硼酸抗性给予蛋白质及其基因转让专利
申请号 : CN200580007305.4
文献号 : CN1930292B
文献日 : 2014-04-02
发明人 : 藤原彻 , 野泽彰
申请人 : 独立行政法人科学技术振兴机构
摘要 :
提供一种存在可以制备对硼过剩具有抗性的植物的可能性并且可以给予生物硼酸抗性的基因和蛋白质。通过使高等植物拟南芥的几个基因在真核生物的模式生物酵母中表达，发现了5种给予酵母硼酸抗性的基因，即AtPAB2，AtRBP47c’，AtRPS20B，AtMYB13，及AtMYB68，AtRBP45a，AtRBP45b，AtRBP45c，AtRBP45d，AtRBP47a，AtRBP47b，AtRBP47c，AtUBPla，AtUBPlb，AtUBP1c的各个基因。此外，发现了硼酸的毒性机制的关键在于剪接的特异性抑制，与剪接效率增强相关的基因是硼酸抗性给予基因。
权利要求 :
1.编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA作为硼酸抗性给予基因的用途，其中，用编码所述蛋白质的DNA转化酵母时，能够给予该转化酵母80mM的硼酸抗性。
2.由序列号3所示的碱基序列构成的DNA作为硼酸抗性给予基因的用途，所述DNA编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质，其中，用所述DNA转化酵母时，能够给予该转化酵母
80mM的硼酸抗性。
3.由序列号4所示的氨基酸序列构成的具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的用途，其中，该蛋白质在酵母内表达时，能够给予80mM的硼酸抗性。
4.根据权利要求1或2记载的用途，所述作为硼酸抗性给予基因的用途是，用于制作含有编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA且能够表达硼酸给予蛋白质的重组载体。
说明书 :
硼酸抗性给予蛋白质及其基因
技术领域
[0001] 本发明涉及一种拟南芥中硼酸抗性给予蛋白质及其基因、含有该基因的重组载体、导入了该重组载体的转化体、以及硼酸抗性给予基因的筛选方法。
背景技术
[0002] 硼是高等植物的必须的微量元素中的一种(例如、非专利文献1参照)。硼也有毒性，如果过剩摄取，会抑止植物的生长发育，或者动物也会由于急性中毒而死亡。土壤溶液中的硼以无电荷的分子状存在。因此比较容易滤去，在农作物中容易发生缺乏症。现已报道，在包括日本在内的全世界80个以上的国家中，130个品种由于硼欠乏症导致的农业上产量，品质的下降(例如、参照非专利文献2)。此外、已知硼比其它元素的最佳浓度范围窄，能显示出欠乏症状的浓度与显现过剩症状的浓度差小。因此，在农业上一直难以调节硼的施肥量。尤其是，在施了过剩量的硼时，难以除去硼，在该农田的作物生产时就会带来障碍。此外，由于水道水中含有硼，因此在干燥地区通过灌溉进行农耕时硼过剩的危害多会形成问题。这样一来，过剩施加了硼的田地以及世界上硼浓度高的地区分布广泛，包括这些地区在内的各个国家正以针对硼过剩的危害的对策作为农业政策上的重要课题。此外，硼还存在于金属表面处理剂和漂白剂中，从使用这些物质的工厂排出的水中含有大量的硼。人类中，硼的致死量为15-20g，然而已知即使比该致死量更少量的硼也会在消化器官和神经系统中引起各种损伤。现在，工业排水中所含的硼量现已成为问题。
[0003] 最近，渐已清楚了植物中的硼的作用。清楚了硼交联细胞壁的果胶质多糖(例如，参照非专利文献3)。还公开了这种交联是植物生长发育所必须的(例如，非专利文献4参照)。这就是植物中涉及硼的生理机能的最早的分子水平的观点。一方面，植物体内的硼输送机制中仍然残留了很多不清楚的地方。一直认为硼通过脂质双层膜长期的被动扩散进入到细胞内，通过蒸腾流被输送到植物体内(例如，参照非专利文献5)。另一方面，已知适于生长发育的硼营养条件在种间和品种间差异很大。作为其原因的可能性，可以列举的是吸收和转位，利用效率的不同，但并不清楚作为其要素的分子。近年来，提出了通过导管进行输送(例如、参照非专利文献6)，但是其根据只不过是使用非洲爪蟾的卵母细胞中的表达系和膜囊的体外实验、并未显示出在实际的个体中这些导管分子是否与硼输送相关。此外，虽然根据向日葵的根吸收实验提示存在由运载体进行的能量输送(例如，参照非专利文献7)，但是还未鉴定到承担这种作用的运载体。
[0004] 本发明人在生物界中首次从模式植物拟南芥中分离出排出型硼抗性蛋白质BOR1(例如，参照专利文献1)。一般认为BOR1承担在低硼营养条件下向导管积极地输送硼的作用(例如，参照非专利文献8)。此外，作为承担硼输送作用的抗性，除了BOR1之外，先已知还有酵母的YNL 275w(例如，参照非专利文献9)。
[0005] 此外，如上所述，硼(B)是植物(例如、非专利文献10参照)及动物(例如、非专利文献11参照)所必须的微量营养素，但是高浓度下是有毒的(例如，参照非专利文献12，13)。含有自然产生的高浓度硼的土壤分布于世界各地，硼的施肥、化石燃烧、使用含硼的水的灌溉等人类活动造成了高浓度硼的环境(例如，参照非专利文献12，13)。
[0006] 作为植物中由于硼的毒性产生的症状，包括叶缘的萎黄病(例如，参照非专利文献13)，果实的异常和/或树皮坏死(例如，参照非专利文献14)。过剩量的硼使作物的产量和质量减少。硼的毒性现已成为世界上农业生产的极大的障碍。硼以高浓度对动物和微生物有毒。可以推定硼的致死量在成人中为约140mg/kg、在幼儿中为约270mg/kg(例如，参照非专利文献15，16)。如果经过长期摄取高浓度的硼，就会在人体中诱发食欲不振、恶心、体重的减少、性欲的减退(例如，参照非专利文献17)。现在，已表明可以允许的硼的安全摄取量为成人13mg/日(例如，参照非专利文献18)。由于硼对微生物有杀菌效果，因此食品的防腐剂中逐渐包含硼(例如，参照非专利文献19)。进而，硼作为常年的杀虫剂，其逐渐被使用于特别是蟑螂杀虫剂(例如，参照非专利文献20)。
[0007] 数十年来，自认识到硼的毒性以来，就开始进行了用于研究硼的毒性的影响的研究。其中许多是生理学的研究。例如、大豆的叶中、尿囊酸酰胺加水分解酶的活性由于硼酸而降低(例如，参照非专利文献21)。珊瑚轮澡(Chara corallina)中，观察到由于硼产生的对苹果酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶活性的抑制(例如，参照非专利文献22)。此外，还报道了胎盘中的硼量与涉及卟吩胆色素原(porphobilinogen)(卟啉合成的介质)合成的新生儿中的Δ氨基乙酰丙酸脱水酶活性负相关(例如，参照非专利文献23)。
[0008] 我们认为可溶化硼酸盐对硼的毒性起重要的作用。细胞内的硼酸由于内部pH高而部分转化为硼酸盐。如果高浓度硼酸被提供给细胞，细胞内硼酸盐浓度上升，与包括细胞内的分子的各种cis-diol形成硼酸盐复合体。包括分子的这种cis-diol包括NAD+、ATP、S-Ado Met、RNA及几种糖(例如，参照非专利文献24，25)。
[0009] 这些分子，由于可以作为多种酶的辅酶和/或基质，可能会诱导硼酸盐的结合，功能的缺失或者酶活性的改编，生物化学反应的抑制和最终的代谢异常。虽然积累了生物化学和生理学的分析，以及关于硼的毒性影响的推测，但诱导细胞死亡的硼的毒性分子机制还不清楚。
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发明内容
[0062] 本发明要解决的技术问题
[0063] 通过在植物导入酵母中硼酸抗性给予基因，就有可以制备出对硼过剩具有抗性的植物可能性。我们认为硼抗性植物有益于受硼过剩危害的地域的作物增产。此外，也存在通过使用导入这些基因的硼酸抗性提高的藻类和细菌，也可以在通过使其吸收工业用水中所含的硼以除去硼等环境净化中使用的可能性。本发明要解决的技术问题在于提供可以制备对硼过剩具有抗性的植物的给予生物硼酸抗性的基因和蛋白质。此外，还在于通过了解硼酸的毒性机制，提供了高效筛选硼酸抗性给予基因的方法。
[0064] 用于解决技术问题的方法
[0065] 本发明人为了解决上述技术问题进行了积极的研究，通过使高等植物拟南芥的几个基因在真核生物的模式生物酵母中表达，发现了给予酵母硼酸抗性的5种基因，即AtPAB2，AtRBP47，AtRPS20B，AtMYB13，及AtMYB68各基因，从而完成了本发明完成。此外，硼酸的毒性机制的关键在于对剪接的特异性抑制，发现与剪接效率的增强相关的基因是硼酸抗性给予基因，从而完成本发明。
[0066] 也就是说，本发明涉及(1)编码由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA和，(2)编码由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的蛋白质、并且具有硼酸抗性给予活性的DNA和，(3)由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，
23，25，27，或29所示的碱基序列或其互补的序列构成的硼酸抗性给予基因DNA和，(4)由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成的并且编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA和，(5)与权利要求3记载的DNA在严紧条件下杂交并且编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA和，(6)由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的具有硼酸抗性给予活性的蛋白质和，(7)由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，
22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硼酸抗性给予活性的蛋白质和，(8)含有权利要求1～5任一项记载的DNA，并且可以表达硼酸抗性给予蛋白质的重组载体和，(9)导入了权利要求8记载的重组载体，并且表达硼酸抗性给予蛋白质转化体和，(10)权利要求9记载的转化体，其特征在于转化体是酵母和，(11)权利要求9记载的转化体，其特征在于转化体是植物和，(12)硼酸抗性给予基因的筛选方法，其特征在于使用基因文库，缺失YNL 275w基因，转化不表达YNL
275w的YNL 275w破坏酵母，在含有硼酸的培养基中培养所得转化YNL 275w破坏酵母，测定并评价该转化YNL 275w破坏酵母的硼酸抗性给予活性和，(13)硼酸抗性给予基因的筛选方法，其特征在于以由硼酸产生的对剪接的特异性抑制为目标，测定并评价剪接效率的增强程度和，(14)权利要求13记载的硼酸抗性给予基因的筛选方法，其特征在于使被检物质在酵母细胞内表达，在硼酸的存在下，培养被检物质表达，以酵母中含有内含子的基因的由硼酸产生的对剪接的特异性抑制的改善程度作为剪接效率的增强程度进行测定和评价和，(15)权利要求14记载的硼酸抗性给予基因的筛选方法，其特征在于酵母中含有内含子的基因是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组内的RPL7B基因和，(16)权利要求
1～5任一项记载的DNA作为硼酸抗性给予基因的用途和，(17)权利要求1～5任一项记载的DNA用于制备被给予了硼酸抗性的植物或酵母的用途和，(18)权利要求6或7记载的蛋白质作为具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的用途和，(19)权利要求6或7记载的蛋白质用于制备被给予了硼酸抗性的植物或酵母的用途。
23，25，27，或29所示的碱基序列或其互补的序列构成的硼酸抗性给予基因DNA和，(4)由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成的并且编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA和，(5)与权利要求3记载的DNA在严紧条件下杂交并且编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA和，(6)由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的具有硼酸抗性给予活性的蛋白质和，(7)由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，
