色谱分离核酸混合物的方法

摘要

本发明的主题是一种色谱分离核酸混合物的方法，具体是把质粒脱氧核糖核酸(DNA)从核酸混合物的其它组分中，特别是从其它核酸中分离出并进行提纯的方法。本发明的主要特点是，无需添加核糖核酸酶就能把质粒DNA从污染的核糖核酸(RNA)中分离出来，而且所采用的都是成本低廉并对环境友好的组分。这些参数允许本发明方法应用于“大规模”生产质粒脱氧核糖核酸。此外，本发明还包括按照本发明方法制得的质粒脱氧核糖核酸在生产一种内含质粒DNA制剂中的应用，而这种制剂用于基因治疗和遗传疫苗接种。

权利要求

1.把质粒脱氧核糖核酸从混合物的其它组分中分离出的色谱分离法，其特征在于：a)在必要时，在水溶液中用一种或多种碱金属盐和/或碱土金属盐把核酸混合物调节到相当于在pH值为4.8至5.4以及温度为20℃时为70mS至95mS的电导率；

b)使核酸混合物和色谱载体材料接触；

c)然后，用以pH值7至7.4为基准浓度范围在900mM至1800mM的含碱金属盐溶液和/或以pH值7至7.4为基准浓度范围在100mM至240mM的含碱土金属盐溶液，将载体材料至少洗涤一次；

d)接着，用以pH值7至7.4为基准浓度为等于或高于1300mM的含碱金属盐溶液和/或以pH值7至7.4为基准浓度为等于或高于270mM的含碱土金属盐溶液，对与色谱载体材料结合的质粒DNA进行洗脱。

2.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，所述的碱金属盐是碱金属卤化物，以及所述的碱土金属盐是碱土金属卤化物。

3.根据权利要求2所述的色谱分离法，其特征在于，所述的碱金属卤化物为NaCl、KCl、CsCl和/或LiCl，以及碱土金属卤化物为CaCl2。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的色谱分离法，其特征在于，用KCl把核酸混合物调节到相当于pH值为4.8至5.4以及温度为20℃时为70mS至85mS的电导率。

5.根据权利要求4所述的色谱分离法，其特征在于，用KCl把核酸混合物调节到相当于pH值为4.8至5.4以及温度为20℃时为70mS至80mS的电导率。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的色谱分离法，其特征在于，用NaCl把核酸混合物调节到相当于pH值为4.8至5.4以及温度为20℃时为70mS至95mS的电导率。

7.根据权利要求6所述的色谱分离法，其特征在于，用NaCl把核酸混合物调节到相当于pH值为4.8至5.4以及温度为20℃时为85mS至95mS的电导率。

8.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，权利要求1的步骤c的洗涤步骤中用以pH值7至7.4为基准浓度范围在1100mM至1800mM的含KCl溶液进行洗涤。

9.根据权利要求8项所述的色谱分离法，其特征在于，权利要求1的步骤c的洗涤步骤中用以pH值7至7.4为基准浓度范围在1300mM至1700mM的含KCl溶液进行洗涤的特点。

10.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，权利要求1的步骤c的洗涤步骤中用以pH值7至7.4为基准浓度范围在950mM至1200mM的含NaCl溶液进行洗涤。

11.根据权利要求10所述的色谱分离法，其特征在于，权利要求1的步骤c的洗涤步骤中用以pH值7至7.4为基准浓度范围在1100mM至1150mM的含NaCl溶液进行洗涤。

12.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，权利要求1的步骤d的洗脱步骤用以pH值7至7.4为基准浓度为等于或高于1900mM的含KCl溶液。

13.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，权利要求1的步骤d的洗脱步骤用以pH值7至7.4为基准浓度为等于或高于1300mM的含NaCl溶液。

14.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，所述的色谱载体材料是阴离子交换剂。

15.根据权利要求14所述的色谱分离法，其特征在于，用硅胶、硅藻土、玻璃、氧化铝、氧化钛、氧化锆、羟基磷灰石、葡聚糖、琼脂糖、丙烯酰胺、聚苯乙烯树脂或前述材料的共聚物来制备所述色谱载体材料。

16.根据权利要求15项所述的色谱分离法，其特征在于，所述的色谱载体材料通过通过如下反应制得，在第一步中，使权利要求15中所列的任一种载体材料与通式I的硅烷化试剂反应：R1R2R3SiR4    (I)

