一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用。该蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆相关的蛋白质。该大豆Trihelix转录因子及其编码基因可用于培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，如耐盐、耐旱和耐寒大豆。

权利要求

1.大豆GmGT-2B基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

3.含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。

4.含有权利要求1所述基因的工程菌。

5.权利要求1所述的基因在培育耐逆性植物中的应用，所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性和/或耐寒性。

说明书

一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB和PHD等等。Trihelix转录因子是植物特有的一类小的转录因子家族。Trihelix转录因子因其蛋白质结构中的DNA结合域有3个α-螺旋(helix-loop-helix-loop-helix)而得名。该蛋白家族的成员根据其DNA结合元件的特异性而划分为3个蛋白亚家族，即GT-1，GT-2和GT-3(Ayadi et al.，2004 Analysis of GT-3a identifies a distinctsubgroup of trihelix DNA-binding transcription factors in Arabidopsis，FEBSLetters 562，147-154.)。就蛋白质结构中DNA结合域数目而言，GT-1类和GT-3类仅在其N端有一个trihelix域，而GT-2类蛋白则具有两个trihelix域，分别位于C端和N端。

[0003] Trihelix转录因子调控光应答基因的表达。最近有报道，拟南芥中的PETAL LOSS是一个GT-2类的蛋白，它参与叶与花器官的正常发育(Brewer et al.，2004，PETALLOSS，a trihelix ranscription factor gene，regulates perianth architecturein the Arabidopsis flower.Development 131，4035-4046.)。而关于Trihelix转录因子是否在植物耐受非生物胁迫机制中发挥作用，尚未见报道。

[0004] 大豆是我国五大作物之一，弄清其耐非生物胁迫分子机理，进而为提高其耐逆性提供基础，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用。

[0006] 本发明所提供的大豆Trihelix转录因子，名称为GmGT-2B，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

[0007] 1)序列表中的SEQ ID №：2；

[0008] 2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆相关的蛋白质。

[0009] 其中，序列表中的序列2由581个氨基酸残基组成。GmGT-2B是一种Trihelix转录因子，它具有两个trihelix域，分别位于C端和N端。N端的trihelix域是自序列2的氨基端第90(Leu)-150(Tyr)位氨基酸残基序列，C端的trihelix域是自序列2的氨基端第428(Arg)-520(Tyr)位氨基酸残基序列。

[0010] 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0011] 上述大豆Trihelix转录因子的编码基因(GmGT-2B)也属于本发明的保护范围。

[0012] 上述大豆Tribelix类转录因子的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

[0013] 1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

[0014] 2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

[0015] 3)与序列表中SEQ ID №：1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

[0016] 4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

[0017] 上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

[0018] 其中，序列表中的SEQ ID №：1由1746个脱氧核苷酸组成，自序列1的5′端第1-1746位核苷酸序列为编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质GmGT-2B；自5’端第268-450位核苷酸序列以及第1282-1560位核苷酸序列为GmGT-2B中的2个trihelix结构域的编码序列。

[0019] 含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。

[0020] 可利用植物表达载体将本发明的GmGT-2B的编码基因导入植物细胞，获得对逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

[0021] 将GmGT-2B构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

[0022] 携带有本发明GmGT-2B基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等双子叶植物。

[0023] 实验结果表明，本发明的GmGT-2B的表达受高盐、干旱、低温和脱落酸ABA的诱导。ABA是与植物非生物胁迫应答相关的植物激素，因此GmGT-2B与植物对非生物逆境应答的调控相关。过量表达GmGT-2B的转基因拟南芥与未转基因的野生型拟南芥相比，其耐盐性、耐旱性和耐低温的能力均显著提高，说明转录因子GmGT-2B参与了植物对非生物胁迫应答的调控。

[0024] 本发明的GmGT-2B基因对培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，如耐盐、耐旱和耐低温大豆，提高农作物特别是大豆的产量具有重要意义，并且从分子生物学角度证明了转录因子Trihelix家族中的一些成员确实参与植物对非生物胁迫应答的调控，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。