22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硼酸抗性给予活性的蛋白质和，(8)含有权利要求1～5任一项记载的DNA，并且可以表达硼酸抗性给予蛋白质的重组载体和，(9)导入了权利要求8记载的重组载体，并且表达硼酸抗性给予蛋白质转化体和，(10)权利要求9记载的转化体，其特征在于转化体是酵母和，(11)权利要求9记载的转化体，其特征在于转化体是植物和，(12)硼酸抗性给予基因的筛选方法，其特征在于使用基因文库，缺失YNL 275w基因，转化不表达YNL
275w的YNL 275w破坏酵母，在含有硼酸的培养基中培养所得转化YNL 275w破坏酵母，测定并评价该转化YNL 275w破坏酵母的硼酸抗性给予活性和，(13)硼酸抗性给予基因的筛选方法，其特征在于以由硼酸产生的对剪接的特异性抑制为目标，测定并评价剪接效率的增强程度和，(14)权利要求13记载的硼酸抗性给予基因的筛选方法，其特征在于使被检物质在酵母细胞内表达，在硼酸的存在下，培养被检物质表达，以酵母中含有内含子的基因的由硼酸产生的对剪接的特异性抑制的改善程度作为剪接效率的增强程度进行测定和评价和，(15)权利要求14记载的硼酸抗性给予基因的筛选方法，其特征在于酵母中含有内含子的基因是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组内的RPL7B基因和，(16)权利要求
1～5任一项记载的DNA作为硼酸抗性给予基因的用途和，(17)权利要求1～5任一项记载的DNA用于制备被给予了硼酸抗性的植物或酵母的用途和，(18)权利要求6或7记载的蛋白质作为具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的用途和，(19)权利要求6或7记载的蛋白质用于制备被给予了硼酸抗性的植物或酵母的用途。
[0067] 发明的效果
[0068] 通过在植物中导入本发明的硼酸抗性给予基因，就存在可以制备对硼过剩具有抗性的植物可能性。我们认为硼抗性植物有益于受硼过剩危害的地域的作物增产。此外，也存在通过使用导入这些基因的硼酸抗性提高的藻类和细菌，也可以在通过使其吸收工业用水中所含的硼以除去硼等环境净化中使用的可能性。
具体实施方式
[0069] 作为本发明的基因DNA，如果是有(A)编码由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA；
(B)编码由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的并且具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA；(C)由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，
19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列或其互补的序列构成(拟南芥来源的)的硼酸抗性给予基因DNA硼酸抗性给予基因DNA；(D)由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，
25，27，或29所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成的并且编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA；或(E)与由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，
19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因DNA在严紧条件下杂交并且编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA；构成的硼酸抗性给予基因，没有特别的限制。此外，作为本发明的硼酸抗性给予蛋白质，如果是(A)由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，
18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的具有硼酸抗性给予活性的蛋白质；或(B)由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硼酸抗性给予活性的蛋白质；没有特别的限制，其中所谓“硼酸抗性给予基因”是指给予生物体硼酸抗性的基因，所谓“硼酸抗性给予蛋白质”是指给予生物体硼酸抗性的蛋白质。
(B)编码由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的并且具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA；(C)由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，
19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列或其互补的序列构成(拟南芥来源的)的硼酸抗性给予基因DNA硼酸抗性给予基因DNA；(D)由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，
25，27，或29所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成的并且编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA；或(E)与由序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，
19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因DNA在严紧条件下杂交并且编码具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的DNA；构成的硼酸抗性给予基因，没有特别的限制。此外，作为本发明的硼酸抗性给予蛋白质，如果是(A)由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，
18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列构成的具有硼酸抗性给予活性的蛋白质；或(B)由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有硼酸抗性给予活性的蛋白质；没有特别的限制，其中所谓“硼酸抗性给予基因”是指给予生物体硼酸抗性的基因，所谓“硼酸抗性给予蛋白质”是指给予生物体硼酸抗性的蛋白质。
[0070] 上述所谓“具有硼酸抗性给予活性的蛋白质”是指给予酵母、植物等生物体对硼酸的抗性的蛋白质，高表达这种蛋白质的植物和酵母、即使在高浓度硼酸的存在下也可以生长发育。
[0071] 作为序列号1所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可以例举有AtPAB2基因，作为序列号2所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可以例举有AtPAB2，作为序列号3所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可以例举有AtRBP47c’基因，作为序列号4所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可以例举有AtRBP47c’，作为序列号5所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可以例举有AtRPS20B基因，作为序列号6所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可以例举有AtRPS20B，作为序列号7所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtMYB13基因，作为序列号8所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtMYB13，作为序列号9所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtMYB68基因，作为序列号10所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtMYB68，作为序列号11所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtRBP45a基因，作为序列号12所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtRBP45a，作为序列号13所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtRBP45b基因，作为序列号14所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtRBP45b，作为序列号15所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtRBP45c基因，作为序列号16所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtRBP45c，作为序列号17所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtRBP45d基因，作为序列号18所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtRBP45d，作为序列号19所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtRBP47a基因，作为序列号20所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtRBP47a，作为序列号21所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtRBP47b基因，作为序列号22所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtRBP47b，作为序列号23所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtRBP47c基因，作为序列号24所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtRBP47c，作为序列号25所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtUBP1a基因，作为序列号26所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtUBP1a，作为序列号27所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtUBP1b基因，作为序列号28所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtUBP1b，作为序列号29所示的碱基序列构成的硼酸抗性给予基因，可例举有AtUBP1c基因，作为序列号30所示的氨基酸序列构成的硼酸抗性给予蛋白质，可例举有AtUBP1c。
[0072] 上述所谓“缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列”是指例如缺失、取代或添加了1～20个、优选1～15个、更优选1～10个、更优选1～5个任意个数的氨基酸的氨基酸序列。此外，上述所谓“缺失、取代或添加了1个或数个碱基的碱基序列”是指例如缺失、取代或添加了1～20个、优选1～15个、更优选1～10个、更优选1～5个任意个数的碱基的碱基序列。
