真菌细胞壁降解酶转让专利
申请号 : CN200580006100.4
文献号 : CN1922314B
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 吴文平 , 柯克·M·施努尔
申请人 : 诺维信公司
摘要 :
分离了一种具有溶菌酶活性的新的真菌酶。本发明进一步涉及具有溶菌酶活性并属于GH25家族的真菌多肽，其中所述酶选自(a)包含与SEQ IDNO：2的氨基酸1-233具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与由插入到存在于菌株DSM16084中的质粒中的核苷酸序列的溶菌酶编码部分所编码的多肽具有至少80％同一性；(c)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在高度严格条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸84-782的互补链组成的多核苷酸探针杂交；或(d)具有溶菌酶活性的(a)，(b)或(c)的片段。
权利要求 :
1.具有溶菌酶活性并属于GH25家族的真菌多肽，其选自：(a)由与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233相比具有保守性取代、缺失或插入的氨基酸序列组成的多肽，所述保守性取代、缺失或插入的氨基酸的数目至多为10；
(b)由下述氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与由插入到存在于菌株DSM16084中的质粒中的核苷酸序列的溶菌酶编码部分所编码的多肽相比具有保守性取代、缺失或插入，所述保守性取代、缺失或插入的氨基酸的数目至多为10；
(c)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在高度严格条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸84-782的互补链组成的多核苷酸探针杂交。
2.根据权利要求1的多肽，其中所述保守性取代、缺失或插入的氨基酸的数目至多为5。
3.根据权利要求1-2任一项的多肽，其由SEQ ID NO：2的氨基酸1-233组成。
4.根据权利要求1的多肽，其由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列在极高度严格条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸84-782的互补链组成的多核苷酸探针杂交。
5.由编码在权利要求1-4任一项中定义的多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸。
6.核酸构建体，其包含权利要求5中定义的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作性地连接到引导所述多肽在合适宿主中生产的一种或多种控制序列上。
7.重组表达载体，其包含权利要求6的核酸构建体。
8.重组宿主细胞，其包含权利要求6的核酸构建体。
9.生产如在权利要求1-4任一项中定义的多肽的方法，包括：(a)培养菌株从而生产所述多肽，所述菌株的野生型形式能够生产所述多肽；和(b)回收所述多肽。
10.生产如在权利要求1-4任一项中定义的多肽的方法，包括：(a)在有益于生产所述多肽的条件下，培养如在权利要求8中所定义的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
11.由核苷酸序列组成的多核苷酸，所述核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸84-782编码的氨基酸序列相比具有保守性取代、缺失或插入，所述保守性取代、缺失或插入的氨基酸的数目至多为10。
12.根据权利要求11的多核苷酸，其中所述保守性取代、缺失或插入的氨基酸的数目至多为5。
13.由SEQ ID NO：1组成的多核苷酸。
14.由核苷酸序列组成的多核苷酸，所述核苷酸序列编码的氨基酸序列与由插入到存在于菌株DSM16084中的质粒中的核苷酸序列的溶菌酶编码部分相比具有取代、缺失或插入，所述取代、缺失或插入的氨基酸的数目至多为10。
15.由编码具有溶菌酶活性的多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸，并且所述核苷酸序列在高度严格条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸84-782的互补链组成的多核苷酸探针杂交。
16.由经修饰的核苷酸序列组成的多核苷酸，所述经修饰的核苷酸序列在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个修饰，并且其中所述经修饰的核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1-233组成的多肽。
17.根据权利要求1-4任一项的多肽在生产生物膜形成抑制剂中的应用。
18.根据权利要求1-4任一项的多肽在生产牙用组合物中的应用。
19.根据权利要求1-4任一项的多肽在生产去污剂组合物中的应用。
20.根据权利要求1-4任一项的多肽在生产动物饲料中的应用。
说明书 :
发明领域
本发明涉及具有溶菌酶活性的真菌酶，编码该溶菌酶的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的核酸构建体，生产该溶菌酶的方法，以及该溶菌酶的应用。
发明背景
溶菌酶是一种由许多种生物作为对抗细菌的防御性机制生产的O-糖基水解酶。该酶通过剪切肽聚糖的糖苷键引发细菌细胞壁的水解；所述肽聚糖是细菌中一种重要的结构分子。在它们的细胞壁被溶菌酶作用弱化后，细菌细胞由于渗透压而裂解。
溶菌酶存在于许多生物中，如病毒，植物，昆虫，鸟类，爬行动物和哺乳动物。在哺乳动物中，已经从鼻分泌物，唾液，眼泪，肠，尿和乳中分离出溶菌酶。该酶剪切N-乙酰基胞壁酸的1号碳和N-乙酰基-D-葡糖胺的4号碳之间的糖苷键。在体内，这两种糖聚合形成细胞壁多糖。
溶菌酶对其显示有效性的细菌包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)和单核细胞增多性李斯特杆菌(Listeria monocytogenes)。
卵清溶菌酶蛋白的溶菌作用目前用在两个市场中。
在干酪生产中，已经发现溶菌酶对于营养体型的梭菌属细菌并且特别是酪丁酸梭菌具有有效破坏性。已经发现这些细菌在用于生产干酪的奶的热处理后能够存活并且随后繁殖以引发后期气孔生成(late blowing)。后期气孔生成是在发生于干酪成熟期间丁酸发酵过程中的产气。不必要的产气(eyes)可能造成这样的影响：产生不规则形状的气孔而造成的结构缺陷；或明显令人不快的味道和气味；最后，干酪块可能完全裂开。在奶发酵中使用溶菌酶，可以进行干酪的生产和加工而不用考虑丁酸发酵引发后期气孔生成。这带来欧洲干酪生产中广泛使用溶菌酶，特别是在中度和长期成熟的干酪的制造中。推荐的剂量是0.2Ibs/1000加仑奶。由于热不稳定性，溶菌酶必须在最后的热处理之后加入，并且由于蛋白酶敏感性在粗制凝乳酶加入之前尽可能早地加入。
在药学中，溶菌酶在生物液体中的天然功能是攻击对于身体外源的细菌。许多通过任何典型途径——眼、口、鼻和伤口侵袭身体的细菌受到人免疫系统的对抗，溶菌酶是所述免疫系统的关键部分。通过生产包含这种卵清来源的蛋白质的药物片剂和胶囊已经将这种抗感染活性用于药物工业中。它还是眼药水、牙膏和喉片中的重要成分。溶菌酶的潜在用途是多样的。已经在癌症研究和兽医应用中确定了成功的结果。作为食品防腐剂，溶菌酶是许多潜在致癌物的天然、有机替代物。溶菌酶在婴儿食品应用以及动物饲料中的应用已经显示出积极的结果。这种卵清来源的酶的潜能是多样的并且对将来应用的研究和开发正在进行之中。
已经报道了一种来自Chalaropsis的GH25溶菌酶(Felsch JW，Ingagami T，and Hash JH.(1975)The N，O-Diacetylmuramidase of Chalaropsis species；VThe complete amino acid sequence.JBC.250：10pp 3713-3720)。
可以在商业市场上购得的主要产品是母鸡卵清溶菌酶，其并不剪切在例如金黄色链球菌(Streptococcus aureus)细胞壁中的N，6-O-二乙酰胞壁质酶(N，6-O-diacetylmuramidase)因而不能溶解这种重要的人类病原体及其他。
所以需要新的具有溶菌酶活性的多肽。
发明概述
本发明的发明人分离了一种编码具有溶菌酶活性的酶的真菌基因/cDNA。据我们所知编码这种酶的基因/cDNA以往未曾被描述过。
所以在第一方面本发明涉及具有溶菌酶活性并且属于GH25家族的真菌多肽。
在第二方面本发明涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
定义
在讨论本发明的详细实施方案之前，提供相对于本发明主要方面的特定术语的定义。
缩写：GicNAc，N-乙酰氨基葡萄糖；MurNAc，N-乙酰基胞壁酸
基本上纯的多肽(substantially pure polypeptide)：在本文中，术语“基本上纯的多肽”意指多肽制品，其最多包含10重量％的与它天然伴随的其它多肽物质(其它多肽物质的更低百分比是优选的，例如，最多8重量％，最多6重量％，最多5重量％，最多4重量％，最多3重量％，最多2重量％，最多1重量％，最多1/2重量％)。因而，优选所述基本上纯的多肽具有至少92％的纯度，即，所述多肽构成存在于制品中总多肽物质的重量的92％，优选更高的百分比如至少94％的纯度，至少95％的纯度，至少96％的纯度，至少97％的纯度，至少98％的纯度，至少99％的纯度，最多99.5％纯度。优选本文公开的多肽是基本上纯的形式。特别地，优选本文公开的多肽是“实质上(essentially)纯的形式”，即所述多肽制品实质上不含它所天然伴随的其它多肽物质。这可以，例如，通过公知的重组方法制备多肽而实现。这里，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”是同义的。
溶菌酶活性：术语溶菌酶活性在本文中定义为O-糖基水解酶，其催化两种或多种糖之间，或糖和非糖部分之间的糖苷键的水解。溶菌酶剪切细菌细胞壁的粘多糖和粘多肽中某些残基之间的糖苷键，导致细菌裂解。溶菌酶属于酶类别EC3.2.1.17。
同一性：在本文中，两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的同源性由参数“同一性”来描述。
为了本发明的目的，通过可用于蛋白质和DNA比对的Needleman-Wunsch比对来确定两种氨基酸序列之间的同一性程度。对于蛋白质比对来说所用的默认评分矩阵为BLOSUM50，对缺口中第一个残基的罚分为-12，而对缺口中其它残基的罚分为-2。可以用来自FASTA软件包v20u6版的Align软件进行比对(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448；andW.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTPand FASTA″，Methods in Enzymology，183：63-98)。
使用同一性矩阵为默认评分矩阵，利用与上面所述相同的算法和软件包可以确定两种核苷酸序列之间的同一性程度。对缺口中第一个残基的罚分为-16，而对缺口中的其它残基的罚分为-4。
片段：当在本文中使用时，SEQ ID NO：2的“片段”是保留氨基酸序列的溶菌酶活性，但有一个或多个氨基酸从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删除的多肽.优选地，一个片段包含SEQ ID NO：2的至多208个氨基酸残基，例如，氨基酸20-228。
基本上纯的多核苷酸：如本文所用的术语“基本上纯的多核苷酸”指这样一种多核苷酸制品，其中所述多核苷酸已经离开了其天然遗传环境，因此不含其它无关的或不需要的编码序列，并且为适于应用在遗传工程蛋白生产系统中的形式。因而，基本上纯的多核苷酸最多包含10％重量的与它天然伴随的其它多核苷酸物质(其它多核苷酸物质的更低百分比是优选的，例如，最多8重量％，最多6重量％，最多5重量％，最多4重量％，最多3重量％，最多2重量％，最多1重量％，最多1/2重量％)。不过，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选所述基本上纯的多核苷酸具有至少92％的纯度，即，所述多核苷酸构成存在于制品中总多核苷酸物质的重量的至少92％，优选更高的百分比如至少94％的纯度，至少95％的纯度，至少96％的纯度，至少97％的纯度，至少98％的纯度，至少99％的纯度，最多99.5％的纯度。优选本文公开的多核苷酸是基本上纯的形式。特别地，优选本文公开的多核苷酸是“实质上纯的形式”，即所述多核苷酸制品实质上不含与它天然伴随的其它多核苷酸物质。这可以，例如，通过公知的重组方法制备多核苷酸而实现。这里，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”是同义的。
修饰：在本发明的上下文中术语“修饰”意指由显示为SEQ ID NO：2的氨基酸1-233的氨基酸序列组成的多肽的任何化学修饰以及编码该多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是在目标氨基酸中或目标氨基酸上的氨基酸侧链的替换，取代，删除和/或插入。
人工变体：当在本文中使用时，术语“人工变体”意为具有溶菌酶活性的多肽，其由一种生物产生，所述生物表达与SEQ ID NO：1相比修饰过的基因。所述修饰过的基因当在合适的宿主中表达时由此产生所述变体，该基因是通过人类干预由SEQ ID NO：1中公开的核苷酸序列的修饰而获得的。
cDNA：当用于本文中时术语“cDNA”意在涵盖可以通过由源自真核细胞的成熟的、经过剪切的mRNA分子的反转录制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起初的初级RNA转录本是mRNA的前体并且它在变为成熟的经过剪切的mRNA之前经历一系列加工事件。这些事件包括通过称作剪切的过程来除去内含子序列。当cDNA源自mRNA时，它相应地缺少内含子序列。
核酸构建体：当用于本文时，术语“核酸构建体”意为一种核酸分子，不论是单链或双链的，其分离自天然存在的基因或者其经过修饰以天然不存在的方式包含核酸的片段。当核酸构建体包含本发明的编码序列表达所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”同义。
控制序列：术语“控制序列”在这里定义为包括任何组分，其是本发明的多肽表达所必需的或有益的。每种控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列而言可以是固有的或外源的。这些控制序列包括，但不限于，前导序列，多腺苷化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止子。至少，所述控制序列包括启动子和转录与翻译终止信号。所述控制序列具有接头用来导入有利于控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接的特定限制性位点。
可操作性连接的：术语“可操作性连接的”在本文中被定义为这样一种构型，其中将控制序列相对于DNA序列的编码序列适当地置于一个位置上从而使控制序列指导多肽的表达.
