适用作毒蕈碱性受体拮抗剂的联苯基化合物转让专利
申请号 : CN200580007636.8
文献号 : CN1930125B
文献日 : 2010-07-21
发明人 : M·玛曼 , 季玉华 , 穆永琪 , C·休斯菲尔德 , 李莉
申请人 : 施万制药
摘要 :
权利要求 :
1.下式的化合物，或者其药学上可接受的盐：
其中：
m是0或1；
R4选自氢和(1-4C)烷基；
s是0、1或2；
Ar1表示亚苯基，其中该亚苯基被(R5)q取代，其中q是0或1至2的整数，并且每个R5独立地选自卤素或(1-4C)烷氧基；
t是0、1或2；以及
R7和R8独立地是氢或(1-4C)烷基；
其中R5、R7和R8中的每个烷基和烷氧基任选地被1至5个氟取代基取代。
2.权利要求1的化合物，其中m是0，s是0并且t是1。
3.权利要求1的化合物，其中-CONR7R8基团处于对位位置。
4.权利要求1的化合物，其中Ar1表示苯-1，3-亚基或苯-1，4-亚基；其中该亚苯基任选被一个或者两个R5取代基取代。
5.权利要求4的化合物，其中Ar1表示苯-1，4-亚基，其任选被一个或者两个R5取代基取代。
6.权利要求1至4任一项的化合物，其中R4选自氢、甲基和乙基。
7.权利要求1至4任一项的化合物，其中R7选自氢、甲基、乙基、正-丙基和异丙基；并且R8是氢。
8.权利要求1至4任一项的化合物，其中R7和R8是乙基。
9.权利要求1的化合物，其中m是0；s是0；t是1；Ar1表示苯-1，4-亚基，其任选被一个或者两个R5取代基取代；-CONR7R8基团处于对位位置；并且R8是氢。
10.权利要求1的化合物，它选自：联苯-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯或其药学上可接受的盐。
11.药物组合物，它包含药学上可接受的载体和治疗有效量的权利要求1至10任一项的化合物。
12.权利要求11的药物组合物，其中该组合物还包含治疗有效量的选自β2肾上腺素能受体激动剂、甾体抗炎剂、磷酸二酯酶-4抑制剂和它们的组合的药剂。
13.权利要求12的药物组合物，其中该组合物包含治疗有效量的β2肾上腺素能受体激动剂和甾体抗炎剂。
14.制备权利要求1至10任一项的化合物的方法，该方法包括：(a)使式II的化合物：
或其盐，与式III的化合物反应：
其中Z1表示离去基团；或者(b)使式IV的化合物：
与式V的化合物：
或其反应性衍生物偶联；或者(c)使式VI的化合物：
其中Z2表示离去基团；与式VII的化合物反应：
或者
(d)使式II的化合物与式VIII的化合物：
在还原剂的存在下反应；或者(e)使式IX的化合物：
与式VII的化合物在还原剂的存在下反应；或者(f)使式XVIII的化合物：
其中R’是H、-CH3或-CH2CH3，与式XIX的化合物反应：NHR7R8
XIX
产生下式的化合物：
在上述各式中：
a、b、c、d和p各为0；
n为2；
m是0或1；
R4选自氢和(1-4C)烷基；
s是0、1或2；
Ar1表示亚苯基，其中该亚苯基被(R5)q取代，其中q是0或1至2的整数，并且每个R5独立地选自卤素或(1-4C)烷氧基；
t是0、1或2；以及
R7和R8独立地是氢或(1-4C)烷基；
其中R5、R7和R8中的每个烷基和烷氧基任选地被1至5个氟取代基取代。
15.权利要求14的方法，它还包括形成所得到产物的药学上可接受的盐。
16.权利要求1至10任一项的化合物在制备用于研究包含毒蕈碱性受体的生物系统或样品的产品中的用途。
17.含有权利要求1至10任一项的化合物的药物，该药物适用于治疗肺疾病。
18.权利要求17的药物，其适用于拮抗哺乳动物中的毒蕈碱性受体。
19.权利要求1至10任一项的化合物在制备用于治疗肺疾病的药物中的用途。
说明书 :
本发明的领域
本发明涉及具有毒蕈碱性受体拮抗剂活性或抗胆碱能活性的新的联苯基化合物。本发明还涉及包含这类联苯基化合物的药物组合物、制备这类联苯基化合物的方法和中间体以及使用这类联苯基化合物治疗肺疾病的方法。
本领域的状态
肺或呼吸障碍，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘，在世界范围内影响数百万人并且这类障碍是发病和死亡的主要原因。
已知毒蕈碱性受体拮抗剂产生支气管保护作用，因此，这类化合物适用于治疗呼吸障碍，例如COPD和哮喘。当被用于治疗这类障碍时，毒蕈碱性受体拮抗剂通常通过吸入给药。然而，即使通过吸入给药，常常显著量的毒蕈碱性受体拮抗剂被吸收到系统循环中，导致系统副作用，例如口干、瞳孔散大和心血管副作用。
另外，许多吸入的毒蕈碱性受体拮抗剂的作用持续时间较短，需要将它们每天多次给药。这种一天多次的给药方案不但不方便，而且由于患者对所需频繁给药方案的不顺应性，会产生显著的不充分治疗的风险。
因此，对新的毒蕈碱性受体拮抗剂存在需求。特别是，对当通过吸入给药时具有高效价和减少的系统副作用的新毒蕈碱性受体拮抗剂存在需求。另外，对作用持续时间长，从而允许一天一次或甚至一周一次给药的吸入的毒蕈碱性受体拮抗剂存在需求。预期这类化合物用于治疗肺疾病，例如COPD和哮喘特别有效，同时减少或消除副作用，例如口干和便秘。
本发明概述
本发明提供新的具有毒蕈碱性受体拮抗剂活性或抗胆碱能活性的联苯基化合物。除了其它的性质以外，现已发现当通过吸入给药时，本发明的化合物具有高效价和减少的全身副作用并且作用的持续时间长。
因此，在其组成方面的一方面，本发明提供式I的化合物，或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体：
其中：
a是0或1至5的整数；
每个R1独立地选自(1-4C)烷基、(2-4C)烯基、(2-4C)炔基、(3-6C)环烷基、氰基、卤素、-OR1a、-C(O)OR1b、-SR1c、-S(O)R1d、-S(O)2R1e、-NR1fR1g、-NR1hS(O)2R1i和-NR1jC(O)R1k；其中R1a、R1b、R1c、R1d、RA1e、R1f、R1g、R1h、R1i、R1j和R1k中的每一个独立地是氢、(1-4C)烷基或苯基(1-4C)烷基；
b是0或1至4的整数；
每个R2独立地选自(1-4C)烷基、(2-4C)烯基、(2-4C)炔基、(3-6C)环烷基、氰基、卤素、-OR2a、-C(O)OR2b、-SR2c、-S(O)R2d、-S(O)2R2e、-NR2fR2g、-NR2hS(O)2R2i和-NR2jC(O)R2k；其中R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、R2j和R2k中的每一个独立地是氢、(1-4C)烷基或苯基(1-4C)烷基；
W代表O或NWa，其中Wa是氢或(1-4C)烷基；
c是0或1至5的整数；
每个R3独立地表示(1-4C)烷基或者两个R3基团连接在一起形成(1-3C)亚烷基、(2-3C)亚烯基或环氧乙烷-2，3-二基；
m是0或1；
R4选自氢、(1-4C)烷基和(3-4C)环烷基；
s是0、1或2；
Ar1表示亚苯基或(3-5C)亚杂芳基，含有1或2个独立地选自氧、氮或硫的杂原子；其中亚苯基或亚杂芳基被(R5)q取代，其中q是0或1至4的整数并且每个R5独立地选自卤素、羟基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷氧基；
t是0、1或2；
n是0或1至3的整数；
d是0或1至4的整数；
每个R6独立地表示氟或(1-4C)烷基；
p是0或1；并且
R7和R8独立地是氢或(1-4C)烷基；
其中R1、R1a-1k、R2、R2a-2k、R3、R5、R6、R7和R8中的每个烷基和烷氧基任选被1至5个氟取代基取代。
在其组成方面的另一方面，本发明涉及药物组合物，它包含药学上可接受的载体和治疗有效量的式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。这类药物组合物可以任选含有其它治疗剂。因此，在一个实施方案中，本发明涉及这类药物组合物，其中该组合物还包含治疗有效量的甾体抗炎剂，例如皮质类固醇；β2肾上腺素能受体激动剂；磷酸二酯酶-4抑制剂；或者它们的组合。
本发明的化合物具有毒蕈碱性受体拮抗剂活性。因此，预期式I的化合物适用于治疗肺疾病，例如慢性阻塞性肺疾病和哮喘。
因此，在其方法方面的一方面，本发明涉及治疗肺疾病的方法，该方法包括给患者给予治疗有效量的式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
另外，在其方法方面的另一方面，本发明涉及在患者中产生支气管扩张作用的方法，该方法包括给患者给予产生支气管扩张量的式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
本发明还涉及治疗慢性阻塞性肺疾病或哮喘的方法，该方法包括给患者给予治疗有效量的式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
在其方法方面的另一方面，本发明涉及拮抗哺乳动物中毒蕈碱性受体的方法，它包括给所述哺乳动物给予治疗有效量的式I的化合物。
因为本发明的化合物具有毒蕈碱性受体拮抗剂活性，所以这类化合物还适用作研究工具。因此，在其方法方面的还另一方面，本发明涉及将式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体用作研究生物系统或样品的研究工具的方法，或用于发现新的具有毒蕈碱性受体拮抗剂活性的化合物的方法。
本发明还涉及适用于制备式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体的方法和新中间体。因此，在其方法方面的另一方面，本发明涉及制备式I的化合物的方法，该方法包括：
(a)使式II的化合物与式III的化合物反应；或者
(b)使式IV的化合物与式V的化合物偶联；或者
(c)使式VI的化合物与式VII的化合物反应；或者
(d)使式II的化合物与式VIII的化合物在还原剂的存在下反应；或者
(e)使式IX的化合物与式VII的化合物在还原剂的存在下反应；或者
(f)使式XVIII的化合物与式XIX的化合物反应；
如果必需，然后除去任何保护基，产生式I的化合物；其中式I-IX，XVIII和XIX的化合物，如本文中定义。
在一个实施方案中，上述方法进一步包括形成式I化合物的药学上可接受的盐的步骤。在其它的实施方案中，本发明涉及本文描述的其它方法；并且涉及通过本文描述的任意方法制备的产物。
本发明还涉及用于治疗中的或作为药剂的式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
另外，本发明涉及式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体，用于制备药剂的用途；尤其是用于制备用于治疗哺乳动物中肺疾病或拮抗毒蕈碱性受体的药物。
本发明的详细说明
在其组成方面的一方面，本发明涉及式I的新的联苯基衍生物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。这些化合物包含一个或多个手性中心，因此除非另外指出，本发明涉及外消旋混合物；纯立体异构体(即对映异构体或非对映异构体)；富含立体异构体的混合物等。除非另外指出，当本文展示或命名特定立体异构体时，本领域技术人员将理解少量的其它立体异构体可以存在于本发明的组合物中，条件是组合物作为整体的有用性不被这类其它异构体的存在消除。
本发明的化合物也包含多个碱性基团(例如氨基基团)，因此式I化合物可以作为游离碱或以各种盐形式存在。所有这类盐形式都包括在本发明范围内。此外，式I化合物的溶剂合物或其盐包括在本发明的范围内。
此外，除非另外指出，当可适用时，式I化合物的所有顺-反或E/Z异构体(几何异构体)、互变异构形式和拓扑异构形式包括在本发明的范围内。
式I的化合物，以及在其合成中使用的那些化合物还可以包括同位素标记的化合物，即，其中一个或多个原子富集有具有不用于自然界主要发现的原子质量的原子质量的原子。可以结合到式(I)化合物中的同位素的例子包括，但不限于2H、3H、13C、14C、15N、18O和17O。
本文采用的用以命名本发明化合物及其中间体的命名法一般是利用商业上可购得的AutoNom软件(MDL、San Leandro，California)派生的。通常，其中W是O的式I化合物被命名为联苯基-2-基氨基甲酸的酯衍生物。
有代表性的实施方案
下述取代基和值是为了提供本发明各方面和实施方案的有代表性的例子。这些有代表性的值是为了进一步定义和说明这些方面和实施方案，并不是为了排除其它实施方案或限制本发明的范围。在这一方面，除非具体指出，优选特定值或取代基的表述不是为了以任何方式从本发明排除其它值或取代基。
a和b的值独立地是0、1、2、3、4或5；尤其独立地为0、1或2，甚至更特别的是0或1。在一个实施方案中，a和b都是0。
当存在时，每个R1可以位于其所连接的苯基环的2、3、4、5或6-位。每个R1独立地选自(1-4C)烷基、(2-4C)烯基、(2-4C)炔基、(3-6C)环烷基、氰基、卤素、-OR1a、-C(O)OR1b、-SR1c、-S(O)R1d、-S(O)2R1e、-NR1fR1g、-NR1hS(O)2R1i和-NR1jC(O)R1k，其例子包括甲基、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、氨基、甲氨基、二甲氨基等。R1的特别的值是氟或氯。
当存在时，每个R2可以位于其所连接的亚苯基环的3、4、5或6-位(其中与氮原子连接的亚苯基环上的碳原子是1位)。每个R2独立地选自(1-4C)烷基、(2-4C)烯基、(2-4C)炔基、(3-6C)环烷基、氰基、卤素、-OR2a、-C(O)OR2b、-SR2c、-S(O)R2d、-S(O)2R2e、-NR2fR2g、-NR2hS(O)2R2i和-NR2jC(O)R2k，其例子包括甲基、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、氨基、甲氨基、二甲氨基等。R2的特别的值是氟或氯。
如在R1和R2中分别使用的，每个R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R1h、R1i、WR1j和R1k以及R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、R2j和R2k独立地是氢、(1-4C)烷基或苯基(1-4C)烷基，其例子包括氢、甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、异丁基、叔-丁基或苄基。在一个实施方案中，这些基团独立地是氢或(1-3C)烷基。在另一个实施方案中，这些基团独立地是氢、甲基或乙基。另外，R1、R1a-1k、R2和R2a-2k中的每个烷基和烷氧基任选地被1至5个氟取代基取代。
在本发明的一个实施方案中，W是O。在另一个实施方案中，W是NWa。一般说来，现已发现其中W表示O的化合物表现出特别高的对毒蕈碱性受体的亲和性。因此，本发明的特别实施方案中，W表示O。
当W是NWa时，Wa是氢或(1-4C)烷基，其例子包括氢、甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、异丁基和叔-丁基。在一个实施方案中，Wa是氢或(1-3C)烷基。在另一个实施方案中，Wa是氢、甲基或乙基，特别是氢或甲基。在还另一个实施方案中，Wa是氢并且NWa是NH。
c的值是0、1、2、3、4或5；特别是0、1或2；更特别是0或1。在一个特别的实施方案中，c是0。在另一个实施方案中，c是2。
每个R3独立地表示(1-4C)烷基或者两个R3结合在一起形成(1-3C)亚烷基、(2-3C)亚烯基或环氧乙烷-2，3-二基。在一个实施方案中，每个R3独立地是(1-4C)烷基，例如甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、异丁基和叔-丁基。另外，R3中的每个烷基任选地被1至5个氟取代基取代。在一个实施方案中，每个R3独立地是(1-3C)烷基，并且在另一个实施方案中，每个R3独立地是甲基或乙基。
在一个实施方案中，每个R3处于哌啶环的3、4或5-位上(其中哌啶环的氮原子是1位)。在特别的实施方案中，R3在哌啶环的4-位上。在另一个实施方案中，R3在哌啶环的1-位上，即，在哌啶环的氮原子上，因此形成季胺盐。
在还另一个实施方案中，两个R3基团连接在一起形成(1-3C)亚烷基或(2-3C)亚烯基。例如，在哌啶环的2和6-位上的两个R3基团可以结合形成亚乙基桥(即，哌啶环和R3基团形成8-氮杂双环[3.2.1]辛烷环)；或者在哌啶环的1和4-位上的两个R3基团可以结合形成亚乙基桥(即，哌啶环和R3基团形成1-氮杂双环[2.2.2]辛烷环)。在这一实施方案中，如本文中所定义的其它的R3基团也可以存在。
在还另一个实施方案中，两个R3基团连接在一起形成环氧乙烷-2，3-二基基团。例如，在哌啶环的2和6-位上的两个R3基团可以结合形成3-氧杂三环[3.3.1.02，4]壬烷环)。在这一实施方案中，如本文中所定义的其它的R3基团也可以存在。
m的值是0或1。在一个实施方案中，m是0。
R4表示氢、(1-4C)烷基或(3-4C)环烷基。(1-4C)烷基的例子包括甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、异丁基和叔-丁基。(3-4C)环烷基基团的例子包括环丙基和环丁基。在一个实施方案中，R4表示氢或(1-3C)烷基，特别是氢、甲基或乙基。在另一个实施方案中，R4是氢。
s的值是0、1或2。s的特别的值是0或1。在一个实施方案中，s是0。在另一个实施方案中，s是2。
Ar1是亚苯基或(3-5C)亚杂芳基，含有1或2个独立地选自氧、氮或硫的杂原子。亚苯基或亚杂芳基可以是未被取代的(q是0)，也可以被1、2、3或4(q是1、2、3或4)个R5取代基取代，该取代基独立地选自卤素、羟基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷氧基。另外，R5中的每个烷基和烷氧基任选地被1至5个氟取代基取代。q的值是0、1、2、3或4，特别是0、1、2或3。在一个实施方案中，q是0、1或2。对于Ar1的连接点在任意可利用的碳或杂原子环原子上。在某些实施方案中，Ar1是在间位或对位连接的亚苯基基团。