[0025] 下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

[0026] 图1为含有GmGT-2B的植物表达载体的部分结构示意图

[0027] 图2为GmGT-2B在非生物逆境胁迫下的表达特性图

[0028] 图3A为转GmGT-2B基因的拟南芥T1代株系L1和L2与野生型植株在盐胁迫下和正常生长条件下的生长比较图

[0029] 图3B为转GmGT-2B基因的拟南芥T1代株系L1和L2与野生型植株在自然干旱条件下的生长情况

[0030] 图3C为转GmGT-2B基因的拟南芥T1代株系L1和L2与野生型植株在低温条件下的生长情况

具体实施方式

[0031] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

[0032] 实施例1、大豆GmGT-2B基因的筛选及其cDNA的克隆

[0033] 首先用BLAST程序将各拟研究转录因子家族的保守的DNA结合域序列与大豆EST数据库中的序列进行比对，分别得到13个Trihelix家族成员的EST该片段。以栽培大豆品种南农1138-2为材料，取15天苗龄的大豆苗分别进行冷(4℃)，盐(150mMNaCl溶液)，ABA(100μM溶液)，大气干旱处理即用滤纸吸干根部水份，置于空气中。上述处理0、1、3、6、12小时后，分别采收叶子，提取RNA。

[0034] 根据上述13个Trihelix家族成员的EST，设计各自特异的RT-PCR引物。用RT-PCR方法对上述基因在盐、干旱、冷、ABA胁迫下的应答反应进行分析。上述13个基因中，有2个基因，其中包括GmGT-2B，在高盐、干旱、低温和ABA胁迫下均诱导表达，遂作为候选基因，进一步开展了基因克隆及其功能分析研究。

[0035] 利用RACE的方法，在人工进一步拼接的EST序列基础上设计RACE引物，其中5′RACE的特异巢式引物1(GSP1)为5′-CTTGCAGGGGACGAAGTAGTGGCTGAGA-3′， 特异巢式引物2(GSP2)5′-CATCATGTCCTCAAGGAGCTTGTTGTGC-3′；3′RACE的特异巢式引物1(GSP3)5′-GAGGAAGCTTGGAAGAAGCAAGAGATGG-3′，特异巢式引物2(GSP4)5′-GTCCCCTGCAAGCCACACCCTCAAGAAG-3′，巢式通用引物序列(NUP)为5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′。

[0036] 5′RACE第一链cDNA的合成：取1μg大豆品种南农1138-2的RNA，加1μl的5’-CDS primcr[5’-(T)25N-1N-3’(N＝A，C，G or T；N-1＝A，G or C)]，加1μl的SMART II A oligo，，加水至终体积5μl，70℃水浴2分钟，然后置冰上2分钟，然后分别加2μl
5×first strand buffer，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP mix(10mM)，1μlPowerScript reverse transcriptase，然后混匀，42℃反转录1.5小时，然后加超纯水至250μl，在72℃下变性7分钟，获得5′RACE第一链cDNA。置-20℃冰箱待用。

[0037] 5′RACE反应程序：分2步扩增。第一步扩增反应体系25μl∶17.25μl超纯水，2.5μl 10×GC buffer I，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl LA-Taq酶，1.25μl 5’-RACE第一链cDNA，2.5μl UPM(10×)，0.5μl GSP1(10μM)，混匀，上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃5sec；68℃10sec、72℃3min，25个循环；4℃保存。

[0038] 巢式反应体系50μl∶36μl超纯水，5μl 10×GC buffer I，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl LA-Taq酶，5μl第 一 步 扩 增 产 物 (50×)，1μl NUP(10μM)，1μl GSP2(10μM)，混匀，上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃，5sec；68℃，10sec；72℃，3min，30个循环。将反应产物回收后，连接PMD18-T vector，测序。