编码序列：当在本文中使用时术语“编码序列”意在涵盖核苷酸序列，其直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，其通常以ATG起始密码子开始。所述编码序列一般包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。
表达：在本文中，术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：在本文中，术语“表达载体”涵盖线性或环状的DNA分子，，其包含编码本发明多肽的片段，并且所述片段可操作性地连接到提供其转录的其它片段上。
宿主细胞：如本文所用的，术语“宿主细胞”包括任何易受核苷酸构建体转化的细胞类型。当使用细菌细胞作为宿主细胞时它不适于表达本发明的真菌多肽，不过，细菌宿主细胞可以用于克隆目的。
术语“多核苷酸探针”，“杂交”以及各种严格条件在标题为“具有溶菌酶活性的多肽”的部分进行定义。
发明详述
本发明的多肽是在筛选高度分泌的多肽的过程中从真菌，更确切从朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus，与朱红栓菌(Trametes cinnabarina)同义)中分离的，其功能已被确定。在第一个实施方案中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且属于GH25家族的真菌多肽。EC 3.2.1.17酶活性分类包括进行原核生物细胞壁的肽聚糖杂聚物中N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙酰基胞壁酸之间1，4-β-键水解的酶。一种酶可以具有一种底物特异性(例如N-乙酰基胞壁酸)而没有另一种底物特异性(在此情况下为N-乙酰基-D-葡糖胺)。
GH25家族是根据Henrissat糖基水解酶家族分类的酶的分类(Henrissat B.，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.280：309-316(1991)；Henrissat B.，BairochA.New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.293：781-788(1993)；Henrissat B.，Bairoch A.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316：695-696(1996)；Davies G.，Henrissat B.Structures and mechanisms ofglycosyl hydrolases.Structure 3：853-859(1995))。
除了GH25之外，具有溶菌酶(EC 3.2.1.17)活性的其它水解酶家族有GH22，GH23和GH24。家族GH22，或溶菌酶C包括鸡卵清溶菌酶和反刍动物的胃溶菌酶。此家族是四个家族中研究最广泛的。一般称为溶菌酶G的GH23由Goose和许多研究较少的来自基因组测序项目的噬菌体以及细菌序列所代表。GH24包括特别是噬菌体T4和其它噬菌体和细菌溶菌酶。由Seo等2003年(Seo HJ；Kitaoka M；Ohmiya K；Hayashi K.，(2003)Substratespecificity of the N，6-O-diacetylmuramidase from Streptomyces globisporus.Journal of Bioscience and Bioengineering，Vol.95(3)pp.313-316)进行的研究显示，至少对于球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)GH25酶来说，观察到与鸡卵清溶菌酶GH22相比不同的活性谱.该链霉菌的酶具有N-乙酰胞壁质酶和N，6-O-二乙酰胞壁质酶活性.这使得球孢链霉菌酶能够降解高度乙酰化的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁。这种活性可以外推到该家族中的其它溶菌酶，如本发明的溶菌酶GH25。
在另外的实施方案中本发明涉及这样的多肽，其中所述包含与SEQ IDNO：2的氨基酸1-233具有至少65％，优选至少70％，例如至少75％，更加优选至少80％，如至少85％，还要更加优选至少90％，最优选至少95％，例如至少96％，如至少97％，还要最优选至少98％，如至少99％的同一性程度的氨基酸序列，优选由所述氨基酸序列组成(下文中称为″同源性多肽″)。在一个令人感兴趣的实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233至多有十个氨基酸(例如十个氨基酸)不同，特别是至少五个氨基酸(例如五个氨基酸)，如至多四个氨基酸(例如四个氨基酸)，例如至多三个氨基酸(例如三个氨基酸)不同。在一个特别令人感兴趣的实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233至多有两个氨基酸(例如两个氨基酸)，如一个氨基酸不同。
优选地，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；其等位变体；或其具有溶菌酶活性的片段。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-233。在另外的实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸1-233组成。
本发明的多肽可以是由天然来源鉴定和分离的野生型溶菌酶。这些野生型多肽可以例如通过生物信息学方法进行具体鉴定，所述方法是一种能够用来鉴定溶菌酶候选物的方法。简言之GH25溶菌酶候选物可以通过利用GH25家族的已知溶菌酶作为搜索序列在基因组或cDNA测序项目中直接进行鉴定。另一种方法是利用一种标准的同源性搜索程序如WU-BlastX(2.0a19MP-WashU)比较所有的独特DNA片段(重叠群)。
另外，可以通过如在J.E.Ness等，Nature Biotechnology 17，893-896(1999)中所述的DNA改组技术制备本发明的多肽。而且，本发明的多肽可以是一种人工变体，其包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233相比具有氨基酸的至少一个取代，删除和/或插入的氨基酸序列，或优选由其组成。这些人工变体可以通过本领域已知的标准技术进行构建，如通过包含显示为SEQ IDNO：2的氨基酸1-233的多肽的定点/随机诱变。在本发明的一个实施方案中，氨基酸变化(在人工变体以及在野生型多肽中)是微小的，这些变化有：保守性氨基酸取代，并不显著影响蛋白质的折叠和或活性；小的删除，一般是1个到大约30个氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延长，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；长达大约20-25个残基的小的连接肽；或小的延伸，其通过改变静电或另一种功能而有利于纯化，如多组氨酸区(polyhistidinetract)，抗原性表位或结合结构域。
保守性取代的实例是在各组氨基酸：碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸)之内发生取代。一般不改变特定活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如，H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，TheProteins，Academic Press，New York所描述。最常发生的互换是Ala/Ser，Val/lle，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly以及这些的反向互换。
在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，所述氨基酸变化使多肽的物理-化学特性得以改变.例如，可以进行提高多肽的热稳定性、改变底物特异性改变最适pH值等等的氨基酸改变.
优选地，与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233相比，这些取代、删除和/或插入的数目为至多10个，例如至多9个，如至多8个，更加优选至多7个，例如至多6个，如至多5个，最优选至多4个，例如至多3个，如至多2个，特别是至多1个。
在另一个实施方案中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，其由在极低严格条件下，优选在低严格条件下，更加优选在中等严格条件下，更加优选在中等高度严格条件下，进一步优选在高度严格条件下，最优选在极高严格条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸84-782的互补链组成的多核苷酸探针杂交的核苷酸序列所编码(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold SpringHarbor，New York)。
SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其子序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可以用来设计多核苷酸探针以便根据本领域公知的方法由不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有溶菌酶活性的多肽的DNA。特别地，这些探针可以用来根据标准的Southern印迹操作与目标属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可以比完整序列短得多，但长度应当为至少15，优选至少25，更加优选至少35个核苷酸，如至少70个核苷酸长。不过，优选所述多核苷酸探针至少100个核苷酸长。例如，所述多核苷酸探针可以至少200个核苷酸长，至少300个核苷酸长，至少400个核苷酸长或至少500个核苷酸长。甚至可以使用更长的探针，例如，至少600个核苷酸长，至少700个核苷酸长，至少800个核苷酸长，或至少900个核苷酸长的多核苷酸探针。可以使用DNA和RNA探针。一般对探针进行标记以便检测相应的基因(例如，用32p，3H，35S，生物素，或抗生物素蛋白)。
由此，可以从制备自这些其它生物的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并编码具有溶菌酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术来从这些其它生物中分离基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定于硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1同源的克隆或DNA，将具有固定DNA的载体材料用于Southern印迹中。
为了本发明的目的，“杂交”表明所述核苷酸序列在极低到极高严格条件下与标记的多核苷酸序列杂交，该标记的多核苷酸序列与SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列杂交。利用X射线胶片或通过本领域已知的其它方法可以检测在这些条件下与所述多核苷酸探针杂交的分子。无论何时术语“多核苷酸探针”用于本文，应当理解这种探针包含至少15个核苷酸。
在另一个令人感兴趣的实施方案中，所述多核苷酸探针是编码SEQ IDNO：2的多肽的核苷酸序列的互补链。在另一个令人感兴趣的实施方案中，所述多核苷酸探针是SEQ ID NO：1的互补链。在另一个令人感兴趣的实施方案中，所述多核苷酸探针是SEQ ID NO：1的成熟肽编码区的互补链。
对于至少100个核苷酸长的长探针，极低到极高严格条件被定义为按照标准的Southern印迹操作，在42℃于5X SSPE，1.0％SDS，5X Denhardt′s溶液，100μg/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA中进行预杂交和杂交。优选地，至少100个核苷酸长的长探针包含不超过1000个核苷酸。对于至少100个核苷酸长的长探针，最后用2x SSC，0.1％SDS于42℃(极低严格)将载体材料洗涤三次每次15分钟，优选地用0.5x SSC，0.1％SDS于42℃(低严格)洗涤三次每次15分钟，更加优选地用0.2x SSC，0.1％SDS于42℃(中等严格)洗涤三次每次15分钟，进一步优选地用0.2x SSC，0.1％SDS于55℃(中高度严格)洗涤三次每次15分钟，最优选地用0.1x SSC，0.1％SDS于60℃(高度严格)洗涤三次每次15分钟，特别地用0.1x SSC，0.1％SDS于68℃(极高严格)洗涤三次每次15分钟。
尽管不是特别优选地，预期也可以使用较短的探针，例如从大约15到99个核苷酸长的探针，如从大约15到大约70个核苷酸长。对于这些短探针，严格条件被定义为，于0.9M NaCl，0.09M Tris-HCI pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mMATP，和0.2mg酵母RNA每ml中，在比根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)的计算法计算的Tm低5℃到10℃的温度下，按照标准的Southern印迹操作进行预杂交、杂交和洗涤杂交后产物。
溶菌酶活性
对于溶菌酶活性的测定已经描述了几种测定法。在J.Biochem.(H.Maeda，1980，vol.88(4)：1185-1191)中描述的一种测定法是基于利用荧光素标记的肽聚糖作为底物的荧光极化作用或荧光强度，所述荧光素标记的肽聚糖获自溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)。
另一种测定法是基于在450nm处监测由溶菌酶造成的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)悬液的澄清，并与已知活性的溶菌酶标准相比较。这种测定法是在FIP Center for Standards，International Commission onPharmaceutical Enzymes，Harelbekestaat 72，B-9000gent，Belgium中开发出来的。这种测定法需要使用冻干的存活藤黄微球菌ATCC 4698细胞。这种底物以及详细的方案可以由上述Center for Standards获得。
另一种测定法，Lysozyme Assay Kit(E-22013)，可由MolecularProbes获得，并且是基于对标记以荧光素的溶壁微球菌细胞壁的溶菌酶活性的测量。
具有溶菌酶活性的多肽的来源
本发明的多肽是真菌多肽。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)，壶菌门(Chytridiomycota)，和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等于Ainsworth and Bisby’s Dictionaryof The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义的)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，同前，第171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同前)。
在具体的实施方案中，所述真菌多肽是酵母多肽。在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽酵母(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，为了本发明的目的，酵母的定义将如Biology and Activities of Yeast，Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9，1980所述。
在特定实施方案中的酵母多肽为假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽.在一个令人感兴趣的实施方案中，所述多肽是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis的多肽。
在另一种特定实施方案中，本发明的真菌多肽是丝状真菌多肽如枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮霉属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)的多肽。
在另一个令人感兴趣的实施方案中，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黄色镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、网状镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肽色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicolainsolens、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、严紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。
将会理解的是对于前述物种，本发明包括完全和不完全的状态，以及其它分类学上的等价物，例如无性型，不管其种名如何。本领域的技术人员将方便地认识到合适的等价物的同一性。
公众可以方便地从多个培养物保藏中心，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究机构保藏中心(NRRL)处获得这些物种的菌株。
此外，可以使用上述探针从其它来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物中鉴定并获得这些多肽.从自然生境分离微生物的技术在本领域中众所周知.然后类似地通过筛选另一种微生物的基因组文库或cDNA文库可得到核苷酸序列.一旦用探针检测到编码该多肽的核酸序列，可使用本领域普通技术人员所知的技术分离或克隆该序列(见，例如，Sambrook等人，1989，同前).
由本发明的核苷酸序列编码的多肽也包括融合多肽或可切开的融合多肽，其中另一种多肽在该多肽或其片段的N端或C端与之融合。融合多肽是通过将编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)相融合而产生的。产生融合多肽的技术在本领域中已知，包括连接编码多肽的编码序列，使得它们共阅读框，并使融合多肽的表达位于相同启动子和终止子的控制之下。
多核苷酸和核苷酸序列
本发明还涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。特别地，本发明涉及由编码本发明的多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸。在具体的实施方案中，所述核苷酸序列在SEQ ID NO：1中给出。在更加具体的实施方案中，核苷酸序列139-724是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。
本发明还包括具有编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽组成的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，优选由其组成，所述多核苷酸基于遗传密码的简并性与SEQ ID NO：1区别。
本发明还涉及具有编码具溶菌酶活性的SEQ ID NO：2片段的SEQ IDNO：1的子序列的多核苷酸，优选由其组成。SEQ ID NO：1的子序列是SEQID NO：1所包括的核苷酸序列，除了从5’和/或3’端已删去了一个或多个核苷酸。
本发明还涉及具有在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个修饰的经修饰的核苷酸序列的多核苷酸，优选由其组成，其中所述经修饰的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的氨基酸19-233。
用于分离或克隆编码一种多肽的核酸序列的技术在本领域众所周知，包括从基因组DNA的分离、从cDNA的制备或其组合。例如，通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或表达库的抗体筛选来检测具有共同结构特征的克隆DNA片段，能从这种基因组DNA中克隆本发明的核酸序列。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，AcademicPress，New York。可以应用其它核酸扩增方法如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。可从曲霉株或另一种或相关生物中克隆核酸序列，因而，该核酸序列可以是例如该核酸序列多肽编码区的等位变体或种间变体。
可通过基因工程中使用的标准克隆方法获得核苷酸序列，以便将该核苷酸序列从其天然位置再定位到另外的位点，在此位点上该序列将被复制。克隆方法可包括包含编码该多肽的核苷酸序列的期望片段的切割和分离、该片段向载体分子中的插入，以及重组载体向宿主细胞中的掺入，在宿主细胞中该核酸序列的多拷贝或克隆将被复制。该核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成的来源或其任意组合。
本发明还涉及多核苷酸，其具有与SEQID NO：1的核苷酸84-782有至少65％同一性的核苷酸序列，优选由其组成。优选地，所述核苷酸序列与SEQID NO：1的核苷酸84-782有至少70％同一性，例如，至少80％同一性，如至少90％同一性，更加优选至少95％同一性，如至少96％同一性，例如至少97％同一性，还要更加优选至少98％同一性，如至少99％同一性。特别地，所述核苷酸序列编码具有溶菌酶活性的多肽。如先前所述的那样来测定两种核苷酸序列之间的同一性程度(见标题为“定义”的部分)。
编码本发明的多肽的核苷酸序列的修饰对于多肽的合成可能是必需的，所述多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233相比具有至少一个置换、删除和/或插入的氨基酸序列。这些人工变体可能以工程改造的方式有别于分离自其天然来源的多肽，例如，在比活性、热稳定性、最适pH等等方面有所区别的变体。
对本领域的技术人员而言显然这种修饰能在分子功能的关键区之外进行，而仍产生活性多肽。为本发明的分离核酸序列所编码的多肽的活性所必需，因此优选地不予修饰的氨基酸残基，可根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸分区诱变(见，例如，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1080-1085)来鉴定。在后一种方法中，在分子中每一带正电荷的残基处均引入突变，测定产生的突变分子的溶菌酶活性(如实施例所示)以鉴定对于分子活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能通过三维结构分析来确定，三维结构由核磁共振分析、晶体学或光亲和标记(见，例如，de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)来确定。
另外，通过导入核苷酸取代可以修饰编码本发明多肽的核苷酸序列，所述取代不会产生由核苷酸序列编码的多肽的另一种氨基酸序列，但是其对应于宿主生物产生酶所偏好的密码子用法。
通过利用本领域已知的任何方法进行定点诱变，可以将一个核苷酸调换另一个核苷酸的突变导入核苷酸序列中。特别有用的是利用具有目标插入片段超螺旋的双链DNA载体和两个包含所需突变的合成引物的方法。每条分别与载体的相对链互补的寡核苷酸引物借助Pfu DNA聚合酶在温度循环过程中延伸。纳入引物后，生成包含错列缺口的突变质粒。在温度循环后，用对于甲基化和半甲基化DNA特异性的DpnI处理产物以消化亲代DNA模板并选择包含突变的合成DNA。还可以使用本领域已知的其它方法。关于核苷酸取代的一般性描述参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression andPurification 2：95-107。
本发明还涉及一种多核苷酸，其具有编码具溶菌酶活性的多肽的核苷酸序列，优选由其组成，并且其在极低严格条件下，优选在低严格条件下，更加优选在中等严格条件下，更加优选在中等高度严格条件下，进一步优选在高度严格条件下，最优选在极高严格条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸84-782的互补链组成的多核苷酸探针杂交。
如将要被理解的，所述核苷酸序列的与杂交相关的细节和详细说明将与在标题为“具有溶菌酶活性的多肽”部分讨论的杂交方面相同或类似。
核酸构建体
本发明还涉及包含可操作性连接到一种或多种控制序列上的本发明的核苷酸序列的核酸构建体，所述控制序列在与控制序列相容的条件下于合适的宿主细胞中指导编码序列的表达。
可以用多种方式操作编码本发明的多肽的核苷酸序列以便于所述多肽的表达。取决于表达载体，在核苷酸序列插入载体之前对其进行操作可以是有利的或必需的。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域公知的。
控制序列可以是合适的启动子序列，即为了核酸序列的表达而被宿主细胞识别的一种核酸序列.启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列.启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变型、截短型或杂合型启动子，并可从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得.