在一个实施方案中，Ar1是苯-1，3-亚基或苯-1，4-亚基，其中亚苯基未被取代或被1、2或3个R5取代基取代。有代表性的R5取代基包括氟、氯、溴、甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、二氟甲基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基和三氟甲氧基。这一实施方案中的Ar1基团的特殊例子包括2-氟苯-1，4-亚基、3-氟苯-1，4-亚基、2-氯苯-1，4-亚基、3-氯苯-1，4-亚基、2-甲基苯-1，4-亚基、3-甲基苯-1，4-亚基、2-甲氧基苯-1，4-亚基、3-甲氧基苯-1，4-亚基、2-三氟甲氧基苯-1，4-亚基、3-三氟甲氧基苯-1，4-亚基、2，3-二氟苯-1，4-亚基、2，5-二氟苯-1，4-亚基、2，6-二氟苯-1，4-亚基、2，3-二氯苯-1，4-亚基、2，5-二氯苯-1，4-亚基、2，6-二氯苯-1，4-亚基、2-氯代-5-甲氧基苯-1，4-亚基、2-氯代-6-甲氧基苯-1，4-亚基、2-氯代-5-三氟甲氧基苯-1，4-亚基、2-氯代-6-三氟甲氧基苯-1，4-亚基和2，5-二溴苯-1，4-亚基。
在另一个实施方案中，Ar1是(3-5C)亚杂芳基，含有1或2个独立地选自氧、氮或硫的杂原子；其中亚杂芳基未被取代或被1或2个R5取代基取代。有代表性的亚杂芳基包括吡咯、咪唑、噻唑、噁唑、呋喃、噻吩、吡唑、异噁唑、异噻唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶的二价基团，其中连接点在任意可利用的碳或氮环原子上。这类Ar1基团的更特定的例子包括2，5-亚呋喃基、2，4-亚噻吩基、2，5-亚噻吩基、2，5-亚吡啶基、2，6-亚吡啶基和2，5-亚吡咯基。有代表性的R5取代基包括氟、氯、甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、二氟甲基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基和三氟甲氧基。取代的Ar1基团的特殊例子包括3-氟-2，5-亚噻吩基、3-氯代-2，5-亚噻吩基、3-甲基-2，5-亚噻吩基、3-甲氧基-2，5-亚噻吩基和3-甲氧基-6-氯代-2，5-亚吡啶基。
在一个特别的实施方案中，Ar1表示苯-1，3-亚基、苯-1，4-亚基、2，4-亚噻吩基或2，5-亚噻吩基；其中亚苯基或亚噻吩基任选被1或2个R5取代基取代。在另一个特殊的实施方案中，Ar1表示苯-1，4-亚基或2，4-亚噻吩基，其任选被1或2个R5取代基取代。
t的值是0、1或2。t的特殊的值是1。
n的值是0、1、2或3。n的特殊的值是1或2。在一个实施方案中，n是2。
d的值是0、1、2、3或4。d的特殊的值是0、1或2。在一个实施方案中，d是0。
每个R6独立地表示氟或(1-4C)烷基，其例子包括甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、异丁基和叔-丁基。另外，R6中的每个烷基和烷氧基任选地被1至5个氟取代基取代。在一个实施方案中，每个R6独立地表示氟或(1-3C)烷基，并且在另一个实施方案中，每个R6独立地选自氟、甲基、乙基或三氟甲基。
p的值是0或1。在一个特别的实施方案中，p是0。
R7和R8各自独立地表示氢或(1-4C)烷基，其例子包括甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、异丁基和叔-丁基。在一个实施方案中，R7和R8各自独立地表示氢或(1-3C)烷基。在特别的实施方案中，R7是氢、甲基、乙基、正-丙基或异丙基并且R8是氢。在另一个特殊的实施方案中、R7和R8都是氢或都是乙基。另外，R7和R8中的每个烷基和烷氧基任选地被1至5个氟取代基取代。
如在式I中所注释的，-CONR7R8基团可以位于环上的任意碳原子上。例如，当n是2时，-CONR7R8基团可以位于邻、间或对位。在一个实施方案中，-CONR7R8基团位于间或对位；并且在特殊的实施方案中，-CONR7R8基团位于对位。
一组特殊的目标化合物是式I的化合物，其中a、b、c和d是0；n是2；并且R4是氢、甲基或乙基。
另一组特殊的目标化合物是式I的化合物，其中a、b、c和d是0；R4是氢、甲基或乙基；并且R7是氢。
另一组特殊的目标化合物是式I的化合物其中a、b、c和d是0；R4是氢、甲基或乙基；R7是氢、甲基、乙基、正-丙基或异丙基和R8是氢。
另一组特殊的目标化合物是式I的化合物其中a、b、c和d是0；R4是氢、甲基或乙基；并且R7和R8是乙基。
另一组特殊的目标化合物是式I的化合物其中a、b、c和d是0；R4是氢、甲基或乙基；R7和R8是氢；并且s是0。
另一组特殊的目标化合物是式I的化合物其中a、b、c和d是0；R4是氢、甲基或乙基；R7和R8是氢；s是0；并且t是1。
另一组特殊的目标化合物是式I的化合物其中a、b、c和d是0；R4是氢、甲基或乙基；R7和R8是氢；s是0；t是1；并且m是0。
有代表性的亚属基团
下面的亚属式和基团是用来提供本发明的各个方面和实施方案的有代表性的例子，这样除非另有说明，它们不用来将其它实施方案排除在外，也不用来限制本发明的范围。
一组特殊的式I的化合物是在2004年3月11日提交的美国临时申请No.60/552,443中公开的那些化合物。该组包括式Ia的化合物，或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体：
其中：
a是0或1至3的整数；每个R1独立地选自(1-4C)烷基、(2-4C)烯基、(2-4C)炔基、(3-6C)环烷基、氰基、卤素、-OR1a、-C(O)OR1b、-SR1c、-S(O)R1d、-S(O)2R1e和-NR1fR1g；R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g中的每一个独立地是氢、(1-4C)烷基或苯基(1-4C)烷基；
b是0或1至3的整数；每个R2独立地选自(1-4C)烷基、(2-4C)烯基、(2-4C)炔基、(3-6C)环烷基、氰基、卤素、-OR2a、-C(O)OR2b、-SR2c、-S(O)R2d、-S(O)2R2e和-NR2fR2g；R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、R2f和R2g中的每一个独立地是氢、(1-4C)烷基或苯基(1-4C)烷基；
W代表O或NWa，其中Wa是氢或(1-4C)烷基；
c是0或1至4的整数；每个R3独立地表示(1-4C)烷基；
m是0或1；
R4是氢或(1-4C)烷基；
s是0或1；
Ar1表示亚苯基或(3-5C)亚杂芳基，含有1或2个独立地选自氧、氮或硫的杂原子；其中亚苯基或亚杂芳基被(R5)q取代，其中q是0或1至4的整数并且每个R5独立地选自卤素、羟基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷氧基；
t是0或1；
n是0、1或2；
d是0或1至4的整数；每个R6独立地表示氟或(1-4C)烷基；并且
R7是氢或(1-4C)烷基；
其中R1、R1a-1g、R2、R2a-2g、R3、R5、R6或R7中的每个烷基和烷氧基任选被1至5个氟取代基取代。
该组还包括式Ib的化合物，或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体：
其中：R4、q、R5和R7如关于式Ia所定义。特殊实施方案包括式Ib的化合物，其中q是0、1或2并且R5独立地选自卤素、(1-4C)烷基或(1-4C)烷氧基，其中每个烷基和烷氧基任选被1至3个氟取代基取代。
另外，感兴趣的特殊的式I化合物包括：
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]乙氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{甲基-[4-(4-甲基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{甲基-[4-(4-丙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-异丙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-{2-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氟苯甲酰氨基]乙基}哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[2，5-二溴代-4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氟苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-{2-[4-(4-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氟苯甲酰氨基]乙基}哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氟苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(3-(S)-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[4-(2氨基甲酰基-哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰基-哌啶-1-基甲基)-2-甲氧基苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)噻吩-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)噻吩-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)噻吩-2-羰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)噻吩-2-羰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-1H-吡咯-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-1H-吡咯-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)呋喃-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-二乙基氨基甲酰基-哌啶-1-基甲基)呋喃-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)呋喃-2-羰基]-氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)呋喃-2-羰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-[2-({3-[4-(3-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰基}甲氨基)乙基]哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-[2-({3-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰基}甲氨基)乙基]哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{3-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{3-[4-(4-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{3-[4-(3-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-{2-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰氨基]乙基}哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氯代-苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氯代-5-甲氧基苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；以及
联苯基-2-基氨基甲酸1-[2-({2-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]乙酰基}甲氨基)乙基]哌啶-4-基酯；
或者它们的药学上可接受的盐或溶剂合物。
定义
当描述本发明的化合物、组合物、方法和过程时，除非另外指出，下述术语具有下述含义。
术语“烷基”指可能是直链或支链的一价饱和烃基。除非另外定义，这种烷基基团通常包含1-10个碳原子。有代表性的烷基基团包括，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。
术语“亚烷基”指可能是直链或支链的二价饱和烃基。除非另外定义，这种亚烷基基团通常包含1-10个碳原子。有代表性的亚烷基基团包括，亚甲基、乙烷-1，2-二基(“亚乙基”)、丙烷-1，2-二基、丙烷-1，3-二基、丁烷-1，4-二基、戊烷-1，5-二基等。
术语“烷氧基”指式(烷基)-O-的一价基团，其中烷基如本文所定义。有代表性的烷氧基基团包括，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。
术语“烯基”指可能是直链或支链的一价不饱和烃基，其具有至少1个，通常有1、2或3个碳碳双键。除非另外定义，这种烯基基团通常包含2-10个碳原子。有代表性的烯基基团包括，通过举例，乙烯基，正丙烯基，异丙烯基，正丁-2-烯基，正己-3-烯基等。术语“亚烯基”指二价烯基基团。
术语“炔基”指可能是直链或支链的一价不饱和烃基，其具有至少1个，通常有1、2或3个碳碳三键。除非另外定义，这种炔基基团通常包含2-10个碳原子。有代表性的炔基基团包括，乙炔基、正丙炔基、正丁-2-炔基、正己-3-炔基等。术语“亚炔基”指二价炔基基团。
术语“芳基”指具有单环(即苯基)或稠合环(即萘)的一价芳族烃。除非另外定义，这种芳基基团通常包含6-10个碳环原子。有代表性的芳基基团包括，苯基和萘-1-基、萘-2-基等。术语“亚芳基”指二价芳基基团。
术语“氮杂环烷基”指包含一个氮原子的一价杂环，即其中一个碳原子被氮原子取代的环烷基基团。除非另外定义，这类氮杂环烷基基团通常包含2-9个碳原子。氮杂环烷基基团的有代表性的例子是吡咯烷基和哌啶基基团。术语“亚氮杂环烷基”指二价氮杂环烷基基团。亚氮杂环烷基基团的有代表性的例子是亚吡咯烷基和亚哌啶基基团。
术语“环烷基”指一价饱和的碳环烃基。除非另外定义，这种环烷基基团通常包含3-10个碳原子。有代表性的环烷基基团包括，通过举例、环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。术语“环亚烷基”指二价环烷基基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。
术语“杂芳基”指具有单环或两个稠合环并且在环中包含至少一个(通常1-3个杂原子)选自氮、氧或硫的杂原子的一价芳基。除非另外定义，这种杂芳基基团通常包含5-10个总环原子。有代表性的杂芳基基团包括，通过举例，吡咯，咪唑，噻唑，噁唑，呋喃，噻吩，三唑，吡唑，异噁唑，异噻唑，吡啶，吡嗪，哒嗪，嘧啶，三嗪，吲哚，苯并呋喃，苯并噻吩，苯并咪唑，苯并噻唑，喹啉，异喹啉，喹唑啉，喹噁啉等的一价类，其中连接点是在任何可用的碳或氮环原子。术语“亚杂芳基”指二价杂芳基基团。
术语“杂环基”或“杂环”指具有单环或多稠合环且在环中包含至少一个选自氮、氧或硫的杂原子(通常1-3个杂原子)的一价饱和或不饱和(非芳香)基团。除非另外定义，这种杂环基团通常包含2-9个总环碳原子。有代表性的杂环基团包括，一价类的吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、哌啶、1、4-二噁烷、吗啉、硫代吗啉、哌嗪、3-吡咯林等，其中连接点是在任何可用的碳或氮环原子。术语“亚杂环基”指二价杂环基或杂环基团。
关于本文采用的特定术语当意指碳原子的特定数目时，在术语前的括号中显示碳原子数目。例如，术语“(1-4C)烷基”指具有1-4个碳原子的烷基基团。
术语“药学上可接受的盐”指能被接受用来给予患者例如哺乳动物的盐(例如对于给定的剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。这种盐可以衍生自药学上可接受的无机或有机碱和衍生自药学上可接受的无机或有机酸。衍生自药学上可接受的无机碱的盐包括铵、钙、铜、三价铁、二价铁、锂、镁、三价锰、二价锰、钾、钠、锌等。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药学上可接受的有机碱的盐包括伯胺盐、仲胺盐何叔胺盐，包括取代的胺、环胺、天然形成的胺等，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N、N′-二苄基亚乙基二胺、二乙基胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、亚乙基二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、海巴明、异丙基胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶(piperadine)、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙基胺、三甲基胺、三丙基胺、氨丁三醇等。来自药学上可接受的酸的盐包括醋酸盐、抗坏血酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙磺酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、龙胆酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、谷氨酸盐、马尿酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、萘-1，5-二磺酸盐、萘-2，6-二磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、对-甲苯磺酸盐、昔萘酸盐等。特别优选的是柠檬酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、羟乙磺酸盐、马来酸盐、萘-1，5-二磺酸盐、磷酸盐、硫酸盐和酒石酸盐。