[0073] 例如，这些缺失、取代或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成的DNA(变异DNA)也可以通过化学合成，基因工程的方法，诱变等本领域技术人员公知的任意方法制备。具体的是，通过对于由序列号1，3，5，7或9所示的碱基序列构成的DNA、采用使之与作为变异原的药剂接触作用的方法，照射紫外线的方法，基因工程的方法等，在这些DNA中导入变异，可以获得变异DNA。基因工程的方法中的一种特异性位点的诱变法由于是可以在特定位点导入特定的变异的方法因而是有用的，可以按照Molecular Cloning：A laboratoryMannual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989.(以后简称为《分子克隆》第2版)、Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1～38，John Wiley & Sons(1987-1997)等中记载的方法进行。通过采用适当的表达系使变异DNA表达，可以获得缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0074] 上述所谓“严紧条件下杂交的碱基序列”是指使用DNA或RNA等核酸作为探针，通过采用克隆杂交法、噬菌斑杂交法或southern杂交法等可获得的碱基序列，具体可以列举通过使用固定了克隆或噬菌斑由来的DNA或该DNA的片段的滤膜，在0.7-1.0M的NaCl存在下、65℃下进行杂交后，用0.1-2倍左右的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成是150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65℃条件下清洗滤膜可以鉴定的DNA。可以按照《分子克隆》第2版等中记载的方法进行杂交。
[0075] 例如，作为可以在严紧条件下杂交的DNA，可以列举有与作为探针使用的DNA的碱基序列具有一定以上的同源性的DNA，可以列举的最佳例子有例如具有60％或60％以上，优选70％或70％以上，更优选80％或80％以上，更优选90％或90％以上，特别优选95％或95％以上，最优选98％或98％以上的同源性的DNA。
[0076] 本发明的基因的获得方法和制备方法没有特别的限定，基于本说明书中公开的序列号1，3，5，7，9所示的碱基序列信息或序列号2，4，6，8，10所示的氨基酸序列信息制备适当的探针和引物，用它们通过筛选经预测存在该基因的c D N A文库可以分离目的基因，或者按照常规方法通过化学合成可以制备。
[0077] 具体的是，从分离本发明的基因的拟南芥中按照常规方法制备c D N A文库，然后，通过从该文库中，使用本发明的基因所特有的适当的探针选出所希望的的克隆，可以获得本发明的基因。作为上述c D N A的起源，可以列举有上述植物来源的各种细胞或者组织，此外，从这些细胞或组织分离和纯化总R N A、m R N A，获得c D N A和其克隆等可以按照任一常规方法实施。从c D N A文库中筛选本发明的基因的方法可以例举有例如、《分子克隆》第2版等中记载的方法等，本领域技术人员常用的方法。
[0078] 此外，作为上述(B)～(F)任一项所示的碱基序列构成的本发明的变异基因或相同基因，可以通过利用具有序列号1，3，5，7或9所示的碱基序列或其一部分的D N A片段，从其它生物体等中在适当条件下筛选该DNA的同系物进行分离。此外，还可以通过前述的变异DNA的制备方法进行制备。
[0079] 本发明的蛋白质的获得和制备方法没有特别的限定，可以是天然来源的蛋白质，化学合成的蛋白质，通过基因重组技术制备的重组蛋白质的任一种。在获得天然来源的蛋白质的情况中，通过适当组合从表达这种蛋白质的细胞或组织中分离纯化蛋白质的方法，可以获得本发明的蛋白质。通过化学合成制备蛋白质时，按照例如，Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法可以合成本发明的蛋白质。此外，利用各种市售的肽合成机也合成本发明的蛋白质。通过基因重组技术制备蛋白质时，通过在最佳的表达系中导入由编码该蛋白质的碱基序列构成的DNA，可以制备本发明的蛋白质。即使在这些方法中，通过比较容易操作的并且可以大量制备的基因重组技术进行制备仍然是优选的。
[0080] 例如，通过基因重组技术，制备本发明的蛋白质时，为了从细胞培养物中回收纯化这种蛋白质，可以使用包括硫酸铵或者乙醇沉淀，酸提取，阴离子或者阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的公知方法，优选高效液相层析。尤其是，通过使用例如，结合了针对本发明的蛋白质的单克隆抗体等抗体的柱作为亲和层析中使用的柱，或者在上述本发明的蛋白质上添加常规的肽标记时，使用结合了与此肽标记具有亲和性的某种物质的柱作为亲和层析中使用的柱，可以获得这些蛋白质的纯化物。此外，本发明的蛋白质在细胞膜表达时，使细胞膜分解酶作用后，通过进行上述纯化处理可以获得纯化制品。
[0081] 进而，如果是本领域技术人员，根据分别表示编码序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列的碱基序列的其中一例的序列号1，3，5，7，9，
11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列的信息，就可以适当制备或获得由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质、或与序列号2，4，6，8，10，12，14，16，
18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列具有60％或60％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。例如、以具有序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列或其一部分的DNA作为探针，从拟南芥以外的生物中通过在适当的条件下筛选该DNA的同系物，可以将其分离。在克隆这种同系物DNA的全长DNA后，整合到表达载体中，使之在适当的宿主中表达，可以制备由该同系物DNA编码的蛋白质。
11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列的信息，就可以适当制备或获得由序列号2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质、或与序列号2，4，6，8，10，12，14，16，
18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列具有60％或60％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。例如、以具有序列号1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的碱基序列或其一部分的DNA作为探针，从拟南芥以外的生物中通过在适当的条件下筛选该DNA的同系物，可以将其分离。在克隆这种同系物DNA的全长DNA后，整合到表达载体中，使之在适当的宿主中表达，可以制备由该同系物DNA编码的蛋白质。
[0082] 作为本发明的重组载体，如果是前述含有本发明的基因并且可以表达硼酸抗性给予蛋白质的重组载体，没有特别的限制，本发明的重组载体、可以通过在表达载体中适当整合本发明的基因构建。作为表达载体，优选可以在宿主细胞中自主复制的载体或者可以整合到宿主细胞的染色体中的载体，此外，可以最佳使用在可以表达本发明的基因的位点含有启动子、增强子、终止子等控制序列的载体。作为表达载体，可以酵母用表达载体、植物细胞用表达载体、细菌用表达载体、动物细胞用表达载体等，但是优选采用酵母用表达载体和植物细胞用表达载体的重组载体。
[0083] 作 为 酵 母 用 的 表 达 载 体，可 以 例 举 有，例 如、pYES2(Invitrogen)、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。作为酵母用的启动子，具体可以例举有，例如、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、GAL1启动子、GAL10启动子、热激蛋白蛋白质启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。
[0084] 作为植物细胞用的表达载体，可以例举有，例如、Ti质粒(肿瘤诱导质粒，Tumor inducingplasmid)、pSPORT1、pT7Blue-T 载 体、pIG121-Hm〔Plant Cell Report，15，809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J.6，3901-3907(1987)〕等质粒、或烟草花叶病毒、菜花花叶病毒、双生病毒(geminivirus)等植物病毒载体等。作为植物细胞用的启动子，可以例举有，例如、花椰菜花叶病毒35S启动子〔Mol.Gen.Genet(1990)220，389-392〕、二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子等，作为终止子，可以例举有例如胭脂碱合成酶基因的终止子。
[0085] 此外，作为本发明的转化体，如果是导入了上述本发明的重组载体并且表达硼酸抗性给予蛋白质的转化体，没有特别的限制，可以例举有转化酵母、转化植物(细胞、组织、个体)、转化细菌、转化动物(细胞、组织、个体)，但是优选转化酵母和转化植物(细胞、组织、个体)。
[0086] 作为制备转化酵母是可以使用的宿主酵母，可以例举有酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)等。作为向酵母宿主导入重组载体的方法，可以例举有，例如、电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法等。
[0087] 在制备转化植物(细胞、组织、个体)时可以使用的宿主植物(细胞、组织、个体)，其种类没有特别的限定，可以从花卉、果实植物、野菜、根菜、谷类、赏叶植物、包括果树在内的树木等植物、例如属于茄科、禾本科，油菜科、菊科、芝麻科、木犀科、桃金娘科、蔷薇科、豆科、槟榔科或茜草科的植物和这些植物的培养细胞、组织(种子、愈伤组织等)中适当选择。为了制备这种转化植物，可以采用使用含有本发明的基因的上述本发明的重组载体，在植物细胞内导入该重组载体，在植物细胞中的基因组DNA中导入本发明的基因DNA的方法。植物的转化，可以根据植物种类等，适当采用叶盘共存培养法、电穿孔法、农杆菌法、基因枪法等公知方法进行。此外，也可以采用通过以物理或化学方式提高植物细胞的渗透性在受体细胞中直接获得本发明的重组载体来制备转化植物的方法。
[0088] 作为本发明的硼酸抗性给予基因的筛选方法，如果是采用各种植物、酵母等的基因文库，缺失YNL275w基因，转化不表达YNL275w的YNL275w破坏酵母，在硼酸含有培养基中培养获得的转化YNL275w破坏酵母，测定和评价该转化YNL275w破坏酵母的硼酸抗性给予活性的方法，没有特别的限制。作为硼酸抗性给予活性的测定和评价，可以例举有硼酸含有培养基中转化酵母的生长发育及增殖的程度的测定和评价。此外，作为YNL275w的破坏株，可最佳例举有酿酒酵母1169株(Winzeler，E.A.；Shoemaker，D.D.；Astromoff，A.；Liang，H.；Anderson，K.；Andre，B.；Bangham，R.； Benito，R.；Boeke，J.D.；Bussey，H.；
Chu，A.M.；Connelly，C.；Davis，K.；Dietrich，F.；Dow，S.W.；El Bakkoury，M.；Foury，F.；Friend，S.H.；Gentalen，E.；Giaever，G.；Hegemann，J.H.；Jones，T.；Laub，M.；Liao，H.；Liebundguth，N.；Lockhart，D.J.；Lucau-Danila，A.；Lussier，M.；M ′ Rabet，N.；
