制凋亡的调节剂的药物组合物。一种或多种治疗可以是肿瘤治疗。肿瘤治疗可以是化疗或放疗。
附图说明
图1表明在未感染细胞中沙门氏菌感染导致NF-kB核定位的发生。HT29细胞在玻璃盖片上生长，或者模拟感染，未处理的，用鼠鼠伤寒沙门氏菌感染的，或用TNFα(10ng/ml)处理的。组A：HT29细胞模拟感染或用从ssaH启动子表达GFP的鼠伤寒沙门氏菌株SjW1103G以100MOI感染，该启动子仅在感染的宿主细胞内有活性。使用明视场显微镜(BF)给细胞照相，如所述用免疫荧光检测GFP或DAPI。图像结合(叠加)揭示细胞被感染。组B：HT29细胞未处理、用鼠伤寒沙门氏菌株1103处理、或用TNFα处理。通过间接免疫荧光如所述监测在各种状态下NF-kB p65(RelA)的定位。使用明视场显微镜(BF)观察细胞，用DAPI染色细胞核，用FITC观察p65(RelA)。DAPI染色被误染成红色使得结合(叠加)显影更易被区别。
图2表示沙门氏菌培养液中的蛋白因子导致NF-kB激活。组A：如所示处理浓缩100倍的沙门氏柏林菌培养液，如所示用感染细菌激发HT29细胞。通过EMSA从处理45分钟后制备的全部细胞提取液中分析NF-kB DNA结合活性。用p65(RelA)-特异的和p50特异的抗体超迁移(supershifts)确定NF-kB DNA：蛋白质复合物的确实性(Authenticity)。组B：在Superose12柱上通过凝胶渗入色谱分析浓缩的沙门氏柏林菌培养液(IN)。在10％SDS-PAGE上通过分级法分析洗脱的蛋白部分，并用考马斯兰观察染色。显示出色谱分析和在凝胶上的分子量标记。如所示每级分的试样用于刺激HT29细胞，用用于NF-kBDNA结合活性的EMSA分析得到的WCEs。组C：在POROS HQ基质上通过阴离子交换色谱分析浓缩的沙门氏柏林菌培养液(IN)。如所示用增加浓度梯度的NaCl洗脱蛋白质，在10％SDS-PAGE上分析，并用考马斯兰(CB)染色观察。如所示每部分的输入和试样用于刺激HT29细胞，用用于NF-kB DNA结合活性的EMSA分析得到的WCEs。从复制的10％SDS-PAGE凝胶分离的蛋白带B1-B6和凝胶空白的相应洗脱物，与从最初和最终NaCl缓冲梯度液来源的缓冲液样品一起用于刺激HT29细胞，用用于NF-kB DNA结合活性的EMSA分析得到的WCEs。
图3表示如质谱测定法所鉴别的，沙门氏菌培养液中的NF-kB激活因子是鞭毛蛋白。用胰蛋白酶消化带2的微毛细管HPLC前后质谱测定。计数沙门氏菌肽相应的峰值，相应数字的肽序列在右侧被鉴定。
图4表示鞭毛蛋白突变不能激活NF-kB。组A：在未感染细胞(UN)、如所示用野生型大肠杆菌DH5α、野生型沙门氏柏林菌或SopE-突变、SopB-突变、SopE-/SopB-双突变、野生型鼠伤寒沙门氏菌1103、fliC-突变(fliC：：Tn10)、fliC-/fljB-双突变在MOI 50直接感染HT29细胞45分钟制备的WCEs中用EMSAs分析NF-kB DNA结合活性。组B：
从未感染细胞(UN)或用如所示的从野生型和突变细菌的无菌过滤的浓缩培养液激发HT29细胞后45分钟制备的WCEs中用EMSA法分析NF-kB DNA结合活性。
图5表示在沙门氏菌感染过程中需要鞭毛蛋白激活多种信号途径，从而导致NF-kB核定位。组A：未处理的HT29细胞，用TNFα(10ng/ml)或茴香霉素[An](20μg/ml)/PMA(12.5ng/ml)鸡尾酒刺激15分钟的HT29细胞，或如所述用野生型鼠伤寒沙门氏菌株1103或鼠伤寒沙门氏菌fliC-/fljB-双突变株134感染HT29细胞。在指定时间或TNF处理细胞10分钟或茴香霉素/PMA处理细胞15分钟时制备WCE，并用于EMSAs以分析NF-kB DNA结合活性，或用于使用抗IKK或抗IKK抗体的免疫激酶分析(KA)以测定在他们各自底物GST-IkBα1-54和GST-cJun1-79中IKK和IKK激酶活性(如所示)。每种提取物中相当量的蛋白质(40μg)的免疫印迹分析(IB)在SDS-PAGE凝胶上分级，并转膜到PVDF膜上，用所示抗体杂交以检测大多数IKK，JNK，ERK，和p38，如所示。使用ERK和p38的含磷的特异性抗体检测激活的ERK和p38的免疫印迹分析被显示。组B：免疫荧光分析，通过间接免疫荧光分析显示出鞭毛蛋白突变的沙门氏菌不能感染HT29细胞，HT29细胞的纯化的鞭毛蛋白刺激导致了NF-kB核p65(RelA)定位。处理的图像表明在盖玻片上生长的HT29细胞基本上与图1A和B相同。DAPI染色的假着色被用于增强DAPI染色的核和p65核定位的影响观察。
图6表明纯化的鞭毛蛋白激活信号途径以及模拟野生型沙门氏菌感染，在肠上皮细胞感染前基因表达。未处理的或用TNFα(10ng/ml)或用茴香霉素[An](20μg/ml)/PMA(12.5ng/ml)鸡尾酒10分钟处理的、或用鞭毛蛋白(1μg/ml)处理指定时间的HT29细胞。制备WCE，用EMSA分析其NF-kB DNA结合活性，用使用ERK或p38的含磷的特异性抗体的免疫激酶分析(KA)或免疫印迹分析检测活性，并用如图5A所示的激酶特异性抗体检测所示的大多数激酶含量。组A：检测NF-kB DNA结合活性的EMSA。组B：如图5A的检测IKK，JNK，ERK和p38激酶活性和蛋白含量的免疫印迹和激酶分析。组C：未处理的、野生型和鞭毛蛋白双突变鼠伤寒沙门氏菌感染的，TNFα(10ng/ml)或鞭毛蛋白(1mg/ml)刺激的细胞的感染前基因表达的半定量RT-PCR。在指定处理后的指定时间收集HT29细胞，用分离的RNA合成初始链cDNA，随后该cDNA用IL1α、IL1β、IL-8、TNFα、MCP1和β肌动蛋白的基因特异性引物的R T-P C R中。β肌动蛋白作为标准以标准化表达模式。得到的PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离，并用溴化二氨乙苯啡啶染色以便观察。
图7表示鞭毛蛋白介导的NF-kB的激活是MyD88依赖的。感染野生型沙门氏柏林菌(100MOI)，IL-1(20ng/ml)，纯化的鞭毛蛋白(1μl/ml)(如所示)，从野生型沙门氏柏林菌和SopE-/Sop B-双突变沙门氏柏林菌株SE1SB2(S2，如所示)的无菌过滤的和浓缩的100kDa的过滤滞留物上清(spt)被用于激发野生型、MyD88-/-缺失或TLR2-/-/TLR4-/-双缺失MEF，如所示。处理45分钟后制备WCEs，用EMSA检查以分析NF-kB DNA结合活性。用IL-2(20ng/ml)作为阳性对照以监控MyD88的功能。
图8表示TLR5抑制鞭毛蛋白介导的NF-kB受体基因活性。在6孔平板中转染HT29细胞，用指定的DN-TLR哺乳动物表达载体或反义TLR5(AS TLR5)(2μg/孔)、2XNF-kB Luc受体基因(100ng/孔)、pRL-TKRenilla荧光素酶用于标准化(50ng/孔)，与空的载体pCDNA3.1DNA调整至每孔DNA总量为4μg，重复三次。组A：在未刺激细胞(浅色阴影)和TNFα(10ng/ml)处理的细胞(深色阴影)中的2XNF-kB Luc受体基因的折叠诱导。刺激后12小时制备裂解液。图示出各自的试验结果。组B：用鞭毛蛋白(1μg/ml)处理如图8A转染的HT29细胞，制备裂解液，如图8A所示分析。图示出各自的试验结果。
图9表示小肠上皮细胞的鞭毛蛋白刺激导致了一系列的TLR基因激活。用鞭毛蛋白(1mg/ml)刺激HT29细胞，3小时后用Trizol分离RNA，并用该RNA合成第一链cDNA。图示出如所述用每种TLR基因特异性引物产生的RT-PCR产物。用β肌动蛋白作标准标准化表达模式。
图10表示在多种细胞类型中表达TLR5，其对鞭毛蛋白具有不同的反应。组A：从未刺激的T84、HT29、A549、HeLa、293T、T98G细胞制备全细胞提取液，在8％的SDS-PAGE凝胶上分离，将蛋白转移到PVDF膜上，用抗TLR5抗体杂交作免疫印迹分析(IB)。通过用抗肌动蛋白抗体杂交检测加入的蛋白量。组B：HT29、A549、HeLa、293T和T98G细胞未处理(——)、用鞭毛蛋白(F)处理或用TNFα(T)处理，45分钟后制备WCEs，并用于EMSA以监控NF-kB DNA的结合活性。用p65(RelA)特异抗体复合物的超迁移检测NF-kB带移位的确实性。
图11表示p53缺陷加速了小鼠中GI症状的发展。组A：腹腔注射PFTα(10mg/kg)从一次9Gy量的γ射线以及部分累积射线量12.5Gy(5X2.5Gy)中保护C57B1/6J小鼠(如果没有指明，此处和以下使用6-8周雄性小鼠)。对于一次受12.5和25GyIR的小鼠，PFTα在小鼠的生存上没有作用：(表示出各自的实验结果；以每分钟4Gy的剂量速率使用Shepherd4000Ci铯137辐射源)。组B：在对低剂量(10Gy)和高剂量(15Gy)的γ射线的相对敏感性上野生型和p53缺陷的C57B1/6J小鼠不同：与p53缺陷小鼠相比，野生型对10Gy更敏感，而对15Gy更有抗性。组C：用11Gy的全身γ射线处理小鼠，12小时后从野生型或p53缺陷的同源的C57B1/6J小鼠注射1.5X107骨髓细胞(此剂量在未重建(nonreconstituted)的对照组小鼠中引起100％的死亡率)。两个月后，造血功能完全恢复后，用全身γ射线量15Gy处理动物，表现骨髓p53状态不同的两组间的死亡率没有差别。组D：15Gyγ射线辐射后在指定的时间上野生型和p53缺陷小鼠的小肠损伤动力学的比较表明在p53缺陷小鼠中损伤加速(苏木素-曙红染色，石蜡切片；放大X125)。如果是阴窝切片，24h组包括TUNEL染色图片：厚重的凋亡在野生型很明显，而在p53缺陷上皮不明显。
图12表明在野生型和p53缺陷小鼠的小肠中细胞增殖和生存的动力学。组A：用IR处理后野生型和p53缺陷小鼠的小肠中增值率的比较。(左)用14C胸腺嘧啶脱氧核苷(每只动物10μCi)腹腔注射处理或未处理的4周龄野生型和p53缺陷小鼠用15Gyγ射线照射的放射自显影的全身切片(放大X1.7)(Westphal et al 1997)。箭头指小肠。(右)15Gyγ射线照射后在不同时间的野生型和p53缺陷小鼠小肠中BrdU结合的比较。在杀死小鼠前2小时注射BrdU(50mg/kg)，如前所述进行免疫染色(Watson & Pritchard 2000)。在更大倍数下(X400)表示96h组的片断。组B：15Gyγ射线照射后不同时间上在野生型和p53缺陷小鼠小肠中BrdU阳性细胞/阴窝数的比较。在每个时间点上分析3只动物，从每个动物中制备5个回肠横切片，用显微镜分析，以评估阴窝和绒毛数。在X200放大倍数下(100-30阴窝)在5个随机的视野下计数阴窝中的BrdU阳性细胞数，用BrdU阳性细胞平均值作图。组C：15Gyγ射线照射后不同时间上在野生型和p53缺陷小鼠小肠中追踪BrdU标记细胞的数量和位置。照射前30注射BrdU，在指定时间处死小鼠。在p53-缺陷小鼠中观察到从阴窝向绒毛的加速迁移，及随后的标记细胞的快速消失。
图13表明重组鞭毛蛋白能激活NF-kB。
图14显示了检测鞭毛蛋白从辐射中保护小鼠的各种试验。向C56BL6小鼠(6周龄，雄性)，每组10只静脉注射2.0μg(0.1mg/kg)或5.0μg(0.25mg/kg)溶于PBS的鞭毛蛋白。四小时后，用15Gy照射小鼠，每天检测小鼠的生存。
图15显示静脉注射或未注射0.25mg/kg的鞭毛蛋白的小鼠用15Gyγ射线处理后的小肠上皮组织切片(HE染色)。与鞭毛蛋白处理的小鼠的接近正常的组织形态学相比，对照组小鼠的隐窝和绒毛有完全的损伤。
图16显示鞭毛蛋白在小鼠对全身γ射线量10Gy的敏感性中的作用。
图17显示在小鼠对全部体重γ射线量13Gy(左)和10Gy(右)的敏感性中照射前在指定时间静脉注射鞭毛蛋白的作用。
图18显示鞭毛蛋白在小鼠对全部体重γ射线量10，13和15Gy的敏感性中的作用。
图19显示细菌鞭毛蛋白的结构域结构。F41和Ca骨架痕迹、疏水核心分布的结构信息。四个不同的疏水核心是D1、D2a、D2b、和D3。所有的疏水侧链原子用Ca骨架显示。侧链原子用颜色的标记：Ala，黄色；Leu，Ile，或Val，橙色；Phe和Tyr，紫色(碳链)和红色(氧原子)。C，鞭毛蛋白氨基酸序列中的不同结构特性的位置和结构域。如所示，从上到下：F41片段用蓝色表示；三个b-薄层折叠为褐色；有螺旋的二级结构分布为黄色；b-结构为绿色，b-折转为紫色；每50个残基的tic标记为蓝色；D0，D1，D2，D3结构域；在第一元素中的轴向亚单位接触区为青色；高度保守的氨基酸序列为红色，变异区为紫罗兰色；F41区的点突变产生不同的超盘绕元素。底下的字母表示突变元素的形态学：L(D107E，R124A，R124S，G426A)，L-型直链；R(A449V)，R-型直链；C(D313Y，A414V，A427V，N433D)，弯曲的33。(Samatey等Nature，2001)。
图2表示沙门氏菌培养液中的蛋白因子导致NF-kB激活。组A：如所示处理浓缩100倍的沙门氏柏林菌培养液，如所示用感染细菌激发HT29细胞。通过EMSA从处理45分钟后制备的全部细胞提取液中分析NF-kB DNA结合活性。用p65(RelA)-特异的和p50特异的抗体超迁移(supershifts)确定NF-kB DNA：蛋白质复合物的确实性(Authenticity)。组B：在Superose12柱上通过凝胶渗入色谱分析浓缩的沙门氏柏林菌培养液(IN)。在10％SDS-PAGE上通过分级法分析洗脱的蛋白部分，并用考马斯兰观察染色。显示出色谱分析和在凝胶上的分子量标记。如所示每级分的试样用于刺激HT29细胞，用用于NF-kBDNA结合活性的EMSA分析得到的WCEs。组C：在POROS HQ基质上通过阴离子交换色谱分析浓缩的沙门氏柏林菌培养液(IN)。如所示用增加浓度梯度的NaCl洗脱蛋白质，在10％SDS-PAGE上分析，并用考马斯兰(CB)染色观察。如所示每部分的输入和试样用于刺激HT29细胞，用用于NF-kB DNA结合活性的EMSA分析得到的WCEs。从复制的10％SDS-PAGE凝胶分离的蛋白带B1-B6和凝胶空白的相应洗脱物，与从最初和最终NaCl缓冲梯度液来源的缓冲液样品一起用于刺激HT29细胞，用用于NF-kB DNA结合活性的EMSA分析得到的WCEs。
图3表示如质谱测定法所鉴别的，沙门氏菌培养液中的NF-kB激活因子是鞭毛蛋白。用胰蛋白酶消化带2的微毛细管HPLC前后质谱测定。计数沙门氏菌肽相应的峰值，相应数字的肽序列在右侧被鉴定。
图4表示鞭毛蛋白突变不能激活NF-kB。组A：在未感染细胞(UN)、如所示用野生型大肠杆菌DH5α、野生型沙门氏柏林菌或SopE-突变、SopB-突变、SopE-/SopB-双突变、野生型鼠伤寒沙门氏菌1103、fliC-突变(fliC：：Tn10)、fliC-/fljB-双突变在MOI 50直接感染HT29细胞45分钟制备的WCEs中用EMSAs分析NF-kB DNA结合活性。组B：
从未感染细胞(UN)或用如所示的从野生型和突变细菌的无菌过滤的浓缩培养液激发HT29细胞后45分钟制备的WCEs中用EMSA法分析NF-kB DNA结合活性。
图5表示在沙门氏菌感染过程中需要鞭毛蛋白激活多种信号途径，从而导致NF-kB核定位。组A：未处理的HT29细胞，用TNFα(10ng/ml)或茴香霉素[An](20μg/ml)/PMA(12.5ng/ml)鸡尾酒刺激15分钟的HT29细胞，或如所述用野生型鼠伤寒沙门氏菌株1103或鼠伤寒沙门氏菌fliC-/fljB-双突变株134感染HT29细胞。在指定时间或TNF处理细胞10分钟或茴香霉素/PMA处理细胞15分钟时制备WCE，并用于EMSAs以分析NF-kB DNA结合活性，或用于使用抗IKK或抗IKK抗体的免疫激酶分析(KA)以测定在他们各自底物GST-IkBα1-54和GST-cJun1-79中IKK和IKK激酶活性(如所示)。每种提取物中相当量的蛋白质(40μg)的免疫印迹分析(IB)在SDS-PAGE凝胶上分级，并转膜到PVDF膜上，用所示抗体杂交以检测大多数IKK，JNK，ERK，和p38，如所示。使用ERK和p38的含磷的特异性抗体检测激活的ERK和p38的免疫印迹分析被显示。组B：免疫荧光分析，通过间接免疫荧光分析显示出鞭毛蛋白突变的沙门氏菌不能感染HT29细胞，HT29细胞的纯化的鞭毛蛋白刺激导致了NF-kB核p65(RelA)定位。处理的图像表明在盖玻片上生长的HT29细胞基本上与图1A和B相同。DAPI染色的假着色被用于增强DAPI染色的核和p65核定位的影响观察。
图6表明纯化的鞭毛蛋白激活信号途径以及模拟野生型沙门氏菌感染，在肠上皮细胞感染前基因表达。未处理的或用TNFα(10ng/ml)或用茴香霉素[An](20μg/ml)/PMA(12.5ng/ml)鸡尾酒10分钟处理的、或用鞭毛蛋白(1μg/ml)处理指定时间的HT29细胞。制备WCE，用EMSA分析其NF-kB DNA结合活性，用使用ERK或p38的含磷的特异性抗体的免疫激酶分析(KA)或免疫印迹分析检测活性，并用如图5A所示的激酶特异性抗体检测所示的大多数激酶含量。组A：检测NF-kB DNA结合活性的EMSA。组B：如图5A的检测IKK，JNK，ERK和p38激酶活性和蛋白含量的免疫印迹和激酶分析。组C：未处理的、野生型和鞭毛蛋白双突变鼠伤寒沙门氏菌感染的，TNFα(10ng/ml)或鞭毛蛋白(1mg/ml)刺激的细胞的感染前基因表达的半定量RT-PCR。在指定处理后的指定时间收集HT29细胞，用分离的RNA合成初始链cDNA，随后该cDNA用IL1α、IL1β、IL-8、TNFα、MCP1和β肌动蛋白的基因特异性引物的R T-P C R中。β肌动蛋白作为标准以标准化表达模式。得到的PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离，并用溴化二氨乙苯啡啶染色以便观察。
图7表示鞭毛蛋白介导的NF-kB的激活是MyD88依赖的。感染野生型沙门氏柏林菌(100MOI)，IL-1(20ng/ml)，纯化的鞭毛蛋白(1μl/ml)(如所示)，从野生型沙门氏柏林菌和SopE-/Sop B-双突变沙门氏柏林菌株SE1SB2(S2，如所示)的无菌过滤的和浓缩的100kDa的过滤滞留物上清(spt)被用于激发野生型、MyD88-/-缺失或TLR2-/-/TLR4-/-双缺失MEF，如所示。处理45分钟后制备WCEs，用EMSA检查以分析NF-kB DNA结合活性。用IL-2(20ng/ml)作为阳性对照以监控MyD88的功能。
图8表示TLR5抑制鞭毛蛋白介导的NF-kB受体基因活性。在6孔平板中转染HT29细胞，用指定的DN-TLR哺乳动物表达载体或反义TLR5(AS TLR5)(2μg/孔)、2XNF-kB Luc受体基因(100ng/孔)、pRL-TKRenilla荧光素酶用于标准化(50ng/孔)，与空的载体pCDNA3.1DNA调整至每孔DNA总量为4μg，重复三次。组A：在未刺激细胞(浅色阴影)和TNFα(10ng/ml)处理的细胞(深色阴影)中的2XNF-kB Luc受体基因的折叠诱导。刺激后12小时制备裂解液。图示出各自的试验结果。组B：用鞭毛蛋白(1μg/ml)处理如图8A转染的HT29细胞，制备裂解液，如图8A所示分析。图示出各自的试验结果。