术语“其盐”指当一种酸的氢被阳离子例如金属阳离子或有机阳离子等取代形成的化合物。优选地，该盐是药学上可接受的盐，但是对于不是给予患者的中间体化合物的盐来说不需要这样。
术语“溶剂合物”指通过一种溶质即式I化合物或其药学上可接受的盐的一个或多个分子与一种溶剂的一个或多个分子形成的复合物或聚集体。这种“溶剂合物”通常是具有实质上固定摩尔比的溶质和溶剂的结晶固体。有代表性的溶剂包括水、甲醇、乙醇、异丙醇、醋酸等。当溶剂是水时，形成的溶剂合物是水合物。
将理解，术语“或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体”指包括盐、溶剂合物和立体异构体的所有置换，例如式I化合物的立体异构体的药学上可接受的盐的溶剂合物。
术语“治疗有效量”指当给予需要治疗的患者时足以实现治疗的量。
本文采用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指治疗患者例如哺乳动物(尤其是人)的疾病或医学状况(例如COPD)，这包括：
(a)预防疾病或医学状况发生，即预防性治疗患者；
(b)改善疾病或医学状况，即在患者中消除或使疾病或医学状况消退；
(c)遏制疾病或医学状况，即在患者中延缓或阻止疾病或医学状况的发展；或者
(d)在患者中减轻疾病或医学状况的症状。
术语“离去基团”指在取代反应例如亲核取代反应中能够被另一官能团或原子取代的一个官能团或原子。有代表性的离去基团包括氯、溴和碘基团；磺酸酯基团，例如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、对溴苯磺酸酯、对硝基苯磺酸酯等；以及酰氧基基团，例如乙酰氧基，三氟乙酰氧基等。
术语“其受保护的衍生物”指其中化合物的一个或多个官能团被用保护或封端基团保护免于参与不需要的反应的特定化合物的衍生物。可以被保护的官能团包括，羧酸基团、氨基基团、羟基基团、硫羟基团、羰基基团等。羧酸的有代表性的保护基团包括酯类(例如对甲氧基苄基酯)、酰胺类和酰肼类；对于氨基基团，氨基甲酸酯类(例如叔-丁氧基羰基)和酰胺类；对于羟基基团，醚类和酯类；对于硫羟基团，硫醚类和硫酯类；对于羰基基团，缩醛类和缩酮类；等等。这些保护基团对于本领域技术人员是公知的，并且例如在T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups In Organic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999及其中引用的参考文献中有描述。
术语“氨基-保护基团”指适于在氨基基团防止不需要的反应的保护基团。有代表性的氨基-保护基团包括，但不限于，叔丁氧基羰基(BOC)、三苯甲基(Tr)、苄氧基羰基(Cbz)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲酰基、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBS)等。
术语“羧基-保护基团”指适于在羧基基团防止不需要的反应的保护基团。有代表性的羧基-保护基团包括，但不限于，酯，例如甲基、乙基、叔丁基、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二苯基甲基(二苯甲基、DPM)等。
术语“羟基-保护基团”指适于在羟基基团防止不需要的反应的保护基团。有代表性的羟基-保护基团包括，但不限于，甲硅烷基基团，包括三(1-6C)烷基甲硅烷基基团，例如三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)等；酯类(酰基基团)包括(1-6C)烷酰基基团，例如甲酰基，乙酰基等；芳基甲基基团，例如苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)、二苯基甲基(二苯甲基，DPM)等。此外，两个羟基基团也可以作为一个亚烷基被保护，例如丙-2-亚基(ylidine)，例如通过与酮例如丙酮反应形成的。
一般合成方法
本发明的联苯基化合物可以利用下述一般方法和步骤，或通过应用对于本领域普通技术人员来说容易获得的其它信息，由容易获得的原料来制备。虽然本文可能显示或描述本发明的特殊实施方案，但是本领域那些技术人员将会认识到，利用本文描述的方法或者通过应用对于本领域技术人员已知的其它方法、试剂和原料，可以制备本发明的所有实施方案或方面。也将会理解，除非另外陈述，当给出一般或优选的方法条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)时，也能使用其它方法条件。虽然最佳反应条件可以随着采用的特定反应物或溶剂变化，但是本领域技术人员通过常规优化程序能够容易地确定这些条件。
此外，如对于本领域的技术人员将显而易见的是，为防止某些官能团进行不合需要的反应，常规保护基团可能是必需的或期望的。对于特殊官能团的合适保护基团以及这种官能团的保护和脱保护的合适条件的选择，在本领域中是公知的。如果需要，可以采用除在本文描述的方法中说明的那些之外的保护基团。例如，大量的保护基团，以及它们的引入和除去，在T.W.Greene和G.M.Wuts，ProtectingGroups In Organic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999及其中引用的参考文献中有描述。
举例来说，可以通过包括如下步骤的方法制备式I的化合物：
(a)使式II的化合物：
或其盐，与式III的化合物反应：
其中Z1表示离去基团；或者
(b)使式IV的化合物：
与式V的化合物：
或其反应性衍生物偶联；或者
(c)使式VI的化合物：
其中Z2表示离去基团；与式VII的化合物反应：
或
(d)使式II的化合物与式VIII的化合物：
在还原剂的存在下反应；或者
(e)使式IX的化合物：
与式VII的化合物在还原剂的存在下反应；或者
(f)使式XVIII的化合物：
其中R’是H、-CH3或-CH2CH3，与式XIX的化合物反应：
NHR7R8
XIX
然后
(g)除去可能存在的任何保护基，产生式I的化合物；并且任选地，形成其药学上可接受的盐。
一般说来，如果在上述方法中使用原料之一的盐，例如酸加成盐，该盐通常在反应过程之前或在反应过程中被中和。该中和反应通常通过对于每摩尔当量的酸加成盐来说，使所述盐与一摩尔当量的碱接触来完成。
在步骤(a)中，式II化合物和III化合物之间的反应，Z1代表的离去基团可以是，例如，卤素，例如氯、溴或碘，或磺酸酯基，例如甲磺酸酯或甲苯磺酸酯。在碱，例如，叔胺例如二异丙基乙胺的存在下，方便地进行该反应。常规的溶剂包括腈类，例如乙腈。在0℃至100℃下方便地进行该反应。
在本领域中式II的化合物一般是已知的，或者可以通过式X的化合物脱保护来制备：
其中P1表示氨基保护基，例如苄基。使用氢气或甲酸铵和第VIII族金属催化剂，例如钯，通过还原方便地除去苄基。当W表示NWa时，使用Pearlman’s催化剂(Pd(OH)2)方便地进行氢化。
可以通过如下步骤制备式X的化合物：使式XI的异氰酸酯化合物：
XI
与式XII的化合物反应：
式III的化合物可以从其中Z1表示羟基的相应的化合物开始进行制备，例如，通过卤化剂，例如亚硫酰氯的反应，得到式III的化合物，其中Z1表示卤素，例如氯。其中Z1表示羟基的化合物可以被制备，例如，通过使式V的化合物与适合的氨基取代的醇，例如2-氨基乙醇或3-氨基丙烷-1-醇反应。
在步骤(b)中，使式IV的化合物与式V的化合物或其反应性衍生物反应。至于化合物V的“反应性衍生物”，它是指羧酸被活化，例如，通过形成醛或羧酸卤化物，例如羧酸氯化物。或者，可以使用常规羧酸/胺偶联试剂，例如碳二亚胺类，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’四甲尿鎓六氟磷酸盐(HATU)等活化羧酸。在常规形成酰胺键的条件下可方便地进行该反应。该步骤在-10℃至100℃范围内的温度下方便地进行。
可以通过如下步骤制备式IV的化合物：使式II的化合物与式XIII的化合物：
OHC(CH2)mCH2NR4P2
XIII
其中P2表示氢或氨基保护基，例如苄基，在还原剂，例如三乙酰氧基硼氢化钠的存在下反应，如果需要接着通过例如在钯存在下的氢化，除去氨基保护基P2。
可以通过如下步骤制备式V的化合物：使式VII的化合物与式XIV反应：
其中P3表示氢或羧基保护基，例如甲基或乙基，并且Z3表示离去基团，如果需要接着除去羧基保护基P3。或者，这类化合物可以通过将式XV的化合物：
用式VII的化合物在常规反应条件下，例如关于步骤(d)和(e)所述的那些条件下，还原性氨基化来制备。
关于步骤(c)，Z2代表的离去基团可以是，例如，卤素，例如氯、溴或碘，或磺酸酯基，例如甲磺酸酯基或甲苯磺酸酯基。该反应方便地在碱，例如，叔胺例如二异丙基乙胺的存在下进行。常用的溶剂包括腈类，例如乙腈。该反应方便地在0℃至100℃范围内的温度下进行。式VI的化合物可以通过使式IV的化合物与式XVI的化合物：
或其反应性衍生物，例如酰基氯或酸酐反应来制备。按照例如，本文所述步骤(b)的方法，可便利地进行该反应。式VII的化合物一般是已知的或者可以使用公知的合成方法，由可轻易获得的原料进行制备。
在步骤(d)中，还原剂可以是，例如，在第VIII族金属催化剂，例如钯存在下的氢气，或金属氢化物还原剂，例如硼氢化物，包括三乙酰氧基硼氢化钠。适合的溶剂包括醇类，例如甲醇。该反应便利地在0℃至100℃范围内的温度下进行。式VIII的化合物可以通过氧化对应于其中Z1表示羟基的式III的化合物进行制备。这类氧化反应可以，例如，使用二氧化硫吡啶复合物，在二甲基亚砜中，在叔胺，例如二异丙基乙胺的存在下来进行。
在步骤(e)中，还原剂可以是，例如，在第VIII族金属催化剂，例如钯存在下的氢气，或金属氢化物还原剂，包括硼氢化物，例如三乙酰氧基硼氢化钠，任选与四醇钛，例如四异丙醇钛联合使用。适宜的溶剂包括醇类，例如甲醇和卤代烃类，例如二氯甲烷。该反应便利地在0℃至100℃范围内的温度下进行。式IX的化合物可以通过使式IV的化合物与式XVII的化合物：
在羧酸/胺偶联剂，例如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)等存在下反应来制备。
关于步骤(f)，式XVIII的化合物可以通过使式IX的化合物与式VII的化合物在还原剂，例如三乙酰氧基硼氢化钠的存在下反应来制备，与在步骤(e)中进行的类似。
正如对本领域的技术人员显而易见的，使用本领域中公知的方法和试剂，可以进一步将通过步骤(a)到(f)中的任一步骤制备的式I的化合物衍生化，以形成其它的式I化合物。举例来说，可以使式I的化合物与溴反应，得到其中R2，例如，表示溴基团的相应的式I化合物。另外，可以将其中R4表示氢原子的式I化合物烷基化，得到其中R4表示(1-4C)烷基的相应的式I化合物。
本文描述的某些中间体被认为是新的，因此作为本发明的另一方面，提供这类化合物，包括例如，式III、V和VIII的化合物，及其盐。
在下面给出的实施例中描述了关于制备本发明有代表性的化合物或其中间体的具体反应条件或其它方法的进一步细节。
药物组合物和制剂
本发明的联苯基化合物通常是以药物组合物或制剂形式对患者给药的。这类药物组合物可以通过任何可接受的给药途径对患者给药，包括但不限于，吸入、口服、鼻用、局部(包括透皮)和肠胃外给药方式。
应该理解，适于特定给药模式的本发明化合物的任何形式(即游离碱、药学上可接受的盐、溶剂合物等等)可以被用在本文讨论的药物组合物中。
因此，在本发明组合物方面之一，本发明涉及包含药学上可接受的载体或赋形剂和治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体的药物组合物。任选地，如果需要，这类药物组合物可以包含其它治疗剂和/或制剂用物质。
本发明的药物组合物通常包含治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。通常，这类药物组合物将包含约0.01至约95％重量的活性剂；包括约0.01至约30％重量；例如约0.01至约10％重量的活性剂。
任何常规载体或赋形剂可以被用在本发明的药物组合物中。特定载体或赋形剂，或者载体或赋形剂的组合的选择，将取决于被用于治疗特定患者的给药模式或医学状况或疾病状态的类型。在这点上，用于特定给药模式的合适药物组合物的制备完全在药物领域技术人员的能力范围内。此外，用于这类组合物的成分是商业上可购得的，例如购自Sigma，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178。进一步举例来说，在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott Williams&White，Baltimore，Maryland(2000)；和H.C.Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，第7版，Lippincott Williams&White，Baltimore，Maryland(1999)中描述了常规制剂技术。
可以作为药学上可接受的载体的物质的有代表性的例子包括，但不限于，下述物质：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡类；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；(21)压缩推进气体，例如氯氟碳和氢氟碳；和(22)在药物组合物中使用的其它无毒相容性物质。
本发明的药物组合物通常是通过彻底地和密切地混合或掺合本发明的化合物和药学上可接受的载体和一种或多种任选的成分来制备的。如果必需或需要，可以利用常规方法和设备将得到的均匀混合的混合物塑形或加载到片剂、胶囊、丸剂、罐、药筒等中。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物适于吸入给药。用于吸入给药的适合药物组合物通常是气雾剂或粉末形式。这类组合物通常利用公知的给药装置给药，例如雾化器吸入器、定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或类似的给药装置。
在本发明的特定实施方案中，包含活性剂的药物组合物是利用雾化器吸入器通过吸入给药的。这种雾化器装置通常产生高速气流，它使得包含活性剂的药物组合物作为雾被喷入患者的呼吸道。因此，当被配制用于在雾化器吸入器中时，活性剂通常被溶解在合适的载体中以形成溶液。或者，可以将活性剂微粉化且与合适的载体混合，以形成可吸入大小的微粉化颗粒的悬浮液，其中微粉化通常被定义为大约90％或更多的颗粒具有小于约10μm的直径。合适的雾化器装置被商业上提供，例如由PARI GmbH(Starnberg，德国)。其它的雾化器装置包括Respimat(Boehringer Ingelheim)和那些例如在Lloyd等人的美国专利No.6,123,068和WO 97/12687(Eicher等人)中公开的装置。
用于雾化器吸入器中的有代表性的药物组合物包括等渗水溶液，它包含约0.05μg/mL至约10mg/mL式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
在本发明的另一个特定实施方案中，包含活性剂的药物组合物是利用干粉吸入器通过吸入给药的。这种干粉吸入器通常给予自由流动粉末形式的活性剂，其在吸入期间分散在患者的气流中。为了获得自由流动的粉末，通常将活性剂与合适的赋形剂例如乳糖或淀粉一起配制。
用于干粉吸入器中的有代表性的药物组合物的例子包括颗粒大小在约1μm和约100μm之间的干乳糖和式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体的微粉化颗粒。
这种干粉制剂可以，例如通过将乳糖和活性剂混合，然后干混合组分来制备。或者，如果需要，可以不用赋形剂来配制活性剂。然后通常将药物组合物装入干粉分配器中，或装入与干粉给药装置一起使用的吸入药筒或胶囊。
干粉吸入器给药装置的例子包括Diskhaler(GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC)(例如，参见Newell等人的美国专利No.5,035,237)；Diskus(GlaxoSmithKline)(例如，参见Davies等人的美国专利No.6,378,519；Turbuhaler(AstraZeneca，Wilmington，DE)(例如，参见Wetterlin等人的美国专利No.4,524,769)；Rotahaler(GlaxoSmithKline)(例如，参见Hallworth等人的美国专利No.4,353,365)和Handihaler(Boehringer Ingelheim)。在Casper等人的美国专利No.5,415,162、Evans等人的美国专利No.5,239,993和Armstrong等人的美国专利No.5,715,810及其中引用的参考文献中描述了合适的DPI装置的另外的例子。
