生产乳酸的方法转让专利
申请号 : CN200580003209.2
文献号 : CN1914325B
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 山口育男 , 早乙女理 , 黑宫茂 , 大西彻 , 保谷典子 , 斋藤聪志 , 毛利诚 , 中野充 , 臼杵有光 , 石田亘广 , 德弘健郎 , 长森英二 , 高桥治雄
申请人 : 丰田自动车株式会社
摘要 :
生产具有前所未及的高光学纯度的乳酸。已发现当乳酸与甘油共存时，乳酸的光学纯度随乳酸消旋反应的进行而降低。通过在加热浓缩乳酸之前降低甘油量，可以将加热浓缩后的乳酸的光学纯度保持在高水平。
权利要求 :
1.生产乳酸的方法，包括通过加热在含有降低甘油量的溶液中浓缩乳酸的步骤，其中溶液中相对于乳酸的甘油量为以重量计3.5％或更低。
2.根据权利要求1的生产乳酸的方法，还包括使用具有降低的甘油生产能力的微生物通过乳酸发酵制备溶液的步骤。
3.根据权利要求2的生产乳酸的方法，其中微生物是变体，其至少一个涉及甘油生产的基因的表达受到抑制。
4.根据权利要求3的生产乳酸的方法，其中变体是编码3-磷酸甘油脱氢酶的基因被破坏的产乳酸微生物。
5.根据权利要求4的生产乳酸的方法，其中产乳酸微生物是分类为酵母属成员的微生物。
6.根据权利要求1的生产乳酸的方法，其中溶液中相对于乳酸的甘油量为以重量计0.1％或更低。
7.根据权利要求1的生产乳酸的方法，还包括使用微生物通过乳酸发酵制备溶液的步骤和从该溶液中去除甘油的步骤。
8.根据权利要求7的生产乳酸的方法，其中在去除甘油步骤中溶液中相对于乳酸的甘油量为以重量计3.5％或更低。
9.根据权利要求8的生产乳酸的方法，其中在去除甘油步骤中溶液中相对于乳酸的甘油量为以重量计0.1％或更低。
10.通过向产乳酸微生物引入变异而获得的变体，其中通过破坏编码3-磷酸甘油脱氢酶的基因的变异导致降低的甘油产生量。
11.根据权利要求10的变体，其中产乳酸微生物是分类为酵母属成员的微生物。
12.根据权利要求10的变体，其中的产乳酸微生物经过诱变而使产生的甘油量相对于乳酸以重量计低至3.5％或更低。
13.根据权利要求12的变体，其中的产乳酸微生物经过诱变而使产生的甘油量相对于乳酸以重量计低至0.1％或更低。
14.生产乳酸的方法，包括使用具有降低的甘油生产能力的微生物通过乳酸发酵产生乳酸的步骤。
15.根据权利要求14的生产乳酸的方法，其中微生物是变体，其至少一个涉及甘油生产的基因的表达受到抑制。
16.根据权利要求15的生产乳酸的方法，其中变体是3-磷酸甘油脱氢酶被破坏的产乳酸微生物。
17.根据权利要求16的生产乳酸的方法，其中产乳酸微生物是分类为酵母属成员的微生物。
18.根据权利要求16的生产乳酸的方法，其中的产乳酸微生物经过诱变而使产生的甘油量相对于乳酸以重量计降低至3.5％或更少。
19.根据权利要求18的生产乳酸的方法，其中的产乳酸微生物经过诱变而使产生的甘油量相对于乳酸以重量计降低至0.1％或更少。
20.根据权利要求18的生产乳酸的方法，其中的产乳酸微生物是经过诱变的，从而产生的甘油量相对于乳酸降低35％或更多。
说明书 :
技术领域
本发明涉及生产乳酸的方法，由此能够以高光学纯度产生用作聚乳酸等的生产材料的乳酸。
背景技术
聚乳酸是可体内降解并且在机械性能等方面优越的多聚体，因此其已用于医学领域。另外，由于它也可在自然环境中降解，从环境保护的立场，期望在多种应用中利用聚乳酸。
生产聚乳酸的方法的实例包括以乳酸为起始材料直接脱水缩合的方法、乳酸酯脱醇缩合的方法、以及丙交酯开环聚合的方法。可以使用具有高光学纯度的乳酸，以任何这些方法生产在物理性质方面优越的聚乳酸。
生产乳酸的方法的实例是发酵方法，所述发酵方法使用具有乳酸生物合成系统的微生物或被赋予乳酸生物合成体系的微生物。据认为使用发酵方法，可以使用由于其基因结构仅产生L-乳酸或D-乳酸的菌株按如上描述实现使用具有高光学纯度的乳酸作为起始原料的聚乳酸的生产。
然而，当要求聚乳酸具有更优越的物理性质时，即使使用仅产生L-乳酸或D-乳酸的菌株，也很难通过常规发酵方法制备具有足够光学纯度的乳酸。
发明内容。
因此，由于上述实际的情形，本发明的目的是提供生产乳酸的方法，由此可以生产具有高光学纯度、也可例如用作在物理性质方面优越的聚乳酸的起始原料的乳酸。
作为实现上述目标的深入研究结果，本发明的发明人发现，当乳酸与甘油共存时，乳酸的光学纯度随乳酸消旋反应进行而降低。这导致本发明的完成。
即，本发明包括下列：
(1)生产乳酸的方法，包括通过加热在含有降低甘油量的溶液中浓缩乳酸的步骤；
(2)(1)中所述生产乳酸的方法，还包括使用具有降低的甘油生产能力的微生物通过乳酸发酵制备溶液的步骤；
(3)(2)中所述生产乳酸的方法，其中微生物是其至少一个涉及甘油生产的基因的表达受到抑制的变体；
(4)(3)中所述生产乳酸的方法，其中变体是编码3-磷酸甘油脱氢酶的基因被破坏的产乳酸微生物；
(5)(4)中所述生产乳酸的方法，其中产乳酸微生物是分类为酵母(Saccharomyces)属成员的微生物。
(6)(1)中所述生产乳酸的方法，其中溶液中相对于乳酸的甘油量为以重量计3.5％或更低，更优选以重量计0.1％或更低。
(7)(1)中所述生产乳酸的方法，还包括使用微生物乳酸发酵制备溶液的步骤和从该溶液中去除甘油的步骤；
(8)(7)中所述生产乳酸的方法，其中在去除甘油步骤中溶液中相对于乳酸的甘油量为以重量计3.5％或更低，更优选以重量计0.1％或更低；
(9)通过诱变产乳酸微生物获得的变体，以便降低产生的甘油量；
(10)(9)中所述变体，其中产乳酸微生物是分类为酵母属成员的微生物；
(11)(9)中所述变体，其中通过破坏编码3-磷酸甘油脱氢酶的基因而降低了产生的甘油量；和
(12)(9)中所述变体，通过将变异引入产乳酸微生物而获得该变体，而使产生的甘油量相对于乳酸以重量计低至3.5％或更低，更优选以重量计0.1％或更低。
另外，本发明的发明人发现，在乳酸发酵中使用具有降低的甘油生产能力的微生物提高了乳酸生产效率。这导致本发明的完成。即，本发明包括下列：
(13)生产乳酸的方法，包括使用具有降低的甘油生产能力的微生物通过乳酸发酵产生乳酸的步骤；
(14)(13)中所述生产乳酸的方法，其中微生物是其至少一个涉及甘油生产的基因的表达受到抑制的变体；
(15)(14)中所述生产乳酸的方法，其中变体是3-磷酸甘油脱氢酶被破坏的产乳酸微生物；
(16)(15)中所述生产乳酸的方法，其中产乳酸微生物是分类为酵母属成员的微生物；和
(17)(15)中所述生产乳酸的方法，其中将变异引入产乳酸微生物，而使产生的甘油量相对于乳酸以重量计降低3.5％或更多，更优选以重量计0.1％或更多。
本说明书包含日本专利申请No.2004-265655的说明书中公开的部分或全部内容，所述日本专利申请No.2004-265655是本申请的优先权文件。
附图简述
图1显示使用含有L-乳酸和甘油的溶液、以GC-MS分析结果获得的层析谱。
图2显示使用含有L-乳酸和甘油的溶液、以GC-MS分析结果获得的MS谱。
图3显示使用含有L-乳酸和乙二醇的溶液、以GC-MS分析结果获得的层析谱。
图4显示使用含有L-乳酸和乙二醇的溶液、以GC-MS分析结果获得的MS谱。
实施本发明的最佳模式
此后将参考附图对本发明进行更详细的描述。
根据本发明生产乳酸的方法包括通过加热在含有降低甘油量的溶液中浓缩乳酸的步骤。具体而言，通过发酵方法将本发明应用于乳酸生产。发酵方法是培养基中的糖类由于微生物的作用而产生乳酸的现象。在下列描述中，把具有乳酸生产能力的微生物及被赋予这类能力的微生物共同称为“产乳酸细菌”。
同样，在本发明中，“降低甘油量”指通过发酵方法降低产乳酸微生物产生甘油的能力、去除和/或降解由产乳酸微生物产生的甘油或其二者。据显示，当乳酸和甘油共存时，乳酸的消旋作用基于下列反应进行。
化学式1
另外，上述反应的进行中由于在浓缩乳酸步骤中增加的热能导致不利的降低的光学纯度，该乳酸已由加热、通过加热的酯化作用或加热蒸馏产生。因此，在加热已产生的乳酸步骤之前降低甘油量，可以获得具有高光学纯度的乳酸。
关于降低甘油量的方法，此后将依次描述通过发酵方法降低产乳酸微生物的甘油生产能力的方法(方法1)和去除和/或降解由产乳酸微生物产生的甘油的方法(方法2)。
A)方法1
降低产乳酸微生物的甘油生产能力时可以使用下列方法1)至8)：
1)破坏产乳酸微生物具有的涉及甘油生产的基因；
2)抑制涉及甘油生产的基因的表达；
3)抑制由涉及甘油生产的基因编码的蛋白质的活性；
4)提高甘油代谢和降解能力；
5)抑制甘油向细胞膜外的分泌；
6)促进甘油向细胞膜内的吸收；
7)获得产生的甘油量降低的突变株；和
8)向培养基添加引起产生的甘油量降低的化合物。可以通过上述方法1)至8)中任何一项、或两项或更多项的组合降低产乳酸微生物的甘油生产能力。
可以用于根据本发明的生产乳酸的方法的产乳酸微生物的实例包括细菌、酵母和真菌之类具有乳酸生产能力的微生物。这类细菌的实例包括乳酸菌属(Lactobacillus)细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、嗜柠檬酸明串球菌属(Leuconostoc)细菌和片球菌属(Pediococcus)细菌。这类酵母的实例包括克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)酵母。这类真菌的实例包括根霉属(Rhizopus)真菌和曲霉属(Aspergillus)真菌。使用的这些产乳酸微生物特别优选为具有同型乳酸发酵能力的微生物。
另外，被赋予乳酸生产能力的微生物指最初不具有乳酸生产能力、但是通过基因工程技术改造而具有这类能力的微生物。其实例包括把涉及乳酸生产的基因引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)而获得的酵母突变体。除了这类酵母突变体，还可以在向其中引入涉及乳酸生产的基因后使用不具有乳酸产生能力的细菌、酵母和真菌。可以将这类微生物的具体实例分类为酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属、Pichia、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、丝孢酵母属(Trichosporon)、或Yamadazyma属成员。这类细菌的实例包括大肠杆菌属(Escherichia coli)细菌、发酵单胞菌属(Zymomonas)细菌和棒状杆菌类群细菌。这类真菌的实例包括根霉属细菌、曲霉属细菌和毛霉菌属细菌。
涉及乳酸生产的基因的实例包括编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的基因(LDH基因)。依赖于生物种类或体内发现许多乳酸脱氢酶(LDH)的同系物。本发明中使用的LDH不仅包括来自天然的LDH，也包括化学合成的或基因工程的、人工合成的LDH。这类LDH优选来自真核细胞(例如真菌)、或原核细胞，例如瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、thermotolerans克鲁维酵母、戴尔有孢圆酵母属(Torulaspora delbrueckii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和米根霉(Rhizopus oryzae)。它们更优选来自高等真核细胞，例如植物、动物和昆虫。其实例是牛LDH(L-LDH)。将上述生物的基因引入最初不具有产生乳酸的能力的微生物(例如上述酵母)中，从而可以赋予这类微生物乳酸生产能力。在根据本发明的生产乳酸的方法中，可以广泛使用由此获得的被赋予乳酸生产能力的微生物。
1)破坏产乳酸微生物中含有的涉及甘油生产的基因的方法
产生甘油涉及从醇脱氢酶反应体系中去除在微生物糖酵解途径中产生的乙醛，从而诱导用甘油-3-脱氢酶引起NADH氧化的发酵转化，致使甘油的产生和蓄积。涉及甘油生产的基因是编码作用于上述产生甘油的反应之一的酶的基因。
涉及甘油生产的基因的实例包括3-磷酸甘油脱氢酶基因、1-磷酸甘油脱氢酶基因和甘油激酶基因。对于酿酒酵母，这类实例更具体地包括GPD1和GPD2基因(3-磷酸甘油脱氢酶基因)、RHR2和HOR2基因(1-磷酸甘油脱氢酶基因)、以及GPP1和GPP2基因(甘油激酶基因)。
另外，对于酿酒酵母GPD1和GPD2基因的情况，在该基因之一或两者被破坏的菌株中可以降低甘油的产生(Nissen T.L.等人，Yeast 16，463-474(2000))。对于酿酒酵母RHR2和HOR2基因的情况，在该基因两者均被破坏的菌株中可以降低甘油的产生(Pahlman A.K.等人，J.Biol.Chem.276，3555-3563(2001))。
在产乳酸微生物中破坏上述基因的方法的实例包括(但是不具体限于)从基因组删除这类基因的方法和将外源DNA片段插入这类基因的方法。
如上所述，可以通过破坏涉及甘油生产的基因抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
2)抑制涉及甘油生产的基因的表达的方法
抑制涉及甘油生产的基因的表达的方法排除破坏上述基因的方法，包括抑制这些基因表达的方法。抑制基因表达的方法的实例包括抑制上述基因的转录的方法、抑制这些基因在其转录后翻译的方法、和选择性降解这些基因的mRNA的方法。
抑制上述基因转录的方法的实例更具体地包括从基因组删除这些基因的转录控制区的方法和将外源DNA片段插入这些基因转录控制区的方法。另外，通过将编码RNA诱杀剂的核酸导入细胞，可以在转录水平抑制上述基因的表达。这类RNA诱杀剂是编码转录因子结合蛋白质的基因或包含转录因子结合位点的序列或与其相似的序列的RNA。将它们作为“诱杀剂”导入细胞，从而抑制转录因子的功能。
同时，抑制上述基因的翻译的方法的实例包括反义RNA方法.反义RNA方法指引入与部分或全部mRNA杂交的反义RNA的方法、或将编码这类反义RNA的DNA片段引入宿主基因组的方法.反义RNA是具有与目的mRNA互补的核苷酸序列的RNA，以致这些RNA组成双链，致使在翻译水平抑制由该mRNA编码的基因表达.另外，除了这类反义RNA，可以使用反义DNA从而可以在转录水平抑制新基因的表达.无论如何，可以使用的反义序列包括阻断基因翻译或转录的任何核酸物质.其实例包括DNA、RNA或任意假核酸物质.因此，可以以某种方式设计反义核酸(寡核苷酸)，以致该序列与表达受到抑制的新基因的部分序列互补.同样，可以使用反义寡核苷酸的分子类似物.这类分子类似物具有高稳定性、分布特异性等.这类分子类似物的实例包括通过允许例如结合离子的乙二胺四乙酸与反义寡核苷酸结合而获得的化学反应基团.
