GLP-1及其类似物与人溶菌酶融合的重组蛋白及其用途转让专利
申请号 : CN200610047963.2
文献号 : CN1927888B
文献日 : 2011-03-02
发明人 : 黄庆生 , 李元 , 李别虎 , 薛小平 , 张明杰
申请人 : 大连帝恩生物工程有限公司
摘要 :
本发明涉及降血糖肽与人溶菌酶的重组蛋白及其用途。该融合蛋白中的降血糖肽是指GLP-1或其类似物，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的一种；所述的人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；降血糖肽与人溶菌酶通过以下四种方式中的一种连接：①降血糖肽-连接肽-人溶菌酶；②降血糖肽-人溶菌酶；③人溶菌酶-连接肽-降血糖肽；④人溶菌酶-降血糖肽。该融合蛋白保留了GLP-1的降血糖活性，并延长了其在体内的半衰期，此外还具有人溶菌酶的抗感染及降低AGE水平、促进尿中AGE的排出、减轻蛋白尿的活性，有利于缓解诸多糖尿病并发症症状，可用于制备治疗糖尿病及防治糖尿病并发症的药物。
权利要求 :
1.一种融合蛋白，其特征在于它是由降血糖肽与人溶菌酶在基因水平融合后表达的重组蛋白；
所述的降血糖肽为氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的一种；
所述的人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
降血糖肽与人溶菌酶通过以下四种方式中的一种连接：①降血糖肽-连接肽-人溶菌酶，
②降血糖肽-人溶菌酶，
③人溶菌酶-连接肽-降血糖肽，
④人溶菌酶-降血糖肽；
所述的连接肽序列是GGSGGS。
2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是由毕赤酵母菌表达系统重组表达产生的。
3.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
4.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗糖尿病并发症的药物中的应用，所述的糖尿病并发症包括感染、由晚期糖基化终末产物引发的肾脏和血管并发症。
说明书 :
GLP-1及其类似物与人溶菌酶融合的重组蛋白及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及重组蛋白及其在制药领域的应用，尤其涉及GLP-1及其类似物等降血糖肽与人溶菌酶在基因水平融合后表达的重组蛋白，以及该类融合蛋白在非胰岛素依赖型糖尿病及其并发症治疗中的应用。
背景技术
[0002] 胰高血糖素样肽I(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是人体自身分泌的一种肠道激素，它是由胰高血糖素原(Proglucagon)分子经肠道蛋白水解酶作用后产生的一种30个氨基酸的短肽。该肽通过与胰岛β细胞表面的特异受体结合而刺激胰岛素分泌。人体内的GLP-1有两种形式，一种为GLP-1(7-36)NH2，是由30个氨基酸残基组成的多肽，其C端是酰胺化了的；另一种为GLP-1(7-37)，是由31个氨基酸残基组成的多肽，GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)有相同的促胰岛素分泌作用。
[0003] GLP-1是一种非常理想的糖尿病治疗药物。能明显降低病人在用餐后的血糖，刺激胰岛素的产生，同时还能起到一定的减肥效应，并且不会引起低血糖症(Drucker DJ，Diabetes.1998 Feb；47(2)：159-69)，此外，GLP-1还有一定的促胰腺再生功能(Drucker DJ，Endocrinology.2003 Dec；144(12)：5145-8)然而，各国学者在研究中也发现，由于GLP-1能很快被体内的二肽基肽酶(DPP IV)降解，以及从肾脏中被排出体外，以至于它在体内的半衰期非常短，只有90至120秒，很大程度上限制了该肽作为糖尿病治疗药物的开发。因此，活性更强、稳定性更高的GLP-1类似物的研究是目前各国学者研究的重点。在解决半衰期短的问题上，短肽与其它分子量相对较大的蛋白融合后重组表达，以增加短肽在体内的半衰期是一种行之有效的方法。如将GLP-1及其类似物与白蛋白或球蛋白融合后，GLP-1及其类似物在体内的半衰期就能延长几十倍(Chuang VT，Pharm Res.2002 19：569-577；Baggio LL，Diabetes.2004 Sep；53(9)：2492-500)。
[0004] 在糖尿病并发症方面，持续高血糖状态下葡萄糖可以在非酶条件下与脂类以及蛋白结合，形成晚期糖基化终末产物(AGEs)，对肾脏和血管系统造成损害。AGEs的损害机制包括：(1)使肾小球基底膜(GBM)成分交联增多，导致GBM增厚及孔径选择性和电荷选择性丧失，而产生蛋白尿；(2)糖化的血管基质可通过AGEs捕获渗出血管外的可溶性血浆蛋白如LDL，致富含胆固醇性LDL在局部堆积，促进动脉硬化；(3)使醛糖还原酶(AR)糖化，其活性增加，参与多元醇途径的活化；LDL糖化后则清除减少，致血浆中LDL浓度升高，渗入血管壁，促进血管并发症发生；(4)通过AGEs与细胞上特异性受体(RAGE)结合激活细胞，尤其是巨噬细胞，随后分泌大量的细胞因子和细胞介质如IL-1、TNF1、TGFb、PDGF等，引起组织损伤。此外，AGEs与RAGE结合后还会导致细胞氧化增加，产生大量氧自由基，而激活NFkB，后者可诱导ET-1及血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)等表达。此外，在体外培养的系膜上Amadori修饰的白蛋白不仅能诱导TGFb1基因和蛋白表达，亦能上调TGFb II型受体功能，因而促进细胞外基质蛋白的表达。
[0005] 溶菌酶是人体内非特异防御的重要组成部分，多数II型糖尿病患者体内的溶菌酶水平较低，这可能是糖尿病患者易发生感染的重要原因。人溶菌酶分子上一个包含18个氨基酸的结构域可以和AGEs结合，减轻AGEs对糖尿病患者的肾损害和血管损害。其作用机理是：(1)与AGEs结合后加速AGEs从体内排出；(2)抑制巨噬细胞与mesangial细胞释放炎症因子；(3)改善糖尿病患者的蛋白尿；(4)促进巨噬细胞对AGEs的清除。(Zheng F，Mol Med.2001Nov；7(11)：737-47.)