Menard，P.；Mittmann，M.；Pai，C.；Rebischung，C.；Revuelta，J.L.；Riles，L.；Roberts，C.J.；Ross-MacDonald，P.；Scherens，B.；Snyder，M.；Sookhai-Mahadeo，S.；Storms，R.K.；Veronneau，S.；Voet，M.；Volckaert，G.；Ward，T.R.；Wysocki，R.；Yen，G.S.；Yu，K.X.；Zimmermann，K.；Philippsen，P.；Johnston，M.；Davis，R.W.(1999)Functional characterization of the Saccharomyces cerevisiaegenome by gene deletion and parallel analysis.Science 285：901-906)。筛选中使用的酵母不仅可以使用YNL275w的破坏株，还可以使用其野生型。
Chu，A.M.；Connelly，C.；Davis，K.；Dietrich，F.；Dow，S.W.；El Bakkoury，M.；Foury，F.；Friend，S.H.；Gentalen，E.；Giaever，G.；Hegemann，J.H.；Jones，T.；Laub，M.；Liao，H.；Liebundguth，N.；Lockhart，D.J.；Lucau-Danila，A.；Lussier，M.；M ′ Rabet，N.；
Menard，P.；Mittmann，M.；Pai，C.；Rebischung，C.；Revuelta，J.L.；Riles，L.；Roberts，C.J.；Ross-MacDonald，P.；Scherens，B.；Snyder，M.；Sookhai-Mahadeo，S.；Storms，R.K.；Veronneau，S.；Voet，M.；Volckaert，G.；Ward，T.R.；Wysocki，R.；Yen，G.S.；Yu，K.X.；Zimmermann，K.；Philippsen，P.；Johnston，M.；Davis，R.W.(1999)Functional characterization of the Saccharomyces cerevisiaegenome by gene deletion and parallel analysis.Science 285：901-906)。筛选中使用的酵母不仅可以使用YNL275w的破坏株，还可以使用其野生型。
[0089] 此外，作为本发明的硼酸抗性给予基因的筛选方法，可以例举有以由硼酸产生的对剪接的特异性抑制为目标，测定和评价剪接效率的增强程度的方法，可以举例说明如下，例如使被检物质在酵母细胞中表达，在硼酸存在下，培养被检物质表达，测定和评价酵母中含有内含子的基因的由硼酸产生的对剪接的特异性抑制的改善程度作为剪接效率的增强程度。作为酵母中含有内含子的基因，具体可举例说明有编码酿酒酵母基因组内必须的核糖体的大亚单位蛋白质的基因RPL7B基因(序列号33)。由硼酸产生的对剪接的特异性抑制的改善程度可以通过例如RT-PCR测定，此外，此时，优选以硼酸抗性给予基因AtRBP47c’基因作为阳性对照。
[0090] 本发明中，包括上述本发明的DNA的作为硼酸抗性给予基因的用途(方法)、上述本发明的DNA的用于制备被给予了硼酸抗性的植物或酵母的用途(方法)和、上述本发明的蛋白质的作为具有硼酸抗性给予活性的蛋白质的用途(方法)和、上述本发明的蛋白质的用于制备被给予了硼酸抗性的植物或酵母的用途(方法)。因而，本发明的实施方式中包括在制备被给予了硼酸抗性的植物和酵母时使用上述本发明的硼酸抗性给予基因和具有硼酸抗性给予活性的蛋白质(硼酸抗性给予蛋白质)。
[0091] 下面。通过对本发明进行更详细的说明，但是本发明的技术范围不受这些实施例的限定。
[0092] 实施例1
[0093] [供试酵母及质粒]
[0094] 作为酵母，使用酿酒酵母1169株(购自Research Genetics公司)和酿酒酵母BY4741株(购自Research Genetics公司)。其基因型分别是，1169株为MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0；YNL275w：：kanMX4，BY4741株 为 MATa；his3Δ1；leu2Δ0；
met15Δ0；ura3Δ0。此外，质粒使用pYES2(购自lnvitrogen Genetics公司)和pFL61(由德国、ホ一ヘハイム大学的Nicolaus von Wiren博士提供；Minet M.，Dufour M.-E.，and Lacroute F.(1992)Complementation of Saccharomyces cerevisiae auxotrophic mutants by Arabidopsis thalianacDNAs.Plant J.2；417-422.)。使用pFL61以制备拟南芥表达文库。
met15Δ0；ura3Δ0。此外，质粒使用pYES2(购自lnvitrogen Genetics公司)和pFL61(由德国、ホ一ヘハイム大学的Nicolaus von Wiren博士提供；Minet M.，Dufour M.-E.，and Lacroute F.(1992)Complementation of Saccharomyces cerevisiae auxotrophic mutants by Arabidopsis thalianacDNAs.Plant J.2；417-422.)。使用pFL61以制备拟南芥表达文库。
[0095] [酵母1169株的硼酸抗性试验]
[0096] 对使用的酵母1169株的硼酸抗性能进行检测。用接种环挑取(かきとり)经pYES2和pYES2-BOR1(pYES2载体的GAL1启动子的下游插入有拟南芥的硼抗性基因BOR1的CDS的载体)转化的酵母1169株的单菌落，在SD液体培养基中振动培养直至OD600的值达到约1.0。将培养液分别划线于含有0、20、30、40、50、60、70、80、90、和100mM硼酸的SD固体培养基上。26.5℃下培养16天，检测酵母是否可以在各培养基上形成菌落。
[0097] [硼酸抗性给予基因的筛选]
[0098] 使用拟南芥的表达文库(由德国、ホ一ヘンハイム大学的Nicolaus von Wiren博士提供；Schaaf G.，Catoni E.，Fits M.，Schwacke R.，Schneider A.，von Wiren N.，and Frommer W.B.(2002)A putative role for the vacuoler calcium/manganese proton antiporter AtCAX2 in heavy metaldetoxification.Plant Biot.4；612-618.)，通过醋酸锂法，转化酵母1169株。将转化酵母划线于加入了80mM硼酸的S D培养基(6.7g/l没有氨基酸的酵母nitrogen base，5g/l硫酸铵，20g/l葡萄糖，2g/l组胺酸，2g/l蛋氨酸，3g/l亮氨酸，20g/l琼脂，pH5.5)上，于26.5℃下培养。10天-14天后，从形成菌落的酵母中回收质粒。将回收的质粒再次导入酵母，确认硼酸抗性能力的再现性。
[0099] [硼酸抗性试验]
[0100] 通过斑点测试(spot assay)和液体培养进行测定。斑点测试(spot assay)按以下步骤进行。在S D液体培养基中振动培养各酵母直至OD600的值达到0.5-1.0。用SD培养基稀释成各酵母的OD600的值相同。对OD600的值一致的各酵母培养液，制备1/5、1/2 5、1/125、和1/625稀释的稀释液。用自动移液器(Pipetman)(Gilson)将各稀释液分别一点一点地将5μl点样于加入了硼酸的SD固体培养基和作为对照的未加入硼酸的SD固体培养基中，就同一酵母而言，按从左至右浓度变薄的方式点样。点样了酵母的平板在30℃下培养约10天，观察酵母的生长发育状况。
[0101] 通过液体培养的测定按如下方式进行。30℃下在SD液体培养基中振动培养各酵母直至OD600的值达到约1.0。将各培养液接种于含有硼酸的SD液体培养基和作为对照的不含硼酸的SD液体培养基中继续培养直至OD600的值为0.1。30℃下振动培养，每24小时测定OD600的值。
[0102] [硼酸抗性给予基因的测序]
[0103] 通过筛选获得的6个cDNA克隆的碱基序列的解析按如下方式进行。通过荧光染色终止子法进行测序反应，使用ABI 310基因分析仪分析碱基序列。从获得的碱基序列中通过TAIR(http://www.arabidopsis.org/)的BLAST检索确定其碱基序列的编码基因。
[0104] [硼酸抗性给予基因的筛选结果]
[0105] 首先，进行本实验中使用的酵母1169株的硼酸抗性能力的测定。以pYES2和pYES2-BOR1转化酵母1169。使用pYES2和pYES2-BOR1转化是因为这些载体带有与接下来的筛选中使用的拟南芥表达文库中使用的载体FL61相同的URA3作为筛选标记。此外，由于SD培养基不诱导pYES-BOR1的BOR1基因的表达，应该会显示出经pYES2转化相同程度的硼酸抗性。将经pYES2和pYES2-BOR1转化的酵母分别命名为“2”和“7”。在SD液体培养基中振动培养“2”和“7”，划线于含有0、20、30、40、50、60、70、80、90和100mM硼酸的SD固体培养基中。其结果表明，经以上任一载体转化的酵母几乎不能在含有80mM和80mM以上的硼酸的SD培养基上生长(图1)。
[0106] 为了分离硼酸抗性给予基因，本实验中通过使酵母1169株表达，寻找可以在含有80mM的SD培养基上生长的拟南芥基因。于是，将经拟南芥的表达文库转化的约120万酵母划线于含有80mM的SD培养基上。其结果是，可以获得对80mM硼酸显示出抗性的46、66、
72、84、86、和87这6个转化酵母。通过斑点测试(spot assay)获得的46、72、84、86、和87的转化酵母的硼酸抗性能示于图2(对于66，如下所示，由于编码与46相同的基因，因此结果仅表示46)。酵母1169株，如图2的上部所示，含有80mM的SD培养基上几乎不形成菌落。另一方面，这些转化酵母可以比任一1169株形成更多的菌落。下面，通过液体培养进行试验。液体培养中，如图3所示，46、72、86、87中显示出比硼酸培养基中的1169株高约
3倍的增殖能力。但是，84中生长速度差别大，就硼酸抗性而言没有发现与1169株有能力差。此外，在将这些基因导入到酵母BY4741株中时，与导入到1169株时同样也可以给予硼酸抗性。图4中表示斑点测试(spot assay)的结果，图5中表示液体培养的结果。在导入到BY4741株时，在所有的转化酵母中，在液体培养中也发现对硼酸抗性存在能力差(图5)。
72、84、86、和87这6个转化酵母。通过斑点测试(spot assay)获得的46、72、84、86、和87的转化酵母的硼酸抗性能示于图2(对于66，如下所示，由于编码与46相同的基因，因此结果仅表示46)。酵母1169株，如图2的上部所示，含有80mM的SD培养基上几乎不形成菌落。另一方面，这些转化酵母可以比任一1169株形成更多的菌落。下面，通过液体培养进行试验。液体培养中，如图3所示，46、72、86、87中显示出比硼酸培养基中的1169株高约
3倍的增殖能力。但是，84中生长速度差别大，就硼酸抗性而言没有发现与1169株有能力差。此外，在将这些基因导入到酵母BY4741株中时，与导入到1169株时同样也可以给予硼酸抗性。图4中表示斑点测试(spot assay)的结果，图5中表示液体培养的结果。在导入到BY4741株时，在所有的转化酵母中，在液体培养中也发现对硼酸抗性存在能力差(图5)。
[0107] [硼酸抗性给予基因的测序]
[0108] 测定经筛选获得的6个cDNA克隆的碱基序列，通过BLAST检索确定它们的编码基因。其结果表明，46和66与AtPAB2一致，72与AtMYB68一致，84与AtMYB13一致，86与AtRPS20B一致、87与AtRBP47一致。各基因的序列示于下述序列表中。AtPAB2是编码聚腺苷酸结合蛋白质的基因，AtMYB13和AtMYB68是编码MYB样转录因子的基因，AtRPS20是编码核糖体蛋白质的基因，AtRBP47是编码RNA结合蛋白质的基因。