图9表示小肠上皮细胞的鞭毛蛋白刺激导致了一系列的TLR基因激活。用鞭毛蛋白(1mg/ml)刺激HT29细胞，3小时后用Trizol分离RNA，并用该RNA合成第一链cDNA。图示出如所述用每种TLR基因特异性引物产生的RT-PCR产物。用β肌动蛋白作标准标准化表达模式。
图10表示在多种细胞类型中表达TLR5，其对鞭毛蛋白具有不同的反应。组A：从未刺激的T84、HT29、A549、HeLa、293T、T98G细胞制备全细胞提取液，在8％的SDS-PAGE凝胶上分离，将蛋白转移到PVDF膜上，用抗TLR5抗体杂交作免疫印迹分析(IB)。通过用抗肌动蛋白抗体杂交检测加入的蛋白量。组B：HT29、A549、HeLa、293T和T98G细胞未处理(——)、用鞭毛蛋白(F)处理或用TNFα(T)处理，45分钟后制备WCEs，并用于EMSA以监控NF-kB DNA的结合活性。用p65(RelA)特异抗体复合物的超迁移检测NF-kB带移位的确实性。
图11表示p53缺陷加速了小鼠中GI症状的发展。组A：腹腔注射PFTα(10mg/kg)从一次9Gy量的γ射线以及部分累积射线量12.5Gy(5X2.5Gy)中保护C57B1/6J小鼠(如果没有指明，此处和以下使用6-8周雄性小鼠)。对于一次受12.5和25GyIR的小鼠，PFTα在小鼠的生存上没有作用：(表示出各自的实验结果；以每分钟4Gy的剂量速率使用Shepherd4000Ci铯137辐射源)。组B：在对低剂量(10Gy)和高剂量(15Gy)的γ射线的相对敏感性上野生型和p53缺陷的C57B1/6J小鼠不同：与p53缺陷小鼠相比，野生型对10Gy更敏感，而对15Gy更有抗性。组C：用11Gy的全身γ射线处理小鼠，12小时后从野生型或p53缺陷的同源的C57B1/6J小鼠注射1.5X107骨髓细胞(此剂量在未重建(nonreconstituted)的对照组小鼠中引起100％的死亡率)。两个月后，造血功能完全恢复后，用全身γ射线量15Gy处理动物，表现骨髓p53状态不同的两组间的死亡率没有差别。组D：15Gyγ射线辐射后在指定的时间上野生型和p53缺陷小鼠的小肠损伤动力学的比较表明在p53缺陷小鼠中损伤加速(苏木素-曙红染色，石蜡切片；放大X125)。如果是阴窝切片，24h组包括TUNEL染色图片：厚重的凋亡在野生型很明显，而在p53缺陷上皮不明显。
图12表明在野生型和p53缺陷小鼠的小肠中细胞增殖和生存的动力学。组A：用IR处理后野生型和p53缺陷小鼠的小肠中增值率的比较。(左)用14C胸腺嘧啶脱氧核苷(每只动物10μCi)腹腔注射处理或未处理的4周龄野生型和p53缺陷小鼠用15Gyγ射线照射的放射自显影的全身切片(放大X1.7)(Westphal et al 1997)。箭头指小肠。(右)15Gyγ射线照射后在不同时间的野生型和p53缺陷小鼠小肠中BrdU结合的比较。在杀死小鼠前2小时注射BrdU(50mg/kg)，如前所述进行免疫染色(Watson & Pritchard 2000)。在更大倍数下(X400)表示96h组的片断。组B：15Gyγ射线照射后不同时间上在野生型和p53缺陷小鼠小肠中BrdU阳性细胞/阴窝数的比较。在每个时间点上分析3只动物，从每个动物中制备5个回肠横切片，用显微镜分析，以评估阴窝和绒毛数。在X200放大倍数下(100-30阴窝)在5个随机的视野下计数阴窝中的BrdU阳性细胞数，用BrdU阳性细胞平均值作图。组C：15Gyγ射线照射后不同时间上在野生型和p53缺陷小鼠小肠中追踪BrdU标记细胞的数量和位置。照射前30注射BrdU，在指定时间处死小鼠。在p53-缺陷小鼠中观察到从阴窝向绒毛的加速迁移，及随后的标记细胞的快速消失。
图13表明重组鞭毛蛋白能激活NF-kB。
图14显示了检测鞭毛蛋白从辐射中保护小鼠的各种试验。向C56BL6小鼠(6周龄，雄性)，每组10只静脉注射2.0μg(0.1mg/kg)或5.0μg(0.25mg/kg)溶于PBS的鞭毛蛋白。四小时后，用15Gy照射小鼠，每天检测小鼠的生存。
图15显示静脉注射或未注射0.25mg/kg的鞭毛蛋白的小鼠用15Gyγ射线处理后的小肠上皮组织切片(HE染色)。与鞭毛蛋白处理的小鼠的接近正常的组织形态学相比，对照组小鼠的隐窝和绒毛有完全的损伤。
图16显示鞭毛蛋白在小鼠对全身γ射线量10Gy的敏感性中的作用。
图17显示在小鼠对全部体重γ射线量13Gy(左)和10Gy(右)的敏感性中照射前在指定时间静脉注射鞭毛蛋白的作用。
图18显示鞭毛蛋白在小鼠对全部体重γ射线量10，13和15Gy的敏感性中的作用。
图19显示细菌鞭毛蛋白的结构域结构。F41和Ca骨架痕迹、疏水核心分布的结构信息。四个不同的疏水核心是D1、D2a、D2b、和D3。所有的疏水侧链原子用Ca骨架显示。侧链原子用颜色的标记：Ala，黄色；Leu，Ile，或Val，橙色；Phe和Tyr，紫色(碳链)和红色(氧原子)。C，鞭毛蛋白氨基酸序列中的不同结构特性的位置和结构域。如所示，从上到下：F41片段用蓝色表示；三个b-薄层折叠为褐色；有螺旋的二级结构分布为黄色；b-结构为绿色，b-折转为紫色；每50个残基的tic标记为蓝色；D0，D1，D2，D3结构域；在第一元素中的轴向亚单位接触区为青色；高度保守的氨基酸序列为红色，变异区为紫罗兰色；F41区的点突变产生不同的超盘绕元素。底下的字母表示突变元素的形态学：L(D107E，R124A，R124S，G426A)，L-型直链；R(A449V)，R-型直链；C(D313Y，A414V，A427V，N433D)，弯曲的33。(Samatey等Nature，2001)。
具体实施方式
本发明是基于从由压力引起的凋亡中保护正常的细胞和组织的，该压力包括，但不局限于，化疗、放疗和辐射。在细胞中有两个主要的调控凋亡的机制：p53路径(前凋亡)和NF-kB途径(抗凋亡)。两种途径在肿瘤中通常都不受控制：p53通常缺失，而NF-kB变得组成型激活。因此，在正常细胞中抑制p53和激活NF-kB可以防止其被压力引起的死亡，如肿瘤治疗，但并不会使肿瘤细胞对抗治疗，因为这些控制机制不受控制了。这与传统的p53和NF-kB的观念相反，传统认为p53和NF-kB应分别被激活和抑制。
本发明涉及诱导NF-kB的活性，以从凋亡中保护正常细胞。通过在哺乳动物中诱导NF-kB的活性，可以从细胞压力和细胞老化造成的凋亡中保护正常细胞，该压力发生在肿瘤治疗和极高热中；暴露于有害剂量的射线，如核能厂、国防工业或放射药物生产的工人，士兵。在许多肿瘤细胞中，由于NF-kB是组成型被激活的，诱导NF-kB活性可以从凋亡中保护细胞，而对肿瘤细胞没有益处。一旦正常细胞被修复，NF-kB活性可恢复到正常水平。NF-kB活性可被诱导以保护此种放疗和化疗敏感组织，如造血系统(包括免疫系统)，内脏上皮和毛囊。
NF-kB活性诱导子还可用于各种其他的应用。哺乳动物暴露于各种严重状态引起的病理后果和死亡可来源于对压力反应的正常生理机制的激活，这些状态包括但不局限于，射线、创伤、中毒、感染、老化、和高温应激，该生理机制的激活如诱导渐进的细胞死亡(凋亡)或释放生物活性蛋白，细胞因子。
凋亡通常具有从创伤或遗传上损伤的细胞中“清理”组织的功能，而细胞因子可动员生物体的防御系统对抗病源。可是在严重损伤的状态下，两种压力反应自身可引起死亡。例如，射线导致的死亡可来源于发生在造血、免疫和消化系统的大量p53介导的凋亡。合理的药物调节NF-kB可在严重的压力下增强生存。控制这些因子可允许对损伤器官中的细胞炎症反应和生死抉择进行控制。
NF-kB的保护作用可通过多种基因的转录激活调节，这些基因编码：a)阻断两种主要凋亡途径的抗凋亡蛋白，b)诱导HP和其他干细胞增殖和生存的细胞因子和生长因子，和c)潜伏的ROS-清扫抗过氧化蛋白，如MnSOD(SOD-2)。因此，通过NF-kB短暂激活的辐射防护，不仅仅可以实现肿瘤患者的凋亡抑制，由于同时发生的免疫刺激作用，还可以降低二级癌症症发生率的可能性，如果通过激活Toll类似受体而实现NF-kB被激活。
作为靶，NF-kB途径的另一个吸引特性是其被认为是辐射防护剂的多种天然因子激活。其中，有多种病源相关的分子类型(PAMPs)。PAMPs是宿主生物体中不存在的分子，其特征是病源的大组，不容易突变。他们被Toll类似受体(TLRs)识别，Toll类似受体是内在免疫的主要感受器成分。TLRs直接地或通过细胞因子的释放诱导免疫细胞的迁移或激活，可作为免疫系统的初级警告机制。TLRs是I型膜蛋白，作为同或异二聚物发挥作用。与配体结合后，TLRs募集MyD88蛋白，对于多数TLRs，MyD88蛋白是不可缺少的信号转接器。随后的信号系列产生的作用包括(i)激活NF-kB途径，(ii)激活MAPKs，包括Jun N-末端激酶(JNK)。Toll-类受体配体激活的NF-kB途径产生了作为潜伏辐射防护剂的配体吸引物。不像细胞因子，许多PAMPs除激活TLRs外没什么作用，因此不产生副作用。而且，许多PAMPs存在于人类。
与其免疫细胞的激活功能一致，所有的TLRs在脾和外周血白细胞中表达，在其他的淋巴器官和白细胞系中具有更多的TLR特异模式表达。可是，TLRs也表达在身体的其他组织和器官，如TLR1广范表达，TLR5也表达在GI上皮和内皮，TLRs2、6、7、8已知在肺表达。
1.定义
应当理解此处使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例而不是限制本发明。必须注意，如说明书和权利要求中所使用的，单数“a”“an”和“the”除非特别指明，包括多重指代的含义。
在本文使用的术语“给药”，当用于描述诱导NF-kB活性的制剂的剂量时，指该制剂的一次或多次给药剂量。
在本文使用的术语“类似物”，当用于肽或多肽的上下文时，指包含一种或多种非标准氨基酸或传统氨基酸的其他结构变异的肽或多肽。
在本文使用的术语“抗体”指IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE类抗体，或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab’)2、Fd和单链抗体、微型双功能抗体、双特异抗体、双功能抗体、及其衍生物。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、亲和力纯化的抗体、或其混合物，其呈现出对相关抗原决定簇或其衍生的序列的足够的特异性结合。抗体还可以是嵌合的抗体。可以通过一种或多种本领域已知的化学的、肽或多肽半族的连接衍生出抗体。抗体还可以与化学半族连接。
本文中使用的“凋亡”指细胞死亡的形式，包括胞内细胞器完整性保存而细胞体积的渐进收缩；如光镜或电镜观察到的染色体浓缩(即核浓缩)；和/或DNA断裂成核小体大小的片段，如离心沉淀分析所确定的。细胞死亡发生在细胞膜完整性缺失时(如膜泡)，完整的细胞片段(凋亡小体)被巨噬细胞吞胞(engulfment)。
本文中使用的术语“癌症”指任何一种特征为对抗凋亡刺激的状态。
本文使用的术语“癌症治疗”指任何本领域中已知的治疗癌症的方法，包括但不局限于化疗和放疗。
本文的术语“与结合”用于描述投药诱导NF-kB活性的制剂和额外的治疗时，在额外的治疗前、与其一同或在其后或与其结合给药。
本文的术语“衍生物”，当用于肽或多肽的上下文时，指不同于初级结构(氨基酸或氨基酸类似物)的肽或多肽。通过描述，衍生物可以通过糖基化、转录后修饰的一种方式而不同。例如肽或多肽由于在异种系统表达可以展现糖基化模式。如果保留至少一种生物学活性，那么这些肽或多肽是根据本发明的衍生物。其他衍生物包括但不局限于具有共价修饰的N-或C-末端的融合肽或融合多肽，PEG化的(PEGylated)肽和多肽，与脂质半族相关的肽或多肽、烷基化的肽或多肽、通过氨基侧链功能组与其它肽、多肽或化学物连接的肽或多肽，本领域中应该理解的额外的修饰。
本文中的术语“鞭毛蛋白”指的是任何来源的鞭毛蛋白，包括但不局限于任何细菌种。鞭毛蛋白可以是沙门氏菌种。还可以特异地是所述鞭毛蛋白的片段、变异、类似物、同源物、或衍生物及其结合。此处所述的各种片段、变异、类似物、同源物、或衍生物可以与野生型鞭毛蛋白具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的同一性。
本文的术语“片段”，当用于肽或多肽的上下文时，指8-50个氨基酸长度的肽。片段的长度可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个氨基酸。
本文中的术语“同源物”，当用于肽或多肽的上下文时，指享有共同进化祖先的肽或多肽。
本文的术语“潜伏的TGFβ”指不具活性的TGFβ前体。潜伏的TGFβ可以是含有活性TGFβ和潜伏相关肽(LAP)的TGFβ前体。潜伏的TGFβ还可以含有连接到潜伏的TGFβ结合蛋白的LAP。潜伏的TGFβ还可以是大的潜伏的复合物。进一步，潜伏的TGFβ可以被修饰的潜伏的TGFβ，从而转染成活性TGFβ的速率或转染成TGFβ的能力降低。被修饰的潜伏的TGFβ可以是，例如，防止或降低转染为活性TGFβ的TGFβ变异。
本文的术语“TGFβ”指任何活性或潜伏的TGFβ的异构体，包括但不局限于TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4、或TGFβ5及其组合。还可以特异地指所述TGFβ异构体的片段、变异、类似物、同源物、或衍生物，及其组合。此处所述的各种片段、变异、类似物、同源物、或衍生物可以与TGFβ异构体具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的同一性。
此处所述的术语“治疗”或“治疗”，当指从状态中保护哺乳动物时，意味着保护、抑制、压制或清除状态。保护状态包括在状态发生前向哺乳动物投药本发明的组合物。抑制状态涉及在状态诱导后但在临床症状前向哺乳动物投药本发明的组合物。压制状态涉及临床症状出现后向哺乳动物投药本发明的组合物使此状态降低或维持。消除状态涉及临床症状出现后向哺乳动物投药本发明的组合物使哺乳动物不再遭受此种状态。
如此处所述，术语“肿瘤细胞”指对抗凋亡刺激的任何细胞。
如此处所述，术语“变异”当在肽或多肽的上下文时，指通过氨基酸的插入、缺失或保守性替代使肽或多肽的氨基酸序列不同，但保留了至少一种生物功能。为了本发明的目的，“生物活性”包括，但不局限于通过特异抗体的结合能力。氨基酸的保守替代，即，用具有相似特性的不同氨基酸取代(如，亲水性、带电区的程度和分布)的氨基酸可被本领域中作所识别典型地涉及较小变化。这些小变化可部分地通过考虑氨基酸的疏水指数鉴别，如本领域中已知的。Kyte等J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的疏水指数是以考虑它的疏水性和电荷为基础的。本领域中已知相似疏水指数的氨基酸可被取代，仍保留蛋白功能。在一方面，疏水指数2的氨基酸被取代。氨基酸的疏水性还可被用于揭示可导致蛋白质保持功能的取代基。在肽中大部分氨基酸的疏水性可允许计算该肽的最大局部平均疏水性，其是一个有用的指数，被报道与抗原性和免疫原性有关。美国专利No.4554101在此引入作参考。具有相似疏水性值的氨基酸取代可使肽保留生物活性，例如免疫原性，如本领域中知道的。在一方面，用亲水性相差±2的氨基酸中进行取代。氨基酸的疏水性和亲水性指数都受该氨基酸特定的侧链的影响。与此观察相一致的，与生物功能一致的氨基酸取代被认为是依赖氨基酸的相对相似性，特别是这些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小、和其他特性所揭示的。
2.治疗方法
a.组成型地激活的NF-kB肿瘤
本发明涉及治疗遭受组成型地激活NF-kB癌症症的哺乳动物的治疗，包括向哺乳动物投药含有治疗潜伏剂量的诱导NF-kB活性的制剂。诱导NF-kB活性的制剂可以与肿瘤治疗物联合给药。
该制剂可以与其它抗肿瘤治疗如化疗或放疗同时或分次(metronomically)给药。此处的术语“同时”或“同时地”指其它抗肿瘤治疗和本发明的化合物在48小时、优选24小时、更优选12小时、更优选6小时、最优选3小时或更少时间的间隔。此处的术语“分次”指与化疗在不同的时间内，以某种相对重复给药和/或化疗方案的频率给药。
可以在任何暴露于肿瘤治疗前的时间点上给药，包括但不局限于暴露前48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小时。可以在任何肿瘤治疗后的时间点上给药，包括但不局限于暴露后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小时。
肿瘤治疗可以包括给药细胞毒性制剂或抑制细胞的制剂，或其结合。细胞毒性制剂防止癌症细胞增殖，其通过：(1)干扰细胞复制DNA的能力(2)诱导癌症细胞中的细胞死亡或凋亡。抑制细胞的制剂通过调节、干扰或抑制细胞信号传导的过程发挥作用，其调节细胞增殖有时在低的持续水平。
可作为细胞毒性剂的化合物种类包括：烷化剂(包括但不局限于氮芥子气、次乙亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、和三氮烯)：尿嘧啶芥子气、氮芥、环磷酰胺(Cytoxan)、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙烯基-三聚氰胺、三乙烯基硫磷酰胺、白消安、卡氯芥、环己亚硝脲、链脲霉素、达卡巴嗪、和蒂清；抗代谢物(包括但不局限于叶酸抗体、嘧啶类似物、嘌呤类似物、和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脲苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨磷酸盐、pentostatine、和gemcitabine；天然产品及其衍生物(例如，长春蔓生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和鬼臼毒素)：长春碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、放线菌素D、正定霉素、阿霉素、epirubicin、柔红霉素、阿糖胞苷、泰素(泰素在商售上为Taxol)，光神霉素、去氧间型霉素、丝裂霉素-C、1-天冬酰胺酶、干扰素(优选IFN-α)、足叶乙甙和替尼泊苷。
其他的增生的细胞毒制剂是navelbene、CPT-11、阿那曲唑、来曲唑、吉西他滨、reloxafine、环磷酰胺、异环磷酰胺和droloxafine。