[0039] 3′RACE第一链cDNA的合成：取1μg大豆品种南农1138-2的RNA，加1μl的3’-CDS primer[5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3’(N＝A，C，G or T；N-1＝A，G or C)]，加1μl的SMART II A oligo，加水至终体积5μl，70℃水浴2分钟，然后置冰上2分钟，然后分别加2μl 5×first strand buffer，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP mix(10mM)，
1μl PowerScript reverse transcriptase，然后混匀，42℃反转录1.5小时，然后加超纯水至250μl，在72℃下变性7分钟，获得3′RACE第一链cDNA。置-20℃冰箱待用。

[0040] 3′RACE反应程序：分2步扩增。第一步扩增反应体系25μl∶17.25μl超纯水，2.5μl 10×GC buffer I，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl LA-Taq酶，1.25μl 3’-RACE第一链cDNA，2.5μl UPM(10×)，0.5μl GSP1(10μM)，混匀，上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃5sec；68℃10sec、72℃3min，25个循环；4℃保存。

[0041] 巢式反应体系50μl∶36μl超纯水，5μl 10×GC buffer I，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl LA-Taq酶，5μl第 一 步扩 增 产物 (50×)，1μl NUP(10μM))，1μl GSP2(10μM)，混匀，上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃，5sec；68℃，10sec；72℃，3min，30个循环。将反应产物回收后，连接PMD18-T vector，测序。

[0042] 通过测序明确所扩增的5′端和3′端序列属于目的基因组分，然后通过人工拼接，找到最大阅读框，再通过NCBI BLAST，确定是目的基因的全长，然后从该基因的起始密码子向5′非翻译区延伸，设计正向引物5′-GTCGGATCCATGTTCGATGGAGTACCAGACC-3′，从终止密码子起向3′端非翻译区延伸设计反向引物5′-CGAGAGCTCTTAAAACTGATCAAAATCCAAAG-3′，以大豆品种南农1138-2的RNA为模板，取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，获得cDNA片段做为模板，PCR的反应体系为50μl，其中包括4μl一链cDNA(0.05μg)、6μl引物(20μM)、5μl 10×pfu PCR Buffer、1.0μl dNTP(10mM)和1U pfu Taq DNA聚合酶，余用超纯水补齐。上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性4min；94℃变性30sec，57℃复性30sec、72℃延伸3min30sec，共30个循环；然后72℃延伸10min。将所扩增的目的基因连接pMD18-T vector，测序，结果表明，获得候选基因的全长ORF序列，命名为GmGT-2B，GmGT-2B的全长为1746bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列1的5′端第1-1746位核苷酸序列为编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质GmGT-2B；自5’端第268-450位核苷酸序列以及第1282-1560位核苷酸序列为GmGT-2B中的2个trihelix结构域的编码序列。序列表中序列2由581个氨基酸残基组成。GmGT-2B具有两个trihelix域，分别位于C端和N端。Trihelix结构域氨基酸残基非常保守，而中间部分的序列变异较大。N端的tribelix域是自序列2的氨基端第90(Leu)-150(Tyr)位氨基酸残基序列，C端的trihelix域是自序列2的氨基端第428(Arg)-520(Tyr)位氨基酸残基序列，因此GmGT-2B属于GT-2亚家族。

[0043] 实施例2、GmGT-2B基因在非生物胁迫下的表达特性

[0044] 对大豆南农1138-2进行干旱、NaCl、低温胁迫和ABA处理用于分析大豆GmGT-2B在非生物胁迫下的表达情况。将南农1138-2的种子种在盆中，生长2星期后，对幼苗分别进行冷(4℃)，盐(150mM NaCl溶液)，大气干旱，ABA处理。在不同处理时段，分别采收叶子，用于提取RNA。具体方法如下所述：

[0045] 下述胁迫处理：

[0046] 干旱处理：将大豆南农1138-2幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，分别在光照条件下干旱培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