在丝状真菌宿主细胞中引导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从编码下列酶的基因中获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gla A)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来源于编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的杂合型启动子)，及其突变型、截短型和杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子可获自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。Romanos等，1992，Yeast，8：423-488描述了用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子。
控制序列也可以是合适的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的一种序列。终止子序列被可操作性地连接到编码多肽的核酸序列的3’端。在所选宿主细胞中有功能的任何终止子均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子可从编码酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)或酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因中获得。Romanos等，1992，同前，描述了用于酵母宿主细胞的其它有用的终止子。
控制序列也可以是合适的前导序列，即对于宿主细胞翻译重要的mRNA的一种非翻译区。前导序列被可操作性地连接到编码多肽的核酸序列的5’端。在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列可从编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因中获得。用于酵母宿主细胞的合适的前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)中获得。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，即被可操作性地连接到核酸序列3’端的一种序列，在转录时它可被宿主细胞作为信号识别，以将聚腺苷残基加至转录的mRNA。在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列可从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因中获得。Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology15：5983-5990描述了用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基端相连接的氨基酸序列，并引导编码的多肽进入细胞的分泌途径.核苷酸序列编码序列的5’端可固有地含有信号肽编码区，该编码区与编码分泌多肽的编码区片段在翻译读框内天然连接.或者，编码序列的5’端可含有对于编码序列外源的信号肽编码区.当编码序列正常条件下不含有信号肽编码区时，可能需要外源的信号肽编码区.或者，外源信号肽编码区可简单地替换天然信号肽编码区以获得增强的多肽分泌.然而，引导表达的多肽进入所选宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区均可用于本发明.
所述信号肽编码区为SEQ ID NO：1的核苷酸84-138，其编码SEQ IDNO：2的氨基酸1-18。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)纤维素酶基因或柔毛腐质霉脂酶基因中获得的信号肽编码区。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。Romanos等人，1992，同前，描述了其它有用的信号肽编码区。
控制序列也可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基端的氨基酸序列。所产生的多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或者有时称为酶原(zymogen))。多肽原通常无活性，通过由多肽原催化或自催化地切割前肽能转化为成熟的活性多肽。
当信号肽和前肽区两者都存在于多肽的氨基端时，前肽区紧接多肽的氨基端，信号肽区紧接前肽区的氨基端。
最好加入使得多肽表达能够相对于宿主细胞的生长而被调节的调节序列。调节系统的实例是那些响应包括存在调节化合物存在的化学或物理刺激而引起基因表达被打开或关闭的调节系统。在酵母中，可使用包括ADH2系统或GAL1系统的调节系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。调节序列的其它实例是允许基因扩增的调节序列。在真核系统中，包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和有重金属时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的核酸序列常与调节序列可操作性地连接。
表达载体
本发明也涉及含有本发明的核酸构建体的重组表达载体。上述多种核苷酸和控制序列可以连接在一起产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一种或多种适宜的限制性位点，以便于编码多肽的核酸序列在这些位点的插入或置换。或者，可通过将核酸序列或含有该序列的核酸构建体插入到合适的表达载体中来表达本发明的核苷酸序列。在生成表达载体时，将编码序列定位于载体中，从而使编码序列与用于表达的适当控制序列可操作性地连接。
重组表达载体可以是能方便地对其进行重组DNA程序并能导致核酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与待引入载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或闭合环状的质粒。
载体可以是自主复制性载体，即，作为一种染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。
载体可含有保证自我复制的任何工具。或者，载体可以是这样一种载体，当被引入宿主细胞时，它整合到基因组中并与所整合的染色体一起复制。另外，可以使用单一载体或质粒或是两种或多种载体或质粒，它们一起含有被引入到宿主细胞基因组中的总DNA，或者可以是转座子。
本发明的载体优选地含有允许容易地筛选转化细胞的一种或多种选择性标记.选择性标记是这样一种基因，其产物有助于产生对杀生物剂或病毒的抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型的转变等等.
用于酵母宿主细胞的合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可以包括，但不限于：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等价物。
优选的用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选地含有这样的元件，其允许载体向宿主细胞基因组中的稳定整合或载体在细胞中不依赖于细胞基因组的自主复制。
对于向宿主细胞基因组中的整合而言，载体可依赖编码多肽的核苷酸序列，或用于通过同源或非同源重组使载体稳定地整合到基因组中的载体的任何其它元件。或者，载体可以含有用于引导通过同源重组向宿主细胞基因组中整合的附加的核苷酸序列。所述附加的核苷酸序列使载体能在染色体的精确位置整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件优选地应含有足够数量的与相应靶序列高度同源的核酸，如100-1,500个碱基对，优选地400-1,500个碱基对，最优选地800-1,500个碱基对，以增加同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制而言，载体可进一步包含使载体能在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。复制起点可以具有使其在宿主细胞内的作用成为温度敏感型的突变(见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National.Academy of Sciences USA 75：1433)。
可以将多于一个拷贝的编码本发明的多肽的核酸序列插入宿主细胞中以增强该核酸序列的表达。通过将至少核酸序列的另一个拷贝整合到宿主细胞基因组中，或者将核酸序列包含有可扩增的选择性标记基因，通过在合适的选择剂的存在下培养细胞，能筛选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而也就含有所述核酸序列的更多拷贝的细胞，由此可以获得核苷酸序列拷贝数的增加。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法为本领域的技术人员所公知(见，例如，Sambrook等，1989，同前)。
宿主细胞
本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞，其方便地用于多肽的重组产生。将含有本发明的核苷酸序列的载体引入宿主细胞，以使载体作为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体而维持在胞内。
宿主细胞可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物，或真菌细胞。并且，为了克隆的目的所述宿主细胞可以是细菌细胞，例如，大肠杆菌细胞。
在优选的实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞.在此所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK所定义的)，以及卵菌门(如Hawksworth等人，1995，同前，第171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同前)。
在一种更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽酵母(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，对于本发明的目的而言，将如Biology and Activities of Yeast Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9，1980所述定义酵母。
在一种更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia的细胞。
在一种最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁维酵母、诺地酵母或Saccharomycesoviformis细胞。在另一种最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一种最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia Lipolytica细胞。
在另一种更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人，1995，同前，所述)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝壁。营养生长是通过菌丝延伸，碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖，碳分解代谢可以是发酵的。
在一种进一步优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是但不限于：枝顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢霉属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium属或木霉属的种的细胞。
在一种最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一种最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黄色镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、网状镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肽色镰孢、拟枝孢镰孢、Fusariumsulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum细胞。在一种最优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一种最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielaviaterrestris、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉或绿色木霉多肽。
真菌细胞的转化方法包括原生质体形成、原生质体转化和以本来已知的方式进行的细胞壁再生。用于曲霉属宿主细胞转化的合适方法描述于EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National.Academy of SciencesUSA 81：1470-1474。Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述了转化镰孢属的种的合适方法.可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methodsin Enzymology，194，182-187，Academic Press，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of theNational.Academy of Sciences USA 75：1920中所述的方法转化酵母。
生产方法
本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括(a)培养菌株，其以野生型形式能产生多肽；和(b)回收该多肽。优选地该菌株属于曲霉属，更加优选地为米曲霉。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽生产的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该多肽。
在本发明的生产方法中，用本领域中已知的方法在适于多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培养细胞，这在合适的培养基中和使多肽能被表达和/或分离的条件下进行。用本领域中已知的方法，在含有碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商得到或根据公开的组成(例如，于美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。如果该多肽不被分泌，则可从细胞裂解产物中回收。
可使用本领域中已知的、对多肽特异的方法检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，如本文所述可使用酶测定法确定多肽的活性。
可以通过本领域已知的方法回收得到的多肽。例如，可以通过常规方法，包括，但不限于，离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀将多肽从营养培养基中回收出来。
本发明的多肽可通过本领域中已知的多种方法进行纯化，所述方法包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(见，例如，Protein Purification J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。
组合物
在又一方面，本发明涉及含有本发明的多肽的组合物。
所述组合物可含有本发明的多肽作为主要的酶组分，例如，单组分组合物。或者，组合物可包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、溶果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶或木聚糖酶。
组合物可按照本领域已知的方法制备，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。要包括在所述组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法进行稳定。
下面给出本发明的多肽组合物的优选用途的例子。本发明的多肽组合物的剂量和使用组合物的其它条件可以在本领域已知的方法基础之上确定。
生物膜(biofilm)
生长在生物膜中的微生物比生长在传统悬浮液培养物中的相同微生物不易受各种类型抗微生物剂影响。众所周知饥饿的细菌对多种抗微生物刺激的敏感度低的多。例如，许多经典的抗生素如青霉素，在缓慢或未分裂的细菌中作用微弱。溶菌酶由于攻击并破坏肽聚糖层而不管细菌的生长状态如何，所以保持有效。
生物膜控制；实例牙科器械水道(dental water line)：
在牙科器械水道(dental water line)中的生物膜积聚物可能包含由多种生物——举少数几例，铜绿假单胞菌(Psuedomonas aeroginosa)，奇异变形菌(Proteus mirabilis)及某种军团菌(Leigonella sp.)——构成的生物膜。还有可能由于系统的防回缩阀失灵而使通常出现在口腔中的物种得以移生。当涉及免疫受损的患者时，交叉感染的危险当然就更成为潜在的威胁，而当今时代这一类的患者数目持续稳定增加。需要对牙科器械水道中细菌生物膜积聚进行有效控制。生物膜的综述可见：Watnick P和Kolter R.(2000)Biofilm，city of microbes.JBacteriol.；182(10)：2675-9。
一种商业喉片产品的典型实例是由BOEHRINGER INGELHEIMFRANCE生产的Lysopaine。
活性成分：
杆菌肽200U.I.
(至65iu/mg)
木瓜蛋白酶2mg
至30NK/mg
溶菌酶盐酸盐5mg
至26000UFIP/mg：通过测量悬浮在缓冲液中的细胞裂解物的OD动力学测定的单位。通过裂解物诱导的悬浮在缓冲液中的细菌培养物的混浊度变化测量单位测定。
非活性成分：
糖精 赋形剂
硬脂酸镁 赋形剂
薄荷脑 香味剂
山梨醇 赋形剂
用于局限于口咽颊膜的点感染的局部治疗。注意：如果常规细菌感染的临床指征明显，考虑抗生素治疗。
牙膏：
可以单独或与其它酶甚至是抗微生物肽组合使用溶菌酶。其它酶的例子：葡萄糖氧化酶，乳过氧化物酶。
包括溶菌酶的典型牙膏组合物是″Biotene：Laclede，Inc.2030EastUniversity Drive，Rancho Domiguez，CA 90220，USA。
成分
活性成分
包含：乳过氧化物酶(100gm)
无活性成分
葡萄糖氧化酶，溶菌酶，单氟磷酸钠，山梨醇，甘油，焦磷酸钙，水合二氧化硅，Zylitol，羧甲基纤维素，香料，苯甲酸钠，β-d-葡萄糖，硫氰酸钾.