[0006] 基于上述的理论与实践可以推测，将GLP-1与人溶菌酶共建为融合蛋白，那么该融合蛋白将同时具有GLP-1与人溶菌酶的双重生物学活性，可用于糖尿病及其并发症的治疗；并能延长GLP-1在体内的半衰期。
[0007] 专利号为US 7045677的美国专利“Fusion proteins incorporating lysozyme”所公开的内容中涉及到“人溶菌酶/GLP-1的融合蛋白”；但其目的是获取GLP-1单体：GLP-1短肽在生物体内极易被降解，且无法通过正常乳汁分泌过程产生，与人溶菌酶形成融合蛋白后便可以由转基因动物产生，并通过乳汁分泌；同时，乳汁中所含的蛋白质大部分为酸性，这使得碱性的人溶菌酶融合蛋白很容易被分离出来，因此，该专利发明人将GLP-1/溶菌酶的融合蛋白基因转入动物，使转基因动物产生融合蛋白，并随着乳汁分泌，然后从乳汁中提取这种融合蛋白，继而再将GLP-1与溶菌酶裂解开，最后提取获得GLP-1短肽。该专利发明人并没有预见到人溶菌酶/GLP-1融合蛋白本身的双重生物活性，而所产生的“人溶菌酶/GLP-1的融合蛋白”除了包含人溶菌酶、GLP-1及连接肽序列外，至少还包含位于人溶菌酶及GLP-1之间的一个酶切位点。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种能克服GLP-1及其类似物等降血糖肽体内半衰期短的不足，并同时具有降血糖肽及溶菌酶双重生物学活性的融合蛋白。该融合蛋白既能有效地降低血糖，又能提高糖尿病患者的抗感染能力、减轻其肾脏与血管的损害。
[0009] 在综合现有研究成果的基础上，本发明通过大量的实验筛选，选定包括GLP-1及其类似物在内的共5种具有降血糖活性的短肽，分别为降血糖肽1～5，将编码这5种降血糖肽氨基酸序列的基因与人溶菌酶基因进行融合后进行表达，分离纯化得到目标融合蛋白。
[0010] 本发明所述的融合蛋白是由降血糖肽与人溶菌酶在基因水平融合后表达的重组蛋白；
[0011] 其中所述的降血糖肽为GLP-1(7-36)或其类似物，其氨基酸序列为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的一种，它们的氨基酸序列分别为：
[0012] 降血糖肽1：
[0013] His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg
[0014] Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
[0015] (SEQ ID NO.1)
[0016] 降血糖肽2：
[0017] His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys
[0018] Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
[0019] (SEQ ID NO.2)
[0020] 降血糖肽3：
[0021] His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys[0022] Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
[0023] (SEQ ID NO.3)
[0024] 降血糖肽4：
[0025] His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys[0026] Glu Phe Ile Ala Trp Leu
[0027] (SEQ ID NO.4)
[0028] 降血糖肽5：
[0029] His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys[0030] Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Thr Ser
[0031] (SEQ ID NO.5)
[0032] 所述的人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，即：
[0033] Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly[0034] Tyr Arg Gly Met Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn[0035] Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile[0036] Asn Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu[0037] Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Val[0038] Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg[0039] Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val
[0040] (SEQ ID NO.6)
[0041] 降血糖肽与人溶菌酶通过以下四种方式中的一种连接：
[0042] ①降血糖肽-连接肽-人溶菌酶，
[0043] ②降血糖肽-人溶菌酶，
[0044] ③人溶菌酶-连接肽-降血糖肽，
[0045] ④人溶菌酶-降血糖肽；
[0046] 连接肽是一个柔性连接子，用于连接需要进行融合的两个蛋白，其作用是为了使两个蛋白在折叠、形成空间构型时不会相互影响，以保留各自的生物学活性。通常情况下，连续的甘氨酸(G)或甘氨酸与丝氨酸(S)的交替就会具备柔性连接子的功能。连接肽的氨基酸数一般在20个以内，但G与S的组合方式目前并没有一个固定的模式。本发明的实施例中所采用的连接肽是一个富含甘氨酸(G)与丝氨酸(S)的直链短肽：GGSGGS，但毫无疑问，任何具有上述连接功能的短肽都可以作为本发明中的连接肽使用而不会影响本发明的实施。
[0047] 本发明所述的GLP-1及其类似物与人溶菌酶的融合蛋白通过基因重组技术获得，具体的技术方案根据目标融合蛋白中降血糖肽与人溶菌酶连接方式的不同而有所差异，本发明的具体实施例对5种不同的降血糖肽以4种不同的连接方式与人溶菌酶构建融合蛋白的技术方案进行了详细的描述。
[0048] 本发明采用SDS-PAGE电泳和western-blot对上述20种融合蛋白进行了鉴定：SDS-PAGE电泳采用15％浓度的丙烯酰胺凝胶，考马斯亮蓝R-250染色，经凝胶成像仪扫描后得到结果，证明各融合蛋白的分子量均与预计的大小一致，约为18KD；在此基础上，采用抗人溶菌酶单克隆抗体对转移至硝酸纤维素膜上的蛋白进行Western-blot，第一抗体用抗人溶菌酶单克隆抗体，二抗采用碱性磷酸酶标记的兔抗鼠抗体，荧光底物显色，再经X光片暴光显影后得到结果，进一步证实了这些融合蛋白为溶菌酶的融合蛋白。
[0049] 此外，本发明还对根据上述方法所获得的共20种融合蛋白进行了生物学活性的检验，包括：
[0050] (1)以GLP-1为阳性对照、GK II型糖尿病大鼠为动物模型，检测融合蛋白的降血糖活性及其持续时间；实验结果证明融合蛋白具有与GLP-1相似降血糖活性，且其降血糖活性比GLP-1约延长3天。
[0051] (2)以GLP-1为阳性对照、体外培养的大鼠胰岛β细胞为实验模型，检测融合蛋白刺激大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素和刺激胰岛β细胞增生的情况；实验结果证明融合蛋白和GLP-1一样，具有刺激胰岛β细胞分泌胰岛素及刺激大鼠胰岛β细胞增生的作用。
[0052] (3)以GLP-1为阳性对照、正常昆明种小鼠为实验模型，检测融合蛋白对葡萄糖耐受作用；实验结果证明融合蛋白具有比GLP-1更好的葡萄糖耐受能力。
[0053] (4)以人溶菌酶为阳性对照、金黄色葡球菌感染的NOD小鼠为模型，检测融合蛋白的抗感染作用；实验结果证明融合蛋白与阳性对照人溶菌酶一样具有抗NOD小鼠感染的作用。
[0054] (5)以人溶菌酶为阳性对照、NOD小鼠为模型，通过测定血和尿AGEs值及白蛋白/肌酸酐比值来评价融合蛋白清除AGEs和改善尿蛋白作用；实验结果证明融合蛋白与人溶菌酶阳性对照一样具有降低NOD小鼠血中AGEs水平、促进尿中AGEs的排出、减轻蛋白尿的作用。
[0055] 根据上述结果可知，GLP-1及其类似物与人溶菌酶的融合蛋白保留了GLP-1类降血糖肽的降血糖活性，解决了GLP-1及其类似物等短肽在体内半衰期短的问题，还具有人溶菌酶的抗感染及降低AGEs水平、促进尿中AGEs的排出、减轻蛋白尿的作用，有利于缓解由于AGEs水平增高而带来的诸多糖尿病并发症症状，因此，本发明所述的融合蛋白可用于制备治疗糖尿病及防治糖尿病并发症的药物。
附图说明
[0056] 本发明附图2幅，它们分别是：
[0057] 图1：5种不同的降血糖肽以4种不同的连接方式与人溶菌酶构建形成的20种融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果图；
[0058] 其中，样品1为标准分子量Marks；样品2～21分别为P1-L-hlz，P1-hlz，hlz-L-P1，hlz-P1，P4-L-hlz，P4-hlz，hlz-L-P4，hlz-P4，P2-L-hlz，P2-hlz，hlz-L-P2，hlz-P2，P3-L-hlz，P3-hlz，hlz-L-P3，hlz-P3，P5-L-hlz，P5-hlz，hlz-L-P5和hlz-P5；
[0059] 图2：5种不同的降血糖肽以4种不同的连接方式与人溶菌酶构建形成的20种融合蛋白的Western-blot结果图；
[0060] 其中，样品1为标准分子量Marks；样品2～21分别为P4-L-hlz，P4-hlz，hlz-L-P4，hlz-P4，P2-L-hlz，P2-hlz，hlz-L-P2，hlz-P2，P3-L-hlz，P3-hlz，hlz-L-P3，hlz-P3，P5-L-hlz，P5-hlz，hlz-L-P5，hlz-P5，P1-L-hlz，P1-hlz，hlz-L-P1，hlz-P1。
