一种非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法转让专利
申请号 : CN200610086243.7
文献号 : CN1928116B
文献日 : 2010-07-21
发明人 : 徐岩 , 滕云
申请人 : 江南大学
摘要 :
一种非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法，属于非水相脂肪酶催化技术领域。本发明是利用脂肪酶在非水相体系中催化对硝基苯酚酯与醇之间的转酯化反应，反应一定时间后，吸取一定体积的反应液用0.1M的NaOH溶液萃取，用比色法于410nm处测定吸光度以确定对硝基苯酚的生成量，一个脂肪酶酶活单位定义为生成1μmol的对硝基苯酚所需的酶量。本发明用于高酯合成活性脂肪酶生产菌的直接筛选，将会得到目的性更强，更适合于非水相催化的脂肪酶生产菌。本发明方法与国际上已有的有关脂肪酶合成酶活力测定与筛选方法相比，无需气相色谱、液相色谱，无需价格昂贵的荧光底物和荧光分光光度计。
权利要求 :
1.一种非水相中脂肪酶的合成酶活力快速测定方法，其特征是利用脂肪酶在非水相体系中催化对硝基苯酚棕榈酸酯与乙醇之间的转酯化反应，转酯化反应条件为：对硝基苯酚棕榈酸酯浓度为10mM，乙醇浓度为1M，反应温度30-60℃，反应时间5-30分钟，摇床转速200转/分钟，酶浓度为0.01-0.3U；反应后，吸取50μl的反应液用1ml 0.1M的NaOH溶液在比色皿或多孔微孔板中萃取，用比色法于410nm处测定吸光度以确定对硝基苯酚的生成量，一个脂肪酶酶活单位定义为生成1μmol的对硝基苯酚所需的酶量。
2.根据权利要求1所述的非水相中脂肪酶的合成酶活力快速测定方法，其特征是用于在非水相中具有合成活性的脂肪酶生产菌的筛选，将脂肪酶生产菌培养一定时间后制备成细胞冻干粉或发酵液冻干粉后在比色皿或多孔微孔板中萃取、测定酶活，根据酶活高低筛选出目的菌株。
3.根据权利要求2所述的非水相中脂肪酶的合成酶活力快速测定方法，其特征是所用多孔微孔板为96孔微孔板进行萃取、测定酶活，以提高测定和/或筛选的效率。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法，可用在非水相中具有高酯合成活性的脂肪酶生产菌的筛选及酶活快速测定，属于非水相脂肪酶催化技术领域。
背景技术
脂肪酶作为一种甘油三酯水解酶，随着非水相酶学的不断深入和发展，已经成为非水相生物催化过程中用于有机合成的高效催化剂，能有效催化酯化与转酯化反应，已成功用于许多重要的化合物生产，如芳香酯、单甘酯、手性化合物以及生物柴油等等。脂肪酶种类多，催化特性千差万别，所以有目的的选择所需要的脂肪酶是催化过程的关键。
酶的选择取决于酶活力测定方法，因此针对不同的目的已经形成了许多种不同的脂肪酶酶活测定方法，绝大多数的脂肪酶酶活测定方法都是基于其水解特性，即测定的是脂肪酶的水解活力。然而问题在于有机相中的合成酶活和水相中的水解酶活不对应(Wu，Jaaskelainen et al.，Enzyme and MicrobialTechnology，1996，226)，根据水解酶活筛选得到的脂肪酶并不适合于酯化、转酯化反应和在非水相中进行催化。国外许多研究者在研究过程中均发现这一问题，并采取了一些手段来解决这一矛盾。因而一些研究者基于酯化和转酯化反应开发出了脂肪酶合成酶活的测定方法，这些方法大多采用GC、HPLC甚至滴定法测定酸或者酯的量以测定酶活，而这些方法的缺点在于当样品量大或用于筛选工作时将会需要大量的实验和时间消耗。针对以上缺点，Konarzycka-Bessler等人(Konarzycka-Bessler and Bornscheuer，AngewandteChemie-International Edition，2003，1418)开发了一种用于水解酶合成酶活高通量筛选的方法，和其原理相似Min Su Han等人(Han，Jung et al.，Journal ofOrganic Chemistry，2004，2583)也发明了一种用于测定有机相中蛋白酶转酯化活力的方法，两者均采用荧光显色的方法。然而并不是所有实验室都具备荧光分光光度计，并且荧光底物通常价格昂贵，且对反应溶剂要求高。