另外，可以使用核酶在翻译水平抑制上述基因的表达。在此，核酶包括切割特定蛋白质的mRNA并抑制这类蛋白质的翻译的那些。可以基于编码特定蛋白质的基因的排列设计核酶。例如，可以通过FEBS letter，228；228-230(1988)中描述的方法设计锤头状核酶。同样，除了锤头状核酶，在本发明中也可以使用诸如发夹和δ核酶这类核酶，只要其切割特定蛋白质的mRNA并抑制这类蛋白质的翻译。
选择性降解上述基因的mRNA的方法实例包括利用RNA干涉的方法。RNA干涉是形成双链的细胞内RNA(此后称为“双链RNA”或“dsRNA”)引起具有与该RNA同源的序列的内源mRNA降解、导致基于这类mRNA的基因表达的特异性抑制现象。可以将RNA干涉称为RNAi。基于目的基因(其表达受到抑制)的核苷酸序列以某种方式设计使用RNA干涉原理的基因，从而在宿主内形成双链RNA例如发夹dsRNA。
如上所述，可以通过抑制涉及甘油生产的基因的表达抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
3)抑制由涉及甘油生产的基因编码的蛋白质活性的方法
可以通过抑制由上述涉及甘油生产的基因编码的酶的活性来抑制产乳酸微生物中的甘油产生。具体可以使用针对这类酶的抗体或特异性作用于这类酶的物质。
这类抗体可以应用已知方法获得，并且不受限于来源、种类(单克隆或多克隆)或其形状，只要它们抑制上述酶的活性。例如，只要这类抗体将上述酶识别为抗原并与其结合，可以充分使用的该抗体的实例包括(但是不具体限于)小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体和绵羊抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。然而，在同源抗体的稳定生产方面优选单克隆抗体。可以通过本领域技术人员公知的方法生产多克隆或单克隆抗体。
使用如下所述的已知方法基本上可以制作可产生单克隆抗体的杂交瘤。即，可以以某种方式产生这类杂交瘤，从而根据常规免疫方法使用目的抗原及表达这类抗原的细胞作为免疫敏化抗原，然后通过常规细胞融合方法将所获免疫细胞与已知的亲本细胞融合，随后基于常规筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)。可以根据例如Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73：3-46)产生杂交瘤。
同时，可以使用的抑制剂是具有特异性抑制酶活性的功能的物质，所述酶由上述涉及甘油生产的基因编码。
如上所述，可以通过抑制由涉及甘油生产的基因编码的酶的活性来抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
4)提高甘油代谢和降解能力
可以使用引起涉及甘油代谢的基因过表达的方法提高甘油代谢和降解能力。涉及甘油代谢的基因实例包括甘油磷酸酶基因(glycerolphosphoenzyme gene)和3-磷酸甘油脱氢酶基因.另外，其对于酿酒酵母的实例包括甘油磷酸酶基因(GUT1)、3-磷酸甘油脱氢酶基因(GUT2)、甘油脱氢酶基因(GCY1)和二氢丙酮磷酸酶基因(dihydroacetonephosphoenzyme gene)(DAK1)。
将上述基因引入产乳酸细菌中的方法不受具体限制。根据引入外源基因的形式(染色体外或染色体内)选择整合上述基因的DNA片段、质粒(DNA)、病毒(DNA)、逆转录转座子(DNA)、和线性形式的人工染色体(YAC)等，从而可以产生重组载体并将其引入产乳酸细菌中。
如上所述，可以通过提高甘油代谢和降解能力抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
5)抑制甘油向细胞膜外的分泌
可以使用破坏编码向细胞膜外分泌甘油的通道的基因的方法来抑制甘油向细胞膜外的分泌，。这类基因的实例包括酿酒酵母中的FPS1基因。
在产乳酸微生物中破坏上述基因的方法实例包括(但是不具体限于)从基因组删除该基因的方法、将外源DNA片段插入该基因的方法、以及引入导致该基因表达蛋白质的活性下降的变异的方法。
另外，根据上文“2)抑制涉及甘油生产的基因的表达的方法”中所述的方法，可以选择的方法包括抑制编码向细胞膜外分泌甘油的通道的基因的表达的方法。类似地，根据上文“3)抑制由涉及甘油生产的基因编码的蛋白质活性的方法”中所述的方法，可以选择抑制的方法包括由编码向细胞膜外分泌甘油的通道的基因编码的蛋白质活性。
如上所述，可以通过抑制向细胞膜外分泌甘油抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
6)促进甘油向细胞膜内的吸收
可以使用引起编码吸收甘油的泵的基因的过表达的方法促进甘油向细胞膜内吸收。这类基因的实例包括酿酒酵母中的GUP1和GUP2基因。
如上所述，可以通过促进甘油向细胞膜内的吸收抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
7)获得产生甘油量降低的突变株
可以使用任何突变方法作为获得酵母突变体的方法来获得产生的甘油量降低的突变株。其实例包括物理方法(例如紫外线辐射和放射)以及将酵母悬浮于矫香剂(例如甲基磺酸乙酯、N-甲基-N-硝基胍、亚硝酸、吖啶染料等溶液中)的化学方法。同样，可以通过自发突变获得目的酵母突变体，尽管所获的频率较低。
在如上所述获得的产生的甘油量降低的突变株中，甘油的产生受到抑制。在此，这类突变株的实例可以包括涉及由于甘油生物合成、甘油代谢、甘油向细胞外分泌或甘油向细胞膜内吸收的基因的突变而使其中产生的甘油量降低的突变株。该菌株不受限于引入突变的位点。
8)向培养基添加导致产生的甘油量降低的化合物
关于向培养基添加导致产生的甘油量降低的化合物，已知在酿酒酵母的情况下向培养基中添加肌醇、儿茶素、二硫化钠、抗氧化剂等会降低产生的甘油量(Caridi，A.(2002).Protective agents used to reverse themetabolic changes induced in wine yeasts by concomitant osmotic andthermal stress，Lett Appl Microbiol 35，98-101)。另外，可以添加其它引起产生的甘油量降低的化合物。
如上所述，可以通过向培养基添加导致产生的甘油量降低的化合物抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
同样，在上述方法1)至8)中，产乳酸细菌的培养条件和培养基组合物不受具体限制，从而可以在这类方法中应用常用的培养条件和培养基组合物。例如，当使用被赋予乳酸生产能力的酿酒酵母菌株TC38(GPD1和GPD2基因被破坏的菌株)作为产乳酸细菌的实例时，通常在需氧条件下执行培养，例如于25℃至38℃摇床培养或通风振荡培养12至80小时。培养期间，优选将pH保持在2.0至7.0。可以用无机或有机酸、碱溶液等调节pH。培养期间，必要时可以向培养基添加抗生素，例如潮霉素和G418。
另外，可以使用天然或合成培养基，只要其含有碳源、氮源以及可以被微生物同化的无机盐，例如培养基组合物。可使用的碳源的实例包括：碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉和纤维素；有机酸，例如乙酸和丙酸；醇，例如乙醇和丙醇；以及糖浆和木质生物质的水解产物。可以使用的氮源的实例包括：氨水；铵盐，包括无机盐或有机盐，例如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵；其它含氮化合物；蛋白胨；肉提取物；玉米浆；和酵母提取物。可以使用的无机物包括磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁(I)、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。另外，可以向培养基添加维生素，例如硫胺素、生物素、叶酸、烟酸、核黄素、吡哆醇和泛酸。
此外，当使用其它细菌时，通常在对细菌发酵约30℃至60℃、对酵母发酵约20℃至45℃的温度范围内的条件下进行培养。真菌发酵的温度范围广泛；然而，在大多数情况下在约20℃至45℃的温度范围内。培养期间，优选将pH保持在2.0至7.0。可以使用含有上述培养基组合物的培养基。
同时，根据上述方法1)至8)降低产乳酸微生物的甘油生产能力时，在含有产生的乳酸的溶液(例如培养产乳酸细菌的培养基)中，相对于该溶液中所含乳酸的甘油量优选为以重量计3.5％更低，更优选以重量计0.4％重量或更低，最优选以重量计0.1％或更低。
另外，根据上述方法1)至8)降低产乳酸微生物的甘油生产能力时，与甘油生产能力没有降低的产乳酸微生物产生的、相对于乳酸的甘油量相比，在含有产生的乳酸的溶液(例如培养产乳酸细菌的培养基)中所含的、相对于该溶液中所含乳酸的甘油量必须显著降低。该量的降低优选35％或更多，更优选90％或更多，最优选95％或更多。
方法2
去除由产乳酸微生物产生的甘油的方法包括去除由使用产乳酸微生物的发酵方法产生的甘油的步骤，从而阻止由前述化学式所示的化学反应的进行。另外，可以在下面的说明中把从产乳酸细菌培养液中去除细胞获得的溶液称为粗乳酸水溶液。
在此步骤中，可以去除由使用产乳酸细菌的发酵方法获得的粗乳酸水溶液中含有的甘油，并且可以去除产乳酸细菌培养液中含有的甘油。需要在由上述化学反应式所示的化学反应进行之前执行这些步骤。具体地，向甘油与乳酸共存的体系添加该化学反应所必需的热能，使得该反应进行。例如，在乳酸生产过程中，当通过加热浓缩由使用产乳酸细菌的发酵方法获得的粗乳酸水溶液时，优选在通过加热浓缩之前去除该粗乳酸水溶液中的甘油。
在去除甘油步骤之后，相对于乳酸的甘油量优选为以重量计3.5％或更低，更优选以重量计0.4％或更低，最优选以重量计0.1％或更低.当相对于乳酸的甘油量为以重量计3.5％或更低时，的确阻止了上述化学反应的进行.结果，对于最终获得的乳酸可能达到显著的高光学纯度.同时，当相对于乳酸的甘油量超过以重量计3.5％时，则进行了上述化学反应进行.结果，最终获得的乳酸的光学纯度不利地降低.