影响微管的制剂干扰细胞有细分裂，于是产生了本领域熟知的细胞毒性。用于本发明的影响微管的制剂包括，但不局限于allocolchicine(NSC406042)、halichondrinB(NSC609395)、秋水仙碱(NSC757)、秋水仙碱衍生物(如NSC33410)、dolastatin10(NSC376128)、美登素(NSC153858)、rhizoxin(NSC332598)、paclitaxel(Taxol，NSC125973)、Taxol衍生物(如，衍生物(如NSC608832)，thiocolchicine NSC361792)、三苯甲半胱氨酸(NSC83265)、长春碱硫酸盐(NSC49842)、长春新碱硫酸盐(NSC67574)、天然和合成的埃坡霉素，包括但不局限于埃坡霉素A、埃坡霉素B和discodermolide(见Service，(1996)Science，274：2009)磷雌氮芥、nocodazole、MAP4等等。这些制剂的例子也描述在Bulinski(1997)J Cell Sci 110：3055-3346；Panda(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：10560-10564；Muhlradt(1997)Cancer Res.57：3344-3346；Nicolaou(1997)Nature 387：268-272；Vasquez(1997)Mol Biol Cell 8：973-985；和Panda(1996)JBiolChem271：29807-29812。
另外适合的细胞毒制剂还有epidophyllotoxin；抗新生物酶；topoisomerase抑制剂；甲基苄肼；米托蒽醌；铂联合复合物如顺式铂和炭铂；生物反应调节剂；生长抑制剂；抗激素治疗剂；亚叶酸；恩世康；和造血生长因子。
细胞生长抑剂可以包括但不局限于激素和类固醇(包括合成的类似物)：17α炔雌醇、己烯雌酚、睾丸激素、强的松、氟羚甲基睾丸素、屈他雄酮丙酸盐、睾丸激素、甲地孕酮、甲基脱氢皮质甾醇、甲基睾丸激素、脱氢皮质甾醇、去炎松、hlorotrianisene、羟孕酮、氨基导眠能、磷雌氮芥、安宫黄体酮醋酸盐、醋酸亮丙瑞林、氟化酰胺、托瑞米芬、诺雷德。
其他的细胞生长抑剂是抗血管生成剂，如矩阵金属蛋白酶抑制剂、和其他的VEGF抑制剂，如抗VEGF抗体和小分子如ZD6474和SU6668页包括在内。Genetech的抗Her2抗体也可以被使用。一种合适的EGFR抑制剂是EKB-569(不可逆的抑制剂)。还包括对EGFR具免疫特异性的Imclone抗体C225和src抑制剂。
作为细胞生长抑剂的合适的制剂还包括Casodex(bicalutamide，Astra Zeneca)，其提供了男性激素依赖的癌症非增殖。依然另外一种细胞生长抑剂的例子是男性激素Tamoxifen，其抑制雌激素依赖的乳腺癌症的增殖或生长。细胞增殖信号传导的抑制剂是细胞生长抑剂。代表的例子包括表皮生长因子抑制剂、Her-2抑制剂、MEK-1激酶抑制剂、MAPK激酶抑制剂、PI3抑制剂、Src激酶抑制剂、和PDGF抑制剂。
可以根据本发明治疗各种肿瘤，包括但不局限于膀胱(包括加速的和转移的膀胱癌症)，乳腺、结肠(包括结肠直肠癌症)，肾，肝脏，肺(包括小和非小细胞肺癌症和肺腺癌症)，卵巢，前列腺，睾丸，泌尿生殖道，淋巴系统，直肠，喉，胰腺(包括外分泌胰腺癌症)，食管，胃，胆囊，子宫，甲状腺，和皮肤(包括鳞状细胞癌症)；淋巴血系的造血系统癌症，包括白血病，急性淋巴细胞白血病，急性淋巴母细胞白血病，B-细胞淋巴瘤，T-细胞淋巴瘤，赫杰森氏病，非赫杰森氏淋巴瘤，毛细胞淋巴瘤，组织细胞淋巴瘤，和Burketts淋巴瘤；骨髓血系的造血肿瘤，包括急、慢性髓性白血病，再生障碍性疾病，骨髓白血病和原髓细胞白血病；中枢和周围神经系统肿瘤包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、和雪旺氏细胞瘤；间叶细胞来源的肿瘤包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其他的肿瘤包括黑素瘤、xenodermapigmentosum、keratoactanthoma、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌症、畸胎癌症。在一个优选的实施例中，本发明用于治疗胃肠道肿瘤。
B肿瘤治疗副作用的治疗
本发明还涉及哺乳动物的治疗方法，该哺乳动遭受组成型活性NF-kB癌症症治疗所引起的正常组织损伤，该方法包括向哺乳动物投药含有治疗潜伏量的诱导NF-kB活性的制剂的组合物。诱导NF-kB活性的制剂可以与上述肿瘤治疗联合给药。
C细胞老化的调节
本发明还涉及在哺乳动物中调节细胞老化的方法，其包括向哺乳动物投药含有治疗潜伏量的诱导NF-kB活性的制剂的组合物。诱导NF-kB活性的制剂可以其他治疗联合给药。
该制剂可以在其它治疗前任何时间给药，包括但不局限于48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小时。该制剂可以在其它治疗后任何时间给药，包括但不局限于给药后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小时。
D治疗压力
本发明还涉及治疗压力引起的正常组织损伤的的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物投药含有治疗潜伏量的诱导NF-kB活性的制剂的组合物。诱导NF-kB活性的制剂可以其他治疗联合给药。压力可以来源于任何原因，包括但不局限于射线、创伤、中毒、感染、和高热应激。
含有NF-kB诱导剂的组合物可以在暴露于压力前的任何时间给药，包括但不局限于48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小时。含有NF-kB诱导剂的组合物可以在暴露于压力后的任何时间给药，包括但不局限于压力后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小时。
E放射
本发明还涉及从射线暴露中保护细胞的方法。离子辐射造成的正常细胞的损伤和死亡是对受射细胞的直接放射诱导的损伤和对涉线诱导压力的活性遗传性渐进的细胞反应共同导致的死亡或凋亡。在许多放射敏感的器官中凋亡在细胞缺失中起重要作用(即，造血和免疫系统，消化道上皮等)，其衰竭确定了生物体一般的放射敏感性。
对离子射线的暴露(IR)可以是短期的或长期的，可以是一次或多次剂量，可以是全身或局部。因此，核事故或军事攻击可涉及全身暴露于一次的高剂量射线(有时随后有长期的放射性同位素中毒)。对于骨髓移植患者的预处理也是同样(其严格控制使用的量)，当有必要为供体骨髓准备造血器官时，从受体血前体中“清除”他们。肿瘤治疗可涉及多次剂量的局部放射，如果全身放射，则其大大超过了致死量。放射性同位素的中毒和治疗导致了靶器官长期局部暴露于射线(如，125I吸入的情况的甲状腺)。最后，有许多离子射线的物理形式在其生物作用的严重性中显著不同。
在分子和细胞水平，放射粒子能产生DNA、蛋白质、细胞膜和其他大分子结构的断裂和交联。离子射线还可以通过增加自由基和活性氧种(ROS)诱导细胞成分的二级损伤。多种修复系统对抗此损伤，如恢复DNA完整性和保真度的许多DNA修复途径，清除自由基和ROS及减少被氧化的蛋白和脂质的抗氧化化学物和酶。细胞检测系统检测DNA损伤和延长细胞周期性进展，直至损伤恢复或决定细胞生长停滞或渐进性细胞死亡(凋亡)。
射线可以引起哺乳动物器官损伤，从野生型突变和低剂量的致癌症作用到几乎导致死亡的高剂量。生物体的整个放射敏感性通过许多敏感组织发生的病理改变决定，其包括造血系统、生殖系统和具有高速率细胞反转的分化的上皮细胞。
导致死亡的γ射线的急性病理作用随剂量不同而不同，通过某些器官的衰竭而确定，其定义了生物体对每种特定剂量的敏感性的阈值。因此，低剂量致死发生于骨髓发育不全，而通过诱导肠道症状的中剂量加快了杀伤。非常高的射线引起神经坏死而导致立即死亡。
射线急性毒性期存活的生物体可遭受长的远期的结果，包括受辐射几个月或几年后，射线诱导的癌症症和暴露器官的纤维化(如肾脏，肝脏或肺)。
细胞DNA是IR的主要靶子，其通过直接或间接的机制(自由基为基础的)引起多种类型的DNA损伤(基因毒的压力)。所有的有机体保留了DNA修复系统，其可地恢复放射损伤的DNA；DNA修复过程中的错误可导致突变。
肿瘤通常对γ射线更敏感，可用多种对正常组织产生相对低的损伤局部剂量治疗，。但是，在一些情况下，正常组织的损伤是肿瘤治疗中γ射线应用的一个限制性因子。在传统的肿瘤治疗中使用γ射线、三维适形、或更聚焦点的BeamCath传送也具有剂量限制的毒性，其是由累积的射线产生，并诱导快速再生的正常组织的干细胞损伤，如骨髓和胃肠(GI)道。
在高剂量下，射线诱导的致死与所述的造血和胃肠射线症状相关。造血症状的特征是造血细胞和其祖先细胞的缺失，导致了不能生成血和淋巴系统。死亡通常是感染(免疫抑制的结果)、出血和/或贫血的结果。GI症状由肠道上皮中多数细胞死亡引起，主要是小肠，随后是肠壁的不完整，并死于菌血症和败血症。造血症状通常在低剂量射线比较多，导致比GI症状延迟的死亡。
在过去，射线防护剂典型的是抗氧化剂-包括合成的和天然的。最近，细胞因子和生长因子被加入到射线防护剂中；这些射线防护剂的机制被认为是有助于敏感组织的再生。在两组射线防护剂中没有明确的功能区别，可是，一些细胞因子诱导细胞抗氧化蛋白的表达，如过氧化镁岐化酶(MnSOD)和金属硫蛋白。
特定制剂的防护检测可用剂量调节因子(DMF或DRF)表示。用一定范围的射线剂量照射辐射防护剂处理的目标物和未处理的对照物，然后比较其生存或其他终结点，从而确定DMF。DMF通常被计算30天的生存率(用对照组的LD50/30除以药物处理组的LD50/30)，并定量造血系统的保护。为了分析胃肠道系统的保护，LD50和DMF被计算6或7天的生存。除非特别指明，此处的DMF值是30天的。
NF-kB诱导剂在细胞水平以及在整个有机体水平具有强的促生存活性。为了对超致死剂量的射线反应，NF-kB诱导剂抑制肠道和造血系统症状，其是主要的急性射线暴露的致死原因。作为这些特性的结果，NF-kB诱导剂可用于治疗天然放射事件和核事故的作用。而且，由于NF-kB诱导剂通过不同于以前所知的所有射线防护剂的机制发挥作用，他们可与其他射线防护剂联合使用，从而，大大地增加了对离子射线的防护范围。
与传统射线防护剂(如自由基清除剂)相反，抗凋亡制剂也许不能降低一级放射介导的损伤，但是可以对抗二级事件，包括对一级损伤的活性细胞反应，因而补足了存在的防护线。皮斐松-α，p53的药物抑制剂(哺乳动物细胞中一种主要的放射反应调节剂)，是此种新的射线防护剂的例子。可是，p53抑制剂的活性限于保护造血系统，在消化系统没有保护作用(胃肠道症状)，因此，降低了这类化合物的治疗价值。具有很宽活性范围的抗凋亡药物绝对是需要的。
NF-kB诱导剂可被用作射线防护剂，通过超出目前方法(存在的生物防护剂的防护和应用)可达到的水平地增加人机体对射线的抵抗力来扩大可容忍的放射剂量，并大大地增加了核事故或大规模日光粒子事件中人员的生存机会。NF-kB诱导剂鞭毛蛋白的大概DMF(30天生存)大于1.5，其比目前报道任何天然化合物都有效。
NF-kB诱导剂还可用于治疗低剂量辐射引起的不可替代的细胞缺失，例如，在中枢神经系统和生殖器官中。NF-kB诱导剂还可被用于癌症症化疗中，以治疗化疗产生的副作用，包括秃头症。
再一个实施例中，治疗受辐射的哺乳动物，包括向哺乳动物投药含有治疗有效量的NF-kB诱导剂的组合物。含有NF-kB诱导剂的组合物可以与一种或多种辐射防护剂联合给药。一种或多种辐射防护剂可以是任何治疗受辐射的制剂，包括但不局限于抗氧化剂、自由基清除剂和细胞因子。
NF-kB诱导剂还可以抑制放射诱导的DNA和其他细胞结构损伤的渐进性细胞死亡；可是，NF-kB诱导剂不能处理细胞的损伤，也不能防止突变。自由基和反应氧族(ROS)是引起突变和其他细胞内损伤的主要原因。抗氧化剂和自由基清除剂可有效地防护自由基产生的损伤。NF-kB诱导剂和抗氧化剂或自由基清除剂联合使用可导致受射哺乳动物更小范围的损伤、高的生存和改善的健康状态。实际上可用于本发明的抗氧化剂和自由基清除剂包括但不局限于硫醇、如半胱氨酸、巯基乙胺、谷胱甘肽和胆红素；amifostine(WR-2721)；维生素A；维生素C；维生素E；和类黄酮，如印度荷力罗勒(Ocimum sanctum)，orientin，和vicenin。
NF-kB诱导剂还可以与多种通过补充和/或保护射线敏感干细胞群而提供放射防御的细胞因子和生长因子联合给药。可通过使用干细胞因子(SCF，c-试剂盒配体)、flt-3配体和白细胞介素1片段IL-1 b-rd而实现具有最少副作用的放射防护。可以通过诱导干细胞增殖(所有提到的细胞因子)及防止其凋亡(SCF)实现防护。治疗允许辐射前白细胞及其前体集聚，从而使辐射后免疫系统可以得到快速重建。SCF可有效地防止受辐射小鼠的死亡，DMF在1.3-1.35，其也可以有效地对抗肠道症状。Flt-3配体也可以提供对小鼠(在LD100/30时，30天生存率70-80％，相当于DMF)1.2)和兔子(15，16)的强保护。
一些因子，本质上不是细胞因子，刺激免疫细胞增殖，可以与NF-kB诱导剂联合使用。5-AED(5-雄甾烯二酮)是类固醇，可刺激细 胞因子的表达并增加对细菌和病毒感染的抗性。辐射前24小时向小鼠皮下注射5-AED可改善生存，DMF＝1.26。合成的化合物，如三氯代铵(二氧乙烯-O，O’-)碲酸盐(AS-101)可被用于诱导多种细胞因子的分泌，可与NF-kB诱导剂联合使用。
生长因子和细胞因子可被用于提供肠道症状的保护。角化细胞生长因子(KGF)促进肠粘膜的增殖和分化，在肠阴窝增加辐射后的细胞生存。造血细胞因子和放射防护SCF可以增加肠干细胞的生存及相关的短期有机体生存。
NF-kB诱导剂可保护肠道(GI)和造血系统的症状。由于暴露于全身致死辐射15Gy的小鼠多数死于肠道症状，含有NF-kB诱导剂和一种或多种GI症状抑制剂的组合物可更有效。用于本发明的GI症状抑制剂包括但不局限于细胞因子，如SCF和KGF。
含有NF-kB诱导剂的组合物可在辐射暴露于辐射前的任何时间给药，包括但不局限于包括但不局限于暴露前48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小时。含有NF-kB诱导剂的组合物可以在暴露于辐射后的任何时间给药，包括但不局限于包括但不局限于暴露后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小时。
3.制剂
本发明还涉及诱导NF-kB活性的制剂。制剂可以是人工合成的化合物或天然存在的化合物。制剂可以是低分子量的化合物、多肽或肽、或片段、类似物、同源物、其变异或衍生物。
制剂还可以是诱导NF-kB细胞因子的，包括但不局限于IL2、IL6、TNF和TGFβ。制剂还可以是前列腺素。制剂还可以是生长因子，包括但不局限于KGF和PDGF。制剂还可以是诱导NF-kB活性的抗体。
A.鞭毛蛋白
在一个实施例中，制剂是鞭毛蛋白，其可来自细菌包括但不局限于沙门氏菌属，如鼠伤寒沙门氏菌。如以下的实施例中所示的，在细胞水平和作为一个整体的有机体，鞭毛蛋白具有强的促生存活性(pro-survival)。
具有有益特性的NF-kB诱导剂的片段、变异、类似物、同源物或衍生物，如鞭毛蛋白可通过以鞭毛蛋白结构域结构为基础的合理设计得到。沙门氏菌鞭毛蛋白的结构域结构在文献中报道了(图19)。鞭毛蛋白在N末端和C末端具有保守结构域(D1和D2)，以及一个中间的高变异区(D3)(Samatey，等2001，Eaves-Pyles T.等2001a)。通过大肠杆菌埃希氏菌属铰链区分离的含有氨基酸D1和D2及羰基D1和D2(ND1-2/ECH/CD2)的重组蛋白的结果表明当连接到ECH元件时D1和D2具有生物活性。这种嵌合体，并不仅仅是铰链区，在两个小肠上皮细胞系诱导IkBα降解、NF-kB激活和NO及IL8生成。非保守的D3区在鞭毛蛋白细丝表面上，含有主要的抗原决定簇。鞭毛蛋白的有效的促炎性活性可能位于高保守的N和CD1和D2区。
B.寄生虫的NF-kB诱导剂
鞭毛蛋白的特性表明额外的NF-kB调节剂可存在于寄生虫。有许多寄生虫依赖于凋亡抑制，因为没有宿主细胞，他们不能存活。这些生物体经过适应通过分泌抗凋亡因子而在宿主有机体中有效地存活。像发展的肿瘤，这些生物体分泌的因子能增强其自身的存活，而解决与宿主压力反应防御机制的冲突。
来自寄生或共生的生物体的抗凋亡因子通过数百万年的适应而最小化了可影响宿主生存的伤害。结果，这些因子很少需要，如果有额外的修饰，可被直接应用或小量修饰后应用。这些因子可用于治疗压力介导的凋亡，如与化疗或放疗相关的副作用。
本发明还涉及筛选用于鉴别NF-kB调节剂的寄生虫的方法。该候选的调节剂可来自人或非人源寄生虫。寄生虫优选宿主细胞外寄生虫。寄生虫还可以是共生体。本发明的调节剂可分离自的寄生虫包括但不局限于支原体、衣原体和沙门氏菌。可通过此处所述的筛选方法以及生物化学和基因选择方法、体外试验、细胞死亡保护剂和体内来鉴别这些调节剂。
4.组合物
本发明还涉及含有治疗有效剂量的NF-kB诱导剂的组合物。该组合物可以是药物组合物，可以使用本领域熟知的方法制备。如上所述，含有NF-kB诱导剂的组合物可以给药于哺乳动物用于治疗凋亡相关的状态，包括但不局限于暴露于辐射、癌症治疗的副作用、压力和细胞老化。组合物可以包括另外的制剂，包括但不局限于辐射防护剂或化疗药物。
A.给药
本发明的组合物可以以任何方式给药，包括但不局限于口服、肠道外、舌下、经皮的、直肠、经粘膜、局部、经吸入、经颊给药或其组合。肠道外给药包括但不局限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鞘内、和关节内给药。在兽医中的应用，可以根据常规兽医操作以适当的配方形式给药组合物。兽医可以确定最适合特定动物的药方剂量和给药途径。
B.配方
本发明的组合物可以以传统的方式以片剂或锭剂配方。例如，用于口服给药的片剂或胶囊配方可以包含常规的赋形剂包括但不局限于结合制剂、填充剂、滑润剂、分解质和湿润剂。结合制剂包括但不局限于糖浆、accacia、凝胶、山梨醇、黄芪胶、淀粉的黏液和聚乙烯吡咯烷酮。填充剂包括但不局限于乳糖、糖、微晶体纤维素、玉米淀粉、磷酸钙、和山梨醇。滑润剂包括但不局限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、聚乙烯乙二醇、和硅石。分解质包括但不局限于土豆淀粉、乙醇酸钠淀粉。湿润剂包括但不局限于月桂醇硫酸钠。根据本领域熟知的方法将片剂包被。
本发明的组合物还可以是液体配方，包括但不局限于水或油性悬浊液、溶液、乳状液、糖浆和西也剂。组合物也可被配方成干燥的产物，使用前用水或适合的媒介物构建。这种液体制剂何以含有添加剂包括但不局限于悬浮剂、乳化剂、非水性媒介或防腐剂。悬浮剂包括但不局限于山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、凝胶、羟乙基纤维素、羰甲基纤维素、硬脂酸铝和氢化可食的脂肪。乳化剂包括但不局限于卵磷脂、山梨醇单油酸盐和阿拉伯树胶。非水性媒介包括但不局限于食用油、杏仁油、分级的椰子油、油脂、丙烯乙二醇和乙烯乙醇。防腐剂包括但不局限于甲基或丙基p-羟基安息香酸盐和山梨酸。
本发明的组合物还可以被配方成栓剂、气可以含有栓剂的基础成分，包括但不局限于可可黄油或甘油酯。本发明的组合物还可被配方成吸入剂包括但不局限于溶液、悬浮液、或乳剂，可以粉末形式或使用推动剂如二氯二氟甲烷或三氯二氟甲烷以气雾剂形式给药。本发明的组合物还可以被配方成经皮的配方，其包括水或非水媒介，包括但不局限于乳霜、药膏、洗剂、糊、药用糊、块或膜。
本发明的组合物还可被配方成肠外投药，包括但不局限于注射或持续浸剂。用于注射的配方可以是油或水性介质中的悬浮液、溶液、或乳剂的形式，可以含有配方制剂包括但不局限于悬浮的、稳定的、和分散的制剂。组合物还可以以粉末的形式被提供，使用恰当的媒介重建，包括但不局限于消过毒的，无热原质的水。
