包含脂质体的射线照相造影剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种射线照相造影剂，其含有具有窄的囊泡尺寸分布且含有包含含聚氧化烯烃基基团化合物和/或甾醇的脂质膜的脂质体，并且该脂质体包封了水溶性的非离子型碘化合物。将脂质膜内封闭了水相的脂质体分散在含水介质中，优选地，水相和含水介质均含有碘化合物和添加剂，并且碘化合物的浓度和添加剂的浓度在水相和含水介质中都分别基本上相等，其中碘化合物与脂质膜的重量比为1～10。该造影剂通过超临界二氧化碳法制备得到，并因此基本上不含有毒溶剂如含氯溶剂。

权利要求

1.一种射线照相造影剂，其包含脂质体，该脂质体包含水溶性非离子型碘化合物，并且该造影剂基本上不含含氯溶剂，其中所述脂质体通过下述方法进行制备，该方法是将磷脂与超临界二氧化碳或者亚临界二氧化碳混合，以及使水溶性非离子碘化合物与磷脂接触而形成脂质体。

2.根据权利要求1的造影剂，其中所述脂质体基本上是单层囊泡。

3.根据权利要求1的造影剂，其中所述碘化合物包含至少一个2，4，6-三碘苯基基团。

4.根据权利要求1的造影剂，其中所述脂质体的平均尺寸为0.05到0.5μm。

5.根据权利要求4的造影剂，其中所述平均尺寸为0.05到0.2μm。

6.根据权利要求5的造影剂，其中所述平均尺寸为0.11到0.13μm。

7.根据权利要求1的造影剂，其中所述脂质体是PEG修饰的脂质体，每个该脂质体含有经具有10到3500个氧化乙烯单元的PEG修饰的脂质膜，该PEG的量为基于形成脂质体的脂质的0.1重量％到30重量％。

8.根据权利要求1的造影剂，其中所述脂质体是经具有0.1到0.4μm孔径的过滤器过滤的脂质体。

9.根据权利要求1的造影剂，其中所述脂质体包含碘化合物，该碘化合物与脂质体膜脂质的重量比为1～10。

10.根据权利要求9的造影剂，其中重量比为3～8。

11.根据权利要求10的造影剂，其中重量比为5～8。

12.根据权利要求1的造影剂，其中包封在脂质体内的碘化合物占造影剂中全部碘化合物重量的5％到30％。

13.根据权利要求1的造影剂，其中每个脂质体含有脂质膜和包封在脂质膜内的水相，该脂质膜含有选自含有聚氧化烯烃基团的化合物和甾醇中的至少一种，并且水相包含碘化合物。

14.根据权利要求1的造影剂，其中每个脂质体含有脂质膜和包封在脂质膜内的水相，该脂质膜含有经聚氧化烯烃修饰的磷脂，且水相包含碘化合物。

15.根据权利要求1的造影剂，其中每个脂质体含有脂质膜和包封在脂质膜内的水相，该脂质膜含有聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，且水相包含碘化合物。

16.根据权利要求1的造影剂，其中含有脂质膜和包封在脂质膜内的水相的脂质体分散在含水介质中，所述水相和含水介质均包含碘化合物和添加剂，并且在水相和含水介质中的碘化合物浓度基本相同，在水相和含水介质中的添加剂浓度基本相同。

17.根据权利要求16的造影剂，其中添加剂是水溶性的胺类缓冲剂或螯合剂。

18.根据权利要求17的造影剂，其中胺类缓冲剂是氨基丁三醇。

19.根据权利要求17的造影剂，其中螯合剂是EDTANa2-Ca。

20.一种制备射线照相造影剂的方法，包括以下步骤：

将磷脂与超临界二氧化碳或者亚临界二氧化碳混合以形成混合物，以及使得水溶性的非离子型碘化合物与磷脂接触以形成包含了碘化合物的脂质体。

21.根据权利要求20的方法，其中该方法包括以下步骤：

将磷脂与超临界二氧化碳或者亚临界二氧化碳混合以形成混合物，将包含非离子型的碘化合物的水溶液导入到混合物中，以及

排出二氧化碳以形成包封了碘化合物的脂质体。

2

22.根据权利要求20的方法，其中向二氧化碳施用50到500kg/cm 的压力。

23.根据权利要求20的方法，其中向二氧化碳施用25到200℃的温度。

24.根据权利要求21的方法，其中将选自由聚氧化烯烃修饰的磷脂、包含聚氧化烯烃基基团的化合物、包含聚乙二醇基团的化合物和甾醇中的至少一种进一步与超临界二氧化碳或者亚临界二氧化碳混合，然后，向该混合物中导入含有非离子型碘化合物的水溶液，再排出二氧化碳以形成包封了碘化合物的脂质体；该方法还包括使用0.1到0.4μm孔径的过滤器过滤脂质体。

25.根据权利要求21的方法，其中将选自由聚氧化烯烃修饰的磷脂和甾醇中的至少一种进一步与超临界二氧化碳或者亚临界二氧化碳混合，然后，向该混合物中导入含有非离子型碘化合物和添加剂的水溶液并排出二氧化碳，以形成包封了碘化合物和添加剂的脂质体；该方法还包括使用0.1到0.4μm孔径的过滤器过滤脂质体以形成含有脂质膜和包封于脂质膜内的水相的脂质体，该脂质体被分散在含水介质中，所述水相和含水介质均包含碘化合物和添加剂，并且在水相和含水介质中的碘化合物浓度基本相同，在水相和含水介质中的添加剂浓度基本相同。

说明书

包含脂质体的射线照相造影剂及其制备方法

发明领域

[0001] 本发明涉及在射线照相法中使用的非口服造影剂，特别是涉及含有包封了造影剂材料的脂质体的射线照相造影剂。

[0002] 发明背景

[0003] 简单的X射线照相术和计算机X射线断层造影是当前医学影像诊断的核心。所谓的硬度大的组织例如骨骼和牙齿能够有效的吸收X射线，因此可以得到高对比度的X射线影像。反之，不同的软组织之间吸收X射线的差别相对小，难于获得高对比度的影像。此时，通常使用造影剂来获得高对比度的影像。

[0004] 当前实际应用的X射线造影剂几乎全部都是包含三碘苯基基团的水溶性化合物的造影剂材料。造影剂被送入内腔区域中，例如血管、输尿管或者输卵管，用来检查内腔的形状和狭窄。然而，由于上述化合物没有与组织或疾病区域相互作用而迅速从内腔区域流出，这不益于对组织或疾病区域具体例如癌组织的详细检查。所以，期望有一种X射线造影剂能够选择性积聚于目标组织或疾病区域之内/或之上，由此获得和周围或其他区域具有清晰对比区别的影像。这样的造影剂能够对即使微小量的癌组织进行准确检测。不但X射线照相术而且其它基于不同测量原理的方法也已经发展成为定位肿瘤的检查方法。例如，MRI(核磁共振成像)在癌组织具体例如微小量的癌组织的精确成像中显示出有限的灵敏度，PET(正发射X射线断层造影)由于其需暴露于放射线中和其操作成本而没有普遍应用，上面两种方法都需要大型的设备和昂贵的仪器，仍都不是常规使用的检查方法。

[0005] 国际公开WO98/46275、同WO95/31181、同WO96/28414、同WO96/00089，美国专利号4873075和4567034公开的方法中将疏水性的碘化合物分散在存有表面活性剂或脂肪的水中，以使肿瘤、肝脏、脾脏、肾上腺皮质、动脉硬化巢、脉管和淋巴系统成像。在上述方法中，微粒造影剂的使用延长了它的内部保留时间，以选择性增强疾病区域的影象对比。然而，为了这个目的而提出的药学制剂在增强对比效率和选择性方面是不足的。而且，其中使用的碘化合物是疏水性的，因此成像之后向外排出会受到阻碍，产生一些问题，比如增加病人的不适。

[0006] 此外，对于生成微粒形式造影剂这一技术的方法进行了研究，该方法中造影剂化合物被包封在脂质体内，该脂质体含有与生物膜类似的脂类，并且由于它的低抗原性而显示出高安全性。国际公开WO88/09165、同WO89/00988、同WO90/07491，JP-A No.07-316079和2003-5596(在下文中，术语JP-A指日本专利申请公开)提出了一种包含离子或非离子型造影剂的脂质体。日本专利号2619307公开了一种方法，其中水溶性的碘化合物被包封在脂质体内，通过将脂质体内碘化合物的量增加到1.5至6g/g类脂会增强器官选择性。然而，这种方法被证明对肿瘤是低选择性的。推断这可能是由于尺寸为0.5-1.0μm的相对大的粒子。大约0.1μm的粒子可能更适合积聚在肿瘤组织上，然而，在上述方法中很难得到细小粒子，并且减小囊泡的尺寸会导致碘/脂质量比降低。此外，在上面的方法中，尽管脂质体作为原料在体内显示出高度安全性和体内最佳降解性，然而在制备过程中使用了有机溶剂，特别是含氯溶剂如氯仿和二氯甲烷，作为磷脂形成脂质体膜的溶剂。因此，由于残留溶剂的毒性，上述方法均不能进行实际应用。