[0109] 实施例2
[0110] [酵母株及筛选]
[0111] 本研究中，使用酿酒酵母株BY4741(MATa his3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0)，Y01169(MATa his3D1 Leu2D0 met15D0 ura3D0 YNL275W：：kanMX4)、Y04443(MATa his3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0 YGL076C：：kan MX4)、及Y01094(MATa his3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0 YPL198W：：kanMX4)。可以通过插入性诱变(insertional mutagenesis)从BY4741中构建Y01169、Y04443、Y01094株(Winzeler et al.，1999)，由EUROSCARF获得。
[0112] 通过醋酸锂法(Gietz and Schiestl，1995)，以克隆于表达质粒pFL61的拟南芥cDNA文库转化酵母感受态细胞(Minet et al.，1992)。由于与对应的野生型株相比，缺失了排出型硼运载体即对硼酸具有感受性的YNL275W(以下BOR1)，因此Y01169株可以作为宿主使用(未显示数据)。在26.5℃下在含有80mM的硼酸的SD固体培养基(Sherman，1991)中筛选转化体。SD培养基含有变异体成长所必需的2％葡萄糖、0.67％不含氨基酸的酵母nitrogen base、和0.05％硫酸铵、变异体生长所必需的氨基酸(20mg/L的His、30mg/L的Leu、20mg/L的Met)，用Tris将pH调整成5.5。为了形成固体培养基，添加琼脂(2％w/v)。通过添加80mM的硼酸，可以完全抑制非转化Y01169(Δbor1)细胞的菌落形成。转化细胞中，在26.5℃下培养2周后，在含有80mM硼酸的SD培养基中选择形成菌落的细胞，在80mM硼酸存在下检查其生长发育情况，确认其抗性。为了确认由质粒给予的表型，从阳性分离物(positive isolate)中分离质粒，再转化酵母株Y01169。对抗性分离物，进行氟乳清酸诱导质粒loss(fluoro-orotic acid-inducedplasmid loss)(Boeke，J.D.，LaCroute，F.，& Fink，G.R.(1984)Mol.Gen.Genet.197，345-346.)，选择显示出质粒依赖性的硼酸抗性的克隆。
[0113] [质粒的构建]
[0114] 用表1记载的引物组，通过PCR，扩增AtRBP47c”相关基因和RPL7B的ORF序列(参照序列号34)。将扩增产物克隆到pGEM-T easy载体的亚克隆位点(Promega社制)。用NotI处理这些质粒，将组为结果产生的AtRBP45a、AtRBP47b、AtRBP47c、AtRBP47c’及AtUBP1的ORF片段克隆到表达载体pFL61的NotI位点中(Minet et al，1992)。此外，将RPL7B的ORF片段克隆到表达载体pDR195的NotI位点(Rentsch et al.，1995)。pFL61及pDR195分别带有用于表达的PGK及PMA1启动子。
[0115] 【表1】
[0116]Gene Primer sequences
AtRBP45a 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGCAACCACCGTCAAACGCC-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTTCACTGACGTTGCTGCTGATAGTT-3’
AtRBP47a 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGACACCAAACAACAACGGT-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTCAAGAAGCTCCCGGGACTGCAGC-3’
AtRBP47b 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGACAACCAACGGCTCAGAT-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTCAATTCTCCCCATGATAGTTGTT-3’
AtRBP47c 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGGCAGACGTCAAGATTCAATCC-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTCAGCTAACTTGTTGCTGATGACC-3’
AtRBP47c 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGGCAGACGTCAAGGTTCAATCC-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTCAGCTAACTTGTTGCTGATGACC-3’
AtUBP1a 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGAATCAAAGGCTTATTAAG-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTTACTGATAGTACATGAGCTGCTG-3’
RPL7B 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGTCCACTGAAAAAATCTT-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTTAGTTCATAGCCTTAACCA-3’
AtRBP45a 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGCAACCACCGTCAAACGCC-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTTCACTGACGTTGCTGCTGATAGTT-3’
AtRBP47a 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGACACCAAACAACAACGGT-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTCAAGAAGCTCCCGGGACTGCAGC-3’
AtRBP47b 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGACAACCAACGGCTCAGAT-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTCAATTCTCCCCATGATAGTTGTT-3’
AtRBP47c 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGGCAGACGTCAAGATTCAATCC-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTCAGCTAACTTGTTGCTGATGACC-3’
AtRBP47c 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGGCAGACGTCAAGGTTCAATCC-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTCAGCTAACTTGTTGCTGATGACC-3’
AtUBP1a 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGAATCAAAGGCTTATTAAG-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTTACTGATAGTACATGAGCTGCTG-3’
RPL7B 5’-AAAAAGCAGGCTTAATGTCCACTGAAAAAATCTT-3’
5’-AGAAAGCTGGGTTTTAGTTCATAGCCTTAACCA-3’
[0117] [硼酸抗性分析]
[0118] 为了分析AtRBP47c”相关家族基因的硼酸抗性，在酿酒酵母株BY4741中导入表达质粒。作为对照，没有插入的空载体也导入到BY4741中。使转化体在SD液体培养基中生长至稳定期，将培养物的细胞密度调整至OD600＝1.0。将调整了细胞密度的培养物用SD液体培养基稀释成1/5、1/2 5、1/125及1/625，将稀释的培养液滴到10μl含有或不含有80mM的硼酸的SD培养基中，于30℃下培养7天。
[0119] 为了进行培养液内的分析，使转化体在SD液体培养基中生长至稳定期，用SD液体培养基含有或不含有80mM硼酸的液体培养基稀释，调整至OD600＝1.0以检查高浓度硼酸的抗性能力。
[0120] 为了分析Δrp17a(Y04443)变异体及Δrp17b(Y01094)变异体的硼酸抗性，使用含有2％葡萄糖、0.67％氨基酸不含酵母nitrogen base及0.05％的硫酸铵的SD培养基，用Tris将pH调整至5.5，再添加必需的氨基酸(20mg/L的His、30mg/L的Leu、20mg/L的Met及20mg/L的Ura)。从EUROSCARF获得变异体。为了进一步调查硼酸抗性中RPL7B的作用，使RPL7B在酵母株Y04443中过剩表达。通过上述方式进行硼酸抗性分析。
[0121] [通过RT-PCR检测非剪接转录物]
[0122] 酵母细胞在SD液体培养基中生长至对数期(OD600＝0.5～1.0)，以80mM的终浓度添加硼酸。30℃下培养24小时后、取出1ml试样、通过离心分离回收细胞、液氮下冷冻，于-80℃保存直至使用。
[0123] 使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司制)从酵母细胞中提取总RNA，使用MuLV逆转录酶(Applied Biosystem社制)及olig(dT)16引物逆转录1μg的总RNA。对RT产物的1/15，以如下循环进行PCR：94℃下30秒、45℃下30秒、72℃下1分钟，进行40～50次。在Smart Cycler(Cepheid社制)中，使用DNA聚合酶ExTaq(Takara社制)进行PCR。该分析中使用的引物组记载于表2中，作为在PNAS的网页上的补充信息被发表。在2％琼脂糖凝胶上分离扩增的转录物，经Etd溴染色后检测。
[0124] 【表2】
[0125]Gene Primer sequences
SNR17A 5’-AATCTGTGTCGACGTACTTC-3’(Forward)
5’-AGAAGTACATAGGATGGGTC-3’(Reverse)
SNR17B 5’-AAAAATTGTCGACGTACTTC-3’(Forward)
5’-AAAGGAAGTTATCACAATTG-3’(Reverse)
YBR230C 5’-CCAGCATCTATGTCTGCAAC-3’(Forward)
5’-CGTATCTGGAGTAGTATTTC-3’(Reverse)
VMA10 5’-GCAAGGTATACAAAGCAGAA-3’(Forward)
5’-TCATCCTTTTTCTTCTCTGC-3’(Reverse)
SEC27 5’-GACACGGATGAAGTTGGATAT3’(Forward)
5’-TGACTGTCAAATCATCACTG-3’(Reverse)
YNL050C 5’-CAGTATAAAAATGGTCTGAAT3’(Forward)
5’-TGGTTGATTATTTCTTCTTC-3’(Reverse)
RPL7B 5’-ATCAACGTCATAATGTCCAC-3’(Forward)
5’-TACCAGAGTTGATTCTTGTC-3’(Reverse)
SNR17A 5’-AATCTGTGTCGACGTACTTC-3’(Forward)