本发明的组合物还可以被配方成贮存制剂，其可通过植入或肌肉内注射给药。组合物还可被配方成合适的聚合体或疏水物质(例如以可接受的油形式的乳化剂)、离子交换树脂、或保守的溶液衍生物(例如保守的溶液衍生盐)。
C.剂量
用于治疗的制剂的治疗有效剂量随被治疗状态、需要诱导NF-kB活性的时间长短、病人的年龄和状态的不同而不同，最终由参加的医师决定。可是，一般而言，用于成年病人治疗的剂量通常在每天约0.001mg/kg-200mg/kg。剂量可以是大约每天1μg/kg-100μg/kg。通常可一次地给药所需剂量，或在恰当的时间间隔内多次给药，如，一天给药2，3，4或更多次。通常想要或需要多次剂量，因为一旦不再给药制剂，在正常的细胞内NF-kB活性会降低。
NF-kB诱导剂的剂量可以是任何剂量，包括但不局限于1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、852μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg或1mg/kg。
5.筛选方法
本发明还涉及鉴别诱导NF-kB活性的制剂的方法。可以通过一种方法鉴别诱导NF-kB活性的制剂，该方法包括将猜想的NF-kB活性诱导剂加到NF-kB激活的表达系统，与对照比较NF-kB激活表达的水平，藉由增加NF-kB激活表达系统的水平的能力鉴别NF-kB活性的诱导剂。
候选制剂可存在于数据库中(即，许多化合物)。例如，此种制剂可以被表达数据库中的DNA分子编码。候选制剂可存在于条件的介质或细胞提取物。其他此类制剂包括本领域熟知的“小分子”化合物，分子量小于105道尔顿，优选小于104道尔顿，跟优选小于103道尔顿。此种候选制剂可以作为组合的数据库的成员被提供，其包括根据多种预定的化学合成制备的合成制剂(如肽)。本领域普通技术人员应当能够理解根据确定的步骤可以制备此数据库的多种类别，并可根据此处的方法同时或相继地筛选候选制剂的数据库成员。
可以以各种形式进行筛选方法，包括体外、细胞基础的和体内分析。任何细胞可用于细胞基础的分析中。优选地，用于本发明的细胞包括哺乳动物细胞、更优选地包括人或非人类灵长类细胞。细胞基础的筛选可以使用表达NF-kB激活的代用品标记的基因修饰的肿瘤细胞来进行。此种标记包括但不局限于细菌β半乳糖苷酶、荧光素酶和增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。可应用本领域的标准技术测量代用品标记的表达量包括但不局限于比色、发光和荧光。
将猜想调节剂加入细胞，如通过混合，的条件是如果基本上没有干扰凋亡或信号的其他调节化合物存在，细胞能够进行凋亡或信号的条件。有效的条件包括但不局限于允许细胞生长的恰当的介质、温度、pH和氧状态。恰当的介质典型地是固体或液体介质，其含有生长因子和可吸收的碳、氮、和磷酸源，以及恰当的盐、矿物质、金属和其他营养物，如维生素，并包括细胞可在其中生长并表现出凋亡和信号的介质。例如，对于哺乳动物细胞，介质可以含有10％胎牛血清的Dulbecco修饰的Eagle介质。
可以在各种容器中培养细胞，包括但不局限于组织培养瓶、试管、微量滴定皿、和培养板。培养在适合细胞的温度、pH和二氧化碳含量的条件下进行。此培养条件也在本领域的范围。
将猜想调节剂加入细胞的方法包括电穿孔、微注射、细胞表达(即使用包括裸核酸分子、重组病毒、逆转录酶病毒表达载体和腺病毒表达的表达系统)，使用有助于细胞通透的离子配对试剂和去垢剂。
本发明具有多个方面，通过下述非限制性实施例描述。
实施例1
P53缺陷加速小鼠肠道症状的发展
哺乳动物离子辐射的初期致死原因依赖于射线剂量。达到9-10Gy的剂量，小鼠12-20天后死亡，主要是由于致命的骨髓缺失造血综合征(HP)。在此剂量下，受辐射小鼠可通过骨髓移植得到挽救。受到大于15Gy的动物在处理后7-12天死亡(在造血综合征杀死之前)，死于小肠-胃肠道综合征(GI)的并发症(Gudkov&Komarova 2003)。在HP和GI综合征两种情况下，组织的致死性损伤来自于大多数p53依赖的凋亡(Potten1992，Merritt 1994，Cui等1995，Potten等1994)，此观察使得我们可以较早地建议p53可以确定放射诱导的死亡。同样的，p53缺陷小鼠对抗通过HP症状进行杀伤的射线剂量(Westphal等1997，Komarov等1999)，通过小分子的p53抑制剂皮斐松α(PFT)(pifithrin-alpha)暂时药物地抑制p53可以降低6-11Gyγ射线在野生型动物中引起的死亡(Komarov等1999)。通过证实作为实验性化疗和放疗结果的毛发缺失(秃头症)的p53依赖，进一步强化了p53对基因毒性压力的敏感组织因子的定义(Botchkarev等2000)。因此，基于上述观察，大家可以期待p53在高剂量的IR后的致死性GI综合征的发展中持续起重要的作用。令人吃惊的是，p53缺陷使小鼠对高剂量导致致死的胃肠道综合征的IR敏感(图11)。IR后在p53缺陷上皮的隐窝中持续的细胞增殖于加速的隐窝受损细胞的死亡和快速的绒毛破坏相关。P53通过诱导小肠隐窝的生长停滞延长生存，因而保持肠道完整性(图12)。所以，p53的促凋亡功能加速了造血症状，而其生长停滞功能延缓了胃肠道症状。
小肠细胞的动力学已被详细的分析了。肠道上皮的细胞增殖局限于隐窝，其中有干细胞和早期增殖的祖细胞。一系列细胞分裂后，已近分化的隐窝干细胞的后代移到绒毛，在绒毛顶脱落。在小鼠的小肠中，细胞的整个“旅途”(增生部分到绒毛顶)一般需要3-5天(Potten1992，Potten等1997，Booth等2002，Somosy等2002)。虽然小肠对γ射线的反应在病理形态学水平上已被详细研究了，仍不明白的是到底是什么引起的GI致死，包括初级事件。死亡可以上皮隐窝细胞损伤及随后的绒毛剥脱，而导致的液体和电解质失衡、菌血症和毒血症的直接后果。除了炎性和间质反应，内皮的功能丧失是导致死亡的重要因素(Potten等1997，Somosy等2002)。总言之，对防止IR诱导的HP症状的有效方法，p53的药物抑制并不能对抗GI症状(如果不是有害的)。因此，有必要发展一种其他的方法，在其他机制上对小肠上皮进行放射性保护，例如，NF-kB的激活和随后的细胞死亡的抑制。
实施例2
沙门氏菌感染激活NF-kB
沙门氏菌感染导致有效的IKK和NF-kB激活以及促炎性基因的激活(Elewaut等1999)。先前的研究表明在培养的肠上皮细胞中大约30-40％的肠上皮细胞在典型的沙门氏菌感染中被感染(Valdivia等1996)。我们希望解决这个问题，宿主细胞大约30％的细菌感染是怎样使NF-kB DNA的结合活性增加到作为TNFα治疗剂量的几乎所有的宿主细胞中的NF-kB活性的。
为了详细检测这个现象，假感染或在MOI50时用野生型鼠伤寒沙门氏菌感染HT29细胞1小时，该鼠伤寒沙门氏菌用编码沙门氏菌ssaH启动子控制的绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pFM10.1转染，仅当细菌侵入宿主细胞是才具功能(Valdivia等1997)。用沙门氏菌侵入的细胞通过直接的荧光显微镜检测GFP的表达来检测。P65(RelA)定位通过使用间接的免疫荧光检测，用FITC连接的驴抗兔抗体检测兔抗p65抗体。DAPI用于染色核。
如图1A所示，GFP的表达发生在大约30-40％的细胞。下一步我们检测在未处理的(假感染)、沙门氏菌感染或TNFα(10ng/ml)刺激的细胞中NF-kB亚单位p65的定位。P65(RelA)定位于未处理细胞的细胞质中，而p65(RelA)定位于沙门氏菌感染或TNFα处理细胞的细胞核上(图1B)。这些结果表明沙门氏菌感染几乎在所有的细胞激活NF-kB，尽管只有一少部分被感染。
实施例3
鞭毛蛋白激活NF-kB
因为培养的小肠上皮细胞感染沙门氏菌仅导致大概30％的感染，而几乎全部的细胞中NF-kB都被激活，我们期望NF-kB的激活是对宿主细胞识别细菌结构成分或细菌产物的反应，而不是通过侵入过程。侵入自身被证明在激活上述认为的促炎症基因过程中不是必要的(16)。为了研究此种可行性，使用未处理的或煮沸20分钟的消毒过滤的柏林沙门氏菌培养液激发HT29小肠上皮细胞，通过暴露45分钟后制备的全细胞提取物(WCEs)的电迁移分析(EMSA)分析NF-kBDNA的结合活性(3，40)。在两种条件下观察到对培养液反应的潜伏激活，表明激活因子是热稳定的。
随后用DNase、RNase、蛋白激酶K或在100kDa的centricon过滤器上粗略地分离处理天然消毒过滤浓缩的培养液。然后用各种处理的培养液激发HT29肠上皮细胞45分钟后制备WCEs，用EMSA分析NF-kB DNA的结合活性(图2A)。通过鼠伤寒沙门氏菌1103的HT29细胞的直接感染或暴露于如所述培养液(supt)，诱导NF-kB DNA结合活性，而发现活性诱导剂对蛋白激酶消化敏感，并通过100kDa过滤器保留(图2A)。为了进一步确定NF-kB诱导活性的身份，用Superose12凝胶通透色谱(图2B)和阴离子交换色谱(图2C)分离消毒过滤浓缩的培养液培养基。分析色谱分离的水性部分对激活HT29细胞中NF-kB的能力，并用EMSA分析。如在考马斯兰染色凝胶中所见(图2B，上)，对应增加的大约55kDa的蛋白质，NF-kB DNA结合活性增强(图2B，下组4-6泳道)。如所示的在POROS HQ基质上的阴离子交换色谱和如所示的具有增加的盐梯度的结合蛋白洗提液(图2C)证明了NF-kB NDNA结合诱导活性对应了含有增加的含量的55kDa的蛋白质的色谱部分(图2C，上，数据未显示)。图2C中的洗提液被浓缩，并在预备的12％SDS-PAGE凝胶上分离，从胶上切除B1-B6的带，洗提蛋白质，沉淀，复性，并用于刺激HT29细胞。通过EMSA分析这些细胞中的全部细胞提取液的NF-kB DNA结合诱导活性，仅有对应55kDa蛋白的带2(B2)能过引起NF-kB DNA结合活性，而从开始或最后的盐剃度缓冲液不能激活NF-kB DNA结合活性(图2C，F)。
进一步对B1-B6蛋白带的蛋白和凝胶的空白区进行蛋白测序。B2蛋白质的胰蛋白酶消化和电分散离子捕获LC/MS分析鉴别出一个21个肽的氨基酸序列。鞭毛蛋白(21个肽的覆盖率为75％)毫无疑问地被鉴定为诱导NF-kB DNA结合活性的蛋白质(图3)。
实施例4
在肠上皮中需要鞭毛蛋白激活NF-kB
为了确认鞭毛蛋白到底是不是在肠上皮暴露于直接的细菌感染或治病沙门氏菌的过滤的培养液后NF-kB活性触发的因子，我们从非鞭毛蛋白的大肠杆菌DH5α、致病的柏林沙门氏菌2229、异源柏林沙门氏菌2229 SopE-突变、异源柏林沙门氏菌2229 SopB-突变、异源柏林沙门氏菌2229 SopE-/B-双突变(SE1SB2株)、鼠伤寒沙门氏菌1103、异源鼠伤寒沙门氏菌fliC-Tn10插入突变(株86)和鼠伤寒沙门氏菌1103异源双突变fliC-/fljB-中制备了感染细菌，煮沸，过滤培养液。SopE是病原性沙门氏菌噬菌体编码的蛋白被注入宿主细胞，并作为小RhoGTPases Rac1和CdC42启动的细胞骨架重排的交换因子发挥作用，最终激活MAPK、SAPK和NF-kB途径(7，15)，而SopB是作为磷酸肌糖磷酸酶发挥作用的沙门氏蛋白，参加细胞骨架重排和刺激宿主细胞分泌氯(44)。用细菌和培养液激发HT29小肠上皮细胞，45分钟后制备WCEs提取液，通过EMSA分析NF-kB DNA结合活性。沙门氏菌株能够激活NF-kB，而不能产生鞭毛蛋白的沙门氏菌株(如所述的fliC和fliC-/fljB-突变)也不能激活NF-kB(图4A&B)。大肠杆菌DH5α是非鞭毛蛋白，不产生鞭毛蛋白，不能激活NF-kB。通过多种试验我们还注意到柏林沙门氏菌的直接感染比如图4A的鼠伤寒沙门氏菌通常激活更多的NF-kB，而两种菌种的培养液几乎同样地激活NF-kB(图4B)。我们相信这种区别也许是由于在感染期间柏林沙门氏菌比鼠伤寒沙门氏菌向细胞培养介质中释放更多的鞭毛蛋白，因为从两种柏林沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的培养液中纯化并加入相同剂量的色谱纯化的鞭毛蛋白而产生相似的NF-kB激活。还注意到的是双鞭毛蛋白基因突变与在单相I鞭毛蛋白fliC::Tn10插入突变(图4A&4B中接近最后一泳道)中观察到的很小的激活相比不能激活NF-kB，原因可能是相II鞭毛蛋白的有限的表达(从fljB)，尽管此处使用的沙门氏菌株遗传上不能或很少迁移鞭毛蛋白产物的相。由于在小肠上皮细胞的直接感染中需要鞭毛蛋白激活NF-kB途径，很可能鞭毛蛋白也是其他小肠上皮细胞的致病性沙门氏菌感染激活的主要的促有丝分裂和压力激活的信号途径的主要决定因子。小肠上皮细胞直接的沙门氏菌感染导致JNK激活(8)，也通过IKK激活NF-kB(3)。
实施例5
鞭毛蛋白触发有丝分裂激活的蛋白激酶、压力激活的蛋白激酶和IKK信号途径的活性。
对于向肠腔表面的侵入，小肠上皮细胞作为哨兵发挥作用，其可通过产生细胞因子基因如IL-8和巨噬细胞化学吸引蛋白1(MCP1)促炎症的细胞因子基因如TNFα、IL-1和IL-6(1，4-6)吸引免疫细胞到局部。这些基因的表达主要依赖转录因子的活性，这些转录因子通过对MAPK、SAPK和IKK信号途径的信号传导的反应被激活。由于NF-kB被认为是促炎症基因的中枢调节/激活剂，我们决定检测不产生鞭毛蛋白的沙门氏菌突变株在激活MAPK、SAPK和IKK信号途径的作用，并与野生型沙门氏菌感染的肠上皮或暴露于纯化的鞭毛蛋白的肠上皮比较。野生型鼠伤寒沙门氏菌感染HT29细胞导致了MAPK、ERK1&2、SAPKsp38和JNK和IKK的激活(图5)，如通过免疫印迹(IB)分析中的活性指示磷酸特异性抗体分析或分别使用底物GST-cJun1-79和GST-IkBα1-54的JNK和IKK的抗体特异性免疫激酶分析(KA)所确定的那样。有趣的是，MAPK刺激在本质上是短暂的，在45分钟开始激活降低，而p38、JNK和IKK随时间超过一小时增加。如图4所见，fliC-/fljB-双突变沙门氏菌也不能诱导IKK和NF-kB的活性(如图5所示)。令人吃惊的是，fliC-/fljB-双突变沙门氏菌不能诱导SAPKs p38和JNK，仅能暂时地(15分钟)激活MAPK。此结果是令人疑惑的，原因是其他沙门氏菌蛋白如SopE和SopE2能够激活小的GTPaseRac和CdC42，这些Rho家族的GTPases与JNK和p38的激活相联系(7，8，14，15)可是在鞭毛蛋白负株中没有功能。
与野生型沙门氏菌相比，fliC-/fljB-双突变沙门氏菌不能侵入HT29细胞，如基因刺激防护/侵入分析(gentamycinprotection/invasion assay)中所确定的。鞭毛蛋白fliC-/fljB-双突变沙门氏菌在其侵入HT29细胞的能力中显示出4级不同的幅度。为了进一步说明这一点，我们用野生型沙门氏菌和fliC-/fljB-双突变沙门氏菌(株134)感染HT29细胞，用在沙门氏菌ssaH启动子控制下编码表达GFP的质粒pFM10.1转染两种菌株，仅当细菌侵入宿主细胞是才发挥功能(10，36)。很明显野生型沙门氏菌能够感染HT29细胞(GFP，图5B)而鞭毛蛋白突变细菌不能侵入HT29细胞，如没有GFP表达所验证的(图5B)。为了确定为了侵入，鞭毛蛋白是否足够或需要其他细菌产生的蛋白，我们将纯化的鞭毛蛋白或消毒过滤的培养液或其混合加入HT29细胞，用沙门氏菌fliC-/fljB-双突变激发HT29细胞，并分析侵入。使用纯化的鞭毛蛋白和/或fliC-/fljB-双突变株2培养液的所有试验组合不能侵入肠上皮细胞都。不相信鞭毛蛋白基因和III型分泌系统有直接的关联以传递细菌产物蛋白如，SopE、SopE2和SipA或其他在抑制细菌整合中起重要作用的Sip蛋白(7，14，15，45，46)的有效性。而且，为了评估鞭毛蛋白刺激p65(RelA)在肠上皮细胞中核定位的有效性，我们用纯化的鞭毛蛋白激发HT29细胞，并使用间接免疫荧光检测p65(RelA)的定位，发现p65(RelA)几乎定位于每一个细胞核(如图5B所示)。
在HT29细胞中纯化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)有效地激活NF-kB，这与TNF(10ng/ml)处理的HT29细胞中观察得到的时间依赖的方式相似(图6A)，其中WCEs在暴露后的指定的各个时间上制备，用EMSAs分析NF-kB DNA结合活性。在这些相同的提取液中分析MAPK、SAPK和IKK信号途径(图6B)，使用激活特异的磷酸抗体检测MAPK和p38激酶活性或抗体特异性免疫沉淀激酶分析检测JNK和IKK活性，证明JNK和IKK活性在一小时内增加而p38和MAPK(ERK1&2)活性在30分钟达到最大，在一小时时下降到可注意的低水平(如图6B所示)。MAPK、SAPK和IKK信号分子ERK1&2，p38，JNK，和IKK在小肠上皮细胞中对暴露于纯化的鞭毛蛋白的反应曲线与野生型沙门氏菌感染的小肠上皮细胞惊人的相似(图5A)。从这些观察中我们得出结论，此处检测到的信号系统暂时的激活(MAPK，SAPK和IKK)反映了沙门氏菌感染的早期状况，几乎可专有地通过小肠上皮细胞对鞭毛蛋白的识别和反应确定。
我们希望进一步检测纯化鞭毛蛋白沙门氏菌中的和鞭毛蛋白在肠上皮细胞中暂时的促炎症细胞因子基因表达的作用，以便区分鞭毛蛋白单独、鞭毛蛋白化的沙门氏菌或非鞭毛蛋白化的沙门氏菌感染。HT29细胞未处理、用TNFα(10ng/ml)刺激、或用鞭毛蛋白(0.5μg/ml)刺激、或用野生型鼠伤寒沙门氏菌或沙门氏菌fliC/fljB双突变(MOI50)感染。在处理或感染指定的时间后，在冰冷的PBS中回收HT29细胞，在Trizol中裂解细胞沉淀，纯化RNA，并用其制备第一链cDNA链(见实验步骤)。cDNA水溶液用于半定量RT-PCR反应中，使用IL1α、IL1β、IL-8、TNFα、MCP1和β肌动蛋白基因特异性引物(根据要求提供序列)，在含溴化二氨乙苯啡啶的1.2％的琼脂糖凝胶的上分离产物。已知的NF-kB靶基因IL1β、IL-8、TNFα、MCP1的表达在对TNFα或纯化的鞭毛蛋白暴露的反应中增加(图6C)。野生型沙门氏菌感染也能导致这些基因的激活，尽管相比之下TNFα、MCP1的表达是短暂的，发生在感染之后。沙门氏菌fliC-/fljB-双突变不能诱导IL-1β、IL-8和TNFα的表达，但是可诱导MCP1的表达，尽管水平比野生型沙门氏菌低，而且，MCP1的表达不是暂时的而是持续整个时间(9h)(图6C)。作为内部标准的β肌动蛋白的表达水平用于比较。有趣的是，在所有的处理激发的HT29细胞在反应中都刺激了非NF-kB靶基因，IL-1α。很明显，沙门氏菌fliC-/fljB-双突变能激活其他不知道的信号途径，导致IL-1α的表达。
实施例6
鞭毛蛋白以MyD88-依赖的方式激活NF-kB DNA结合