去除粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油的方法实例更具体地包括电渗析、离子交换方法、层析法、萃取方法(溶剂萃取方法)、离心方法、以及在修饰为趋向沉淀的物质后分离甘油的方法。注意去除粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油的技术不限于这些方法。例如，这类技术的实例包括使甘油经过化学反应从而产生另一种物质的方法。
在此，电渗析是这样的方法，即在该方法中将一对电极置于粗乳酸水溶液或培养液中，将直流电施加于该溶液，从而将乳酸和甘油分离并分别定位于不同电极附近。应用电渗析时，对于分离粗乳酸水溶液或培养液中含有的乳酸的情况，优选先使用碱制备乳酸以形成乳酸盐。离子交换方法是这样的方法，即在该方法中将粗乳酸水溶液或培养液施加于离子交换树脂，从而由于利用离子物质在离子交换树脂上的吸附将乳酸和甘油分离。层析法是这样的方法，即在该方法中将粗乳酸水溶液或培养液与展开剂一起施加于柱体，从而由于甘油和乳酸迁移速率的差异可以将甘油和乳酸分离。萃取方法是这样的方法，即在该方法中使用溶剂溶解并分离粗水溶液和培养液中含有的组成物质。离心方法是这样的方法，即在该方法中将离心力施加于粗乳酸水溶液或培养液，从而由于甘油和乳酸比重的差异将甘油和乳酸分离。在修饰为趋向沉淀的物质后分离甘油的方法的实例包括：通过向粗乳酸水溶液或培养液添加浓硫酸或烟硫酸使甘油磺化、将磺化甘油在其中沉淀、从而通过过滤粗乳酸水溶液或培养液分离乳酸和甘油的方法；以及向粗乳酸水溶液或培养液添加氢氧化钙或碳酸钙从而中和乳酸、通过冷却在其中沉淀乳酸以致产生乳酸钙、然后通过过滤该粗乳酸水溶液或培养液分离乳酸和甘油的方法。
同时，使甘油经过化学反应以产生另一种物质的方法的实例包括：允许甘油分子在酸性条件下进行脱水的方法；以及允许甘油与羰基化合物(醛化合物和酮化合物)相互反应以致产生缩醛的方法。
根据上述方法1和2，可以降低粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油量。根据本发明生产乳酸的方法包括允许溶液中的乳酸经受加热浓缩的步骤。在该步骤中，将通过方法1获得的从培养液中去除细胞而制备的溶液或通过方法2去除甘油的溶液在降低的压力下经受加热浓缩，直至该溶液中含有的乳酸浓度成为(但是不具体限于)以重量计大约60％至70％。在该方法中，降低溶液中的甘油量从而不出现由上述化学式所示的化学反应。因此，即使通过加热浓缩后也可以产生具有高光学纯度的乳酸。
具体地，在此方法中，当使用具有L-乳酸生产能力的产乳酸细菌通过发酵方法生产乳酸时，最终可以达到99％或以上的乳酸光学纯度。即使通过常规方法生产具有高光学纯度的乳酸时，也不可能产生具有99％或更高光学纯度的乳酸，所以本发明中所期望的高光学纯度前所未及。因此，优选具有99％或更高光学纯度的乳酸作为生物降解能力优越的聚乳酸的起始材料或物理性质优越的聚乳酸的起始材料。
另外，根据上述方法1和2，可以通过降低粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油量提高乳酸生产率，并且可以产生具有高光学纯度的乳酸。例如，在引入乳酸脱氢酶基因的酵母(产乳酸细菌的实例)的情况下，由于实施酵母固有的乙醇发酵，乳酸产量不必要高。因此，为了提高乳酸产量曾经尝试抑制醇发酵。然而，在醇发酵受到抑制的产乳酸酵母的情况下，除乳酸产量之外，不能获得在发酵速率、培养速率等方面充分的菌株。
另一方面，根据上述方法1和2，可以通过降低粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油量降低产生的乙醇量.由此可以提高乳酸产量.因此，根据本发明的生产乳酸的方法，可以生产光学纯度优越的具有高生产率和高产量的乳酸.
另外，本发明生产乳酸的方法可以包括与使用产乳酸细菌通过发酵方法产生乳酸的已知方法相似的处理步骤。例如，在这类发酵方法中，用氨水中和培养液和粗乳酸水溶液中含有的乳酸成分，从而形成乳酸铵。同样，在根据本发明的生产乳酸的方法中，可以用氨水中和培养液和粗乳酸水溶液中含有的乳酸成分，从而形成乳酸铵。当培养液和粗乳酸水溶液中含有乳酸铵时，经过上述加热浓缩后，分离乳酸成分，随后使用醇(例如丁醇)酯化并以乳酸盐的形式(例如乳酸丁醇)蒸馏。此后，水解并浓缩由此分离的乳酸盐，从而产生乳酸。另外，当乳酸成分没有以氨水中和、并且以乳酸的形式含于培养液和粗乳酸水溶液中时，可以产生乳酸，随后从培养液和粗乳酸水溶液直接蒸馏。
尽管本发明的技术范围不限于实施例，此后将关于实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例
在说明应用本发明的实施例之前，经证实上述式所示反应确实发生。在该实施例中，经证实甘油与乳酸之间的化学反应及乙二醇与乳酸之间的化学反应可以在实践中发生。
首先将乳酸与甘油或乙二醇以1∶2的比例(摩尔比)混合而制备溶液。然后向该溶液中添加对甲苯磺酸，随后在常压下加热(150℃，15小时)，同时蒸发溶液中含有的水份。
终止该反应后，将该溶液溶解于氯仿(以重量计1％至10％)，随后为GC-MS分析。关于GC-MS分析，在下列条件下使用四级质谱仪(JMS-AM SUN200，JEOL)和柱(DB-1，J&W Scientific)：注射温度：300℃；柱温：50℃至300℃；升温速率：5℃/分钟；氦流速：1ml/分钟。
当上述化学反应式所示的甘油和乳酸之间的化学反应在进行中时，可以检测到式中描述的环状化合物。另外，认为乙二醇与乳酸之间出现下述化学反应式所示化学反应。因此，可以检测到下述式的环状化合物。导致产生下列式所述的环状化合物的反应进行越多，L-乳酸的光学纯度越低。
化学式2
在可以同时于146和115处检测到其分子离子峰的假设上，观察到由甘油与乳酸之间的化学反应产生的环状化合物。这是因为，在与上述环状化合物结构相似的甘油二聚体的MS谱中，当去除该二聚体侧链的羟甲基时，观察到分子离子峰。另外，在可以同时于116和73处检测到其分子离子峰的假设上，观察到由乙二醇与乳酸之间的化学反应产生的环状化合物，所述环状化合物经过核实为参照实例(Macromolecules，2001，34，8641)。
作为使用含有L-乳酸和甘油的溶液的实验结果，可以观察到产生的化合物在14.5分钟的保留时间于146和115处同时显示分子离子峰(见图1和2)。另外，作为使用含有L-乳酸和乙二醇的溶液的实验结果，可以观察到产生的化合物在7分钟的保留时间于73和116处同时显示分子离子峰(见图3和4)。同样，证实峰强度比与参考文献中的描述几乎相等。(116和73处的分子离子峰之间的强度比为23∶100(Macromolecules，2001，34，8641)。)
基于上述结果可以证实，当向乳酸和甘油或乙二醇共存的体系中添加热能时，进行了上述化学反应式所示的化学反应。因此，根据这些实施例，提示可以通过在允许溶液中的乳酸经受加热浓缩之前降低该溶液中的甘油量而生产具有高光学纯度的乳酸。
[实施例1]
根据上述实施例，提示可以通过在允许溶液中的乳酸经受加热浓缩之前降低该溶液中的甘油量而生产具有高光学纯度的乳酸。因此，在该实施例中，证明可以使用产乳酸微生物通过发酵方法生产具有高光学纯度的乳酸，所述产乳酸微生物中涉及甘油生产的基因被破坏。
含有被破坏基因的菌株的产生
含有被破坏GPD1的菌株的产生
允许具有乳酸生产能力的酵母在孢子形成培养基(1％磷酸钾；0.1％酵母提取物；0/05％右旋糖；2％琼脂)中形成孢子，随后利用同宗接合二倍化，所述具有乳酸生产能力的酵母根据日本专利出版物(Kokai)No.2003-259878A(JP专利申请No.2002-65879)生产。然后，获得将LDH基因导入每个二倍染色体中的菌株。确定所获菌株为菌株KCB-27-7。
使用大肠杆菌菌株K12作为模板通过PCR扩增潮霉素抗性基因DNA片段(此后称为HPH基因)。HPH基因的DNA核苷酸序列以登录号V01499于GenBank数据库注册。所用引物是位于HPH基因两个末端的HPH-U(5′-ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC-3′(SEQ ID NO：1))和HPH-D(5′-CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG-3′(SEQ ID NO：2))。
使用酵母菌株IFO2260(注册于Institute of Fermentation)的基因组DNA作为模板通过PCR扩增TDH2启动子区DNA片段。TDH3基因的DNA核苷酸序列以登录号Z72977于GenBank数据库注册。所用引物为TDH3P-U(5′-ATA TAT GGA TCC TAG CGT TGA ATG TTA GCG TCAAC-3′；添加BtamHI位点的TDH3启动子序列(SEQ ID NO：3))和TDH-3P-D(5′-ATA TAT CCC GGG TTT GTT TGT TTA TGT GTG TTTATT CG-3′；添加SmaI位点的TDH3启动子序列(SEQ ID NO：4))。
使用酵母菌株IFO2260的基因组DNA作为模板通过PCR扩增CYC1终止子区DNA片段。CYC1终止子区的DNA核苷酸序列以登录号Z49548于GenBank数据库注册。所用引物为CYCT-U(5′-ATA TAT AAG CTTACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3′；添加HindIII位点的CYC1终止子序列(SEQ ID NO：5))和TDH-3P-D(5′-ATA TAT GTC GAC GTT ACATGC GTA CAC GCG-3′添加SalI位点的CYC1终止子序列(SEQ ID NO：5))。