式中

R1是含有1-10个碳原子的烷氧基，或者是卤原子，或者是具有相同或不同的有1-6个碳原子的烷基的二烷基氨基；

R2和R3各自独立地为含有1-10个碳原子的烃基，或是含有1-10个碳原子的烷氧基，或是卤原子或插入至少一个氧原子或氨基基团的含有4-20个碳原子的烷基，其中前述基团可被卤素、氰基、硝基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基或芳基取代一次或多次；

R4是含有1-20个碳原子的烃链或是插入至少一个氧原子或一个氨基的烷基，其中前述基团可被卤素、氰基、硝基、氨基、单烷基氨基、二二烷基氨基、烷氧基、羟基、芳基和/或环氧基取代一次或多次，在随后的第二步中，使在第一个步骤中得到改性的载体材料与通式II的试剂进行反应：X-R-Y    (II)

式中

X是氨基-、羟基-、环氧基或卤原子；

R是含有2-20个碳原子的烃链或是插入至少一个氧原子或氨基的烷基，此处的基团可被卤素、氰基、硝基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羟基、芳基和/或环氧基取代一次或多次；

Y是带有形成阴离子交换剂的官能团的烃基，含有1-10个碳原子，并可被氨基-、单烷基氨基-、二烷基氨基-、三烷基铵取代一次或多次。

17.如权利要求16所述的色谱分离法，其特征在于，R1定义中的烷氧基选自-OCH3、-OC2H5或-OC3H7。

18.如权利要求16所述的色谱分离法，其特征在于，R1定义中的卤素选自-Cl。

19.如权利要求16所述的色谱分离法，其特征在于，R2和R3定义中的烃基分别选自-CH3、-C2H5或-C3H7。

20.如权利要求16所述的色谱分离法，其特征在于，R2和R3定义中的烷氧基分别选自-OCH3、-OC2H5或-OC3H7。

21.如权利要求16所述的色谱分离法，其特征在于，R4是

22.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，所述的方法在室温下进行。

23.根据权利要求1至3中任一项所述的色谱分离法，其特征在于，至少在权利要求1的a)步骤中将KCl用作盐。

24.根据权利要求1所述的色谱分离方法，其特征在于，不同碱金属盐和/或碱土金属盐的混合物也可用于权利要求1的a)、c)和d)步骤中。

25.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，所述核酸混合物是原核细胞经过澄清的裂解产物。

26.根据权利要求1所述的色谱分离法，其特征在于，所述方法用于将质粒脱氧核糖核酸从其它核酸中分离出来。

27.根据权利要求1至26任一项所述的色谱分离法在提纯质粒脱氧核糖核酸方面的应用。

说明书

本发明的主题是一种色谱分离核酸混合物的方法，即主要是把质粒脱氧核糖核酸(DNA)从核酸混合物的其它组分中，特别是从其它核酸中分离出并进行提纯的方法。本发明的主要特点是，无需添加核糖核酸酶就能把质粒DNA从混合的核糖核酸(RNA)中分离出来，而且所采用的都是成本低廉并对环境友好的组分。分离过程的参数，允许本发明方法应用于“大规模”生产质粒脱氧核糖核酸。此外，本发明还包括按照本法制得的质粒脱氧核糖核酸在生产一种内含质粒DNA制剂中的应用，而这种制剂是用于基因治疗和遗传疫苗接种的药物。

质粒提纯的根本问题是要除去产品中其它种类的核酸。这个问题主要出现在需要提供特别纯的质粒DNA制剂的行业，例如将质粒DNA用于基因治疗的领域。前已提及的其它核酸类，主要是不同的RNAs，但也包括基因组的DNA和ssDNA(单链DNA)等。要除去RNA特别困难。根据现有的技术水平，常见的是采用核糖核酸酶除去RNA。RNA在核糖核酸酶的作用之下被降解成核糖核苷酸，从而在随后的色谱分离过程中更容易从质粒DNA中除去。这种方法的一个最大缺点是要使用RNA酶。这种酶通常为一种外源蛋白质。RNA酶是从动物材料中分离出来的，通常是从牛体材料中分离而得。特别是在制备用于人类的肠胃外治疗剂时，由于会对产品造成细菌、病毒或蛋白原性病原体污染，所以不允许在制造过程中添加动物蛋白。由于导致发生BSE(牛海绵样脑病)问题，在治疗剂制造过程中尤其不允许添加牛蛋白。