由于鞭毛蛋白能够激活与促炎症基因激活一致的需要的信号途径，这种活性与细胞因子激活相关，如TNFα激活所有存在其细胞表面受体的细胞(见图1和图5C中的p65[RelA]核定位)，我们决定检测Toll类受体其是已知的病源识别受体在暴露于鞭毛蛋白是激活NF-kB途径的潜力。为了检测这种假说，我们检测了表达腺病毒的显性负性MyD88(aa152-296)(47)在HT29细胞中鞭毛蛋白诱导的BNF-kB激活中的作用。MyD88是IL-1受体和所有已知TLR利用的转接蛋白，TLR通过他们的细胞质信号区与IL-1同源，在NF-kB途径的立即激活中是必须的(48，49)。DN-MyD88在HT29细胞中的表达阻滞了EMSA检测到的在IL-1或暴露于鞭毛蛋白的反应中的NF-kB DNA结合活性的激活，与TLR介导的NF-kB的激活作用一致。为了进一步检测这种可能性，我们开始使用野生型、MyD88-/-和TLR2-/-/TLR4-/-MEF(从日本大阪大学S.Akira得到的礼物)证实MyD88的作用，并检测两种TLR对鞭毛蛋白反应或对直接的野生型沙门氏菌感染导致NF-kB激活的有效作用(图7)。在野生型和TLR缺陷MEFs中，野生型沙门氏菌感染有效地激活NF-kB(泳道2和5)，但这种激活在MyD88缺陷的MEFs中缺失(泳道10)。用浓缩的灭菌过滤的野生型柏林沙门氏菌或双SopE-/SopB-异源突变柏林沙门氏菌SE1SB2株培养液激发的所有三种细胞，在野生型MEF和TLR2/4双缺陷细胞中激活NF-kB，而在MyD88缺陷细胞中不能激活NF-kB(比较泳道11、12与泳道3，4，6，7，16和17)。在野生型MEF中暴露与纯化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)有力地激活NF-kB，因而消除了LPS在这些实验中在NF-kB的激活中起作用的可能性。也可通过TLR2/4双缺陷MEF的有力激活排除LPS作为NF-kB激活剂的可能性(泳道16和17)。TLR2和4分别对细菌脂肽、肽聚糖、某些LPSs和γ阴性LPS发生反应(50-52)。IL-1刺激证实了在IL-1传递和鞭毛蛋白介导的信号中需要MyD88的功能。
为了进一步确定TLRs在鞭毛蛋白识别中的作用，我们分析了TLRs过度表达在通常对鞭毛蛋白反应弱的细胞中激活NF-kB的能力。选择对纯化鞭毛蛋白轻度反应的细胞可以保证鞭毛蛋白使用的信号成分和转接器的存在和功能，限制性因子看起来仅仅是对鞭毛蛋白反应的受体。我们发现Hela细胞和HEK293细胞对IL-1反应激活NF-kB DNA结合活性，而对暴露于鞭毛蛋白反应弱，我们选择HEK293细胞进一步使用，是因为他们有更强的转染效率。氨基末端FLAG决定簇标记的TLR1-9(Yale Univ.和R.Ulevitch，TSRI的R.Medzhitov来的礼物)(42，43)在HEK293细胞瞬时转染后与2x-NF-kB-依赖的启动子启动的荧光素酶受体基因一起过度表达，确定了在未处理、鞭毛蛋白(0.5μg/ml)或TNFα(10ng/ml)的反应中的荧光素酶的表达。TLR5是唯一的一种其表达导致可见的鞭毛蛋白激发细胞反应的TLR(见表1)。
为了进一步确定TLR5作为TLR通过其鞭毛蛋白激活NF-kB的可能性，我们通过去除每个TLR的羧基部分使其成为TIR结构域的保守的色氨酸来构建显性负性信号突变。IL-1受体中相似的突变取消了其导致NF-kB活性的能力(54，55)。每一个DN-TLR和反义TLR5克隆(AS-TLR5)被克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.1(Invitrogen)。所有的突变蛋白很好的表达。每一个DN-TLR哺乳动物表达载体和具有2xNF-kBLuc的空载体如上所述被转染到对鞭毛蛋白反应好的HT29细胞中。不转染的细胞未处理、用TNFα(10ng/ml)或纯化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)刺激。观察到受体基因表达不被对转染细胞TNFα刺激反应的DN-TLR表达影响(图8A)；可是，仅表达DN-TLR5或反义TLR5构建分别导致了接近50％和25％的鞭毛蛋白介导的受体基因活性的抑制(图8B)，而DN-TLR2也被发现可中度抑制鞭毛蛋白介导的受体表达。这些结果意味着TLR5是细胞表面识别鞭毛蛋白并启动导致NF-kB活性的信号途径的一部分。DN-TLR2在NF-kB依赖的受体基因激活中的作用可以是非特异的，因为与其它DN-TLRs相比，它的表达也抑制了TNFα介导的受体激活。DN-TLR2还可以竞争TLR2和TLR5享有的未知的转接器蛋白。在任何情况下，TLR2和TLR4如图7的结果所示在鞭毛蛋白介导的NF-kB的激活中不是必要的。
实施例7
鞭毛蛋白介导的NF-kB激活导致增加的TLRs系列的表达
用鼠伤寒沙门氏菌或纯化的鞭毛蛋白刺激小肠上皮细胞导致促炎症基因的激活(图6C)。我们希望检测在鞭毛蛋白刺激的细胞中TLR基因表达是否也被改变。用纯化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)处理HT29细胞，从未处理的和刺激三小时后的处理细胞分离总RNA，用于合成第一链cDNA。使用每种TLR的特定的基因特异性引物进行半定量RT-PCR，用从未刺激的和鞭毛蛋白刺激的细胞中制备第一链cDNA，用于合成DNA产物，在含有溴化二氨乙苯啡啶的1.2％琼脂糖凝胶上分离该DNA产物。在鞭毛蛋白刺激后TLRs 2、3、7的表达增加(图9)。其它TLRs的表达模式不变，β肌动蛋白用于内部对照。
TLR5在对鞭毛蛋白反应不好的细胞中表达。此研究和其他(22，33)鉴别出TLR5可能与TLR一样通过鞭毛蛋白激活NF-kB。先前的报道并没有确定细胞中TLR5的存在或量，以用于确定他的功能(22，23)。我们希望确定在不能对鞭毛蛋白的激发产生反应或反应弱的细胞中TLR5蛋白是不存在还是大大降低。在许多细胞系中用免疫印迹分析检测TLR5充分度，使用TLR5特异性抗体并与纯化鞭毛蛋白诱导的从其制备的WCEs的NF-kB DNA结合活性相比较。小肠上皮细胞系T84和HT29被用作肺腺癌症细胞系A549，人宫颈腺癌症细胞系HeLa，表达大T抗原的人胚胎肾细胞系HEK293，和胶质细胞瘤细胞系T98G。用TLR5特异的抗体通过免疫印迹在所有的细胞中检测TLR5蛋白(图10A)。T84细胞系表现出最高度富含，而其他细胞系的表达水平相似，区别不超过2倍(图10A)。从每种细胞系制备的WCEs中通过EMSA分析在未刺激细胞、TNFα和鞭毛蛋白刺激的细胞中的NF-kB DNA结合活性(图10B)。HT29和A549细胞对鞭毛蛋白和TNFα刺激反应强烈，而HeLa、293T和T98G细胞对鞭毛蛋白刺激反应弱(HeLa，293T)或没反应(T98G)。NF-kB DNA结合复合物的确实性用p65特异的抗体对超迁移NF-kB DNA：蛋白质复合物检测。令人感兴趣的是表达TLR5的一些细胞完全不反应或反应非常弱。这可能是由于缺乏胞膜或胞内受体、这些细胞系中的TLR5基因的失活或有害的突变或所需的联合受体或转接器蛋白的缺乏或量少(如在一些细胞中的TLR4和它的联合受体/转接器MD2(30，56，57))。在所有检测的细胞系中IL-1能激活NF-kB DNA结合活性，MyD88下游至NF-kB的信号器好像是完整的。
实施例8
重组鞭毛蛋白的分离
为了确定重组鞭毛蛋白能诱导NF-kB，用携带NF-kB反应荧光素酶(luc)的报告细胞检测其活性。报告构建含有3个来自结合Hsp70最小启动子的E-选择子启动子的NF-kB结合位点，通常被用于检测NF-kB。向介质中加入鞭毛蛋白6小时后在细胞裂解液中检测荧光素酶活性。用TNFα作阳性对照。结果分别在图13中显示，表明重组鞭毛蛋白能够激活NF-kB。
实施例9
鞭毛蛋白延迟IR诱导的GI症状引起的小鼠死亡
如上所述，鞭毛蛋白是NF-kB潜伏的激活剂，推断其能作为凋亡死亡抑制剂发挥作用。由于能诱导NF-kB的细胞因子可作为辐射防护剂发挥作用，我们检测了鞭毛蛋白能否作辐射防护剂。
小鼠全身受辐射15Gyγ射线辐射可导致8天内死于肠道症状(见上)，提供一个常规的辐射诱导肠道损伤的模型中。为了检测鞭毛蛋白能否防护IR的GI症状，我们检测了受辐射15Gy后小鼠死亡的动力学中静脉注射鞭毛蛋白的作用。我们用了各种计量的鞭毛蛋白，其明显低于文献报道的最大耐受量(300μg/小鼠，Eaves-Pyles，T.等，2001b)。处理4小时后照射。结果分别在图14中表示。如所预期的，对照受辐射小鼠(静脉注射PBS)处理后5-8天死亡，而接受鞭毛蛋白的动物存活明显延长；存活的延长与鞭毛蛋白的剂量有关。照射7天后小肠的病理形态学分析表明鞭毛蛋白处理组与对照组的显著差异(图15)。静脉、腹腔、和皮下注射0.2mg/kg的鞭毛蛋白后受13Gy辐射提供了相似的防护作用，导致小鼠30天的生存率为85-90％(数据未显示)。如上所示用13Gy的射线和各种给药途径进行实验确定最优计量。
实施例10
鞭毛蛋白拯救了IR诱导的造血症状致死的小鼠
下一步我们检测了鞭毛蛋白对由于HP症状导致的IR诱导的死亡是否有效，辐射通过较低的实验性辐射剂量引起的(通常最多11Gy)，其不能引起致死的GI毒性。实验与上述的相似(图14和15)，只是没用15Gy，小鼠接受了10Gy的照射，此剂量在对照组中第13天100％杀死小鼠(图16)。鞭毛蛋白处理组(5μg/小鼠)显示出对此剂量IR的完全的防护，表明鞭毛蛋白介导的射线防护不仅抗GI，也抗IR诱导的HP症状。
实施例11
鞭毛蛋白防护作用的时间依赖
为了评估鞭毛蛋白射线防护活性在治疗时间上的依赖性，在13Gyγ射线照射前不同时间注射小鼠。其中的一个结果在图17中表示。得到的结果表明照射前1-4小时注射对13Gy的射线防护有效，如果照射前24小时注射则无效。
为了评估鞭毛蛋白射线防护活性在治疗时间上的依赖性，在相对γ射线的不同时间点上注射。如上所述进行实验，每只小鼠腹腔注射5μg/小鼠(0.2mg/kg)的CBLB501或对照小鼠，注射5μg/小鼠(0.2mg/ml)的细菌RNA多聚酶。在NIH瑞士株小鼠上进行实验。结果表明如果在处理前1-2小时注射，鞭毛蛋白501可在13Gy照射后提供大约90％的生存(图17)。为了清楚仅做了-1小时的曲线，可是，两个时间点(-1和-2小时)提供相似的生存率和动力学。4小时的时间点显示一些防护的下降。放射24小时前注射鞭毛蛋白对13Gy诱导的死亡没有防护作用。
有趣的是，10Gyγ射线照射前24小时投药鞭毛蛋白提供100％的防护。而13Gy照射在小鼠中主要由GI症状诱导死亡，10Gy诱导的死亡多数是由造血症状介导的。从而，这种对10Gy照射的长期的保护可能是通过鞭毛蛋白和/或长期二级细胞因子诱导的增强的造血干细胞的增殖或生存介导的。
实施例12
确定鞭毛蛋白的LD50/30、LD50/7和DMF
我们得到了鞭毛蛋白的放射剂量依赖防护评估。如上所示(图17)，用鞭毛蛋白处理的能够100％防护10Gyγ射线(此剂量引起造血症状的死亡)，对13Gy 30天的生存为90％(造血和GI综合症)。如上所述进行实验，放射1小时前用鞭毛蛋白5μg/小鼠(0.2mg/kg)腹腔注射。
可是，在15Gy，7天生存率为100％，死亡延迟到13天之后，(30天的生存率为0％)，而对照组第7天全部死于GI综合症。
辐射后天数 辐射后天数 辐射后天数
图8，CBLB501在小鼠对全身γ射线量10、13、15Gy的敏感性上的效果(详见本文)。
(图18)15Gy照射后CBLB-501处理组的死亡的动力学治疗组死亡率为使人想起对照组在10Gy的死亡率，暗示死亡由造血综合症引起。此结果提供了鞭毛蛋白LD50/30在大约13.5-14Gy和大约1.75-1.8的DMF30的评估。此放射防护水平显著高于报道的任何天然化合物。
表1
TLR5对鞭毛蛋白反应并激活NF-kB
用空载体(pCDNA3.1)或独自列出的野生型TLR等位基因在6孔平板中转染293T细胞，重复三次。细胞未处理(未刺激)、TNFα(10ng/ml)或鞭毛蛋白(1μg/ml)处理。通过将相对于到对照Renilla荧光素酶活性表达标准化调整NF-kB报告活性，通过处理细胞的报告基因活性/未刺激细胞的报告基因活性计算诱导倍数。ND为未测定。
未刺激 TNF FliC 载体 1 13.5 4.9 TLR1 1.7 ND 5.1 TLR2 1.6 ND 5.3
TLR3 1.5 ND 5.0 TLR4 1.8 ND 5.4 TLR5 1.6 ND 9.2* TLR7 1.5 ND 5.2 TLR8 1.4 ND 5.0 TLR9 1.5 ND 5.1
相关申请的交叉参考
本发明要求2003年12月2日提交的美国临时申请No.60/526,460、2003年12月2日提交的美国临时申请No.60/526,461、2003年12月2日提交的美国临时申请No.60/526,496、和2003年12月2日提交的美国临时申请No.60/526,666的权利，这些申请在此通过参考而并入本申请。
本发明涉及诱导NF-kB的活性，以从凋亡中保护正常细胞。通过在哺乳动物中诱导NF-kB的活性，可以从细胞压力和细胞老化造成的凋亡中保护正常细胞，该压力发生在肿瘤治疗和极高热中；暴露于有害剂量的射线，如核能厂、国防工业或放射药物生产的工人，士兵。在许多肿瘤细胞中，由于NF-kB是组成型被激活的，诱导NF-kB活性可以从凋亡中保护细胞，而对肿瘤细胞没有益处。一旦正常细胞被修复，NF-kB活性可恢复到正常水平。NF-kB活性可被诱导以保护此种放疗和化疗敏感组织，如造血系统(包括免疫系统)，内脏上皮和毛囊。
NF-kB活性诱导子还可用于各种其他的应用。哺乳动物暴露于各种严重状态引起的病理后果和死亡可来源于对压力反应的正常生理机制的激活，这些状态包括但不局限于，射线、创伤、中毒、感染、老化、和高温应激，该生理机制的激活如诱导渐进的细胞死亡(凋亡)或释放生物活性蛋白，细胞因子。
凋亡通常具有从创伤或遗传上损伤的细胞中“清理”组织的功能，而细胞因子可动员生物体的防御系统对抗病源。可是在严重损伤的状态下，两种压力反应自身可引起死亡。例如，射线导致的死亡可来源于发生在造血、免疫和消化系统的大量p53介导的凋亡。合理的药物调节NF-kB可在严重的压力下增强生存。控制这些因子可允许对损伤器官中的细胞炎症反应和生死抉择进行控制。
NF-kB的保护作用可通过多种基因的转录激活调节，这些基因编码：a)阻断两种主要凋亡途径的抗凋亡蛋白，b)诱导HP和其他干细胞增殖和生存的细胞因子和生长因子，和c)潜伏的ROS-清扫抗过氧化蛋白，如MnSOD(SOD-2)。因此，通过NF-kB短暂激活的辐射防护，不仅仅可以实现肿瘤患者的凋亡抑制，由于同时发生的免疫刺激作用，还可以降低二级癌症症发生率的可能性，如果通过激活Toll类似受体而实现NF-kB被激活。
作为靶，NF-kB途径的另一个吸引特性是其被认为是辐射防护剂的多种天然因子激活。其中，有多种病源相关的分子类型(PAMPs)。PAMPs是宿主生物体中不存在的分子，其特征是病源的大组，不容易突变。他们被Toll类似受体(TLRs)识别，Toll类似受体是内在免疫的主要感受器成分。TLRs直接地或通过细胞因子的释放诱导免疫细胞的迁移或激活，可作为免疫系统的初级警告机制。TLRs是I型膜蛋白，作为同或异二聚物发挥作用。与配体结合后，TLRs募集MyD88蛋白，对于多数TLRs，MyD88蛋白是不可缺少的信号转接器。随后的信号系列产生的作用包括(i)激活NF-kB途径，(ii)激活MAPKs，包括Jun N-末端激酶(JNK)。Toll-类受体配体激活的NF-kB途径产生了作为潜伏辐射防护剂的配体吸引物。不像细胞因子，许多PAMPs除激活TLRs外没什么作用，因此不产生副作用。而且，许多PAMPs存在于人类。
与其免疫细胞的激活功能一致，所有的TLRs在脾和外周血白细胞中表达，在其他的淋巴器官和白细胞系中具有更多的TLR特异模式表达。可是，TLRs也表达在身体的其他组织和器官，如TLR1广范表达，TLR5也表达在GI上皮和内皮，TLRs2、6、7、8已知在肺表达。
1.定义
应当理解此处使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例而不是限制本发明。必须注意，如说明书和权利要求中所使用的，单数“a”“an”和“the”除非特别指明，包括多重指代的含义。
在本文使用的术语“给药”，当用于描述诱导NF-kB活性的制剂的剂量时，指该制剂的一次或多次给药剂量。
在本文使用的术语“类似物”，当用于肽或多肽的上下文时，指包含一种或多种非标准氨基酸或传统氨基酸的其他结构变异的肽或多肽。
在本文使用的术语“抗体”指IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE类抗体，或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab’)2、Fd和单链抗体、微型双功能抗体、双特异抗体、双功能抗体、及其衍生物。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、亲和力纯化的抗体、或其混合物，其呈现出对相关抗原决定簇或其衍生的序列的足够的特异性结合。抗体还可以是嵌合的抗体。可以通过一种或多种本领域已知的化学的、肽或多肽半族的连接衍生出抗体。抗体还可以与化学半族连接。
本文中使用的“凋亡”指细胞死亡的形式，包括胞内细胞器完整性保存而细胞体积的渐进收缩；如光镜或电镜观察到的染色体浓缩(即核浓缩)；和/或DNA断裂成核小体大小的片段，如离心沉淀分析所确定的。细胞死亡发生在细胞膜完整性缺失时(如膜泡)，完整的细胞片段(凋亡小体)被巨噬细胞吞胞(engulfment)。
本文中使用的术语“癌症”指任何一种特征为对抗凋亡刺激的状态。
本文使用的术语“癌症治疗”指任何本领域中已知的治疗癌症的方法，包括但不局限于化疗和放疗。
本文的术语“与结合”用于描述投药诱导NF-kB活性的制剂和额外的治疗时，在额外的治疗前、与其一同或在其后或与其结合给药。
本文的术语“衍生物”，当用于肽或多肽的上下文时，指不同于初级结构(氨基酸或氨基酸类似物)的肽或多肽。通过描述，衍生物可以通过糖基化、转录后修饰的一种方式而不同。例如肽或多肽由于在异种系统表达可以展现糖基化模式。如果保留至少一种生物学活性，那么这些肽或多肽是根据本发明的衍生物。其他衍生物包括但不局限于具有共价修饰的N-或C-末端的融合肽或融合多肽，PEG化的(PEGylated)肽和多肽，与脂质半族相关的肽或多肽、烷基化的肽或多肽、通过氨基侧链功能组与其它肽、多肽或化学物连接的肽或多肽，本领域中应该理解的额外的修饰。
本文中的术语“鞭毛蛋白”指的是任何来源的鞭毛蛋白，包括但不局限于任何细菌种。鞭毛蛋白可以是沙门氏菌种。还可以特异地是所述鞭毛蛋白的片段、变异、类似物、同源物、或衍生物及其结合。此处所述的各种片段、变异、类似物、同源物、或衍生物可以与野生型鞭毛蛋白具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的同一性。
本文的术语“片段”，当用于肽或多肽的上下文时，指8-50个氨基酸长度的肽。片段的长度可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个氨基酸。
本文中的术语“同源物”，当用于肽或多肽的上下文时，指享有共同进化祖先的肽或多肽。