[0007] 从另一方面来说，尽管脂溶性的化学物质易于被包封在脂质体内，然而取决于其它因素包封量不必很大。尽管水溶性电解质也能被包封在脂质体内通过化学物质的电荷与带电脂类相互作用，但是对于水溶性的非电解质，上述方法是行不通的。通常期望将基本上表现出低毒性的非离子型碘化合物而不是离子型造影剂化合物包封在脂质体内，从上述的原因来看，这并非易事。此外，成型的脂质体容易形成多层膜，并且碘化合物的包封率低。将水溶性的非电解质有效的包封在脂质体内的方法包括，例如，反相蒸发法和乙醚注射法。然而，在这些方法中使用了有机溶剂，会产生安全性问题。

[0008] JP-ANo.2003-119120公开了一种通过使用超临界二氧化碳制备含有脂质体的化妆品或者皮肤外用药品的方法，该方法具体实施在制备皮肤外用药品中，使亲水性和疏水性的药用成分密闭在脂质体内。然而，尽管其中公开了作为药用成分的水溶性电解质的例子，但是水溶性非电解质通过这种方法是否有效地包封在脂质体内是不清楚的。

[0009] 即使造影剂材料能够很好的包封在脂质体内，一些问题例如造影剂随着时间推移的泄漏或者脂质体自身环境变得不稳定都是必须要考虑的。进一步指出因为脂质体导入生物体后几乎总是陷进网状内皮组织系统中，例如肝或脾，因而并没有达到预想的效果(Cancer Res.，43，5328(1983))。

[0010] 发明概述

[0011] 本发明的目的在于提供一种用于X射线诊断的造影剂，其通过将造影剂材料包封在脂质体内显示了有效传输和高度选择性。具体地，本发明的目的在于提供一种能够探测出微小的癌组织并显示出极佳的肿瘤图像的射线照相造影剂及其制备方法，在该造影剂中碘化合物被包封在脂质体内且没有使用毒性有机溶剂。

[0012] 上述目的是通过以下方案实现的。

[0013] 本发明的射线照相造影剂，其特征在于该造影剂包含包封了水溶性非离子型碘化合物的脂质体，并且该造影剂基本上不含含氯溶剂。

[0014] 该造影剂的特征在于脂质体是通过以下步骤制备的，将磷脂与超临界二氧化碳或亚临界二氧化碳混合，并使得水溶性非离子型碘化合物与磷脂接触形成脂质体。

[0015] 脂质体优选基本上是单层囊泡。

[0016] 碘化合物优选至少含有一个2，4，6-三碘苯基基团。

[0017] 脂质体的优选平均囊泡尺寸为0.05到0.5μm。

[0018] 平均囊泡尺寸优选0.05到0.2μm。

[0019] 平均囊泡尺寸优选0.11到0.13μm。

[0020] 脂质体优选包含经具有10到3500个氧化乙烯单元的聚乙二醇修饰的脂质膜(lipid membrane)，该PEG的量为基于形成脂质体的脂质的0.1重量％到30重量％。

[0021] 脂质体优选是经0.1到0.4μm孔径的过滤器过滤的脂质体。

[0022] 脂质体优选包封碘化合物，该碘化合物与脂质体膜脂质(liposomemembrane lipid)重量比为1～10(1 to 10)。

[0023] 碘化合物与脂质体膜脂质的重量比为3～8。

[0024] 碘化合物与脂质体膜脂质的重量比为5～8。

[0025] 包封在脂质体内的碘化合物占造影剂中全部碘化合物重量的5％到30％。

[0026] 脂质体优选含有脂质膜和包封在脂质膜内的水相，脂质膜包含选自含有聚氧化烯烃基基团的化合物和甾醇类至少一种，水相包含碘化合物。

[0027] 脂质体优选含有脂质膜和包封在脂质膜内的水相，脂质膜包含由聚氧化烯烃修饰的磷脂，水相包含碘化合物。

[0028] 脂质体是含有脂质膜和包封在脂质膜内水相的囊泡，脂质膜包含聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物，水相包含碘化合物。

[0029] 含有脂质膜和包封在脂质膜内水相的脂质体，优选分散在含水介质中，水相和含水介质中含有碘化合物和添加剂，并且碘化合物的浓度和添加剂的浓度在水相和含水介质中都分别基本上相等。

[0030] 添加剂优选水溶性的胺类缓冲剂或螯合剂。

[0031] 胺类缓冲剂优选氨基丁三醇。

[0032] 螯合剂优选EDTA Na2-Ca。

[0033] 本发明的制备方法包括将磷脂与超临界二氧化碳或亚临界二氧化碳混合形成混合物，使得水溶性非离子型碘化合物与磷脂接触形成包含包封了碘化合物的囊泡的脂质体。

[0034] 制备方法优选将磷脂与超临界二氧化碳或亚临界二氧化碳混合形成混合物，将含有非离子型碘化合物的水溶液导入到混合物中，排出二氧化碳以形成包含包封了碘化合物的囊泡的脂质体。

[0035] 二氧化碳优选在50到500kg/cm2的压力下应用。

[0036] 二氧化碳的温度优选25到200℃。

[0037] 上述方法中，磷脂和作为脂质体膜成分的选自聚氧化烯烃修饰的磷脂、含有聚氧化烯烃基基团的化合物、含有聚乙二醇基团的化合物和甾醇的化合物中的至少一种相混合，与磷脂、超临界二氧化碳或亚临界二氧化碳一起，将碘化合物的水溶液导入其中，之后，排出二氧化碳，形成包封了碘化合物的脂质体，并且脂质体经0.1到0.4μm孔径的过滤器过滤。

[0038] 上述方法中，磷脂和作为脂质体膜成分的选自由聚氧化烯烃修饰的磷脂和甾醇中的至少一种相混合，与磷脂、超临界二氧化碳或亚临界二氧化碳一起，将碘化合物的水溶液导入其中，之后，排出二氧化碳，形成包封了碘化合物的脂质体，并且脂质体经0.1到0.4μm孔径的过滤器过滤，形成包含脂质膜和脂质膜内的封闭水相的脂质体，将该脂质体分散在含水介质中，水相和含水介质中都含有碘化合物和添加剂，并且碘化合物的浓度和添加剂的浓度在水相和含水介质中都分别基本上相等。

[0039] 发明详述

[0040] 本发明进一步详细描述了造影剂化合物、脂质体和射线照相造影剂。

[0041] 造影剂化合物

[0042] 任何可用作于造影剂的离子或非离子型的水溶性碘化合物均可应用于本发明中。非离子的碘化合物，由于通常比离子型碘化合物显示出较低的渗透压力而优选。特别地，本发明优选含有至少一个碘代苯基基团如2，4，6-三碘苯基基团的水溶性非离子型碘化合物。

[0043] 非离子型碘化合物的具体例子包括碘海醇(iohexol)、碘喷托(iopentol)、碘克沙醇(iodixanol)、碘普胺(iopromide)、碘曲仑(iotrolan)、碘美普尔(iomeprol)、N，N’-双[2-羟基-1-羟甲基-乙基]-5-[(2-羟基-1-氧代丙基)-氨基]-2，4，6-三碘-1，3-苯-二羧基酰胺(碘帕醇(iopamidol))和甲泛葡胺(metrizamide)。

[0044] 此外，非离子型碘化合物的例子包括泛影酸(diatrizoic aicd)、泛影酸钠、泛影葡胺(meglumine diatrizoate)、acetorizoic acid及其可溶性盐、尿影酸(diprotrizo acid)、碘达酸(iodamide)、胆影酸钠(iodipamide sodium)、胆影葡甲胺(meglumine iodipamide)、碘马尿酸(iodohippuric acid)及其可溶性盐、iodomethamic acid、碘吡拉啥(iodopyracet)、碘-2-羟基吡啶-N-乙酸、3，5-二碘-4-羟基吡啶-N-乙酸(碘吡拉啥)以及上述酸的二乙基铵盐、碘他拉酸(iothalamic acid)、甲泛影酸(metrizoic acid)及其盐、碘番酸(iopanoic acid)、碘醋胺酸(iocetamic acid)、碘芬酸(iophenoic acid)及其可溶性盐、sodiumthyropanoate、碘泊酸钠(sodium iopodate)和其它类似的碘化合物。

[0045] 这些碘化合物可以单独使用也可联合使用。应用于本发明中的碘化合物并不限于上述所列举的化合物，并且不仅包括游离形式，还包括其盐和水合物形式。

[0046] 在本发明中适合作为射线照相造影剂的碘化合物优选碘美普尔(iomeprol)、碘帕醇(iopamidol)、碘曲仑(iotrolan)和碘克沙醇(iodixanol)，它们即使在相对高的浓度中也表现出高亲水性和低渗透压。特别是二聚的非离子型碘化合物如碘曲仑和碘克沙醇更具优势，因为当在相同的碘浓度中制备时，它们制备得到的造影剂有更低的总分子量，会使渗透压降低。