此外，使用RNA酶和含有乙醇的缓冲液会明显增加成本。尤其是在“大规模”(大约2克以上)制造质粒DNA时，所需酶和缓冲液花费的是不容低估的成本。另外，使用乙醇也是相关员工的一种负担，而且对环境来说也是应该考虑的重要因素。

从原核细胞中，还有从真核细胞中进行核酸提纯的一个普遍问题是，为了释出核酸，必需首先进行细胞的裂解。在本发明的方法中，首选采用的是Birnborn和Dohly(Nucl.Acids Res.7，pp.1513-1522；1979)所述的碱性裂解，但不局限于碱性裂解。也可以通过热裂解或在去污剂存在下进行裂解。高压裂解(弗氏压碎器)被证明是不适合的，因为高压形成的大剪切力产生了非常小的基因组DNA片，而这种DNA小片实际上不可能从质粒DNA中分离出来。

为了把核糖核酸从这样种裂解(溶胞)产物中提纯出来，现有技术中已知的有色谱分离法。色谱分离法通常又分为两种不同的方法。一种是现有技术中已知的Gillespie和Vogelstein的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，76pp.615-619；1979)。在这种方法中，核糖核酸的提纯是通过在离液盐，例如GuHCl、NaI等存在下与硅胶或硅藻土的结合来完成的。与阴离子交换剂不同，在高浓度盐的存在下结合DNA，而在低浓度盐中进行它的洗脱。由于在该法中核酸的结合遵照“要麽全部要麽没有”的原则，所以不能定量分离RNA、ssDNA和蛋白质。因此，通过该方法获得的DNA样品，由于会混杂RNA和蛋白质而不适用于基因治疗。

第二种方法是通过阴离子交换剂进行提纯，如EP 0268946所述。按照此法，细胞，例如细菌细胞，首选采用碱性裂解法。细胞蛋白质和基因组DNA利用去垢剂和随后的离心过程进行分离。这样获得的含有质粒DNA的上清液，被称为滤清的溶胞液。将此溶胞液在阴离子交换柱(例如QIAGEN GmbH，Hilden，德国)中提纯并进行定量分离RNA和ssDNA。

本发明方法的基本技术问题是从核酸混合物中提纯质粒DNA和在不使用RNA酶的情况下改进对RNA、ssDNA和基因组DNA等污染物的分离。本发明的另一个基本任务是，提出一种同样适用于“大批量”生产的成本低廉且对环境友好的质粒提纯方法。

令人意外的是，本发明的基本技术问题可通过权利要求书所述的方法来解决。在本发明的方法中，质粒DNA从核酸混合物的其它组分中，特别是从其它种类的核酸中分离出来，

a)在必要时，在水溶液中用一种或多种碱金属盐和/或碱土金属盐把核酸混合物调节到相当于在pH值为4.8至5.4以及温度为20℃时为70mS至95mS的电导率，并且

b)使核酸混合物和色谱载体材料接触，并且

a)然后，用以pH值7至7.4为基准浓度范围在900mM至1800mM的含碱金属盐溶液和/或以pH值7至7.4为基准浓度范围在100mM至240mM的含碱土金属溶液，将载体材料至少洗涤一次；并且

c)接着，用以pH值7至7.4为基准浓度为等于或高于1300mM的含碱金属盐溶液和/或以pH值7至7.4为基准浓度为等于或高于270mM的含碱土金属盐溶液，对与色谱载体材料结合的质粒DNA进行洗脱。为分离核酸混合物，必须首先裂解细胞。这些细胞可以是原核细胞或真核细胞。裂解细胞的过程可以按照上述方式进行。在本发明的方法中，原则上首选采用的是Birnborn和Dohly(Nucl.Acids Res.7，pp.1513-1522；1979)描述的碱性裂解法，但不局限于此法。其它的裂解法有热裂解法或去垢剂裂解法。高压裂解(弗氏压碎器)被证明是不适合的，因为高压形成的大剪切力产生了非常小的基因组DNA片，而这种DNA小片实际上不可能从质粒DNA中分离出来。

本发明意义上的核酸混合物，同时是一种细胞裂解液，正如一种经过预先提纯或澄清的裂解液，也可以是人工混合物其中质粒DNA被至少一种其它核酸种类以及可能的其它污染物所污染。在本发明方法的优选实施方案中，所述核酸混合物是原核澄清裂解液。