酶的选择取决于酶活力测定方法，因此针对不同的目的已经形成了许多种不同的脂肪酶酶活测定方法，绝大多数的脂肪酶酶活测定方法都是基于其水解特性，即测定的是脂肪酶的水解活力。然而问题在于有机相中的合成酶活和水相中的水解酶活不对应(Wu，Jaaskelainen et al.，Enzyme and MicrobialTechnology，1996，226)，根据水解酶活筛选得到的脂肪酶并不适合于酯化、转酯化反应和在非水相中进行催化。国外许多研究者在研究过程中均发现这一问题，并采取了一些手段来解决这一矛盾。因而一些研究者基于酯化和转酯化反应开发出了脂肪酶合成酶活的测定方法，这些方法大多采用GC、HPLC甚至滴定法测定酸或者酯的量以测定酶活，而这些方法的缺点在于当样品量大或用于筛选工作时将会需要大量的实验和时间消耗。针对以上缺点，Konarzycka-Bessler等人(Konarzycka-Bessler and Bornscheuer，AngewandteChemie-International Edition，2003，1418)开发了一种用于水解酶合成酶活高通量筛选的方法，和其原理相似Min Su Han等人(Han，Jung et al.，Journal ofOrganic Chemistry，2004，2583)也发明了一种用于测定有机相中蛋白酶转酯化活力的方法，两者均采用荧光显色的方法。然而并不是所有实验室都具备荧光分光光度计，并且荧光底物通常价格昂贵，且对反应溶剂要求高。
发明内容
(1)要解决的问题
本发明的目的是建立一种非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法，该方法用于脂肪酶生产菌的筛选。所用底物选择对硝基苯酚酯和乙醇，其价格低廉，且容易获得，采用普通分光光度法进行测定，测定方法简单易行，绝大多数实验室仪器可满足要求。
(2)技术方案
本发明利用脂肪酶在非水相体系中催化对硝基苯酚酯与醇之间的转酯化反应，反应5-30分钟后，吸取50μL的反应液用1ml0.1M的NaOH溶液在比色皿或多孔微孔板中萃取，用比色法于410nm处测定吸光度以确定对硝基苯酚的生成量，一个脂肪酶酶活单位定义为生成1μmol的对硝基苯酚所需的酶量。反应温度和反应时间对于不同的脂肪酶有所不同。本发明还可以根据脂肪酶不同的底物而特异性改变对硝基苯酚酯的碳链长度，适合于酯链长C4-C16的对硝基苯酚酯的转酯化反应所用脂肪酶的合成酶活力测定。可用于考察已知脂肪酶在非水相中的底物特异性，可用作筛选特定底物特异性的脂肪酶。
反应原理
所用底物对硝基苯酚酯为：对硝基苯酚丙酸酯，对硝基苯酚己酸酯，对硝基苯酚月桂酸酯或对硝基苯酚棕榈酸酯，所用底物醇为乙醇。
本发明所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法，转酯化反应条件为：对硝基苯酚酯浓度为10mM，醇浓度为1M，反应温度30-60℃，反应时间5-30分钟，摇床转速200转/分钟，酶浓度为0.01-0.3U。
该非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法，用于在非水相中具有合成活性的脂肪酶生产菌的筛选，将脂肪酶生产菌培养一定时间后制备成细胞冻干粉或发酵液冻干粉后在比色皿或多孔微孔板中萃取、测定酶活，根据酶活高低筛选出目的菌株。使用96孔微孔板进行萃取、测定酶活，以提高测定和/或筛选的效率。