在本发明的还另一个特定实施方案中，包含活性剂的药物组合物是利用定量吸入器通过吸入给药的。这种定量吸入器通常利用压缩推进气体放出测定量的活性剂或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。因此，利用定量吸入器给药的药物组合物通常包含活性剂在液化推进剂中的溶液或悬浮液。可以采用任何合适的液化推进剂，包括含氯氟烃，例如CC13F和氢氟烷类(HFAs)，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134a)和1，1，1，2，3，3，3-七氟-正-丙烷，(HFA 227)。由于担心含氯氟烃影响臭氧层，通常优选包含HFAs的制剂。HFA制剂的另外任选的成分包括共溶剂，例如乙醇或戊烷和表面活性剂，例如三油酸山梨坦、油酸、卵磷脂和甘油。参见例如Purewal等人的美国专利No.5,225,183、EP 0717987A2(Minnesota Mining and ManufacturingCompany)和WO 92/22286(Minnesota Mining and ManufacturingCompany)。
用于定量吸入器中的有代表性的药物组合物包含约0.01％至约5％重量的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体；约0％-约20％重量的乙醇；和约0％-约5％重量的表面活性剂；余下的是HFA推进剂。
这种组合物通常通过向包含活性剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的合适的器中加入冰冷的或加压的氢氟烷类进行制备。为制备悬浮液，将活性剂微粉化，然后与推进剂混合。然后将该制剂装入气雾剂罐，其形成定量吸入器装置的一部分。在Marecki的美国专利No.6,006,745和Ashurst等人的美国专利No.6,143,277中提供了特别为与HFA推进剂一起使用而开发的定量吸入器装置的例子。或者，悬浮液制剂可以通过在微粉化的活性剂颗粒上喷雾干燥表面活性剂的包衣来制备。参见，例如WO 99/53901(Glaxo Group Ltd.)和WO 00/61108(Glaxo Group Ltd.)。
至于制备可吸入颗粒的方法，以及适于吸入给药的制剂和装置的其它例子参见Gao等人的美国专利No.6,268,533、Trofast等人的美国专利No.5,983,956、Briggner等人的美国专利No.5,874,063和Jakupovic等人的美国专利No.6,221,398；以及WO 99/55319(GlaxoGroup Ltd.)和WO 00/30614(AstraZeneca AB)。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物适于口服给药。用于口服给药的合适药物组合物可以是胶囊、片剂、丸剂、锭剂、扁胶囊、糖衣丸、粉剂、颗粒剂形式；或作为在含水或无水液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油或油包水乳剂；或作为酏剂或糖浆等；每个包含预定量的作为活性成分的本发明的化合物。
当用于以固体剂型(即胶囊、片剂、丸剂等形式)口服给药时，本发明的药物组合物通常将包含作为活性成分的本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的载体，例如柠檬酸钠或磷酸二钙。任选地或可选择地，这种固体剂型也可以包含：(1)填充剂或增充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如十六醇和/或单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和/或膨润土；(9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和/或它们的混合物；(10)着色剂；以及(11)缓冲剂。
释放剂、湿润剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于本发明的药物组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸盐、丁基化的羟基苯甲醚(BHA)、丁基化的羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。用于片剂、胶囊、丸剂等的包衣剂包括用于肠溶衣的那些，例如醋肽纤维素(CAP)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、乙酸-1，2，4-苯三酸纤维素(CAT)、羧甲基乙基纤维素(CMEC)、羟丙甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(HPMCAS)等。
如果需要，本发明的药物组合物也可以被配制以提供活性成分的缓慢或控制释放，举例来说，利用不同比例的羟丙甲基纤维素；或其它聚合物基质、脂质体和/或微球。
此外，本发明的药物组合物可以任选地包含遮光剂并且可以被配制，使得它们仅仅或优先地在胃肠道的特定部分释放活性成分，任选地，以延迟的方式。可以被采用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。活性成分也可以是微囊化形式，如果合适，与一种或多种上述赋形剂一起。
用于口服给药的合适的液体剂型包括，举例来说，药学上可接受的乳剂、微乳、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。这种液体剂型通常包含活性成分和惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和它们的混合物。除活性成分以外，悬浮液可以包含混悬剂例如乙氧基化的异硬酯醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和西黄蓍胶和它们的混合物。
当想用于口服给药时，本发明的药物组合物优选地被包装在单元剂型中。术语“单元剂型”指适于给药患者的物理上离散的单元，即每个单元包含被计算单独或与一个或多个另外的单元结合产生需要的治疗效果的预定量的活性剂。例如，这种单元剂型可以是胶囊、片剂、丸剂等。
本发明的化合物也可以利用已知的透皮给药系统和赋形剂透皮给药。例如，本发明的化合物能够与渗透促进剂混合，例如丙二醇、聚乙二醇单月桂酸酯、氮杂环烷-2-酮等，并被加入贴片或相似的给药系统。如果需要，可以在这种透皮组合物中使用另外的赋形剂包括胶凝剂、乳化剂和缓冲剂。
本发明的药物组合物也可以包含其它治疗剂，该治疗剂与式I化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体共给药。例如，本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种选自其它支气管扩张剂(例如PDE3抑制剂、腺苷2b调质和β2肾上腺素能受体激动剂)；抗炎剂(例如甾体抗炎剂，例如皮质类固醇类；非甾体抗炎剂(NSAIDs)和PDE4抑制剂)；其它毒蕈碱性受体拮抗剂(即抗胆碱能剂)；抗感染剂(例如革兰氏阳性和革兰氏阴性抗生素或抗病毒药)；抗组胺药；蛋白酶抑制剂；和传入阻滞剂(例如D2激动剂和神经激肽调质)的治疗剂。其它治疗剂可以以药物上可接受的盐或溶剂合物的形式应用。此外，如果合适，其它治疗剂可以以光学纯立体异构体的形式使用。
能够与本发明化合物组合使用的有代表性的β2肾上腺素能受体激动剂包括，但不限于沙美特罗、沙丁胺醇、福莫特罗、沙甲胺醇、非诺特罗、特布他林、沙丁胺醇、异他林、奥西那林、比托特罗、吡布特罗、左沙丁胺醇等，或它们的药学上可接受的盐。可以与本发明化合物组合使用的其它β2肾上腺素能受体激动剂包括，但不限于3-(4-{[6-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟基甲基)-苯基]乙基}氨基)-己基]氧}丁基)苯磺酰胺和3-(3-{[7-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟基甲基)苯基]乙基}-氨基)庚基]氧}-丙基)苯磺酰胺和在WO 02/066422(GlaxoGroup Ltd.)中公开的相关化合物；3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟基甲基)苯基]乙基]氨基)己基]氧}丁基)-苯基]咪唑烷-2，4-二酮和在WO 02/070490(Glaxo Group Ltd.)中公开的相关化合物；3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羟基苯基]-2-羟基乙基}氨基)己基]氧}丁基)-苯磺酰胺；3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羟基苯基]-2-羟基乙基}氨基)己基]氧}丁基)-苯磺酰胺，3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羟基苯基]-2-羟基乙基}氨基)己基]氧}丁基)-苯磺酰胺，N-(叔丁基)-3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羟基苯基]-2-羟基乙基}氨基)己基]-氧}丁基)苯磺酰胺，N-(叔丁基)-3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羟基苯基]-2-羟基乙基}氨基)-己基]氧}丁基)-苯磺酰胺，N-(叔-丁基)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羟基苯基]-2-羟基乙基}氨基)己基]-氧}丁基)苯磺酰胺和在WO 02/076933(Glaxo Group Ltd.)中公开的相关化合物；4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2，6-二氯苄基)氧]乙氧基}己基)氨基]-1-羟乙基}-2-(羟甲基)苯酚和在WO 03/024439(Glaxo Group Ltd.)中公开的相关化合物；N-{2-[4-((R)-2-羟基-2-苯基乙氨基]苯基}乙基}-(R)-2-羟基-2-(3-甲酰氨基-4-羟基苯基)乙胺和在美国专利No.6,576,793(Moran等)中公开的相关化合物；N-{2-[4-(3-苯基-4-甲氧基苯基)氨基苯基]乙基}-(R)-2-羟基-2-(8-羟基-2(1H)-喹啉酮-5-基)乙胺和在Moran等的美国专利No.6,653,323中公开的相关化合物；以及它们的药学上可接受的盐。在特殊的实施方案中，β2肾上腺素能受体激动剂是N-{2-[4-((R)-2-羟基-2-苯基乙氨基)苯基]乙基}-(R)-2-羟基-2-(3-甲酰氨基-4-羟基苯基)乙胺的结晶单盐酸盐。当使用时，β2-肾上腺素能受体激动剂将以治疗有效量存在于药物组合物中。通常，β2-肾上腺素能受体激动剂以足以提供每剂量约0.05μg至约500μg的量存在。
能够与本发明化合物组合使用的有代表性的甾体抗炎剂包括，但不限于，甲基泼尼松龙、泼尼松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲基酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-(2-氧-四氢呋喃-3S-基)酯、倍氯米松酯(例如17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼缩松、莫米松酯(例如糠酸酯)、曲安西龙、罗氟奈德、环索奈德、布替可特丙酸酯、RPR-106541、ST-126等，或它们的药学上可接受的盐。当使用时，甾体抗炎剂将以治疗有效量存在于药物组合物中。通常，甾体抗炎剂将以足以提供每剂量约0.05μg至约500μg的量存在。
示范性的组合是式I的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体，与作为β2肾上腺素能受体激动剂的沙美特罗，以及作为甾体抗炎剂的丙酸氟替卡松共给药。另一个示范性的组合是式I的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体，与作为β2肾上腺素能受体激动剂的N-{2-[4-(R)-2-羟基-2-苯乙氨基)苯基]乙基}-(R)-2-羟基-2-(3-甲酰氨基-4-羟基苯基)乙胺的结晶单盐酸盐，以及作为甾体抗炎剂的6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯共给药。
其它合适的组合包括，例如其它抗炎剂，例如NSAIDs(例如色甘酸钠；奈多罗米钠；磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如茶碱、PDE4抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂)；白三烯拮抗剂(例如孟鲁司特)；白细胞三烯合成的抑制剂；iNOS抑制剂；蛋白酶抑制剂，例如类胰蛋白酶和弹性酶抑制剂；β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(例如腺苷2a激动剂)；细胞因子拮抗剂(例如趋化因子拮抗剂例如白细胞介素抗体(αIL抗体)，特别地，αIL-4疗法，αIL-13疗法或它们的组合)；或细胞因子合成的抑制剂。
例如，能够与本发明化合物组合使用的有代表性的磷酸二酯酶-4(PDE4)抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂包括，但不限于顺式4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸、2-甲酯基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-酮；顺-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-醇]；顺-4-氰基-4-[3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基]环己烷-1-羧酸等，或它们的药学上可接受的盐。其它有代表性的PDE4或混合的PDE4/PDE3抑制剂包括AWD-12-281(elbion)；NCS-613(INSERM)；D-4418(Chiroscience和Schering-Plough)；CI-1018或PD-168787(Pfizer)；在WO99/16766(Kyowa Hakko)中公开的苯并间二氧杂环戊烯化合物；K-34(Kyowa Hakko)；V-11294A(Napp)；罗氟司特(Byk-Gulden)；在WO99/47505(Byk-Gulden)中公开的pthalazinone化合物；普马芬群(Byk-Gulden，now Altana)；阿罗茶碱(Almirall-Prodesfarma)；VM554/UM565(Vernalis)；T-440(Tanabe Seiyaku)；和T2585(TanabeSeiyaku)。
可以与本发明化合物组合使用的(除了本发明的化合物以外)有代表性的毒蕈碱性拮抗剂(即抗胆碱能剂)包括，但不限于阿托品、硫酸阿托品、氧阿托品、甲基硝酸阿托品、氢溴酸后马托品、氢溴酸莨菪碱(d，l)、氢溴酸东莨菪碱、异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托溴铵、溴甲胺太林、丙胺太林溴化物、辛托品甲基溴化物、克利溴铵、copyrrolate(甘罗溴铵)、异丙碘铵、溴美喷酯、氯化三乙己苯铵(Pathilone)、甲硫己环铵、盐酸环戊通、托吡卡胺、盐酸苯海索、哌仑西平、替仑西平、AF-DX 116和美索曲明等，或它们的药学上可接受的盐；或者，列出的那些化合物作为盐，它们的可替换的药学上可接受的盐。
可以与本发明化合物组合使用的有代表性的抗组胺药(即H1-受体拮抗剂)包括，但不限于，乙醇胺类，例如马来酸卡比沙明、富马酸氯马斯汀、盐酸苯海拉明和茶苯海明；乙二胺类，例如马来酸(amleate)美吡拉敏、盐酸苄吡二胺和柠檬酸苄吡二胺；烷基胺类，例如氯苯那敏和阿伐斯汀；哌嗪类，例如盐酸羟嗪、双羟萘酸羟嗪、盐酸苯甲嗪、乳酸赛克利嗪、盐酸美克洛嗪和盐酸西替立嗪；哌啶类，例如阿司咪唑、左卡巴斯汀盐酸盐、氯雷他定或它的去乙氧羰基类似物、特非那定和盐酸非索那定；盐酸氮卓斯丁等，或它们的药学上可接受的盐；或者，列出的那些化合物作为盐，它们的可替换的药学上可接受的盐。
与本发明化合物组合给药的其它治疗剂的适合剂量在每天大约0.05μg至每天大约100mg范围内。
下述制剂举例说明本发明有代表性的药物组合物：
制剂实施例A
如下制备通过吸入给药的干粉：
有代表性的方法：将本发明化合物微粉化，然后与乳糖混合。将该混合的混合物装入明胶吸入药筒。利用粉末吸入器给药药筒内容物。
制剂实施例B
如下制备用在干粉吸入装置中的干粉制剂：
有代表性的方法：制备了本发明微粉化化合物与乳糖的混合(bulk)制剂比为1∶200的药物组合物。将该组合物装入每剂量能够传递约10μg至100μg本发明化合物的干粉吸入装置。
制剂实施例C
如下制备在定量吸入器中通过吸入给药的干粉：
有代表性的方法：通过将10g平均粒径小于10μm的微粉化颗粒形式的本发明化合物分散在由0.2g卵磷脂溶解在200mL软化水中形成的溶液中，制备包含5wt％本发明的化合物和0.1wt％卵磷脂的悬浮液。将该悬浮液喷雾干燥并将得到的物质微粉化成平均直径小于1.5μm的颗粒。将颗粒装入有加压的1，1，1，2-四氟乙烷的药筒中。
制剂实施例D
如下制备用于定量吸入器的药物组合物：
有代表性的方法：通过将5g平均粒径小于10μm的微粉化颗粒形式的活性成分分散在由0.5g海藻糖和0.5g卵磷脂溶解在100mL软化水中形成的胶体溶液中，制备包含5wt％本发明化合物、0.5wt％卵磷脂和0.5wt％海藻糖的悬浮液。将该悬浮液喷雾干燥并将得到的物质微粉化成平均直径小于1.5μm的颗粒。将颗粒装入有加压的1，1，1，2-四氟乙烷的灌中。
制剂实施例E
如下制备用于雾化器吸入器的药物组合物：