将HPH基因片段插入大肠杆菌质粒pBluescriptII(Promega)的EcoRV位点.将产生的质粒命名为pBhph.在BamHI和SmaI位点切割质粒pBhph，然后在其中插入TDH3启动子片段.将产生的质粒命名为pBhph-P.还在HindIII和SalI位点切割该质粒，然后在其中插入CYC1终止子片段.将产生的质粒命名为pBhph-PT.使用pPBhph-PT作为模板执行PCR扩增DNA片段，所述DNA片段中，在添加了TDH3启动子区和CYC1终止子区的HPH基因盒的两个末端添加了部分GPD1基因(77bp).添加的GPD1基因的DNA核苷酸序列以登录号Z24454于GenBank数据库注册.所用引物为GPD1-CYC1-R(5′-TTA CGT TACCTT AAA TTC TTT CTC CCT TTA ATT TTC TTT TAT CTT ACTCTC CTA CAT AAG ACA TCA AGA AAC AAT TGg tta cat gcg tac acgcgt ttg t-3′；其中大写字母表示GPD1基因序列，小写字母表示HPH基因序列(SEQ ID NO：6))，其中将GPD1基因的-127至-51区域添加到HPH基因外部；以及GPD1-TDH3-F(5′-CTA ATC TTC ATG TAG ATCTAA TTC TTC AAT CAT GTC CGG CAG GTT CTT CAT TGG GTAGTT GTT GTA AAC GAT TTG Gta gcg ttg aat gtt agc gtc aac a-3′；其中大写字母指示GPD1基因序列，小写字母指示HPH基因序列(SEQ ID NO：7))，其中以相似的方式添加GPD1基因的+1100至+1176区域。使用产生的PCR产物，通过醋酸锂方法(Ito等人，J.Bacteriol.，153，163-168(1983))转化菌株KCB27-7。转化后，将经过转化的菌株接种到含有200μg/ml潮霉素的YPD培养基板中，并于30℃培养2天，从而获得其转化体。从转化体制备基因组DNA。然后，使用插入DNA片段的外部引物GPD1-295F(5′-TGC TTC TCT CCC CTT CTT-3′(SEQ ID NO：8))和GPD1+1472R(5′-CAG CCT CTG AAT GAG TGG T-3′(SEQ ID NO：9))，通过PCR证实将HPH基因在GPD1基因区整合到染色体中。
允许产生的菌株在孢子形成培养基中形成孢子，随后利用同宗接合二倍化。然后，获得将HPH基因整合到每个二倍染色体的GPD1基因区中从而破坏GPD1基因的菌株。确定所获菌株为菌株TC20。
含有被破坏的GPD2的菌株的生产
使用pCAT 3-Basic Vector(Promega)作为模板通过PCR扩增氯霉素抗性基因(此后称为CAT基因)的DNA片段。CAT基因的DNA核苷酸序列以登录号M16323于GenBank数据库注册。所用引物是定位于CAT基因两个末端的CAT-U(5′-ATA TAT CCC GGG ATG GAG AAA AAAATC ACT GGA TAT AC-3′(SEQ ID No：10))和CAT-D(5′-ATA TATAAG CTT TTA CGC CCC GCC CTG CCA CTC ATC-3′(SEQ ID NO：11))。
将CAT基因片段插入大肠杆菌质粒pBluescriptII(Promega)的EcoRV位点。将该质粒命名为pBCAT。在BamHI和SmaI位点切割该质粒，然后在其中插入TDH3启动子片段。将产生的质粒命名为pBCAT-P。还在HindIII和SalI位点切割该质粒，然后在其中插入CYC1终止子片段。将产生的质粒命名为pBCAT-PT。
使用pBCAT-PT作为模板进行PCR扩增DNA片段，所述DNA片段中，在添加了TDH3启动子区和CYC1终止子区的CAT基因盒的两个末端添加了部分GPD2基因。添加的GPD2基因的DNA核苷酸序列以登录号Z74801于GenBank数据库注册。所用引物为GPD2-CYC1-R
(5′-ATT TAT CCT TGG GTT CTT CTT TCT ACT CCT TTA GATTTT TTT TTT ATA TAT TAA TTT TTA AGT TTA TGT ATT TTG GTgtta cat gcg tac acg cgt ttg t-3′；其中大写字母指示GPD2基因序列，小写字母指示CAT基因序列(SEQ ID NO：12))，其中将GPD2基因的-127至-51区域添加到CAT基因外部；以及GPD2-TDH3-F
(5′-CTA TTC GTC ATC GAT GTC TAG CTC TTC AAT CATCTC CGG TAG GTC TTC CAT GCG GAC GTT GTT GTA GAC TATCTG Gta gcg ttg aat gtt agc gtc aac a-3′；其中大写字母表示GPD2基因序列，小写字母表示CAT基因序列(SEQ ID NO：13))，其中以相似的方式添加GPD2基因的+1247至+1323区域.使用产生的PCR产物，通过醋酸锂方法转化菌株KCB27-7和菌株TC20.此后，将经过转化的菌株接种到含有6mg/ml氯霉素的YPD培养基中，随后于30℃培养2天，从而获得转化体.从转化体制备基因组DNA.然后，使用插入DNA片段外部的引物GPD2-262F(5′-GTT CAG CAG CTC TTC TCT AC-3′(SEQ ID NO：14))和GPD2+1873R(5′-CGC AGT CAT CAA TCT GAT CC-3′(SEQID NO：15))，通过PCR证实将CAT基因在GPD2区整合到染色体中。
允许产生的菌株在孢子形成培养基中形成孢子，随后利用同宗接合二倍化。然后，获得将CAT基因整合到每个二倍染色体GPD2基因区中从而破坏GPD2基因的菌株。在获得的GPD2被破坏的菌株来自菌株KCB27-7的情况下，将该菌株命名为TC21，在该菌株来自菌株TC20的情况下，命名为TC38。
发酵测试1
将上面获得的转化体接种到500ml发酵培养基(蔗糖：14.4％；糖浆：0.6％)中至细胞浓度为0.3％，并于34℃、pH 5.0(以氨水中和)、气流体积0.6vvm经受3天发酵。此后，测定产生的L-乳酸和甘油量。使用生物传感器BF-4(Oji Scientific Instruments)确定L-乳酸、乙醇和甘油浓度。通过将产生L-乳酸量除以发酵前的含糖量计算基于糖的L-乳酸得率。结果列于表1。
表1
L-乳酸 (％) 甘油 (％) TC38菌株(导入LDH并且GPD1/GPD2被 破坏的菌株) 9.1 0.0082 KCB27-7菌株(导入LDH的菌株) 8.6 0.64
如表1所列，终止发酵时培养液中的L-乳酸和甘油浓度分别为以重量计9.1％(相当于以重量计10.8％的乳酸铵)及以重量计0.0082％。相对于乳酸的甘油浓度为0.1％或更低。另外，使用F-试剂盒(Roche)确定D-乳酸浓度，从而根据下列等式计算L-乳酸的光学纯度。在下列等式中，分别以“D”和“L”代表D-乳酸和L-乳酸的浓度。
等式1
(L-D)×100/(L+D)
作为计算结果，L-乳酸的光学纯度为99.93％。
发酵测试2
将上面获得的每个转化体接种到含有50ml发酵培养基(葡萄糖：4％；酵母提取物：1％)的100ml锥形瓶中至细胞浓度为0.3％，并于32℃振荡(转速：80rpm；振幅：70mm)经受2至3天发酵。此后，测定产生的L-乳酸、乙醇和甘油量。结果列于表2。
表2
L-乳 酸 (％) 乙醇 (％) 甘油 (％) 基于糖 的L-乳 酸得率 (％) 相对于L- 乳酸量的 甘油量 (％) TC 20菌株 (导入LDH并且GPD1 被破坏的菌株) 3.00 0.50 0.011 75 0.37 TC 21菌株 (导入LDH并且GPD2 被破坏的菌株) 2.84 0.58 0.091 71 3.2 TC 38菌株 (导入LDH并且 GPD1/GPD2被破坏的 菌株) 3.09 0.45 0.002 77 0.065 KCB27-7菌株 (导入LDH的菌株) 2.65 0.67 0.14 66 5.3
结果，与菌株KCB27-7相比，在GPD1被破坏的菌株和GPD2被破坏的菌株中L-乳酸产生量增加，且乙醇产生和甘油产生量降低，从而提高了基于糖的L-乳酸得率。在GPD1和GPD2被破坏的菌株的情况下，乙醇产生和甘油产生量与GPD1被破坏的菌株和GPD2被破坏的菌株相比进一步降低，从而提高了基于糖的得率。
具体而言，与菌株KCB27-7中相对于乳酸的甘油量(以重量计5.3％)相比，菌株TC20中相对于乳酸的甘油量(以重量计0.37％)降低93.0％，菌株TC21中相对于乳酸的甘油量(以重量计3.2％)降低39.6％，菌株TC38中相对于乳酸的甘油量(以重量计0.065％)降低98.8％。
因此，可以确认在GPD-1被破坏的菌株和/或GPD-2被破坏的菌株中甘油生产量的降低造成乙醇生产率的降低和乳酸生产率的提高。另外，显示基于糖的L-乳酸的产量提高5％或更高，在优选的情况下为10％或更高。
L-乳酸的纯化
首先，使用过滤器(产品名：Microza；Asahi Kasei Chemicals)从通过上述发酵方法获得的培养液分离细胞，从而制备粗乳酸水溶液。然后，将所获粗乳酸水溶液在大气压力下通过加热至124℃浓缩(热源温度：160℃)，以至于测定的粗乳酸水溶液中含有的L-乳酸浓度约为70％。
接下来，将丁醇以3倍乳酸的量(摩尔)加入经过加热浓缩的粗乳酸水溶液中.将产生的溶液在大气压力下于110℃至120℃(热源温度：160℃)反应12小时，从而将该粗乳酸水溶液中含有的乳酸铵酯化.然后，将含有乳酸丁酯的反应溶液在20托压力及120℃温度(热源温度：160℃)条件下蒸馏，从而分离和纯化乳酸丁酯.