以下采用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)与乙醇作为底物，对来源于Brukholderia sp.的商品化脂肪酶L-PS-C和来源于Rhizopus chinenisis CCTCCM201021的全细胞脂肪酶(实验室制备)进行更为详尽的研究。
测定方法的可行性
试剂及脂肪酶
共使用了5种商品化脂肪酶和一种自备全细胞脂肪酶，分别是：
L-G(Amano G，Penicillium sp.lipase)Amano Pharmaceutical公司；
L-PS-C(Amano PS-C，Brukholderia sp.lipase)Amano Pharmaceutical公司；
L-AY(Amano AY，Candida rugosa lipase)Amano Pharmaceutical公司；
L-CR(lipase from Candida rugosa)Sigma公司；
L-PP(lipase from Porcine Pancreas)Sigma公司，
L-Rh(lipase from Rhizopus chinenisis，全细胞冻干粉)实验室制备，制备方法参见(Xu，Wang et al.，Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2002(18)，29-37)。
pNPP(对硝基苯酚棕榈酸酯)购于Sigma公司，其他试剂均为分析纯或者色谱纯。
比色法测定合成酶活的典型过程：准确称取189mg pNPP溶于50mL经4分子筛除去水分的正庚烷中，配制成10mM的溶液。各脂肪酶2.5-10mg，加入到2mL的具塞塑料管中。加入0.5ml上述pNPP正庚烷溶液，然后加入30μL经4分子筛除去水分的无水乙醇(浓度约为1M)。200rmp，30-60℃条件下反应5-30分钟，取50μL反应液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，于410nm处测定吸光度，若吸光值偏高，则将反应液稀释一定浓度后测定。仪器为尤尼柯UNICOUV-2102 PC紫外可见分光光度计，1mL玻璃或者塑料比色皿。酶活的计算根据pNP(对硝基苯酚)标准浓度溶液绘制的标准曲线计算，一个酶活单位定义为生成1μmol pNP所需的酶量。
与本方法对照的脂肪酶合成酶活力测定方法为用气相色谱检测棕榈酸乙酯的生成量：取上述反应液150μL，用3mL 0.1M NaOH溶液萃取，混匀后离心，取上层清液加入一定量浓度的2-己醇内标后气相检测。色谱条件为初始温度150℃，10℃/min升至220℃，保持10min，进样口温度250℃，检测器温度250℃。气相色谱为Agilent 6820，色谱柱为AC20(PEG20000)，检测器为FID。
与本方法对照的脂肪酶合成酶活力测定方法为脂肪酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活测定：辛酸和无水乙醇分别溶于正庚烷，浓度分别为0.6M和0.72M。分别取0.5mL反应底物于具塞塑料管中，加入约20mg脂肪酶，40℃，150rmp下振荡反应30min。离心，取0.4mL上清液，加入0.1mL内标2-己醇，混匀，同时空白对照，气相色谱法测定。气相色谱测定条件为：初始温度90℃，保持1min，10℃/min升温至200℃，保持5min，检测器温度250℃，进样器温度250℃。气相色谱为Agilent 6820，色谱柱为AC20(PEG20000)，检测器为FID。在测定条件下，每分钟转化1μmol辛酸乙酯的酶量定义为1个脂肪酶合成酶活单位。
本发明测定方法的最佳测定范围与测定条件
反应温度：不同脂肪酶对温度的稳定性不同，对于非水相催化反应酶的温度稳定性要远好于水相催化反应。本测定方法在温度30℃-60℃之间对于大多数脂肪酶而言都是有效的。