去污剂组合物
本发明的溶菌酶可以加入到并且因而成为去污剂组合物的组分，特别是在具有pH 7或更低的液体去污剂中。
本发明的去污剂组合物可以配制成手工或机器洗衣去污剂组合物，其包括适于预处理污损织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加织物软化剂组合物，也可配制成用于一般家庭硬表面清洁操作的去污剂组合物配方，或用于手工工或机器洗碗操作的配方。
在具体的方面，本发明提供包含本发明溶菌酶的去污剂添加剂。所述去污剂添加剂以及去污剂组合物可以包含一种或多种其它酶，如蛋白酶、脂酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶，和/或过氧化物酶。
一般所述酶的特性应当与选定去污剂相容，(即最优pH，与其它酶和非酶成分的相容性，等)，并且所述酶应当以有效量存在。
DNA重组(改组(shuffling))
SEQ ID NO：1的核苷酸序列可以用于DNA重组(或改组)操作。以这种操作获得的新多核苷酸序列可以编码具有提高特性的溶菌酶活性的新多肽，如提高的稳定性(贮存稳定性，热稳定性)，提高的特异性活性，提高的最优pH，和/或提高的针对特异性化合物的耐受性。
在两种或多种同源性输入多核苷酸之间的改组(起始点多核苷酸)包括片段化多核苷酸和重组片段，以获得输出多核苷酸(即已经进行过改组循环的多核苷酸)，其中许多核苷酸片段与输入多核苷酸相比得以调换。
DNA重组或改组可以是(部分地)随机过程，其中嵌合基因文库由两种或多种起始基因生成。可以使用多种已知的方案实施这种改组或重组过程。
该过程可以包括亲本DNA的随机片段化，随后通过PCR重组装成新的全长基因，例如US5605793，US5811238，US5830721，US6117679所述的。基因的体外重组可以按照例如US6159687，WO98/41623，US6159688，US5965408，US6153510所述来实施。重组过程可以在活体细胞中体内发生，例如WO 97/07205和WO 98/28416所述。
亲本DNA可以如Kikuchi等(2000a，Gene 236：159-167)所述通过DNA酶I处理或通过限制性核酸内切酶消化进行片段化。如Kikuchi等(2000b，Gene 243：133-137)所述改组两个亲本的单链亲本DNA可以实现两个亲本的改组。
一种特定的改组方法是按照在Crameri等，1998，Nature，391：288-291和Ness等，Nature Biotechnology 17：893-896中所述的方法。另一种格式为在US 6159687中所述的方法：实施例1和实施例2。
通过下列实施例对本发明作进一步描述，所述实施例不应被视为限制本发明的范围。
实施例
实施例1
从朱红栓菌中克隆GH25溶菌酶
朱红栓菌(＝朱红密孔菌)CBS114004，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌目(Polyporales)，Agricomycetidae，担子菌纲(Basidiomycetes)，担子菌门(Basidiomycota)。从板栗的死枝中分离该菌株，所述死枝由WenpingWu于2002年9月收集自中国北京怀柔县。Wenping Wu于2002年10月11日将该菌株最后鉴定为朱红栓菌。11月17日将该菌株保藏于真菌菌种保藏中心(Centraal Bureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，P.O.Box85167，3508AD Utrecht，The Netherlands)，保藏号CBS114004。
发酵和酶指纹分析：
将真菌菌株CBS114004在两种培养基中进行发酵；FG4和MEX-1培养基于25摄氏度，160rpm，6天。通过标准酶指纹识别测定对培养液测试酶活性：(培养液的酶指纹分析。
酶指纹分析：通过在广谱的酶测定法上测定培养物肉汤获得酶活性曲线。制备带有底物的96孔微量滴定(MT)板并保存于+10℃待用。准备两种不同的pH值：pH3和pH7。使用下列底物：0.05％AZCL(Mazurine带染料和交联底物，Megazyme)-直链淀粉、阿拉伯聚糖、β-葡聚糖(大麦)、酪蛋白、胶原、凝乳聚糖、葡聚糖、半乳聚糖(马铃薯)，半乳甘露聚糖(角豆Carob)，羟乙基纤维素，支链淀粉，木聚糖(燕麦)，和木葡聚糖(AZCL-酪蛋白不能在pH3使用，所以从这些板中省去)。底物的制备：pH3板：0.1g的每种AZCL底物溶于100ml 0.2M琥珀酸pH3+10μl TritonX-100(0.01％)，以得到最终浓度0.1％AZCL。pH7板：0.1g的每种AZCL底物溶于50ml无菌H20加10μl TritonX-100(0.01％)。将50ml 0.4M MOPS pH 7加入每种50ml AZCL底物中，以得到100ml的最终体积和0.2M缓冲液，0.1％AZCL的最终浓度。还包括漆酶和脂酶活性分析物，其制备如下：
漆酶：35ml含0.08mg/ml Chicago Sky Blue的0.2M磷酸/硼酸盐缓冲液，pH 9；脂酶：将2％PVA溶液与豆油3∶1混合制备聚乙烯醇(PVA)/豆油乳状液(emulation)。利用MLTRA-TURRAX乳化该油，并将12ml的乳化液与含10mM CaCl2pH 5.5的500ml 0.2M醋酸钠缓冲液和5ml 0.2％结晶紫溶液混合。利用Multidrop S20Stacker，Titertek Instruments，Inc.，Alabama制备MT板，并使用US.Sterilin 96孔MT板。将200μl的每种AZCL底物和脂酶底物以及150μl的漆酶底物分装至MT孔中并向每种底物中加入30-50μl培养液并于26摄氏度过夜孵育。在测定中取得的结果值如下：0：无活性，1：弱活性，2：强活性。在第6天收集菌丝体，此时样品显示许多不同的酶活性，并在-80度下保存待用于cDNA文库构建。
总RNA分离：
使用经过修改的Fenozol总RNA提取法(Active Mogif，Inc)。
材料：
来自Active motif的Fenozol，Cat.nr.2100
无RNA酶的eppendorf管，吸头
无RNA酶的氯仿
无RNA酶的异丙醇
无RNA酶的96％和70％乙醇
无RNA酶的3M醋酸钠pH 5，2
酚-氯仿混合物
CIA(氯仿∶异戊醇，24∶1)
将下列材料于250℃烘干12小时：
石英砂
金属勺
研钵和研棒
150ml玻璃烧杯
150ml烘干玻璃烧杯中加20ml Fenozol。在液氮下于预冷的研钵和研棒中用烘干的石英砂研磨保藏的菌丝体(-80℃)。将研磨好的材料用勺转移到烧杯中并迅速混合以便将冷冻的材料溶解形成浓悬浮液。将包含所述材料的烧杯转移到50℃水浴中15分钟。随后将所述材料转移到Oakridge管中并加入“无RNA酶”的氯仿。随后剧烈涡旋混合样品并随后让其在室温中放置10分钟。于12,000g，室温将试管离心20分钟并且随后将上层相转移到新的Oakridge管中。加入等体积的酚-氯仿混合物并且随后将样品剧烈涡旋混合样品并随后在相同条件下进行离心。将样品上层相转移到新的试管中并加入等体积的CIA，并重复振荡和离心步骤，但只离心10分钟。将水相转移到新的试管中并加入6.25ml异丙醇，混合并且随后将所述材料于室温孵育15分钟。随后将试管于12,000g，4℃离心30分钟。小心去除上清液并小心加入18ml的70％乙醇。将试管于12,000g，4℃离心5分钟并且随后去除上清液并将沉淀进行风干。将RNA沉淀物重悬于500μl DEPC(二甲基焦碳酸酯)处理的水中。于65℃加热10分钟以帮助重悬。将总RNA保存于-80℃待进一步使用。
聚腺苷酸富集的RNA产品：
使用来自Active Motif的mTrap Midi mRNA分离试剂盒(Active Motif，Europe)。按照生产商的说明书纯化聚腺苷酸富集的RNA，同时作下列改变：使用上述分离的总RNA悬浮液作为起始材料。向大约20μg总RNA中加入15ml无蛋白酶的裂解缓冲液。通过如方案中所述的柱层析洗脱mRNA级分并选择呈现0.5kb以上的级分集合进行cDNA合成。
cDNA文库的生成：
使用Smart cDNA构建试剂盒(K1051-1，BD Biosciences)，同时作如下改动：在第二链cDNA合成步骤后，根据生产商的说明书(AP Pharma)使用GFX离心柱层析纯化所述材料并将所述材料洗脱于85μl的去离子水中。在Sfil消化后，根据下列方法用溴化乙锭凝胶纯化对处理的cDNA进行大小分级：
1)制备1x TBE(溶于高压灭菌的LiChroSolv/HPLC水)缓冲液中0.8％的SeaPlaque LMP琼脂糖凝胶，胶和缓冲液中都加溴化乙锭。向来自步骤D的100μl Sfil消化液加入加样缓冲液，在干净的电泳槽中15V下将样品与加于样品两侧的DNA分子量标记一起电泳过夜。
2)在UV盒和长波UV(360nm)下，显影cDNA和DNA分子量标记。用解剖刀移除全部在500bp以下的凝胶并移除样品孔的上部。将剩余的凝胶滑到槽下并在样品孔上面倒入1.5％Seaplaque溴化乙锭琼脂糖凝胶。
3)反接电泳装置的电极并使DNA跑入1.5％琼脂糖凝胶中一小段距离。
4)在长波UV下进行标准凝胶切割和凝胶片段的GFX纯化。
根据生产商的说明书利用T4DNA连接酶(New England Biolabs，Inc)在标准的连接反应中将样品连接入载体pMHas5中.在专利申请WO2003044049中描述了pMhas5质粒和在该质粒中产生的真菌cDNA文库的使用.使用相同的方法鉴定如WO2003044049中所述来自SigA4转座子的栓菌(Trametes)GH25溶菌酶.在最初的BLAST命中中，序列SEQ ID1被鉴定为与GENESEQP：AAW85696鲁地链霉菌(Strptomycesrutgersensis)糖基水解酶GH 25和真菌序列SWISSPROT：P00721Chalaropsis sp.GH 25肽序列以及许多其它来自基因组测序产物的较少注解的链霉菌开放阅读框(天兰色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，Q9FBR0)都有高度的相似性(见同源性矩阵表1)。基于此信息，决定在米曲霉中表达栓菌GH 25候选物。
表1.
在公共数据库中发现的高分GH25水解酶的同源性表
Chalaropsis NP001276 AAW85696 Q9FBR0
Chalaropsis 100 60 32 40
NP001276 100 40 53
AAW85696 100 45
Q9FBR0 100
AAW85696，鲁地链霉菌；Q9FBR0，天兰色链霉菌；NP001276本发明的GH25；Chalaropsis(SWISSPROT：P00721)
实施例2
来自栓菌的本发明的GH25酶的表达：
使用序列号1设计自定义的寡核苷酸引物用于PCR反应以生成编码本发明插入片段，其侧翼为有利于克隆入表达载体的限制性酶位点。
引物：
引物1(Seq ID No 3)，NP1276EcoRI
5′GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3′
引物2，(Seq ID No 4)，NP1276NotI
5′-ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3′
下划线部分为加到引物上的额外DNA序列以引入用于克隆的限制性酶位点。
以下列方式由以上cDNA文库(见上面实施例1)扩增GH25溶菌酶编码序列：使用1微升的cDNA(大约10纳克的DNA)作为模板与两种引物NP1276EcoRI和NP1276NotI一起进行PCR反应。
NP1276
EcoRI：5′GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3′(SEQ IDNO：3)
NP1276
NotI：5′-ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3′(SEQ IDNO：4)
在100μl反应体积中每种引物使用10pmol。在厂商推荐的条件下使用ProofStart聚合酶(Qiagen GMBH)。在初始的于94摄氏度热处理10分钟后的条件如下：变性温度；94摄氏度-30秒，退火温度；55摄氏度-30秒，和在72摄氏度下延伸1分钟。总共运行35个循环。
在1％琼脂糖凝胶上分离PCR反应物等份。在预测的820碱基对处看到单一的明显条带。通过GFX离心层析柱(AB Phama)从凝胶中分离片段并用剪切由PCR引物引入的凸出部分的EcoRI和NotI进行消化.分离消化的片段并克隆入pXYG1051，一种基于质粒pMStr46的曲霉属表达质粒(见国际专利申请WO2003070956的实施例).具体地，通过HindIII消化和重连接(relegation)去除AMA自主复制区，形成完整的载体.在标准的连接，转化入DH10B大肠杆菌后，鉴定在LB板上氨苄青霉素选择下生长的菌落.选择10个菌落以便制备质粒DNA.利用专利申请WO2003070956中披露的pXYG1051的载体引物对得到的质粒DNA进行测序.选择其中一个没有PCR错误的克隆(NP001276-4)用于Qiagen小量质粒制备(Qiagen GMBH)。
利用选择的克隆(NP001276-4)在曲霉菌中表达所述酶(见下面)并且将包含本发明基因的EcoRI-NotI插入片段用于将所述片段亚克隆入标准细菌载体，pBlueScript KS+(StratageneInc.)，并转化入大肠杆菌菌株DH10B(来自Clontech)。此菌株于2003年12月8日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany)，保藏号DSM16084。
在曲霉菌中表达克隆NP001276：
将cDNA克隆NP001276-4转化入米曲霉菌株Jal355(在国际专利申请WO2003070956中公开)。于蔗糖作为碳源的Cove硝酸盐基础培养基平板上在选择性和非诱导性条件下将30个转化子重分离两次。为了检测NP1276的表达，将转化子在30摄氏度下于具有10ml YPM(2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％麦芽糖)的试管中生长4天。如生产商所推荐地将上清液在NuPage10％Bis-Tris SDS凝胶(Invitrogen)上电泳。当用麦芽糖诱导Plectasin的表达时曲霉菌生长良好。在大多数转化子中见到GH 25溶菌酶的预期大小的明显条带(23kDa)，而在未转化的宿主菌株米曲霉BECh2中未见到此带。选择强表达的单一曲霉菌转化子(EXP00787)进行继续研究。用具有三块隔板的20×1000ml Erlingmeyer摇瓶进行大规模摇瓶实验。每只瓶包含100毫升FG4P培养基(FG4P：3％豆粕(SFK 102-2458)，1.5％麦芽糊精(Roquette)，0.5％Pep-tone bacto(Difco 0118)，1.5％KH2PO4(Merck 4873)，0.2ml/升Pluronic PE 6100(BASF))。所用条件：30摄氏度，150RPM，生长3天。通过滤过两层微孔布miracloth收集培养液并进行冷冻待用。
实施例3.
本发明的GH25酶的纯化
纯化的描述：
将1.7升的发酵液进行细菌过滤并在SP-sepharose柱上利用50mM NaAcpH 5/50mM NaAc，1M NaCI pH 5进行纯化。将收集的级分在Amicon槽(Millipore)上以10kDa截留分子量进行浓缩。N末端氨基酸序列(EKRANPKGID)确证了纯化的蛋白质是成熟的GH25酶。
实施例4.
通过细胞壁测定法检测溶菌酶活性
将冻干的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)(Sigma)用作底物。将底物悬浮于适当pH的Britton&Robinson缓冲液中(0.08M磷酸，0.08M硼酸和0.08M醋酸；用1M NaOH调节pH至2-12)至最终浓度为0.3mg/ml。向96孔微量滴定板中的每个孔加入100μl底物悬浮液和30μl浓度为大约1mg/ml的酶溶液。加入酶之后5分钟在酶标仪中于450nm上测量浊度的变化。计算曲线的斜率并用作酶活性的相对度量。
温度曲线：将纯化的酶于40、50、60和70℃温育15min.将样品冷却至室温并用上述测定法中测量pH 5处的相对残留活性。所述酶在高达50℃都是稳定的。
表2.