[0047] 盐处理：将大豆南农1138-2幼苗的根系置于150mM NaCl溶液中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

[0048] 低温处理：将大豆南农1138-2幼苗置于4℃培养箱中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

[0049] ABA处理：将大豆南农1138-2幼苗的根系置于100μM ABA溶液中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

[0050] 分别提取上述处理大豆南农1138-2叶片总RNA。分别以用上述方法处理的不同大豆样品以及没有经过胁迫处理的大豆样品(对照)的RNA为模板，取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，获得cDNA片段做为模板；根据已知EST序列，设计特异的RT-PCR引物对，其中正向引物为5′-GTTTTTGCGAGAGCATTGTG-3′，反向引物为5′-AACTAGGGTTCTGGGGAGGA-3′。采用RT-PCR方法。RT-PCR的反应体系为20μl，其中包括1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl 10×PCR Buffer、0.5μl dNTP (10mM)和1U Taq DNA聚合酶，余用超纯水补齐。上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性4min；94℃变性30sec、56℃复性
30sec、72℃延伸1min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。以扩增大豆的一个组成性表达的Tubulin基因的产物作为对照，其引物为5′-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3′和
5′-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3′。扩增产物在1.0％琼脂糖胶(含溴化乙锭)，1×TAE电泳分离，紫外灯下观察照相。对上述基因在盐、干旱、冷胁迫以及ABA处理下的应答反应进行分析。如图2所示，GmGT-2B基因的表达受高盐、干旱和低温诱导和ABA诱导，因此GmGT-2B可能参与植物对非生物胁迫的应答反应。

[0051] 实施例3、GmGT-2B蛋白及其编码基因的功能鉴定

[0052] 一、转GmGT-2B基因拟南芥株系的获得及其耐盐性鉴定

[0053] 根据GmGT-2B基因序列设计引物：GmGT-2B ORF正向引物：5’-GTCGGATCCATGTTCGATGGAGTACCAGACC-3’(BamH I)，GmGT-2B ORF反向引物：5’-CGAGAGCTCTTAAAACTGATCAAAATCCAAAG-3’(Sac I)，应用RT-PCR方法，从大豆总RNA中扩增GmGT-2B基因。具体方法如下所述：取南农1138-2叶片，置于液氮中研碎，悬于4mol/L异硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20μl PCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl
10×PCR缓冲液、0.4μl dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20μl，液面覆盖液体石蜡油。反应在PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性5min；再94℃30sec，
56℃30sec，72℃2min，共30-32个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物为1764bp，含有序列表中序列1的核苷酸序列，然后克隆于pMD18-T质粒的多克隆位点，得到重组载体pMDGmGT-2B。

[0054] 用BamHI和SacI双酶切pMDGmGT-2B，得到包含GmGT-2B完整编码框的片段，将其正向插入pBI121植物表达载体的BamHI和SacI酶识别位点之间，然后测序验证，将确认含有GmGT-2B的植物表达载体，命名为pBI121-GmGT-2B，其部分结构示意图如图1所示。pBI121-GmGT-2B通过根癌农杆菌GV3101的介导转化拟南芥，PCR检测结果表明获得31个转化植株，RT-PCR分析表明其中至少3株中GmGT-2B的表达量很高，将表达量高的2株分别命名为L-1、L-2。将L-1和L-2的种子种入MS培养基，将得到的L-1、L-2的T1代株系幼苗分别命名为L1、L2，5天后和同时播种的未转基因拟南芥(WT)幼苗分别移栽到含0mM、75mM、
125mM、150mM和180mM NaCl的MS培养基中培养16天，每个处理各30株。结果表明，正常生长条件下，野生型和转pBI121-GmGT-2B植株没有差别，在75mM NaCl条件下也差别不大，但在125mMNaCl条件下野生型植株出现叶片反卷，而转pBI121-GmGT-2B植株基本正常，在
150mMNaCl条件下野生型植株叶片完全卷缩成一团，植株呈现紫红色，转pBI121-GmGT-2B植株出现轻微的反卷现象。在180mM NaCl条件下野生型植株生长停止，开始死亡，然而转pBI121-GmGT-2B植株中有80％-90％的能维持缓慢生长。