[0047] 造影剂中包含的水溶性碘化合物的浓度可根据以下因素任意设定：例如造影剂化合物的性质、药物的推荐剂量途径和临床指南等。脂质体内包封的水溶性碘化合物的量一般占造影剂中所包含的全部碘化合物重量的5％到95％，优选5％到70％重量。特别地，本发明中为了防止脂质体内包封的碘化合物不稳定，脂质体内包封的水溶性碘化合物通常占全部碘化合物5％到30％重量，优选5％到25％，更优选5％到20％重量。如果被包封在脂质体囊泡内的水溶性碘化合物的比例占到造影剂中包含的全部碘化合物重量的5％到25％(优选5％到20％重量)，存在有70％到95％重量(或者75％-95％重量)的残余物，基本上可以忽略流出到囊泡外的水分散体中的被包封的碘化合物。相应地，由于脂质体渗透压的影响，碘化合物的包封能够防止不稳定性，从而增强造影剂材料的稳定性。

[0048] 脂质体

[0049] 根据本发明的射线照相造影剂，上述造影剂化合物以脂质体内包封物的形式被使用，脂质体作为一种微型载体能够有效且有选择地将造影剂化合物转运到目标区域，例如靶器官或组织。应用脂质体的造影剂能增加在血液中的保留时间，促进血液的稳定性，由此获得有效的药物转运和靶向作用。需要对于与保留效果密切相关的改进如稳定的脂质体结构和包封材料的保留稳定性以及一些特性如血液稳定性和血液保留性的改进，从而产生对获得极佳的肿瘤影像很有效的EPR(增强的渗透性和保留时间)效果。

[0050] 在本发明的射线照相造影剂中，适当设计的囊泡尺寸和包被造影剂化合物的脂质体双分子膜能够获得靶向作用，其中考虑了主动靶向作用和被动靶向作用。前者通过调整囊泡尺寸、脂类成分或者脂质体的电荷可以控制生物学行为。通过随后描述的方法可以很容易地将脂质体的尺寸调整到狭窄的范围。脂质体膜表面的设计可以通过改变磷脂的种类和组分及包封材料来完成，以提供想要得到的特性。

[0051] 还应考察主动靶向的引入，它能够提高造影剂的完整性和选择性。例如，引入能够控制向靶向区域的指引过程的聚氧化烯烃或者聚乙二醇(PEG)的聚合物链，是非常有好处的。适合本发明造影剂的脂质体是表面经聚氧化烯烃或者PEG修饰的能够延长在血液中的保留时间的脂质体和不容易被网状内皮组织细胞如肝脏吞噬(binged)的脂质体。没有到达癌组织或者发病区域的造影剂没有积聚在正常区域，在由脂质体降解引起副作用之前就被排出体外。这可以通过在脂质体设计中优化控制脂质体的稳定性与向外排出的时间关系而实现。碘化合物作为造影剂材料能够迅速经肾排入尿中，因此能够阻止由体内无效保留引起的不利影响和延迟副作用的发生。

[0052] 下面将描述在射线照相造影剂中用作转运系统的脂质体的设计和制备。

[0053] 脂质体通常由脂质双分子层形成。大多数情况下，优选磷脂和/或糖脂作为脂质层的组分。

[0054] 脂质体中优选的中性磷脂的例子包括从大豆或蛋黄中得到的卵磷脂和溶血卵磷脂，以及它们的氢化物或羟基衍生物。此外，磷脂的例子还包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和神经鞘磷脂，它们都来源于蛋黄、大豆或其它动植物，或者通过半合成的方法获得；通过合成的方法得到的为磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和二硬脂酰磷脂酸(DSPA)。

[0055] 这些磷脂可以单独使用也可以两种或两种以上联合使用。优选所用的两种或两种以上带电磷脂带同种电荷，即全带负电或全带正电，这样可以防止脂质体的凝集。中性磷脂和带电磷脂联合使用优选重量比为200∶1到3∶1，更优选100∶1到4∶1，且更优选40∶1到5∶1。

[0056] 甘油糖脂的例子包括甘油脂类，例如双半乳糖甘油二酯和双半乳糖甘油二酯硫酸酯；鞘氨醇糖脂如半乳糖神经酰胺、半乳糖神经酰胺硫酸酯、乳糖神经酰胺、神经节苷脂G7、神经节苷脂G6和神经节苷脂G4。

[0057] 除了上述的脂类外，也可以选择性的含有其它物质作为脂质膜的组分。例如，用作脂层稳定剂的有胆固醇、二氢胆固醇、胆固醇酯、植物甾醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、羊毛甾醇和2，4-二羟基羊毛甾醇。此外，甾醇的衍生物例如1-O-甾醇葡糖苷、1-O-甾醇麦芽糖苷和1-O-甾醇半乳糖苷显示对稳定脂质体有效，参见JP-ANo.5-245357，前面所述的甾醇，特别优选胆固醇。优选甾醇用量为0.01到0.5mol，更优选0.05到0.1mol甾醇每摩尔磷脂。甾醇使用量小于0.01mol时不能通过甾醇增强混合脂类的分散性而起到稳定作用，使用量大于0.5mol时会抑制脂质体的形成或得到其不稳定的形式。

[0058] 被包封在脂质膜内的胆固醇能够起到像锚(anchor)一样的作用而将聚氧化烯烃引入。具体地，胆固醇作为脂质膜组分包含在脂质体中，可以选择性地经锚与聚氧化烯烃基基团连接。短链的烯基或氧化烯基可被用作锚。JP-ANo.9-3093中公开了用作脂质体的组分新的胆固醇衍生物，其中多种活性物质能够有效的固定在聚氧化烯烃链的上部。

[0059] 其它的添加剂化合物包括，例如，提供负电荷的物质、磷脂酸烷基酯如二乙酰磷酸酯和提供正电荷的物质，脂肪胺如硬脂酰胺。

[0060] 在本发明中，包含聚氧化烯烃(PAO)基团(又称为聚氧化烯烃基基团，-(RO)n-H，R为亚烷基)或类似基团的磷脂或化合物被用作脂质体囊泡膜的组分，以得到预期目的的造影剂。为了克服一些问题如被网状内皮组织细胞俘获和脂质体本身的不稳定性如破坏或凝集，试图向脂质体表面引入聚合物链如聚乙二醇(PEG)链(又称为聚氧化烯烃基基团，(CH2CH2O)n-H)，参见JP-ANO.1-249717中和FEBS letters 268，235(1990)中的描述。将聚氧化烯烃链(又称为聚氧化烯烃链)或PEG链连接到脂质体囊泡的表面上能够给脂质体带来新的作用。例如，这种PEG修饰的脂质体预计对于免疫系统具有更低的可识别性(所谓的隐身状态)。已经证明脂质体具有亲水倾向会促进血液稳定性，从而在很长一段时间可稳定地保持血液浓度，参见Biochim.Biophys.Acta.，1066，29-36(1991)。JP-ANO.2002-37833中公开了一种技术，其中经聚氧化烯烃修饰的磷脂掺入脂质体膜中，来增加脂质体在血液中的保留时间。这种脂质体还显示出改善的老化稳定性。

[0061] 上述性质能够使本发明的射线照相造影剂具有器官-特异性。例如，因为脂类成分容易积聚在肝脏，欺期望使用未含有或含有微量PEG的脂质体能选择性地提供与肝脏的对照。将囊泡的尺寸增加到0.2μm或更大，将导致被肝脏枯否氏细胞(Kupffer cells)吞噬作用而迅速合并的机率增加，引起在肝脏的所述位点中的积聚。在给肝癌成像时，由于癌组织的枯否氏细胞比正常细胞少，造影剂脂质体合并的量较少，能形成清晰的对照。脾脏中的情况是类似的。

[0062] 相反，对其它器官成像时，通过引入PEG，脂质体成了隐身状态，在肝脏中聚集变的困难，所以，推荐PEG修饰的脂质体。PEG的引入形成了水合球体，从而稳定了脂质体并增强了血液保留。通过改变PEG中氧化乙烯单元的长度和引入比例，可以调整其功能。作为PEG，优选具有10到3500个氧化乙烯单元的聚乙二醇。按照构成脂质体的脂质量，优选含有的PEG的重量为0.1％到30％，更优选重量的1％到15％。

[0063] 在脂质体中应用PEG进行修饰可以通过公知技术来完成。例如，将连接在一种锚式化合物(如胆固醇)上的PEG与作为膜组分的磷脂混合以形成脂质体，并且该锚式化合物可以与活化的PEG相连接。由于引入脂质体表面的聚乙二醇基团与将在下文陈述的功能性材料(“functional material”)不发生反应，很难将功能性物质固定在脂质体表面上。与其相反，使顶端经化学修饰的PEG结合在磷脂上，将其作为制备脂质体的组分。