此后，将水以16倍乳酸丁酯的量(摩尔)加入所获的经过分离和纯化的乳酸丁酯中。将产生的溶液在大气压力下于100℃(热源温度：160℃)反应8小时，从而水解乳酸丁酯。最后，将该反应溶液在大气压力下通过加热至128℃浓缩(热源温度：160℃)，以至于测定的纯化乳酸水溶液中含有的L-乳酸浓度约为90％。
确定通过上述步骤获得的L-乳酸为终产物。所获终产物中的L-乳酸的光学纯度为99.51％。另外，上述步骤后的乳酸回收率为76.0％。
[实施例2]
在该实施例中，证明可以通过去除由产乳酸细菌产生的甘油、随后允许乳酸经过加热浓缩而生产具有高光学纯度的乳酸。
产乳酸细菌和发酵方法
在该实施例中使用的产乳酸微生物是实施例1中使用的、被赋予乳酸生产能力的酿酒酵母，只是其中的GPD1和GPD2基因没有被破坏。同样，在该实施例中，在与实施例1相似的条件下实施发酵方法。
终止发酵时L-乳酸和甘油的浓度分别为以重量计8.6％(相当于以重量计10.2％的乳酸铵)和以重量计0.7％。L-乳酸的光学纯度为99.71％。
甘油的去除
在该实施例中，首先，使用过滤器(产品名：Microza；Asahi KaseiChemicals)从通过上述发酵方法获得的培养液分离细胞，从而制备粗乳酸水溶液。然后，将所获粗乳酸水溶液进行电渗析，从而分离并去除该溶液中的甘油。具体使用电渗析仪(MICRO ACILYZER S3：Asahi KaseiChemicals和筒(cartridge)(AC-110-550：Asahi Kasei Chemicals)。在该设备中，将粗乳酸水溶液置于稀释侧，将蒸馏水置于浓缩侧。以15V的应用电压实施电渗析直至在稀释侧获得0.5mS的电导率，从而将乳酸转移到浓缩侧。另外，丢弃稀释侧电导率下降的粗乳酸水溶液。然后，将粗乳酸水溶液再次至于稀释侧。重复实施电渗析。
电渗析后测定结果，粗乳酸水溶液中含有的L-乳酸和甘油的浓度分别为以重量计21.6％和以重量计0.02％。相对于L-乳酸的甘油浓度为0.1％或更低。
L-乳酸的纯化
使用Rotavapor R-220(Buchi)，将如上所述去除甘油的粗乳酸水溶液在大气压力下加热至124℃浓缩(热源温度：160℃)，以至于测定的粗乳酸水溶液中含有的L-乳酸浓度约为65％。
然后将丁醇以3倍乳酸的量(摩尔)加入经过加热浓缩的粗乳酸水溶液中。将产生的溶液在大气压力下于110℃至120℃(热源温度：160℃)乳酸的起始原料。
序列表免费文本
SEQ ID NO：1至15指合成的RNA。
反应12小时，从而将该粗乳酸水溶液中含有的乳酸铵酯化。然后，将含有乳酸丁酯的反应溶液在20托压力及120℃温度(热源温度：160℃)条件下蒸馏，从而分离和纯化乳酸丁酯。
此后，将水以16倍的乳酸丁酯量(摩尔)加入所获的经过分离及纯化的乳酸丁酯中。将产生的溶液在大气压力下于100℃(热源温度：160℃)反应8小时，从而水解乳酸丁酯。最后，将该反应溶液在大气压力下通过加热至128℃浓缩(热源温度：160℃)，以至于测定的纯化乳酸水溶液中含有的L-乳酸浓度约为90％。
确定通过上述步骤获得的L-乳酸为终产物。所获终产物中的L-乳酸的光学纯度为99.16％。另外，上述步骤后的乳酸回收率为64.8％。
[比较例]
为了比较，使用实施例2中使用的产乳酸细菌如实施例2所述实施发酵方法。在该比较例中，不去除粗乳酸水溶液中含有的甘油，然后实施后续的L-乳酸纯化。结果，终止发酵后培养液中含有的L-乳酸的光学纯度为99.71％。培养液中含有的相对于L-乳酸的甘油浓度为1％。纯化L-乳酸后，L-乳酸的光学纯度为98.40％。另外，L-乳酸的回收率为70.4％。
[结果]
从实施例1和2的结果显而易见，证明可以通过在允许L-乳酸经受加热浓缩之前降低甘油量而生产具有高光学纯度的L-乳酸。更具体而言，当乳酸在含有1％甘油的体系中经受加热浓缩时(比较例1)，L-乳酸的光学纯度为98.40％。然而，当乳酸在含有0.1％或更低甘油的体系中经受加热浓缩时(实施例1和2)，L-乳酸的光学纯度为99％或更高。因此，依照实施例1和2，建立了生产具有高光学纯度(例如99％或更高)的L-乳酸的方法。
在此引用的所有出版物、专利和专利申请全文引用作为参考。
工业适用性
根据本发明，提供生产乳酸、从而可以生产具有高光学纯度的乳酸的方法，所述具有高光学纯度的乳酸也可以用作例如具有优越物理性质的聚
序列表
<110>丰田自动车株式会社
<120>生产乳酸的方法
<130>PH-2555-PCT
<150>JP 2004-265655
<151>2004-09-13
<160>15
<170>PatentIn版本3.1
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生产聚乳酸的方法的实例包括以乳酸为起始材料直接脱水缩合的方法、乳酸酯脱醇缩合的方法、以及丙交酯开环聚合的方法。可以使用具有高光学纯度的乳酸，以任何这些方法生产在物理性质方面优越的聚乳酸。
生产乳酸的方法的实例是发酵方法，所述发酵方法使用具有乳酸生物合成系统的微生物或被赋予乳酸生物合成体系的微生物。据认为使用发酵方法，可以使用由于其基因结构仅产生L-乳酸或D-乳酸的菌株按如上描述实现使用具有高光学纯度的乳酸作为起始原料的聚乳酸的生产。
然而，当要求聚乳酸具有更优越的物理性质时，即使使用仅产生L-乳酸或D-乳酸的菌株，也很难通过常规发酵方法制备具有足够光学纯度的乳酸。
发明内容。
因此，由于上述实际的情形，本发明的目的是提供生产乳酸的方法，由此可以生产具有高光学纯度、也可例如用作在物理性质方面优越的聚乳酸的起始原料的乳酸。
作为实现上述目标的深入研究结果，本发明的发明人发现，当乳酸与甘油共存时，乳酸的光学纯度随乳酸消旋反应进行而降低。这导致本发明的完成。
即，本发明包括下列：
(1)生产乳酸的方法，包括通过加热在含有降低甘油量的溶液中浓缩乳酸的步骤；
(2)(1)中所述生产乳酸的方法，还包括使用具有降低的甘油生产能力的微生物通过乳酸发酵制备溶液的步骤；
(3)(2)中所述生产乳酸的方法，其中微生物是其至少一个涉及甘油生产的基因的表达受到抑制的变体；
(4)(3)中所述生产乳酸的方法，其中变体是编码3-磷酸甘油脱氢酶的基因被破坏的产乳酸微生物；
(5)(4)中所述生产乳酸的方法，其中产乳酸微生物是分类为酵母(Saccharomyces)属成员的微生物。
(6)(1)中所述生产乳酸的方法，其中溶液中相对于乳酸的甘油量为以重量计3.5％或更低，更优选以重量计0.1％或更低。
(7)(1)中所述生产乳酸的方法，还包括使用微生物乳酸发酵制备溶液的步骤和从该溶液中去除甘油的步骤；
(8)(7)中所述生产乳酸的方法，其中在去除甘油步骤中溶液中相对于乳酸的甘油量为以重量计3.5％或更低，更优选以重量计0.1％或更低；
(9)通过诱变产乳酸微生物获得的变体，以便降低产生的甘油量；
(10)(9)中所述变体，其中产乳酸微生物是分类为酵母属成员的微生物；
(11)(9)中所述变体，其中通过破坏编码3-磷酸甘油脱氢酶的基因而降低了产生的甘油量；和
(12)(9)中所述变体，通过将变异引入产乳酸微生物而获得该变体，而使产生的甘油量相对于乳酸以重量计低至3.5％或更低，更优选以重量计0.1％或更低。
另外，本发明的发明人发现，在乳酸发酵中使用具有降低的甘油生产能力的微生物提高了乳酸生产效率。这导致本发明的完成。即，本发明包括下列：
(13)生产乳酸的方法，包括使用具有降低的甘油生产能力的微生物通过乳酸发酵产生乳酸的步骤；
(14)(13)中所述生产乳酸的方法，其中微生物是其至少一个涉及甘油生产的基因的表达受到抑制的变体；
(15)(14)中所述生产乳酸的方法，其中变体是3-磷酸甘油脱氢酶被破坏的产乳酸微生物；
(16)(15)中所述生产乳酸的方法，其中产乳酸微生物是分类为酵母属成员的微生物；和
(17)(15)中所述生产乳酸的方法，其中将变异引入产乳酸微生物，而使产生的甘油量相对于乳酸以重量计降低3.5％或更多，更优选以重量计0.1％或更多。
本说明书包含日本专利申请No.2004-265655的说明书中公开的部分或全部内容，所述日本专利申请No.2004-265655是本申请的优先权文件。
附图简述
图1显示使用含有L-乳酸和甘油的溶液、以GC-MS分析结果获得的层析谱。
图2显示使用含有L-乳酸和甘油的溶液、以GC-MS分析结果获得的MS谱。
图3显示使用含有L-乳酸和乙二醇的溶液、以GC-MS分析结果获得的层析谱。
图4显示使用含有L-乳酸和乙二醇的溶液、以GC-MS分析结果获得的MS谱。
实施本发明的最佳模式
此后将参考附图对本发明进行更详细的描述。
根据本发明生产乳酸的方法包括通过加热在含有降低甘油量的溶液中浓缩乳酸的步骤。具体而言，通过发酵方法将本发明应用于乳酸生产。发酵方法是培养基中的糖类由于微生物的作用而产生乳酸的现象。在下列描述中，把具有乳酸生产能力的微生物及被赋予这类能力的微生物共同称为“产乳酸细菌”。
同样，在本发明中，“降低甘油量”指通过发酵方法降低产乳酸微生物产生甘油的能力、去除和/或降解由产乳酸微生物产生的甘油或其二者。据显示，当乳酸和甘油共存时，乳酸的消旋作用基于下列反应进行。
化学式1
另外，上述反应的进行中由于在浓缩乳酸步骤中增加的热能导致不利的降低的光学纯度，该乳酸已由加热、通过加热的酯化作用或加热蒸馏产生。因此，在加热已产生的乳酸步骤之前降低甘油量，可以获得具有高光学纯度的乳酸。
关于降低甘油量的方法，此后将依次描述通过发酵方法降低产乳酸微生物的甘油生产能力的方法(方法1)和去除和/或降解由产乳酸微生物产生的甘油的方法(方法2)。
A)方法1
降低产乳酸微生物的甘油生产能力时可以使用下列方法1)至8)：
1)破坏产乳酸微生物具有的涉及甘油生产的基因；
2)抑制涉及甘油生产的基因的表达；
3)抑制由涉及甘油生产的基因编码的蛋白质的活性；
4)提高甘油代谢和降解能力；
5)抑制甘油向细胞膜外的分泌；
6)促进甘油向细胞膜内的吸收；
7)获得产生的甘油量降低的突变株；和
8)向培养基添加引起产生的甘油量降低的化合物。可以通过上述方法1)至8)中任何一项、或两项或更多项的组合降低产乳酸微生物的甘油生产能力。
可以用于根据本发明的生产乳酸的方法的产乳酸微生物的实例包括细菌、酵母和真菌之类具有乳酸生产能力的微生物。这类细菌的实例包括乳酸菌属(Lactobacillus)细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、嗜柠檬酸明串球菌属(Leuconostoc)细菌和片球菌属(Pediococcus)细菌。这类酵母的实例包括克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)酵母。这类真菌的实例包括根霉属(Rhizopus)真菌和曲霉属(Aspergillus)真菌。使用的这些产乳酸微生物特别优选为具有同型乳酸发酵能力的微生物。
另外，被赋予乳酸生产能力的微生物指最初不具有乳酸生产能力、但是通过基因工程技术改造而具有这类能力的微生物。其实例包括把涉及乳酸生产的基因引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)而获得的酵母突变体。除了这类酵母突变体，还可以在向其中引入涉及乳酸生产的基因后使用不具有乳酸产生能力的细菌、酵母和真菌。可以将这类微生物的具体实例分类为酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属、Pichia、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、丝孢酵母属(Trichosporon)、或Yamadazyma属成员。这类细菌的实例包括大肠杆菌属(Escherichia coli)细菌、发酵单胞菌属(Zymomonas)细菌和棒状杆菌类群细菌。这类真菌的实例包括根霉属细菌、曲霉属细菌和毛霉菌属细菌。
涉及乳酸生产的基因的实例包括编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的基因(LDH基因)。依赖于生物种类或体内发现许多乳酸脱氢酶(LDH)的同系物。本发明中使用的LDH不仅包括来自天然的LDH，也包括化学合成的或基因工程的、人工合成的LDH。这类LDH优选来自真核细胞(例如真菌)、或原核细胞，例如瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、thermotolerans克鲁维酵母、戴尔有孢圆酵母属(Torulaspora delbrueckii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和米根霉(Rhizopus oryzae)。它们更优选来自高等真核细胞，例如植物、动物和昆虫。其实例是牛LDH(L-LDH)。将上述生物的基因引入最初不具有产生乳酸的能力的微生物(例如上述酵母)中，从而可以赋予这类微生物乳酸生产能力。在根据本发明的生产乳酸的方法中，可以广泛使用由此获得的被赋予乳酸生产能力的微生物。
1)破坏产乳酸微生物中含有的涉及甘油生产的基因的方法
产生甘油涉及从醇脱氢酶反应体系中去除在微生物糖酵解途径中产生的乙醛，从而诱导用甘油-3-脱氢酶引起NADH氧化的发酵转化，致使甘油的产生和蓄积。涉及甘油生产的基因是编码作用于上述产生甘油的反应之一的酶的基因。
涉及甘油生产的基因的实例包括3-磷酸甘油脱氢酶基因、1-磷酸甘油脱氢酶基因和甘油激酶基因。对于酿酒酵母，这类实例更具体地包括GPD1和GPD2基因(3-磷酸甘油脱氢酶基因)、RHR2和HOR2基因(1-磷酸甘油脱氢酶基因)、以及GPP1和GPP2基因(甘油激酶基因)。
另外，对于酿酒酵母GPD1和GPD2基因的情况，在该基因之一或两者被破坏的菌株中可以降低甘油的产生(Nissen T.L.等人，Yeast 16，463-474(2000))。对于酿酒酵母RHR2和HOR2基因的情况，在该基因两者均被破坏的菌株中可以降低甘油的产生(Pahlman A.K.等人，J.Biol.Chem.276，3555-3563(2001))。
在产乳酸微生物中破坏上述基因的方法的实例包括(但是不具体限于)从基因组删除这类基因的方法和将外源DNA片段插入这类基因的方法。
如上所述，可以通过破坏涉及甘油生产的基因抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
2)抑制涉及甘油生产的基因的表达的方法
抑制涉及甘油生产的基因的表达的方法排除破坏上述基因的方法，包括抑制这些基因表达的方法。抑制基因表达的方法的实例包括抑制上述基因的转录的方法、抑制这些基因在其转录后翻译的方法、和选择性降解这些基因的mRNA的方法。
抑制上述基因转录的方法的实例更具体地包括从基因组删除这些基因的转录控制区的方法和将外源DNA片段插入这些基因转录控制区的方法。另外，通过将编码RNA诱杀剂的核酸导入细胞，可以在转录水平抑制上述基因的表达。这类RNA诱杀剂是编码转录因子结合蛋白质的基因或包含转录因子结合位点的序列或与其相似的序列的RNA。将它们作为“诱杀剂”导入细胞，从而抑制转录因子的功能。
同时，抑制上述基因的翻译的方法的实例包括反义RNA方法.反义RNA方法指引入与部分或全部mRNA杂交的反义RNA的方法、或将编码这类反义RNA的DNA片段引入宿主基因组的方法.反义RNA是具有与目的mRNA互补的核苷酸序列的RNA，以致这些RNA组成双链，致使在翻译水平抑制由该mRNA编码的基因表达.另外，除了这类反义RNA，可以使用反义DNA从而可以在转录水平抑制新基因的表达.无论如何，可以使用的反义序列包括阻断基因翻译或转录的任何核酸物质.其实例包括DNA、RNA或任意假核酸物质.因此，可以以某种方式设计反义核酸(寡核苷酸)，以致该序列与表达受到抑制的新基因的部分序列互补.同样，可以使用反义寡核苷酸的分子类似物.这类分子类似物具有高稳定性、分布特异性等.这类分子类似物的实例包括通过允许例如结合离子的乙二胺四乙酸与反义寡核苷酸结合而获得的化学反应基团.