有代表性的方法：用于雾化器中的水性气溶胶制剂是通过将0.1mg本发明化合物溶解在用柠檬酸酸化的1mL 0.9％氯化钠溶液中进行制备的。搅拌并声处理混合物直到活性成分溶解。通过缓慢添加NaOH将溶液的pH调整至3至8范围内的值。
制剂实施例F
如下制备用于口服给药的硬明胶胶囊：
有代表性的方法：将成分彻底混合，然后装入硬明胶胶囊(每个胶囊460mg组合物)。
制剂实施例G
如下制备用于口服给药的悬浮液：
有代表性的方法：将成分混合以形成每10mL悬浮液包含100mg活性成分的悬浮液。
制剂实施例H
如下制备可注射的制剂：
有代表性的方法：混合上述成分，并用0.5N HCl或0.5N NaOH将pH调节至4±0.5。
实用性
预期本发明的联苯基化合物适用作毒蕈碱性受体拮抗剂，因此，预期这类化合物适用于治疗由毒蕈碱性受体介导的医学状况，即，通过用毒蕈碱性受体拮抗剂得到改善的医学状况。这类医学状况包括，举例来说，肺障碍或疾病，包括与可逆性气道阻塞有关的那些，例如慢性阻塞性肺疾病(例如，慢性和喘鸣支气管炎以及肺气肿)、哮喘、肺纤维化、过敏性鼻炎、鼻溢等。可以用毒蕈碱性受体拮抗剂治疗的其它医学状况是生殖泌尿道障碍，例如膀胱活动过度或逼肌活动过强和它们的症状；胃肠道障碍，例如过敏性肠综合征、憩室疾病、弛缓不能、胃肠运动过度障碍和腹泻；心律失常，例如窦性心动过缓；帕金森氏病；认知障碍，例如阿尔茨海默氏病；dismenorrhea；等。
在一个实施方案中，本发明的化合物适用于治疗哺乳动物，包括人类和他们的伙伴动物(例如，狗、猫等)中的平滑肌障碍。这类平滑肌障碍包括，举例来说，膀胱活动过度、慢性阻塞性肺疾病和过敏性肠综合征。
当被用于治疗平滑肌障碍或由毒蕈碱性受体介导的其它状况时，本发明的化合物通常将以每天单日剂量或以多剂量经口、直肠、胃肠外或通过吸入给药。每剂量给予的活性剂的量或每天给予的总量通常将由患者的医生确定并且将取决于这样的因素例如患者状况的性质和严重性、被治疗的状况、患者的年龄和一般健康情况、患者对活性剂的耐受性、给药途径等。
典型地，治疗平滑肌障碍或由毒蕈碱性受体介导的其它障碍的适合剂量将在大约0.14μg/kg/天至大约7mg/kg/天的活性剂范围内；包括大约0.15μg/kg/天至大约5mg/kg/天。对于平均70kg人来说，这将相当于每天大约10μg至每天大约500mg的活性剂。
在一个特定的实施方案中，本发明的化合物适用于治疗包括人类的哺乳动物的肺或呼吸障碍，例如COPD或哮喘。当被用于治疗这类障碍时，本发明的化合物通常将以每日多剂量或单日剂量或单周剂量通过吸入给药。通常，治疗肺障碍的剂量将在大约10μg/天至200μg/天的范围内。如在本文使用的，COPD包括慢性阻塞性支气管炎和肺气肿(例如见Barnes，Chronic ObstructivePulmonary disease，N EnglJ Med：343：269-78(2000))。
当被用于治疗肺障碍时，本发明的化合物任选与其它的治疗剂联合给药，例如与β2-肾上腺素能受体激动剂；皮质类固醇、非甾体抗炎药或它们的组合。
当通过吸入给药时，本发明的化合物通常具有产生支气管扩张的作用。因此，在其方法方面的另一方面，本发明涉及在患者中产生支气管扩张的方法，该方法包括给患者给予产生支气管扩张量的本发明的化合物。一般说来，产生支气管扩张作用的治疗有效剂量将在大约10μg/天至大约200μg/天的范围内。
在另一个实施方案中，本发明的化合物被用于治疗膀胱活动过度。当被用于治疗膀胱活动过度时，本发明的化合物通常将以单日剂量或以每天多剂量；优选以单日剂量口服给药。优选地，治疗膀胱活动过度的剂量将在大约1.0至大约500mg/天的范围内。
在还另一个实施方案中，本发明的化合物被用于治疗过敏性肠综合征。当被用于治疗过敏性肠综合征时，本发明的化合物通常将以单日剂量或以每天多剂量口服给药。优选地，治疗过敏性肠综合征的剂量将在大约1.0至大约500mg/天的范围内。
因为本发明的化合物是毒蕈碱性受体拮抗剂，这类化合物还适用作用于探索或研究含有毒蕈碱性受体的生物系统或样品的研究工具。这样的生物系统或样品可包含M1、M2、M3、M4和/或M5毒蕈碱性受体。在这类研究中可以使用任何适合的含有毒蕈碱性受体的生物系统或样品，该研究可以在体外或体内进行。适合于这类研究的有代表性的生物系统或样品包括，但不限于，细胞、细胞提取物、质膜、组织样品、哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猪等)等。
在这一实施方案中，使包含毒蕈碱性受体的生物系统或样品与毒蕈碱性受体拮抗量的本发明的化合物接触。然后利用常规方法和设备，例如放射配基结合试验和功能试验，测定拮抗毒蕈碱性受体的效果。这类功能试验包括配基介导的细胞内环腺苷酸(cAMP)的变化、配基介导的酶腺苷酸环化酶(其合成cAMP)活性的变化、配基介导的经由受体催化的[35S]GTPγS与GDP交换将鸟苷5′-O-(γ-硫代)三磷酸酯([35S]GTPγS)结合到分离膜中的变化，配基介导的游离细胞内钙离子的变化(例如用来自Molecular Devices，Inc.的荧光联合成像板读出器或测量)。在上述列出的任何功能试验或类似性质的试验中，本发明化合物将拮抗或减少毒蕈碱性受体的活化。本发明化合物的毒蕈碱性受体拮抗量通常将在约0.1纳摩尔至约100纳摩尔的范围内。
此外，本发明的化合物可以被用作发现具有毒蕈碱性受体拮抗剂活性的新化合物的研究工具。在这一实施方案中，将试验化合物或试验化合物组的毒蕈碱性受体结合数据(例如，通过体外放射性配基置换试验测定的)与本发明化合物的毒蕈碱性受体结合数据相比较，以鉴别那些具有大约相同的或更好的毒蕈碱性受体结合的那些试验化合物，如果有的话。作为单独的实施方案，本发明的这一方面包括，产生比较数据(利用合适的试验)和分析该试验数据以鉴定目标试验化合物。
在另一个实施方案中，将本发明的化合物用于拮抗生物系统，以及哺乳动物特别是，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猪、人类等中的毒蕈碱性受体。在这一实施方案中，给所述哺乳动物给予治疗有效量的式I的化合物。然后可以用常规方法和设备测定拮抗毒蕈碱性受体的作用，其例子在下文进行描述。
除了其它的性质外，现已发现本发明的化合物为M3毒蕈碱性受体活性的强效抑制剂。因此，在特定的实施方案中，本发明涉及对于M3受体亚型的抑制解离常数(Ki)小于或等于10nM；优选地，小于或等于5nM(例如，通过放射配体置换测定法测定的)的式I的化合物。
另外，还发现本发明的化合物具有令人惊奇和预料之外的作用持续时间。因此，在另一个特定的实施方案中，本发明涉及作用持续时间大于或等于大约24小时的式I的化合物。
此外，现已发现本发明的化合物当通过吸入给药时，与通过吸入给予的其它已知的毒蕈碱性受体拮抗剂(例如tiotropium)相比，在有效剂量下具有减少的副作用，例如口干。
本发明化合物的性质和实用性可以利用对于本领域技术人员公知的各种体外和体内试验来证明。例如，在下述实施例中进一步详细描述了有代表性的试验。
实施例
下面的制备和实施例举例说明了本发明的特定实施方案。在这些实施例中，下列缩写具有下述含义：
AC 腺苷酸环化酶
ACh 乙酰胆碱
ACN 乙腈
BSA 牛血清白蛋白
cAMP 3′-5′环腺苷一磷酸
CHO 中国仓鼠卵巢
cM5 克隆的黑猩猩M5受体
DCM 二氯甲烷(即氯化亚甲)
DIBAL 氢化二异丁基铝
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
dPBS Dulbecco磷酸盐缓冲盐水
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
EDC 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺
EDCI 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
EDTA 乙二胺四乙酸
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
FBS 胎牛血清
FLIPR 荧光测定成像板读出器
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-
四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HBSS Hank′s缓冲盐溶液
HEPES 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
hM1 克隆的人M1受体
hM2 克隆的人M2受体
hM3 克隆的人M3受体
hM4 克隆的人M4受体
hM5 克隆的人M5受体
HOBT 1-羟基苯并三唑水合物
HPLC 高效液相色谱法
IPA 异丙醇
MCh 甲基胆碱
MTBE 甲基叔-丁基醚
TFA 三氟醋酸
THF 四氢呋喃
本文中使用但没有定义的任何其它缩写具有它们的标准、被普遍接受的含义。除非另外指出，所有材料例如试剂、原料和溶剂购自商品提供商(例如Sigma-Aldrich、Fluka等)并且在没有进一步纯化的情况下使用。
除非另外显示，使用装配有具有3.5微米颗粒尺寸的ZorbaxBonus RP 2.1×50mm柱(Agilent)的Agilent(Palo Alto，CA)系列1100仪器进行HPLC分析。用在214nm处的UV吸收度进行检测。使用的流动相如下(按体积计)：A是ACN(2％)、水(98％)和TFA(0.1％)；B是ACN(90)、水(10％)和TFA(0.1％)。使用6分钟梯度内10至70％B(余下的为A)的0.5mL/分钟的流速，获得HPLC 10-70数据。相似地，使用5分钟梯度内5％至35％B；或10％至90％B，获得HPLC5-35和HPLC10-90数据。
用Applied Biosystems(Foster City，CA)型API-150EX仪器获得液相色谱质谱(LCMS)数据。用5分钟梯度内10至90％流动相B获得LCMS 10-90数据。
利用来自Applied Biosystems的API 150EX Prep工作站系统进行小规模纯化。使用的流动相如下(按体积计)是：A是水和0.05％TFA；并且B是ACN和0.05％TFA。对于系统(通常约3至50mg回收样本大小)采用下述条件：20mL/分钟流速；15分钟梯度和有5微米颗粒的20mm×50mm Prism RP柱(ThermoHypersil-Keystone，Bellefonte，PA)。对于更大规模纯化(通常大于100mg粗制样本)，采用下述条件：60ml/分钟流速；30分钟梯度和有10微米颗粒的41.4mm×250mm Microsorb BDS柱(Varian，PaloAlto，CA)。
制备1
联苯基-2-基氨基甲酸哌啶-4-基酯
将联苯基-2-异氰酸酯(97.5g，521mmol)和4-羟基-N-苄基哌啶(105g，549mmol)在70℃一起加热12小时。然后将反应混合物冷却到50℃并添加EtOH(1L)，然后缓慢加入6M HCl(191mL)。然后将得到的混合物冷却到室温并添加甲酸铵(98.5g，1.56mol)，然后使氮气通过溶液鼓泡20分钟。然后添加活性炭上钯(20g，10wt.％干基)并且在40℃加热反应混合物12小时，然后通过硅藻土垫过滤。然后减压除去溶剂并将1M HCl(40mL)添加到粗残余物中。然后用10NNaOH调节混合物的pH至pH12。用乙酸乙酯(2×150mL)提取水层并干燥(硫酸镁)有机层、过滤并减压除去溶剂得到155g标题中间体(100％收率)。HPLC(10-70)Rt＝2.52；m/z：[M+H+]C18H20N2O2计算值，297.15；实测值，297.3。
制备2
N-苄基-N-甲氨基乙醛
向3-颈2-L烧瓶中添加N-苄基-N-甲基乙醇胺(30.5g，0.182mol)、DCM(0.5L)、DIPEA(95mL，0.546mol)和DMSO(41mL，0.728mol)。使用冰浴，将混合物冷却到大约-10℃并用5分钟间隔分4部分添加三氧化硫吡啶复合物(87g，0.546mol)。在-10℃搅拌反应2小时。除去冰浴前，加水(0.5L)猝灭反应。分离水层并用水(0.5L)和盐水(0.5L)洗涤有机层然后用硫酸镁干燥，并过滤得到标题化合物，在没有进一步纯化下使用它。
制备3
联苯基-2-基氨基甲酸1-[2-(苄基甲氨基)乙基]哌啶-4-基酯
向含有DCM(0.5L)中的制备2的产物的2-L烧瓶中添加制备1的产物(30g，0.101mol)，接着添加三乙酰氧基氢硼化钠(45g，0.202mol)。搅拌反应混合物过夜然后在剧烈搅拌下添加1N盐酸(0.5L)猝灭。观察到三层并除去水层。用1N NaOH(0.5L)洗涤后，得到均匀的有机层，然后用饱和的NaCl水溶液(0.5L)洗涤、用硫酸镁干燥、过滤并减压除去溶剂。通过将它溶解在最少量的IPA中并将该溶液冷却至0℃形成固体，来纯化残余物，收集固体并用冷的IPA洗涤，得到42.6g标题化合物(95％收率)。MS m/z：[M+H+]C28H33N3O2计算值，444.3；实测值，444.6。Rf＝3.51分钟(10-70 ACN∶H2O，反相HPLC)。
制备4
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-甲氨基乙基)哌啶-4-基酯
向帕尔氢化烧瓶中添加制备3的产物(40g，0.09mol)和EtOH(0.5L)。用氮气冲洗烧瓶并与乙酸(20mL)一起添加活性炭上钯(15g，10wt.％(干基)，37％wt/wt)。在氢气氛(～50psi)下将混合物保持在帕尔氢化器上3小时。然后过滤混合物并用EtOH洗涤。浓缩滤液并将残余物溶解在最少量的DCM中。缓慢加入乙酸异丙酯(10体积)形成固体，收集固体，得到22.0g标题化合物(70％收率)。MS m/z：[M+H+]C21H27N3O2计算值，354.2；实测值，354.3。Rf＝2.96分钟(10-70 ACN∶H2O，反相HPLC)。
制备5
联苯基-2-基氨基甲酸1-{2-[(4-甲酰基苯甲酰基)甲氨基]-乙基}哌啶-4-基酯
向三颈1-L烧瓶中添加4-羧基苯甲醛(4.77g，31.8mmol)、EDC(6.64g，34.7mmol)、HOBT(1.91g，31.8mmol)和DCM(200mL)。当混合物均匀时，缓慢加入制备4的产物(10g，31.8mmol)在DCM(100mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物16小时然后用水(1×100mL)、1N HCl(5×60mL)、1N NaOH(1×100mL)盐水(1×50mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到12.6g标题化合物(92％收率；85％基于HPLC的纯度)。MS m/z：[M+H+]C29H31N3O4计算值，486.2；实测值，486.4。Rf3.12分钟(10-70 ACN∶H2O，反相HPLC)。
实施例1
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
向三颈2-L烧瓶中添加异哌啶甲酰胺(5.99g，40.0mmol)、乙酸(2.57mL)、硫酸钠(6.44g)和IPA(400mL)。用冰浴将反应混合物冷却到0-10℃并缓慢添加制备5的产物(11g，22.7mmol)在IPA(300mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物2小时然后冷却到0-10℃。分次添加三乙酰氧基硼氢化钠(15.16g，68.5mmol)并在室温下搅拌该混合物16h。然后减压下浓缩反应混合物至体积为大约50mL，用1NHCl(200mL)酸化该混合物至pH3。在室温下搅拌得到的混合物1小时，然后用DCM(3×250mL)提取。用冰浴将水相冷却到0-5℃并添加50％NaOH水溶液以调节混合物的pH至10。然后用乙酸异丙酯(3×300mL)提取该混合物，用水(100mL)、盐水(2×50mL)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到10.8g标题化合物(80％收率。MS m/z：[M+H+]C35H43N5O4计算值，598.3；实测值，598.6。Rf＝2.32分钟(10-70ACN∶H2O，反相HPLC)。
实施例1A
使用下面的步骤，还制备了二磷酸盐形式的联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯：
将5.0g实施例1的产物与80ml IPA∶ACN(1∶1)混合。添加4.0ml水并在搅拌下将混合物加热到50℃，形成澄清溶液。在50℃向该溶液中滴加16ml 1M磷酸。在50℃搅拌得到的浑浊溶液5小时，然后在缓慢搅拌下让其冷却到室温，过夜。过滤收集得到的晶体并风干1小时，然后真空干燥18小时，得到标题化合物的二磷酸盐(5.8g，75％收率)，为白色结晶固体(98.3％通过HPLC的纯度)。
实施例1B
使用下面的步骤，还制备了单硫酸盐形式的联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。
将442mg实施例1的产物(0.739mmol的96％纯物质)溶解在5ml H2O∶ACN(1∶1)中并缓慢加1.45ml的1N硫酸，同时监测pH。将pH调节至大约pH3.3。通过0.2微米滤器过滤澄清溶液、冷冻并冻干至干。将161g冻干的物质溶解在8.77ml的IPA∶ACN(10∶1)中。通过将小瓶放置在预热的70℃水浴1.5小时来加热悬浮液。在5分钟内形成油滴。将加热降低至60℃并再加热混合物1.5小时，接着在50℃加热40分钟，在40℃加热40分钟，然后在30℃加热45分钟。关掉加热并让混合物缓慢地冷却到室温。第二天，在显微镜下观察物质并显示针状体和片。然后在40℃加热该物质2小时，在35℃加热30分钟，然后在30℃加热30分钟。关掉加热并让混合物缓慢地冷却至室温。然后过滤固体并使用真空泵干燥1小时，得到标题化合物的单硫酸盐(117mg，73％收率)。
实施例1C
使用下面的步骤，还制备了草酸氢盐形式的联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。