[0064] 可引入公知的聚氧化烯烃基基团代替前述被引入的PEG，所述聚氧化烯烃用通式-(AO)n-Y表示，其中AO为具有2至4个碳原子的氧化烯烃基基团；n表示平均加成摩尔数且为1至2000的整数；Y为氢原子、烷基基团或者官能团。具有2至4个碳原子的氧化烯烃基基团的例子包括氧化乙烯基基团、氧化丙烯基基团、氧化三亚甲基基团、氧化四亚甲基基团、氧-1-乙基乙烯基基团和氧-1，2-二甲基乙烯基基团。这些氧化烯烃基基团是通过氧化烯烃如氧化乙烯、氧化丙烯、环氧丙烷(oxetane)、1-氧化丁烯、2-氧化丁烯或四氢呋喃的加成聚合反应得到的。正数n为1至2000，优选10至500，更优选20至200。当n大于等于2时，两个以上的氧化烯烃基基团可相同或不同。对于后者，不同的氧化烯烃基基团可以是随机的形式或者嵌段共聚的形式。为了使氧化烯烃基基团具有亲水性，优选只用氧化乙烯进行加成聚合反应，其中n优选大于等于10。在不同的氧化烯烃之间发生加成聚合反应的情况中，预计至少20mol％(优选至少50mol％)的氧化乙烯进行了加成聚合。为了使氧化烯烃基基团具有亲油性，优选增加除氧化乙烯之外的氧化烯烃的摩尔浓度。例如，包含聚氧化乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(或称聚氧乙烯嵌段共聚聚氧丙烯)的脂质体是本发明优选的一种实施例。Y为氢原子、烷基基团或官能团。烷基基团为具有1至5个碳原子的直链或支链的脂肪烃。官能团为将例如糖、糖蛋白、抗体、凝集素和细胞粘合因子的功能性物质连接到聚氧化烯烃上的基团，其中具体实例包括氨基基团、氧化羰基咪唑基团和N-羟基琥珀酰亚胺。

[0065] 锚向聚氧化烯烃链且上部结合了前述的功能性物质的脂质体，不仅显示出由于引入聚氧化烯烃基基团的效果，还能给出功能性物质全面的作用，例如，识别部件的功能，如对具体器官的方向性(即器官趋向性)和对癌组织的方向性。

[0066] 包含聚氧化烯烃基基团的磷脂或者化合物可单独使用或者联合使用。按照脂质体膜形成成分的总量计算，其含量优选为0.001到50mol％，更优选0.01到25mol％，且更优选0.1到10mol％。含量小于0.001mol％会导致降低的预期效果。

[0067] 可通过公知技术将聚氧化烯烃链引入脂质体中。例如，锚式化合物(anchor)(如胆固醇)与作为膜成分的磷脂混合形成脂质体，并且将活化的聚氧化烯烃连接到锚式化合物上。在这种方法中，在脂质体形成以后必需在脂质体膜表面上进行多级化学反应，这会限制预期的功能性物质的引入量或者导致反应副产物或杂质的污染，产生如对脂质体膜的更大破坏等问题。

[0068] 从另一方面来说，作为一种优选的制备方法，磷脂聚氧化烯烃(PEO)衍生物被预先包括在原料如磷脂类中以形成脂质体。适合此方法的经修饰的磷脂由以下分子式表示，参见JP-ANO.7-165770：

[0069] 分子式

[0070]

[0071] 其中R1和R2各自为具有2至29个碳原子的烷基基团；M为氢原子或碱金属原子如钠或钾；AO、n和Y同前述定义。

[0072] 其中具体实例包括磷脂酰胺的聚氧乙烯(PEO)衍生物等，如二硬脂酰磷脂酰二乙醇胺聚氧乙烯(DSPE-PEO)。此外，JP-A NO.2002-37883公开了纯度极高的聚氧化烯烃修饰的磷脂，以制备显示增强血液保留性的水溶性的聚合物修饰的脂质体。还公开了在制备脂质体时使用具有相对低单酰基含量的聚氧化烯烃修饰的磷脂，会给脂质体分散体带来非常出色的老化稳定性。

[0073] 这里还提出了多种制备脂质体的方法。不同的方法通常最终产生形状和性质差别很大的脂质体，参见JP-ANO.6-80560。所以，应根据所需脂质体的形式或特征选择最适合的制备方法。通常，通过将脂类成分如磷脂、甾醇和凝集素几乎没有例外地溶解于有机溶剂如氯仿、二氯甲烷、乙醚、四氯化碳、乙酸乙酯、二噁烷或四氢呋喃(THF)特别是含氯溶剂中而制备脂质体。减压蒸馏挥发性物质后，将脂类混合物分散在含有规定量包封物质的缓冲溶液中。然后搅拌分散体几个小时，形成脂质体，并且部分分散体(包含包封物质)被包封在脂质体囊泡中。接着，通过将分散体进行超声处理或使用表面活性剂或其它方法，减小脂质体的尺寸和分散体的粘度。这种脂质体产品一定包含有机溶剂。很难将残余的有机溶剂特别是含氮溶剂完全排除，该含氯溶剂因为会对生物体产生副作用而引起关注。

[0074] 为了制备本发明的脂质体，利用超临界或亚临界二氧化碳而没有使用任何有机溶剂特别是任何氯化有机溶剂的制备方法，避免了上述的问题。选择二氧化碳，是因为它具有31.1℃的临界温度和73.8巴(bar)的临界压力且易于操作，并且因为其为惰性气体且即使残留也对人体无毒，以及其高纯度液体价廉且容易获得。通过这种方法制备的脂质体在作为射线照相造影剂包封碘化合物方面具有优势和优点，这将在下文中陈述。

[0075] 利用超临界或亚临界二氧化碳制备脂质体，必须在二氧化碳的超临界状态(包括亚临界状态)下溶解、分散或混合前述的脂质膜组分。此超临界二氧化碳容易渗透到物质内并表现出极强的溶解性。既然这样，优选使用一种或多种醇类作为辅助性溶剂，如低级醇、乙二醇或乙二醇醚增强前述脂质膜组分的可溶性。例如，优选使用醇类作为辅助性溶剂，用量为根据超临界二氧化碳0.1％到10％重量，优选用量为1％到8％重量。对于辅助性溶剂，考虑到根据安全性和除去的难易性，优选乙醇。

[0076] 在超临界状态下(包括亚临界状态)二氧化碳的适宜压力为50到500kg/cm2，优2
选100到400kg/cm。在超临界状态下(包括亚临界状态)二氧化碳的适宜温度是25到
200℃，优选31到100℃，更优选35到80℃。超临界状态下(包括亚临界状态)的二氧化碳通过优化选择上述范围内的压力或温度条件而获得。

[0077] 以下面的方式制备本发明中用作射线照相造影剂的脂质体。在存在脂质膜组分下加入液态二氧化碳，在上述适宜的压力和温度下达到超临界状态或亚临界状态。可使用选自聚氧化烯烃修饰的磷脂、含有聚氧化烯烃的化合物、含有聚乙二醇的化合物和与上述磷脂混合的甾醇中至少一种化合物作为膜脂质。此时，可任选使用上述的辅助性溶剂。然后，连续加入碘化合物和任选的包含添加剂如药物制剂助剂的溶液以形成水/二氧化碳乳液。在该乳液中，预计脂类成分以微团的形状分散，同时聚集或分离。连续搅拌一段时间之后，含有微团的乳液变得稳定，持续加水直到二氧化碳相和水相分离。据推断增加水相会引起相转移，且过量的二氧化碳会通过二氧化碳/水乳液以及二氧化碳/水的两相系统而从二氧化碳/水乳液中分离出来。脂质体按预期转移到水相中，抽真空排除二氧化碳以形成水分散溶液，其中包封了碘化合物的脂质体囊泡分散在该溶液中。在这种情况下，碘化合物还可包含于除脂质体囊泡内部的水相之外的囊泡外面的水相中(外部水相)。既然上述的水溶液被包封在脂质体囊泡内部，则现在碘化合物不仅存在于外部水相中还主要存在于脂质体囊泡的内部，处于所谓的内囊(endocyst)状态。此外，脂质体还要通过孔径为0.1到0.4μm的多孔过滤器。然后，经药剂制备加工过程，如消毒和包装，制备了本发明的射线照相造影剂。

[0078] 已经证实通过超临界或亚临界二氧化碳制备脂质体具有脂质体高形成率、包封材料d高包封百分率和脂质体内的被包封材料的高保持率，参见JP-ANO.2003-1191120。此外，本发明中的上述方法，甚至能达到工业化应用程度，能使非离子型水溶性物质在脂质体中得到有效包封，基本上不需任何有机溶剂，适用于制备本发明的射线照相造影剂。具体地，本发明的造影剂基本不包含含氯溶剂。在此处，术语“基本不包含含氯溶剂”是指造影剂中包含的含氯溶剂量不超过10μg/升造影剂。含氯溶剂的例子包括二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷和三氯乙烯。

[0079] 本发明涉及的脂质体基本上是单层囊泡，也就是说由单一的磷脂双分子层形成的单层囊泡。术语“基本上”的意思是囊泡由磷脂双分子层构成，利用冷冻割裂复制技术经透射电子显微观察其复制品，几乎均被识别为单层的。因此，当观察在碳膜上保留的微粒印记时，没有差别的可判断为单层囊泡，具有两个或两个以上差别的是多层囊泡。在本发明中，以总脂质体的量也就是射线照相造影剂中含有的总囊泡量计，这种单层囊泡的量优选至少80％，更优选90％。