[0061] 图1为本发明的摘要附图。
[0062] 需要说明的是：本说明书中，以P1～P5分别依次代表降血糖肽1～5；L代表连接肽GGSGGS，hlz代表人溶菌酶。
[0063] 例如：P1-L-hlz即表示具有“降血糖肽1-GGSGGS-人溶菌酶”氨基酸序列的融合蛋白，亦即由SEQ ID NO.1所示序列、连接肽GGSGGS、SEQ ID NO.6所示序列三者顺序连接而成的多肽。
具体实施方式
[0064] 以下结合具体实施方式对本发明的内容做进一步的说明。
[0065] 以下实施例中所使用的连接肽为GGSGGS、载体为pPIC9k、表达的宿主菌为毕赤酵母。其中，pPIC9k载体为一种商品化的通用载体，购自Invitrogen公司；所述毕赤酵母菌是与pPIC9K载体配套的宿主菌，也是购自Invitrogen公司。对上述连接肽、载体及表达宿主的选定仅为了更清楚地阐明本发明的内容，不应当视为对本发明的任何形式的限制。
[0066] 为了描述的方便，如无特别说明，本说明书中的“融合蛋白”指GLP-1及其类似物与人溶菌酶融合的重组蛋白；降血糖肽1～5依次分别指氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的降血糖肽。
[0067] 以下实施例中基因合成以及构建载体所用的工具酶、DNA聚合酶、dNTP等分子生物学试剂均购自大连宝生物公司(TaKaRa)，扩增基因的引物也是由大连宝生物公司合成。
[0068] 实施例1
[0069] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽1-连接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，包括以下具体步骤：
[0070] (1)获取编码“降血糖肽1-GGSGGS”序列的基因
[0071] ①合成引物EX-F1和EX-R1
[0072] EX-F 1：5’tactcgagaaaagacatggtgaaggaacatttaccagtgacttgtcaaaacagatggaagaggaggcagtgcgg 3’(SEQ ID NO.7)
[0073] EX-R 1：5’atggatccacctgagccacccgatggcggaggtgccccgctacttggtcctccgttcttaagccactcaataaataaccgcactgcctcctcttcc 3’(SEQ ID NO.8)
[0074] ②上述两种引物按照下述反应条件退火、延伸后得到编码“降血糖肽1-GGSGGS”序列的基因
[0075] 反应体系总体积50μl，其中含dNTP 4μl(4种核苷酸浓度各为2.5mM)、25μM的上述两种引物各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反应缓冲液5μl、水39μl。退火、延伸的循环条件为：94℃3分钟预变性后进入下述的循环：94℃10秒→55℃10秒→72℃20秒，10个循环。反应产物经1.5％琼脂糖电泳后回收。
[0076] 所得到的编码“降血糖肽1-GGSGGS”序列的基因的5’端包含Xho I酶切位点以及α因子信号肽末端的碱基序列，即tactcgagaaaaga；3’端包含编码接连肽GGSGGS和BamH I酶切位点的基因。
[0077] (2)获得编码人溶菌酶的基因
[0078] ①合成扩增人溶菌酶基因的引物hly pf1和hly pr1
[0079] hly pf1：5’atgaattcggatccaaggtctttgaaaggtgtgag 3’；(SEQ ID NO.14[0080] hly pr1：5’atgcggccgcttacactccacaaccttgaacatactg 3’；(SEQ ID NO.15)[0081] 上游引物hly pf1的5’端引入了EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点。下游引物hly pr1 5’端引入Not I限制性内切酶位点；
[0082] ②人溶菌酶基因的获得
[0083] 用引物hly pf1和hly pr1使用PCR扩增人溶菌酶基因，人溶菌酶基因由本公司技术人员从人体淋巴细胞中采用RT-PCR方法获得并克隆在T载体中(TaKaRa公司的pDM18 T载体)，并经测序证实为人溶菌酶的cDNA。PCR的反应条件为：反应总体积50μl，其中含dNTP 4μl(4种核苷酸浓度浓度各为2.5mM)、25μM的引物hly pf1和引物hly pr1各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反应缓冲液5μl、含人溶菌酶cDNA的T载体质粒DNA1μl、水38μl。退火、延伸的循环条件为：94℃3分钟预变性后进入下述的循环，94℃20秒→55℃20秒→72℃30秒，25个循环。
[0084] 扩增产物经1.0％琼脂糖电泳后回收。这样就获得了5’端带EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点，3’端带Not I酶切位点的人溶菌酶基因序列。
[0085] (3)降血糖肽1-GGSGGS-人溶菌酶融合基因载体的构建
[0086] ①人溶菌酶基因克隆至pPIC9K载体：
[0087] 将步骤(2)所得的人溶菌酶基因用EcoR I和Not I双酶切后克隆至酵母表达载体多克隆位点中的EcoR I和Not I位点，该载体是在pPIC9K载体(一种商品化的通用载体，购自Invitrogen公司)的基础上对载体原有的一个BamH I酶切位点以及载体原有的二个Xho I酶切位点中的一个(α因子信号肽以外的一个Xho I酶切位点)进行突变后的载体，即新的载体不含BamH I酶切位点，只含一个Xho I酶切位点(位于α因子信号肽)。初步确认的阳性克隆进行序列测定，确认人溶菌酶基因是克隆在载体α因子信号肽的下游。
[0088] ②降血糖肽1-GGSGGS基因克隆至人溶菌酶-pPIC9K载体含人溶菌酶的pPIC9K载体用Xho I和BamH I双酶切，与同样双酶切的降血糖肽1-GGSGGS基因连接，转化JM109大肠杆菌，获得了降血糖肽1-GGSGGS-人溶菌酶融合基因克隆于酵母表达载体的质粒，序列测定予以确认。
[0089] (4)融合蛋白基因转化毕赤酵母菌
[0090] 确认的阳性克隆提取质粒，Sal I酶切成线性后，采用电穿孔的方法转化GS115毕赤酵母菌，具体操作过程参照Wu S等的报道(Wu S.Biotechniques.2004
[0091] Jan；36：152-4)，转化菌在MD平板上初筛，然后再进行G418抗性筛选，从中筛选抗4mg/ml G418的酵母工程菌。
[0092] (5)发酵表达
[0093] 步骤(4)筛选得到的酵母工程菌采用常规方法在甲醇诱导下进行发酵表达。发酵在德国‘贝朗’30-L发酵罐中进行，发酵液经蛋白电泳扫描推算，表达量约为1mg/ml(1000mg/l)。发酵中甘油流加和甲醇流加的方法参照Zhang W等的报道进行(Zhang W.J Ind Microbiol Biotechnol.2003 Apr；30(4)：210-5.)。
[0094] (6)产物提取纯化
[0095] 包括发酵液离心、超滤、离子交换柱层析。发酵液的浓缩采用超滤的方法，超滤膜为Millipore公司的5K膜；浓缩的发酵液经G25凝胶过滤除盐后，采用CMFF离子交换层析进行纯化。G25和CMFF凝胶也均购自Millipore公司。纯化后的产物作为随后生物活性检测用融合蛋白。
[0096] 实施例2
[0097] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽2-连接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例1所述的技术方案步骤均相同。
[0098] 本实施例中为了获得编码“降血糖肽2-GGSGGS”序列的基因所采用的引物为G-A-F1和G-R1：
[0099] G-A-F 1：5’tactcgagaaaagacatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’；(SEQIDNO.9)
[0100] G-R 1：5’atggatccacctgagccacctcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag 3’；(SEQIDNO.10)
[0101] 实施例3
[0102] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽3-连接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例1所述的技术方案步骤均相同。
[0103] 本实施例中为了获得编码“降血糖肽3-GGSGGS”序列的基因所采用的引物为G-G-F1和G-R1：
[0104] G-G-F 1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’；(SEQ ID NO.11)
[0105] G-R1：5’atggatccacctgagccacctcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag 3’；(SEQ ID NO.10)
[0106] 实施例4
[0107] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽4-连接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例1所述的技术方案步骤均相同。
[0108] 本实施例中为了获得编码“降血糖肽4-GGSGGS”序列的基因所采用的引物为G-G-F1和G-26-R1：
[0109] G-G-F 1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ IDNO.11)