转速：由于非水相催化大多为固液两相体系，而对于固液两相系统，底物的传质阻力是必然存在的，特别是对于固定化酶而言。第一层传质阻力来源于固体催化剂表面所包裹的溶剂层，也称之为外扩散阻力。当酶的反应速度远小于底物扩散速度时，外扩散阻力不成为限制因素，而当酶的反应速度快时，外扩散阻力则为限制性因素。以脂肪酶L-PS-C为例，L-PS-C催化反应的速度较快，随着转速的加快反应速度显著提高说明该反应为外扩散阻力控制，当转速达到200rmp以上时，扩散阻力基本消失。对于本测定方法200rmp的转速可满足要求。
底物浓度：酶活测定所需的底物浓度对于不同的酶而言差异很大，分别以脂肪酶L-PS-C和L-Rh全细胞脂肪酶为例，按上述比色法测定合成酶活的典型过程测定pNPP浓度在2.5-70mM范围内的反应速率，采用Lineweaver-Burk法求得Km值。综合考虑为使该方法对大多脂肪酶具有更好的通用性，采用10mM的对硝基苯酚酯浓度作为反应浓度，乙醇浓度为1M。
酶浓度：酶浓度对于测定方法也是至关重要的，酶浓度过低会使得酶活检测不到，而酶浓度过高则导致所测酶活不准确。仍然以酶活高的脂肪酶L-PS-C和酶活相对较低的L-Rh全细胞脂肪酶为例。按上述比色法测定合成酶活的典型过程，定时取样测定不同酶浓度条件下的转化曲线，称取不同质量的酶加入到反应体系中，以此控制反应体系中的酶浓度。以酶浓度和反应速率绘制曲线，考察加酶浓度的最适范围。结果表明当酶浓度在0.01-0.3U之间可以较准确地测定酶活。1U即为生成1μmol pNP所需的脂肪酶的量。
综上所述，得出本测定方法的最佳测定条件(即转酯化条件)如下：底物浓度对硝基苯酚酯10mM，乙醇1M；反应温度30℃-60℃；反应时间5-30分钟，摇床转速200rmp；酶浓度0.01-0.3U。
(3)有益效果
本发明建立了一种适用于非水相中脂肪酶合成酶活力快速测定与筛选方法，能在酶量较小的情况下准确测定其合成酶活。所用底物易得，测定方法简单，能快速测定脂肪酶合成酶活。对任意选取的6种脂肪酶采用不同合成酶活测定方法进行检测，与本测定方法进行比较，证明了本测定方法的可行性。对一种商品化酶L-PS-C和L-Rh全细胞脂肪酶采用本测定方法进行了详细研究，在确定最佳测定条件的同时也验证了本方法能有效测定脂肪酶非水相体系中的合成酶活。
本发明与传统的脂肪酶酶活力测定方法相比，根据水解酶活与非水相中的合成活性无必然联系这一现象，突出了非水相中脂肪酶的催化特性。将本发明用于高合成酶活脂肪酶生产菌的直接筛选，将会得到目的性更强，更适合于非水相催化的脂肪酶生产菌。本发明方法与国际上已有的有关脂肪酶合成酶活测定与筛选方法相比，无需气相色谱、液相色谱，无需价格昂贵的荧光底物和荧光分光光度计。
本发明的目的是建立一种非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法，该方法用于脂肪酶生产菌的筛选。所用底物选择对硝基苯酚酯和乙醇，其价格低廉，且容易获得，采用普通分光光度法进行测定，测定方法简单易行，绝大多数实验室仪器可满足要求。
(2)技术方案
本发明利用脂肪酶在非水相体系中催化对硝基苯酚酯与醇之间的转酯化反应，反应5-30分钟后，吸取50μL的反应液用1ml0.1M的NaOH溶液在比色皿或多孔微孔板中萃取，用比色法于410nm处测定吸光度以确定对硝基苯酚的生成量，一个脂肪酶酶活单位定义为生成1μmol的对硝基苯酚所需的酶量。反应温度和反应时间对于不同的脂肪酶有所不同。本发明还可以根据脂肪酶不同的底物而特异性改变对硝基苯酚酯的碳链长度，适合于酯链长C4-C16的对硝基苯酚酯的转酯化反应所用脂肪酶的合成酶活力测定。可用于考察已知脂肪酶在非水相中的底物特异性，可用作筛选特定底物特异性的脂肪酶。
反应原理
所用底物对硝基苯酚酯为：对硝基苯酚丙酸酯，对硝基苯酚己酸酯，对硝基苯酚月桂酸酯或对硝基苯酚棕榈酸酯，所用底物醇为乙醇。
本发明所述的非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法，转酯化反应条件为：对硝基苯酚酯浓度为10mM，醇浓度为1M，反应温度30-60℃，反应时间5-30分钟，摇床转速200转/分钟，酶浓度为0.01-0.3U。