本发明的方法能够确保对前面提及的污染物进行色谱分离，并提供满足基因治疗或遗传疫苗接种纯度要求的质粒DNA。在本文中，技术人员对色谱法的理解为根据混合物在固定相和流动相之间的分配不同从而物理-化学分离所述混合物的集合概念。在这里的典型方法中，用阴离子交换剂材料来分离质粒DNA和污染物。令人吃惊的是，市售的(QIAGEN GmbH，Hilden，德国)材料特别适用于本发明方法。通过本发明的方法，这种材料能够非常有效地将RNA以及例如ssDNA与质粒DNA分离。在本申请中更详细定义的条件下，RNA和ssDNA在一个单独的峰中被洗脱出来，该峰在本发明方法中远离同样是单独的质粒DNA的峰。与本领域已知的方法相比，质粒DNA与RNA和/或ssRNA共洗脱的危险被大大降低

以商品名为(QIAGEN GmbH，Hilden，德国)购得的色谱载体材料是一种经过改性的多孔无机材料。适合于本发明方法的色谱无机载体材料有硅胶、硅藻土、玻璃、氧化铝、氧化钛、氧化锆、羟基磷灰石等，可考虑采用的有机载体材料有，如葡聚糖、琼脂糖、丙烯酰胺、聚苯乙烯树脂或所述材料单体组分的共聚物。

首选用于本发明方法的阴离子交换剂，例如可通过如下反应获得。在第一步中，使前面所列的任一种载体材料与通式I的硅烷化试剂进行反应：

R1R2R3SiR4                (I)

式中

R1是含有1-10个碳原子的烷氧基，主要是-OCH3、-OC2H5或-OC3H7，或者是卤原子，主要是-Cl，或者是具有相同或不同的有1-6个碳原子的烷基的二烷基氨基；

R2和R3各自独立地为含有1-10个碳原子的烃基，主要是-CH3、-C2H5或-C3H7，或是含有1-10个碳原子的烷氧基，主要是-OCH3、-OC2H5或-OC3H7，或是卤原子或插入至少一个氧原子或氨基基团的含有4-20个碳原子的烷基，其中前述基团可被卤素、氰基、硝基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基或芳基取代一次或多次；

R4是含有1-20个碳原子的烃链或是插入至少一个氧原子或一个氨基的烷基，其中前述基团可被卤素、氰基、硝基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羟基、芳基和/或环氧基取代一次或多次，主要是

在随后的第二步中，使在第一个步骤中得到改性的载体材料与通式II的试剂进行反应：

X-R-Y    (II)

式中

X是氨基-、羟基-、环氧基或一个卤原子；

R是含有2-20个碳原子的烃链或是插入至少一个氧原子或氨基的烷基，此处的基团可被卤素、氰基、硝基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羟基、芳基和/或环氧基取代一次或多次；

Y是一个带有形成阴离子交换剂的官能团的烃基，含有1-10个碳原子，并可被氨基-、单烷基氨基-、二烷基氨基-、三烷基铵取代一次或多次。也可参见EP 0743949第4-5页的所述，其内容已摘选并引入本文。

在优选的实施方式中，前述本发明方法的选用步骤a)中所述的核酸混合物在水溶液中用一种或多种碱金属盐和/或碱土金属盐调节到相当于在pH值为4.8至5.4以及温度为20℃时为70mS至95mS的电导率。专业人员明白，含盐溶液的电导率会依照当时的温度和pH值发生明显的波动，并可根据自己熟悉的原理，通过改变温度和/或pH值对电导率作相应调节。因此，在改变上述参数时实施本发明方法不会产生任何问题。

在本发明方法中优选采用的盐是碱金属盐和/或碱土金属盐，碱金属盐的阳离子组分或部分阳离子组分来源于元素周期表的第一主族，碱土金属盐的阳离子组分或部分阳离子组分来源于元素周期表的第二主族。特别优选的碱金属盐是碱金属卤化物，特别优选的碱土金属盐是碱土金属卤化物。特别优选使用碱金属卤化物KCl、NaCl、CsCl和/或LiCl以及碱土金属卤化物CaCl2。除碱金属盐或碱土金属盐以外，铵盐(伪碱金属盐)也可用于本发明的方法，优选的是羧酸的铵盐，更优选的是乙酸铵。最优选使用的盐是KCl和/或NaCl。除了单独的盐以外，不同碱金属盐和/或碱土金属盐的混合物也可用于本发明的方法。