将510mg实施例1的产物(0.853mmol的96％纯物质)溶解在5ml H2O∶ACN(1∶1)中并缓慢加入1.7ml 1M草酸水溶液，同时监测pH。将pH调节至大约pH3.0。通过0.2微米滤器过滤澄清溶液、冷冻并冻干至干。将150mg冻干的物质溶解在13.1ml 94％IPA/6％H2O。在预热的60℃水浴中搅拌混合物2.5小时。关掉加热并让混合物冷却至室温。于4℃冷藏小瓶。6天后，观察到油状物质，在瓶的侧面出现的好象是晶体。然后让小瓶达到室温，此时加入晶种(如下合成)并让其静置16天。在这段时间内，观察到更多的晶体从溶液中析出。然后过滤固体并使用真空泵干燥14小时，得到标题化合物的草酸氢盐(105mg，70％收率)。
晶种合成
将510mg实施例1的产物(0.853mmol 96％纯物质)溶解在5mlH2O∶ACN(1∶1)中并缓慢加入1.7ml 1M草酸水溶液，同时监测pH。将pH调节至大约pH3.0。通过0.2微米滤器过滤澄清溶液、冷冻并冻干至干，得到草酸氢盐。将31.5mg该草酸氢盐溶解在2.76ml94％IPA/6％H2O中。在预热的60℃水浴中搅拌混合物2.5小时。25分钟后，所有的样品为溶液。关掉加热并让混合物冷却至室温。第二天，出现少量的粘稠物质。在4℃冷藏小瓶。4天后，粘稠的物质还存在。小瓶在室温下放置并在一个月后观察。该物质看起来是固体，并且在显微镜下观察是结晶。然后过滤固体并使用真空泵干燥1小时，得到草酸氢盐(20mg，63.5％收率)。
实施例1D
使用下面的步骤，还制备了游离碱晶体形式的联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。
使用轻微的加热，将230mg实施例1的产物溶解在0.2mlH2O∶ACN(1∶1)中。然后在70℃水浴中加热混合物2小时。关掉加热并让混合物冷却至室温，然后在4℃冷藏1小时。然后添加50μl水(油化出的)，接着添加40μl ACN，使样品重新成溶液。在缓慢搅拌和室温下添加晶种(如下所述合成)。晶体开始形成，并在缓慢搅拌下让混合物静置过夜。第二天，应用热冷循环(30℃10分钟，40℃10分钟，然后50℃20分钟)。关掉加热并让混合物冷却到过夜，同时缓慢搅拌。第二天，应用第二热/冷循环(60℃1小时，在70℃观察到溶解)。关掉加热并让混合物冷却过夜，同时缓慢搅拌。第二天，出现晶体并应用第三热冷循环(60℃3小时)。关掉加热并让混合物冷却过夜，同时缓慢搅拌。第二天，应用热冷循环(60℃3小时，缓慢冷却，然后60℃3小时)。关掉加热并让混合物冷却过夜，同时缓慢搅拌。3天后，过滤固体并放在高真空管道(line)中，以除去所有溶剂并得到标题化合物的游离碱晶体。
晶种合成
将109mg实施例1的产物溶解在0.56ml H2O∶ACN(1∶1)中。将悬浮液留在瓶中(上面宽松地放一盖)以允许较缓慢的蒸发时间。将该瓶放置在氮气流环境中，尽管氮气不是用于蒸发，只是用于环境。1天内可见到沉淀，在显微镜下观察到该沉淀是晶体。然后将固体放置在高真空管上，以除去所有溶剂得到游离碱晶体。定量回收率，97.8％通过HPLC纯化。
实施例1E
使用下面可替代的步骤，还制备了游离碱晶体形式的联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。
将70mg实施例1的产物溶解在0.1mL ACN中。添加0.3mlMTBE后，溶液出现浑浊。添加另外50μl的ACN以使溶液(155mg/ml ACN∶MTBE＝1∶2)澄清。将混合物留在瓶中并盖上盖。到第二天出现固体。然后过滤固体并将其放在高真空管道中以除去所有溶剂并得到标题化合物的游离碱晶体。
实施例2
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-苯甲酰基]乙氨基}乙基)哌啶-4-基酯
使用实施例1的方法，并且在制备2中用N-苄基-N-乙基乙醇胺替换N-苄基-N-甲基乙醇胺，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C36H45N5O4计算值，612.3；实测值，612.6。
制备6
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-甲酯哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
向三颈100ml烧瓶中添加甲基异哌啶甲酸酯(344mg，2.4mmol)、乙酸(136μl)、硫酸钠(341mg)和IPA(20ml)。用冰浴将反应混合物冷却到0-10℃并缓慢添加制备5的产物(600mg，1.24mmol)在IPA(10ml)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物1小时然后冷却到0-10℃。分次添加三乙酰氧基硼氢化钠(763mg，3.6mmol)。在室温搅拌16小时后，然后在减压下浓缩反应混合物至体积为大约5ml并且用DCM(50ml)稀释。用0.5N HCl(2×30ml)、水(2×30mL)、盐水(2×30ml)洗涤有机层，用硫酸钠干燥、过滤并浓缩得到700mg标题化合物。(92％收率。MS m/z：[M+H+]C36H44N4O5计算值，612.8；实测值，613.5.)
实施例3
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{甲基-[4-(4-甲基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯
向4ml小瓶中添加制备6的产物(61.2mg，0.1mmol)和甲胺(1ml，2M在MeOH中)。在60℃加热反应混合物72小时并通过制备型HPLC纯化，得到46.9mg标题化合物。(MS m/z：[M+H+]C36H45N5O4计算值，611.8；实测值，612.4.)
实施例4
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
使用实施例3的步骤，并用乙胺(1ml，2M在EtOH中)替换甲胺(1ml，2M在MeOH中)，制备了17mg标题化合物。(MS m/z：[M+H+]C37H47N5O4计算值，625.8；实测值，626.4.)
实施例5
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{甲基-[4-(4-丙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯
向4ml小瓶中添加制备6的产物(61.2mg，0.1mmol)和丙胺(1ml)。在60℃加热反应混合物24小时并通过制备型HPLC纯化，得到39.5mg标题化合物。(MS m/z：[M+H+]C38H49N5O4计算值，639.8；实测值，640.4.)
实施例6
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-异丙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
使用实施例5的步骤，并用异丙胺(1ml)替换丙胺(1ml)，制备了27.8mg标题化合物。(MS m/z：[M+H+]C38H49N5O4计算值，639.8；实测值，640.4.)
制备7
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-Boc-氨基乙基)哌啶-4-基酯
向含有DCM(0.43L)中的制备2的产物(25.4g，85.6mmol)的1-L烧瓶中，添加DIPEA(29.9mL，171.1mmol)和2-(Boc-氨基)乙基溴化物(21.8g，94.4mmol)。然后将反应加热至50℃过夜(～18小时)。过夜后，然后将反应冷却到0℃以诱导产物沉淀。过滤并收集沉淀，得到标题化合物，42％收率(15.8g)。MS m/z：[M+H+]C25H33N3O4计算值，439.3；实测值，440.4。
制备8
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2氨基乙基)哌啶-4-基酯
将制备7的产物(3.5g，8.1mmol)添加到1∶1 DCM∶TFA(50mL)中并允许反应在室温下搅拌30分钟。完成后，用DCM(125mL)稀释反应并用1N NaOH(200mL)洗涤混合物。然后用水(200mL)、NaCl(饱和的)(200mL)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，然后过滤。在减压下除去溶剂。粗物质足够纯，不需进一步纯化就可以使用。获得标题化合物，94％收率(2.6g，7.6mmol)。MS m/z：[M+H+]C20H25N3Ox计算值，339.2；实测值，339.6。
制备9
2-氟-4-甲酰基苯甲酸
将搅拌的4-氰基-2-氟苯甲酸(2.5g，15.2mmol)在DCM(100mL)中的溶液冷却到-78℃并向该溶液中滴加DIBAL(30mL，45.4mmol，25％在甲苯中)，由于H2放出要小心使用。允许该溶液在-78℃搅拌4小时。通过添加MeOH(10mL)猝灭反应，由于H2放出要小心使用。然后用1N HCl(100mL)、水(100mL)、NaCl(饱和的)(100mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，然后过滤。在减压下除去溶剂。粗物质足够纯，不需进一步纯化就可以使用。获得标题化合物78％收率(2.0g，11.9mmol)。
实施例7
联苯基-2-基氨基甲酸1-{2-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氟苯甲酰氨基]乙基}哌啶-4-基酯
使用实施例1的方法并且，在制备5中，用制备8的产物替换制备4的产物并且用制备9的产物替换4-羧基苯甲醛，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C34H40FN5O4计算值，601.7；实测值，602.2。
实施例8
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氟苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
使用实施例1的方法并，在制备5中，用制备9的产物替换4-羧基苯甲醛，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C35H42FN5O4计算值，615.8；实测值，616.2
制备10
哌啶-4-羧酸二乙基酰胺
向1-叔丁氧基羰基哌啶-4-羧酸(5g，22.0mmol)在DMF(100mL)中的搅拌的溶液中添加二乙胺(4.6mL，44mmol)、三乙胺(9.1mL，66.0mmol)、HOAt(22.0mL，0.5M在DMF中，22.0mmol)和最后添加EDCI(8.4g，44mmol)。允许该溶液在室温下搅拌14小时。然后减压除去溶剂。将混合物溶解在DCM(100mL)中。然后用水(100mL)、1N HCl(100mL)、NaCl(饱和的)(100mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，然后过滤。向有机层中添加TFA(33mL)。允许反应在室温下搅拌2小时。然后减压除去溶剂。将混合物溶解在DCM(100mL)中。然后用1N NaOH(100mL)、水(100mL)、NaCl(饱和的)(100mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，然后过滤。在减压下除去溶剂。粗物质足够纯，不需进一步纯化就可以使用。获得标题化合物86％收率(3.5g，19.0mmol)。
实施例9
联苯基-2-基氨基甲酸1-{2-[4-(4-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-
氟苯甲酰氨基]乙基}哌啶-4-基酯
使用实施例1的方法并且，在制备5中，用制备9的产物替换4-羧基苯甲醛并用制备8的产物替换制备4的产物并且，在实施例1中，用制备10的产物替换异哌啶甲酰胺，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C38H48FN5O4计算值，657.8；实测值，658.4。
实施例10
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氟苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
使用实施例1的方法并且，在制备5中，用制备9的产物替换4-羧基苯甲醛并且，在实施例1中，用制备10的产物替换异哌啶甲酰胺，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C39H50FN5O4计算值，671.9；实测值，672.4。
实施例11
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
使用实施例1的方法但用制备10的产物替换异哌啶甲酰胺，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C39H51N5O4计算值，653.9；实测值，654.4。
实施例12
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(3-(S)-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
使用实施例1的方法但用哌啶-3-(S)-羧酸二乙基酰胺替换异哌啶甲酰胺，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C39H51N5O4计算值，653.9；实测值，654.4。
按照Chirality 7(2)：90-95(1995)完成了哌啶-3-(S)-羧酸二乙基酰胺的制备。
制备11
N-{2-[4-(联苯基-2-基氨甲酰氧基)哌啶-1-基]乙基}-
-2，5-二溴代-N-甲基对苯二酸(terephthalamic Acid)
向含有在DMF(20mL)中的制备2的产物(2.5g，7.1mmol)的100mL烧瓶中添加2，5-二溴对苯二酸(6.88g，21.2mmol)，接着添加DIPEA(1.6mL，9.2mmol)和HATU(3.23g，8.5mol)。在室温下搅拌黄色浆液3小时(反应完成后所有物质为溶液)。用DCM(200mL)稀释反应混合物。向该溶液中添加1N NaOH(150mL)和MeOH(添加最小量，以便使添加碱后观察到的细白色沉淀溶解)。将溶液转到分液漏斗中并弃去水层。用1N HCl(1×150mL)洗涤有机层，用硫酸钠干燥，过滤并减压除去溶剂，得到7g标题化合物(＞100％收率，由于存在残留的DMF)。在没有进一步纯化的情况下使用该物质。MS m/z：[M+H+]C29H29Br2N3O5计算值，659.4；实测值，660.3。Rf＝3.39分钟(2-90ACN∶H2O，反相HPLC)。
制备12
N-{2-[4-(联苯基-2-基氨甲酰氧基)哌啶-1-基]乙基}--2，5-二溴代-N-甲基对苯二酸甲酯
向含有制备11的产物(7.0g，10.6mmol)的100mL烧瓶中添加甲苯/MeOH(9∶1，70mL)的溶液。所有的固体物质不溶解，所以添加另外3mL的MeOH。在冰浴上将溶液冷却到0℃并通过注射器添加三甲基甲硅烷基重氮甲烷(2.0M己烷中的溶液，6.3mL，12.7mmol)。让反应混合物温至室温。搅拌2小时后，HPLC和MS分析显示，反应不完全。添加另外的三甲基甲硅烷基重氮甲烷(10.0mL)并在室温下搅拌反应70小时。尽管HPLC分析已显示分析已显示反应不完全，但将乙酸(15mL)添加到反应混合物中并在减压下浓缩得到的溶液。通过硅胶色谱法，使用在DCM中的2％至5％MeOH作为洗脱剂，纯化粗产物得到2.32g标题化合物(49％收率)。MS m/z：[M+H+]C30H31Br2N3O5计算值，673.4；实测值，674.3。Rf＝4.26分钟(2-90ACN∶H2O，反相HPLC)。
制备13
联苯基-2-基-氨基甲酸1-{2-[(2，5-二溴代-4-羟基甲基苯甲酰基)-甲氨基]乙基}哌啶-4-基酯
向含有制备12的产物(2.2g，3.3mmol)100mL烧瓶中添加THF(35mL)。使用冰浴，将混合物冷却到大约0℃并通过注射器添加氢化锂铝(在THF中的1.0M溶液，6.6mL，6.6mmol)。在室温下搅拌得到的浆液4h。通过添加1N NaOH(100mL)猝灭反应。分离水层并用盐水(50mL)洗涤有机层，用硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩(80.2％通过HPLC纯化)。通过制备型HPLC(20-40ACN∶H2O，反相HPLC)纯化一部分粗产物，得到317mg的TFA盐。将期望产物的TFA盐分配在EtOAc(10mL)和饱和的碳酸氢钠溶液(10mL)之间。用盐水(5mL)洗涤有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到223.6mg标题化合物。MS m/z：[M+H+]C29H31Br2N3O4计算值，645.4；实测值，646.3。Rf＝3.56分钟(10-70ACN∶H2O，反相HPLC)。
制备14
甲磺酸4-({2-[4-(联苯基-2-基氨甲酰氧基)哌啶-1-基]乙基}甲基氨甲酰基)-2，5-二溴苄酯
向含有制备13的产物(223.6mg，0.346mmol)的25mL烧瓶中添加DCM(10mL)，接着添加DIPEA(135.5uL，0.778mmol)和甲磺酰氯(41uL，0.528mmol)。在室温下搅拌反应30分钟。然后向反应混合物中添加饱和的碳酸氢钠溶液(10mL)。弃取水层并用盐水(5mL)洗涤有机层，用硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，得到229mg标题化合物(91％收率)。MS m/z：[M+H+]C30H33Br2N3O6S计算值，723.5；实测值，724.3。Rf＝3.77分钟(10-70ACN∶H2O，反相HPLC)。