[0055] 将在75mM、125mM、150mM和180mM NaCl条件下处理16天的幼苗(每个处理各30株)转移到正常条件的蛭石中恢复生长，分别恢复8天以及21天后观察其恢复生长情况。结果如图3A所示，结果表明，在较高NaCl条件下，野生型的拟南芥成活率较低(在75mM和
125mM NaCl处理中，野生型的30株苗均能恢复生长，但在150mM NaCl处理和180mM NaCl处理下，分别有10株和5株能恢复生长)，而且生长受到了抑制；而转pBI121-GmGT-2B植物恢复生长良好，成活率高(在75mM和125mM NaCl处理中，转基因植株的30株苗均能恢复生长，而在150mM NaCl处理和180mM NaCl处理下，分别有24株和26株能恢复生长)。结果表明，GmGT-2B基因与耐盐性相关，其过量表达可提高植物的耐盐性。

[0056] 二、转GmGT-2B基因拟南芥株系的耐旱性鉴定

[0057] 将在MS培养基中生长7天的野生型和转pBI121-GmGT-2B拟南芥T1代L1、L2株系的幼苗(各30株)在26-28℃中大气干旱，即停止给水16天后观察结果，以在正常条件下培养的野生型和转pBI121-GmGT-2B拟南芥T1代L1、L2株系的幼苗为对照。结果如图3B所示，结果表明，转pBI121-GmGT-2B植株无论苗期还是开花期，均表现出明显的耐旱性。野生型植株存活率达43％(存活13株)，而转基因植株仍然有80％以上能正常生长，结实，其中，T1代L1株系有24株能正常生长，结实；L2株系有26株能正常生长，结实。

[0058] 三、转GmGT-2B基因拟南芥株系的耐冻性鉴定

[0059] 将在MS培养基中生长7天的野生型(对照)和转pBI121-GmGT-2B拟南芥T1代L1、L2株系的幼苗(各20株)，移植到正常蛭石中生长5天后，将对照与转pBI121-GmGT-2B拟南芥T1代L1、L2植株置于-20℃冰柜中处理105min，之后在正常生长条件下恢复8天后观察结果，结果如图3C所示，结果表明，野生型对照存活率为20％(存活4株)，而转pBI121-GmGT-2B植株仍然有80％以上(T1代L1株系17株，L2株系18株)的能恢复生长。