[0110] G-26-R1：5’atggatccacctgagccacccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.12)
[0111] 实施例5
[0112] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽5-连接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例1所述的技术方案步骤均相同。
[0113] 本实施例中为了获得编码“降血糖肽5-GGSGGS”序列的基因所采用的引物为G-G-F1和G-TS-R1：
[0114] G-G-F 1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ IDNO.11)
[0115] G-TS-R1：5’atggatccacctgagccaccactagttcggcctttcaccagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc 3’(SEQ ID NO.13)
[0116] 实施例6
[0117] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽1-人溶菌酶”融合蛋白的方法，包括以下步骤：
[0118] (1)获取降血糖肽1的基因
[0119] ①合成引物EX-F1和EX-R2
[0120] EX-F 1：5’tactcgagaaaagacatggtgaaggaacatttaccagtgacttgtcaaaacagatggaagaggaggcagtgcgg 3’(SEQ ID NO.7)
[0121] EX-R2：5’ctcacacctttcaaagaccttcgatggcggaggtgccccgctacttggtcctccgttcttaagccactcaataaataaccgcactgcctcctcttcc 3’(SEQ ID NO.16)
[0122] ②上述两种引物退火延伸，获得了3’端包含人溶菌酶基因的前21个碱基的降血糖肽1的基因。
[0123] 退火延伸的反应条件为：总体积50μl，其中含dNTP 4μl(浓度各为2.5mM)、25μM的上述两种引物各1μl、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反应缓冲液5μl、水39μl。退火、延伸的循环条件为：94℃3分钟预变性后进入下述的循环，94℃10秒→55℃10秒→72℃20秒，10个循环。反应产物经1.5％琼脂糖电泳后回收。
[0124] (2)获取人溶菌酶基因
[0125] 以hly pf2：5’aaggtctttgaaaggtgtgag3’(SEQ ID NO.17)和hly pr1：5’atgcggccgcttacactccacaaccttgaacatactg 3’(SEQ ID NO.15)为引物，以人溶菌酶基因为模板，扩增人溶菌酶基因。PCR的条件为：总体积50μl，其中含dNTP 4μl (浓度各为2.5mM)、25μM的hly pf2引物和hly pr1引物各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反应缓冲液5μl、含人溶菌酶cDNA的T载体质粒DNA1μl、水38μl。扩增的循环条件为：
94℃3分钟预变性后进入下述的循环，94℃20秒→55℃20秒→72℃50秒，30个循环。扩增产物(人溶菌基因)经1.0％琼脂糖电泳后回收。
94℃3分钟预变性后进入下述的循环，94℃20秒→55℃20秒→72℃50秒，30个循环。扩增产物(人溶菌基因)经1.0％琼脂糖电泳后回收。
[0126] (3)获取降血糖肽1-人溶菌酶的融合基因
[0127] 以上述步骤(1)、(2)制得的降血糖肽基因和人溶菌酶基因混合后为模板，以EX-F1和hly pr1为引物，采用融合PCR方法，扩增获得目标融合基因。基因的5’端包含Xho I酶切位点以及α因子信号肽末端序列，3’端含Not I酶切位点。融合PCR的方法为：总体积50μl，其中含dNTP 4μl(浓度各为2.5mM)、25μM的EX-F1引物和hly pr1引物各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反应缓冲液5μl、上述的降血糖肽基因1μl、人溶菌酶基因1μl、水37μl。扩增的循环条件为：94℃3分钟预变性后进入下述的循环，94℃30秒→55℃30秒→72℃50秒，30个循环。扩增产物(降血糖肽-人溶菌融合基因)经1.0％琼脂糖电泳后回收。
[0128] (4)融合基因克隆至酵母表达载体及发酵表达与纯化
[0129] 将步骤(3)所获得的目标融合基因用Xho I和Not I双酶切后克隆至酵母表达载体。初步确认的阳性克隆进行序列测定，确认目标融合基因是克隆在载体α因子信号肽的下游，转化大肠杆菌，测序确认的阳性克隆提取质粒，Sal I酶切成线性后，转化GS115毕赤酵母菌，再做G418抗性筛选，获得抗4mg/ml G418的酵母工程菌。随后进行酵母工程菌的发酵表达。酵母工程菌采用常规方法在甲醇诱导下进行发酵表达。发酵在德国‘贝朗’30-L发酵罐中进行，发酵液经蛋白电泳扫描推算，表达量约为1mg/ml(1000mg/l)。发酵液经离心、超滤、离子交换层析柱纯化后，作为治疗药物用于随后的糖尿病模型动物的治疗实验。上述载体与宿主菌特征、转化方法、发酵与纯化步骤与实施例1所述相同。
[0130] 实施例7
[0131] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽2-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例6所述的技术方案步骤均相同。
[0132] 本实施例中为了获得降血糖肽2基因所采用的引物为G-A-F1和G-R2：
[0133] G-A-F 1：5’tactcgagaaaagacatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’；(SEQ ID NO.9)
[0134] G-R2：5’ctcacacctttcaaagacctttcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag 3’；(SEQ ID NO.18)
[0135] 相应的，步骤(3)中为获取融合基因所使用的引物是G-A-F1和hly pr1。
[0136] 实施例8
[0137] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽3-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例6所述的技术方案步骤均相同。
[0138] 本实施例中为了获得降血糖肽3基因所采用的引物为G-G-F1和G-R2：
[0139] G-G-F 1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.11)；
[0140] G-R2：5’ctcacacctttcaaagacctttcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag 3’(SEQ ID NO.18)；
[0141] 相应的，步骤(3)中为获取融合基因所使用的引物是G-G-F1和hly pr1。
[0142] 实施例9
[0143] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽4-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例6所述的技术方案步骤均相同。
[0144] 本实施例中为了获得降血糖肽4基因所采用的引物为G-G-F1和G-26-R2：
[0145] G-G-F 1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.11)；
[0146] G-26-R2：5’ctcacacctttcaaagaccttcagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.19)；
[0147] 相应的，步骤(3)中为获取融合基因所使用的引物是G-G-F1和hly pr1。
[0148] 实施例10
[0149] 在毕赤酵母中表达“降血糖肽5-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例6所述的技术方案步骤均相同。
[0150] 本实施例中为了获得降血糖肽5基因所采用的引物为G-G-F1和G-TS-R2：
[0151] G-G-F 1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagct gcc 3’(SEQ ID NO.11)；
[0152] G-TS-R2：5’ctcacacctttcaaagacctt actagttcggcctttcaccagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc 3’(SEQ ID NO.20)；
[0153] 相应的，步骤(3)中为获取融合基因所使用的引物是G-G-F1和hly pr1。
[0154] 实施例11
[0155] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-连接肽-降血糖肽1”融合蛋白的方法，包括以下步骤：
[0156] (1)获取降血糖肽1的基因，包括：
[0157] ①合成引物EX-F2和EX-R3
[0158] EX-F2：5’taggatcccatggtgaaggaacatttaccagtgacttgtcaaaacagatggaagaggaggcagtgcgg 3’(SEQ ID NO.21)；
[0159] EX-R3：5’atgcggccgcttacgatggcggaggtgccccgctacttggtcctccgttcttaagccactcaataaataaccgcactgcctcctcttcc 3’(SEQ ID NO.22)；