该非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法，用于在非水相中具有合成活性的脂肪酶生产菌的筛选，将脂肪酶生产菌培养一定时间后制备成细胞冻干粉或发酵液冻干粉后在比色皿或多孔微孔板中萃取、测定酶活，根据酶活高低筛选出目的菌株。使用96孔微孔板进行萃取、测定酶活，以提高测定和/或筛选的效率。
以下采用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)与乙醇作为底物，对来源于Brukholderia sp.的商品化脂肪酶L-PS-C和来源于Rhizopus chinenisis CCTCCM201021的全细胞脂肪酶(实验室制备)进行更为详尽的研究。
测定方法的可行性
试剂及脂肪酶
共使用了5种商品化脂肪酶和一种自备全细胞脂肪酶，分别是：
L-G(Amano G，Penicillium sp.lipase)Amano Pharmaceutical公司；
L-PS-C(Amano PS-C，Brukholderia sp.lipase)Amano Pharmaceutical公司；
L-AY(Amano AY，Candida rugosa lipase)Amano Pharmaceutical公司；
L-CR(lipase from Candida rugosa)Sigma公司；
L-PP(lipase from Porcine Pancreas)Sigma公司，
L-Rh(lipase from Rhizopus chinenisis，全细胞冻干粉)实验室制备，制备方法参见(Xu，Wang et al.，Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2002(18)，29-37)。
pNPP(对硝基苯酚棕榈酸酯)购于Sigma公司，其他试剂均为分析纯或者色谱纯。
比色法测定合成酶活的典型过程：准确称取189mg pNPP溶于50mL经4分子筛除去水分的正庚烷中，配制成10mM的溶液。各脂肪酶2.5-10mg，加入到2mL的具塞塑料管中。加入0.5ml上述pNPP正庚烷溶液，然后加入30μL经4分子筛除去水分的无水乙醇(浓度约为1M)。200rmp，30-60℃条件下反应5-30分钟，取50μL反应液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，于410nm处测定吸光度，若吸光值偏高，则将反应液稀释一定浓度后测定。仪器为尤尼柯UNICOUV-2102 PC紫外可见分光光度计，1mL玻璃或者塑料比色皿。酶活的计算根据pNP(对硝基苯酚)标准浓度溶液绘制的标准曲线计算，一个酶活单位定义为生成1μmol pNP所需的酶量。
与本方法对照的脂肪酶合成酶活力测定方法为用气相色谱检测棕榈酸乙酯的生成量：取上述反应液150μL，用3mL 0.1M NaOH溶液萃取，混匀后离心，取上层清液加入一定量浓度的2-己醇内标后气相检测。色谱条件为初始温度150℃，10℃/min升至220℃，保持10min，进样口温度250℃，检测器温度250℃。气相色谱为Agilent 6820，色谱柱为AC20(PEG20000)，检测器为FID。
与本方法对照的脂肪酶合成酶活力测定方法为脂肪酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活测定：辛酸和无水乙醇分别溶于正庚烷，浓度分别为0.6M和0.72M。分别取0.5mL反应底物于具塞塑料管中，加入约20mg脂肪酶，40℃，150rmp下振荡反应30min。离心，取0.4mL上清液，加入0.1mL内标2-己醇，混匀，同时空白对照，气相色谱法测定。气相色谱测定条件为：初始温度90℃，保持1min，10℃/min升温至200℃，保持5min，检测器温度250℃，进样器温度250℃。气相色谱为Agilent 6820，色谱柱为AC20(PEG20000)，检测器为FID。在测定条件下，每分钟转化1μmol辛酸乙酯的酶量定义为1个脂肪酶合成酶活单位。