另外，可以使用核酶在翻译水平抑制上述基因的表达。在此，核酶包括切割特定蛋白质的mRNA并抑制这类蛋白质的翻译的那些。可以基于编码特定蛋白质的基因的排列设计核酶。例如，可以通过FEBS letter，228；228-230(1988)中描述的方法设计锤头状核酶。同样，除了锤头状核酶，在本发明中也可以使用诸如发夹和δ核酶这类核酶，只要其切割特定蛋白质的mRNA并抑制这类蛋白质的翻译。
选择性降解上述基因的mRNA的方法实例包括利用RNA干涉的方法。RNA干涉是形成双链的细胞内RNA(此后称为“双链RNA”或“dsRNA”)引起具有与该RNA同源的序列的内源mRNA降解、导致基于这类mRNA的基因表达的特异性抑制现象。可以将RNA干涉称为RNAi。基于目的基因(其表达受到抑制)的核苷酸序列以某种方式设计使用RNA干涉原理的基因，从而在宿主内形成双链RNA例如发夹dsRNA。
如上所述，可以通过抑制涉及甘油生产的基因的表达抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
3)抑制由涉及甘油生产的基因编码的蛋白质活性的方法
可以通过抑制由上述涉及甘油生产的基因编码的酶的活性来抑制产乳酸微生物中的甘油产生。具体可以使用针对这类酶的抗体或特异性作用于这类酶的物质。
这类抗体可以应用已知方法获得，并且不受限于来源、种类(单克隆或多克隆)或其形状，只要它们抑制上述酶的活性。例如，只要这类抗体将上述酶识别为抗原并与其结合，可以充分使用的该抗体的实例包括(但是不具体限于)小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体和绵羊抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。然而，在同源抗体的稳定生产方面优选单克隆抗体。可以通过本领域技术人员公知的方法生产多克隆或单克隆抗体。
使用如下所述的已知方法基本上可以制作可产生单克隆抗体的杂交瘤。即，可以以某种方式产生这类杂交瘤，从而根据常规免疫方法使用目的抗原及表达这类抗原的细胞作为免疫敏化抗原，然后通过常规细胞融合方法将所获免疫细胞与已知的亲本细胞融合，随后基于常规筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)。可以根据例如Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73：3-46)产生杂交瘤。
同时，可以使用的抑制剂是具有特异性抑制酶活性的功能的物质，所述酶由上述涉及甘油生产的基因编码。
如上所述，可以通过抑制由涉及甘油生产的基因编码的酶的活性来抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
4)提高甘油代谢和降解能力
可以使用引起涉及甘油代谢的基因过表达的方法提高甘油代谢和降解能力。涉及甘油代谢的基因实例包括甘油磷酸酶基因(glycerolphosphoenzyme gene)和3-磷酸甘油脱氢酶基因.另外，其对于酿酒酵母的实例包括甘油磷酸酶基因(GUT1)、3-磷酸甘油脱氢酶基因(GUT2)、甘油脱氢酶基因(GCY1)和二氢丙酮磷酸酶基因(dihydroacetonephosphoenzyme gene)(DAK1)。
将上述基因引入产乳酸细菌中的方法不受具体限制。根据引入外源基因的形式(染色体外或染色体内)选择整合上述基因的DNA片段、质粒(DNA)、病毒(DNA)、逆转录转座子(DNA)、和线性形式的人工染色体(YAC)等，从而可以产生重组载体并将其引入产乳酸细菌中。
如上所述，可以通过提高甘油代谢和降解能力抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
5)抑制甘油向细胞膜外的分泌
可以使用破坏编码向细胞膜外分泌甘油的通道的基因的方法来抑制甘油向细胞膜外的分泌，。这类基因的实例包括酿酒酵母中的FPS1基因。
在产乳酸微生物中破坏上述基因的方法实例包括(但是不具体限于)从基因组删除该基因的方法、将外源DNA片段插入该基因的方法、以及引入导致该基因表达蛋白质的活性下降的变异的方法。
另外，根据上文“2)抑制涉及甘油生产的基因的表达的方法”中所述的方法，可以选择的方法包括抑制编码向细胞膜外分泌甘油的通道的基因的表达的方法。类似地，根据上文“3)抑制由涉及甘油生产的基因编码的蛋白质活性的方法”中所述的方法，可以选择抑制的方法包括由编码向细胞膜外分泌甘油的通道的基因编码的蛋白质活性。
如上所述，可以通过抑制向细胞膜外分泌甘油抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
6)促进甘油向细胞膜内的吸收
可以使用引起编码吸收甘油的泵的基因的过表达的方法促进甘油向细胞膜内吸收。这类基因的实例包括酿酒酵母中的GUP1和GUP2基因。
如上所述，可以通过促进甘油向细胞膜内的吸收抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
7)获得产生甘油量降低的突变株
可以使用任何突变方法作为获得酵母突变体的方法来获得产生的甘油量降低的突变株。其实例包括物理方法(例如紫外线辐射和放射)以及将酵母悬浮于矫香剂(例如甲基磺酸乙酯、N-甲基-N-硝基胍、亚硝酸、吖啶染料等溶液中)的化学方法。同样，可以通过自发突变获得目的酵母突变体，尽管所获的频率较低。
在如上所述获得的产生的甘油量降低的突变株中，甘油的产生受到抑制。在此，这类突变株的实例可以包括涉及由于甘油生物合成、甘油代谢、甘油向细胞外分泌或甘油向细胞膜内吸收的基因的突变而使其中产生的甘油量降低的突变株。该菌株不受限于引入突变的位点。
8)向培养基添加导致产生的甘油量降低的化合物
关于向培养基添加导致产生的甘油量降低的化合物，已知在酿酒酵母的情况下向培养基中添加肌醇、儿茶素、二硫化钠、抗氧化剂等会降低产生的甘油量(Caridi，A.(2002).Protective agents used to reverse themetabolic changes induced in wine yeasts by concomitant osmotic andthermal stress，Lett Appl Microbiol 35，98-101)。另外，可以添加其它引起产生的甘油量降低的化合物。
如上所述，可以通过向培养基添加导致产生的甘油量降低的化合物抑制产乳酸微生物中甘油的产生。
同样，在上述方法1)至8)中，产乳酸细菌的培养条件和培养基组合物不受具体限制，从而可以在这类方法中应用常用的培养条件和培养基组合物。例如，当使用被赋予乳酸生产能力的酿酒酵母菌株TC38(GPD1和GPD2基因被破坏的菌株)作为产乳酸细菌的实例时，通常在需氧条件下执行培养，例如于25℃至38℃摇床培养或通风振荡培养12至80小时。培养期间，优选将pH保持在2.0至7.0。可以用无机或有机酸、碱溶液等调节pH。培养期间，必要时可以向培养基添加抗生素，例如潮霉素和G418。
另外，可以使用天然或合成培养基，只要其含有碳源、氮源以及可以被微生物同化的无机盐，例如培养基组合物。可使用的碳源的实例包括：碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉和纤维素；有机酸，例如乙酸和丙酸；醇，例如乙醇和丙醇；以及糖浆和木质生物质的水解产物。可以使用的氮源的实例包括：氨水；铵盐，包括无机盐或有机盐，例如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵；其它含氮化合物；蛋白胨；肉提取物；玉米浆；和酵母提取物。可以使用的无机物包括磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁(I)、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。另外，可以向培养基添加维生素，例如硫胺素、生物素、叶酸、烟酸、核黄素、吡哆醇和泛酸。
此外，当使用其它细菌时，通常在对细菌发酵约30℃至60℃、对酵母发酵约20℃至45℃的温度范围内的条件下进行培养。真菌发酵的温度范围广泛；然而，在大多数情况下在约20℃至45℃的温度范围内。培养期间，优选将pH保持在2.0至7.0。可以使用含有上述培养基组合物的培养基。
同时，根据上述方法1)至8)降低产乳酸微生物的甘油生产能力时，在含有产生的乳酸的溶液(例如培养产乳酸细菌的培养基)中，相对于该溶液中所含乳酸的甘油量优选为以重量计3.5％更低，更优选以重量计0.4％重量或更低，最优选以重量计0.1％或更低。
另外，根据上述方法1)至8)降低产乳酸微生物的甘油生产能力时，与甘油生产能力没有降低的产乳酸微生物产生的、相对于乳酸的甘油量相比，在含有产生的乳酸的溶液(例如培养产乳酸细菌的培养基)中所含的、相对于该溶液中所含乳酸的甘油量必须显著降低。该量的降低优选35％或更多，更优选90％或更多，最优选95％或更多。
方法2
去除由产乳酸微生物产生的甘油的方法包括去除由使用产乳酸微生物的发酵方法产生的甘油的步骤，从而阻止由前述化学式所示的化学反应的进行。另外，可以在下面的说明中把从产乳酸细菌培养液中去除细胞获得的溶液称为粗乳酸水溶液。
在此步骤中，可以去除由使用产乳酸细菌的发酵方法获得的粗乳酸水溶液中含有的甘油，并且可以去除产乳酸细菌培养液中含有的甘油。需要在由上述化学反应式所示的化学反应进行之前执行这些步骤。具体地，向甘油与乳酸共存的体系添加该化学反应所必需的热能，使得该反应进行。例如，在乳酸生产过程中，当通过加热浓缩由使用产乳酸细菌的发酵方法获得的粗乳酸水溶液时，优选在通过加热浓缩之前去除该粗乳酸水溶液中的甘油。
在去除甘油步骤之后，相对于乳酸的甘油量优选为以重量计3.5％或更低，更优选以重量计0.4％或更低，最优选以重量计0.1％或更低.当相对于乳酸的甘油量为以重量计3.5％或更低时，的确阻止了上述化学反应的进行.结果，对于最终获得的乳酸可能达到显著的高光学纯度.同时，当相对于乳酸的甘油量超过以重量计3.5％时，则进行了上述化学反应进行.结果，最终获得的乳酸的光学纯度不利地降低.