温度，℃ 相对残留活性，％ 40 100 50 98 60 64 70 28
pH曲线：制备pH 4，5，6，7和8的底物悬浮液，并如上述测量酶的相对活性。所述酶在pH5上具有最优pH。
表3.
pH 相对活性，％ 4 35 5 100 6 41 7 20 8 15
生物材料的保藏
按布达佩斯条约要求将下列生物材料保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，D-38124Braunschweig，Germany)，并给予下列编号：
保藏物 编号 保藏日
大肠杆菌DH10B DSM16084 2003-12-05
按布达佩斯条约要求将下列生物材料保藏于真菌菌种保藏中心(CentralBureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，3508ADUtrecht，the Netherlands)，并给予下列编号：
保藏物 编号 保藏日
朱红栓菌 CBS114004 2003-11-17
0-1 0-1-1 表格PCT/RO/134(SAFE) 与保藏的微生物或其它生物材料有关的 声明(PCR细则第13条之二) 制备时利用 PCT-SAFE[EASY模式.版 本3.50(Build 0002.169) 0-2 国际申请号 PCR/DK2005/000099 0-3 申请人或代理人的参考卷号 10515.204-WO
1 1-1 1-2 下面列出与说明书中提及的 保藏的微生物或其它生物材 料有关的声明： 页 行 34 23 1-3 1-3-1 1-3-2 1-3-3 1-3-4 保藏鉴定 保藏机构名称 保藏机构地址 保藏日期 保藏号 DSMZ-德意志微生物保藏中心 Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，德国 2003年12月05日(05.12.2003) DSMZ16084 1-5 声明适用的指定国 全部指定 2 2-1 2-2 下面列出与说明书中提及的 保藏的微生物或其它生物材 料有关的声明： 页 行 35 06 2-3 2-3-1 2-3-2 2-3-3 2-3-4 保藏鉴定 保藏机构名称 保藏机构地址 保藏日期 保藏号 Central Bureau voor Schimmelcμltures Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，3508 AD Utrecht，荷兰 2003年11月17日(17.11.2003) CBS 114004 2-5 声明适用的指定国 全部指定
仅用于国际局
0-5 该表格为国际局接受 0-5-1 授权官员
溶菌酶存在于许多生物中，如病毒，植物，昆虫，鸟类，爬行动物和哺乳动物。在哺乳动物中，已经从鼻分泌物，唾液，眼泪，肠，尿和乳中分离出溶菌酶。该酶剪切N-乙酰基胞壁酸的1号碳和N-乙酰基-D-葡糖胺的4号碳之间的糖苷键。在体内，这两种糖聚合形成细胞壁多糖。
溶菌酶对其显示有效性的细菌包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)和单核细胞增多性李斯特杆菌(Listeria monocytogenes)。
卵清溶菌酶蛋白的溶菌作用目前用在两个市场中。
在干酪生产中，已经发现溶菌酶对于营养体型的梭菌属细菌并且特别是酪丁酸梭菌具有有效破坏性。已经发现这些细菌在用于生产干酪的奶的热处理后能够存活并且随后繁殖以引发后期气孔生成(late blowing)。后期气孔生成是在发生于干酪成熟期间丁酸发酵过程中的产气。不必要的产气(eyes)可能造成这样的影响：产生不规则形状的气孔而造成的结构缺陷；或明显令人不快的味道和气味；最后，干酪块可能完全裂开。在奶发酵中使用溶菌酶，可以进行干酪的生产和加工而不用考虑丁酸发酵引发后期气孔生成。这带来欧洲干酪生产中广泛使用溶菌酶，特别是在中度和长期成熟的干酪的制造中。推荐的剂量是0.2Ibs/1000加仑奶。由于热不稳定性，溶菌酶必须在最后的热处理之后加入，并且由于蛋白酶敏感性在粗制凝乳酶加入之前尽可能早地加入。
在药学中，溶菌酶在生物液体中的天然功能是攻击对于身体外源的细菌。许多通过任何典型途径——眼、口、鼻和伤口侵袭身体的细菌受到人免疫系统的对抗，溶菌酶是所述免疫系统的关键部分。通过生产包含这种卵清来源的蛋白质的药物片剂和胶囊已经将这种抗感染活性用于药物工业中。它还是眼药水、牙膏和喉片中的重要成分。溶菌酶的潜在用途是多样的。已经在癌症研究和兽医应用中确定了成功的结果。作为食品防腐剂，溶菌酶是许多潜在致癌物的天然、有机替代物。溶菌酶在婴儿食品应用以及动物饲料中的应用已经显示出积极的结果。这种卵清来源的酶的潜能是多样的并且对将来应用的研究和开发正在进行之中。
已经报道了一种来自Chalaropsis的GH25溶菌酶(Felsch JW，Ingagami T，and Hash JH.(1975)The N，O-Diacetylmuramidase of Chalaropsis species；VThe complete amino acid sequence.JBC.250：10pp 3713-3720)。
可以在商业市场上购得的主要产品是母鸡卵清溶菌酶，其并不剪切在例如金黄色链球菌(Streptococcus aureus)细胞壁中的N，6-O-二乙酰胞壁质酶(N，6-O-diacetylmuramidase)因而不能溶解这种重要的人类病原体及其他。
所以需要新的具有溶菌酶活性的多肽。
发明概述
本发明的发明人分离了一种编码具有溶菌酶活性的酶的真菌基因/cDNA。据我们所知编码这种酶的基因/cDNA以往未曾被描述过。
所以在第一方面本发明涉及具有溶菌酶活性并且属于GH25家族的真菌多肽。
在第二方面本发明涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
定义
在讨论本发明的详细实施方案之前，提供相对于本发明主要方面的特定术语的定义。
缩写：GicNAc，N-乙酰氨基葡萄糖；MurNAc，N-乙酰基胞壁酸
基本上纯的多肽(substantially pure polypeptide)：在本文中，术语“基本上纯的多肽”意指多肽制品，其最多包含10重量％的与它天然伴随的其它多肽物质(其它多肽物质的更低百分比是优选的，例如，最多8重量％，最多6重量％，最多5重量％，最多4重量％，最多3重量％，最多2重量％，最多1重量％，最多1/2重量％)。因而，优选所述基本上纯的多肽具有至少92％的纯度，即，所述多肽构成存在于制品中总多肽物质的重量的92％，优选更高的百分比如至少94％的纯度，至少95％的纯度，至少96％的纯度，至少97％的纯度，至少98％的纯度，至少99％的纯度，最多99.5％纯度。优选本文公开的多肽是基本上纯的形式。特别地，优选本文公开的多肽是“实质上(essentially)纯的形式”，即所述多肽制品实质上不含它所天然伴随的其它多肽物质。这可以，例如，通过公知的重组方法制备多肽而实现。这里，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”是同义的。
溶菌酶活性：术语溶菌酶活性在本文中定义为O-糖基水解酶，其催化两种或多种糖之间，或糖和非糖部分之间的糖苷键的水解。溶菌酶剪切细菌细胞壁的粘多糖和粘多肽中某些残基之间的糖苷键，导致细菌裂解。溶菌酶属于酶类别EC3.2.1.17。
同一性：在本文中，两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的同源性由参数“同一性”来描述。
为了本发明的目的，通过可用于蛋白质和DNA比对的Needleman-Wunsch比对来确定两种氨基酸序列之间的同一性程度。对于蛋白质比对来说所用的默认评分矩阵为BLOSUM50，对缺口中第一个残基的罚分为-12，而对缺口中其它残基的罚分为-2。可以用来自FASTA软件包v20u6版的Align软件进行比对(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448；andW.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTPand FASTA″，Methods in Enzymology，183：63-98)。
使用同一性矩阵为默认评分矩阵，利用与上面所述相同的算法和软件包可以确定两种核苷酸序列之间的同一性程度。对缺口中第一个残基的罚分为-16，而对缺口中的其它残基的罚分为-4。
片段：当在本文中使用时，SEQ ID NO：2的“片段”是保留氨基酸序列的溶菌酶活性，但有一个或多个氨基酸从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删除的多肽.优选地，一个片段包含SEQ ID NO：2的至多208个氨基酸残基，例如，氨基酸20-228。
基本上纯的多核苷酸：如本文所用的术语“基本上纯的多核苷酸”指这样一种多核苷酸制品，其中所述多核苷酸已经离开了其天然遗传环境，因此不含其它无关的或不需要的编码序列，并且为适于应用在遗传工程蛋白生产系统中的形式。因而，基本上纯的多核苷酸最多包含10％重量的与它天然伴随的其它多核苷酸物质(其它多核苷酸物质的更低百分比是优选的，例如，最多8重量％，最多6重量％，最多5重量％，最多4重量％，最多3重量％，最多2重量％，最多1重量％，最多1/2重量％)。不过，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选所述基本上纯的多核苷酸具有至少92％的纯度，即，所述多核苷酸构成存在于制品中总多核苷酸物质的重量的至少92％，优选更高的百分比如至少94％的纯度，至少95％的纯度，至少96％的纯度，至少97％的纯度，至少98％的纯度，至少99％的纯度，最多99.5％的纯度。优选本文公开的多核苷酸是基本上纯的形式。特别地，优选本文公开的多核苷酸是“实质上纯的形式”，即所述多核苷酸制品实质上不含与它天然伴随的其它多核苷酸物质。这可以，例如，通过公知的重组方法制备多核苷酸而实现。这里，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”是同义的。
修饰：在本发明的上下文中术语“修饰”意指由显示为SEQ ID NO：2的氨基酸1-233的氨基酸序列组成的多肽的任何化学修饰以及编码该多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是在目标氨基酸中或目标氨基酸上的氨基酸侧链的替换，取代，删除和/或插入。
人工变体：当在本文中使用时，术语“人工变体”意为具有溶菌酶活性的多肽，其由一种生物产生，所述生物表达与SEQ ID NO：1相比修饰过的基因。所述修饰过的基因当在合适的宿主中表达时由此产生所述变体，该基因是通过人类干预由SEQ ID NO：1中公开的核苷酸序列的修饰而获得的。
cDNA：当用于本文中时术语“cDNA”意在涵盖可以通过由源自真核细胞的成熟的、经过剪切的mRNA分子的反转录制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起初的初级RNA转录本是mRNA的前体并且它在变为成熟的经过剪切的mRNA之前经历一系列加工事件。这些事件包括通过称作剪切的过程来除去内含子序列。当cDNA源自mRNA时，它相应地缺少内含子序列。
核酸构建体：当用于本文时，术语“核酸构建体”意为一种核酸分子，不论是单链或双链的，其分离自天然存在的基因或者其经过修饰以天然不存在的方式包含核酸的片段。当核酸构建体包含本发明的编码序列表达所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”同义。
控制序列：术语“控制序列”在这里定义为包括任何组分，其是本发明的多肽表达所必需的或有益的。每种控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列而言可以是固有的或外源的。这些控制序列包括，但不限于，前导序列，多腺苷化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止子。至少，所述控制序列包括启动子和转录与翻译终止信号。所述控制序列具有接头用来导入有利于控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接的特定限制性位点。
可操作性连接的：术语“可操作性连接的”在本文中被定义为这样一种构型，其中将控制序列相对于DNA序列的编码序列适当地置于一个位置上从而使控制序列指导多肽的表达.
编码序列：当在本文中使用时术语“编码序列”意在涵盖核苷酸序列，其直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，其通常以ATG起始密码子开始。所述编码序列一般包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。
表达：在本文中，术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：在本文中，术语“表达载体”涵盖线性或环状的DNA分子，，其包含编码本发明多肽的片段，并且所述片段可操作性地连接到提供其转录的其它片段上。
宿主细胞：如本文所用的，术语“宿主细胞”包括任何易受核苷酸构建体转化的细胞类型。当使用细菌细胞作为宿主细胞时它不适于表达本发明的真菌多肽，不过，细菌宿主细胞可以用于克隆目的。
术语“多核苷酸探针”，“杂交”以及各种严格条件在标题为“具有溶菌酶活性的多肽”的部分进行定义。
发明详述
本发明的多肽是在筛选高度分泌的多肽的过程中从真菌，更确切从朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus，与朱红栓菌(Trametes cinnabarina)同义)中分离的，其功能已被确定。在第一个实施方案中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且属于GH25家族的真菌多肽。EC 3.2.1.17酶活性分类包括进行原核生物细胞壁的肽聚糖杂聚物中N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙酰基胞壁酸之间1，4-β-键水解的酶。一种酶可以具有一种底物特异性(例如N-乙酰基胞壁酸)而没有另一种底物特异性(在此情况下为N-乙酰基-D-葡糖胺)。
GH25家族是根据Henrissat糖基水解酶家族分类的酶的分类(Henrissat B.，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.280：309-316(1991)；Henrissat B.，BairochA.New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.293：781-788(1993)；Henrissat B.，Bairoch A.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316：695-696(1996)；Davies G.，Henrissat B.Structures and mechanisms ofglycosyl hydrolases.Structure 3：853-859(1995))。
除了GH25之外，具有溶菌酶(EC 3.2.1.17)活性的其它水解酶家族有GH22，GH23和GH24。家族GH22，或溶菌酶C包括鸡卵清溶菌酶和反刍动物的胃溶菌酶。此家族是四个家族中研究最广泛的。一般称为溶菌酶G的GH23由Goose和许多研究较少的来自基因组测序项目的噬菌体以及细菌序列所代表。GH24包括特别是噬菌体T4和其它噬菌体和细菌溶菌酶。由Seo等2003年(Seo HJ；Kitaoka M；Ohmiya K；Hayashi K.，(2003)Substratespecificity of the N，6-O-diacetylmuramidase from Streptomyces globisporus.Journal of Bioscience and Bioengineering，Vol.95(3)pp.313-316)进行的研究显示，至少对于球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)GH25酶来说，观察到与鸡卵清溶菌酶GH22相比不同的活性谱.该链霉菌的酶具有N-乙酰胞壁质酶和N，6-O-二乙酰胞壁质酶活性.这使得球孢链霉菌酶能够降解高度乙酰化的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁。这种活性可以外推到该家族中的其它溶菌酶，如本发明的溶菌酶GH25。
在另外的实施方案中本发明涉及这样的多肽，其中所述包含与SEQ IDNO：2的氨基酸1-233具有至少65％，优选至少70％，例如至少75％，更加优选至少80％，如至少85％，还要更加优选至少90％，最优选至少95％，例如至少96％，如至少97％，还要最优选至少98％，如至少99％的同一性程度的氨基酸序列，优选由所述氨基酸序列组成(下文中称为″同源性多肽″)。在一个令人感兴趣的实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233至多有十个氨基酸(例如十个氨基酸)不同，特别是至少五个氨基酸(例如五个氨基酸)，如至多四个氨基酸(例如四个氨基酸)，例如至多三个氨基酸(例如三个氨基酸)不同。在一个特别令人感兴趣的实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233至多有两个氨基酸(例如两个氨基酸)，如一个氨基酸不同。
优选地，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；其等位变体；或其具有溶菌酶活性的片段。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-233。在另外的实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸1-233组成。
本发明的多肽可以是由天然来源鉴定和分离的野生型溶菌酶。这些野生型多肽可以例如通过生物信息学方法进行具体鉴定，所述方法是一种能够用来鉴定溶菌酶候选物的方法。简言之GH25溶菌酶候选物可以通过利用GH25家族的已知溶菌酶作为搜索序列在基因组或cDNA测序项目中直接进行鉴定。另一种方法是利用一种标准的同源性搜索程序如WU-BlastX(2.0a19MP-WashU)比较所有的独特DNA片段(重叠群)。
另外，可以通过如在J.E.Ness等，Nature Biotechnology 17，893-896(1999)中所述的DNA改组技术制备本发明的多肽。而且，本发明的多肽可以是一种人工变体，其包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233相比具有氨基酸的至少一个取代，删除和/或插入的氨基酸序列，或优选由其组成。这些人工变体可以通过本领域已知的标准技术进行构建，如通过包含显示为SEQ IDNO：2的氨基酸1-233的多肽的定点/随机诱变。在本发明的一个实施方案中，氨基酸变化(在人工变体以及在野生型多肽中)是微小的，这些变化有：保守性氨基酸取代，并不显著影响蛋白质的折叠和或活性；小的删除，一般是1个到大约30个氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延长，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；长达大约20-25个残基的小的连接肽；或小的延伸，其通过改变静电或另一种功能而有利于纯化，如多组氨酸区(polyhistidinetract)，抗原性表位或结合结构域。
保守性取代的实例是在各组氨基酸：碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸)之内发生取代。一般不改变特定活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如，H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，TheProteins，Academic Press，New York所描述。最常发生的互换是Ala/Ser，Val/lle，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly以及这些的反向互换。
在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，所述氨基酸变化使多肽的物理-化学特性得以改变.例如，可以进行提高多肽的热稳定性、改变底物特异性改变最适pH值等等的氨基酸改变.