[0060] 序列表

[0061] <160>2

[0062] <210>1

[0063] <211>1746

[0064] <212>DNA

[0065] <213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

[0066] <400>1

[0067] atgttcgatg gagtaccaga ccagttccac caattcataa ctccaaggac ctcacaacct 60[0068] cttcacttac ctttccctct ccatgcttca ggaaccccca ataccacctt cccttccaat 120[0069] tttgatcctt ataacaaccc ttctcatcaa ttgccactcc aacccaacaa cctcttgcac 180[0070] ccattacacc acaaagatga agagaaggaa gaaaacacaa ccaccgtccc aatgaacttc 240[0071] gaaatccaaa gagatcaaag gcaacaactt cctgaactaa ttgatccctg gactaccgat 300[0072] gaagtgctta ccctcttgag gatcagatct agcatggaaa gttggttccc agaactcact 360[0073] tgggaacatg tctcaaggaa actagcaggg cttggatata agaggagtgc agagaagtgc 420[0074] aaggagaagt ttgaagaaga gagtagatat ttcaacaaca acatcaatta cgccaagaat 480[0075] aacaataata gtaccagcaa ttatcggttt cttagtgagc ttgaacaact ttatcaccaa 540[0076] caagggagta gtggtgatca tcttgaaaag atgactcagc caccactgca gaaacaaggc 600[0077] aggatggacc accatgcatt agaattggaa gaggaagaag gggattcgag aaacgttatt 660[0078] gttgacgcat cggtgacaaa aatacaaagc gacgaggcac ttgcggtgga aaagatcaca 720[0079] aaggaccgca agaggaagag gtctgatagg tttgagatgt tcaagggttt ttgcgagagc 780[0080] attgtgcaca agatgatgac tcagcaagaa gagatgcaca acaagctcct tgaggacatg 840[0081] atgaagagag atgaagagaa gttcaccaga gaggaagctt ggaagaagca agagatggag 900[0082] aagatgaaca aggagcttga gatgatggca cgtgagcagg ctgttgcagg tgatagacaa 960[0083] gccaaaatta tccaaatcct gaacaaattc tcagccacta cttcgtcccc tgcaagcctc 1020[0084] accctcaaga aggtaaacac ccacatttca caaaacccta atccttcaca aacagaaaac 1080[0085] cctactttaa gtgttgcaca agacacactg attccttcta cttcttctac ttcaactcca 1140[0086] gctccagctc ctccccagaa ccctagttct tgttctctaa atagccagaa taataatcat 1200[0087] attaataata atattccagt agagaaaaat tcgattttga ataaggggtc ctcatcaaat 1260[0088] gagaaagacg atgttgggag aaggtggcca aaggatgaag tgttggcact cataaacctg 1320[0089] aggtgcacca gtgtgaacaa caacaacaac aatgaggaga aggaagggaa caacaaggtc 1380[0090] cctctgtggg agagaatctc acaagggatg tcggagttga gatacaagag gagtgcaaag 1440[0091] aggtgcaaag agaagtggga gaacataaac aagtacttca ggaaaaccaa ggatattact 1500[0092] aagaagaggt cccttgactc aagaacttgt ccctactttc atcagttgag cagtctctac 1560[0093] aatcaaggaa aactcgttct acaatctgaa agccacttga ataatactcc acctgatcag 1620[0094] aatcccgagc aagtaaaacc agatcaaaca acacaagctc atgagtcttc ttcgcaggtg 1680[0095] gggtctggta gtggtttcag tgttcagcaa cagcaggtac cttctttgga ttttgatcag 1740[0096] ttttaa 1746[0097] <210>2

[0098] <211>581

[0099] <212>PRT

[0100] <213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

[0101] <400>2

[0102] Met Phe Asp Gly Val Pro Asp Gln Phe His Gln Phe Ile Thr Pro Arg[0103] 1 5 10 15

[0104] Thr Ser Gln Pro Leu His Leu Pro Phe Pro Leu His Ala Ser Gly Thr[0105] 20 25 30

[0106] Pro Asn Thr Thr Phe Pro Ser Asn Phe Asp Pro Tyr Asn Asn Pro Ser[0107] 35 40 45

[0108] His Gln Leu Pro Leu Gln Pro Asn Asn Leu Leu His Pro Leu His His[0109] 50 55 60

[0110] Lys Asp Glu Glu Lys Glu Glu Asn Thr Thr Thr Val Pro Met Asn Phe[0111] 65 70 75 80[0112] Glu Ile Gln Arg Asp Gln Arg Gln Gln Leu Pro Glu Leu Ile Asp Pro[0113] 85 90 95

[0114] Trp Thr Thr Asp Glu Val Leu Thr Leu Leu Arg Ile Arg Ser Ser Met[0115] 100 105 110

[0116] Glu Ser Trp Phe Pro Glu Leu Thr Trp Glu His Val Ser Arg Lys Leu[0117] 115 120 125

[0118] Ala Gly Leu Gly Tyr Lys Arg Ser Ala Glu Lys Cys Lys Glu Lys Phe[0119] 130 135 140