[0160] ②EX-F2引物和EX-R3引物退火、延伸后获得了降血糖肽1的基因，基因的5’端包含BamH I酶切位点，3’端包含Not I酶切位点。
[0161] 退火、延伸的条件方法同实施例1中步骤(1)所述。
[0162] (2)构建“人溶菌酶-GGSGGS”基因，包括：
[0163] ①合成引物hly pf3和hly pr2：
[0164] hly pf3：5’tactcgagaaaagaaaggtctttgaaaggtgtgag 3’(SEQ ID NO.28)；
[0165] hly pr2：5’atgcggccgcatcggatccacctgagccacccactccacaaccttgaacatac3’(SEQ ID NO.29)；
[0166] ②上游引物hly pf3的5’端引入了Xho I酶切位点；下游引物hly pr2的5，端引入BamH I和Not I限制性内切酶位点以及GGSGGS连接肽序列；用这一对引物扩增人溶菌酶基因，获得了5’端带Xho I酶切位点，3’端带GGSGGS以及BamH I和Not I酶切位点的人溶菌酶基因序列。
[0167] (3)“人溶菌酶-GGSGGS-降血糖肽1”融合基因的获取及转化；
[0168] 将上述步骤(2)中获得的人溶菌酶-GGSGGS基因用Xho I和Not I双酶切后克隆至酵母表达载体，确认人溶菌酶基因是克隆在载体α因子信号肽的下游。含人溶菌酶基因的载体用BamH I和Not I双酶切，与同样双酶切步骤(1)中获得的降糖肽基因分别连接，转化大肠杆菌，获得了目标融合基因克隆于酵母表达载体的质粒，序列测定予以确认，确认的阳性克隆提取质粒，Sal I酶切成线性后，转化GS115毕赤酵母菌，再做G418抗性筛选，获得抗4mg/ml G418的酵母工程菌。
[0169] (4)发酵表达及产物提取纯化
[0170] 酵母工程菌采用常规方法在甲醇诱导下进行发酵表达。发酵在德国‘贝朗’30-L发酵罐中进行，发酵液经蛋白电泳扫描推算，表达量约为1mg/ml(1000mg/l)。发酵液经离心、超滤、离子交换层析柱纯化后，用作随后的生物活性检测实验。
[0171] 本实施例中所涉及到的载体与宿主菌特征、转化方法、发酵与纯化步骤与实施例1所述相同。
[0172] 实施例12
[0173] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-连接肽-降血糖肽2”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例11所述的技术方案步骤均相同。
[0174] 本实施例中为了获得降血糖肽2基因所采用的引物为G-A-F2和G-R3：
[0175] G-A-F2：5’taggatcccatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.23)；
[0176] G-R3：5’atgcggccgcttatcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.24)；
[0177] 实施例13
[0178] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-连接肽-降血糖肽3”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例11所述的技术方案步骤均相同。
[0179] 本实施例中为了获得降血糖肽3基因所采用的引物为G-G-F2和G-R3：
[0180] G-G-F2：5’taggatcccatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.25)；
[0181] G-R3：5’atgcggccgcttatcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.24)；
[0182] 实施例14
[0183] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-连接肽-降血糖肽4”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例11所述的技术方案步骤均相同。
[0184] 本实施例中为了获得降血糖肽4基因所采用的引物为G-G-F2和G-26-R3：
[0185] G-G-F2：5’taggatcccatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.25)；
[0186] G-26-R3：5’atgcggccgcttacagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.26)；
[0187] 实施例15
[0188] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-连接肽-降血糖肽5”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例11所述的技术方案步骤均相同。
[0189] 本实施例中为了获得降血糖肽5基因所采用的引物为G-G-F2和G-TS-R3：
[0190] G-G-F2：5’taggatcccatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.25)；
[0191] G-TS-R3：5’atgcggccgcttaactagttcggcctttcaccagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc3’(SEQ ID NO.27)；
[0192] 实施例16
[0193] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-降血糖肽1”融合蛋白的方法，包括以下具体步骤：
[0194] (1)获取降血糖肽的基因，包括：
[0195] ①合成引物EX-F3和EX-R3
[0196] EX-F3：5’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatggtgaaggaacatttaccagtgacttgtcaaaacagatggaagaggaggcagtgcgg3’(SEQ ID NO.30)；
[0197] EX-R3：5’atgcggccgcttacgatggcggaggtgccccgctacttggtcctccgttcttaagccactcaataaataaccgcactgcctcctcttcc 3’(SEQ ID NO.22)；
[0198] ②上述两种引物退火、延伸后，获得了降血糖肽1的基因，且基因的5’端包含人溶菌酶基因的后24个碱基。
[0199] 退火、延伸的条件方法同实施例1中步骤(1)所述。
[0200] (2)获取人溶菌酶基因，包括：
[0201] ①合成引物hly pf3和hly pr3
[0202] hly pf3：5’tactcgagaaaagaaaggtctttgaaaggtgtgag 3’(SEQ ID NO.28)；
[0203] hly pr3：5’cactccacaaccttgaacatac 3’(SEQ ID NO.31)；
[0204] ②以上hly pf3和hly pr3为引物，人溶菌酶基因为模板，PCR扩增人溶菌酶基因。PCR的反应条件同实施例1步骤(2)中所述。
[0205] (3)融合基因的获得
[0206] 步骤(1)所获得的降血糖肽基因和步骤(2)所获得的人溶菌酶基因混合后为模板，以hly pf3和EX-R3为引物，扩增获得人溶菌酶-降血糖肽1的融合基因。基因的5’端包含Xho I酶切位点以及α因子信号肽末端序列，3’端含Not I酶切位点。PCR扩增条件同实施例6步骤(3)所述。
[0207] (4)融合基因转化
[0208] 将步骤(3)中获得的融合基因用Xho I和Not I双酶切后克隆至酵母表达载体，初步确认的阳性克隆进行序列测定，确认人溶菌酶-降血糖肽基因是克隆在载体α因子信号肽的下游，转化大肠杆菌，测序确认的阳性克隆提取质粒，SalI酶切成线性后，转化GS115毕赤酵母菌，再做G418抗性筛选，获得抗4mg/mlG418的酵母工程菌。
[0209] (5)转化体的发酵表达及目标融合蛋白的提取纯化
[0210] 酵母工程菌采用常规方法在甲醇诱导下进行发酵表达。发酵在德国‘贝朗’30-L发酵罐中进行，发酵液经蛋白电泳扫描推算，表达量约为1mg/ml(1000mg/l)。发酵液经离心、超滤、离子交换层析柱纯化后，用作随后的生物活性检测实验。
[0211] 本实施例中所涉及到的载体与宿主菌特征、转化方法、发酵与纯化步骤与实施例1所述相同。
[0212] 实施例17
[0213] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-降血糖肽2”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例16所述的技术方案步骤均相同。
[0214] 本实施例中为了获得降血糖肽2基因所采用的引物为G-A-F3和G-R3：
[0215] G-A-F3：5’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.32)；
[0216] G-R3：5’atgcggccgcttatcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.24)；
[0217] 相应的，步骤(3)中为获取融合基因所使用的引物是hly pf3和G-R3。
[0218] 实施例18
[0219] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-降血糖肽3”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例16所述的技术方案步骤均相同。
[0220] 本实施例中为了获得降血糖肽3基因所采用的引物为G-G-F3和G-R3：
