采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法

摘要

本发明属于医药原料的生产，特别是指采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法。在酶催化反应罐中，投入DL-对羟基苯海因和溶剂，调整DL-对羟基苯海因投料量为溶剂体积的4％-28％；加入为反应液总量的1-12％且酶活高于0.3U/mL的酶制剂，在pH为6.2-8.6、温度为30-44℃条件下搅拌反应；取样并用高压液相色谱检测反应，反应进行6-12h后，则有D-对羟基苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度降至0.25％以下时，反应结束。本发明解决了现有技术存在的溶液体积过大，产量低，能耗高的问题。具有在水系中实现了微生物催化转化从液—液到固—固工艺的革新，与现有一步酶法结合后形成了D-对羟基苯甘氨酸的全新生产技术；产率高，能耗低，合格率达99％以上等优点。

权利要求

1.采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于它包括如下工艺步骤：(1)在酶催化反应罐中，投入DL-对羟基苯海因和溶剂，调整DL-对羟基苯海因投料量为溶剂体积的4％-28％，其中溶剂选用无氧水；

(2)加入酶活高于0.3U/mL的酶制剂，加入量为反应液总质量的1-12％，在pH为

6.2-8.6、温度为30-44℃条件下，开始搅拌反应；所述的酶制剂包括海因酶制剂和N-氨甲酰胺水解酶制剂，以产生海因酶的菌株Arthrobacteraurescens和热稳定性的氨甲酰胺水解酶的菌株Agrobacteriumradiobacter利用生物发酵制备海因酶制剂和N-氨甲酰胺水解酶制剂；

(3)取样并用高压液相色谱检测反应情况，当反应进行6-12h后，则有D-对羟基苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度降至0.25％以下时，反应结束。

2.根据权利要求1所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)中酶制剂的酶活为高于0.55U/mL。

3.根据权利要求1所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的取样采用间隔3-6小时取样。

4.根据权利要求1所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)中的搅拌转速为40-110r/min。

5.根据权利要求1或4所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)中罐内压力低于0.06MPa。

6.根据权利要求1所述的采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(2)中酶制剂溶液的酶活为高于0.65U/mL。

说明书

采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法

技术领域

[0001] 本发明属于医药原料的生产，特别是指采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法。

背景技术

[0002] D-对羟基苯甘氨酸主要用于生产阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢哌酮和头孢曲嗪等半合抗。采用生物法生产的技术目前报道的有“两步酶法”和“一步酶法”两种，其酶源有假单孢杆菌Pseudomonas sp.和土壤放射菌Agrobacterium radiobacter。在均相工艺中这两株菌产生的酶可以用于DL-对羟基苯海因转化水解生产D-对羟基苯甘氨酸，而在非均相工艺中凸显其催化能力的不足，转化率低且反应时间过长。上述现有技术存在着装置的生产能力严重地受到D-对羟基苯甘氨酸本身溶解度很小的限制，液-液转化溶液体积过大，产量低，能耗高的问题。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法以解决现有均相转化工艺中存在的产量低、能耗高的问题。

[0004] 本发明属于一步酶法，其技术能实现的基础是以产生海因酶的菌株Arthrobacte raurescens和热稳定性的氨甲酰胺水解酶的菌株Agrobacterium radiobacter。并利用生物发酵制备海因酶制剂和N-氨甲酰胺水解酶制剂，以下所说的酶制剂包括海因酶制剂和N-氨甲酰胺水解酶制剂。

[0005] 本发明的整体技术解决方案是：

[0006] 采用非均相酶催化法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括如下工艺步骤：

[0007] (1)在酶催化反应罐中，投入DL-对羟基苯海因和溶剂，调整DL-对羟基苯海因投料量为溶剂体积的4％-28％；

[0008] (2)加入酶活高于0.3U/mL的酶制剂，加入量为反应液总质量的1-12％，在pH为6.2-8.6、温度为30-44℃条件下，开始搅拌反应；

[0009] (3)取样并用高压液相色谱检测反应情况，当反应进行6-12h后，则有D-对羟基苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度降至0.25％以下时，反应结束。