5’-AGAAGTACATAGGATGGGTC-3’(Reverse)
SNR17B 5’-AAAAATTGTCGACGTACTTC-3’(Forward)
5’-AAAGGAAGTTATCACAATTG-3’(Reverse)
YBR230C 5’-CCAGCATCTATGTCTGCAAC-3’(Forward)
5’-CGTATCTGGAGTAGTATTTC-3’(Reverse)
VMA10 5’-GCAAGGTATACAAAGCAGAA-3’(Forward)
5’-TCATCCTTTTTCTTCTCTGC-3’(Reverse)
SEC27 5’-GACACGGATGAAGTTGGATAT3’(Forward)
5’-TGACTGTCAAATCATCACTG-3’(Reverse)
YNL050C 5’-CAGTATAAAAATGGTCTGAAT3’(Forward)
5’-TGGTTGATTATTTCTTCTTC-3’(Reverse)
RPL7B 5’-ATCAACGTCATAATGTCCAC-3’(Forward)
5’-TACCAGAGTTGATTCTTGTC-3’(Reverse)
[0126]MUD1 5’-ACCTAAAGAAACCATGTCAG-3’(Forward)
5’-TATCAAGGTTGTACGTTTCG-3’(Reverse)
SNC1 5’-ATGTACAGTCTAAGTCAAGG-3’(Forward)
5’-GACTAAAGTGAACAGCAATG-3’(Reverse)
POP8 5’-GAGAATGGCAATATTTCAAG-3’(Forward)
5’-TGTTCTTCTFCTTCCATTAC-3’(Reverse)
ARP2 5’-TGGACCCACATAATCCAATT-3’(Forward)
5’-TTTCGAACATTACCTCACAC-3’(Reverse)
CNB1 5’-GTGGATGGTCTTTTAGAAGA-3’(Forward)
5’-AACTCCTCGAAACTTAAACG-3’(Reverse)
RPS22B 5’-TATTGAGACCTTCTTCCAAG-3’(Forward)
5’-AAGATTTTACCGGAAACGTG-3’(Reverse)
YML025C 5’-GACGATAAAAAGAAATTTGGTG-3’(Forward)
5’-CTCAAAGCGTTGTTGAAAG-3’(Reverse)
TUB3 5’-GAGAGAGGTCATTAGTATTA-3’(Forward)
5’-TTTTCTAATAACAGGGAACC-3’(Reverse)
STO1 5’-GTTTAATAGAAAAAGAAGAGGAG-3’(Forward)
5’-TAGTTCATCAACTAAAAACATGG-3’(Reverse)
RPS16A 5’-AGCTGTCCCAAGTGTTCAA-3’(Forward)
5’-ACCCTTACCACCGAATTTC-3’(Reverse)
SAR1 5’-GTTGGGATATTTTTGGTTGG-3’(Forward)
5’-AAAGGAACGTCCTTCAATTC-3’(Reverse)
PMI400 5’-AACAAGCTGTTCAGGTTAGA-3’(Forward)
5’-GGTTTGTGATTATCATCAGG-3’(Reverse)
RPL7A 5’-AATTAAAGATCACAATGGCCG-3’(Forward)
5’-CTTGGTAACTTTGACGAATG-3’(Reverse)
YBL091C-A 5’-CAGAAAAGCTGGTGTTCAAG-3’(Forward)
5’-TGATTCTGCATCGTGGTTTC-3’(Reverse)
RPL19A 5’-TTGATTAAGAACTCCAAAGC-3’(Forward)
5’-TCTTCTCAAGACACGTAATC-3’(Reverse)
PCH2 5’-AGATGAGGTTGAAGCAATAG-3’(Forward)
5’-CAAGGGCAATTTCCTTATTG-3’(Reverse)
5’-TATCAAGGTTGTACGTTTCG-3’(Reverse)
SNC1 5’-ATGTACAGTCTAAGTCAAGG-3’(Forward)
5’-GACTAAAGTGAACAGCAATG-3’(Reverse)
POP8 5’-GAGAATGGCAATATTTCAAG-3’(Forward)
5’-TGTTCTTCTFCTTCCATTAC-3’(Reverse)
ARP2 5’-TGGACCCACATAATCCAATT-3’(Forward)
5’-TTTCGAACATTACCTCACAC-3’(Reverse)
CNB1 5’-GTGGATGGTCTTTTAGAAGA-3’(Forward)
5’-AACTCCTCGAAACTTAAACG-3’(Reverse)
RPS22B 5’-TATTGAGACCTTCTTCCAAG-3’(Forward)
5’-AAGATTTTACCGGAAACGTG-3’(Reverse)
YML025C 5’-GACGATAAAAAGAAATTTGGTG-3’(Forward)
5’-CTCAAAGCGTTGTTGAAAG-3’(Reverse)
TUB3 5’-GAGAGAGGTCATTAGTATTA-3’(Forward)
5’-TTTTCTAATAACAGGGAACC-3’(Reverse)
STO1 5’-GTTTAATAGAAAAAGAAGAGGAG-3’(Forward)
5’-TAGTTCATCAACTAAAAACATGG-3’(Reverse)
RPS16A 5’-AGCTGTCCCAAGTGTTCAA-3’(Forward)
5’-ACCCTTACCACCGAATTTC-3’(Reverse)
SAR1 5’-GTTGGGATATTTTTGGTTGG-3’(Forward)
5’-AAAGGAACGTCCTTCAATTC-3’(Reverse)
PMI400 5’-AACAAGCTGTTCAGGTTAGA-3’(Forward)
5’-GGTTTGTGATTATCATCAGG-3’(Reverse)
RPL7A 5’-AATTAAAGATCACAATGGCCG-3’(Forward)
5’-CTTGGTAACTTTGACGAATG-3’(Reverse)
YBL091C-A 5’-CAGAAAAGCTGGTGTTCAAG-3’(Forward)
5’-TGATTCTGCATCGTGGTTTC-3’(Reverse)
RPL19A 5’-TTGATTAAGAACTCCAAAGC-3’(Forward)
5’-TCTTCTCAAGACACGTAATC-3’(Reverse)
PCH2 5’-AGATGAGGTTGAAGCAATAG-3’(Forward)
5’-CAAGGGCAATTTCCTTATTG-3’(Reverse)
[0127]RPS9B 5’-TAAGACTAAGCAACAATGCC-3’(Forward)
5’-AAACCCAACTTGTAGACTTG-3’(Reverse)
YBR230C 5’-GCATCTCATAATATGTCTGC-3’(Forward)
5’-TTGTTGCTAAGACTGTAGAG-3’(Reverse)
YDR381C-A 5’-CAAATCCATTTCAAAATAGG-3’(Forward)
5’-CTCCTCCTATCTAAAAAACC-3’(Reverse)
YRA1 5’-AAGAAGAGTTGGTAAGCAAG-3’(Forward)
5’-CACCGTTTTTGAATGTGATG-3’(Reverse)
UBC8 5’-AGCGTAATACGAAAGATGAG-3’(Forward)
5’-AGCTTCGTTATTCAAGGGAT-3’(Reverse)
MND1 5’-GTATCATAAACATTCAACAATG-3’(Forward)
5’-CGGATCTGTTGTTTATTCTC-3’(Reverse)
MER3 5’-AAACAAAGTTTGATCGCCTC-3’(Forward)
5’-TCGTGCTCAAACATTTCTTC3-’(Reverse)
ERV1 5’-AAAATGACGGATAATCCACC-3’(Forward)
5’-TTCAAAGTCTTTAGCACACC-3’(Reverse)
SRB2 5’-CAATCCATCATGGGAAAATC-3’(Forward)
5’-CTTGGACGGACAAATAGTGT-3’(Reverse)
MOBI 5’-AGGACTTCAATTTCCATGTC-3’(Forward)
5’-AGTGTCATCTCCACAATTTG-3’(Reverse)
RPS21A 5’-GAAAACGATAAGGGCCAATT-3’(Forward)
5’-CGTTCTTTAACAAACCATCG-3’(Reverse)
NYVI 5’-TACCAAATGAAACGCTTTAATG-3’(Forward)
5’-TCTTCATGGAAAGAGTCTAG-3’(Reverse)
YLR211C 5’-ATGGAATGAGTACTTTAGCG-3’(Forward)
5’-CTTCATTTCCGAGTTTTTGG-3’(Reverse)
TAD3 5’-AATAGAAAATCGGCTTCTGC-3’(Forward)
5’-TATTTGATCATTGGGGTTGC-3’(Reverse)
ERV41 5’-GATTGAAGACATTTGATGCG-3’(Forward)
5’-TCGCCACTAACTCTATTTAC-3’(Reverse)
SPO1 5’-ACCATTTCAGGTACAATGTC-3’(Forward)
5’-CTTCGGAAATATCGAATTCC-3’(Reverse)
5’-AAACCCAACTTGTAGACTTG-3’(Reverse)
YBR230C 5’-GCATCTCATAATATGTCTGC-3’(Forward)
5’-TTGTTGCTAAGACTGTAGAG-3’(Reverse)
YDR381C-A 5’-CAAATCCATTTCAAAATAGG-3’(Forward)
5’-CTCCTCCTATCTAAAAAACC-3’(Reverse)
YRA1 5’-AAGAAGAGTTGGTAAGCAAG-3’(Forward)
5’-CACCGTTTTTGAATGTGATG-3’(Reverse)
UBC8 5’-AGCGTAATACGAAAGATGAG-3’(Forward)
5’-AGCTTCGTTATTCAAGGGAT-3’(Reverse)
MND1 5’-GTATCATAAACATTCAACAATG-3’(Forward)
5’-CGGATCTGTTGTTTATTCTC-3’(Reverse)
MER3 5’-AAACAAAGTTTGATCGCCTC-3’(Forward)
5’-TCGTGCTCAAACATTTCTTC3-’(Reverse)
ERV1 5’-AAAATGACGGATAATCCACC-3’(Forward)
5’-TTCAAAGTCTTTAGCACACC-3’(Reverse)
SRB2 5’-CAATCCATCATGGGAAAATC-3’(Forward)
5’-CTTGGACGGACAAATAGTGT-3’(Reverse)
MOBI 5’-AGGACTTCAATTTCCATGTC-3’(Forward)
5’-AGTGTCATCTCCACAATTTG-3’(Reverse)
RPS21A 5’-GAAAACGATAAGGGCCAATT-3’(Forward)
5’-CGTTCTTTAACAAACCATCG-3’(Reverse)
NYVI 5’-TACCAAATGAAACGCTTTAATG-3’(Forward)
5’-TCTTCATGGAAAGAGTCTAG-3’(Reverse)
YLR211C 5’-ATGGAATGAGTACTTTAGCG-3’(Forward)
5’-CTTCATTTCCGAGTTTTTGG-3’(Reverse)
TAD3 5’-AATAGAAAATCGGCTTCTGC-3’(Forward)
5’-TATTTGATCATTGGGGTTGC-3’(Reverse)
ERV41 5’-GATTGAAGACATTTGATGCG-3’(Forward)
5’-TCGCCACTAACTCTATTTAC-3’(Reverse)