优选地，与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233相比，这些取代、删除和/或插入的数目为至多10个，例如至多9个，如至多8个，更加优选至多7个，例如至多6个，如至多5个，最优选至多4个，例如至多3个，如至多2个，特别是至多1个。
在另一个实施方案中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，其由在极低严格条件下，优选在低严格条件下，更加优选在中等严格条件下，更加优选在中等高度严格条件下，进一步优选在高度严格条件下，最优选在极高严格条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸84-782的互补链组成的多核苷酸探针杂交的核苷酸序列所编码(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold SpringHarbor，New York)。
SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其子序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可以用来设计多核苷酸探针以便根据本领域公知的方法由不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有溶菌酶活性的多肽的DNA。特别地，这些探针可以用来根据标准的Southern印迹操作与目标属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可以比完整序列短得多，但长度应当为至少15，优选至少25，更加优选至少35个核苷酸，如至少70个核苷酸长。不过，优选所述多核苷酸探针至少100个核苷酸长。例如，所述多核苷酸探针可以至少200个核苷酸长，至少300个核苷酸长，至少400个核苷酸长或至少500个核苷酸长。甚至可以使用更长的探针，例如，至少600个核苷酸长，至少700个核苷酸长，至少800个核苷酸长，或至少900个核苷酸长的多核苷酸探针。可以使用DNA和RNA探针。一般对探针进行标记以便检测相应的基因(例如，用32p，3H，35S，生物素，或抗生物素蛋白)。
由此，可以从制备自这些其它生物的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并编码具有溶菌酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术来从这些其它生物中分离基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定于硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1同源的克隆或DNA，将具有固定DNA的载体材料用于Southern印迹中。
为了本发明的目的，“杂交”表明所述核苷酸序列在极低到极高严格条件下与标记的多核苷酸序列杂交，该标记的多核苷酸序列与SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列杂交。利用X射线胶片或通过本领域已知的其它方法可以检测在这些条件下与所述多核苷酸探针杂交的分子。无论何时术语“多核苷酸探针”用于本文，应当理解这种探针包含至少15个核苷酸。
在另一个令人感兴趣的实施方案中，所述多核苷酸探针是编码SEQ IDNO：2的多肽的核苷酸序列的互补链。在另一个令人感兴趣的实施方案中，所述多核苷酸探针是SEQ ID NO：1的互补链。在另一个令人感兴趣的实施方案中，所述多核苷酸探针是SEQ ID NO：1的成熟肽编码区的互补链。
对于至少100个核苷酸长的长探针，极低到极高严格条件被定义为按照标准的Southern印迹操作，在42℃于5X SSPE，1.0％SDS，5X Denhardt′s溶液，100μg/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA中进行预杂交和杂交。优选地，至少100个核苷酸长的长探针包含不超过1000个核苷酸。对于至少100个核苷酸长的长探针，最后用2x SSC，0.1％SDS于42℃(极低严格)将载体材料洗涤三次每次15分钟，优选地用0.5x SSC，0.1％SDS于42℃(低严格)洗涤三次每次15分钟，更加优选地用0.2x SSC，0.1％SDS于42℃(中等严格)洗涤三次每次15分钟，进一步优选地用0.2x SSC，0.1％SDS于55℃(中高度严格)洗涤三次每次15分钟，最优选地用0.1x SSC，0.1％SDS于60℃(高度严格)洗涤三次每次15分钟，特别地用0.1x SSC，0.1％SDS于68℃(极高严格)洗涤三次每次15分钟。
尽管不是特别优选地，预期也可以使用较短的探针，例如从大约15到99个核苷酸长的探针，如从大约15到大约70个核苷酸长。对于这些短探针，严格条件被定义为，于0.9M NaCl，0.09M Tris-HCI pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mMATP，和0.2mg酵母RNA每ml中，在比根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)的计算法计算的Tm低5℃到10℃的温度下，按照标准的Southern印迹操作进行预杂交、杂交和洗涤杂交后产物。
溶菌酶活性
对于溶菌酶活性的测定已经描述了几种测定法。在J.Biochem.(H.Maeda，1980，vol.88(4)：1185-1191)中描述的一种测定法是基于利用荧光素标记的肽聚糖作为底物的荧光极化作用或荧光强度，所述荧光素标记的肽聚糖获自溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)。
另一种测定法是基于在450nm处监测由溶菌酶造成的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)悬液的澄清，并与已知活性的溶菌酶标准相比较。这种测定法是在FIP Center for Standards，International Commission onPharmaceutical Enzymes，Harelbekestaat 72，B-9000gent，Belgium中开发出来的。这种测定法需要使用冻干的存活藤黄微球菌ATCC 4698细胞。这种底物以及详细的方案可以由上述Center for Standards获得。
另一种测定法，Lysozyme Assay Kit(E-22013)，可由MolecularProbes获得，并且是基于对标记以荧光素的溶壁微球菌细胞壁的溶菌酶活性的测量。
具有溶菌酶活性的多肽的来源
本发明的多肽是真菌多肽。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)，壶菌门(Chytridiomycota)，和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等于Ainsworth and Bisby’s Dictionaryof The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义的)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，同前，第171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同前)。
在具体的实施方案中，所述真菌多肽是酵母多肽。在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽酵母(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，为了本发明的目的，酵母的定义将如Biology and Activities of Yeast，Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9，1980所述。
在特定实施方案中的酵母多肽为假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽.在一个令人感兴趣的实施方案中，所述多肽是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis的多肽。
在另一种特定实施方案中，本发明的真菌多肽是丝状真菌多肽如枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮霉属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)的多肽。
在另一个令人感兴趣的实施方案中，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黄色镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、网状镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肽色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicolainsolens、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、严紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。
将会理解的是对于前述物种，本发明包括完全和不完全的状态，以及其它分类学上的等价物，例如无性型，不管其种名如何。本领域的技术人员将方便地认识到合适的等价物的同一性。
公众可以方便地从多个培养物保藏中心，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究机构保藏中心(NRRL)处获得这些物种的菌株。
此外，可以使用上述探针从其它来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物中鉴定并获得这些多肽.从自然生境分离微生物的技术在本领域中众所周知.然后类似地通过筛选另一种微生物的基因组文库或cDNA文库可得到核苷酸序列.一旦用探针检测到编码该多肽的核酸序列，可使用本领域普通技术人员所知的技术分离或克隆该序列(见，例如，Sambrook等人，1989，同前).
由本发明的核苷酸序列编码的多肽也包括融合多肽或可切开的融合多肽，其中另一种多肽在该多肽或其片段的N端或C端与之融合。融合多肽是通过将编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)相融合而产生的。产生融合多肽的技术在本领域中已知，包括连接编码多肽的编码序列，使得它们共阅读框，并使融合多肽的表达位于相同启动子和终止子的控制之下。
多核苷酸和核苷酸序列
本发明还涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。特别地，本发明涉及由编码本发明的多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸。在具体的实施方案中，所述核苷酸序列在SEQ ID NO：1中给出。在更加具体的实施方案中，核苷酸序列139-724是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。
本发明还包括具有编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽组成的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，优选由其组成，所述多核苷酸基于遗传密码的简并性与SEQ ID NO：1区别。
本发明还涉及具有编码具溶菌酶活性的SEQ ID NO：2片段的SEQ IDNO：1的子序列的多核苷酸，优选由其组成。SEQ ID NO：1的子序列是SEQID NO：1所包括的核苷酸序列，除了从5’和/或3’端已删去了一个或多个核苷酸。
本发明还涉及具有在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个修饰的经修饰的核苷酸序列的多核苷酸，优选由其组成，其中所述经修饰的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的氨基酸19-233。
用于分离或克隆编码一种多肽的核酸序列的技术在本领域众所周知，包括从基因组DNA的分离、从cDNA的制备或其组合。例如，通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或表达库的抗体筛选来检测具有共同结构特征的克隆DNA片段，能从这种基因组DNA中克隆本发明的核酸序列。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，AcademicPress，New York。可以应用其它核酸扩增方法如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。可从曲霉株或另一种或相关生物中克隆核酸序列，因而，该核酸序列可以是例如该核酸序列多肽编码区的等位变体或种间变体。
可通过基因工程中使用的标准克隆方法获得核苷酸序列，以便将该核苷酸序列从其天然位置再定位到另外的位点，在此位点上该序列将被复制。克隆方法可包括包含编码该多肽的核苷酸序列的期望片段的切割和分离、该片段向载体分子中的插入，以及重组载体向宿主细胞中的掺入，在宿主细胞中该核酸序列的多拷贝或克隆将被复制。该核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成的来源或其任意组合。
本发明还涉及多核苷酸，其具有与SEQID NO：1的核苷酸84-782有至少65％同一性的核苷酸序列，优选由其组成。优选地，所述核苷酸序列与SEQID NO：1的核苷酸84-782有至少70％同一性，例如，至少80％同一性，如至少90％同一性，更加优选至少95％同一性，如至少96％同一性，例如至少97％同一性，还要更加优选至少98％同一性，如至少99％同一性。特别地，所述核苷酸序列编码具有溶菌酶活性的多肽。如先前所述的那样来测定两种核苷酸序列之间的同一性程度(见标题为“定义”的部分)。
编码本发明的多肽的核苷酸序列的修饰对于多肽的合成可能是必需的，所述多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1-233相比具有至少一个置换、删除和/或插入的氨基酸序列。这些人工变体可能以工程改造的方式有别于分离自其天然来源的多肽，例如，在比活性、热稳定性、最适pH等等方面有所区别的变体。
对本领域的技术人员而言显然这种修饰能在分子功能的关键区之外进行，而仍产生活性多肽。为本发明的分离核酸序列所编码的多肽的活性所必需，因此优选地不予修饰的氨基酸残基，可根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸分区诱变(见，例如，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1080-1085)来鉴定。在后一种方法中，在分子中每一带正电荷的残基处均引入突变，测定产生的突变分子的溶菌酶活性(如实施例所示)以鉴定对于分子活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能通过三维结构分析来确定，三维结构由核磁共振分析、晶体学或光亲和标记(见，例如，de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)来确定。
另外，通过导入核苷酸取代可以修饰编码本发明多肽的核苷酸序列，所述取代不会产生由核苷酸序列编码的多肽的另一种氨基酸序列，但是其对应于宿主生物产生酶所偏好的密码子用法。
通过利用本领域已知的任何方法进行定点诱变，可以将一个核苷酸调换另一个核苷酸的突变导入核苷酸序列中。特别有用的是利用具有目标插入片段超螺旋的双链DNA载体和两个包含所需突变的合成引物的方法。每条分别与载体的相对链互补的寡核苷酸引物借助Pfu DNA聚合酶在温度循环过程中延伸。纳入引物后，生成包含错列缺口的突变质粒。在温度循环后，用对于甲基化和半甲基化DNA特异性的DpnI处理产物以消化亲代DNA模板并选择包含突变的合成DNA。还可以使用本领域已知的其它方法。关于核苷酸取代的一般性描述参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression andPurification 2：95-107。
本发明还涉及一种多核苷酸，其具有编码具溶菌酶活性的多肽的核苷酸序列，优选由其组成，并且其在极低严格条件下，优选在低严格条件下，更加优选在中等严格条件下，更加优选在中等高度严格条件下，进一步优选在高度严格条件下，最优选在极高严格条件下与由SEQ ID NO：1的核苷酸84-782的互补链组成的多核苷酸探针杂交。
如将要被理解的，所述核苷酸序列的与杂交相关的细节和详细说明将与在标题为“具有溶菌酶活性的多肽”部分讨论的杂交方面相同或类似。
核酸构建体
本发明还涉及包含可操作性连接到一种或多种控制序列上的本发明的核苷酸序列的核酸构建体，所述控制序列在与控制序列相容的条件下于合适的宿主细胞中指导编码序列的表达。
可以用多种方式操作编码本发明的多肽的核苷酸序列以便于所述多肽的表达。取决于表达载体，在核苷酸序列插入载体之前对其进行操作可以是有利的或必需的。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域公知的。
控制序列可以是合适的启动子序列，即为了核酸序列的表达而被宿主细胞识别的一种核酸序列.启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列.启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变型、截短型或杂合型启动子，并可从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得.