[0221] G-G-F3：5’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.33)；
[0222] G-R3：5’atgcggccgcttatcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.24)；
[0223] 相应的，步骤(3)中为获取融合基因所使用的引物是hly pf3和G-R3。
[0224] 实施例19
[0225] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-降血糖肽4”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例16所述的技术方案步骤均相同。
[0226] 本实施例中为了获得降血糖肽4基因所采用的引物为G-G-F3和G-26-R3：
[0227] G-G-F3：5’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.33)；
[0228] G-26-R3：5’atgcggccgcttacagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.26)；
[0229] 相应的，步骤(3)中为获取融合基因所使用的引物是hly pf3和G-26-R3。
[0230] 实施例20
[0231] 在毕赤酵母中表达“人溶菌酶-降血糖肽5”融合蛋白的方法，除步骤(1)中所使用的引物外，其余步骤与实施例16所述的技术方案步骤均相同。
[0232] 本实施例中为了获得降血糖肽5基因所采用的引物为G-G-F3和G-TS-R3：
[0233] G-G-F3：5’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.33)；
[0234] G-TS-R3：5’atgcggccgcttaactagttcggcctttcaccagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc3’(SEQ ID NO.27)；
[0235] 相应的，步骤(3)中为获取融合基因所使用的引物是hly pf3和G-TS-R3。
[0236] 实施例21
[0237] 对上述实施例1～20所得到的GLP及其类似物与人溶菌酶融合的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测：采用15％浓度的丙烯酰胺凝胶，考马斯亮蓝R-250染色，经凝胶成像仪扫描后结果如附图1所示，可以看出这20种融合蛋白的分子量是一致，都在约18KD大小的位置。
[0238] 实施例22
[0239] 在SDS-PAGE电泳检测结果的基础上，采用抗人溶菌酶单克隆抗体对转移至硝酸纤维素膜上的上述融合蛋白进行western-blot检测，第一抗体用抗人溶菌酶单克隆抗体，二抗采用碱性磷酸酶标记的兔抗鼠抗体，荧光底物显色，再经X光片暴光显影后结果如附图2所示，可以看出在约18KD位置的蛋白可以与抗人溶菌酶单克隆抗体起特异的免疫结合，证实了这些融合蛋白为溶菌酶的融合蛋白，此结果对前面的SDS-PAGE结果给予了进一步的支持和确认。
[0240] 实施例23
[0241] GLP-1及其类似物与人溶菌酶融合的重组蛋白生物活性检测。
[0242] 一、降血糖肽与人溶菌酶融合的重组蛋白作为治疗药物用于GK II型糖尿病大鼠模型的治疗实验
[0243] GK II型糖尿病大鼠220只(每只体重在230g±10g)，分为22组，每组10只；第一组为GLP-1阳性对照组，第二组为生理盐水对照组，第三至第二十二组分别为实施例1～20所述的20种融合蛋白的实验组。
[0244] 220只GK大鼠实验前都抽取血液，分离血清，冰冻保存待测。融合蛋白各实验组每只大鼠腹腔接种15μg的融合蛋白：在融合蛋白中，降血糖肽只占整个融合蛋白分子量的约1/5，所以15μg的融合蛋白中也只相当于3μg的GLP-1；GLP-1阳性对照组每只大鼠腹腔接种3μg的GLP-1；对照组每只大鼠腹腔接种0.5ml的生理盐水；每天注射一次，连续注射10天后，立即抽血，分离血清，冰冻保存待测。停药3天后，再分别采血，分离血清，连同前面冰冻保存待测的血清一起，检测血糖的浓度，结果见表1。
[0245] 表1 融合蛋白治疗GK II型糖尿病大鼠实验结果
[0246]腹腔注射前血糖值 腹腔连续注射10天后 停止注射后3天
实验分组 (mmol/L) 血糖值(mmol/L) 血糖值(mmol/L)
GLP-1阳性对照组 9.6±0.3 5.4±0.5 8.2±0.4
生理盐水对照组 9.4±0.6 9.3±0.3 9.6±0.4
P1-L-hlz组 9.7±0.5 5.6±0.6 6.3±0.2
P2-L-hlz组 9.5±0.3 5.7±0.5 6.9±0.5
P3-L-hlz组 9.3±0.3 5.9±0.4 6.6±0.4
P4-L-hlz组 9.4±0.4 5.5±0.4 6.3±0.4
P5-L-hlz组 9.4±0.2 5.3±0.3 6.3±0.3
P1-hlz组 9.3±0.4 5.4±0.3 7.2±0.4
P2-hlz组 9.5±0.5 5.5±0.2 7.6±0.4
P3-hlz组 9.2±0.4 5.4±0.3 6.8±0.4
P4-hlz组 9.2±0.4 5.8±0.4 6.2±0.5
P5-hlz组 9.3±0.3 5.6±0.3 7.6±0.5
hlz-L-P1组 9.5±0.3 5.7±0.6 7.3±0.6
hlz-L-P2组 9.6±0.5 5.7±0.3 7.3±0.5
hlz-L-P3组 9.6±0.3 5.6±0.5 6.9±0.4
hlz-L-P4组 9.4±0.4 5.4±0.5 6.8±0.5
hlz-L-P5组 9.4±0.5 5.8±0.4 7.5±0.5
hlz-P1组 9.1±0.3 5.6±0.3 7.1±0.4
hlz-P2组 9.4±0.5 5.4±0.3 7.4±0.4
hlz-P3组 9.3±0.3 5.5±0.5 7.5±0.5
hlz-P4组 9.5±0.3 5.6±0.4 7.2±0.4
hlz-P5组 9.4±0.5 5.9±0.4 7.0±0.3
实验分组 (mmol/L) 血糖值(mmol/L) 血糖值(mmol/L)
GLP-1阳性对照组 9.6±0.3 5.4±0.5 8.2±0.4
生理盐水对照组 9.4±0.6 9.3±0.3 9.6±0.4
P1-L-hlz组 9.7±0.5 5.6±0.6 6.3±0.2
P2-L-hlz组 9.5±0.3 5.7±0.5 6.9±0.5
P3-L-hlz组 9.3±0.3 5.9±0.4 6.6±0.4
P4-L-hlz组 9.4±0.4 5.5±0.4 6.3±0.4
P5-L-hlz组 9.4±0.2 5.3±0.3 6.3±0.3
P1-hlz组 9.3±0.4 5.4±0.3 7.2±0.4
P2-hlz组 9.5±0.5 5.5±0.2 7.6±0.4
P3-hlz组 9.2±0.4 5.4±0.3 6.8±0.4
P4-hlz组 9.2±0.4 5.8±0.4 6.2±0.5
P5-hlz组 9.3±0.3 5.6±0.3 7.6±0.5
hlz-L-P1组 9.5±0.3 5.7±0.6 7.3±0.6
hlz-L-P2组 9.6±0.5 5.7±0.3 7.3±0.5
hlz-L-P3组 9.6±0.3 5.6±0.5 6.9±0.4
hlz-L-P4组 9.4±0.4 5.4±0.5 6.8±0.5
hlz-L-P5组 9.4±0.5 5.8±0.4 7.5±0.5
hlz-P1组 9.1±0.3 5.6±0.3 7.1±0.4
hlz-P2组 9.4±0.5 5.4±0.3 7.4±0.4
hlz-P3组 9.3±0.3 5.5±0.5 7.5±0.5
hlz-P4组 9.5±0.3 5.6±0.4 7.2±0.4
hlz-P5组 9.4±0.5 5.9±0.4 7.0±0.3
[0247] 从表1可以看出降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白实验组和GLP-1阳性对照组在连续给药10天后血糖值都降到了正常值的水平(正常大鼠血糖值4.9-6.2)，降血糖肽-人溶菌酶融合蛋白和GLP-1的活性是相同的。但是停药3天后GLP-1阳性对照组的血糖值又回复到了异常值，而降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白实验组的血糖值仍在正常值，说明降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白的活性能维持更长的时间即在体内的活性比GLP-1约延长3天。
[0248] 二、降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白刺激大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素和刺激胰岛β细胞增生作用
[0249] 体外进行原代细胞培养：取大鼠胰岛β细胞，胰蛋白酶消化成单个细胞后计数。5
24孔板中每孔加入10 个细胞，每组4孔。‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’组(分22组，每组4孔)每孔加入相应的‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’的终浓度为5μg/ml，GLP-1组每孔加入GLP-1的终浓度为1μg/ml，阴性对照组每孔加入牛血清白蛋白的终浓度为20μg/ml。细胞置37℃二氧化碳孵箱中培养，培养液为含低糖的DMEM/F2培养液。培养4小时后，每孔取出少量上清后继续培养。