[0120] Glu Glu Glu Ser Arg Tyr Phe Asn Asn Asn Ile Asn Tyr Ala Lys Asn[0121] 145 150 155 160[0122] Asn Asn Asn Ser Thr Ser Asn Tyr Arg Phe Leu Ser Glu Leu Glu Gln[0123] 165 170 175[0124] Leu Tyr His Gln Gln Gly Ser Ser Gly Asp His Leu Glu Lys Met Thr[0125] 180 185 190[0126] Gln Pro Pro Leu Gln Lys Gln Gly Arg Met Asp His His Ala Leu Glu[0127] 195 200 205

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[0130] Val Thr Lys Ile Gln Ser Asp Glu Ala Leu Ala Val Glu Lys Ile Thr[0131] 225 230 235 240[0132] Lys Asp Arg Lys Arg Lys Arg Ser Asp Arg Phe Glu Met Phe Lys Gly[0133] 245 250 255[0134] Phe Cys Glu Ser Ile Val His Lys Met Met Thr Gln Gln Glu Glu Met[0135] 260 265 270

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[0138] Thr Arg Glu Glu Ala Trp Lys Lys Gln Glu Met Glu Lys Met Asn Lys[0139] 290 295 300

[0140] Glu Leu Glu Met Met Ala Arg Glu Gln Ala Val Ala Gly Asp Arg Gln[0141] 305 310 315 320[0142] Ala Lys Ile Ile Gln Ile Leu Asn Lys Phe Ser Ala Thr Thr Ser Ser[0143] 325 330 335[0144] Pro Ala Ser Leu Thr Leu Lys Lys Val Asn Thr His Ile Ser Gln Asn[0145] 340 345 350

[0146] Pro Asn Pro Ser Gln Thr Glu Asn Pro Thr Leu Ser Val Ala Gln Asp[0147] 355 360 365

[0148] Thr Leu Ile Pro Ser Thr Ser Ser Thr Ser Thr Pro Ala Pro Ala Pro[0149] 370 375 380

[0150] Pro Gln Asn Pro Ser Ser Cys Ser Leu Asn Ser Gln Asn Asn Asn His[0151] 385 390 395 400[0152] Ile Asn Asn Asn Ile Pro Val Glu Lys Asn Ser Ile Leu Asn Lys Gly[0153] 405 410 415[0154] Ser Ser Ser Asn Glu Lys Asp Asp Val Gly Arg Arg Trp Pro Lys Asp[0155] 420 425 430

[0156] Glu Val Leu Ala Leu Ile Asn Leu Arg Cys Thr Ser Val Asn Asn Asn[0157] 435 440 445

[0158] Asn Asn Asn Glu Glu Lys Glu Gly Asn Asn Lys Val Pro Leu Trp Glu[0159] 450 455 460

[0160] Arg Ile Ser Gln Gly Met Ser Glu Leu Arg Tyr Lys Arg Ser Ala Lys[0161] 465 470 475 480[0162] Arg Cys Lys Glu Lys Trp Glu Asn Ile Asn Lys Tyr Phe Arg Lys Thr[0163] 485 490 495[0164] Lys Asp Ile Thr Lys Lys Arg Ser Leu Asp Ser Arg Thr Cys Pro Tyr[0165] 500 505 510

[0166] Phe His Gln Leu Ser Ser Leu Tyr Asn Gln Gly Lys Leu Val Leu Gln[0167] 515 520 525

[0168] Ser Glu Ser His Leu Asn Asn Thr Pro Pro Asp Gln Asn Pro Glu Gln[0169] 530 535 540

[0170] Val Lys Pro Asp Gln Thr Thr Gln Ala His Glu Ser Ser Ser Gln Val[0171] 545 550 555 560[0172] Gly Ser Gly Ser Gly Phe Ser Val Gln Gln Gln Gln Val Pro Ser Leu[0173] 565 570 575[0174] Asp Phe Asp Gln Phe

[0175] 580