本发明测定方法的最佳测定范围与测定条件
反应温度：不同脂肪酶对温度的稳定性不同，对于非水相催化反应酶的温度稳定性要远好于水相催化反应。本测定方法在温度30℃-60℃之间对于大多数脂肪酶而言都是有效的。
转速：由于非水相催化大多为固液两相体系，而对于固液两相系统，底物的传质阻力是必然存在的，特别是对于固定化酶而言。第一层传质阻力来源于固体催化剂表面所包裹的溶剂层，也称之为外扩散阻力。当酶的反应速度远小于底物扩散速度时，外扩散阻力不成为限制因素，而当酶的反应速度快时，外扩散阻力则为限制性因素。以脂肪酶L-PS-C为例，L-PS-C催化反应的速度较快，随着转速的加快反应速度显著提高说明该反应为外扩散阻力控制，当转速达到200rmp以上时，扩散阻力基本消失。对于本测定方法200rmp的转速可满足要求。
底物浓度：酶活测定所需的底物浓度对于不同的酶而言差异很大，分别以脂肪酶L-PS-C和L-Rh全细胞脂肪酶为例，按上述比色法测定合成酶活的典型过程测定pNPP浓度在2.5-70mM范围内的反应速率，采用Lineweaver-Burk法求得Km值。综合考虑为使该方法对大多脂肪酶具有更好的通用性，采用10mM的对硝基苯酚酯浓度作为反应浓度，乙醇浓度为1M。
酶浓度：酶浓度对于测定方法也是至关重要的，酶浓度过低会使得酶活检测不到，而酶浓度过高则导致所测酶活不准确。仍然以酶活高的脂肪酶L-PS-C和酶活相对较低的L-Rh全细胞脂肪酶为例。按上述比色法测定合成酶活的典型过程，定时取样测定不同酶浓度条件下的转化曲线，称取不同质量的酶加入到反应体系中，以此控制反应体系中的酶浓度。以酶浓度和反应速率绘制曲线，考察加酶浓度的最适范围。结果表明当酶浓度在0.01-0.3U之间可以较准确地测定酶活。1U即为生成1μmol pNP所需的脂肪酶的量。
综上所述，得出本测定方法的最佳测定条件(即转酯化条件)如下：底物浓度对硝基苯酚酯10mM，乙醇1M；反应温度30℃-60℃；反应时间5-30分钟，摇床转速200rmp；酶浓度0.01-0.3U。
(3)有益效果
本发明建立了一种适用于非水相中脂肪酶合成酶活力快速测定与筛选方法，能在酶量较小的情况下准确测定其合成酶活。所用底物易得，测定方法简单，能快速测定脂肪酶合成酶活。对任意选取的6种脂肪酶采用不同合成酶活测定方法进行检测，与本测定方法进行比较，证明了本测定方法的可行性。对一种商品化酶L-PS-C和L-Rh全细胞脂肪酶采用本测定方法进行了详细研究，在确定最佳测定条件的同时也验证了本方法能有效测定脂肪酶非水相体系中的合成酶活。
本发明与传统的脂肪酶酶活力测定方法相比，根据水解酶活与非水相中的合成活性无必然联系这一现象，突出了非水相中脂肪酶的催化特性。将本发明用于高合成酶活脂肪酶生产菌的直接筛选，将会得到目的性更强，更适合于非水相催化的脂肪酶生产菌。本发明方法与国际上已有的有关脂肪酶合成酶活测定与筛选方法相比，无需气相色谱、液相色谱，无需价格昂贵的荧光底物和荧光分光光度计。
附图说明
图1本发明方法(方法I)与方法III的相关度
方法I：比色法测定合成酶活；方法III：脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活测定。
方法I：比色法测定合成酶活；方法III：脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活测定。
具体实施方式
实施例1 用本发明方法对6种脂肪酶进行验证