24孔板中每孔加入10 个细胞，每组4孔。‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’组(分22组，每组4孔)每孔加入相应的‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’的终浓度为5μg/ml，GLP-1组每孔加入GLP-1的终浓度为1μg/ml，阴性对照组每孔加入牛血清白蛋白的终浓度为20μg/ml。细胞置37℃二氧化碳孵箱中培养，培养液为含低糖的DMEM/F2培养液。培养4小时后，每孔取出少量上清后继续培养。
[0250] 4小时上清中的胰岛素检测结果见表2，可以看出‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’各组和GLP-1阳性对照组上清中胰岛素的量明显要高于阴性对照组，说明‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’和GLP-1一样，具有刺激胰岛β细胞分泌胰岛素的功能。培养7天后将孔中的细胞消化并计数，结果见表2。结果显示‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’和GLP-1具有刺激大鼠胰岛β细胞增生的作用。
[0251] 三、降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白葡萄糖耐受作用：
[0252] 正常昆明种小白鼠220只，(每只体重在22g±2g)，分为22组，每组10只；一组为GLP-1对照组，另一组为生理盐水对照组；其余20组为‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’组；220只小鼠实验前饥饿16小时，并尾部采集血液，分离血清。‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’各组每只小鼠腹腔接种0.5ml，含25μg的‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’；GLP-1对照组每只腹腔接种0.5ml，含5μg的GLP-1；阴性对照组每只腹腔接种0.5ml的生理盐水；
于注射后2小时每只腹腔注射40％的葡萄糖0.2ml，30分钟后测定血糖。血糖测定结果如表3，从表中可以看出，小鼠注射GLP-1和‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’，均有较好的糖耐量反应，而且‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’效果要优于GLP-1阳性对照组。
于注射后2小时每只腹腔注射40％的葡萄糖0.2ml，30分钟后测定血糖。血糖测定结果如表3，从表中可以看出，小鼠注射GLP-1和‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’，均有较好的糖耐量反应，而且‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’效果要优于GLP-1阳性对照组。
[0253] 表2融合蛋白刺激大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素和刺激胰岛β细胞增生实验结果[0254]4小时上清中的 培养7天后平均
实验分组 胰岛素(μU) 每孔细胞数(×105个)
GLP-1阳性对照组 3.1±0.3 7.9
生理盐水对照组 0.4±0.4 0.8
P1-L-hlz组 3.8±0.3 8.9
P2-L-hlz组 3.2±0.4 8.2
P3-L-hlz组 2.8±0.2 8.0
P4-L-hlz组 3.6±0.4 8.1
P5-L-hlz组 3.0±0.3 7.9
P1-hlz组 2.8±0.2 6.9
P2-hlz组 2.9±0.5 7.4
P3-hlz组 3.1±0.5 7.7
P4-hlz组 3.2±0.3 8.2
P5-hlz组 2.9±0.3 7.5
hlz-L-P1组 2.8±0.5 7.5
hlz-L-P2组 2.6±0.3 6.1
hlz-L-P3组 3.1±0.4 6.3
hlz-L-P4组 3.4±0.6 6.0
hlz-L-P5组 2.3±0.3 5.9
hlz-P1组 2.8±0.3 7.0
hlz-P2组 2.3±0.3 6.1
hlz-P3组 2.6±0.2 7.3
hlz-P4组 3.4±0.4 6.7
hlz-P5组 3.0±0.4 6.6
实验分组 胰岛素(μU) 每孔细胞数(×105个)
GLP-1阳性对照组 3.1±0.3 7.9
生理盐水对照组 0.4±0.4 0.8
P1-L-hlz组 3.8±0.3 8.9
P2-L-hlz组 3.2±0.4 8.2
P3-L-hlz组 2.8±0.2 8.0
P4-L-hlz组 3.6±0.4 8.1
P5-L-hlz组 3.0±0.3 7.9
P1-hlz组 2.8±0.2 6.9
P2-hlz组 2.9±0.5 7.4
P3-hlz组 3.1±0.5 7.7
P4-hlz组 3.2±0.3 8.2
P5-hlz组 2.9±0.3 7.5
hlz-L-P1组 2.8±0.5 7.5
hlz-L-P2组 2.6±0.3 6.1
hlz-L-P3组 3.1±0.4 6.3
hlz-L-P4组 3.4±0.6 6.0
hlz-L-P5组 2.3±0.3 5.9
hlz-P1组 2.8±0.3 7.0
hlz-P2组 2.3±0.3 6.1
hlz-P3组 2.6±0.2 7.3
hlz-P4组 3.4±0.4 6.7
hlz-P5组 3.0±0.4 6.6
[0255] 表3 融合蛋白葡萄糖耐受作用实验结果
[0256]给药前血糖值 腹腔注射葡萄糖30分
实验分组 (mmol/L) 钟后血糖值(mmol/L)
GLP-1阳性对照组 5.2±0.3 14.6±1.5
生理盐水对照组 5.1±0.3 22.5±1.8
P1-L-hlz组 5.3±0.3 10.0±1.2
P2-L-hlz组 5.2±0.3 11.6±1.5
P3-L-hlz组 5.5±0.5 11.8±1.4
P4-L-hlz组 5.3±0.4 12.9±1.5
P5-L-hlz组 5.4±0.4 12.3±1.2
P1-hlz组 4.9±0.2 12.1±2.2
P2-hlz组 5.2±0.3 11.4±1.0
P3-hlz组 5.5±0.3 11.5±1.2
P4-hlz组 5.0±0.4 10.3±1.0
P5-hlz组 5.4±0.6 12.9±1.3
hlz-L-P1组 5.2±0.3 11.6±1.1
hlz-L-P2组 5.1±0.2 12.3±1.3
hlz-L-P3组 5.6±0.4 11.1±1.6
hlz-L-P4组 5.7±0.5 10.4±1.0
hlz-L-P5组 5.4±0.3 13.0±1.1
hlz-P1组 5.4±0.3 11.1±1.3
hlz-P2组 5.6±0.2 12.5±1.4
hlz-P3组 5.1±0.3 10.5±1.5
hlz-P4组 5.0±0.3 12.1±1.1
hlz-P5组 5.3±0.4 13.0±1.2
实验分组 (mmol/L) 钟后血糖值(mmol/L)
GLP-1阳性对照组 5.2±0.3 14.6±1.5
生理盐水对照组 5.1±0.3 22.5±1.8
P1-L-hlz组 5.3±0.3 10.0±1.2
P2-L-hlz组 5.2±0.3 11.6±1.5
P3-L-hlz组 5.5±0.5 11.8±1.4
P4-L-hlz组 5.3±0.4 12.9±1.5
P5-L-hlz组 5.4±0.4 12.3±1.2
P1-hlz组 4.9±0.2 12.1±2.2
P2-hlz组 5.2±0.3 11.4±1.0
P3-hlz组 5.5±0.3 11.5±1.2
P4-hlz组 5.0±0.4 10.3±1.0
P5-hlz组 5.4±0.6 12.9±1.3
hlz-L-P1组 5.2±0.3 11.6±1.1
hlz-L-P2组 5.1±0.2 12.3±1.3
hlz-L-P3组 5.6±0.4 11.1±1.6
hlz-L-P4组 5.7±0.5 10.4±1.0
hlz-L-P5组 5.4±0.3 13.0±1.1
hlz-P1组 5.4±0.3 11.1±1.3
hlz-P2组 5.6±0.2 12.5±1.4
hlz-P3组 5.1±0.3 10.5±1.5
hlz-P4组 5.0±0.3 12.1±1.1
hlz-P5组 5.3±0.4 13.0±1.2
[0257] 四、降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白的抗感染作用
[0258] 挑取一定量的金黄色葡球菌菌苔接种于2ml M-H液体培养基中，35℃培养6小时-1 -2 -3 -4后，取出用灭菌干酵母液进行适应稀释(10 、10 、10 、10 )，再取NOD小鼠，随机分组，每组5只鼠，分别腹腔感染不同菌量的受试菌液，测定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(Minimal Lethed dose，MLD)。用该菌量作为体内感染菌量。于感染后即刻静脉注射受试药液，阳性对照用人溶菌酶(Human Lysozyme，活性单位：30000单位/mg)，剂量50mg/kg，溶解在0.5ml生理盐水中。降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白的剂量也是按50mg/kg给药，溶解在0.5ml生理盐水中。阴性对照每只小鼠静脉注射0.5ml生理盐水。观察并记录小鼠死亡数，连续观察7-14天。结果见表4；从表中可以看出重组降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白与阳性对照人溶菌酶一样具有抗NOD小鼠感染的作用。
[0259] 表4 融合蛋白对NOD小鼠腹腔感染细菌所致败血症模型的治疗结果
[0260]实验分组 动物数(只)死亡数(只) 死亡率
人溶菌酶对照组 10 3 30％
生理盐水对照组 10 10 100％
P1-L-hlz组 10 3 30％
P2-L-hlz组 10 4 40％
P3-L-hlz组 10 4 40％
P4-L-hlz组 10 4 40％
P5-L-hlz组 10 4 40％
