本发明涉及海洋绿藻的培养，具体地说是一种海洋绿藻快速生长的方法，培养海洋绿藻的培养基为灭菌冷却后并添加微量营养元素的天然海水，初始接种密度为5.0×105～6.0×105个细胞/ml，液面光照强度3500～4000Lx，光暗时间比12～14∶12～10，光照培养6～8天藻密度能达到2.0×106～2.50×106个细胞/ml，生长期间藻液pH变化缓慢，单位细胞叶绿素含量高，藻细胞个体大。本发明使用微量营养元素培养海洋绿藻细胞，缩短藻细胞达到对数生长后期的时间，提高了藻细胞生长速率，提高单位藻细胞叶绿素含量，为快速培养海洋绿藻提供了一种有效的方法。
1.一种培养海洋绿藻的方法，其特征在于：培养海洋绿藻的培养基为灭菌冷却后并添加微量营养元素的天然海水，藻细胞培养基的组成按每升天然海水中微量元素的mg量计，Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O 129.7，CaCl2 40.21，Na2-EDTA 0.125，ZnSO4·7H2O0.5475，FeSO4·7H2O 0.349，MnSO4·H2O 0.077，CuSO4·5H200.0196，Co(NO3)·6H20
0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，氨三乙酸10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；培养基的pH为8.00～8.30。
2.按照权利要求1所述培养海洋绿藻的方法，其特征在于：接种藻细胞到灭菌冷却后
并添加微量营养元素的天然海水中，调节藻密度到约为5.0×10 ～6.0×10 个细胞/ml；
将接种后的藻细胞放置在液面光照强度3500～4000Lx培养，光暗时间比12～14h∶12～
10h，培养6～8天后藻密度能达到2.0×10 ～2.50×10 个细胞/ml。
3.按照权利要求2所述培养海洋绿藻的方法，其特征在于：可按如下步骤具体操作，
1)藻细胞培养基的配制：于过滤的每升天然海水中添加微量元素mg量为，Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O 129.7，CaCl240.21.Na2-EDTA 0.125，ZnSO4·7H2O
0.5475，FeSO4·7H2O 0.349，MnSO4·H2O0.077，CuSO4·5H20 0.0196，Co(NO3)·6H20 0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，氨三乙酸10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；调节培养基的pH到
2)藻细胞的接种和培养：接种藻细胞到冷却后的海水培养基中，调节藻密度为
5.0×10 ～6.0×10 个细胞/ml，并于每L培养基中添加K2HPO413.68mg和KH2PO4 6.84mg，将藻液放置在液面光照强度3500～4000Lx、光暗时间比12～14h∶12～10h、温度22～
28℃的环境下培养，光照期间3～6小时来回晃动藻液一次。
一种培养海洋绿藻的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及海洋绿藻的培养，具体地说是一种添加微量营养元素调控海洋绿藻快速生长的方法。
背景技术
[0002] 海洋绿藻(Marine Green Algae)是生长于海洋中的低等植物，是被人类广为利用的海洋藻细胞之一。海洋绿藻普遍含有丰富的营养物质，海洋绿藻除被大量用作食品工业原料、肥料和饲料外，它的保健价值和药用价值越来越引起人们的关注，它含有丰富的维生素、氨基酸、矿物质和微量元素，同时脂质和可消化吸收的糖类物质含量较低，所以利用海藻开发低热量高营养的保健食品，已成为当前热门的课题。许多海洋绿藻还含有丰富的生物活性物质和药用成分，作为一种新型保健品和食品具有重要的开发潜力。此外，据研究报道海洋绿藻在一定胁迫条件下能够光照产生氢气，因此海洋绿藻也是被作为一种能够提供清洁能源的研究载体。
[0003] 因此，快速、简便、廉价地获得大量优质海洋绿藻细胞显得尤为重要。对海洋绿藻的培养研究发现如果营养液元素偏低，接种后延迟期较短，藻类细胞在早期生长繁殖较好，但持续时间不长，往往在培养4、5天后生长速度减慢并很快停止，这显然是受到营养元素的限制。相反，培养液营养元素偏高时，接种后早期生长似乎受到一定抑制，但持续时间长，最后获得藻类细胞数量多。对早期生长的抑制可能是藻类细胞有老培养液到新鲜培养液中营养元素浓度差别过大的缘故。
[0004] 目前，海洋绿藻采用传统培养方法，生长周期长，培养期间藻液pH变化大，单位体积藻细胞叶绿素含量低。因此，提高海洋绿藻的生长速率，缩短达到对数生长后期的时间，提高单位体积藻细胞叶绿素含量具有重要的意义。
发明内容
[0005] 本发明在于提供一种快速培养海洋绿藻的方法；通过添加微量营养元素调控海洋绿藻细胞生长，明显缩短藻细胞达到对数生长后期的时间，提高了藻细胞生长速率，提高单位体积藻细胞叶绿素含量，为快速培养海洋绿藻提供了一种有效的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 一种快速培养海洋绿藻的方法，培养海洋绿藻的培养基为灭菌冷却后并添加微量营养元素的天然海水，藻细胞培养基的组成按每升天然海水中微量元素的mg量计，Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O129.7，CaCl2 40.21，Na2-EDTA0.125，ZnSO4·7H2O 0.5475，FeSO4·7H2O0.349，MnSO4·H2O 0.077，CuSO4·5H2O 0.0196，Co(NO3)·6H2O0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，氨三乙酸10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；