实施例13
联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[2，5-二溴代-4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
向含有制备14的产物(229mg，0.316mmol)的25mL烧瓶中添加异哌啶甲酰胺(48.7mg，0.380mmol)、DIPEA(110.2uL，0.633mmol)和ACN(4mL)。在室温下在氮气氛下搅拌反应混合物63小时，然后用DCM(15mL)稀释反应混合物并用饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤。使用1.0N HCl(2×10mL)，将产物提取到水层中。用DCM(2×15mL)洗涤水层并使用1.0N NaOH将pH调节到10-11。然后用DCM(3×20mL)提取混合物，用盐水(10mL)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物，MS m/z：[M+H+]C35H41Br2N5O4计算值，756.5；实测值，756.3。Rf＝2.65分钟(10-70ACN∶H2O，反相HPLC)。
实施例14
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[4-(2-氨基甲酰基-哌啶-1-基甲基)苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
使用实施例1中描述的步骤，并替换合适的原料，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C35H43N5O4计算值，598.3；实测值，597.8。
实施例15
联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰基-哌啶-1-基甲基)-2-甲氧基苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯
向4-溴代-3-甲氧基-苯甲酸(15.0g，58mmol)在DMSO(150mL)的搅拌的溶液中添加NaHCO3(20.0g，230mmol)。将该溶液加热到80℃达18小时。然后将反应冷却到室温并减压除去溶剂。然后将粗的反应混合物溶解在DCM(200mL)中并用1N HCl(100mL)、水(100mL)、NaCl(饱和的)(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，然后过滤。在减压下除去溶剂。粗物质足够纯，不需进一步纯化就可以使用。以79％收率(8.9g，45.8mmol)获得产物，4-甲酰基-3-甲氧基苯甲酸甲酯。
向4-甲酰基-3-甲氧基-苯甲酸甲酯(5.0g，26mmol)在叔丁醇(200mL)中的搅拌的溶液中添加NaH2PO4-2H2O(3.6g，26mmol)、水(50mL)，2-甲基-2-丁烯(11mL，104mmol)并最后添加NaClO2(7.02g，78mmol)。允许反应在室温下搅拌4小时。然后减压除去溶剂。然后将粗反应混合物溶解在DCM(200mL)中并用1N NaOH(200mL)提取产物。用DCM(200mL)洗涤水层，然后用6N HCl(～40mL)中和并且用DCM(200mL)提取产物。然后用水(100mL)、NaCl(饱和的)(100mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，然后过滤。在减压下除去溶剂。粗物质足够纯，不需进一步纯化就可以使用。以47％收率(2.4g，12.3mmol)获得了产物，2-甲氧基对苯二酸4-甲酯。
向2-甲氧基对苯二酸4-甲酯(450mg，2.1mmol)在DMF(10mL)中的搅拌的溶液中添加EDC(630mg，3.3mmol)、HOAt(2.4mL，1.18mmol，0.5M在DMF中)和DIPEA(1.3mL，7.05mmol)。当混合物均匀时，缓慢加入制备4的产物(830mg，2.4mmol)的溶液。在室温下搅拌反应混合物16小时然后用水(100mL)、1N HCl(100mL)、1N NaOH(100mL)、盐水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥、过滤并浓缩得到酯产物，收率为89％(1.04g，1.9mmol)。MS m/z：[M+H+]C31H35N3O6计算值，545.6；实测值，546.6。
在0℃向该酯产物(1.0g，1.8mmol)在THF(100mL)的搅拌的溶液中添加甲醇(57μL，1.8mmol)，接着添加LiAlH4(1.8mL，1.8mmol，1.0M在THF中)。除去冰浴，并在室温下搅拌反应混合物1小时。用1N HCl(aq)在0℃猝灭反应直到不形成更多的泡沫，继续搅拌10分钟。在减压下除去溶剂。将粗反应混合物溶解在DCM(100mL)中并用水(100mL)、NaCl(饱和的)(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，然后过滤。在减压下除去溶剂。粗物质足够纯，不需进一步纯化就可以使用。以89％收率(831mg，1.6mmol)收到醇产物。MS m/z：[M+H+]C30H35N3O5计算值，517.6；实测值，518.6。
在-15℃向在DCM(2.5mL)中的该醇产物(78mg，1.5mmol)的搅拌的溶液中添加DMSO(130μL，22.5mmol)、DIPEA(130μL，7.5mmol)。向该溶液中添加硫-三氧化物吡啶复合物(240mg，15mmol)。30分钟后，用H2O(～3mL)猝灭反应混合物。分离两层，用MgSO4干燥有机层，过滤并在下面的反应中直接使用该醛产物。
使用实施例1的方法，但用该醛产物替换制备5的产物，制备了标题化合物。MS m/z：[M+H+]C36H45N5O5计算值，627.3；实测值，628.2。
使用本文描述的方法并替换合适的原料，制备了下列化合物：
实施例16-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)噻吩-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C33H41N5O4S计算值，604.3；实测值604.2。
实施例17-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)噻吩-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C37H49N5O4S计算值，660.4；实测值660.4。
实施例18-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨基甲酰哌啶-1-基甲基)噻吩-2-羰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C36H47N5O4S计算值，646.3；实测值646.4。
实施例19-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)噻吩-2-羰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C32H39N5O4S计算值，590.3；实测值590.2。
实施例20-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨甲酰基哌啶-1-基甲基)-1H-吡咯-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MSm/z：[M+H+]C37H50N6O4计算值，643.4；实测值643.2。
实施例21-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-1H-吡咯-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C33H42N6O4计算值，587.3；实测值587.2。
实施例22-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨甲酰基哌啶-1-基甲基)呋喃-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C37H49N5O5计算值，644.4；实测值644.4。
实施例23-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-二乙基氨基甲酰基-哌啶-1-基甲基)呋喃-2-羰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C37H49N5O5计算值，644.4；实测值644.4。
实施例24-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)呋喃-2-羰基]-氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C32H39N5O5计算值，574.3；实测值574.2。
实施例25-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{[5-((R)-3-二乙基氨甲酰基哌啶-1-基甲基)呋喃-2-羰基]氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C36H47N5O5计算值，630.4。
实施例26-联苯基-2-基-氨基甲酸1-[2-({3-[4-(3-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰基}甲氨基)乙基]哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C37H47N5O4计算值，626.4；实测值625.8。
实施例27-联苯基-2-基-氨基甲酸1-[2-({3-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰基}甲氨基)乙基]哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C37H47N5O4计算值，626.4；实测值625.8。
实施例28-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{3-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C36H45N5O4计算值，612.4；实测值611.8。
实施例29-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{3-[4-(4-二乙基氨甲酰基哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C40H53N5O4计算值，668.4；实测值667.9。
实施例30-联苯基-2-基-氨基甲酸1-(2-{3-[4-(3-二乙基氨甲酰基哌啶-1-基甲基)苯基]丙酰氨基}乙基)哌啶-4-基酯。MS m/z：[M+H+]C40H53N5O4计算值，668.4；实测值667.9。
使用本文描述的方法并替换合适的原料，可以制备下列化合物：
实施例31-联苯基-2-基氨基甲酸1-{2-[4-(4-氨基甲酰基-哌啶-1-基甲基)苯甲酰氨基]乙基}哌啶-4-基酯；
实施例32-联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氯代-苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶-4-基酯；
实施例33-联苯基-2-基氨基甲酸1-(2-{[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)-2-氯代-5-甲氧基苯甲酰基]甲氨基}乙基)哌啶4-基酯；和
实施例34-联苯基-2-基氨基甲酸1-[2-({2-[4-(4-氨基甲酰哌啶-1-基甲基)苯基]乙酰基}甲氨基)乙基]哌啶-4-基酯。
试验1
放射配体结合试验
A.从表达hM1、hM2、hM3和hM4毒蕈碱性受体亚型的细胞制备膜
使分别地稳定表达克隆的人hM1、hM2、hM3和hM4毒蕈碱性受体亚型的CHO细胞系在由HAM′s F-12组成的的培养基中生长至接近汇合，HAM′s F-12补充了10％FBS和250μg/mL遗传霉素。使细胞在5％CO2，37℃培养箱中生长并用在dPBS中的2mM EDTA提起。通过在650×g离心5分钟收集细胞，并将细胞沉淀在-80℃冷冻储存或立即制备膜。关于膜制备，将细胞沉淀再混悬在细胞溶解缓冲液中并用Polytron PT-2100组织破裂仪(Kinematica AG；20秒×2次破裂)匀浆。在4℃在40,000×g离心粗制膜15分钟。然后将膜沉淀用再混悬缓冲液再混悬，并再次用Polytron组织破裂仪匀浆。通过在Lowry，O.等，Journal of Biochemistry，193：265(1951)中描述的方法来测定膜悬浮液的蛋白质浓度。将所有膜以等分样在-80℃冷冻储藏或立即使用。制备的hM5受体膜的等分样直接购自Perkin Elmer且储存在-80℃直到使用。
B.对毒蕈碱性受体亚型hM1、hM2、hM3、hM4和hM5的放射配体结合试验
在96孔微量滴定板中以100μl的总试验体积进行放射配体结合试验。将稳定表达hM1、hM2、hM3、hM4或hM5的毒蕈碱性亚型的CHO细胞膜稀释在试验缓冲液中至下述特定的靶蛋白浓度(μg/孔)：对于hM1 10μg，对于hM2 10-15μg，对于hM3 10-20μg，对于hM4 10-20μg以及对于hM5 10-12μg。在试验板加入之前，利用Polytron组织破裂仪短暂地匀化该膜(10秒)。测定放射配体KD值的饱和结合研究是利用0.001nM-20nM浓度的L-[N-甲基-3H]氯甲东莨菪碱([3H]-NMS)(TRK666，84.0Ci/mmol，Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)进行的。测定试验化合物Ki值的置换试验是用1nM [3H]-NMS和11个不同试验化合物浓度进行的。首先将试验化合物溶解在稀释缓冲液中至浓度为400μM，然后用稀释缓冲液连续地稀释5×至最终浓度为10pM至100μM。添加至试验板的顺序和体积如下：25μL放射配体，25μL稀释的试验化合物和50μL膜。在37℃培养试验板60分钟。通过用在1％BSA中预处理的GF/B玻璃纤维滤板(PerkinElmer Inc.，Wellesley，MA)快速过滤，终止结合反应。用洗涤缓冲液(10mM HEPES)冲洗滤板三次以除去未结合的放射性。然后风干该板，并向每孔中加入50μL Microscint-20液体闪烁液(PerkinElmer Inc.，Wellesley，MA)。然后在PerkinElmer Topcount液体闪烁计数仪(PerkinElmer Inc.，Wellesley，MA)中对该板计数。利用一位点竞争模型，用GraphPad Prism软件包(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)，通过非线性回归分析来分析结合数据。利用Cheng-Prusoff方程式，从观察到的IC50值和放射配体的KD值计算试验化合物的Ki值(Cheng Y；Prusoff W.H.BiochemicalPharmacology，22(23)：3099-108(1973))。将Ki值转化成pKi值以确定几何平均数和95％置信区间。然后将这些概括性统计数字再转化回成Ki值，用于数据报告。
在这一试验中，较低的Ki值表明试验化合物对受试的受体具有较高的结合亲和性。例如，发现实施例1和2的化合物在这一试验中对于M3毒蕈碱性受体亚型具有小于约5nM的Ki值。例如，发现实施例1的化合物具有小于约5nMr Ki值。
试验2
毒蕈碱性受体功能效力试验
A.cAMP累积的激动剂介导的抑制的阻滞
在这一试验中，通过测量试验化合物阻滞在表达hM2受体的CHO-K1细胞中毛喉素-介导的cAMP累积的氧化震颤素抑制的能力，来测定受试化合物的功能效力。
按照生产商的用法说明，利用有125I-cAMP的快速板(flashplate)腺苷酸环化酶激活试验系统(NEN SMP004B，PerkinElmer LifeSciences Inc.，Boston，MA)，以放射免疫测定格式进行cAMP试验。
用dPBS冲洗细胞一次，并用如在上面细胞培养和膜制备部分中描述的胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA)提起细胞。通过在50mL dPBS中在650×g离心五分钟来洗涤分离的细胞两次。然后将细胞沉淀再混悬在10mL dPBS中，并用Coulter Z1二元粒子计数器(Beckman Coulter，Fullerton，CA)来计数细胞。在650×g再次离心该细胞五分钟，并再混悬在刺激缓冲液中至分析浓度为每毫升1.6×106-2.8×106个细胞。
最初将受试化合物溶解在稀释缓冲液(补充了1mg/mL BSA(0.1％)的dPBS)中至浓度为400μM，然后连续地用稀释缓冲液稀释至最终摩尔浓度为100μM至0.1nM。以相似的方式稀释氧化震颤素。
为测定AC活性的氧化震颤素抑制作用，将25μL毛喉素(稀释在dPBS中，最终浓度为25μM)、25μL稀释的氧化震颤素和50μL细胞加入激动剂试验孔。为测定受试化合物阻滞氧化震颤素抑制的AC活性的能力，将25μL毛喉素和氧化震颤素(稀释在dPBS中，最终浓度分别为25μM和5μM)、25μL稀释的受试化合物和50μL细胞加入剩余的试验孔。