在丝状真菌宿主细胞中引导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从编码下列酶的基因中获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gla A)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来源于编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的杂合型启动子)，及其突变型、截短型和杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子可获自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。Romanos等，1992，Yeast，8：423-488描述了用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子。
控制序列也可以是合适的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的一种序列。终止子序列被可操作性地连接到编码多肽的核酸序列的3’端。在所选宿主细胞中有功能的任何终止子均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子可从编码酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)或酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因中获得。Romanos等，1992，同前，描述了用于酵母宿主细胞的其它有用的终止子。
控制序列也可以是合适的前导序列，即对于宿主细胞翻译重要的mRNA的一种非翻译区。前导序列被可操作性地连接到编码多肽的核酸序列的5’端。在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列可从编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因中获得。用于酵母宿主细胞的合适的前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)中获得。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，即被可操作性地连接到核酸序列3’端的一种序列，在转录时它可被宿主细胞作为信号识别，以将聚腺苷残基加至转录的mRNA。在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列可从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因中获得。Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology15：5983-5990描述了用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基端相连接的氨基酸序列，并引导编码的多肽进入细胞的分泌途径.核苷酸序列编码序列的5’端可固有地含有信号肽编码区，该编码区与编码分泌多肽的编码区片段在翻译读框内天然连接.或者，编码序列的5’端可含有对于编码序列外源的信号肽编码区.当编码序列正常条件下不含有信号肽编码区时，可能需要外源的信号肽编码区.或者，外源信号肽编码区可简单地替换天然信号肽编码区以获得增强的多肽分泌.然而，引导表达的多肽进入所选宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区均可用于本发明.
所述信号肽编码区为SEQ ID NO：1的核苷酸84-138，其编码SEQ IDNO：2的氨基酸1-18。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)纤维素酶基因或柔毛腐质霉脂酶基因中获得的信号肽编码区。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。Romanos等人，1992，同前，描述了其它有用的信号肽编码区。
控制序列也可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基端的氨基酸序列。所产生的多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或者有时称为酶原(zymogen))。多肽原通常无活性，通过由多肽原催化或自催化地切割前肽能转化为成熟的活性多肽。
当信号肽和前肽区两者都存在于多肽的氨基端时，前肽区紧接多肽的氨基端，信号肽区紧接前肽区的氨基端。
最好加入使得多肽表达能够相对于宿主细胞的生长而被调节的调节序列。调节系统的实例是那些响应包括存在调节化合物存在的化学或物理刺激而引起基因表达被打开或关闭的调节系统。在酵母中，可使用包括ADH2系统或GAL1系统的调节系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。调节序列的其它实例是允许基因扩增的调节序列。在真核系统中，包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和有重金属时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的核酸序列常与调节序列可操作性地连接。
表达载体
本发明也涉及含有本发明的核酸构建体的重组表达载体。上述多种核苷酸和控制序列可以连接在一起产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一种或多种适宜的限制性位点，以便于编码多肽的核酸序列在这些位点的插入或置换。或者，可通过将核酸序列或含有该序列的核酸构建体插入到合适的表达载体中来表达本发明的核苷酸序列。在生成表达载体时，将编码序列定位于载体中，从而使编码序列与用于表达的适当控制序列可操作性地连接。
重组表达载体可以是能方便地对其进行重组DNA程序并能导致核酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与待引入载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或闭合环状的质粒。
载体可以是自主复制性载体，即，作为一种染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。
载体可含有保证自我复制的任何工具。或者，载体可以是这样一种载体，当被引入宿主细胞时，它整合到基因组中并与所整合的染色体一起复制。另外，可以使用单一载体或质粒或是两种或多种载体或质粒，它们一起含有被引入到宿主细胞基因组中的总DNA，或者可以是转座子。
本发明的载体优选地含有允许容易地筛选转化细胞的一种或多种选择性标记.选择性标记是这样一种基因，其产物有助于产生对杀生物剂或病毒的抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型的转变等等.
用于酵母宿主细胞的合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可以包括，但不限于：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等价物。
优选的用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选地含有这样的元件，其允许载体向宿主细胞基因组中的稳定整合或载体在细胞中不依赖于细胞基因组的自主复制。
对于向宿主细胞基因组中的整合而言，载体可依赖编码多肽的核苷酸序列，或用于通过同源或非同源重组使载体稳定地整合到基因组中的载体的任何其它元件。或者，载体可以含有用于引导通过同源重组向宿主细胞基因组中整合的附加的核苷酸序列。所述附加的核苷酸序列使载体能在染色体的精确位置整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件优选地应含有足够数量的与相应靶序列高度同源的核酸，如100-1,500个碱基对，优选地400-1,500个碱基对，最优选地800-1,500个碱基对，以增加同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制而言，载体可进一步包含使载体能在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。复制起点可以具有使其在宿主细胞内的作用成为温度敏感型的突变(见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National.Academy of Sciences USA 75：1433)。
可以将多于一个拷贝的编码本发明的多肽的核酸序列插入宿主细胞中以增强该核酸序列的表达。通过将至少核酸序列的另一个拷贝整合到宿主细胞基因组中，或者将核酸序列包含有可扩增的选择性标记基因，通过在合适的选择剂的存在下培养细胞，能筛选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而也就含有所述核酸序列的更多拷贝的细胞，由此可以获得核苷酸序列拷贝数的增加。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法为本领域的技术人员所公知(见，例如，Sambrook等，1989，同前)。
宿主细胞
本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞，其方便地用于多肽的重组产生。将含有本发明的核苷酸序列的载体引入宿主细胞，以使载体作为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体而维持在胞内。
宿主细胞可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物，或真菌细胞。并且，为了克隆的目的所述宿主细胞可以是细菌细胞，例如，大肠杆菌细胞。
在优选的实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞.在此所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK所定义的)，以及卵菌门(如Hawksworth等人，1995，同前，第171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同前)。
在一种更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽酵母(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，对于本发明的目的而言，将如Biology and Activities of Yeast Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9，1980所述定义酵母。
在一种更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia的细胞。
在一种最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁维酵母、诺地酵母或Saccharomycesoviformis细胞。在另一种最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一种最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia Lipolytica细胞。
在另一种更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人，1995，同前，所述)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝壁。营养生长是通过菌丝延伸，碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖，碳分解代谢可以是发酵的。
在一种进一步优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是但不限于：枝顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢霉属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium属或木霉属的种的细胞。
在一种最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一种最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黄色镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、网状镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肽色镰孢、拟枝孢镰孢、Fusariumsulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum细胞。在一种最优选的实施方案中，丝状真菌亲代细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一种最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielaviaterrestris、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉或绿色木霉多肽。
真菌细胞的转化方法包括原生质体形成、原生质体转化和以本来已知的方式进行的细胞壁再生。用于曲霉属宿主细胞转化的合适方法描述于EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National.Academy of SciencesUSA 81：1470-1474。Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述了转化镰孢属的种的合适方法.可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methodsin Enzymology，194，182-187，Academic Press，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of theNational.Academy of Sciences USA 75：1920中所述的方法转化酵母。
生产方法
本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括(a)培养菌株，其以野生型形式能产生多肽；和(b)回收该多肽。优选地该菌株属于曲霉属，更加优选地为米曲霉。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽生产的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该多肽。
在本发明的生产方法中，用本领域中已知的方法在适于多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培养细胞，这在合适的培养基中和使多肽能被表达和/或分离的条件下进行。用本领域中已知的方法，在含有碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商得到或根据公开的组成(例如，于美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。如果该多肽不被分泌，则可从细胞裂解产物中回收。
可使用本领域中已知的、对多肽特异的方法检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，如本文所述可使用酶测定法确定多肽的活性。
可以通过本领域已知的方法回收得到的多肽。例如，可以通过常规方法，包括，但不限于，离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀将多肽从营养培养基中回收出来。
本发明的多肽可通过本领域中已知的多种方法进行纯化，所述方法包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(见，例如，Protein Purification J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。
组合物
在又一方面，本发明涉及含有本发明的多肽的组合物。
所述组合物可含有本发明的多肽作为主要的酶组分，例如，单组分组合物。或者，组合物可包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、溶果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶或木聚糖酶。
组合物可按照本领域已知的方法制备，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。要包括在所述组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法进行稳定。
下面给出本发明的多肽组合物的优选用途的例子。本发明的多肽组合物的剂量和使用组合物的其它条件可以在本领域已知的方法基础之上确定。
生物膜(biofilm)
生长在生物膜中的微生物比生长在传统悬浮液培养物中的相同微生物不易受各种类型抗微生物剂影响。众所周知饥饿的细菌对多种抗微生物刺激的敏感度低的多。例如，许多经典的抗生素如青霉素，在缓慢或未分裂的细菌中作用微弱。溶菌酶由于攻击并破坏肽聚糖层而不管细菌的生长状态如何，所以保持有效。
生物膜控制；实例牙科器械水道(dental water line)：
在牙科器械水道(dental water line)中的生物膜积聚物可能包含由多种生物——举少数几例，铜绿假单胞菌(Psuedomonas aeroginosa)，奇异变形菌(Proteus mirabilis)及某种军团菌(Leigonella sp.)——构成的生物膜。还有可能由于系统的防回缩阀失灵而使通常出现在口腔中的物种得以移生。当涉及免疫受损的患者时，交叉感染的危险当然就更成为潜在的威胁，而当今时代这一类的患者数目持续稳定增加。需要对牙科器械水道中细菌生物膜积聚进行有效控制。生物膜的综述可见：Watnick P和Kolter R.(2000)Biofilm，city of microbes.JBacteriol.；182(10)：2675-9。
一种商业喉片产品的典型实例是由BOEHRINGER INGELHEIMFRANCE生产的Lysopaine。
活性成分：
杆菌肽200U.I.
(至65iu/mg)
木瓜蛋白酶2mg
至30NK/mg
溶菌酶盐酸盐5mg
至26000UFIP/mg：通过测量悬浮在缓冲液中的细胞裂解物的OD动力学测定的单位。通过裂解物诱导的悬浮在缓冲液中的细菌培养物的混浊度变化测量单位测定。
非活性成分：
糖精 赋形剂
硬脂酸镁 赋形剂
薄荷脑 香味剂
山梨醇 赋形剂
用于局限于口咽颊膜的点感染的局部治疗。注意：如果常规细菌感染的临床指征明显，考虑抗生素治疗。
牙膏：
可以单独或与其它酶甚至是抗微生物肽组合使用溶菌酶。其它酶的例子：葡萄糖氧化酶，乳过氧化物酶。
包括溶菌酶的典型牙膏组合物是″Biotene：Laclede，Inc.2030EastUniversity Drive，Rancho Domiguez，CA 90220，USA。
成分
活性成分
包含：乳过氧化物酶(100gm)
无活性成分
葡萄糖氧化酶，溶菌酶，单氟磷酸钠，山梨醇，甘油，焦磷酸钙，水合二氧化硅，Zylitol，羧甲基纤维素，香料，苯甲酸钠，β-d-葡萄糖，硫氰酸钾.