选上述6种脂肪酶，用本发明所述的测定方法进行了验证，并且为本测定方法用于脂肪酶非水相合成酶活力测定的可行性提供了有力证明，结果见表1。由于以上反应不是在最佳酶活测定条件下的结果，所以均以转化率表示该酶催化合成活力的大小。气相色谱检测棕榈酸乙酯的生成量的结果(表1中的方法II)和采用比色法测定的结果(表1中的方法I)相关度为90％，说明本发明的测定方法是可行的，且本发明所采用之检测方法能有效测定脂肪酶催化对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)与乙醇的转酯化反应。将比色法测定的结果(表1中的方法I)与脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活测定结果(表1中的方法III)进行比较，六种脂肪酶用此两种方法测定得到的合成酶活相关度在80％以上，而造成这一结果的原因是不同来源的脂肪酶底物特异性不同，从而导致了测定结果有所差别，但总体而言，本发明的测定方法，能有效测定脂肪酶非水相中的合成酶活。
表1
脂肪酶 方法I (转化率/％) 方法II (转化率/％) 方法III (转化率/％) L-G L-PS-C L-CR L-PP L-Rh L-AY 0 74.5 2.4 0.8 18.1 0 0 74.3 2.1 0.76 16.4 0 0.41 61.6 1.3 1.95 8.4 0.18
方法I：比色法测定1小时内的转化率
方法II：气相色谱检测棕榈酸乙酯的转化率
方法III：脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的转化率
实施例2用本发明方法进行L-PS-C脂肪酶酶活力测定
称取2.5mg L-PS-C脂肪酶置于2mL的具塞塑料管，加入0.5mL 10mM的pNPP正庚烷溶液和经4分子筛除去水分的30μL无水乙醇，200rmp，50℃条件下反应5min，取50μL反应液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，于410nm处测定吸光度，测得酶活为140.1U/g。
实施例3 用本发明方法进行L-Rh全细胞脂肪酶酶活力测定
称取10mg L-Rh全细胞脂肪酶置于2mL的具塞塑料管，加入0.5mL 10mM的pNPP正庚烷溶液和经4分子筛除去水分的30μL无水乙醇，200rmp，40℃条件下反应30min，取50μL反应液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，于410nm处测定吸光度，测得酶活为5.6U/g。
实施例4 脂肪酶生产菌筛选
对于脂肪酶生产菌，需要筛选得到一株能在非水相中具有高合成活性的菌，采用气相或液相检测需要面对的将是巨大的工作量。从我们菌种选育过程中挑选出30株菌，制备成冻干粉，制备方法参见(Xu，Wang et al.，Journal of MolecularCatalysis B-Enzymatic，2002(18)，29-37)。采用上述脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活测定方法测定各菌的合成酶活，同时采用本发明之方法测定合成酶活，结果见附图1。结果显示两种测定方法有较高的相关性，相关度接近83％，表明分光光度法能用于全细胞脂肪酶非水相中合成酶活的测定，并且将该方法用于高合成活性脂肪酶筛选的初筛，和以脂肪酶水解酶活作为初筛手段相比，可大大提高筛选效率和准确性。
实施例5
96孔板用于该测定方法的测定，提高测定效率。采用8×12型96微孔板，称取一定量的酶粉于An-Fn(n＝1，3，5，7，9，11)孔中，或者将可溶性的酶粉溶于缓冲，按应加入的酶量加入酶液，冻干后备用，Am-Fm(m＝2，4，6，8，10，12)孔中加入250μL 0.1M NaOH溶液。反应时An-Fn加入200μL上述比色法测定合成酶活的典型过程中的pNPP正庚烷溶液，加入12μL无水乙醇，反应一定时间后8通道移液器吸取20μL反应液加入到相邻的加有0.1M NaOH溶液的孔中，410nm处测定吸光度。