[0080] 通过使用上述超临界二氧化碳作为脂类溶剂并经使用水的相分离方法能够有效地制备单层囊泡。反之，在传统的脂质体制备方法中，脂质体包含多层囊泡(MLV)，即通常多层囊泡占相当大的比例。因此，需要一些如超声处理或者经特定大小的孔过滤操作以增加单层脂质体的比例。单层囊泡具有使得加入的脂质体量或给予的脂类量通常少于多层囊泡的优点。

[0081] 单层囊泡，特别是大单层囊泡(LUV)其优势是比多层囊泡具有更好的包裹能力。应用在射线照相造影剂中的脂质体，为介于尺寸为0.2至1.0μm的LUV和小于0.05μm的SUV(小单层囊泡)之间。因此，保留体积超过了SUV，碘化合物特别是水溶性碘化合物的俘获率即包封率变得更好，将在后面描述。此外，与MLV或LUV所不同的是，这种囊状脂质体由于结合在网状内皮组织细胞内从而不会从血流中迅速消失。

[0082] 然而，即使单层囊泡表现出较好的碘化合物包封率，当包封的碘化合物重量相对过多时，会降低其稳定性。据观察它表现出变弱倾向因为离子强度迅速改变。通过将本发明造影剂所应用的脂质体调整为相对小的囊泡尺寸，向囊泡膜上引入甾醇或者含聚氧化烯烃或磷酯的化合物，可以增强脂质膜的稳定性。结果证明这种脂质体能够抵抗盐的冲击。

[0083] 脂质体的囊状微粒尺寸(下文也简称为囊泡尺寸)及其分布，与增强血液保留性质、靶向能力和转运效率这些与本发明目有关的方面密切相关。囊泡尺寸可以用以下方法测定，将含有包封碘化合物的脂质体囊泡的分散体冷冻破裂后，使碳蒸发沉积(vapor-deposited)在断裂界面上，并通过电子显微镜观察沉积的碳(冷冻割裂TEM法)。本发明中，平均囊泡尺寸是指被观察的20个囊泡的平均算术值。囊泡大小可以通过设定或控制工艺条件来调节。例如，增加前述的超临界压力而使脂质体囊泡的尺寸减小。利用聚碳酸酯膜过滤以使囊泡尺寸在更窄范围内分布。在这方面，使脂质体穿过安装了0.1到
0.4μm孔径过滤器的挤压机可有效获得具有不到0.5μm的最理想平均囊泡尺寸的单层囊泡脂质体。除了前述的调整大小的操作，又加入了该挤压操作，具有如下优点：调整存在于脂质体外部的碘化合物浓度、改变脂质体分散溶液和除去杂质。

[0084] 脂质体微粒的尺寸对增强脂质体的主动靶向能力是重要的。例如，日本专利NO.2619037公开了，将3μm或更大的脂质体排除就可避免在肺毛细管中的不利保留。然而，0.15到0.3μm的脂质体不一定表现出肿瘤的指向性。

[0085] 本发明中的造影剂应用的脂质体的平均囊泡尺寸通常是0.05到0.5μm，优选0.05到0.3μm，更优选0.05到0.2μm，而且更优选0.05到0.13μm。平均囊泡尺寸可以根据X射线成像的目标进行调整。例如，目的是给肿瘤区域有选择的成像，优选0.11到
0.13μm。调整平均脂质体囊泡尺寸到0.1到0.2μm范围(优选0.11到0.13μm)可使造影剂选择性的集中在癌组织。这被认为是EPR效应。实体癌组织血管化壁上的微孔异常地大于孔径为0.03到0.08μm的正常组织毛细管壁微孔，因此即使是约0.1到约0.2μm的大分子也通过血管壁泄漏。因此，EPR效应是由于癌组织血管壁的渗透性比正常组织微血管壁的渗透性高。

[0086] 由于淋巴管在癌组织周围没有充分生长，泄漏到血管壁的造影剂不能回到血管中，并在那里保留相对长时间。由于EPR效应是利用血流的被动转运而增加血液保留时间，因此需要有效的发展这种效应。因此，造影剂微粒(或者包封碘化合物的脂质体囊状微粒)需要保留在血液中，并且经过很多次靠近癌细胞的血管。本发明的射线照相造影剂，其没有包含任何特别大的粒子，不易变成被网状内皮组织细胞俘获的目标。脂质体囊泡，其形状与红细胞相似并且行为也与红细胞相似，在血液中长时间保留且不会经肾迅速排出，被覆盖时不会被网状内皮组织细胞吞噬。EPR效应必然会加强造影剂化合物向目标器官或组织的转移，并且有选择地集中并积聚在癌组织中。瘤细胞/正常细胞累积比率的升高可以增强造影剂的对照效果。改进的肿瘤造影术使发现到目前为止还是难于被检测的微小的转移瘤成为可能。

[0087] 射线照相造影剂

[0088] 在本发明的射线照相造影剂中，通过增强脂质体的结构稳定性和造影剂材料的保留稳定性，改进了包被在脂质体内的造影剂材料的保留率。

[0089] 造影剂优选在脂质体膜内的水相中和在分散脂质体囊泡的含水介质中包含碘化合物和至少一种辅助性添加剂(药用辅助制剂)，其中各自的浓度优选在膜内和膜外基本相同。语句基本相同是指浓度几乎一样。辅助性添加剂是指与造影剂材料一起加入的化合物，根据制备造影剂的技术可应用多种物质。其中具体的例子包括生理可接受的缓冲剂、螯合剂如乙二胺四乙酸二钠钙盐(又被称为EDTA二钠钙或者EDTA Na2-Ca)或乙二胺四乙酸二钠盐(又被称为EDTA二钠或者EDTANa2)以及任选的，渗透压调节剂、稳定剂、抗氧化剂如α-生育酚和粘度调节剂。优选水溶性胺类缓冲剂和螯合剂。作为pH缓冲剂，优选胺类缓冲剂和碳酸盐类缓冲剂，其中更优选胺类缓冲剂并且特别理想的是氨基丁三醇(又被称为氨基三丁醇或2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)。螯合剂优选EDTANa2-Ca。含水介质是指主要包含可溶解碘化合物或辅助性添加剂的水的溶剂。除了脂质膜内部的水相之外(或叫做包封水溶液)，还有一种水溶液，即其中分散了脂质体囊泡的含水介质，也包含碘化合物和辅助性添加剂，如水溶性的胺类缓冲剂或螯合剂。因此，膜内外的渗透压没有差别，由此可保持脂质体的结构稳定。

[0090] 在射线照相术中，已经披露为了提供预定造影效果而转运到靶器官的碘化合物量，参见日本专利NO.2619037。当碘化合物被包封在微载体如脂质体中，除了要考虑造影剂材料的运载率和保留稳定性外，还必须考虑囊泡膜脂质的重量。增加膜脂质重量会提高造影剂的粘度。对于包封在脂质体内的碘化合物量，在水溶液中被脂质体囊泡包封的碘化合物和形成囊泡膜的类脂的重量比率，优选为1～10，更优选3～8且更优选5～8。

[0091] 包封在脂质体内的碘化合物重量比小于1时需要注入相对大量的类脂，结果降低了造影剂材料的转运率。根据日本专利NO.2619037中的描述，考虑到当时的技术水平，即使重量比为1也是相对高的值。因为射线照相造影剂的粘度取决于脂质体中类脂的量，因而表现出增加了保留体积和包封率性能的单层脂质体显然具有优势。相反，当包封的碘化合物与脂质体膜脂质的重量比超过10，脂质体的结构会变得不稳定，并且在储藏期间或者甚至在被注射进生物体内后不可避免地发生碘化合物从脂质膜中的扩散或泄漏。此外，专利申请号为NO.9-505821的PCT国际申请的日本公开文本中描述到，即使在制备和分离脂质体分散体系之后立即达到100％的包封，由于渗透压造成的不稳定影像，包封的组分会在短时间内减少。

[0092] 本发明的射线照相造影剂在药用溶液中剂量是10到300ml，含碘量是100到50mgI/ml，优选150到300mgI/ml。药用溶液的粘度在37℃时不超过6cPa，优选0.9到3cPa。

[0093] 在一个优选实施例中，能促进肿瘤成像和脂质体造影剂保留稳定性的射线照相造影剂含有具有脂质膜的脂质体，该脂质体在脂质膜中包含含有聚氧化烯烃基基团的化合物和/或甾醇，并且碘化合物被包含在脂质膜内部包封的水相中。此外，所述脂质体是单层脂质体，其包含平均囊泡尺寸为0.05到0.2μm的单层囊泡，并且该单层脂质体包含碘化合物/脂质膜重量比为3到8的碘化合物，被包封在脂质体中的碘化合物的量是全部碘化合物重量的5-25％。