去污剂组合物
本发明的溶菌酶可以加入到并且因而成为去污剂组合物的组分，特别是在具有pH 7或更低的液体去污剂中。
本发明的去污剂组合物可以配制成手工或机器洗衣去污剂组合物，其包括适于预处理污损织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加织物软化剂组合物，也可配制成用于一般家庭硬表面清洁操作的去污剂组合物配方，或用于手工工或机器洗碗操作的配方。
在具体的方面，本发明提供包含本发明溶菌酶的去污剂添加剂。所述去污剂添加剂以及去污剂组合物可以包含一种或多种其它酶，如蛋白酶、脂酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶，和/或过氧化物酶。
一般所述酶的特性应当与选定去污剂相容，(即最优pH，与其它酶和非酶成分的相容性，等)，并且所述酶应当以有效量存在。
DNA重组(改组(shuffling))
SEQ ID NO：1的核苷酸序列可以用于DNA重组(或改组)操作。以这种操作获得的新多核苷酸序列可以编码具有提高特性的溶菌酶活性的新多肽，如提高的稳定性(贮存稳定性，热稳定性)，提高的特异性活性，提高的最优pH，和/或提高的针对特异性化合物的耐受性。
在两种或多种同源性输入多核苷酸之间的改组(起始点多核苷酸)包括片段化多核苷酸和重组片段，以获得输出多核苷酸(即已经进行过改组循环的多核苷酸)，其中许多核苷酸片段与输入多核苷酸相比得以调换。
DNA重组或改组可以是(部分地)随机过程，其中嵌合基因文库由两种或多种起始基因生成。可以使用多种已知的方案实施这种改组或重组过程。
该过程可以包括亲本DNA的随机片段化，随后通过PCR重组装成新的全长基因，例如US5605793，US5811238，US5830721，US6117679所述的。基因的体外重组可以按照例如US6159687，WO98/41623，US6159688，US5965408，US6153510所述来实施。重组过程可以在活体细胞中体内发生，例如WO 97/07205和WO 98/28416所述。
亲本DNA可以如Kikuchi等(2000a，Gene 236：159-167)所述通过DNA酶I处理或通过限制性核酸内切酶消化进行片段化。如Kikuchi等(2000b，Gene 243：133-137)所述改组两个亲本的单链亲本DNA可以实现两个亲本的改组。
一种特定的改组方法是按照在Crameri等，1998，Nature，391：288-291和Ness等，Nature Biotechnology 17：893-896中所述的方法。另一种格式为在US 6159687中所述的方法：实施例1和实施例2。
通过下列实施例对本发明作进一步描述，所述实施例不应被视为限制本发明的范围。
实施例
实施例1
从朱红栓菌中克隆GH25溶菌酶
朱红栓菌(＝朱红密孔菌)CBS114004，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌目(Polyporales)，Agricomycetidae，担子菌纲(Basidiomycetes)，担子菌门(Basidiomycota)。从板栗的死枝中分离该菌株，所述死枝由WenpingWu于2002年9月收集自中国北京怀柔县。Wenping Wu于2002年10月11日将该菌株最后鉴定为朱红栓菌。11月17日将该菌株保藏于真菌菌种保藏中心(Centraal Bureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，P.O.Box85167，3508AD Utrecht，The Netherlands)，保藏号CBS114004。
发酵和酶指纹分析：
将真菌菌株CBS114004在两种培养基中进行发酵；FG4和MEX-1培养基于25摄氏度，160rpm，6天。通过标准酶指纹识别测定对培养液测试酶活性：(培养液的酶指纹分析。
酶指纹分析：通过在广谱的酶测定法上测定培养物肉汤获得酶活性曲线。制备带有底物的96孔微量滴定(MT)板并保存于+10℃待用。准备两种不同的pH值：pH3和pH7。使用下列底物：0.05％AZCL(Mazurine带染料和交联底物，Megazyme)-直链淀粉、阿拉伯聚糖、β-葡聚糖(大麦)、酪蛋白、胶原、凝乳聚糖、葡聚糖、半乳聚糖(马铃薯)，半乳甘露聚糖(角豆Carob)，羟乙基纤维素，支链淀粉，木聚糖(燕麦)，和木葡聚糖(AZCL-酪蛋白不能在pH3使用，所以从这些板中省去)。底物的制备：pH3板：0.1g的每种AZCL底物溶于100ml 0.2M琥珀酸pH3+10μl TritonX-100(0.01％)，以得到最终浓度0.1％AZCL。pH7板：0.1g的每种AZCL底物溶于50ml无菌H20加10μl TritonX-100(0.01％)。将50ml 0.4M MOPS pH 7加入每种50ml AZCL底物中，以得到100ml的最终体积和0.2M缓冲液，0.1％AZCL的最终浓度。还包括漆酶和脂酶活性分析物，其制备如下：
漆酶：35ml含0.08mg/ml Chicago Sky Blue的0.2M磷酸/硼酸盐缓冲液，pH 9；脂酶：将2％PVA溶液与豆油3∶1混合制备聚乙烯醇(PVA)/豆油乳状液(emulation)。利用MLTRA-TURRAX乳化该油，并将12ml的乳化液与含10mM CaCl2pH 5.5的500ml 0.2M醋酸钠缓冲液和5ml 0.2％结晶紫溶液混合。利用Multidrop S20Stacker，Titertek Instruments，Inc.，Alabama制备MT板，并使用US.Sterilin 96孔MT板。将200μl的每种AZCL底物和脂酶底物以及150μl的漆酶底物分装至MT孔中并向每种底物中加入30-50μl培养液并于26摄氏度过夜孵育。在测定中取得的结果值如下：0：无活性，1：弱活性，2：强活性。在第6天收集菌丝体，此时样品显示许多不同的酶活性，并在-80度下保存待用于cDNA文库构建。
总RNA分离：
使用经过修改的Fenozol总RNA提取法(Active Mogif，Inc)。
材料：
来自Active motif的Fenozol，Cat.nr.2100
无RNA酶的eppendorf管，吸头
无RNA酶的氯仿
无RNA酶的异丙醇
无RNA酶的96％和70％乙醇
无RNA酶的3M醋酸钠pH 5，2
酚-氯仿混合物
CIA(氯仿∶异戊醇，24∶1)
将下列材料于250℃烘干12小时：
石英砂
金属勺
研钵和研棒
150ml玻璃烧杯
150ml烘干玻璃烧杯中加20ml Fenozol。在液氮下于预冷的研钵和研棒中用烘干的石英砂研磨保藏的菌丝体(-80℃)。将研磨好的材料用勺转移到烧杯中并迅速混合以便将冷冻的材料溶解形成浓悬浮液。将包含所述材料的烧杯转移到50℃水浴中15分钟。随后将所述材料转移到Oakridge管中并加入“无RNA酶”的氯仿。随后剧烈涡旋混合样品并随后让其在室温中放置10分钟。于12,000g，室温将试管离心20分钟并且随后将上层相转移到新的Oakridge管中。加入等体积的酚-氯仿混合物并且随后将样品剧烈涡旋混合样品并随后在相同条件下进行离心。将样品上层相转移到新的试管中并加入等体积的CIA，并重复振荡和离心步骤，但只离心10分钟。将水相转移到新的试管中并加入6.25ml异丙醇，混合并且随后将所述材料于室温孵育15分钟。随后将试管于12,000g，4℃离心30分钟。小心去除上清液并小心加入18ml的70％乙醇。将试管于12,000g，4℃离心5分钟并且随后去除上清液并将沉淀进行风干。将RNA沉淀物重悬于500μl DEPC(二甲基焦碳酸酯)处理的水中。于65℃加热10分钟以帮助重悬。将总RNA保存于-80℃待进一步使用。
聚腺苷酸富集的RNA产品：
使用来自Active Motif的mTrap Midi mRNA分离试剂盒(Active Motif，Europe)。按照生产商的说明书纯化聚腺苷酸富集的RNA，同时作下列改变：使用上述分离的总RNA悬浮液作为起始材料。向大约20μg总RNA中加入15ml无蛋白酶的裂解缓冲液。通过如方案中所述的柱层析洗脱mRNA级分并选择呈现0.5kb以上的级分集合进行cDNA合成。
cDNA文库的生成：
使用Smart cDNA构建试剂盒(K1051-1，BD Biosciences)，同时作如下改动：在第二链cDNA合成步骤后，根据生产商的说明书(AP Pharma)使用GFX离心柱层析纯化所述材料并将所述材料洗脱于85μl的去离子水中。在Sfil消化后，根据下列方法用溴化乙锭凝胶纯化对处理的cDNA进行大小分级：
1)制备1x TBE(溶于高压灭菌的LiChroSolv/HPLC水)缓冲液中0.8％的SeaPlaque LMP琼脂糖凝胶，胶和缓冲液中都加溴化乙锭。向来自步骤D的100μl Sfil消化液加入加样缓冲液，在干净的电泳槽中15V下将样品与加于样品两侧的DNA分子量标记一起电泳过夜。
2)在UV盒和长波UV(360nm)下，显影cDNA和DNA分子量标记。用解剖刀移除全部在500bp以下的凝胶并移除样品孔的上部。将剩余的凝胶滑到槽下并在样品孔上面倒入1.5％Seaplaque溴化乙锭琼脂糖凝胶。
3)反接电泳装置的电极并使DNA跑入1.5％琼脂糖凝胶中一小段距离。
4)在长波UV下进行标准凝胶切割和凝胶片段的GFX纯化。
根据生产商的说明书利用T4DNA连接酶(New England Biolabs，Inc)在标准的连接反应中将样品连接入载体pMHas5中.在专利申请WO2003044049中描述了pMhas5质粒和在该质粒中产生的真菌cDNA文库的使用.使用相同的方法鉴定如WO2003044049中所述来自SigA4转座子的栓菌(Trametes)GH25溶菌酶.在最初的BLAST命中中，序列SEQ ID1被鉴定为与GENESEQP：AAW85696鲁地链霉菌(Strptomycesrutgersensis)糖基水解酶GH 25和真菌序列SWISSPROT：P00721Chalaropsis sp.GH 25肽序列以及许多其它来自基因组测序产物的较少注解的链霉菌开放阅读框(天兰色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，Q9FBR0)都有高度的相似性(见同源性矩阵表1)。基于此信息，决定在米曲霉中表达栓菌GH 25候选物。
表1.
在公共数据库中发现的高分GH25水解酶的同源性表
Chalaropsis NP001276 AAW85696 Q9FBR0
Chalaropsis 100 60 32 40
NP001276 100 40 53
AAW85696 100 45
Q9FBR0 100
AAW85696，鲁地链霉菌；Q9FBR0，天兰色链霉菌；NP001276本发明的GH25；Chalaropsis(SWISSPROT：P00721)
实施例2
来自栓菌的本发明的GH25酶的表达：
使用序列号1设计自定义的寡核苷酸引物用于PCR反应以生成编码本发明插入片段，其侧翼为有利于克隆入表达载体的限制性酶位点。
引物：
引物1(Seq ID No 3)，NP1276EcoRI
5′GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3′
引物2，(Seq ID No 4)，NP1276NotI
5′-ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3′
下划线部分为加到引物上的额外DNA序列以引入用于克隆的限制性酶位点。
以下列方式由以上cDNA文库(见上面实施例1)扩增GH25溶菌酶编码序列：使用1微升的cDNA(大约10纳克的DNA)作为模板与两种引物NP1276EcoRI和NP1276NotI一起进行PCR反应。
NP1276
EcoRI：5′GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3′(SEQ IDNO：3)
NP1276
NotI：5′-ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3′(SEQ IDNO：4)
在100μl反应体积中每种引物使用10pmol。在厂商推荐的条件下使用ProofStart聚合酶(Qiagen GMBH)。在初始的于94摄氏度热处理10分钟后的条件如下：变性温度；94摄氏度-30秒，退火温度；55摄氏度-30秒，和在72摄氏度下延伸1分钟。总共运行35个循环。
在1％琼脂糖凝胶上分离PCR反应物等份。在预测的820碱基对处看到单一的明显条带。通过GFX离心层析柱(AB Phama)从凝胶中分离片段并用剪切由PCR引物引入的凸出部分的EcoRI和NotI进行消化.分离消化的片段并克隆入pXYG1051，一种基于质粒pMStr46的曲霉属表达质粒(见国际专利申请WO2003070956的实施例).具体地，通过HindIII消化和重连接(relegation)去除AMA自主复制区，形成完整的载体.在标准的连接，转化入DH10B大肠杆菌后，鉴定在LB板上氨苄青霉素选择下生长的菌落.选择10个菌落以便制备质粒DNA.利用专利申请WO2003070956中披露的pXYG1051的载体引物对得到的质粒DNA进行测序.选择其中一个没有PCR错误的克隆(NP001276-4)用于Qiagen小量质粒制备(Qiagen GMBH)。
利用选择的克隆(NP001276-4)在曲霉菌中表达所述酶(见下面)并且将包含本发明基因的EcoRI-NotI插入片段用于将所述片段亚克隆入标准细菌载体，pBlueScript KS+(StratageneInc.)，并转化入大肠杆菌菌株DH10B(来自Clontech)。此菌株于2003年12月8日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany)，保藏号DSM16084。
在曲霉菌中表达克隆NP001276：
将cDNA克隆NP001276-4转化入米曲霉菌株Jal355(在国际专利申请WO2003070956中公开)。于蔗糖作为碳源的Cove硝酸盐基础培养基平板上在选择性和非诱导性条件下将30个转化子重分离两次。为了检测NP1276的表达，将转化子在30摄氏度下于具有10ml YPM(2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％麦芽糖)的试管中生长4天。如生产商所推荐地将上清液在NuPage10％Bis-Tris SDS凝胶(Invitrogen)上电泳。当用麦芽糖诱导Plectasin的表达时曲霉菌生长良好。在大多数转化子中见到GH 25溶菌酶的预期大小的明显条带(23kDa)，而在未转化的宿主菌株米曲霉BECh2中未见到此带。选择强表达的单一曲霉菌转化子(EXP00787)进行继续研究。用具有三块隔板的20×1000ml Erlingmeyer摇瓶进行大规模摇瓶实验。每只瓶包含100毫升FG4P培养基(FG4P：3％豆粕(SFK 102-2458)，1.5％麦芽糊精(Roquette)，0.5％Pep-tone bacto(Difco 0118)，1.5％KH2PO4(Merck 4873)，0.2ml/升Pluronic PE 6100(BASF))。所用条件：30摄氏度，150RPM，生长3天。通过滤过两层微孔布miracloth收集培养液并进行冷冻待用。
实施例3.
本发明的GH25酶的纯化
纯化的描述：
将1.7升的发酵液进行细菌过滤并在SP-sepharose柱上利用50mM NaAcpH 5/50mM NaAc，1M NaCI pH 5进行纯化。将收集的级分在Amicon槽(Millipore)上以10kDa截留分子量进行浓缩。N末端氨基酸序列(EKRANPKGID)确证了纯化的蛋白质是成熟的GH25酶。
实施例4.
通过细胞壁测定法检测溶菌酶活性
将冻干的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)(Sigma)用作底物。将底物悬浮于适当pH的Britton&Robinson缓冲液中(0.08M磷酸，0.08M硼酸和0.08M醋酸；用1M NaOH调节pH至2-12)至最终浓度为0.3mg/ml。向96孔微量滴定板中的每个孔加入100μl底物悬浮液和30μl浓度为大约1mg/ml的酶溶液。加入酶之后5分钟在酶标仪中于450nm上测量浊度的变化。计算曲线的斜率并用作酶活性的相对度量。
温度曲线：将纯化的酶于40、50、60和70℃温育15min.将样品冷却至室温并用上述测定法中测量pH 5处的相对残留活性。所述酶在高达50℃都是稳定的。
表2.
温度，℃ 相对残留活性，％ 40 100 50 98 60 64 70 28
pH曲线：制备pH 4，5，6，7和8的底物悬浮液，并如上述测量酶的相对活性。所述酶在pH5上具有最优pH。
表3.
pH 相对活性，％ 4 35 5 100 6 41 7 20 8 15
生物材料的保藏
按布达佩斯条约要求将下列生物材料保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，D-38124Braunschweig，Germany)，并给予下列编号：
保藏物 编号 保藏日
大肠杆菌DH10B DSM16084 2003-12-05
按布达佩斯条约要求将下列生物材料保藏于真菌菌种保藏中心(CentralBureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，3508ADUtrecht，the Netherlands)，并给予下列编号：
保藏物 编号 保藏日
朱红栓菌 CBS114004 2003-11-17
0-1 0-1-1 表格PCT/RO/134(SAFE) 与保藏的微生物或其它生物材料有关的 声明(PCR细则第13条之二) 制备时利用 PCT-SAFE[EASY模式.版 本3.50(Build 0002.169) 0-2 国际申请号 PCR/DK2005/000099 0-3 申请人或代理人的参考卷号 10515.204-WO
1 1-1 1-2 下面列出与说明书中提及的 保藏的微生物或其它生物材 料有关的声明： 页 行 34 23 1-3 1-3-1 1-3-2 1-3-3 1-3-4 保藏鉴定 保藏机构名称 保藏机构地址 保藏日期 保藏号 DSMZ-德意志微生物保藏中心 Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，德国 2003年12月05日(05.12.2003) DSMZ16084 1-5 声明适用的指定国 全部指定 2 2-1 2-2 下面列出与说明书中提及的 保藏的微生物或其它生物材 料有关的声明： 页 行 35 06 2-3 2-3-1 2-3-2 2-3-3 2-3-4 保藏鉴定 保藏机构名称 保藏机构地址 保藏日期 保藏号 Central Bureau voor Schimmelcμltures Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，3508 AD Utrecht，荷兰 2003年11月17日(17.11.2003) CBS 114004 2-5 声明适用的指定国 全部指定
仅用于国际局
0-5 该表格为国际局接受 0-5-1 授权官员