P1-hlz组 10 5 50％
P2-hlz组 10 5 50％
P3-hlz组 10 4 40％
P4-hlz组 10 6 30％
P5-hlz组 10 4 40％
hlz-L-P1组 10 3 30％
hlz-L-P2组 10 5 50％
hlz-L-P3组 10 4 40％
hlz-L-P4组 10 4 40％
hlz-L-P5组 10 5 50％
hlz-P1组 10 4 40％
hlz-P2组 10 5 50％
hlz-P3组 10 5 50％
hlz-P4组 10 4 40％
hlz-P5组 10 3 30％
人溶菌酶对照组 10 3 30％
生理盐水对照组 10 10 100％
P1-L-hlz组 10 3 30％
P2-L-hlz组 10 4 40％
P3-L-hlz组 10 4 40％
P4-L-hlz组 10 4 40％
P5-L-hlz组 10 4 40％
P1-hlz组 10 5 50％
P2-hlz组 10 5 50％
P3-hlz组 10 4 40％
P4-hlz组 10 6 30％
P5-hlz组 10 4 40％
hlz-L-P1组 10 3 30％
hlz-L-P2组 10 5 50％
hlz-L-P3组 10 4 40％
hlz-L-P4组 10 4 40％
hlz-L-P5组 10 5 50％
hlz-P1组 10 4 40％
hlz-P2组 10 5 50％
hlz-P3组 10 5 50％
hlz-P4组 10 4 40％
hlz-P5组 10 3 30％
[0261] 五、降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白清除AGEs和改善尿蛋白的作用
[0262] NOD小鼠220只，(每只体重在22g±2g)，分为22组，每组10只；一组为人溶菌酶对照组，另一组为生理盐水对照组；其余20组为‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’组；220只小鼠实验前采血和尿测定AGEs值和白蛋白/肌酸酐比值。检测用的AGEs抗体的制备按照文献报道的方法进行，即RNase与葡萄糖作用后形成的AGE-RNase作为免疫原，免疫兔子后获得的抗血清，然后采用竞争抑制法测定AGEs量。‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’各组每只小鼠腹腔接种0.5ml，含25μg的‘降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白’；人溶菌酶对照组每只腹腔接种0.5ml，含25μg的人溶菌酶；阴性对照组每只腹腔接种0.5ml的生理盐水；每天注射连续注射20天后采血和尿测定AGEs值和白蛋白/肌酸酐比值。结果如表5，从表中可以看出，降血糖肽与人溶菌酶融合重组蛋白与单纯人溶菌酶一样具有减轻NOD小鼠血中AGEs水平、促进尿中AGEs的排出、减轻蛋白尿的作用。
[0263] 表5降血糖肽与人溶菌酶融合蛋白清除AGE和改善尿蛋白结果
[0264]血中AGE(U/ml) 尿中AGE(U/ml) 尿蛋白(白蛋白/肌酸酐)
实验分组
给药前 给药后 给药前 给药后 给药前 给药后
人溶菌酶对照 32.6±6 20.5±4.2 215±53 404±64 0.9±0.1 0.4±0.1生理盐水对照 32.2±5 34.1±4.5 208±55 200±66 0.8±0.2 1.0±0.2P1-L-hlz组 31.8±7 21.5±4.4 208±56 405±70 0.9±0.4 0.3±0.1P2-L-hlz组 31.9±5 20.3±5.2 210±62 425±60 0.9±0.6 0.4±0.1P3-L-hlz组 32.4±6 22.2±4.2 206±60 430±66 1.0±0.5 0.4±0.2P4-L-hlz组 32.7±6 23.5±3.7 211±65 435±64 1.0±0.2 0.3±0.2P5-L-hlz组 33.6±5 19.5±4.6 218±63 451±60 0.9±0.3 0.4±0.2P1-hlz组 33.6±7 21.3±3.7 207±55 409±60 1.0±0.7 0.4±0.1
P1-hlz组 32.8±7 22.5±5.2 213±53 404±53 1.0±0.4 0.4±0.2
P3-hlz组 33.6±8 23.5±4.1 205±51 425±55 0.9±0.3 0.4±0.1
P4-hlz组 31.6±4 22.8±5.6 216±63 465±70 0.9±0.5 0.4±0.1
P5-hlz组 32.9±8 21.5±4.4 209±59 450±57 0.8±0.4 0.4±0.1
hlz-L-P1组 30.9±3 20.2±3.3 210±50 432±56 0.9±0.2 0.3±0.1hlz-L-P2组 33.3±4 21.5±5.0 214±60 445±45 0.8±0.4 0.5±0.1hlz-L-P3组 32.8±7 22.2±4.6 202±56 438±58 1.0±0.3 0.4±0.2hlz-L-P4组 33.6±8 23.7±3.7 200±54 461±63 0.9±0.3 0.3±0.1hlz-L-P5组 31.6±6 21.3±5.5 208±52 417±47 0.9±0.5 0.4±0.2hlz-P1组 31.7±5 20.2±3.2 217±60 451±53 1.0±0.6 0.4±0.1
hlz-P2组 30.6±7 21.5±3.2 215±50 437±57 0.9±0.6 0.4±0.2
hlz-P3组 32.3±5 22.1±4.1 210±58 440±55 0.8±0.2 0.3±0.1
hlz-P4组 31.6±9 20.5±3.6 205±55 437±68 0.9±0.7 0.4±0.2
hlz-P5组 31.7±7 21.3±3.8 212±60 426±56 0.9±0.8 0.4±0.1
实验分组
给药前 给药后 给药前 给药后 给药前 给药后
人溶菌酶对照 32.6±6 20.5±4.2 215±53 404±64 0.9±0.1 0.4±0.1生理盐水对照 32.2±5 34.1±4.5 208±55 200±66 0.8±0.2 1.0±0.2P1-L-hlz组 31.8±7 21.5±4.4 208±56 405±70 0.9±0.4 0.3±0.1P2-L-hlz组 31.9±5 20.3±5.2 210±62 425±60 0.9±0.6 0.4±0.1P3-L-hlz组 32.4±6 22.2±4.2 206±60 430±66 1.0±0.5 0.4±0.2P4-L-hlz组 32.7±6 23.5±3.7 211±65 435±64 1.0±0.2 0.3±0.2P5-L-hlz组 33.6±5 19.5±4.6 218±63 451±60 0.9±0.3 0.4±0.2P1-hlz组 33.6±7 21.3±3.7 207±55 409±60 1.0±0.7 0.4±0.1
P1-hlz组 32.8±7 22.5±5.2 213±53 404±53 1.0±0.4 0.4±0.2
P3-hlz组 33.6±8 23.5±4.1 205±51 425±55 0.9±0.3 0.4±0.1
P4-hlz组 31.6±4 22.8±5.6 216±63 465±70 0.9±0.5 0.4±0.1
P5-hlz组 32.9±8 21.5±4.4 209±59 450±57 0.8±0.4 0.4±0.1
hlz-L-P1组 30.9±3 20.2±3.3 210±50 432±56 0.9±0.2 0.3±0.1hlz-L-P2组 33.3±4 21.5±5.0 214±60 445±45 0.8±0.4 0.5±0.1hlz-L-P3组 32.8±7 22.2±4.6 202±56 438±58 1.0±0.3 0.4±0.2hlz-L-P4组 33.6±8 23.7±3.7 200±54 461±63 0.9±0.3 0.3±0.1hlz-L-P5组 31.6±6 21.3±5.5 208±52 417±47 0.9±0.5 0.4±0.2hlz-P1组 31.7±5 20.2±3.2 217±60 451±53 1.0±0.6 0.4±0.1
hlz-P2组 30.6±7 21.5±3.2 215±50 437±57 0.9±0.6 0.4±0.2
hlz-P3组 32.3±5 22.1±4.1 210±58 440±55 0.8±0.2 0.3±0.1
hlz-P4组 31.6±9 20.5±3.6 205±55 437±68 0.9±0.7 0.4±0.2
hlz-P5组 31.7±7 21.3±3.8 212±60 426±56 0.9±0.8 0.4±0.1
[0265] 序列表
[0266] <110>大连帝恩生物工程有限公司
[0267] <120>GLP-1及其类似物与人溶菌酶融合的重组蛋白及其用途
[0268] <160>33
[0269] <170>PatentIn version 3.3
[0270] <210>1
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[0313] His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly[0314] 1 5 10 15
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[0454] taggatccca tgctgaaggg acctttacca gtgatgtaag ttcttatttg gaaggccaag 60[0455] ctgcc 65[0456] <210>24
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[0520] cagtatgttc aaggttgtgg agtgcatggt gaagggacct ttaccagtga tgtaagttct 60[0521] tatttggaag gccaagctgc c 81