[0094] 造影剂以等渗溶液或悬浮液的形式被包封在脂质体内，使脂质体稳定地保留在人体内。使用水或者缓冲溶液如tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液作为这种溶液或悬浮液的介质。上述溶液或悬浮液的pH室温下优选6.5到8.5，更优选6.8到7.8。如美国专利NO.4278654所述，当射线照相造影剂是含有多羟基基团的碘化合物时，优选具有负温度系数的缓冲液。胺类缓冲液具有满足这种要求的性质并特别优选TRIS。这种类型的缓冲液在高压灭菌温度下表现出相对低的pH，其增加了高压釜内造影剂的稳定性，而且在室温下pH回复到生理允许的范围内。此时，没有减小脂质体囊泡尺寸的限制，如过滤灭菌。所以，在高压釜中对脂质体产品进行灭菌以制备用于注射的无菌造影剂是非常方便的，由此还可保持存储稳定性。不能通过高压灭菌的脂质体可通过过滤灭菌。

[0095] 等渗溶液或悬浮液通过将造影剂材料以形成等渗溶液的浓度溶解或悬浮在介质中而制备。例如，当等渗溶液由于造影剂化合物的低溶解性而不能仅用造影剂化合物制备时，可加入非离子型水溶性物质，如盐类如氯化钠，或糖类如甘露醇、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇，以形成等渗溶液或悬浮液。

[0096] 本发明的射线照相造影剂不是经口服而是经血管优选经静脉内如注射或滴注给予人类，然后在X射线下进行成像。剂量与传统的碘类造影剂相同。脂质体内的碘总量或者脂质体内外的碘总量与常规剂量相同。

[0097] 本发明的射线照相造影剂包含包封在脂质体膜内水相中的碘化合物和分散脂质体的含水介质中的碘化合物，并且碘化合物的浓度在膜内和膜外基本相同。这就意味着同一碘化合物同时存在并具有不同的形式。这种状态的造影剂材料在诊断检查中表现出以下优点。根据本发明的射线照相造影剂的应用，未被包封的造影剂材料和被包封在脂质体内的造影剂材料在体内的扩散时间不同，使所呈现的影像随着时间的流逝在分布行为上发生变化，这会提供有价值的诊断信息。

[0098] 在实际诊断检查中，联合应用本发明的造影剂和计算机X射线断层造影装置将会有效地显示出进一步增强的成像效果。例如，在肝脏的计算机X射线断层造影诊断中，未被包封在脂质体内的造影材料自由地穿过肝脏窦状隙(liver sinusoid)，给药后迅速到达肝脏主质细胞(liver parenchyma cell)，提高健康肝脏组织的影像密度，其会迅速降低。密度的降低可以通过脂质体造影剂的持续加强得到补偿，因此造影剂材料能够长时间的维持高的浓度。游离的未被包封的造影剂材料在分布方面有差别，能够进行组织状态的详细分析。

[0099] 射线照相造影剂含有含单层囊泡的脂质体，该单层囊泡具有相对均匀粒径，其中烯氧化物链和/或甾醇被包含在脂质膜中，水溶性碘化合物被包封在水相中，导致改善了脂质体结构的稳定性和包封材料的保留稳定性。

[0100] 此外，本发明的射线照相造影剂含有含单层囊泡的脂质体，该单层囊泡具有相对均匀粒径，其中在脂质体膜内的水相和分散脂质体的含水介质中均包含碘化合物和辅助性添加剂，该碘化合物在膜内和膜外的浓度基本相同，因此改善了脂质体结构的稳定性和包封材料的保留稳定性。

[0101] 此外，本发明的射线照相造影剂显示出突出的血液保留性且表现出EPR效应，结果是其将有选择的集中积聚在目标疾病区域或组织，特别是癌组织。成像之后，碘化合物是水溶性的且易于排出体外。此外，未包封的造影剂材料和被包封在脂质体内的造影剂材料在体内具有不同的扩散时间，使所呈现的影像随时间流逝在分布行为上发生变化，这会提供有价值的诊断信息。

[0102] 上述脂质体的制备方法，由于采用将磷脂或类似物溶解在超临界二氧化碳中，因此没有必要使用有毒溶剂，特别是毒性很高的含氯溶剂。

[0103] 相比传统的射线照相造影剂，本发明的射线照相造影剂用量少，从而减小毒性和副作用，减小病人的负担。

[0104] 实施例

[0105] 本发明将根据实施例作进一步的说明，但并不限于此。

[0106] 脂质体的形状和囊泡大小

[0107] 利用透射电子显微镜冷冻破裂法(TEM)测定造影剂中包含的脂质体微粒(或者囊泡)尺寸和脂质体的结构。因此，脂质体分散体经液氮迅速冷冻，在冷冻状态下破裂，暴露出脂质体的内部结构。然后，将碳蒸发-沉积在断裂界面上，再通过透射电子显微镜观察碳沉积膜。

[0108] 将脂质体的囊状微粒尺寸大小表示为20个微粒直径的平均算术值。至于脂质体微粒的结构，当观察保留在碳膜上的微粒印记时，在水平上(in leVel)没有区别的为单层囊泡，具有两种或以上区别的是多层囊泡。当20个被观察的脂质体的囊状微粒中至少80％被认为是单层结构时，可判断该脂质体为均匀囊泡(或者单层脂质体)。

[0109] 碘化合物的测定

[0110] 脂质体分散体用氯化钠等渗溶液进行透析。透析结束后，向其中加入乙醇使脂质体降解，再用吸收比色法测定包封在脂质体囊泡内的碘化合物量。

[0111] 实施例1

[0112] 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二氧化碳与乙醇一起加入到不锈钢高压反应釜2
内，在高压釜保持60℃和300kg/cm 的条件下，搅拌使DPPC溶解在超临界二氧化碳中。在搅拌超临界二氧化碳溶液的同时，用计量泵持续加入碘美普尔(iomeprol)溶液。碘美普尔溶液通过以下方法制备，816.5mg的碘美普尔通过加热溶解在注射用水中，加入20mM的抗坏血酸，再加入1mg氨基丁三醇，调节pH到生理性pH值，最后加入注射用水至1.0ml。其后，将高压釜抽真空排出二氧化碳，得到包封碘美普尔的脂质体分散体。所得的分散体倒入玻璃瓶中于高压釜内121℃灭菌20分钟得到造影剂。

[0113] 利用透射电子显微镜(TEM)经冷冻破裂法测定造影剂中包含的脂质体囊状微粒的尺寸。脂质体的平均囊泡大小是0.13μm，且脂质体是单层囊泡的脂质体。

[0114] 实施例2

[0115] 将实施例1制备的造影剂用等渗葡萄糖溶液稀释到50mg碘/ml。当将此溶液通过静脉注射到大鼠体内，利用射线照相术观察达肝脏的浓度。发现肝脏内的成像水平(或影象对比)与其它所有器官的成像水平同时随时间推移而减弱，并且几乎所有的碘美普尔都被排到尿里。

[0116] 实施例3

[0117] 将实施例1制备的造影剂用等渗葡萄糖溶液稀释到50mg碘/ml。将此溶液注射进带有大量转移肝癌细胞的大鼠静脉。转移肿瘤区域显示出很高的成像水平(或影象对比)，其中可以观察到直径为5mm的肿瘤。随时间推移，相对其它器官的成像水平，在肿瘤区域的影象对比的减弱会延迟。

[0118] 实施例4

[0119] 造影剂的制备同实施例1，只是调整压力和温度使形成的脂质体具有0.07μm、0.18μm和0.22μm的平均脂质体微粒尺寸。

[0120] 实施例5

[0121] 造影剂的制备同实施例1，只是另外加入了40g具有2000个氧化乙烯单元的PEG。平均脂质体微粒尺寸为0.12μm。

[0122] 实施例6

[0123] 将实施例4和5中制备的造影剂分别按照实施例2的方法进行评测。利用射线照相术观察发现实施例4中制备的造影剂注射后特别集中在肝脏内。实施例5中制备的造影剂比实施例4中的造影剂较少集中在肝脏。

[0124] 实施例7

[0125] 将实施例4和5中制备的造影剂分别按照实施例3的方法进行评测。含有平均脂质体囊泡尺寸为0.07μm脂质体的造影剂在肿瘤区域的造影水平(或影象对比)的减弱比实施例3中的造影剂更快。与实施例3中的造影剂相比较，含有平均脂质体囊泡尺寸为0.18μm脂质体的造影剂在肿瘤区域的造影水平的减弱会延迟。与实施例3中的造影剂相比较，含有平均脂质体囊泡尺寸为0.22μm脂质体的造影剂在肿瘤区域显示出明显减弱的造影水平。这进一步证明实施例5中的造影剂在肿瘤区域的影象对比实施例3中的造影剂更高，且成像水平的减弱会延迟。

[0126] 对比实施例1

[0127] 在常规的造影剂制备方法中，包含脂质体的分散体是通过将磷脂溶解在有机溶剂中而不是溶解在超临界二氧化碳中而制备的。显示表明这样制备的脂质体不是单层脂质体。按照实施例3中的同样方法进行评测，与实施例3中的造影剂相比较，证明其在肿瘤区域的造影水平明显减弱。