SPO1 5’-ACCATTTCAGGTACAATGTC-3’(Forward)
5’-CTTCGGAAATATCGAATTCC-3’(Reverse)
[0128]YOL048C 5’-CTGAAACGATACCAACAATG-3’(Forward)
5’-TTTGTGGTTTAGGCAATACC-3’(Reverse)
RPS9A 5’-ATACAAAAGTATACAACATGCC-3’(Forward)
5’-TTTCCAAGAAATCTTCGACC-3’(Reverse)
CIN2 5’-CTTTACTGCGAAGATAAAGG-3’(Forward)
5’-GCCACTATAATCTGTTGTTG-3’(Reverse)
YPR098C 5’-TCAAAACTACGGCTCATTFG-3’(Forward)
5’-TGAACAAAAGACTCAATCCG-3’(Reverse)
5’-TTTGTGGTTTAGGCAATACC-3’(Reverse)
RPS9A 5’-ATACAAAAGTATACAACATGCC-3’(Forward)
5’-TTTCCAAGAAATCTTCGACC-3’(Reverse)
CIN2 5’-CTTTACTGCGAAGATAAAGG-3’(Forward)
5’-GCCACTATAATCTGTTGTTG-3’(Reverse)
YPR098C 5’-TCAAAACTACGGCTCATTFG-3’(Forward)
5’-TGAACAAAAGACTCAATCCG-3’(Reverse)
[0129] [盐抗性分析]
[0130] 对于盐抗性分析，除了使用含有1.75M或2M的NaCl的SD培养基之外，其余通过上述的硼酸抗性分析进行。
[0131] [登录号]
[0132] 实施例2中记载的序列GenBank登陆号如下所示。拟南芥序列AtRBP45a，MN124872；AtRBP45b，MN101037；AtRBP45c，MN118834；AtRBP45d，MN121940；AtRBP47a，MN103848；AtRBP47b，MN112800；AtRBP47c，MN103642；AtRBP47c’，MN103643；AtUBP1a，MN104285；AtUBP1b，MN101598；AtUBP1c，MN112266；及酿酒酵母序列RPL7A，X62627；RPL7B、Z7355。
[0133] [酵母中给予高浓度硼酸抗性的拟南芥cDNA克隆的分离结果]
[0134] 用拟南芥cDNA表达文库(Minet，M.，Dufour，M.-E.，& Lacroute，F.(1992)Plant J.2，417-422.)转化酿酒酵母株Y01169株，在含有80mM的硼酸的皿中选择这些转化体。这种浓度的硼酸，在26.5℃下培养2周后也可以完全抑制Y01169细胞的菌落形成。通过这种筛选，分离出几个显示出硼酸抗性增强的酵母的菌落。cDNA克隆中的1个显示出编码RNA结合蛋白质AtRBP47c’。
[0135] [拟南芥来源的AtRBP47c’相关基因的表达给予酵母硼酸抗性]
[0136] AtRBP47c’具有3个RNA识别基序(RRM)。拟南芥基因组中有11种编码具有3个RRM并经BLASTP程序计算对于AtRBP47c’具有100以上的序列同一性得分的蛋白质的基因。这些AtRBP47c’相关家族蛋白质的系统树图示于图6A。
[0137] 为了调查这些拟南芥基因的表达是否给予酵母硼酸抗性，在表达载体pFL61中克隆对应于6种基因的ORF序列(AtRBP45a、AtRBP47a、AtRBP47b、AtRBP47c、AtRBP47c’及AtUBP1a)。在酵母株BY4741中导入质粒，调查这些转化体的硼酸抗性。如图6B所示，6种构建体在各种范围内，在含有80mM硼酸的SD培养基中均给予酵母柱生长能力。为了比较这些转化体的硼酸抗性水平，在液体培养中分析硼酸存在下的生长率。所有的转化体均比对照更早显示生长率。图中，显示了表达AtRBP47c’的转化体最早显示生长率(图6C)。
[0138] [硼酸处理抑制酵母中RPL7B的剪接，但是不抑制RPL7A的剪接]
[0139] 本发明人发现AtRBP47c’相关基因的过剩表达给予硼酸抗性。拟南芥的这些基因的作用还不清楚，但是其它植物种类的类似基因可给予特征。烟草白花丹(Nicotianaplumbaginifolia)RBP45(Simpson，C.G.，Jennings，S.N.，Clark，G.P.，Thow，G，& Brown，J.W.S.(2004)Plant J.37，82-91)及UBP1(Lambermon，M.H.，Simpson，G.G.，Wieczorek Kirk，D.A.，Hemmings-Mieszczak，M.，Klahre，U.，& Filipowicz，W.(2000)EMBO J.19，1638-1649)显示出剪接效率增强。于是，在通过RT-PCR任意选择的酿酒酵母的20种含有内含子的基因中、调查硼酸对剪接的影响。酿酒酵母基因组内的6317种核基因中仅
231种基因含有内含子(Munich Information Center for Protein Sequences:http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast)。被调查的20种基因中，比较积累的非剪接片段和剪接片段，通过编码必须核糖体的大亚单位蛋白质的基因RPL7B观察到经硼酸处理产生的非剪接片段的增加。这提示经硼酸处理的酵母中RPL7B的剪接受到抑制(图7B)。
231种基因含有内含子(Munich Information Center for Protein Sequences:http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast)。被调查的20种基因中，比较积累的非剪接片段和剪接片段，通过编码必须核糖体的大亚单位蛋白质的基因RPL7B观察到经硼酸处理产生的非剪接片段的增加。这提示经硼酸处理的酵母中RPL7B的剪接受到抑制(图7B)。
[0140] RPL7B含有2个内含子。非剪接片段的大小显示出这些片段经第1或第2内含子的剪接而来(图7A参照)。为了研究哪一个内含子对硼酸更具感受性，克隆非剪接片段，测定8个克隆的DNA序列。6个和2个的克隆分别含有第1和第2内含子。这提示，在第1及第2内含子两者中均发生抑制，但第1内含子对高浓度硼酸更具感受性。这些结果还表示，2个内含子中的1个正确剪接，也就是说，这些非剪接片段不是基因组DNA因污染而形成的，是通过RNA的逆转录反应产生的。
[0141] 进而，在表达AtRBP47c’的酵母中没有观察到由硼酸产生的对RPL7B的剪接抑制(图7B)。该结果提示，AtRBP47c’在高浓度硼酸存在下，使RPL7B的剪接效率上升。剪接效率的增强可能是酵母中硼酸抗性的原因。
[0142] RPL7B在酵母基因组中具有同源的(パラログ)RPL7A(序列号32)。RPL7A基因(序列号31)如RPL7B基因一样具有2个内含子。调查了硼酸对RPL7A的剪接的影响。和RPL7B的情况不同，没有观察到硼酸产生的剪接抑制(图7C)。
[0143] [由于酵母中RPL7A的破坏减少硼酸抗性]
[0144] RPL7A及RPL7B双重破坏的变异体是致死性的(酵母基因组数据库(SaccharomycesGenome Database):http://db.yeastgenome.org)，显示出RPL7蛋白质是酵母生长发育所必须的。如果考虑2个基因中硼酸感受性对于剪接的差异，就存在RPL7A破坏变异体与RPL7B破坏变异体的硼酸抗性有差异的可能性。Δrp17b(Y01094)显示出与野生型酿酒酵母同等的硼酸抗性水平，但是Δrp17a(Y04443)的硼酸抗性比野生型更低(图
8A)。即使在液体培养中硼酸抗性的差异也很明显(图8B)。这些结果提示由硼酸产生的RPL7B剪接抑制是由于Δrp17a的硼酸抗性减少导致的。
8A)。即使在液体培养中硼酸抗性的差异也很明显(图8B)。这些结果提示由硼酸产生的RPL7B剪接抑制是由于Δrp17a的硼酸抗性减少导致的。
[0145] [RPL7A破坏酵母中由于无内含子RPL7B的表达所产生的硼酸抗性上升]
[0146] Δrp17a的硼酸抗性的减少如果是由于由RPL7B剪接抑制产生的RPL7蛋白质水平的减少形成的，无内含子RPL7BcDNA的表达的确使Δrp17a的抗性上升。
[0147] 调查Δrp17a中无内含子RPL7B的表达是否使硼酸抗性上升。将RPL7B的ORF序列克隆到表达载体pDR195中。接着，将质粒导入Δrp17a，调查转化体的硼酸抗性。如图8C所示，无内含子RPL7B的表达使Δrp17a的硼酸抗性上升。其结果显示RPL7B剪接的抑制是由Δrp17a的高浓度硼酸产生的生长停止的原因。
[0148] [由硼酸处理产生的含有非典型的分支点序列(noncanonical branchpoint sequnce)的基因中剪接抑制的分析结果]
[0149] RPL7B在第1内含子中具有非典型的分支点序列(表3参照)。231种核含有内含子的基因中，发现了28种含有这种非典型的分支点序列的基因。这28种基因中，9种基因中观察到与剪接片段相比，经硼酸处理产生的非剪接片段的水平上升(图9)。这些基因是ERV1、ERV41、NYV1、RPS9A、RPS9B、SRB2、YOL048C、YPR098C及YRA1。
[0150] 【表3】
[0151]
[0152] 表3中表示，酵母中确认的3个共有序列、5’剪接位点、分支点及3’剪接位点。以黑底白字表示第1内含子的分支点中的由A向G的转换点。Y指嘧啶核糖核苷酸(C或U)。
[0153] 分析AtRBP47c’的过剩表达对由硼酸产生的这些基因的剪接抑制的影响。如图9所示，在表达AtRBP47c’的酵母中，NYV1及SRB2的剪接抑制水平受到阻碍。NYV1及SRB2分别编码v-SNARE蛋白质和RNA聚合酶II全酶蛋白质。这些结果强有力地提示AtRBP47c’的过剩表达给予酵母硼酸抗性的机制是剪接效率的增强。
[0154] [盐处理产生的影响与由硼酸处理产生的影响不同]
[0155] 剪接因子基因的过剩表达给予酵母及/或植物盐抗性(Forment，J.，Naranio，M.A.，Roldan，M.，Serrano，R.，& Vicente，O.(2002)Plant J.30，511-519.，2002；Serrano，R.，Gaxiola，R.，Rios，G.，Forment，J.，Vicente，O.，& Ros，R.(2003)Monatsh.Chem.134，1445-1464.)。还调查AtRBP47c’相关基因是否给予酵母盐抗性。对于本研究中检查的6种AtRBP47c’相关基因，酵母中盐抗性均没有上升(图10A)。进而，暴露于高浓度的盐(high salt)下的细胞中没有观察到RPL7B的剪接抑制(图10B)。这些结果似乎是AtRBP47c’相关基因对于盐抗性没有功能，RPL7B剪接的抑制对于硼酸处理是独特的。
[0156] [考察]
[0157] 通过酵母的互补作用(補完)从拟南芥中分离AtRBP47c’作为给予酵母细胞硼酸抗性的基因。酵母基因组中，有7种编码具有3个RRM并经BLASTP程序计算对于AtRBP47c’具有100以上的序列同一性得分的蛋白质的基因。这些的基因中，与AtRBP47c’最类似基因是NAM8。NAM8是作为本来粒线体的剪接缺乏的抑制剂被分离的(Ekwall，K.，Kermorgant，M.，Dujardin，G.，Groudinsky，O.，& Slonimski，P.P.(1992)Mol.Gene.Genet.233，136-144.)，通过其后的分析，显示出NAM8与Ulsn RNA相互作用，这种加工由于存在非典型的5’剪接位点的存在而受到抑制时，NAM 8是5’剪接位点的有效识别所必须的(Gottschalk，A.，Tang，J.，Puig，O.，Salgado，J.，Neubauer，G.，Colot，H.V.，Mann，M.，Seraphin，B.，Rosbash，M.，Luhrmann，R.，& Fabrizio，P.(1 998)RNA 4，374-393.；Puig，O.，Gottschalk，A.，Fabrizio，P.，& Seraphin，B.(1999)Gene.Dev.13，569-580.)。根据这些观察结果，假定AtRBP47c’在硼酸抗性方面与NAM8行使相同作用。但是，NAM8的过剩表达不给予酵母硼酸抗性，NAM8破坏变异体与野生型同样，显示出硼酸抗性，AAtRBP47c’显示出与剪接加工的其它阶段及/或硼酸抗性的其它反应(1或多个)相关的可能性。