培养基的pH为8.00～8.30。
[0008] 快速培养海洋绿藻的过程为：接种藻细胞到灭菌冷却后并添加微量营养元素的天5 5
然海水中，调节藻密度到约为5.0×10 ～6.0×10 个细胞/ml；将接种后的藻细胞放置在液面光照强度3500～4000Lx培养，光暗时间比12～14h：12～10h，培养6～8天后藻密
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度能达到2.0×10 ～2.50×10 个细胞/ml。
[0009] 可按如下步骤具体操作，
[0010] 1)藻细胞培养基的配制：于过滤的每升天然海水中添加微量元素mg量为，Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O 129.7，CaCl240.21，Na2-EDTA0.125，ZnSO4·7H2O 0.5475，FeSO4·7H2O 0.349，MnSO4·H2O0.077，CuSO4·5H2O 0.0196，Co(NO3)·6H20 0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，氨三乙酸10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；
调节培养基的pH到8.00～8.30，115℃灭菌20分钟；
[0011] 特点：合适的C、N、P配比和适量的微量元素能够提高藻细胞的光合作用效率，显著提高生长速率；微量的Tris能够维持培养期间藻液的pH在较小范围内变化；
[0012] 2)藻细胞的接种和培养：接种藻细胞到完全冷却后的海水培养基中，置于曰光灯光照下培养。
[0013] 具体为：接种藻细胞到冷却后的海水培养基中，调节藻密度为5.0×105～5
6.0×10 个细胞/ml，并添加磷酸盐(mg/L培养基)：K2HPO4 13.68，KH2PO46.84，将藻液放置在液面光照强度3500～4000Lx、光暗时间比12～14h∶12～10h、温度22～28℃的环境下培养，光照期间3～6小时来回晃动藻液一次；
[0014] 特点：接种后加入磷酸盐可以避免其在高温灭菌时与其他盐反应生成沉淀；光照期间来回晃动藻液，不仅可以增加藻细胞的游动性，而且使培养体系内部的藻细胞也能够充分接受光照，使培养体系内的细胞均匀、快速生长；从藻细胞生长所需的光照强度和光能的消耗考虑，提供液面光照强度4500～5000Lx较为合适；合适的接种密度既可以缩短接种后的延迟期，又可以节省原始藻液；
[0015] 3)藻细胞培养期间藻液pH和细胞浓度的测定。
[0016] 具体为：取混合均匀的藻液5ml置于45ml的离心管中，将pH电极浸没于藻液中测定pH，然后添加10uL甲醛固定藻细胞用血球计数器计数藻细胞浓度。
[0017] 本发明优点如下：
[0018] 1.海洋绿藻培养基配方简单、成本低。本发明所采用的微量营养元素来源广泛，成本较低。
[0019] 2.藻细胞生长速度快。本发明采用合适的C、N、P配比和适量的微量元素能够提高藻细胞的光合作用效率，显著提高生长速率，并维持藻液的pH在较小范围内变化。
[0020] 3.藻细胞个体较大。本发明所采用的微量营养元素培养的藻细胞个体大，胞内物质含量丰富。
[0021] 总之，本发明根据海洋绿藻在一定光照强度下，合适的C、N、P配比和适量的微量元素能够提高藻细胞的光合作用效率，显著提高生长速率，并维持藻液的pH在较小范围内变化。
附图说明
[0022] 图1为本发明培养海洋绿藻生长速率图；
[0023] 图2为本发明培养海洋绿藻期间藻液pH变化图。
具体实施方式
[0024] 实施例1
[0025] 以海洋亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis)的光照培养为例进一步说明本发明。
[0026] 1)藻细胞培养基的配制：用容积为3升的培养瓶盛装2升经十层纱布过滤的天然海水，并添加微量元素(mg/l)：Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O129.7，CaCl2 40.21，Na2-EDTA 0.125，ZnSO4·7H2O0.5475，FeSO4·7H2O 0.349，MnSO4·H2O
0.077，CuSO4·5H2O 0.0196，Co(NO3)·6H2O 0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，氨三乙酸10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；调节培养基的pH到8.00，115℃灭菌20分钟；
[0027] 其中所用药品中文名分别为：Tris：三(羟甲基)氨基甲烷；CH3COONa：乙酸钠；NH4Cl：氯化铵；MgSO4·7H2O：七水硫酸镁；CaCl2：氯化钙；Na2-EDTA：乙二胺四乙酸二纳；
ZnSO4·7H2O：七水硫酸锌；FeSO4·7H2O：七水硫酸亚铁；MnSO4·H2O：硫酸锰；CuSO4·5H2O：五水硫酸铜；Co(NO3)·6H2O：六水硝酸钴；Na2B4O7·10H2O：四硼酸钠；Nitrilotriaceticacid：
氨三乙酸；(NH4)6MoO7O24·4H2O：四水合钼酸氨
[0028] 2)藻细胞的接种和培养：接种藻细胞到完全冷却后的海水培养基中，调节藻密度5
为6.0×10 个细胞/ml，并添加K2HPO4 13.68，KH2PO4 6.84，将藻液放置在液面光照强度
3500～4000Lx、光暗时间比14h∶10h、温度22～28℃的环境下培养，光照培养期间3～
6小时来回晃动藻液；
[0029] 3)藻细胞培养期间藻液pH和细胞浓度的测定：取混合均匀的藻液5ml置于45ml的离心管中，将pH电极浸没于藻液中测定pH，然后添加10uL甲醛固定藻细胞用血球计数器计数藻细胞浓度。