[0128] 与将磷脂溶解在有机溶剂中制备得到的传统的造影剂相比较，上述结果显然可以证明将磷脂溶解在超临界二氧化碳中制备的射线照相造影剂显示出优异的癌症成像。

[0129] 实施例8

[0130] 将0.04g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、1.2mg的Pluronic F-88(聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段聚合物，来自ADEKA Co.)和0.9g乙醇的混合物，加入至不锈钢高压反应釜内，2
将高压釜内部加热到60℃，随后，加入13g液态二氧化碳。将高压釜内的压力从50kg/cm 升
2
高到200kg/cm，在高压釜内搅拌使DPPC溶解在超临界二氧化碳中。在搅拌超临界二氧化碳溶液的同时，使用定量泵持续加入下述溶液5g，该溶液含有647mg/ml的碘海醇(iohexol)(具有300mg/ml的碘含量)、1.21mg/ml的氨基丁三醇和0.1mg/ml的乙二胺四乙酸钙二钠并且用盐酸或氢氧化钠调节pH到大约等于7。其后，将高压釜内抽真空排出二氧化碳，得到包封碘海醇的脂质体分散体。将相同的操作重复几次，并将得到的分散体加热到60℃，且用0.1μm由Advantech Co.生产的纤维素类过滤器进行压力过滤。通过压力过滤得到的脂质体囊泡的尺寸为0.15μm或者更小。将这样得到的造影剂命名为样品1。平均脂质体囊泡尺寸为0.12μm且脂质体基本上是单层囊泡。包封在囊泡内的碘化合物与囊泡膜脂质的重量比是5.6。

[0131] 实施例9

[0132] 除了将压力调节为高内压，控制了排空速度和改变了所用磷脂的量，与实施例8相同地，脂质体分散体是通过用0.1μm的纤维素类过滤器进行压力过滤(由Advantech Co.生产)制备得到，且命名为样品2。用冷冻割裂技术通过透射电子显微观察，证明样品2的脂质体基本上是单层囊泡。脂质体囊泡的尺寸见表1。

[0133] 实施例10

[0134] 除了调高了压力，控制了排空速度和改变了所用磷脂的量，与实施例8相同地，脂质体分散体是通过用0.1μm的纤维素类过滤器进行压力过滤(由Advantech Co.生产)制备得到，且命名为样品3。用冷冻割裂技术通过透射电子显微观察，证明样品3的脂质体基本上是单层囊泡。脂质体囊泡的尺寸见表1。

[0135] 实施例11

[0136] 除了调高了压力，控制了排空速度和改变了所用磷脂的量，与实施例8相同地，脂质体分散体是通过用0.1μm的纤维素类过滤器进行压力过滤(由Advantech Co.生产)制备得到，且命名为样品4。用冷冻割裂技术通过透射电子显微观察，证明样品4的脂质体基本上是单层囊泡。脂质体囊泡的尺寸见表1。

[0137] 实施例12

[0138] 除了调高了压力，控制了排空速度和改变了所用磷脂的量，与实施例8相同地，脂质体分散体是通过用0.2μm的纤维素类过滤器进行压力过滤(由Advantech Co.生产)制备得到，且命名为样品5。用冷冻割裂技术通过透射电子显微观察，证明样品5的脂质体基本上是单层囊泡。囊状微粒的尺寸见表1。

[0139] 对比实施例2

[0140] 包含脂质体的分散体按照传统的方法制备，即磷脂溶解在有机溶剂中，而不是超临界二氧化碳中，并且改变了所用磷脂的量。这样，制备了两种射线照相造影剂(样品6和7)。如此制备的脂质体并不是单层的脂质体。囊泡的尺寸见表1。

[0141] 实施例13

[0142] 将VX2 calcinorma细胞悬浮液通过皮下植入兔子体内。植入两周后，将实施例8制得的造影剂通过静脉注射到兔子体内，然后通过射线照相术观察。尽管随着时间的过去成像水平(或影象对比)减弱了，但是成像水平或者影象对比在植入区域的减弱延迟了。

[0143] 实施例9到12中制备的造影剂样品(样品2到5)和对比实施例2中制备的造影剂样品6按照相同的方法进行评测。此外，根据日本专利NO.2619037的实施例2中的样品2B制备的造影剂(样品8，对比实施例3)，也进行了评测。其结果见表1。癌症的成像水平根据下列标准进行评测：

[0144] A：影象对比在植入区域的减弱相比其它区域明显延迟了；

[0145] B：影象对比在植入区域的减弱相比其它区域略微延迟了；

[0146] C：影象对比在植入区域的减弱相比其它区差不多相同；

[0147] D：影象对比在植入区域的增强几乎没有。

[0148] 表1

[0149]样品 平均囊泡尺寸 被包封 肿瘤成 注释
*1
序号 (μm) 碘的重量比 像水平
1 0.12 5.6 A 实施例8
2 0.12 3.4 B 实施例9
3 0.10 4.6 B 实施例10
4 0.08 3.4 B 实施例11
5 0.13 5.8 A 实施例12
6 0.15 7.2 C 对比实施例2
7 0.11 2.8 C 对比实施例3
8 0.58 3.7 D 对比实施例4

[0150] *1：脂质体囊泡内包封的碘化合物与脂质体囊状膜脂质的重量比

[0151] 从表1中明显可以看出，样品8的脂质体囊泡的尺寸大于0.5μm，导致了失效的肿瘤成像水平。相反，与通过溶解在有机溶剂中制得的样品6至8相比较，通过将磷脂溶解在超临界二氧化碳中制备得到的样品1到5，表现出极佳的肿瘤成像水平。

[0152] 实施例14

[0153] 将0.04g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、1.2mg的pluronic(F-88，来自ADEKA Co.)和0.9g乙醇的混合物，加入至不锈钢高压反应釜内，将高压釜内部加热到60℃，随后，加入2 2
13g液态二氧化碳。将高压釜内的压力从50kg/cm 升高到200kg/cm，在高压釜内搅拌使DPPC溶解在超临界二氧化碳中。在搅拌超临界二氧化碳溶液的同时，使用定量泵持续加入含有647mg/ml的碘海醇(具有300mg/ml的碘含量)、1.21mg/ml的氨基丁三醇和0.1mg/ml的乙二胺四乙酸钙二钠(EDTANa2-Ca)的溶液5g，该溶液用盐酸或氢氧化钠调节pH到大约等于7。其后，将高压釜内抽真空排出二氧化碳，得到包封碘海醇的脂质体分散体。将得到的分散体加热到60℃，且用0.1μm由Advantech Co.生产的纤维素类过滤器进行压力过滤。将这样得到的造影剂命名为样品9。脂质体的平均囊泡尺寸为0.12μm且脂质体基本上是单层囊泡。包封在囊泡内的碘化合物与囊泡膜脂质的重量比是5.6。

[0154] 除了调高了压力，控制了排空速度和改变了所用磷脂的量，与实施例14相同地，脂质体分散体是通过用0.1μm、0.2μm或者0.4μm的纤维素类过滤器进行压力过滤制备得到的，且命名为样品10到15。

[0155] 样品16的制备方法同实施例1，只是加进不锈钢高压反应釜的混合物是0.04g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、0.01g胆固醇、1.2mg的pluronic(F-88，来自ADEKA Co.)和0.9g乙醇。样品17的制备同样品16，只是没有使用pluronic F-88。对比样品18的制备同样品9，只是没有使用pluronic F-88。样品9到18均被证明是单层囊泡。

[0156] 各个样品包含的脂质体见表2，涉及到脂质体囊状微粒、包封在脂质体内的碘化合物的碘含量与脂质的重量比，和包封在脂质体内的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。

[0157] 表2

[0158]样品 平均囊泡尺寸 包封的碘化合物
序号 (μm)
*1 *2
重量比 比例(wt％)
9 0.12 5.6 25
10 0.10 3.6 23
11 0.08 3.6 21
12 0.13 3.8 23
13 0.16 5.2 28
14 0.11 2.8 17
15 0.22 3.8 24
16 0.12 3.2 25
17 0.11 3.2 20
18 0.15 5.2 28

[0159] *1：包封在脂质体内的碘化合物与脂质体囊泡膜脂质的重量比

[0160] *2：包封在脂质体囊泡内的碘化合物占全部碘化合物的重量百分比[0161] 实施例15

[0162] 将样品9到18分别加入到生理盐水溶液中，密封后加热到42℃，放置3天。这样用光学显微镜观察老化的(aged)样品和未经老化的样品。

[0163] 在任何一个未老化的样品中都没有观察到微粒。在老化的样品18中，观察到了几微米的脂质体微粒，推断其可能是由于脂质体囊泡的聚集作用形成的。这种脂质体微粒在样品17中也有少许被观察到。在又经过了4天的老化后，这种脂质体微粒在样品9到15中有少许被观察到，在样品16中没有观察到脂质体微粒。

[0164] 从上述的结果中可以看出，使用含有包含聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物或胆固醇的脂质体的造影剂能够增强稳定性。

[0165] 实施例16

[0166] 将样品9到18用等渗葡萄糖溶液稀释到浓度为50mg碘/ml。将此溶液分别经静脉注射进大鼠中，通过射线造影术观察到达肝脏的浓度，特别是样品17和18。

[0167] 结果证明使用含有没有聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物的脂质体囊泡的造影剂能够选择性的对肝脏成像。