本文的术语“潜伏的TGFβ”指不具活性的TGFβ前体。潜伏的TGFβ可以是含有活性TGFβ和潜伏相关肽(LAP)的TGFβ前体。潜伏的TGFβ还可以含有连接到潜伏的TGFβ结合蛋白的LAP。潜伏的TGFβ还可以是大的潜伏的复合物。进一步，潜伏的TGFβ可以被修饰的潜伏的TGFβ，从而转染成活性TGFβ的速率或转染成TGFβ的能力降低。被修饰的潜伏的TGFβ可以是，例如，防止或降低转染为活性TGFβ的TGFβ变异。
本文的术语“TGFβ”指任何活性或潜伏的TGFβ的异构体，包括但不局限于TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4、或TGFβ5及其组合。还可以特异地指所述TGFβ异构体的片段、变异、类似物、同源物、或衍生物，及其组合。此处所述的各种片段、变异、类似物、同源物、或衍生物可以与TGFβ异构体具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的同一性。
此处所述的术语“治疗”或“治疗”，当指从状态中保护哺乳动物时，意味着保护、抑制、压制或清除状态。保护状态包括在状态发生前向哺乳动物投药本发明的组合物。抑制状态涉及在状态诱导后但在临床症状前向哺乳动物投药本发明的组合物。压制状态涉及临床症状出现后向哺乳动物投药本发明的组合物使此状态降低或维持。消除状态涉及临床症状出现后向哺乳动物投药本发明的组合物使哺乳动物不再遭受此种状态。
如此处所述，术语“肿瘤细胞”指对抗凋亡刺激的任何细胞。
如此处所述，术语“变异”当在肽或多肽的上下文时，指通过氨基酸的插入、缺失或保守性替代使肽或多肽的氨基酸序列不同，但保留了至少一种生物功能。为了本发明的目的，“生物活性”包括，但不局限于通过特异抗体的结合能力。氨基酸的保守替代，即，用具有相似特性的不同氨基酸取代(如，亲水性、带电区的程度和分布)的氨基酸可被本领域中作所识别典型地涉及较小变化。这些小变化可部分地通过考虑氨基酸的疏水指数鉴别，如本领域中已知的。Kyte等J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的疏水指数是以考虑它的疏水性和电荷为基础的。本领域中已知相似疏水指数的氨基酸可被取代，仍保留蛋白功能。在一方面，疏水指数2的氨基酸被取代。氨基酸的疏水性还可被用于揭示可导致蛋白质保持功能的取代基。在肽中大部分氨基酸的疏水性可允许计算该肽的最大局部平均疏水性，其是一个有用的指数，被报道与抗原性和免疫原性有关。美国专利No.4554101在此引入作参考。具有相似疏水性值的氨基酸取代可使肽保留生物活性，例如免疫原性，如本领域中知道的。在一方面，用亲水性相差±2的氨基酸中进行取代。氨基酸的疏水性和亲水性指数都受该氨基酸特定的侧链的影响。与此观察相一致的，与生物功能一致的氨基酸取代被认为是依赖氨基酸的相对相似性，特别是这些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小、和其他特性所揭示的。
2.治疗方法
a.组成型地激活的NF-kB肿瘤
本发明涉及治疗遭受组成型地激活NF-kB癌症症的哺乳动物的治疗，包括向哺乳动物投药含有治疗潜伏剂量的诱导NF-kB活性的制剂。诱导NF-kB活性的制剂可以与肿瘤治疗物联合给药。
该制剂可以与其它抗肿瘤治疗如化疗或放疗同时或分次(metronomically)给药。此处的术语“同时”或“同时地”指其它抗肿瘤治疗和本发明的化合物在48小时、优选24小时、更优选12小时、更优选6小时、最优选3小时或更少时间的间隔。此处的术语“分次”指与化疗在不同的时间内，以某种相对重复给药和/或化疗方案的频率给药。
可以在任何暴露于肿瘤治疗前的时间点上给药，包括但不局限于暴露前48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小时。可以在任何肿瘤治疗后的时间点上给药，包括但不局限于暴露后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小时。
肿瘤治疗可以包括给药细胞毒性制剂或抑制细胞的制剂，或其结合。细胞毒性制剂防止癌症细胞增殖，其通过：(1)干扰细胞复制DNA的能力(2)诱导癌症细胞中的细胞死亡或凋亡。抑制细胞的制剂通过调节、干扰或抑制细胞信号传导的过程发挥作用，其调节细胞增殖有时在低的持续水平。
可作为细胞毒性剂的化合物种类包括：烷化剂(包括但不局限于氮芥子气、次乙亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、和三氮烯)：尿嘧啶芥子气、氮芥、环磷酰胺(Cytoxan)、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙烯基-三聚氰胺、三乙烯基硫磷酰胺、白消安、卡氯芥、环己亚硝脲、链脲霉素、达卡巴嗪、和蒂清；抗代谢物(包括但不局限于叶酸抗体、嘧啶类似物、嘌呤类似物、和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脲苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨磷酸盐、pentostatine、和gemcitabine；天然产品及其衍生物(例如，长春蔓生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和鬼臼毒素)：长春碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、放线菌素D、正定霉素、阿霉素、epirubicin、柔红霉素、阿糖胞苷、泰素(泰素在商售上为Taxol)，光神霉素、去氧间型霉素、丝裂霉素-C、1-天冬酰胺酶、干扰素(优选IFN-α)、足叶乙甙和替尼泊苷。
其他的增生的细胞毒制剂是navelbene、CPT-11、阿那曲唑、来曲唑、吉西他滨、reloxafine、环磷酰胺、异环磷酰胺和droloxafine。
影响微管的制剂干扰细胞有细分裂，于是产生了本领域熟知的细胞毒性。用于本发明的影响微管的制剂包括，但不局限于allocolchicine(NSC406042)、halichondrinB(NSC609395)、秋水仙碱(NSC757)、秋水仙碱衍生物(如NSC33410)、dolastatin10(NSC376128)、美登素(NSC153858)、rhizoxin(NSC332598)、paclitaxel(Taxol，NSC125973)、Taxol衍生物(如，衍生物(如NSC608832)，thiocolchicine NSC361792)、三苯甲半胱氨酸(NSC83265)、长春碱硫酸盐(NSC49842)、长春新碱硫酸盐(NSC67574)、天然和合成的埃坡霉素，包括但不局限于埃坡霉素A、埃坡霉素B和discodermolide(见Service，(1996)Science，274：2009)磷雌氮芥、nocodazole、MAP4等等。这些制剂的例子也描述在Bulinski(1997)J Cell Sci 110：3055-3346；Panda(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：10560-10564；Muhlradt(1997)Cancer Res.57：3344-3346；Nicolaou(1997)Nature 387：268-272；Vasquez(1997)Mol Biol Cell 8：973-985；和Panda(1996)JBiolChem271：29807-29812。
另外适合的细胞毒制剂还有epidophyllotoxin；抗新生物酶；topoisomerase抑制剂；甲基苄肼；米托蒽醌；铂联合复合物如顺式铂和炭铂；生物反应调节剂；生长抑制剂；抗激素治疗剂；亚叶酸；恩世康；和造血生长因子。
细胞生长抑剂可以包括但不局限于激素和类固醇(包括合成的类似物)：17α炔雌醇、己烯雌酚、睾丸激素、强的松、氟羚甲基睾丸素、屈他雄酮丙酸盐、睾丸激素、甲地孕酮、甲基脱氢皮质甾醇、甲基睾丸激素、脱氢皮质甾醇、去炎松、hlorotrianisene、羟孕酮、氨基导眠能、磷雌氮芥、安宫黄体酮醋酸盐、醋酸亮丙瑞林、氟化酰胺、托瑞米芬、诺雷德。
其他的细胞生长抑剂是抗血管生成剂，如矩阵金属蛋白酶抑制剂、和其他的VEGF抑制剂，如抗VEGF抗体和小分子如ZD6474和SU6668页包括在内。Genetech的抗Her2抗体也可以被使用。一种合适的EGFR抑制剂是EKB-569(不可逆的抑制剂)。还包括对EGFR具免疫特异性的Imclone抗体C225和src抑制剂。
作为细胞生长抑剂的合适的制剂还包括Casodex(bicalutamide，Astra Zeneca)，其提供了男性激素依赖的癌症非增殖。依然另外一种细胞生长抑剂的例子是男性激素Tamoxifen，其抑制雌激素依赖的乳腺癌症的增殖或生长。细胞增殖信号传导的抑制剂是细胞生长抑剂。代表的例子包括表皮生长因子抑制剂、Her-2抑制剂、MEK-1激酶抑制剂、MAPK激酶抑制剂、PI3抑制剂、Src激酶抑制剂、和PDGF抑制剂。
可以根据本发明治疗各种肿瘤，包括但不局限于膀胱(包括加速的和转移的膀胱癌症)，乳腺、结肠(包括结肠直肠癌症)，肾，肝脏，肺(包括小和非小细胞肺癌症和肺腺癌症)，卵巢，前列腺，睾丸，泌尿生殖道，淋巴系统，直肠，喉，胰腺(包括外分泌胰腺癌症)，食管，胃，胆囊，子宫，甲状腺，和皮肤(包括鳞状细胞癌症)；淋巴血系的造血系统癌症，包括白血病，急性淋巴细胞白血病，急性淋巴母细胞白血病，B-细胞淋巴瘤，T-细胞淋巴瘤，赫杰森氏病，非赫杰森氏淋巴瘤，毛细胞淋巴瘤，组织细胞淋巴瘤，和Burketts淋巴瘤；骨髓血系的造血肿瘤，包括急、慢性髓性白血病，再生障碍性疾病，骨髓白血病和原髓细胞白血病；中枢和周围神经系统肿瘤包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、和雪旺氏细胞瘤；间叶细胞来源的肿瘤包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其他的肿瘤包括黑素瘤、xenodermapigmentosum、keratoactanthoma、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌症、畸胎癌症。在一个优选的实施例中，本发明用于治疗胃肠道肿瘤。
B肿瘤治疗副作用的治疗
本发明还涉及哺乳动物的治疗方法，该哺乳动遭受组成型活性NF-kB癌症症治疗所引起的正常组织损伤，该方法包括向哺乳动物投药含有治疗潜伏量的诱导NF-kB活性的制剂的组合物。诱导NF-kB活性的制剂可以与上述肿瘤治疗联合给药。
C细胞老化的调节
本发明还涉及在哺乳动物中调节细胞老化的方法，其包括向哺乳动物投药含有治疗潜伏量的诱导NF-kB活性的制剂的组合物。诱导NF-kB活性的制剂可以其他治疗联合给药。
该制剂可以在其它治疗前任何时间给药，包括但不局限于48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小时。该制剂可以在其它治疗后任何时间给药，包括但不局限于给药后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小时。
D治疗压力
本发明还涉及治疗压力引起的正常组织损伤的的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物投药含有治疗潜伏量的诱导NF-kB活性的制剂的组合物。诱导NF-kB活性的制剂可以其他治疗联合给药。压力可以来源于任何原因，包括但不局限于射线、创伤、中毒、感染、和高热应激。
含有NF-kB诱导剂的组合物可以在暴露于压力前的任何时间给药，包括但不局限于48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小时。含有NF-kB诱导剂的组合物可以在暴露于压力后的任何时间给药，包括但不局限于压力后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小时。
E放射
本发明还涉及从射线暴露中保护细胞的方法。离子辐射造成的正常细胞的损伤和死亡是对受射细胞的直接放射诱导的损伤和对涉线诱导压力的活性遗传性渐进的细胞反应共同导致的死亡或凋亡。在许多放射敏感的器官中凋亡在细胞缺失中起重要作用(即，造血和免疫系统，消化道上皮等)，其衰竭确定了生物体一般的放射敏感性。
对离子射线的暴露(IR)可以是短期的或长期的，可以是一次或多次剂量，可以是全身或局部。因此，核事故或军事攻击可涉及全身暴露于一次的高剂量射线(有时随后有长期的放射性同位素中毒)。对于骨髓移植患者的预处理也是同样(其严格控制使用的量)，当有必要为供体骨髓准备造血器官时，从受体血前体中“清除”他们。肿瘤治疗可涉及多次剂量的局部放射，如果全身放射，则其大大超过了致死量。放射性同位素的中毒和治疗导致了靶器官长期局部暴露于射线(如，125I吸入的情况的甲状腺)。最后，有许多离子射线的物理形式在其生物作用的严重性中显著不同。
在分子和细胞水平，放射粒子能产生DNA、蛋白质、细胞膜和其他大分子结构的断裂和交联。离子射线还可以通过增加自由基和活性氧种(ROS)诱导细胞成分的二级损伤。多种修复系统对抗此损伤，如恢复DNA完整性和保真度的许多DNA修复途径，清除自由基和ROS及减少被氧化的蛋白和脂质的抗氧化化学物和酶。细胞检测系统检测DNA损伤和延长细胞周期性进展，直至损伤恢复或决定细胞生长停滞或渐进性细胞死亡(凋亡)。
射线可以引起哺乳动物器官损伤，从野生型突变和低剂量的致癌症作用到几乎导致死亡的高剂量。生物体的整个放射敏感性通过许多敏感组织发生的病理改变决定，其包括造血系统、生殖系统和具有高速率细胞反转的分化的上皮细胞。
导致死亡的γ射线的急性病理作用随剂量不同而不同，通过某些器官的衰竭而确定，其定义了生物体对每种特定剂量的敏感性的阈值。因此，低剂量致死发生于骨髓发育不全，而通过诱导肠道症状的中剂量加快了杀伤。非常高的射线引起神经坏死而导致立即死亡。
射线急性毒性期存活的生物体可遭受长的远期的结果，包括受辐射几个月或几年后，射线诱导的癌症症和暴露器官的纤维化(如肾脏，肝脏或肺)。
细胞DNA是IR的主要靶子，其通过直接或间接的机制(自由基为基础的)引起多种类型的DNA损伤(基因毒的压力)。所有的有机体保留了DNA修复系统，其可地恢复放射损伤的DNA；DNA修复过程中的错误可导致突变。
肿瘤通常对γ射线更敏感，可用多种对正常组织产生相对低的损伤局部剂量治疗，。但是，在一些情况下，正常组织的损伤是肿瘤治疗中γ射线应用的一个限制性因子。在传统的肿瘤治疗中使用γ射线、三维适形、或更聚焦点的BeamCath传送也具有剂量限制的毒性，其是由累积的射线产生，并诱导快速再生的正常组织的干细胞损伤，如骨髓和胃肠(GI)道。
在高剂量下，射线诱导的致死与所述的造血和胃肠射线症状相关。造血症状的特征是造血细胞和其祖先细胞的缺失，导致了不能生成血和淋巴系统。死亡通常是感染(免疫抑制的结果)、出血和/或贫血的结果。GI症状由肠道上皮中多数细胞死亡引起，主要是小肠，随后是肠壁的不完整，并死于菌血症和败血症。造血症状通常在低剂量射线比较多，导致比GI症状延迟的死亡。
在过去，射线防护剂典型的是抗氧化剂-包括合成的和天然的。最近，细胞因子和生长因子被加入到射线防护剂中；这些射线防护剂的机制被认为是有助于敏感组织的再生。在两组射线防护剂中没有明确的功能区别，可是，一些细胞因子诱导细胞抗氧化蛋白的表达，如过氧化镁岐化酶(MnSOD)和金属硫蛋白。
特定制剂的防护检测可用剂量调节因子(DMF或DRF)表示。用一定范围的射线剂量照射辐射防护剂处理的目标物和未处理的对照物，然后比较其生存或其他终结点，从而确定DMF。DMF通常被计算30天的生存率(用对照组的LD50/30除以药物处理组的LD50/30)，并定量造血系统的保护。为了分析胃肠道系统的保护，LD50和DMF被计算6或7天的生存。除非特别指明，此处的DMF值是30天的。
NF-kB诱导剂在细胞水平以及在整个有机体水平具有强的促生存活性。为了对超致死剂量的射线反应，NF-kB诱导剂抑制肠道和造血系统症状，其是主要的急性射线暴露的致死原因。作为这些特性的结果，NF-kB诱导剂可用于治疗天然放射事件和核事故的作用。而且，由于NF-kB诱导剂通过不同于以前所知的所有射线防护剂的机制发挥作用，他们可与其他射线防护剂联合使用，从而，大大地增加了对离子射线的防护范围。
与传统射线防护剂(如自由基清除剂)相反，抗凋亡制剂也许不能降低一级放射介导的损伤，但是可以对抗二级事件，包括对一级损伤的活性细胞反应，因而补足了存在的防护线。皮斐松-α，p53的药物抑制剂(哺乳动物细胞中一种主要的放射反应调节剂)，是此种新的射线防护剂的例子。可是，p53抑制剂的活性限于保护造血系统，在消化系统没有保护作用(胃肠道症状)，因此，降低了这类化合物的治疗价值。具有很宽活性范围的抗凋亡药物绝对是需要的。
NF-kB诱导剂可被用作射线防护剂，通过超出目前方法(存在的生物防护剂的防护和应用)可达到的水平地增加人机体对射线的抵抗力来扩大可容忍的放射剂量，并大大地增加了核事故或大规模日光粒子事件中人员的生存机会。NF-kB诱导剂鞭毛蛋白的大概DMF(30天生存)大于1.5，其比目前报道任何天然化合物都有效。
NF-kB诱导剂还可用于治疗低剂量辐射引起的不可替代的细胞缺失，例如，在中枢神经系统和生殖器官中。NF-kB诱导剂还可被用于癌症症化疗中，以治疗化疗产生的副作用，包括秃头症。
再一个实施例中，治疗受辐射的哺乳动物，包括向哺乳动物投药含有治疗有效量的NF-kB诱导剂的组合物。含有NF-kB诱导剂的组合物可以与一种或多种辐射防护剂联合给药。一种或多种辐射防护剂可以是任何治疗受辐射的制剂，包括但不局限于抗氧化剂、自由基清除剂和细胞因子。
NF-kB诱导剂还可以抑制放射诱导的DNA和其他细胞结构损伤的渐进性细胞死亡；可是，NF-kB诱导剂不能处理细胞的损伤，也不能防止突变。自由基和反应氧族(ROS)是引起突变和其他细胞内损伤的主要原因。抗氧化剂和自由基清除剂可有效地防护自由基产生的损伤。NF-kB诱导剂和抗氧化剂或自由基清除剂联合使用可导致受射哺乳动物更小范围的损伤、高的生存和改善的健康状态。实际上可用于本发明的抗氧化剂和自由基清除剂包括但不局限于硫醇、如半胱氨酸、巯基乙胺、谷胱甘肽和胆红素；amifostine(WR-2721)；维生素A；维生素C；维生素E；和类黄酮，如印度荷力罗勒(Ocimum sanctum)，orientin，和vicenin。
NF-kB诱导剂还可以与多种通过补充和/或保护射线敏感干细胞群而提供放射防御的细胞因子和生长因子联合给药。可通过使用干细胞因子(SCF，c-试剂盒配体)、flt-3配体和白细胞介素1片段IL-1 b-rd而实现具有最少副作用的放射防护。可以通过诱导干细胞增殖(所有提到的细胞因子)及防止其凋亡(SCF)实现防护。治疗允许辐射前白细胞及其前体集聚，从而使辐射后免疫系统可以得到快速重建。SCF可有效地防止受辐射小鼠的死亡，DMF在1.3-1.35，其也可以有效地对抗肠道症状。Flt-3配体也可以提供对小鼠(在LD100/30时，30天生存率70-80％，相当于DMF)1.2)和兔子(15，16)的强保护。