去除粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油的方法实例更具体地包括电渗析、离子交换方法、层析法、萃取方法(溶剂萃取方法)、离心方法、以及在修饰为趋向沉淀的物质后分离甘油的方法。注意去除粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油的技术不限于这些方法。例如，这类技术的实例包括使甘油经过化学反应从而产生另一种物质的方法。
在此，电渗析是这样的方法，即在该方法中将一对电极置于粗乳酸水溶液或培养液中，将直流电施加于该溶液，从而将乳酸和甘油分离并分别定位于不同电极附近。应用电渗析时，对于分离粗乳酸水溶液或培养液中含有的乳酸的情况，优选先使用碱制备乳酸以形成乳酸盐。离子交换方法是这样的方法，即在该方法中将粗乳酸水溶液或培养液施加于离子交换树脂，从而由于利用离子物质在离子交换树脂上的吸附将乳酸和甘油分离。层析法是这样的方法，即在该方法中将粗乳酸水溶液或培养液与展开剂一起施加于柱体，从而由于甘油和乳酸迁移速率的差异可以将甘油和乳酸分离。萃取方法是这样的方法，即在该方法中使用溶剂溶解并分离粗水溶液和培养液中含有的组成物质。离心方法是这样的方法，即在该方法中将离心力施加于粗乳酸水溶液或培养液，从而由于甘油和乳酸比重的差异将甘油和乳酸分离。在修饰为趋向沉淀的物质后分离甘油的方法的实例包括：通过向粗乳酸水溶液或培养液添加浓硫酸或烟硫酸使甘油磺化、将磺化甘油在其中沉淀、从而通过过滤粗乳酸水溶液或培养液分离乳酸和甘油的方法；以及向粗乳酸水溶液或培养液添加氢氧化钙或碳酸钙从而中和乳酸、通过冷却在其中沉淀乳酸以致产生乳酸钙、然后通过过滤该粗乳酸水溶液或培养液分离乳酸和甘油的方法。
同时，使甘油经过化学反应以产生另一种物质的方法的实例包括：允许甘油分子在酸性条件下进行脱水的方法；以及允许甘油与羰基化合物(醛化合物和酮化合物)相互反应以致产生缩醛的方法。
根据上述方法1和2，可以降低粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油量。根据本发明生产乳酸的方法包括允许溶液中的乳酸经受加热浓缩的步骤。在该步骤中，将通过方法1获得的从培养液中去除细胞而制备的溶液或通过方法2去除甘油的溶液在降低的压力下经受加热浓缩，直至该溶液中含有的乳酸浓度成为(但是不具体限于)以重量计大约60％至70％。在该方法中，降低溶液中的甘油量从而不出现由上述化学式所示的化学反应。因此，即使通过加热浓缩后也可以产生具有高光学纯度的乳酸。
具体地，在此方法中，当使用具有L-乳酸生产能力的产乳酸细菌通过发酵方法生产乳酸时，最终可以达到99％或以上的乳酸光学纯度。即使通过常规方法生产具有高光学纯度的乳酸时，也不可能产生具有99％或更高光学纯度的乳酸，所以本发明中所期望的高光学纯度前所未及。因此，优选具有99％或更高光学纯度的乳酸作为生物降解能力优越的聚乳酸的起始材料或物理性质优越的聚乳酸的起始材料。
另外，根据上述方法1和2，可以通过降低粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油量提高乳酸生产率，并且可以产生具有高光学纯度的乳酸。例如，在引入乳酸脱氢酶基因的酵母(产乳酸细菌的实例)的情况下，由于实施酵母固有的乙醇发酵，乳酸产量不必要高。因此，为了提高乳酸产量曾经尝试抑制醇发酵。然而，在醇发酵受到抑制的产乳酸酵母的情况下，除乳酸产量之外，不能获得在发酵速率、培养速率等方面充分的菌株。
另一方面，根据上述方法1和2，可以通过降低粗乳酸水溶液或培养液中含有的甘油量降低产生的乙醇量.由此可以提高乳酸产量.因此，根据本发明的生产乳酸的方法，可以生产光学纯度优越的具有高生产率和高产量的乳酸.
另外，本发明生产乳酸的方法可以包括与使用产乳酸细菌通过发酵方法产生乳酸的已知方法相似的处理步骤。例如，在这类发酵方法中，用氨水中和培养液和粗乳酸水溶液中含有的乳酸成分，从而形成乳酸铵。同样，在根据本发明的生产乳酸的方法中，可以用氨水中和培养液和粗乳酸水溶液中含有的乳酸成分，从而形成乳酸铵。当培养液和粗乳酸水溶液中含有乳酸铵时，经过上述加热浓缩后，分离乳酸成分，随后使用醇(例如丁醇)酯化并以乳酸盐的形式(例如乳酸丁醇)蒸馏。此后，水解并浓缩由此分离的乳酸盐，从而产生乳酸。另外，当乳酸成分没有以氨水中和、并且以乳酸的形式含于培养液和粗乳酸水溶液中时，可以产生乳酸，随后从培养液和粗乳酸水溶液直接蒸馏。
尽管本发明的技术范围不限于实施例，此后将关于实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例
在说明应用本发明的实施例之前，经证实上述式所示反应确实发生。在该实施例中，经证实甘油与乳酸之间的化学反应及乙二醇与乳酸之间的化学反应可以在实践中发生。
首先将乳酸与甘油或乙二醇以1∶2的比例(摩尔比)混合而制备溶液。然后向该溶液中添加对甲苯磺酸，随后在常压下加热(150℃，15小时)，同时蒸发溶液中含有的水份。
终止该反应后，将该溶液溶解于氯仿(以重量计1％至10％)，随后为GC-MS分析。关于GC-MS分析，在下列条件下使用四级质谱仪(JMS-AM SUN200，JEOL)和柱(DB-1，J&W Scientific)：注射温度：300℃；柱温：50℃至300℃；升温速率：5℃/分钟；氦流速：1ml/分钟。
当上述化学反应式所示的甘油和乳酸之间的化学反应在进行中时，可以检测到式中描述的环状化合物。另外，认为乙二醇与乳酸之间出现下述化学反应式所示化学反应。因此，可以检测到下述式的环状化合物。导致产生下列式所述的环状化合物的反应进行越多，L-乳酸的光学纯度越低。
化学式2
在可以同时于146和115处检测到其分子离子峰的假设上，观察到由甘油与乳酸之间的化学反应产生的环状化合物。这是因为，在与上述环状化合物结构相似的甘油二聚体的MS谱中，当去除该二聚体侧链的羟甲基时，观察到分子离子峰。另外，在可以同时于116和73处检测到其分子离子峰的假设上，观察到由乙二醇与乳酸之间的化学反应产生的环状化合物，所述环状化合物经过核实为参照实例(Macromolecules，2001，34，8641)。
作为使用含有L-乳酸和甘油的溶液的实验结果，可以观察到产生的化合物在14.5分钟的保留时间于146和115处同时显示分子离子峰(见图1和2)。另外，作为使用含有L-乳酸和乙二醇的溶液的实验结果，可以观察到产生的化合物在7分钟的保留时间于73和116处同时显示分子离子峰(见图3和4)。同样，证实峰强度比与参考文献中的描述几乎相等。(116和73处的分子离子峰之间的强度比为23∶100(Macromolecules，2001，34，8641)。)
基于上述结果可以证实，当向乳酸和甘油或乙二醇共存的体系中添加热能时，进行了上述化学反应式所示的化学反应。因此，根据这些实施例，提示可以通过在允许溶液中的乳酸经受加热浓缩之前降低该溶液中的甘油量而生产具有高光学纯度的乳酸。
[实施例1]
根据上述实施例，提示可以通过在允许溶液中的乳酸经受加热浓缩之前降低该溶液中的甘油量而生产具有高光学纯度的乳酸。因此，在该实施例中，证明可以使用产乳酸微生物通过发酵方法生产具有高光学纯度的乳酸，所述产乳酸微生物中涉及甘油生产的基因被破坏。
含有被破坏基因的菌株的产生
含有被破坏GPD1的菌株的产生
允许具有乳酸生产能力的酵母在孢子形成培养基(1％磷酸钾；0.1％酵母提取物；0/05％右旋糖；2％琼脂)中形成孢子，随后利用同宗接合二倍化，所述具有乳酸生产能力的酵母根据日本专利出版物(Kokai)No.2003-259878A(JP专利申请No.2002-65879)生产。然后，获得将LDH基因导入每个二倍染色体中的菌株。确定所获菌株为菌株KCB-27-7。
使用大肠杆菌菌株K12作为模板通过PCR扩增潮霉素抗性基因DNA片段(此后称为HPH基因)。HPH基因的DNA核苷酸序列以登录号V01499于GenBank数据库注册。所用引物是位于HPH基因两个末端的HPH-U(5′-ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC-3′(SEQ ID NO：1))和HPH-D(5′-CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG-3′(SEQ ID NO：2))。
使用酵母菌株IFO2260(注册于Institute of Fermentation)的基因组DNA作为模板通过PCR扩增TDH2启动子区DNA片段。TDH3基因的DNA核苷酸序列以登录号Z72977于GenBank数据库注册。所用引物为TDH3P-U(5′-ATA TAT GGA TCC TAG CGT TGA ATG TTA GCG TCAAC-3′；添加BtamHI位点的TDH3启动子序列(SEQ ID NO：3))和TDH-3P-D(5′-ATA TAT CCC GGG TTT GTT TGT TTA TGT GTG TTTATT CG-3′；添加SmaI位点的TDH3启动子序列(SEQ ID NO：4))。
使用酵母菌株IFO2260的基因组DNA作为模板通过PCR扩增CYC1终止子区DNA片段。CYC1终止子区的DNA核苷酸序列以登录号Z49548于GenBank数据库注册。所用引物为CYCT-U(5′-ATA TAT AAG CTTACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3′；添加HindIII位点的CYC1终止子序列(SEQ ID NO：5))和TDH-3P-D(5′-ATA TAT GTC GAC GTT ACATGC GTA CAC GCG-3′添加SalI位点的CYC1终止子序列(SEQ ID NO：5))。
将HPH基因片段插入大肠杆菌质粒pBluescriptII(Promega)的EcoRV位点.将产生的质粒命名为pBhph.在BamHI和SmaI位点切割质粒pBhph，然后在其中插入TDH3启动子片段.将产生的质粒命名为pBhph-P.还在HindIII和SalI位点切割该质粒，然后在其中插入CYC1终止子片段.将产生的质粒命名为pBhph-PT.使用pPBhph-PT作为模板执行PCR扩增DNA片段，所述DNA片段中，在添加了TDH3启动子区和CYC1终止子区的HPH基因盒的两个末端添加了部分GPD1基因(77bp).添加的GPD1基因的DNA核苷酸序列以登录号Z24454于GenBank数据库注册.所用引物为GPD1-CYC1-R(5′-TTA CGT TACCTT AAA TTC TTT CTC CCT TTA ATT TTC TTT TAT CTT ACTCTC CTA CAT AAG ACA TCA AGA AAC AAT TGg tta cat gcg tac acgcgt ttg t-3′；其中大写字母表示GPD1基因序列，小写字母表示HPH基因序列(SEQ ID NO：6))，其中将GPD1基因的-127至-51区域添加到HPH基因外部；以及GPD1-TDH3-F(5′-CTA ATC TTC ATG TAG ATCTAA TTC TTC AAT CAT GTC CGG CAG GTT CTT CAT TGG GTAGTT GTT GTA AAC GAT TTG Gta gcg ttg aat gtt agc gtc aac a-3′；其中大写字母指示GPD1基因序列，小写字母指示HPH基因序列(SEQ ID NO：7))，其中以相似的方式添加GPD1基因的+1100至+1176区域。使用产生的PCR产物，通过醋酸锂方法(Ito等人，J.Bacteriol.，153，163-168(1983))转化菌株KCB27-7。转化后，将经过转化的菌株接种到含有200μg/ml潮霉素的YPD培养基板中，并于30℃培养2天，从而获得其转化体。从转化体制备基因组DNA。然后，使用插入DNA片段的外部引物GPD1-295F(5′-TGC TTC TCT CCC CTT CTT-3′(SEQ ID NO：8))和GPD1+1472R(5′-CAG CCT CTG AAT GAG TGG T-3′(SEQ ID NO：9))，通过PCR证实将HPH基因在GPD1基因区整合到染色体中。