[0168] 实施例17

[0169] 将VX2 calcinorma细胞悬浮液通过皮下植入兔子体内。植入两周后，将实施例14制得的造影剂样品9到18分别通过静脉注射到兔子体内，然后通过射线照相术观察。与样品13、15、17和18相比较，样品9、10、11、12、14和16的成像水平或影象对比在兔子植入区域的减弱延迟了。

[0170] 实施例18

[0171] 将0.032g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、0.008g胆固醇、1.2mg的pluronic(F-88，来自ADEKA Co.)和0.9g乙醇的混合物，加入至不锈钢高压反应釜内，将高压釜内部加热到2 2
60℃，随后，加入13g液态二氧化碳。将高压釜内的压力从50kg/cm 升高到200kg/cm，在高压釜内搅拌使DPPC溶解在超临界二氧化碳中。在搅拌超临界二氧化碳溶液的同时，使用定量泵持续加入含有647mg/ml的碘海醇(iohexol)(具有300mg/ml的碘含量)、1.21mg/ml的氨基丁三醇和0.1mg/ml的乙二胺四乙酸钙二钠(EDTANa2-Ca)的溶液5g，该溶液也用盐酸或氢氧化钠调节pH到大约等于7。其后，将高压釜内抽真空排出二氧化碳，得到包封碘海醇的脂质体分散体。将得到的分散体加热到60℃，用0.1μm由Advantech Co.生产的纤维素类过滤器进行压力过滤。将这样制得的造影剂命名为样品19。脂质体的平均囊泡尺寸为
0.12μm且脂质体基本上是单层囊泡。被包封的碘化合物与脂质体膜脂质的重量比是5.6，包封在脂质体内的碘化合物占全部碘化合物重量的23％。

[0172] 除了调高了压力，控制了排空速度和改变了所用磷脂的量，与实施例19相同地，脂质体分散体通过用0.1μm、0.2μm和0.4μm的纤维素类过滤器进行压力过滤制备得到的，且命名为样品20到25。样品20到25均被证明基本上包含单层脂质体。在表3中，列出了各样品含有的脂质体，其涉及脂质体囊状微粒、包封在脂质体内的碘化合物的碘含量与脂质体囊泡膜脂质的重量比，和包封在脂质体内的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。

[0173] 样品26的制备方法同样品19，只是所用的是0.024g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和0.006g胆固醇，且分别调整了压力和排空速度。

[0174] 样品27的制备方法同样品19，只是所用的是0.048g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和0.002g胆固醇，且分别调整了压力和排空速度。

[0175] 样品26和27均为单层囊泡的脂质体。各样品中包含的脂质体见表3，其涉及脂质体囊泡、包封在脂质体囊泡内的碘化合物的碘含量与脂质的重量比，和包封在脂质体内的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。

[0176] 样品29到37的制备方法分别同样品19到27，只是均没有使用乙二胺四乙酸钙二钠(EDTA Na2-Ca)。样品29到27均为单层囊泡的脂质体。各样品中包含的脂质体见表3，其涉及脂质体囊泡、包封在脂质体囊泡内的碘化合物的碘含量与脂质的重量比，和包封在脂质体囊泡内的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。从表中可以明显看出，这些样品和使用了乙二胺四乙酸钙二钠的样品表现出几乎相同的结果。

[0177] 样品39到47的制备方法分别同样品19到27，只是均没有使用氨基丁三醇。样品39到47均为单层囊泡的脂质体。各样品中包含的脂质体见表3，其涉及脂质体囊泡、包封在脂质体囊泡内的碘化合物的碘含量与囊泡膜脂质的重量比，和包封在脂质体囊泡内的碘化合物占全部碘化合物量的百分比。从表中可以明显看出，这些样品和使用了氨基丁三醇的样品表现出几乎相同的结果。

[0178] 对比样品119到127、129到137和139到147的制备方法分别同样品19到27、29到37和39到47，只是各个样品所得的脂质体分散体分别用等渗盐溶液进行透析，使包含在脂质体分散体的含水介质中的碘化合物和辅助性添加剂的浓度低于其被包封在脂质体内的浓度。在表3中，列出了各样品中包含的脂质体，涉及平均脂质体囊泡尺寸、包封在脂质体囊泡内的碘化合物的碘含量与膜脂质的重量比，和包封在脂质体囊泡内的碘化合物占全部碘化合物的百分比。

[0179] 实施例19

[0180] 稳定性评测

[0181] 将生理盐水分别加入到实施例18中制得的样品中，密封后，加热到42℃，放置14天。用光学显微镜观察这样老化的(aged)样品和未经老化的样品。

[0182] 在任何一个未老化的样品中都没有观察到微粒。在一些老化的对比样品中，观察到了几微米的微粒，推断其可能是由于脂质体囊状微粒的聚集作用形成的。老化稳定性的评测根据下列标准：

[0183] 5：没有观察到聚集的微粒；

[0184] 4：观察到几个聚集的微粒；

[0185] 3：聚集的微粒比较明显；

[0186] 2：观察到许多聚集的微粒；

[0187] 1：观察到大量聚集的微粒。

[0188] 实施例20

[0189] 从表3中明显可以证明，当脂质体内部和外部的水溶性成分不同时，稳定性降低了。那些用0.1到0.4μm的过滤器过滤的样品得到了增强稳定性。相反，当脂质体内部和外部的水溶性成分相同时，由于水溶性胺类缓冲液或螯合剂的存在，得到了增强的稳定性。

[0190] 表3

[0191]样品 浓度 是否 包封的碘化合物 稳定
差别 过滤 平均囊泡
序号 尺寸(μm) 性
*1 *2 重量比*3 比例(wt％)*4
19 无 无 0.12 3.7 23 4
20 无 是 0.07 3.4 21 5
21 无 是 0.095 3.2 20 5
22 无 是 0.12 3.8 24 5
23 无 是 0.15 3.7 23 5
24 无 是 0.18 4.0 25 5
25 无 是 0.21 3.9 24 5
26 无 是 0.12 6 28 5
27 无 是 0.12 2.5 23 5
29 无 无 0.12 3.7 23 4
30 无 是 0.07 3.4 21 4
31 无 是 0.095 3.2 20 4
32 无 是 0.12 3.8 24 4
33 无 是 0.15 3.7 23 4
34 无 是 0.18 4.0 25 4
35 无 是 0.21 3.9 24 4
36 无 是 0.12 6 28 4
37 无 是 0.12 2.5 23 4
39 无 无 0.12 3.7 23 4

[0192] *1：水溶性成分在脂质体内外的浓度差别

[0193] *2：使用孔径0.1μm、0.2μm和0.4μm的过滤器进行过滤

[0194] *3：包封在脂质体囊泡内的碘化合物与脂质体囊泡膜脂质的重量比[0195] *4：包封在囊泡内的碘化合物占全部碘化合物的重量百分比

[0196] 表3(续-1)

[0197]样品 浓度 是否 包封的碘化合物 稳定
差别 过滤 平均囊泡
*1 *2
序号 尺寸(μm) 性
重量比*3 比例(wt％)*4
40 无 是 0.07 3.4 21 4
41 无 是 0.095 3.2 20 4
42 无 是 0.12 3.8 24 4
43 无 是 0.15 3.7 23 4
44 无 是 0.18 4.0 25 4
45 无 是 0.21 3.9 24 4
46 无 是 0.12 6.0 28 4
47 无 是 0.12 2.5 23 4
119 是 无 0.12 3.7 23 2
120 是 是 0.07 3.4 21 3
121 是 是 0.095 3.2 20 3
122 是 是 0.12 3.8 24 3
123 是 是 0.15 3.7 23 3
124 是 是 0.18 4.0 25 3
125 是 是 0.21 3.9 24 2
126 是 是 0.12 6.0 28 2
127 是 是 0.12 2.5 23 3
129 是 无 0.12 3.7 23 2

[0198] *1：水溶性成分在脂质体内外的浓度差别

[0199] *2：使用孔径0.1μm、0.2μm和0.4μm的过滤器进行过滤

[0200] *3：包封在脂质体囊泡内的碘化合物与脂质体囊泡膜脂质的重量比[0201] *4：包封在囊泡内的碘化合物占全部碘化合物的重量百分比

[0202] 表3(续-2)

[0203]样品 浓度 是否 平均囊泡 包封的碘化合物 稳定
差别 过滤
序号 尺寸(μm) 性
*1 *2 重量比*3 比例(wt％)*4
130 是 是 0.07 3.4 21 3
131 是 是 0.095 3.2 20 3
132 是 是 0.12 3.8 24 3
133 是 是 0.15 3.7 23 3
134 是 是 0.18 4.0 25 2
135 是 是 0.21 3.9 24 2
136 是 是 0.12 6.0 28 2
137 是 是 0.12 2.5 23 3
139 是 无 0.12 3.7 23 2
140 是 是 0.07 3.4 21 2
141 是 是 0.095 3.2 20 2
142 是 是 0.12 3.8 24 2
143 是 是 0.15 3.7 23 2
144 是 是 0.18 4.0 25 2