[0010] 本发明的具体工艺步骤和工艺条件是：

[0011] 步骤(1)中溶剂选用水。其中优选无氧水。

[0012] 步骤(2)中酶制剂的酶活高于0.4U/mL能满足实际要求，步骤(2)中酶制剂溶液的酶活高于0.55U/mL是比较适宜的，其中酶制剂溶液的酶活最好为高于0.65U/mL。

[0013] 步骤(3)中的取样采用间隔3-6小时取样。

[0014] 步骤(2)中的搅拌转速为40-110r/min。

[0015] 步骤(2)中罐内压力低于0.06Mpa。

[0016] 1、转化液转化率的测定及计算

[0017] 这里的转化率指的是将D，L-对羟基苯海因转化成D-对羟基苯甘氨酸的百分数。测定采用高压液相色谱法。

[0018] 具体测定步骤为：

[0019] 待转化反应完成后取10ml转化液于离心试管中，在3500-4000r/min的离心机上离心30min。待离心结束后取上清液1ml用事先配制好的流动相稀释200倍用高压液相色谱仪进行测量，并根据测量结果计算峰峰面积及转化率。

[0020] 转化率的计算公式如下所示：

[0021] Y＝X1/(X1+X2+----+Xn)×100％

[0022] 式中，Y为样品的转化率；

[0023] X1为样品中的D-对羟基苯甘氨酸的峰面积；

[0024] X2、....Xn分别为样品中其它成分的峰面积。

[0025] 2、根据转化的反应原理，在高浓度转化的过程中有氨气、二氧化碳及D-对羟基苯甘氨酸的产成，因此pH在转化过程中会呈现有规律的变化。在进入反应的后期，pH快速升高，从而强烈地抑制了N-氨甲酰胺水解酶的催化活性，导致反应速度减慢，甚至停止。

[0026] 3、pH值对转化率的影响

[0027] 根据取样检测结果，pH选用6.2-8.6是较为适宜的，且在该pH值下反应过程较短。pH增大或减小后，转化液达到相同转化率所需时间都显著变长。

[0028] 4、D，L-对羟基苯海因的加入量是一个较为重要的技术参数，当其投料量高于4％时，由于反应过程中生成的产物部分以晶体的方式析出，因此称为“非均相转化”，但是当其投料量过高，则会影响电机的转速，严重的甚至导致电机停转，影响物料的传质过程。所以，DL-对羟基苯海因投料量以不超过.28％较为适宜。

[0029] 本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

[0030] 在水系中实现了微生物催化转化从液——液到固——固工艺的革新，与现有一步酶法结合后形成了D-对羟基苯甘氨酸的全新生产技术；产率达到78-80％(w/w)，能耗降低40％以上，节水效果明显，产品一次合格率达到99％以上，达到了清洁生产的要求。

具体实施方式

[0031] 实施例1

[0032] 在300L的酶催化反应罐中，先加入无氧水210kg，然后投入D，L-对羟基苯海因27-28kg。在搅拌转速45r/min的条件下，再加入湿的酶活为0.5U/mL的酶制剂15kg。蒸汽加热、控制温度为32-44℃、罐内压力不超过0.05Mpa的条件下，搅拌反应。间隔3-6h取样并用高压液相色谱检测反应情况，当反应进行6-12h后，则有D-对羟基苯甘氨酸晶体开始析出，待反应体系中N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸0.25％以下时，反应基本结束，转化率在
99％以上。分离获得的粗晶经重结晶得到纯产品约13.5kg，溶液经提炼，得到成品约9kg，合计产率在80％以上。

[0033] 实施例2

[0034] 在300L的酶催化反应罐中，加入无氧水210kg，然后投入对羟基苯海因32-38kg。在搅拌转速65r/min的条件下，加入湿的酶活为0.62U/mL的酶制剂约15kg。加热、控制温