在上述洗涤步骤c)中，用以pH值7至7.4为基准浓度为900-1800mM的碱金属盐和/或以pH值7至7.4为基准浓度为100-240mM的碱土金属盐洗脱污染物。从原则上说，专业人员认为合适的所有水溶液都可用于洗涤步骤，例如缓冲体系，但不限于所举下例，例如Tris、乙酸钾、硼酸盐或MOPS缓冲体系，或者非缓冲体系，即仅溶于水的盐。不同的缓冲系统也可能导致不同的pH值，或者可以调节pH值。这里选择的浓度范围是针对pH值为7-7.4而言的，从原则上说，洗涤液的pH值在上述pH范围内是可以改变的。专业人员清楚，在改变这种洗涤液的pH值时，必然会改变其所含盐的浓度，以便达到在这种情况下洗脱污染物的相同效果；这就是说，在实施该方法时，在相同的洗涤和洗脱液pH值时，污染物(例如RNA)和质粒DNA的洗脱点发生了移动，但洗脱点的关系未发生改变，这就意味着不同种类核酸的洗脱峰的间距离始终保持相同。该过程必需的参数可由专业人员根据他的专业知识来选择，无需创造性劳动。本发明的方法包括至少一次洗涤步骤，但专业人员认为合适，也可以采用多个洗涤步骤，也可采用本发明所列的互不相同的洗涤缓冲液。

在一个优选的实施方式中，用以pH值7至7.4为基准浓度为1100-1800mM的含KCl溶液进行至少一个洗涤步骤，特别优选用以pH值7至7.4为基准浓度为1300-1700mM的含KCl溶液进行至少一个洗涤步骤。

在另一个优选的实施方式中，用以pH值7至7.4为基准浓度为950-1200mM的含NaCl溶液进行至少一个洗涤步骤，特别优选用以pH值7至7.4为基准浓度为1100-1150mM的含NaCl溶液进行至少一个洗涤步骤。

在上述洗脱质粒DNA的步骤d)中，所用的是pH值为7至7.4为基准浓度等于或高于1300mM的碱金属盐和/或以pH值7至7.4为基准浓度等于或高于270mM的碱土金属盐。与洗涤步骤相似，原则上专业人员认为合适的所有水溶液，都可用于洗脱过程，例如缓冲体系，例如但不限于Tris、乙酸钾、硼酸盐或MOPS缓冲体系，或者非缓冲体系，即仅溶于水的盐。不同的缓冲系统也可能导致不同的pH值，或者可以调节pH值。这里选择的浓度范围是针对pH值范围为7至7.4而言，但是从原则上说，洗涤液的pH值是可以在上述范围内波动的。专业人员知道，在改变这种洗脱液的pH值时必然改变其所含盐的浓度，以便在这种情况下获得洗脱污染物的同等效果；这就是说，在实施该方法时，在相同的洗涤和洗脱液pH值时，污染物(例如RNA)和质粒DNA的洗脱点发生了移动，但洗脱点的关系未发生改变，这就意味着不同种类核酸的洗脱峰的间距离始终保持相同。该过程必需的参数可由专业人员根据他的专业知识来选择，无需创造性劳动。

在一个优选的实施方式中，洗脱步骤采用以pH值7至7.4为基准浓度为等于或高于1900mM的含KCl溶液进行的。KCl的上限浓度仅受在所用溶液中的溶解度所限制。

在另一个优选的实施型式中，洗脱步骤采用以pH值7至7.4为基准浓度为等于或高于1300mM的含NaCl溶液进行的。NaCl的上限浓度仅受在所用溶液中的溶解度所限制。

如上所述，在使核酸混合物和色谱分离载体材料接触前，核酸混合物的电导率同样用碱金属盐和/或碱土金属盐进行调节。在一个特别优选的实施方式中，核酸混合物用KCl调节到相当于20℃和pH 4.8-5.4时为70-85mS的电导率，特别优选地调节到相当于20℃和pH 4.8-5.4时为70-80mS的电导率。在另一个特别优选的实施方式中，核酸混合物用NaCl调节到相当于20℃和pH 4.8-5.4时为70-95mS的电导率，，特别优选地调节到相当于20℃和pH 4.8-5.4时为85-95mS的电导率。