将反应物在37℃培养10分钟并通过加入100μL冰冷的检测缓冲液来停止反应。密封板、在室温培养过夜并在次日早晨在PerkinElmerTopCount液体闪烁计数仪(PerkinElmer Inc.，Wellesley，MA)上计数。基于观察到的样品的计数和如在生产商用户手册中描述的cAMP标准品，计算产生的cAMP的量(pmol/孔)。使用GraphPadPrism软件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)，利用非线性回归、一位点竞争方程式，通过非线性回归分析来分析数据。使用Cheng-Prusoff方程式来计算Ki，分别利用氧化震颤素浓度-响应曲线的EC50和氧化震颤素试验浓度作为KD和[L]。将Ki值转化为pKi值，以测定几何平均值和95％置信区间。然后将这些概述性的统计值转回成Ki值，用于数据报告。
在这一试验中，较低的Ki值表明受试化合物在受试的受体上具有较高的功能活性。通常发现，在本试验中测试的本发明的典型化合物对于阻滞在表达hM2受体的CHO-K1细胞中毛喉素-介导的cAMP累积的氧化震颤素抑制，具有小于约10nM的Ki值。例如，发现实施例1的化合物具有小于约5nM的Ki值。
B.激动剂介导的[35S]GTPγS结合的阻滞
在第二个功能试验中，通过测量化合物在表达hM2受体的CHO-K1细胞中阻滞氧化震颤素刺激的[35S]GTPγS-结合的能力，来测定受试化合物的功能效力。
在使用时，解冻冷冻的膜，然后将其稀释在每孔有5-10μg蛋白质的最终靶组织浓度的试验缓冲液中。利用Polytron PT-2100组织破裂仪短暂地匀化膜，然后加入试验板。
在每个试验中，测定激动剂氧化震颤素刺激[35S]GTPγS结合的EC90值(对于90％最大响应的有效浓度)。
为测定试验化合物抑制氧化震颤素-刺激的[35S]GTPγS结合的能力，将下述物质加入96孔板的每个孔中：25μL有[35S]GTPγS(0.4nM)的试验缓冲液，25μL氧化震颤素(EC90)和GDP(3μM)，25μL稀释的受试化合物和25μL表达hM2受体的CHO细胞膜。然后在37℃培养试验板60分钟。利用PerkinElmer 96-孔收获仪，用1％BSA预处理的GF/B滤器过滤试验板。用冰冷的冲洗缓冲液冲洗板3×3秒，然后空气或真空干燥。将Microscint-20闪烁液(50μL)加入每个孔中，密封每个板，并在Topcounter(PerkinElmer)上计数放射性。用GraphPad Prism软件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)，利用非线性回归、一位点竞争方程式，通过非线性回归分析来分析数据。使用Cheng-Prusoff方程式来计算Ki，分别利用试验化合物的浓度-响应曲线的IC50值和试验中的氧化震颤素浓度作为KD和[L]，配体浓度。
在这一试验中，较低的Ki值表明受试化合物在受试的受体上具有较高的功能活性。通常发现在这一试验中受试的本发明的典型化合物对于在表达hM2受体的CHO-K1细胞中氧化震颤素-刺激的[35S]GTPγS结合的阻滞具有小于约10nM的Ki值。例如，发现实施例1的化合物具有小于约5nM的Ki值。
C.经由FLIPR试验的激动剂-介导的钙释放的阻滞
与Gq蛋白偶联的毒蕈碱性受体亚型(M1、M3和M5受体)，在激动剂结合受体时激活磷脂酶C(PLC)通路。结果，活化的PLC水解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)成二酰基甘油(DAG)和磷脂酰-1，4，5-三磷酸(IP3)，其依次从细胞内存储处即内质网和肌质网产生钙释放。FLIPR(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)试验通过使用当游离钙结合时发荧光的钙敏感性染料(Fluo-4AM，molecular Probes，Eugene，OR)，利用细胞内钙的这一增加。用FLIPR实时测定该荧光事件，其检测到用人M1和M3以及黑猩猩M5受体克隆的单层细胞的荧光变化。通过拮抗剂抑制激动剂介导的细胞内钙增加的能力能测定拮抗剂效力。
对于FLIPR钙刺激试验，在进行试验前的晚上，将稳定表达hM1、hM3和cM5受体的CHO细胞种入96-孔FLIPR板。通过用Cellwash(MTX Labsystems，Inc.)用FLIPR缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，2mM氯化钙，2.5mM丙磺舒，在无钙和镁的HBSS中)洗涤接种的细胞两次，以除去生长培养基并留下50μL/孔的FLIPR缓冲液。然后用50μL/孔的4μM FLUO-4AM(制成2×溶液)在37℃，5％二氧化碳下培养细胞40分钟。在染料培养期后，用FLIPR缓冲液洗涤细胞两次，留下50μL/孔的最终体积。
为测定拮抗剂效力，首先测定氧化震颤素的细胞内Ca2+释放的剂量依赖性刺激，以使随后可以测量在EC90浓度抗氧化震颤素刺激的拮抗剂效力。首先用化合物稀释缓冲液培养细胞20分钟，随后加入激动剂，这是通过FLIPR进行的。按照在FLIPR测量和下面的数据还原部分中的详细方法，结合公式ECF＝((F/100-F)^1/H)＊EC50，产生氧化震颤素的EC90值。在刺激板中制备3×ECF的氧化震颤素浓度，以便将EC90浓度的氧化震颤素加入拮抗剂抑制试验板的每个孔中。
用于FLIPR的参数是：曝光时长为0.4秒，激光强度为0.5瓦特，激发波长为488nm和发射波长为550nm。通过在添加激动剂前测量荧光变化10秒钟来确定基线。在激动剂刺激后，每0.5至1秒FLIPR连续地测量荧光变化1.5分钟来捕捉最大荧光变化。
将荧光变化表示为每孔最大荧光减去基线荧光。利用S剂量-响应的嵌入(built-in)模型，用GraphPad Prism(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)，通过非线性回归，对药物浓度的对数分析原始数据。按照Cheng-Prusoff方程式(Cheng&Prusoff，1973)，利用氧化震颤素EC50值作为KD和配体浓度的氧化震颤素EC90，通过Prism确定拮抗剂Ki值。
在这一试验中，较低的Ki值表明受试化合物在受试的受体上具有较高的功能活性。通常发现在本试验中测试的本发明的典型化合物对于阻滞在稳定地表达hM3受体的CHO细胞中激动剂介导的钙释放具有小于约10nM的Ki值。例如发现实施例1的化合物对于hM3受体具有小于约5nM的Ki值。
试验3
乙酰胆碱诱导的支气管收缩的豚鼠模型中支气管保护
作用的持续时间的测定
采用本体内试验来评价显示毒蕈碱性受体拮抗剂活性的受试化合物的支气管保护作用。
通过笼子卡片单个地鉴定体重250至350g的6只雄性豚鼠(Duncan-Hartley(HsdPoc：DH)Harlan，Madison，WI)的组。在整个研究中，允许动物自由获得食物及水。
在全身体暴露给药室(R&S Molds，San Carlos，CA)中经10分钟吸入给予试验化合物。安排给药室，以便从中央总管能将气雾剂同时递送至6个单独的室。将豚鼠暴露于受试化合物或载体(WFI)的气雾剂中。这些气雾剂产生自水溶液，例用LC Star雾化器装置(Model 22F51，PARI Respiratory Equipment，Inc.Midlothian，VA)，在22psi的压力下由气体混合物(CO2＝5％，O2＝21％和N2＝74％)驱动。在该操作压力通过雾化器的气体流量是大约3L/分钟。通过正压将产生的气雾剂驱赶入室。在递送气雾化的溶液过程中不使用稀释空气。在10分钟雾化期间，大约1.8mL的溶液被雾化。通过比较填充雾化器的雾化前和雾化后的重量，来重量分析地测量该值。
在给药后1.5、24、48和72小时，利用全身体积扫描术评价经由吸入给予的受试化合物的支气管保护作用。
在肺评价开始前四十五分钟，用氯胺酮(43.75mg/kg)，甲苯噻嗪(3.50mg/kg)和乙酰丙嗪(1.05mg/kg)肌内注射来麻醉每只豚鼠。在手术位置备皮并用70％乙醇清洁后，做颈腹面的2-3cm中线切口。然后分离颈静脉并插入充满盐水的聚乙烯导管(PE-50，Becton Dickinson，Sparks，MD)以使得静脉内输注在盐水中的ACh(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)。然后解剖使开气管游离并插入14G特氟隆管(#NE-014，Small Parts，Miami Lakes，FL)。如果需要，通过进一步肌内注射前面提及的麻醉混合物来维持麻醉。如果动物对掐它的爪有反应或如果呼吸速度大于100次呼吸/分钟，则监测和调节麻醉的深度。
一旦插管完成，就将动物置于体积扫描器(#PLY3114，BuxcoElectronics，Inc.，Sharon，CT)中和插入食管压力导管(PE-160，BectonDickinson，Sparks，MD)，以测量肺驱动压(压力)。将特氟隆气管导管连接至体积扫描器的开口以使豚鼠能呼吸来自室外的空气。然后密封室。使用加热灯维持体温，并利用10mL校准注射器(#5520系列，Hans Rudolph，Kansas City，MO)用4mL空气使豚鼠的肺膨胀3次，以确保下气道不崩塌且该动物不会通气过度。
一旦测定顺应性基线值在0.3-0.9mL/cm H2O范围内，且阻力基线值在0.1-0.199cm H2O/mL/秒范围内，就开始肺评价。Buxco肺测量计算机程序使得能够收集和导出肺的值。
开始这一程序启动了试验方案和数据收集。通过Buxco压力传导器测量随每次呼吸在体积扫描器内发生的体积随时间的变化。通过整合随时间变化的该信号，计算每次呼吸的流量测量值。通过Buxco(MAX 2270)前置放大器将该信号和利用Sensym压力传导器(#TRD4100)收集的肺驱动压力变化连接至数据收集界面(#’sSFT3400和SFT3813)。从这两个输入导出所有其它肺参数。
收集基线值5分钟，之后用ACh攻击豚鼠。从试验开始以下述剂量和预定的时间从注射器泵(sp210iw，World Precision Instruments，Inc.，Sarasota，FL)静脉内输注ACh(0.1mg/mL)1分钟：在第5分钟1.9μg/分钟，在第10分钟3.8μg/分钟，在第15分钟7.5μg/分钟，在第20分钟15.0μg/分钟，在第25分钟30μg/分钟和在第30分钟60μg/分钟。如果在每次ACh剂量后3分钟阻力或顺应性不返回基线值，则从10mL校正注射器用4mL空气膨胀豚鼠的肺3次。记录的肺参数包括呼吸频率(呼吸/分钟)、顺应性(mL/cm H2O)和肺阻力(cm H2O/mL/秒)。一旦在该方案的第35分钟完成肺功能测量，就从体积扫描器中移开豚鼠和通过二氧化碳窒息来使豚鼠安乐死。
以下列方式中的一种或两种来评价数据：
(a)从“压力变化”与“流量变化”的比值计算肺阻力(RL，cmH2O/mL/秒)。计算介质和受试化合物组对ACh(60μg/min，IH)的RL响应。计算在每个处理前时间在介质处理动物中的平均ACh响应，并用来计算在相应的处理前时间在每个受试化合物剂量下ACh响应的抑制百分率。利用GraphPad Prism，用于Windows的3.00版(GraphPad Software，San Diego，California)使‘RL’的抑制剂量-响应曲线与四参数逻辑方程拟合，估计支气管保护ID50(抑制ACh(60μg/分钟)支气管收缩响应50％所需的剂量)。使用的方程式如下：
Y＝Min+(Max-Min)/(l+10((logID50-X)＊希尔斜率))
其中X是剂量的对数，Y是响应(ACh诱导的RL增加的抑制百分率)。Y在Min起始并渐进靠近Max，具有S形状。
(b)量PD2，其被定义为引起基线肺阻力加倍需要的ACh或组胺的量，使用下述方程式(衍生自临床中用于计算PC20值的方程式，其被描述在American Thoracic Society.Guidelines for methacholine andexercise challenge testing-1999.Am J Respir Crit Care Med.161：309-329(2000)中)，利用一系列ACh或组胺攻击期间从流量和压力衍生的肺阻力值来计算：
其中：
C1＝C2前的ACh或组胺的浓度
C2＝导致肺阻力(RL)至少2倍增加的ACh或组胺的浓度
R0＝基线RL值
R1＝C1后的RL值
R2＝C2后的RL值
将有效剂量定义为将对50μg/mL剂量的ACh的支气管收缩响应限制为基线肺阻力的双倍(PD2(50))的剂量。
利用双尾-Studentst-检验进行该数据的统计学分析。P值＜0.05被认为显著。
通常，优选在本试验中在给药后1.5小时对ACh诱导的支气管收缩作用具有小于约200μg/mL的PD2(50)的试验化合物。例如，发现实施例1的化合物在给药后1.5小时对ACh诱导的支气管收缩作用具有小于约200μg/mL的PD2(50)。
试验4
吸入豚鼠流涎试验
使体重200-350g的豚鼠(Charles River，Wilmington，MA)在到达后适应屋内豚鼠居住地至少3天。在馅饼形状的给药室(R&Smolds，San Carlos，CA)中经10分钟时间吸入(IH)给予试验化合物或介质。将试验溶液溶解在无菌水中并利用充满5.0mL给药溶液的雾化器给药。将豚鼠限制在吸入室中30分钟。在这一段时间内，将豚鼠限制在大约110平方厘米的区域内。这一空间对于动物自由转向，自己复位和允许理毛行为是足够的。在适应20分钟后，使动物暴露于从在22psi压力下由房子空气驱动的LS Star Nebulizer Set(型号22F51，PARI Respiratory Equipment，Inc.Midlothian，VA)中产生的气雾剂。在雾化完成时，在处理后1.5、6、12、24、48或72小时评价豚鼠。
在试验前一小时，以0.88mL/kg体积肌内(IM)注射氯胺酮43.75mg/kg、甲苯噻嗪3.5mg/kg和乙酰丙嗪1.05mg/kg的混合物来麻醉豚鼠。将动物的腹部朝上放在加热(37℃)的毯子上，它们的头在向下的斜坡上有20度的倾斜。将4-层2×2英寸纱布垫(Nu-沙布通用棉球，Johnson and Johnson，Arlington，TX)塞入豚鼠嘴中。五分钟后，给予毒蕈碱性激动剂毛果芸香碱(3.0mg/kg、SC)并立即丢掉纱布垫并替换新的预先称重的纱布垫。收集唾液10分钟，在该点称重纱布垫并用记录的重量差来确定累积的唾液的量(用mg表示)。计算接受介质和每个剂量试验化合物的动物所收集的唾液的平均量。介质组平均值被认为是100％流涎。利用结果平均值(n＝3或更多)计算结果。利用双因素ANOVA对每个时间点的每个剂量计算置信区间(95％)。该模型是在Rechter，″Estimation of anticholinergic drugeffects in Mice by antagonism against Pilocarpine-induced salivation″Ata Pharmacol Toxicol，24：243-254(1996)中描述的方法的改进形式。
计算在每个治疗前时间，在介质处理的动物中唾液的平均重量，并用于计算每个剂量在相应的治疗前时间流涎的抑制百分率。利用GraphPad Prism，Windows 3.00版(GraphPad Software，San Diego，California)将抑制剂量响应数据拟合成四参数逻辑方程式，以估计抗催涎ID50(抑制50％的毛果芸香碱诱发的流涎所需的剂量)。采用的方程式如下：
Y＝Min+(Max-Min)/(l+10((logID50-x)＊希尔斜率))
其中X是剂量的对数，Y是响应(流涎的抑制百分率)。Y在Min开始且逐渐靠近Max，具有S形状。
使用抗-催涎ID50与支气管保护ID50的比值来计算试验化合物的表观肺选择性指数。通常，具有大于约5的表观肺选择性指数的化合物是优选的。例如，在本试验中，实施例1的化合物具有大于约5的表观肺选择性指数。
试验5
在神志清醒的豚鼠中醋甲胆碱-诱导的压制反应
在这些研究中使用健康、成年、雄性Sprague-Dawley豚鼠(Harlan，Indianapolis，IN)，体重200至300g。在异氟醚(实现)麻醉下，给动物装上颈总动脉和颈静脉导管(PE-50导管)。利用皮下通道使导管表面化至肩胛下区。所有外科手术切口用4-0 Ethicon丝线缝合并且用肝素(1000单位/mL)固定。在手术结束时每只动物被给予盐水(3mL，SC)以及丁丙诺非(0.05mg/kg，IM)。在返回到它们居住的房间前，让动物依靠加热垫恢复。
外科手术后大约18至20小时，动物称重并将每只动物上的颈动脉导管连接到转导器上，记录动脉压。使用Biopac MP-100获得系统(Acquisition System)记录动脉压和心率。让动物适应和稳定20分n钟时间。
用MCh(0.3mg/kg，IV)攻击每只动物，通过用颈静脉管给予MCh并监测心血管反应10分钟。然后把动物放到全身体给药室中，该给药室与含有试验化合物溶液或媒介物溶液的雾化器连接。使用可吸入空气和5％二氧化碳的气体混合物使溶液雾化10分钟，流速为3升/分钟。从全身体室中移出动物并使它们返回到各自的笼中。在给药后1.5和24小时后，再用MCh(0.3mg/kg，IV)攻击动物并测定血液动力学响应。此后，用戊巴比妥钠(150mg/kg，IV)使动物安乐死。
MCh引起平均动脉压(MAP)下降和心率降低(心动过缓)。测量每次MCh攻击(IH给药之前和之后)的MAP从基线的最大下降(压制反应)。心动过缓效应不用于分析，因为这些反应不是很强并且不可重复。将处理对MCh响应的效应表示为对照压制反应的％抑制(平均值+/-SEM)。用post-hoc检验使用两因素ANOVA检验处理和处理前时间的效应。在吸入给予媒介物后1.5和24小时，对MCh的压制反应相对未变。
使用抗降压ID50与支气管保护ID50的比计算试验化合物的表观肺选择性。一般说来，优选具有大于5的表观肺选择性指数的化合物。例如，在本试验中，实施例1的化合物具有大于5的表观肺选择性指数。
尽管已参照本发明的特定方面或实施方案描述了本发明，但是本领域的普通技术人员将理解，在不偏离本发明的真实精神和范围下，可以进行不同的变化或者用等同方案替换。另外，在可适用的专利法和细则允许的程度上，在相同程度上通过参考将本文中引用的所有出版物、专利和专利申请以其全部并入，如同通过参考已单个地将每个文件并入本文。
本发明的背景