一些因子，本质上不是细胞因子，刺激免疫细胞增殖，可以与NF-kB诱导剂联合使用。5-AED(5-雄甾烯二酮)是类固醇，可刺激细 胞因子的表达并增加对细菌和病毒感染的抗性。辐射前24小时向小鼠皮下注射5-AED可改善生存，DMF＝1.26。合成的化合物，如三氯代铵(二氧乙烯-O，O’-)碲酸盐(AS-101)可被用于诱导多种细胞因子的分泌，可与NF-kB诱导剂联合使用。
生长因子和细胞因子可被用于提供肠道症状的保护。角化细胞生长因子(KGF)促进肠粘膜的增殖和分化，在肠阴窝增加辐射后的细胞生存。造血细胞因子和放射防护SCF可以增加肠干细胞的生存及相关的短期有机体生存。
NF-kB诱导剂可保护肠道(GI)和造血系统的症状。由于暴露于全身致死辐射15Gy的小鼠多数死于肠道症状，含有NF-kB诱导剂和一种或多种GI症状抑制剂的组合物可更有效。用于本发明的GI症状抑制剂包括但不局限于细胞因子，如SCF和KGF。
含有NF-kB诱导剂的组合物可在辐射暴露于辐射前的任何时间给药，包括但不局限于包括但不局限于暴露前48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小时。含有NF-kB诱导剂的组合物可以在暴露于辐射后的任何时间给药，包括但不局限于包括但不局限于暴露后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小时。
3.制剂
本发明还涉及诱导NF-kB活性的制剂。制剂可以是人工合成的化合物或天然存在的化合物。制剂可以是低分子量的化合物、多肽或肽、或片段、类似物、同源物、其变异或衍生物。
制剂还可以是诱导NF-kB细胞因子的，包括但不局限于IL2、IL6、TNF和TGFβ。制剂还可以是前列腺素。制剂还可以是生长因子，包括但不局限于KGF和PDGF。制剂还可以是诱导NF-kB活性的抗体。
A.鞭毛蛋白
在一个实施例中，制剂是鞭毛蛋白，其可来自细菌包括但不局限于沙门氏菌属，如鼠伤寒沙门氏菌。如以下的实施例中所示的，在细胞水平和作为一个整体的有机体，鞭毛蛋白具有强的促生存活性(pro-survival)。
具有有益特性的NF-kB诱导剂的片段、变异、类似物、同源物或衍生物，如鞭毛蛋白可通过以鞭毛蛋白结构域结构为基础的合理设计得到。沙门氏菌鞭毛蛋白的结构域结构在文献中报道了(图19)。鞭毛蛋白在N末端和C末端具有保守结构域(D1和D2)，以及一个中间的高变异区(D3)(Samatey，等2001，Eaves-Pyles T.等2001a)。通过大肠杆菌埃希氏菌属铰链区分离的含有氨基酸D1和D2及羰基D1和D2(ND1-2/ECH/CD2)的重组蛋白的结果表明当连接到ECH元件时D1和D2具有生物活性。这种嵌合体，并不仅仅是铰链区，在两个小肠上皮细胞系诱导IkBα降解、NF-kB激活和NO及IL8生成。非保守的D3区在鞭毛蛋白细丝表面上，含有主要的抗原决定簇。鞭毛蛋白的有效的促炎性活性可能位于高保守的N和CD1和D2区。
B.寄生虫的NF-kB诱导剂
鞭毛蛋白的特性表明额外的NF-kB调节剂可存在于寄生虫。有许多寄生虫依赖于凋亡抑制，因为没有宿主细胞，他们不能存活。这些生物体经过适应通过分泌抗凋亡因子而在宿主有机体中有效地存活。像发展的肿瘤，这些生物体分泌的因子能增强其自身的存活，而解决与宿主压力反应防御机制的冲突。
来自寄生或共生的生物体的抗凋亡因子通过数百万年的适应而最小化了可影响宿主生存的伤害。结果，这些因子很少需要，如果有额外的修饰，可被直接应用或小量修饰后应用。这些因子可用于治疗压力介导的凋亡，如与化疗或放疗相关的副作用。
本发明还涉及筛选用于鉴别NF-kB调节剂的寄生虫的方法。该候选的调节剂可来自人或非人源寄生虫。寄生虫优选宿主细胞外寄生虫。寄生虫还可以是共生体。本发明的调节剂可分离自的寄生虫包括但不局限于支原体、衣原体和沙门氏菌。可通过此处所述的筛选方法以及生物化学和基因选择方法、体外试验、细胞死亡保护剂和体内来鉴别这些调节剂。
4.组合物
本发明还涉及含有治疗有效剂量的NF-kB诱导剂的组合物。该组合物可以是药物组合物，可以使用本领域熟知的方法制备。如上所述，含有NF-kB诱导剂的组合物可以给药于哺乳动物用于治疗凋亡相关的状态，包括但不局限于暴露于辐射、癌症治疗的副作用、压力和细胞老化。组合物可以包括另外的制剂，包括但不局限于辐射防护剂或化疗药物。
A.给药
本发明的组合物可以以任何方式给药，包括但不局限于口服、肠道外、舌下、经皮的、直肠、经粘膜、局部、经吸入、经颊给药或其组合。肠道外给药包括但不局限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鞘内、和关节内给药。在兽医中的应用，可以根据常规兽医操作以适当的配方形式给药组合物。兽医可以确定最适合特定动物的药方剂量和给药途径。
B.配方
本发明的组合物可以以传统的方式以片剂或锭剂配方。例如，用于口服给药的片剂或胶囊配方可以包含常规的赋形剂包括但不局限于结合制剂、填充剂、滑润剂、分解质和湿润剂。结合制剂包括但不局限于糖浆、accacia、凝胶、山梨醇、黄芪胶、淀粉的黏液和聚乙烯吡咯烷酮。填充剂包括但不局限于乳糖、糖、微晶体纤维素、玉米淀粉、磷酸钙、和山梨醇。滑润剂包括但不局限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、聚乙烯乙二醇、和硅石。分解质包括但不局限于土豆淀粉、乙醇酸钠淀粉。湿润剂包括但不局限于月桂醇硫酸钠。根据本领域熟知的方法将片剂包被。
本发明的组合物还可以是液体配方，包括但不局限于水或油性悬浊液、溶液、乳状液、糖浆和西也剂。组合物也可被配方成干燥的产物，使用前用水或适合的媒介物构建。这种液体制剂何以含有添加剂包括但不局限于悬浮剂、乳化剂、非水性媒介或防腐剂。悬浮剂包括但不局限于山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、凝胶、羟乙基纤维素、羰甲基纤维素、硬脂酸铝和氢化可食的脂肪。乳化剂包括但不局限于卵磷脂、山梨醇单油酸盐和阿拉伯树胶。非水性媒介包括但不局限于食用油、杏仁油、分级的椰子油、油脂、丙烯乙二醇和乙烯乙醇。防腐剂包括但不局限于甲基或丙基p-羟基安息香酸盐和山梨酸。
本发明的组合物还可以被配方成栓剂、气可以含有栓剂的基础成分，包括但不局限于可可黄油或甘油酯。本发明的组合物还可被配方成吸入剂包括但不局限于溶液、悬浮液、或乳剂，可以粉末形式或使用推动剂如二氯二氟甲烷或三氯二氟甲烷以气雾剂形式给药。本发明的组合物还可以被配方成经皮的配方，其包括水或非水媒介，包括但不局限于乳霜、药膏、洗剂、糊、药用糊、块或膜。
本发明的组合物还可被配方成肠外投药，包括但不局限于注射或持续浸剂。用于注射的配方可以是油或水性介质中的悬浮液、溶液、或乳剂的形式，可以含有配方制剂包括但不局限于悬浮的、稳定的、和分散的制剂。组合物还可以以粉末的形式被提供，使用恰当的媒介重建，包括但不局限于消过毒的，无热原质的水。
本发明的组合物还可以被配方成贮存制剂，其可通过植入或肌肉内注射给药。组合物还可被配方成合适的聚合体或疏水物质(例如以可接受的油形式的乳化剂)、离子交换树脂、或保守的溶液衍生物(例如保守的溶液衍生盐)。
C.剂量
用于治疗的制剂的治疗有效剂量随被治疗状态、需要诱导NF-kB活性的时间长短、病人的年龄和状态的不同而不同，最终由参加的医师决定。可是，一般而言，用于成年病人治疗的剂量通常在每天约0.001mg/kg-200mg/kg。剂量可以是大约每天1μg/kg-100μg/kg。通常可一次地给药所需剂量，或在恰当的时间间隔内多次给药，如，一天给药2，3，4或更多次。通常想要或需要多次剂量，因为一旦不再给药制剂，在正常的细胞内NF-kB活性会降低。
NF-kB诱导剂的剂量可以是任何剂量，包括但不局限于1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、852μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg或1mg/kg。
5.筛选方法
本发明还涉及鉴别诱导NF-kB活性的制剂的方法。可以通过一种方法鉴别诱导NF-kB活性的制剂，该方法包括将猜想的NF-kB活性诱导剂加到NF-kB激活的表达系统，与对照比较NF-kB激活表达的水平，藉由增加NF-kB激活表达系统的水平的能力鉴别NF-kB活性的诱导剂。
候选制剂可存在于数据库中(即，许多化合物)。例如，此种制剂可以被表达数据库中的DNA分子编码。候选制剂可存在于条件的介质或细胞提取物。其他此类制剂包括本领域熟知的“小分子”化合物，分子量小于105道尔顿，优选小于104道尔顿，跟优选小于103道尔顿。此种候选制剂可以作为组合的数据库的成员被提供，其包括根据多种预定的化学合成制备的合成制剂(如肽)。本领域普通技术人员应当能够理解根据确定的步骤可以制备此数据库的多种类别，并可根据此处的方法同时或相继地筛选候选制剂的数据库成员。
可以以各种形式进行筛选方法，包括体外、细胞基础的和体内分析。任何细胞可用于细胞基础的分析中。优选地，用于本发明的细胞包括哺乳动物细胞、更优选地包括人或非人类灵长类细胞。细胞基础的筛选可以使用表达NF-kB激活的代用品标记的基因修饰的肿瘤细胞来进行。此种标记包括但不局限于细菌β半乳糖苷酶、荧光素酶和增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。可应用本领域的标准技术测量代用品标记的表达量包括但不局限于比色、发光和荧光。
将猜想调节剂加入细胞，如通过混合，的条件是如果基本上没有干扰凋亡或信号的其他调节化合物存在，细胞能够进行凋亡或信号的条件。有效的条件包括但不局限于允许细胞生长的恰当的介质、温度、pH和氧状态。恰当的介质典型地是固体或液体介质，其含有生长因子和可吸收的碳、氮、和磷酸源，以及恰当的盐、矿物质、金属和其他营养物，如维生素，并包括细胞可在其中生长并表现出凋亡和信号的介质。例如，对于哺乳动物细胞，介质可以含有10％胎牛血清的Dulbecco修饰的Eagle介质。
可以在各种容器中培养细胞，包括但不局限于组织培养瓶、试管、微量滴定皿、和培养板。培养在适合细胞的温度、pH和二氧化碳含量的条件下进行。此培养条件也在本领域的范围。
将猜想调节剂加入细胞的方法包括电穿孔、微注射、细胞表达(即使用包括裸核酸分子、重组病毒、逆转录酶病毒表达载体和腺病毒表达的表达系统)，使用有助于细胞通透的离子配对试剂和去垢剂。
本发明具有多个方面，通过下述非限制性实施例描述。
实施例1
P53缺陷加速小鼠肠道症状的发展
哺乳动物离子辐射的初期致死原因依赖于射线剂量。达到9-10Gy的剂量，小鼠12-20天后死亡，主要是由于致命的骨髓缺失造血综合征(HP)。在此剂量下，受辐射小鼠可通过骨髓移植得到挽救。受到大于15Gy的动物在处理后7-12天死亡(在造血综合征杀死之前)，死于小肠-胃肠道综合征(GI)的并发症(Gudkov&Komarova 2003)。在HP和GI综合征两种情况下，组织的致死性损伤来自于大多数p53依赖的凋亡(Potten1992，Merritt 1994，Cui等1995，Potten等1994)，此观察使得我们可以较早地建议p53可以确定放射诱导的死亡。同样的，p53缺陷小鼠对抗通过HP症状进行杀伤的射线剂量(Westphal等1997，Komarov等1999)，通过小分子的p53抑制剂皮斐松α(PFT)(pifithrin-alpha)暂时药物地抑制p53可以降低6-11Gyγ射线在野生型动物中引起的死亡(Komarov等1999)。通过证实作为实验性化疗和放疗结果的毛发缺失(秃头症)的p53依赖，进一步强化了p53对基因毒性压力的敏感组织因子的定义(Botchkarev等2000)。因此，基于上述观察，大家可以期待p53在高剂量的IR后的致死性GI综合征的发展中持续起重要的作用。令人吃惊的是，p53缺陷使小鼠对高剂量导致致死的胃肠道综合征的IR敏感(图11)。IR后在p53缺陷上皮的隐窝中持续的细胞增殖于加速的隐窝受损细胞的死亡和快速的绒毛破坏相关。P53通过诱导小肠隐窝的生长停滞延长生存，因而保持肠道完整性(图12)。所以，p53的促凋亡功能加速了造血症状，而其生长停滞功能延缓了胃肠道症状。
小肠细胞的动力学已被详细的分析了。肠道上皮的细胞增殖局限于隐窝，其中有干细胞和早期增殖的祖细胞。一系列细胞分裂后，已近分化的隐窝干细胞的后代移到绒毛，在绒毛顶脱落。在小鼠的小肠中，细胞的整个“旅途”(增生部分到绒毛顶)一般需要3-5天(Potten1992，Potten等1997，Booth等2002，Somosy等2002)。虽然小肠对γ射线的反应在病理形态学水平上已被详细研究了，仍不明白的是到底是什么引起的GI致死，包括初级事件。死亡可以上皮隐窝细胞损伤及随后的绒毛剥脱，而导致的液体和电解质失衡、菌血症和毒血症的直接后果。除了炎性和间质反应，内皮的功能丧失是导致死亡的重要因素(Potten等1997，Somosy等2002)。总言之，对防止IR诱导的HP症状的有效方法，p53的药物抑制并不能对抗GI症状(如果不是有害的)。因此，有必要发展一种其他的方法，在其他机制上对小肠上皮进行放射性保护，例如，NF-kB的激活和随后的细胞死亡的抑制。
实施例2
沙门氏菌感染激活NF-kB
沙门氏菌感染导致有效的IKK和NF-kB激活以及促炎性基因的激活(Elewaut等1999)。先前的研究表明在培养的肠上皮细胞中大约30-40％的肠上皮细胞在典型的沙门氏菌感染中被感染(Valdivia等1996)。我们希望解决这个问题，宿主细胞大约30％的细菌感染是怎样使NF-kB DNA的结合活性增加到作为TNFα治疗剂量的几乎所有的宿主细胞中的NF-kB活性的。
为了详细检测这个现象，假感染或在MOI50时用野生型鼠伤寒沙门氏菌感染HT29细胞1小时，该鼠伤寒沙门氏菌用编码沙门氏菌ssaH启动子控制的绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pFM10.1转染，仅当细菌侵入宿主细胞是才具功能(Valdivia等1997)。用沙门氏菌侵入的细胞通过直接的荧光显微镜检测GFP的表达来检测。P65(RelA)定位通过使用间接的免疫荧光检测，用FITC连接的驴抗兔抗体检测兔抗p65抗体。DAPI用于染色核。
如图1A所示，GFP的表达发生在大约30-40％的细胞。下一步我们检测在未处理的(假感染)、沙门氏菌感染或TNFα(10ng/ml)刺激的细胞中NF-kB亚单位p65的定位。P65(RelA)定位于未处理细胞的细胞质中，而p65(RelA)定位于沙门氏菌感染或TNFα处理细胞的细胞核上(图1B)。这些结果表明沙门氏菌感染几乎在所有的细胞激活NF-kB，尽管只有一少部分被感染。
实施例3
鞭毛蛋白激活NF-kB
因为培养的小肠上皮细胞感染沙门氏菌仅导致大概30％的感染，而几乎全部的细胞中NF-kB都被激活，我们期望NF-kB的激活是对宿主细胞识别细菌结构成分或细菌产物的反应，而不是通过侵入过程。侵入自身被证明在激活上述认为的促炎症基因过程中不是必要的(16)。为了研究此种可行性，使用未处理的或煮沸20分钟的消毒过滤的柏林沙门氏菌培养液激发HT29小肠上皮细胞，通过暴露45分钟后制备的全细胞提取物(WCEs)的电迁移分析(EMSA)分析NF-kBDNA的结合活性(3，40)。在两种条件下观察到对培养液反应的潜伏激活，表明激活因子是热稳定的。
随后用DNase、RNase、蛋白激酶K或在100kDa的centricon过滤器上粗略地分离处理天然消毒过滤浓缩的培养液。然后用各种处理的培养液激发HT29肠上皮细胞45分钟后制备WCEs，用EMSA分析NF-kB DNA的结合活性(图2A)。通过鼠伤寒沙门氏菌1103的HT29细胞的直接感染或暴露于如所述培养液(supt)，诱导NF-kB DNA结合活性，而发现活性诱导剂对蛋白激酶消化敏感，并通过100kDa过滤器保留(图2A)。为了进一步确定NF-kB诱导活性的身份，用Superose12凝胶通透色谱(图2B)和阴离子交换色谱(图2C)分离消毒过滤浓缩的培养液培养基。分析色谱分离的水性部分对激活HT29细胞中NF-kB的能力，并用EMSA分析。如在考马斯兰染色凝胶中所见(图2B，上)，对应增加的大约55kDa的蛋白质，NF-kB DNA结合活性增强(图2B，下组4-6泳道)。如所示的在POROS HQ基质上的阴离子交换色谱和如所示的具有增加的盐梯度的结合蛋白洗提液(图2C)证明了NF-kB NDNA结合诱导活性对应了含有增加的含量的55kDa的蛋白质的色谱部分(图2C，上，数据未显示)。图2C中的洗提液被浓缩，并在预备的12％SDS-PAGE凝胶上分离，从胶上切除B1-B6的带，洗提蛋白质，沉淀，复性，并用于刺激HT29细胞。通过EMSA分析这些细胞中的全部细胞提取液的NF-kB DNA结合诱导活性，仅有对应55kDa蛋白的带2(B2)能过引起NF-kB DNA结合活性，而从开始或最后的盐剃度缓冲液不能激活NF-kB DNA结合活性(图2C，F)。
进一步对B1-B6蛋白带的蛋白和凝胶的空白区进行蛋白测序。B2蛋白质的胰蛋白酶消化和电分散离子捕获LC/MS分析鉴别出一个21个肽的氨基酸序列。鞭毛蛋白(21个肽的覆盖率为75％)毫无疑问地被鉴定为诱导NF-kB DNA结合活性的蛋白质(图3)。
实施例4
在肠上皮中需要鞭毛蛋白激活NF-kB
为了确认鞭毛蛋白到底是不是在肠上皮暴露于直接的细菌感染或治病沙门氏菌的过滤的培养液后NF-kB活性触发的因子，我们从非鞭毛蛋白的大肠杆菌DH5α、致病的柏林沙门氏菌2229、异源柏林沙门氏菌2229 SopE-突变、异源柏林沙门氏菌2229 SopB-突变、异源柏林沙门氏菌2229 SopE-/B-双突变(SE1SB2株)、鼠伤寒沙门氏菌1103、异源鼠伤寒沙门氏菌fliC-Tn10插入突变(株86)和鼠伤寒沙门氏菌1103异源双突变fliC-/fljB-中制备了感染细菌，煮沸，过滤培养液。SopE是病原性沙门氏菌噬菌体编码的蛋白被注入宿主细胞，并作为小RhoGTPases Rac1和CdC42启动的细胞骨架重排的交换因子发挥作用，最终激活MAPK、SAPK和NF-kB途径(7，15)，而SopB是作为磷酸肌糖磷酸酶发挥作用的沙门氏蛋白，参加细胞骨架重排和刺激宿主细胞分泌氯(44)。用细菌和培养液激发HT29小肠上皮细胞，45分钟后制备WCEs提取液，通过EMSA分析NF-kB DNA结合活性。沙门氏菌株能够激活NF-kB，而不能产生鞭毛蛋白的沙门氏菌株(如所述的fliC和fliC-/fljB-突变)也不能激活NF-kB(图4A&B)。大肠杆菌DH5α是非鞭毛蛋白，不产生鞭毛蛋白，不能激活NF-kB。通过多种试验我们还注意到柏林沙门氏菌的直接感染比如图4A的鼠伤寒沙门氏菌通常激活更多的NF-kB，而两种菌种的培养液几乎同样地激活NF-kB(图4B)。我们相信这种区别也许是由于在感染期间柏林沙门氏菌比鼠伤寒沙门氏菌向细胞培养介质中释放更多的鞭毛蛋白，因为从两种柏林沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的培养液中纯化并加入相同剂量的色谱纯化的鞭毛蛋白而产生相似的NF-kB激活。还注意到的是双鞭毛蛋白基因突变与在单相I鞭毛蛋白fliC::Tn10插入突变(图4A&4B中接近最后一泳道)中观察到的很小的激活相比不能激活NF-kB，原因可能是相II鞭毛蛋白的有限的表达(从fljB)，尽管此处使用的沙门氏菌株遗传上不能或很少迁移鞭毛蛋白产物的相。由于在小肠上皮细胞的直接感染中需要鞭毛蛋白激活NF-kB途径，很可能鞭毛蛋白也是其他小肠上皮细胞的致病性沙门氏菌感染激活的主要的促有丝分裂和压力激活的信号途径的主要决定因子。小肠上皮细胞直接的沙门氏菌感染导致JNK激活(8)，也通过IKK激活NF-kB(3)。