在一个优选的实施方式中，本发明方法中至少在色谱载体材料的洗涤步骤c)中采用碱金属卤化物KCl。

本发明方法优选在室温下实施。在这种情况下，室温表示该方法在约18-25℃的常规操作条件下进行。原则上说，该方法可在专业人员认为合适的所有温度下进行。

本发明方法特别适合提纯质粒DNA。人们可以惊喜地看到，它能使大小不同的质粒在洗脱点上不出现显著的差别，也就是说在这个盐浓度下，质粒DNA都可从色谱载体材料中洗脱下来。因此不要求根据不同质粒大小改变该方法的参数，例如盐浓度或pH值。

因为本发明提供了一个可以获得“大量”质粒以制取用于基因治疗或遗传疫苗接种的含有质粒DNA制剂的方法，能够把除去内毒素技术引入本方法是非常有利和毫无问题的。为此，几乎可以利用所有具有目前技术水平的工艺方法，例如，给澄清的裂解液掺入一种现有技术中已知的清除内毒素的缓冲液(例如含有Triton X 100、Triton X 114、多粘菌素等)并无需改变便可进一步用于本发明的方法中。

附图说明

图1：
通过充填色谱材料的HPLC柱后254nm时的消光与KCl浓度的关系。表示随着KCl浓度的升高不同种类核酸的洗脱状态。试验条件，详见实施例2。
实施例
实施例1：从大肠杆菌DH5α中提纯pCMVβ
将内含pCMVβ质粒的30L大肠杆菌DH5α过夜发酵培养物离心过滤后获得1kg生物质。将该生物质在15L再悬浮缓冲液(10mM EDTA；50mM Tris/HCl pH 8)中进行再次悬浮，然后用15L溶胞缓冲液(200mM NaOH；1％(w/v)SDS)在室温下培育10分钟。随后加入15L中和缓冲液(3M乙酸钾，pH 5.5)。继而撇出该步骤中形成的沉淀物(蛋白质、膜组分、基因组DNA等)。然后再过滤这种经过初步澄清的溶胞液，从而制得澄清的溶胞液。澄清溶胞液的pH值为5.2，用3M KCl调节其电导率，使20℃的电导率为80mS。
在一个色谱分离柱中装填色谱材料(柱容积大约为7L)，并用10个柱容积的平衡缓冲液(20mM乙酸钾)以3.3cm/min的流速进行平衡。将滤清的溶胞液在色谱分离材料平衡后添加到分离柱内，该过程的流速为1.1cm/min。然后使5个柱容积的平衡缓冲液(20mM乙酸钾)以3.3cm/min的流速通过分离柱。
继而直接用10个柱容积的KCl溶液(1350mM KCl；50mM Tris/HCl，pH 7.2)以3.3cm/min的流速洗涤分离柱。然后用1个柱容积的洗脱缓冲液(1600mM NaCl；50mM Tris/HCl，pH 7.2)洗脱质粒。在经过随后进行的超滤/渗滤和最终的无菌过滤后，获得收率大约为400mg的pCMVβ。
实施例2：
在4种不同沉淀物中，每次取600μg经提纯的质粒(1：质粒A[3266bp]；2：质粒B[7200bp]；3：质粒C[7687bp]；4：质粒D[19535bp])与600μg经提纯的RNA(大肠杆菌HB101)一起溶解到5ml 60mM的乙酸钾中。
在HPLC柱(柱容积为4.4ml)中填装色谱材料，并用2个柱容积(流速1ml/min)的平衡缓冲液(60mM乙酸钾)进行平衡。然后把5ml质粒-RNA混合物以1ml/min的流速通过色谱分离柱加注到4根配有当时新装HPLC柱的单独分离柱内。然后再用3个柱容积的60mM乙酸钾冲洗前一句提及的色谱分离柱。
使Tris缓冲液以连续梯度通过分离柱(50mM Tris/HCl；pH 7.2；从0到3M KCl梯度)，然后用光度计测定DNA和RNA的洗脱状态(在254nm时进行消光测量)。在这里可以看到，已经有部分经降解的RNA及短链RNA以一个明显的峰值(在780mMKCl浓度时达到最大值)获得洗脱，接着是长链RNA的稍微扩散的峰(在1120mM KCl时达到最大值，1310mM KCl时洗脱结束)。在1900mM KCl浓度时，质粒DNA的洗脱达到最大值，在2150mM KCl浓度时，洗脱终结。这个结果在图1中以叠加轨迹线表示。显而易见，质粒的洗脱与其粒径大小无关。