选上述6种脂肪酶，用本发明所述的测定方法进行了验证，并且为本测定方法用于脂肪酶非水相合成酶活力测定的可行性提供了有力证明，结果见表1。由于以上反应不是在最佳酶活测定条件下的结果，所以均以转化率表示该酶催化合成活力的大小。气相色谱检测棕榈酸乙酯的生成量的结果(表1中的方法II)和采用比色法测定的结果(表1中的方法I)相关度为90％，说明本发明的测定方法是可行的，且本发明所采用之检测方法能有效测定脂肪酶催化对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)与乙醇的转酯化反应。将比色法测定的结果(表1中的方法I)与脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活测定结果(表1中的方法III)进行比较，六种脂肪酶用此两种方法测定得到的合成酶活相关度在80％以上，而造成这一结果的原因是不同来源的脂肪酶底物特异性不同，从而导致了测定结果有所差别，但总体而言，本发明的测定方法，能有效测定脂肪酶非水相中的合成酶活。
表1
脂肪酶 方法I (转化率/％) 方法II (转化率/％) 方法III (转化率/％) L-G L-PS-C L-CR L-PP L-Rh L-AY 0 74.5 2.4 0.8 18.1 0 0 74.3 2.1 0.76 16.4 0 0.41 61.6 1.3 1.95 8.4 0.18
方法I：比色法测定1小时内的转化率
方法II：气相色谱检测棕榈酸乙酯的转化率
方法III：脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的转化率
实施例2用本发明方法进行L-PS-C脂肪酶酶活力测定
称取2.5mg L-PS-C脂肪酶置于2mL的具塞塑料管，加入0.5mL 10mM的pNPP正庚烷溶液和经4分子筛除去水分的30μL无水乙醇，200rmp，50℃条件下反应5min，取50μL反应液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，于410nm处测定吸光度，测得酶活为140.1U/g。
实施例3 用本发明方法进行L-Rh全细胞脂肪酶酶活力测定
称取10mg L-Rh全细胞脂肪酶置于2mL的具塞塑料管，加入0.5mL 10mM的pNPP正庚烷溶液和经4分子筛除去水分的30μL无水乙醇，200rmp，40℃条件下反应30min，取50μL反应液用1mL 0.1M NaOH溶液萃取，于410nm处测定吸光度，测得酶活为5.6U/g。
实施例4 脂肪酶生产菌筛选
对于脂肪酶生产菌，需要筛选得到一株能在非水相中具有高合成活性的菌，采用气相或液相检测需要面对的将是巨大的工作量。从我们菌种选育过程中挑选出30株菌，制备成冻干粉，制备方法参见(Xu，Wang et al.，Journal of MolecularCatalysis B-Enzymatic，2002(18)，29-37)。采用上述脂肪酶酶催化合成辛酸乙酯的合成酶活测定方法测定各菌的合成酶活，同时采用本发明之方法测定合成酶活，结果见附图1。结果显示两种测定方法有较高的相关性，相关度接近83％，表明分光光度法能用于全细胞脂肪酶非水相中合成酶活的测定，并且将该方法用于高合成活性脂肪酶筛选的初筛，和以脂肪酶水解酶活作为初筛手段相比，可大大提高筛选效率和准确性。
实施例5
96孔板用于该测定方法的测定，提高测定效率。采用8×12型96微孔板，称取一定量的酶粉于An-Fn(n＝1，3，5，7，9，11)孔中，或者将可溶性的酶粉溶于缓冲，按应加入的酶量加入酶液，冻干后备用，Am-Fm(m＝2，4，6，8，10，12)孔中加入250μL 0.1M NaOH溶液。反应时An-Fn加入200μL上述比色法测定合成酶活的典型过程中的pNPP正庚烷溶液，加入12μL无水乙醇，反应一定时间后8通道移液器吸取20μL反应液加入到相邻的加有0.1M NaOH溶液的孔中，410nm处测定吸光度。