允许产生的菌株在孢子形成培养基中形成孢子，随后利用同宗接合二倍化。然后，获得将HPH基因整合到每个二倍染色体的GPD1基因区中从而破坏GPD1基因的菌株。确定所获菌株为菌株TC20。
含有被破坏的GPD2的菌株的生产
使用pCAT 3-Basic Vector(Promega)作为模板通过PCR扩增氯霉素抗性基因(此后称为CAT基因)的DNA片段。CAT基因的DNA核苷酸序列以登录号M16323于GenBank数据库注册。所用引物是定位于CAT基因两个末端的CAT-U(5′-ATA TAT CCC GGG ATG GAG AAA AAAATC ACT GGA TAT AC-3′(SEQ ID No：10))和CAT-D(5′-ATA TATAAG CTT TTA CGC CCC GCC CTG CCA CTC ATC-3′(SEQ ID NO：11))。
将CAT基因片段插入大肠杆菌质粒pBluescriptII(Promega)的EcoRV位点。将该质粒命名为pBCAT。在BamHI和SmaI位点切割该质粒，然后在其中插入TDH3启动子片段。将产生的质粒命名为pBCAT-P。还在HindIII和SalI位点切割该质粒，然后在其中插入CYC1终止子片段。将产生的质粒命名为pBCAT-PT。
使用pBCAT-PT作为模板进行PCR扩增DNA片段，所述DNA片段中，在添加了TDH3启动子区和CYC1终止子区的CAT基因盒的两个末端添加了部分GPD2基因。添加的GPD2基因的DNA核苷酸序列以登录号Z74801于GenBank数据库注册。所用引物为GPD2-CYC1-R
(5′-ATT TAT CCT TGG GTT CTT CTT TCT ACT CCT TTA GATTTT TTT TTT ATA TAT TAA TTT TTA AGT TTA TGT ATT TTG GTgtta cat gcg tac acg cgt ttg t-3′；其中大写字母指示GPD2基因序列，小写字母指示CAT基因序列(SEQ ID NO：12))，其中将GPD2基因的-127至-51区域添加到CAT基因外部；以及GPD2-TDH3-F
(5′-CTA TTC GTC ATC GAT GTC TAG CTC TTC AAT CATCTC CGG TAG GTC TTC CAT GCG GAC GTT GTT GTA GAC TATCTG Gta gcg ttg aat gtt agc gtc aac a-3′；其中大写字母表示GPD2基因序列，小写字母表示CAT基因序列(SEQ ID NO：13))，其中以相似的方式添加GPD2基因的+1247至+1323区域.使用产生的PCR产物，通过醋酸锂方法转化菌株KCB27-7和菌株TC20.此后，将经过转化的菌株接种到含有6mg/ml氯霉素的YPD培养基中，随后于30℃培养2天，从而获得转化体.从转化体制备基因组DNA.然后，使用插入DNA片段外部的引物GPD2-262F(5′-GTT CAG CAG CTC TTC TCT AC-3′(SEQ ID NO：14))和GPD2+1873R(5′-CGC AGT CAT CAA TCT GAT CC-3′(SEQID NO：15))，通过PCR证实将CAT基因在GPD2区整合到染色体中。
允许产生的菌株在孢子形成培养基中形成孢子，随后利用同宗接合二倍化。然后，获得将CAT基因整合到每个二倍染色体GPD2基因区中从而破坏GPD2基因的菌株。在获得的GPD2被破坏的菌株来自菌株KCB27-7的情况下，将该菌株命名为TC21，在该菌株来自菌株TC20的情况下，命名为TC38。
发酵测试1
将上面获得的转化体接种到500ml发酵培养基(蔗糖：14.4％；糖浆：0.6％)中至细胞浓度为0.3％，并于34℃、pH 5.0(以氨水中和)、气流体积0.6vvm经受3天发酵。此后，测定产生的L-乳酸和甘油量。使用生物传感器BF-4(Oji Scientific Instruments)确定L-乳酸、乙醇和甘油浓度。通过将产生L-乳酸量除以发酵前的含糖量计算基于糖的L-乳酸得率。结果列于表1。
表1
L-乳酸 (％) 甘油 (％) TC38菌株(导入LDH并且GPD1/GPD2被 破坏的菌株) 9.1 0.0082 KCB27-7菌株(导入LDH的菌株) 8.6 0.64
如表1所列，终止发酵时培养液中的L-乳酸和甘油浓度分别为以重量计9.1％(相当于以重量计10.8％的乳酸铵)及以重量计0.0082％。相对于乳酸的甘油浓度为0.1％或更低。另外，使用F-试剂盒(Roche)确定D-乳酸浓度，从而根据下列等式计算L-乳酸的光学纯度。在下列等式中，分别以“D”和“L”代表D-乳酸和L-乳酸的浓度。
等式1
(L-D)×100/(L+D)
作为计算结果，L-乳酸的光学纯度为99.93％。
发酵测试2
将上面获得的每个转化体接种到含有50ml发酵培养基(葡萄糖：4％；酵母提取物：1％)的100ml锥形瓶中至细胞浓度为0.3％，并于32℃振荡(转速：80rpm；振幅：70mm)经受2至3天发酵。此后，测定产生的L-乳酸、乙醇和甘油量。结果列于表2。
表2
L-乳 酸 (％) 乙醇 (％) 甘油 (％) 基于糖 的L-乳 酸得率 (％) 相对于L- 乳酸量的 甘油量 (％) TC 20菌株 (导入LDH并且GPD1 被破坏的菌株) 3.00 0.50 0.011 75 0.37 TC 21菌株 (导入LDH并且GPD2 被破坏的菌株) 2.84 0.58 0.091 71 3.2 TC 38菌株 (导入LDH并且 GPD1/GPD2被破坏的 菌株) 3.09 0.45 0.002 77 0.065 KCB27-7菌株 (导入LDH的菌株) 2.65 0.67 0.14 66 5.3
结果，与菌株KCB27-7相比，在GPD1被破坏的菌株和GPD2被破坏的菌株中L-乳酸产生量增加，且乙醇产生和甘油产生量降低，从而提高了基于糖的L-乳酸得率。在GPD1和GPD2被破坏的菌株的情况下，乙醇产生和甘油产生量与GPD1被破坏的菌株和GPD2被破坏的菌株相比进一步降低，从而提高了基于糖的得率。
具体而言，与菌株KCB27-7中相对于乳酸的甘油量(以重量计5.3％)相比，菌株TC20中相对于乳酸的甘油量(以重量计0.37％)降低93.0％，菌株TC21中相对于乳酸的甘油量(以重量计3.2％)降低39.6％，菌株TC38中相对于乳酸的甘油量(以重量计0.065％)降低98.8％。
因此，可以确认在GPD-1被破坏的菌株和/或GPD-2被破坏的菌株中甘油生产量的降低造成乙醇生产率的降低和乳酸生产率的提高。另外，显示基于糖的L-乳酸的产量提高5％或更高，在优选的情况下为10％或更高。
L-乳酸的纯化
首先，使用过滤器(产品名：Microza；Asahi Kasei Chemicals)从通过上述发酵方法获得的培养液分离细胞，从而制备粗乳酸水溶液。然后，将所获粗乳酸水溶液在大气压力下通过加热至124℃浓缩(热源温度：160℃)，以至于测定的粗乳酸水溶液中含有的L-乳酸浓度约为70％。
接下来，将丁醇以3倍乳酸的量(摩尔)加入经过加热浓缩的粗乳酸水溶液中.将产生的溶液在大气压力下于110℃至120℃(热源温度：160℃)反应12小时，从而将该粗乳酸水溶液中含有的乳酸铵酯化.然后，将含有乳酸丁酯的反应溶液在20托压力及120℃温度(热源温度：160℃)条件下蒸馏，从而分离和纯化乳酸丁酯.
此后，将水以16倍乳酸丁酯的量(摩尔)加入所获的经过分离和纯化的乳酸丁酯中。将产生的溶液在大气压力下于100℃(热源温度：160℃)反应8小时，从而水解乳酸丁酯。最后，将该反应溶液在大气压力下通过加热至128℃浓缩(热源温度：160℃)，以至于测定的纯化乳酸水溶液中含有的L-乳酸浓度约为90％。
确定通过上述步骤获得的L-乳酸为终产物。所获终产物中的L-乳酸的光学纯度为99.51％。另外，上述步骤后的乳酸回收率为76.0％。
[实施例2]
在该实施例中，证明可以通过去除由产乳酸细菌产生的甘油、随后允许乳酸经过加热浓缩而生产具有高光学纯度的乳酸。
产乳酸细菌和发酵方法
在该实施例中使用的产乳酸微生物是实施例1中使用的、被赋予乳酸生产能力的酿酒酵母，只是其中的GPD1和GPD2基因没有被破坏。同样，在该实施例中，在与实施例1相似的条件下实施发酵方法。
终止发酵时L-乳酸和甘油的浓度分别为以重量计8.6％(相当于以重量计10.2％的乳酸铵)和以重量计0.7％。L-乳酸的光学纯度为99.71％。
甘油的去除
在该实施例中，首先，使用过滤器(产品名：Microza；Asahi KaseiChemicals)从通过上述发酵方法获得的培养液分离细胞，从而制备粗乳酸水溶液。然后，将所获粗乳酸水溶液进行电渗析，从而分离并去除该溶液中的甘油。具体使用电渗析仪(MICRO ACILYZER S3：Asahi KaseiChemicals和筒(cartridge)(AC-110-550：Asahi Kasei Chemicals)。在该设备中，将粗乳酸水溶液置于稀释侧，将蒸馏水置于浓缩侧。以15V的应用电压实施电渗析直至在稀释侧获得0.5mS的电导率，从而将乳酸转移到浓缩侧。另外，丢弃稀释侧电导率下降的粗乳酸水溶液。然后，将粗乳酸水溶液再次至于稀释侧。重复实施电渗析。
电渗析后测定结果，粗乳酸水溶液中含有的L-乳酸和甘油的浓度分别为以重量计21.6％和以重量计0.02％。相对于L-乳酸的甘油浓度为0.1％或更低。
L-乳酸的纯化
使用Rotavapor R-220(Buchi)，将如上所述去除甘油的粗乳酸水溶液在大气压力下加热至124℃浓缩(热源温度：160℃)，以至于测定的粗乳酸水溶液中含有的L-乳酸浓度约为65％。
然后将丁醇以3倍乳酸的量(摩尔)加入经过加热浓缩的粗乳酸水溶液中。将产生的溶液在大气压力下于110℃至120℃(热源温度：160℃)乳酸的起始原料。
序列表免费文本
SEQ ID NO：1至15指合成的RNA。
反应12小时，从而将该粗乳酸水溶液中含有的乳酸铵酯化。然后，将含有乳酸丁酯的反应溶液在20托压力及120℃温度(热源温度：160℃)条件下蒸馏，从而分离和纯化乳酸丁酯。
此后，将水以16倍的乳酸丁酯量(摩尔)加入所获的经过分离及纯化的乳酸丁酯中。将产生的溶液在大气压力下于100℃(热源温度：160℃)反应8小时，从而水解乳酸丁酯。最后，将该反应溶液在大气压力下通过加热至128℃浓缩(热源温度：160℃)，以至于测定的纯化乳酸水溶液中含有的L-乳酸浓度约为90％。
确定通过上述步骤获得的L-乳酸为终产物。所获终产物中的L-乳酸的光学纯度为99.16％。另外，上述步骤后的乳酸回收率为64.8％。
[比较例]
为了比较，使用实施例2中使用的产乳酸细菌如实施例2所述实施发酵方法。在该比较例中，不去除粗乳酸水溶液中含有的甘油，然后实施后续的L-乳酸纯化。结果，终止发酵后培养液中含有的L-乳酸的光学纯度为99.71％。培养液中含有的相对于L-乳酸的甘油浓度为1％。纯化L-乳酸后，L-乳酸的光学纯度为98.40％。另外，L-乳酸的回收率为70.4％。
[结果]
从实施例1和2的结果显而易见，证明可以通过在允许L-乳酸经受加热浓缩之前降低甘油量而生产具有高光学纯度的L-乳酸。更具体而言，当乳酸在含有1％甘油的体系中经受加热浓缩时(比较例1)，L-乳酸的光学纯度为98.40％。然而，当乳酸在含有0.1％或更低甘油的体系中经受加热浓缩时(实施例1和2)，L-乳酸的光学纯度为99％或更高。因此，依照实施例1和2，建立了生产具有高光学纯度(例如99％或更高)的L-乳酸的方法。
在此引用的所有出版物、专利和专利申请全文引用作为参考。
工业适用性
根据本发明，提供生产乳酸、从而可以生产具有高光学纯度的乳酸的方法，所述具有高光学纯度的乳酸也可以用作例如具有优越物理性质的聚
序列表
<110>丰田自动车株式会社
<120>生产乳酸的方法
<130>PH-2555-PCT
<150>JP 2004-265655
<151>2004-09-13
<160>15
<170>PatentIn版本3.1
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