[0158] 本研究中，在酵母中任意选择的20种基因中，发现硼酸可以抑制RPL7B的剪接(图7B)。通过分析这种基因的第1内含子的DNA序列分析，清楚了第1内含子在分支点的共有序列存在转化。如表1所示，分支点共有序列中第2位的A被转化为RPL7B的第1内含子中的G。与分支点交联蛋白质(Branchpoint bridging protein(BBP)的分支点的结合是剪接进行中重要的步骤(Abovich and Rosbash，1997)。现在已知BBP与分支点序列间的亲和性是剪接效率的重要因素(Champion-Arnaud，et al.，1995)。尤其是，据报道这种分支点序列的第2核苷酸中A向G的转化使与BBP亲和性减少约10％(Berglund，J.A.，Chua，K.，Abovich，N.，Reed，R.，& Rosbash，M.(1997)Cell 89，781-787.)。所以，RPL7B似乎是剪接效率较低的基因之一。
[0159] 据报道，Hela细胞的体外剪接系统中、剪接的第2步骤由于硼酸处理而受到抑制(Shomron，N.，& Ast，G.(2003)FEBS Lett.552，219-224.)。剪接的第2步骤是将被处理外显子的3’末端结扎到下一个外显子的5’末端的加工。如果考虑硼酸通过核糖与cis-diol结合(Ralston，N.V.C.，& Hunt，C.D.(2000)FASEB J.14，A538.；Nicholas et al.，2001；Ricardo，A.，Carrigan，M.A.，Olcott，A.N.，& Benner，S.A.(2004)Science303，196.)，剪接的第2步骤中的结扎反应似乎由于与硼酸的外显子的3’末端的结合而受到抑制。据上述Shomron and Asr(2003)报道，由于5种不同的mRNA前体物质显示出同样的抑制，认为第2步骤中由硼酸产生的剪接抑制是一般的现象。这种情况，所有的内含子的确同样发生酵母中剪接抑制。但是，在本研究的最初的步骤中检查的20种基因中，观察到抑制的基因仅为RPL7B(图7B)。
[0160] 这种特异性抑制可以按如下方式说明。第2步骤中酵母的所有含有内含子的基因中均发生由硼酸产生的剪接抑制。该步骤中、在通常进行剪接时应当立刻减少含有内含子的剪接介质时，含有内含子的剪接介质积累。介质的积累抑制常规的代谢更新。这种情况似乎是具有剪接效率低的内含子的基因对于由硼酸产生的剪接抑制的感受性强。作为这种基因的1个实例，可以例举有像RPL7B这样的含有非典型的分支点序列的基因。以具有相同特征的其它基因，通过分析由高浓度硼酸产生的剪接抑制，检验这种推测(图9)。这种分析中，发现高浓度硼酸处理在RPL7B以外的含有非典型的分支点序列的9种基因中抑制剪接。该结果明确显示，硼酸的毒性的机制的1种是具有剪接效率低的内含子的基因的剪接抑制。进而，这些9种类的基因中，发现2种基因的剪接抑制由于AtRBP47c’的过剩表达而受到抑制障害(图9)。该结果提示由AtRBP47c’的过剩表达产生的硼酸抗性电许是通过高浓度硼酸处理中剪接受到抑制的多个基因的一部分基因的剪接效率的增强实现的。因此，限定数目的基因的剪接抑制也许是生长抑制的原因。
[0161] AtRBP47c’相关蛋白质具有3个RRM。确认了RBP45、RBP47及N.plumbaginifolia的UBP1的RNA结合活性。这些的蛋白质全都有与U-rich序列结合的倾向(Lambermon，M.H.，Simpson，G.G.，Wieczorek Kirk，D.A.，Hemmings-Mieszczak，M.，Klahre，U.，& Filipowicz，W.(2000)EMBO J.19，1638-1649.：Lorkovi？，Z.J.，Wieczorek Kirk，D.A.，Klahre，U.，Hemmings-Mieszczak，M.，& Filipowicz，W.(2000).RNA 6，1610-1624.)。进而，N.plumbaginifolia的RBP45的缺失分析显示与RNA的相互作用中需要至少2个RRM(Lorkovic et al.，2000)。现在逐渐意识到RRM与RNA结合相关，但是一定的蛋白质的RRM参与与其它蛋白质的相互作用(Kielkopf，C.L.，Lucke，S.，& Green，M.R.(2004)Gene
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Dev.18，1513-1526.)。尤其是，据报道含有3个RRM的剪接因子酵母U2AF 的第3个RRM与BBP(Rain，J.C.，Rafi，Z.，Rhani，Z.，Legrain，P.，& Kramer，A.(1998)RNA4，551-565.)。这些结果提示AtRBP47c’也与BBP相互作用的可能性。进而，RBP7B的第1内含子及SRB2内含子序列的分析表明分支点的3’末端存在U-rich序列。如果综合这些结果，假定AtRBP47c’通过与BBP结合，稳定BBP与分支点的相互作用，稳定分支点的U-rich序列。其结果是，剪接效率增加。
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Dev.18，1513-1526.)。尤其是，据报道含有3个RRM的剪接因子酵母U2AF 的第3个RRM与BBP(Rain，J.C.，Rafi，Z.，Rhani，Z.，Legrain，P.，& Kramer，A.(1998)RNA4，551-565.)。这些结果提示AtRBP47c’也与BBP相互作用的可能性。进而，RBP7B的第1内含子及SRB2内含子序列的分析表明分支点的3’末端存在U-rich序列。如果综合这些结果，假定AtRBP47c’通过与BBP结合，稳定BBP与分支点的相互作用，稳定分支点的U-rich序列。其结果是，剪接效率增加。
[0162] 据报道，剪接由于盐压力而受到抑制。进而，据报道SR蛋白质等的多个剪接因子的过剩生产增加酵母和植物中盐抗性(Forment，J.，Naranio，M.A.，Roldan，M.，Serrano，R.，&Vicente，O.(2002)Plant J.30，511-519..，2002；Serrano，R.，Gaxiola，R.，Rios，G.，Forment，J.，Vicente，O.，& Ros，R.(2003)Monatsh.Chem.134，1445-1464.)。本研究中，AtRBP47c’相关基因的过剩表达不给予酵母盐抗性(图10A)，在盐处理后没有检测出RPL7B的剪接抑制(图10B)。这些结果提示在盐处理和硼酸处理中剪接抑制的机制不同。
[0163] 实施例2是表明硼酸的毒性机制的关键是剪接的特异性抑制，与剪接效率的增强相关的基因带来硼酸抗性的最早的报告。但是，确实存在剪接的抑制以外的毒性的机制。原因是，即使在未进行剪接的原核生物中也观察到硼酸的毒性的影响。
附图说明
[0164] 图1是表示使用酵母1169株的硼酸抗性能力的结果的图。用pYES2“2”和pYES2-BORI“7”转化酵母1169株。将各酵母分别划线于含有0-100mM的硼酸的SD培养基上。显示了26.5℃下培养16天的结果。
[0165] 图2是表示在硼酸过剩培养基中的酵母1169株的生长的结果的图。用46，72，84，86和8转化7酵母1169株。液体培养各酵母后，划线于含有80mM的硼酸的SD培养基上。
位点由左向右慢慢稀释1/5。表示了26.5℃下培养9天的结果。
位点由左向右慢慢稀释1/5。表示了26.5℃下培养9天的结果。
[0166] 图3是表示液体培养基中的酵母1169株的硼酸抗性试验的结果的图。
[0167] 用46，72，84，86和87转化酵母1169株。液体培养各酵母后，接种于含有80mM的硼酸的SD培养基中继续培养直至OD600的值为0.1。30℃下培养4天，测定OD600的值。进行3次实验。以与平均值的标准偏差的图表示。
[0168] 图4是表示硼酸过剩培养基中的酵母BY4741株的生长结果的图。
[0169] 用46，72，84，86和87转化酵母BY4741株。液体培养各酵母后，点样于含有100mM的硼酸的SD培养基中。位点由左向右慢慢稀释1/5。表示了26.5℃下培养10天的结果。
[0170] 图5是表示液体培养基中的酵母BY4741株的硼酸抗性试验的结果的图。
[0171] 用46、72，84、86，和87转化酵母BY4741株。对各酵母液体培养后，接种于含有80mM的硼酸的SD培养基中继续培养直至OD600的值为0.1。30℃下培养4天，测定OD600的值。进行3次实验。以与平均值的标准偏差的图表示。
[0172] 图6是表示AtRBP47c’相关基因转化酵母细胞的硼酸抗性的结果的图。
[0173] (A)AtRBP47c’相关家族基因的系统树图。系统树图表示AtRBP47c’相关家族蛋白质的相对的进化距离，采用N J法制成。条表示0.1氨基酸取代/部位的基因距离。
[0174] (B)固体培养基中硼酸抗性。酵母细胞生长至OD600为1.O，连续稀释，接着滴入到在10μl添加了0或80mM的硼酸的SD皿中。10天培养后记录生长。使用经空载体pFL61转化的酵母细胞作为对照。
[0175] (C)液体培养基中硼酸抗性。酵母细胞生长至OD600为1.0，在添加了0或80mM的硼酸的SD培养基中稀释至OD600为0.1。30℃下培养稀释的酵母细胞，记录稀释后的记载小时OD600的值。横条表示3次测定的平均值±平均值的标准偏差。
[0176] 图7是表示剪接中硼酸的影响的图。
[0177] (A)RPL7B的剪接的略图。通过剪接可以从RPL7B的pre-mRNA中产出3种mRNA。箭头指的是RT-PCR中使用的引物的位置。
[0178] (B)硼酸对RPL7B的剪接的影响。酵母细胞生长至OD600为1.0，以80mM的终浓度添加硼酸。24小时后，回收酵母细胞，分离总RNA。从总RNA中合成cDNA，用作通过PCR进行剪接分析的模板。该分析中，使用经空载体pFL61转化的酵母株BY4741(野生型)或AtRBP47c’表达载体(AtRBP47c’)。
[0179] (C)硼酸对RPL7A的剪接的影响。在经PFL61转化的BY4741中通过RT-PCR分析RPL7A的剪接。
[0180] 图8是表示RPL7A或RPL7B破坏酵母细胞的硼酸抗性的结果的图。
[0181] (A)固体培养基中硼酸抗性。酵母细胞生长至OD600为1.0，连续稀释，接着滴入到在10μl添加了0或80mM的硼酸的SD皿中。7天培养后记录生长。
[0182] (B)液体培养基中硼酸抗性。酵母细胞生长至OD600为1.0，在添加了0或80mM的硼酸的SD培养基中稀释至OD600为0.1。稀释后30℃下培养稀释的酵母细胞21小时(SD)及60小时(SD+80mM的硼酸)，然后记录OD600的值。横条表示3次测定的平均值±平均值的标准偏差。Δrpl7a及Δrp17b分别表示RPL7A破坏变异体(Y0443)和RPL7B破坏变异体(Y01094)。
[0183] (C)RPL7B的过剩表达对RPL7A破坏酵母中硼酸抗性的影响。酵母细胞生长至0D600为1.0，连续稀释，接着滴入到在10μl添加了0或80mM的硼酸的SD皿中。5天培养后记录生长。使用经空载体pFL61转化的酵母细胞作为对照。
[0184] 图9是表示硼酸对含有非典型的分支点序列的基因的剪接的影响的图。
[0185] 酵母细胞生长至OD600为1.0，接着以80mM的终浓度添加硼酸。24小时后，回收酵母细胞，分离总RNA，用作通过PCR进行剪接分析的模板。该分析中，使用经空载体pFL61转化的酵母株BY4741(野生型)或AtRBP47c’表达载体(AtRBP47c’)。白和黑的箭头分别指向的是非剪接片段、剪接片段。
[0186] 图10是表示盐对AtRBP47c’相关基因转化酵母细胞的生长和对RPL7B的剪接的影响的图。
[0187] (A)固体培养基中盐抗性。酵母细胞生长至OD600为1.0，连续稀释，接着滴入到在10μl添加了0、1.75或2M的NaCl。培养7天后记录生长。使用经空载体pFL61转化的酵母细胞作为对照。
[0188] (B)盐对RPL7B的剪接的影响。酵母细胞生长至OD600为1.0，以分别为2M或80mM的终浓度添加NaCl或硼酸。24小时后，回收酵母细胞，分离总RNA。从总RNA中合成cDNA，用作通过PCR进行剪接分析的模板。