实施例5
鞭毛蛋白触发有丝分裂激活的蛋白激酶、压力激活的蛋白激酶和IKK信号途径的活性。
对于向肠腔表面的侵入，小肠上皮细胞作为哨兵发挥作用，其可通过产生细胞因子基因如IL-8和巨噬细胞化学吸引蛋白1(MCP1)促炎症的细胞因子基因如TNFα、IL-1和IL-6(1，4-6)吸引免疫细胞到局部。这些基因的表达主要依赖转录因子的活性，这些转录因子通过对MAPK、SAPK和IKK信号途径的信号传导的反应被激活。由于NF-kB被认为是促炎症基因的中枢调节/激活剂，我们决定检测不产生鞭毛蛋白的沙门氏菌突变株在激活MAPK、SAPK和IKK信号途径的作用，并与野生型沙门氏菌感染的肠上皮或暴露于纯化的鞭毛蛋白的肠上皮比较。野生型鼠伤寒沙门氏菌感染HT29细胞导致了MAPK、ERK1&2、SAPKsp38和JNK和IKK的激活(图5)，如通过免疫印迹(IB)分析中的活性指示磷酸特异性抗体分析或分别使用底物GST-cJun1-79和GST-IkBα1-54的JNK和IKK的抗体特异性免疫激酶分析(KA)所确定的那样。有趣的是，MAPK刺激在本质上是短暂的，在45分钟开始激活降低，而p38、JNK和IKK随时间超过一小时增加。如图4所见，fliC-/fljB-双突变沙门氏菌也不能诱导IKK和NF-kB的活性(如图5所示)。令人吃惊的是，fliC-/fljB-双突变沙门氏菌不能诱导SAPKs p38和JNK，仅能暂时地(15分钟)激活MAPK。此结果是令人疑惑的，原因是其他沙门氏菌蛋白如SopE和SopE2能够激活小的GTPaseRac和CdC42，这些Rho家族的GTPases与JNK和p38的激活相联系(7，8，14，15)可是在鞭毛蛋白负株中没有功能。
与野生型沙门氏菌相比，fliC-/fljB-双突变沙门氏菌不能侵入HT29细胞，如基因刺激防护/侵入分析(gentamycinprotection/invasion assay)中所确定的。鞭毛蛋白fliC-/fljB-双突变沙门氏菌在其侵入HT29细胞的能力中显示出4级不同的幅度。为了进一步说明这一点，我们用野生型沙门氏菌和fliC-/fljB-双突变沙门氏菌(株134)感染HT29细胞，用在沙门氏菌ssaH启动子控制下编码表达GFP的质粒pFM10.1转染两种菌株，仅当细菌侵入宿主细胞是才发挥功能(10，36)。很明显野生型沙门氏菌能够感染HT29细胞(GFP，图5B)而鞭毛蛋白突变细菌不能侵入HT29细胞，如没有GFP表达所验证的(图5B)。为了确定为了侵入，鞭毛蛋白是否足够或需要其他细菌产生的蛋白，我们将纯化的鞭毛蛋白或消毒过滤的培养液或其混合加入HT29细胞，用沙门氏菌fliC-/fljB-双突变激发HT29细胞，并分析侵入。使用纯化的鞭毛蛋白和/或fliC-/fljB-双突变株2培养液的所有试验组合不能侵入肠上皮细胞都。不相信鞭毛蛋白基因和III型分泌系统有直接的关联以传递细菌产物蛋白如，SopE、SopE2和SipA或其他在抑制细菌整合中起重要作用的Sip蛋白(7，14，15，45，46)的有效性。而且，为了评估鞭毛蛋白刺激p65(RelA)在肠上皮细胞中核定位的有效性，我们用纯化的鞭毛蛋白激发HT29细胞，并使用间接免疫荧光检测p65(RelA)的定位，发现p65(RelA)几乎定位于每一个细胞核(如图5B所示)。
在HT29细胞中纯化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)有效地激活NF-kB，这与TNF(10ng/ml)处理的HT29细胞中观察得到的时间依赖的方式相似(图6A)，其中WCEs在暴露后的指定的各个时间上制备，用EMSAs分析NF-kB DNA结合活性。在这些相同的提取液中分析MAPK、SAPK和IKK信号途径(图6B)，使用激活特异的磷酸抗体检测MAPK和p38激酶活性或抗体特异性免疫沉淀激酶分析检测JNK和IKK活性，证明JNK和IKK活性在一小时内增加而p38和MAPK(ERK1&2)活性在30分钟达到最大，在一小时时下降到可注意的低水平(如图6B所示)。MAPK、SAPK和IKK信号分子ERK1&2，p38，JNK，和IKK在小肠上皮细胞中对暴露于纯化的鞭毛蛋白的反应曲线与野生型沙门氏菌感染的小肠上皮细胞惊人的相似(图5A)。从这些观察中我们得出结论，此处检测到的信号系统暂时的激活(MAPK，SAPK和IKK)反映了沙门氏菌感染的早期状况，几乎可专有地通过小肠上皮细胞对鞭毛蛋白的识别和反应确定。
我们希望进一步检测纯化鞭毛蛋白沙门氏菌中的和鞭毛蛋白在肠上皮细胞中暂时的促炎症细胞因子基因表达的作用，以便区分鞭毛蛋白单独、鞭毛蛋白化的沙门氏菌或非鞭毛蛋白化的沙门氏菌感染。HT29细胞未处理、用TNFα(10ng/ml)刺激、或用鞭毛蛋白(0.5μg/ml)刺激、或用野生型鼠伤寒沙门氏菌或沙门氏菌fliC/fljB双突变(MOI50)感染。在处理或感染指定的时间后，在冰冷的PBS中回收HT29细胞，在Trizol中裂解细胞沉淀，纯化RNA，并用其制备第一链cDNA链(见实验步骤)。cDNA水溶液用于半定量RT-PCR反应中，使用IL1α、IL1β、IL-8、TNFα、MCP1和β肌动蛋白基因特异性引物(根据要求提供序列)，在含溴化二氨乙苯啡啶的1.2％的琼脂糖凝胶的上分离产物。已知的NF-kB靶基因IL1β、IL-8、TNFα、MCP1的表达在对TNFα或纯化的鞭毛蛋白暴露的反应中增加(图6C)。野生型沙门氏菌感染也能导致这些基因的激活，尽管相比之下TNFα、MCP1的表达是短暂的，发生在感染之后。沙门氏菌fliC-/fljB-双突变不能诱导IL-1β、IL-8和TNFα的表达，但是可诱导MCP1的表达，尽管水平比野生型沙门氏菌低，而且，MCP1的表达不是暂时的而是持续整个时间(9h)(图6C)。作为内部标准的β肌动蛋白的表达水平用于比较。有趣的是，在所有的处理激发的HT29细胞在反应中都刺激了非NF-kB靶基因，IL-1α。很明显，沙门氏菌fliC-/fljB-双突变能激活其他不知道的信号途径，导致IL-1α的表达。
实施例6
鞭毛蛋白以MyD88-依赖的方式激活NF-kB DNA结合
由于鞭毛蛋白能够激活与促炎症基因激活一致的需要的信号途径，这种活性与细胞因子激活相关，如TNFα激活所有存在其细胞表面受体的细胞(见图1和图5C中的p65[RelA]核定位)，我们决定检测Toll类受体其是已知的病源识别受体在暴露于鞭毛蛋白是激活NF-kB途径的潜力。为了检测这种假说，我们检测了表达腺病毒的显性负性MyD88(aa152-296)(47)在HT29细胞中鞭毛蛋白诱导的BNF-kB激活中的作用。MyD88是IL-1受体和所有已知TLR利用的转接蛋白，TLR通过他们的细胞质信号区与IL-1同源，在NF-kB途径的立即激活中是必须的(48，49)。DN-MyD88在HT29细胞中的表达阻滞了EMSA检测到的在IL-1或暴露于鞭毛蛋白的反应中的NF-kB DNA结合活性的激活，与TLR介导的NF-kB的激活作用一致。为了进一步检测这种可能性，我们开始使用野生型、MyD88-/-和TLR2-/-/TLR4-/-MEF(从日本大阪大学S.Akira得到的礼物)证实MyD88的作用，并检测两种TLR对鞭毛蛋白反应或对直接的野生型沙门氏菌感染导致NF-kB激活的有效作用(图7)。在野生型和TLR缺陷MEFs中，野生型沙门氏菌感染有效地激活NF-kB(泳道2和5)，但这种激活在MyD88缺陷的MEFs中缺失(泳道10)。用浓缩的灭菌过滤的野生型柏林沙门氏菌或双SopE-/SopB-异源突变柏林沙门氏菌SE1SB2株培养液激发的所有三种细胞，在野生型MEF和TLR2/4双缺陷细胞中激活NF-kB，而在MyD88缺陷细胞中不能激活NF-kB(比较泳道11、12与泳道3，4，6，7，16和17)。在野生型MEF中暴露与纯化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)有力地激活NF-kB，因而消除了LPS在这些实验中在NF-kB的激活中起作用的可能性。也可通过TLR2/4双缺陷MEF的有力激活排除LPS作为NF-kB激活剂的可能性(泳道16和17)。TLR2和4分别对细菌脂肽、肽聚糖、某些LPSs和γ阴性LPS发生反应(50-52)。IL-1刺激证实了在IL-1传递和鞭毛蛋白介导的信号中需要MyD88的功能。
为了进一步确定TLRs在鞭毛蛋白识别中的作用，我们分析了TLRs过度表达在通常对鞭毛蛋白反应弱的细胞中激活NF-kB的能力。选择对纯化鞭毛蛋白轻度反应的细胞可以保证鞭毛蛋白使用的信号成分和转接器的存在和功能，限制性因子看起来仅仅是对鞭毛蛋白反应的受体。我们发现Hela细胞和HEK293细胞对IL-1反应激活NF-kB DNA结合活性，而对暴露于鞭毛蛋白反应弱，我们选择HEK293细胞进一步使用，是因为他们有更强的转染效率。氨基末端FLAG决定簇标记的TLR1-9(Yale Univ.和R.Ulevitch，TSRI的R.Medzhitov来的礼物)(42，43)在HEK293细胞瞬时转染后与2x-NF-kB-依赖的启动子启动的荧光素酶受体基因一起过度表达，确定了在未处理、鞭毛蛋白(0.5μg/ml)或TNFα(10ng/ml)的反应中的荧光素酶的表达。TLR5是唯一的一种其表达导致可见的鞭毛蛋白激发细胞反应的TLR(见表1)。
为了进一步确定TLR5作为TLR通过其鞭毛蛋白激活NF-kB的可能性，我们通过去除每个TLR的羧基部分使其成为TIR结构域的保守的色氨酸来构建显性负性信号突变。IL-1受体中相似的突变取消了其导致NF-kB活性的能力(54，55)。每一个DN-TLR和反义TLR5克隆(AS-TLR5)被克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.1(Invitrogen)。所有的突变蛋白很好的表达。每一个DN-TLR哺乳动物表达载体和具有2xNF-kBLuc的空载体如上所述被转染到对鞭毛蛋白反应好的HT29细胞中。不转染的细胞未处理、用TNFα(10ng/ml)或纯化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)刺激。观察到受体基因表达不被对转染细胞TNFα刺激反应的DN-TLR表达影响(图8A)；可是，仅表达DN-TLR5或反义TLR5构建分别导致了接近50％和25％的鞭毛蛋白介导的受体基因活性的抑制(图8B)，而DN-TLR2也被发现可中度抑制鞭毛蛋白介导的受体表达。这些结果意味着TLR5是细胞表面识别鞭毛蛋白并启动导致NF-kB活性的信号途径的一部分。DN-TLR2在NF-kB依赖的受体基因激活中的作用可以是非特异的，因为与其它DN-TLRs相比，它的表达也抑制了TNFα介导的受体激活。DN-TLR2还可以竞争TLR2和TLR5享有的未知的转接器蛋白。在任何情况下，TLR2和TLR4如图7的结果所示在鞭毛蛋白介导的NF-kB的激活中不是必要的。
实施例7
鞭毛蛋白介导的NF-kB激活导致增加的TLRs系列的表达
用鼠伤寒沙门氏菌或纯化的鞭毛蛋白刺激小肠上皮细胞导致促炎症基因的激活(图6C)。我们希望检测在鞭毛蛋白刺激的细胞中TLR基因表达是否也被改变。用纯化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)处理HT29细胞，从未处理的和刺激三小时后的处理细胞分离总RNA，用于合成第一链cDNA。使用每种TLR的特定的基因特异性引物进行半定量RT-PCR，用从未刺激的和鞭毛蛋白刺激的细胞中制备第一链cDNA，用于合成DNA产物，在含有溴化二氨乙苯啡啶的1.2％琼脂糖凝胶上分离该DNA产物。在鞭毛蛋白刺激后TLRs 2、3、7的表达增加(图9)。其它TLRs的表达模式不变，β肌动蛋白用于内部对照。
TLR5在对鞭毛蛋白反应不好的细胞中表达。此研究和其他(22，33)鉴别出TLR5可能与TLR一样通过鞭毛蛋白激活NF-kB。先前的报道并没有确定细胞中TLR5的存在或量，以用于确定他的功能(22，23)。我们希望确定在不能对鞭毛蛋白的激发产生反应或反应弱的细胞中TLR5蛋白是不存在还是大大降低。在许多细胞系中用免疫印迹分析检测TLR5充分度，使用TLR5特异性抗体并与纯化鞭毛蛋白诱导的从其制备的WCEs的NF-kB DNA结合活性相比较。小肠上皮细胞系T84和HT29被用作肺腺癌症细胞系A549，人宫颈腺癌症细胞系HeLa，表达大T抗原的人胚胎肾细胞系HEK293，和胶质细胞瘤细胞系T98G。用TLR5特异的抗体通过免疫印迹在所有的细胞中检测TLR5蛋白(图10A)。T84细胞系表现出最高度富含，而其他细胞系的表达水平相似，区别不超过2倍(图10A)。从每种细胞系制备的WCEs中通过EMSA分析在未刺激细胞、TNFα和鞭毛蛋白刺激的细胞中的NF-kB DNA结合活性(图10B)。HT29和A549细胞对鞭毛蛋白和TNFα刺激反应强烈，而HeLa、293T和T98G细胞对鞭毛蛋白刺激反应弱(HeLa，293T)或没反应(T98G)。NF-kB DNA结合复合物的确实性用p65特异的抗体对超迁移NF-kB DNA：蛋白质复合物检测。令人感兴趣的是表达TLR5的一些细胞完全不反应或反应非常弱。这可能是由于缺乏胞膜或胞内受体、这些细胞系中的TLR5基因的失活或有害的突变或所需的联合受体或转接器蛋白的缺乏或量少(如在一些细胞中的TLR4和它的联合受体/转接器MD2(30，56，57))。在所有检测的细胞系中IL-1能激活NF-kB DNA结合活性，MyD88下游至NF-kB的信号器好像是完整的。
实施例8
重组鞭毛蛋白的分离
为了确定重组鞭毛蛋白能诱导NF-kB，用携带NF-kB反应荧光素酶(luc)的报告细胞检测其活性。报告构建含有3个来自结合Hsp70最小启动子的E-选择子启动子的NF-kB结合位点，通常被用于检测NF-kB。向介质中加入鞭毛蛋白6小时后在细胞裂解液中检测荧光素酶活性。用TNFα作阳性对照。结果分别在图13中显示，表明重组鞭毛蛋白能够激活NF-kB。
实施例9
鞭毛蛋白延迟IR诱导的GI症状引起的小鼠死亡
如上所述，鞭毛蛋白是NF-kB潜伏的激活剂，推断其能作为凋亡死亡抑制剂发挥作用。由于能诱导NF-kB的细胞因子可作为辐射防护剂发挥作用，我们检测了鞭毛蛋白能否作辐射防护剂。
小鼠全身受辐射15Gyγ射线辐射可导致8天内死于肠道症状(见上)，提供一个常规的辐射诱导肠道损伤的模型中。为了检测鞭毛蛋白能否防护IR的GI症状，我们检测了受辐射15Gy后小鼠死亡的动力学中静脉注射鞭毛蛋白的作用。我们用了各种计量的鞭毛蛋白，其明显低于文献报道的最大耐受量(300μg/小鼠，Eaves-Pyles，T.等，2001b)。处理4小时后照射。结果分别在图14中表示。如所预期的，对照受辐射小鼠(静脉注射PBS)处理后5-8天死亡，而接受鞭毛蛋白的动物存活明显延长；存活的延长与鞭毛蛋白的剂量有关。照射7天后小肠的病理形态学分析表明鞭毛蛋白处理组与对照组的显著差异(图15)。静脉、腹腔、和皮下注射0.2mg/kg的鞭毛蛋白后受13Gy辐射提供了相似的防护作用，导致小鼠30天的生存率为85-90％(数据未显示)。如上所示用13Gy的射线和各种给药途径进行实验确定最优计量。
实施例10
鞭毛蛋白拯救了IR诱导的造血症状致死的小鼠
下一步我们检测了鞭毛蛋白对由于HP症状导致的IR诱导的死亡是否有效，辐射通过较低的实验性辐射剂量引起的(通常最多11Gy)，其不能引起致死的GI毒性。实验与上述的相似(图14和15)，只是没用15Gy，小鼠接受了10Gy的照射，此剂量在对照组中第13天100％杀死小鼠(图16)。鞭毛蛋白处理组(5μg/小鼠)显示出对此剂量IR的完全的防护，表明鞭毛蛋白介导的射线防护不仅抗GI，也抗IR诱导的HP症状。
实施例11
鞭毛蛋白防护作用的时间依赖
为了评估鞭毛蛋白射线防护活性在治疗时间上的依赖性，在13Gyγ射线照射前不同时间注射小鼠。其中的一个结果在图17中表示。得到的结果表明照射前1-4小时注射对13Gy的射线防护有效，如果照射前24小时注射则无效。
为了评估鞭毛蛋白射线防护活性在治疗时间上的依赖性，在相对γ射线的不同时间点上注射。如上所述进行实验，每只小鼠腹腔注射5μg/小鼠(0.2mg/kg)的CBLB501或对照小鼠，注射5μg/小鼠(0.2mg/ml)的细菌RNA多聚酶。在NIH瑞士株小鼠上进行实验。结果表明如果在处理前1-2小时注射，鞭毛蛋白501可在13Gy照射后提供大约90％的生存(图17)。为了清楚仅做了-1小时的曲线，可是，两个时间点(-1和-2小时)提供相似的生存率和动力学。4小时的时间点显示一些防护的下降。放射24小时前注射鞭毛蛋白对13Gy诱导的死亡没有防护作用。
有趣的是，10Gyγ射线照射前24小时投药鞭毛蛋白提供100％的防护。而13Gy照射在小鼠中主要由GI症状诱导死亡，10Gy诱导的死亡多数是由造血症状介导的。从而，这种对10Gy照射的长期的保护可能是通过鞭毛蛋白和/或长期二级细胞因子诱导的增强的造血干细胞的增殖或生存介导的。
实施例12
确定鞭毛蛋白的LD50/30、LD50/7和DMF
我们得到了鞭毛蛋白的放射剂量依赖防护评估。如上所示(图17)，用鞭毛蛋白处理的能够100％防护10Gyγ射线(此剂量引起造血症状的死亡)，对13Gy 30天的生存为90％(造血和GI综合症)。如上所述进行实验，放射1小时前用鞭毛蛋白5μg/小鼠(0.2mg/kg)腹腔注射。
可是，在15Gy，7天生存率为100％，死亡延迟到13天之后，(30天的生存率为0％)，而对照组第7天全部死于GI综合症。
辐射后天数 辐射后天数 辐射后天数
图8，CBLB501在小鼠对全身γ射线量10、13、15Gy的敏感性上的效果(详见本文)。
(图18)15Gy照射后CBLB-501处理组的死亡的动力学治疗组死亡率为使人想起对照组在10Gy的死亡率，暗示死亡由造血综合症引起。此结果提供了鞭毛蛋白LD50/30在大约13.5-14Gy和大约1.75-1.8的DMF30的评估。此放射防护水平显著高于报道的任何天然化合物。
表1
TLR5对鞭毛蛋白反应并激活NF-kB
用空载体(pCDNA3.1)或独自列出的野生型TLR等位基因在6孔平板中转染293T细胞，重复三次。细胞未处理(未刺激)、TNFα(10ng/ml)或鞭毛蛋白(1μg/ml)处理。通过将相对于到对照Renilla荧光素酶活性表达标准化调整NF-kB报告活性，通过处理细胞的报告基因活性/未刺激细胞的报告基因活性计算诱导倍数。ND为未测定。
未刺激 TNF FliC 载体 1 13.5 4.9 TLR1 1.7 ND 5.1 TLR2 1.6 ND 5.3
TLR3 1.5 ND 5.0 TLR4 1.8 ND 5.4 TLR5 1.6 ND 9.2* TLR7 1.5 ND 5.2 TLR8 1.4 ND 5.0 TLR9 1.5 ND 5.1
相关申请的交叉参考
本发明要求2003年12月2日提交的美国临时申请No.60/526,460、2003年12月2日提交的美国临时申请No.60/526,461、2003年12月2日提交的美国临时申请No.60/526,496、和2003年12月2日提交的美国临时申请No.60/526,666的权利，这些申请在此通过参考而并入本申请。