一种肝癌干细胞及其分离方法和用途

摘要

本发明是一种肝癌干细胞及其分离方法和用途，涉及干细胞，尤其涉及一种人肝癌干细胞。本发明的目的就是提供一种分离得到肝癌干细胞的方法，并且将所分离得到的肝癌干细胞用于重要的有效抗癌药物或药靶筛选，用于肝癌诊断/治疗双功能特异性单克隆抗体制备。所述的从肝癌干细胞系中获得肝癌干细胞的分离方法，是用特异性的AC133/CD133/1单克隆抗体和磁珠分选、富集肝癌干细胞，所分离得到的CD133+肝癌干细胞具有多种特性，用途广泛。

权利要求

1.一种从肝癌细胞系中获得肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，包括步骤：(a)将CD133/1单克隆抗体(也称为AC133单克隆抗体)与含肝癌干细胞的肝癌细胞系混合，形成“CD133/1单克隆抗体-肝癌干细胞”二元复合物；

(b)离心去除未结合的游离的CD133/1单克隆抗体，形成含“CD133/1单克隆抗体-肝癌干细胞”二元复合物的沉淀物；

(c)使步骤(b)的沉淀物悬浮，并与磁珠标记的抗小鼠IgG1第二抗体混合，形成“第二抗体-CD133/1单克隆抗体-肝癌干细胞”三元复合物；

(d)用磁场分离步骤(c)中形成的三元复合物，从而获得肝癌干细胞。

2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞系和肝癌干细胞来自人。

3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的含肝癌干细胞的肝癌细胞系选自下组：(a)SMMC7721，(b)BEL7402，(c)Huh-7，(d)Hep3B，(e)MHCC-LM3，(f)MHCC-97L。

4.一种根据权利要求1所述的分离方法得到的肝癌干细胞，其特征在于，是人肝癌干细胞。

5.如权利要求4所述的肝癌干细胞，其特征在于，在体内或体外能分化为肝细胞。

6.如权利要求4所述的肝癌干细胞，其特征在于，能形成肿瘤。

7.如权利要求4所述的肝癌干细胞，其特征在于，对肿瘤坏死因子诱发的细胞凋亡和细胞周期阻滞有抵抗作用。

8.一种如权利要求4所述的肝癌干细胞在筛选抗肿瘤药物中的应用。

9.一种如权利要求4所述的肝癌干细胞在制备诊断和治疗肝癌干细胞特异性单克隆抗体中的应用。

10.一种筛选抑制肝癌干细胞生长的抑制剂的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在测试组中，向如权利要求4所述的肝癌干细胞中添加待筛选的候选物，并检测肝癌干细胞的增殖情况；

(b)将步骤(a)测试组中肝癌干细胞的增殖情况与未添加候选物的对照组中肝癌干细胞的增殖情况进行比较，如果测试组中的肝癌干细胞的增殖在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制肝癌干细胞生长的化合物。

说明书

一种肝癌干细胞及其分离方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及干细胞，尤其涉及一种肝癌干细胞。

背景技术

[0002] 随着科学技术的进步，肿瘤诊断、治疗的研究也取得了很大进展，尤其是CT、NMR、PET等先进的现代化诊断设备的引入临床使得肿瘤的诊断向“准确”、“早期”迈进了一大步。同样在治疗方面由于近年来各种新型生物治疗、化疗药物的引进也使肿瘤的药物治疗效果有了明显提高，但迄今多种肿瘤(包括肝癌)的发生机理尚未阐明。近年来由于“癌干细胞(cancer stem cell，简称CSC)”概念的提出[Reya等，Nature(2001)414：105-111]，人们对肿瘤治疗效果评估的观念有了明显转变，认为即使疗效再好的常规化疗药物也只能杀死肿瘤组织中的占数量比例较大的“普通肿瘤细胞”，治疗期间可使肿瘤块明显缩小甚至“消失”，而对于其中为数不多(不足十万分之一)的“非常肿瘤细胞”--即癌干细胞却束手无策[Bissell等，Cancer Cell(2005)7：17-23；Patrawala等，Cancer Research(2005)65：
6207-6219]，而且有迹象表明常规化疗药物治疗肿瘤后由于癌干细胞与普通肿瘤细胞的平衡被打破，会刺激癌干细胞非对称分裂或分化为普通肿瘤细胞，最终导致肿瘤的复发甚至转移。

[0003] 因此本领域迫切需要一种分离得到肝癌干细胞的方法，也需要将所得到的肝癌干细胞用于抗肿瘤药物的筛选和制备。

发明内容

[0004] 本发明的目的就是提供一种分离得到肝癌干细胞的方法，并且将所分离得到的肝癌干细胞用于重要的有效抗癌药物或药靶筛选，用于肝癌诊断/治疗双功能特异性单克隆抗体制备，以及获得一种筛选特异性抑制肝癌干细胞生长的抑制剂、促进肝癌干细胞凋亡的诱导剂、杀死肝癌干细胞的细胞毒性药物的方法。

[0005] 在本发明的一个方面，提供了一种从肝癌细胞系中获得肝癌干细胞的分离方法，它包括步骤：

[0006] (a)将CD133/1单克隆抗体(也称为AC133单克隆抗体)与含肝癌干细胞的肝癌细胞系混合，形成“CD133/1单克隆抗体-肝癌干细胞”二元复合物；

[0007] (b)离心去除未结合的游离的CD133/1单克隆抗体，形成含“CD133/1单克隆抗体-肝癌干细胞”二元复合物的沉淀物；

[0008] (c)使步骤(b)的沉淀物悬浮，并与磁珠标记的抗小鼠IgG1第二抗体混合，形成“第二抗体-CD133/1单克隆抗体-肝癌干细胞”三元复合物；

[0009] (d)用磁场分离步骤(c)中形成的三元复合物，从而获得肝癌干细胞。

[0010] 在另一优选例中这种从肝癌细胞系中获得肝癌干细胞的分离方法，包括步骤：

[0011] (a)将AC133/CD133/1单克隆抗体(IgG1，Miltenyi Biotec)与肝癌细胞系充分混合、冰浴上孵育一定时间，用含BSA的缓冲液反复洗涤、离心除去未结合的游离IgG1分子；

[0012] (b)将步骤(a)的肝癌细胞系与适当体积的磁珠标记抗小鼠IgG1的第二抗体充分混合并在冰浴上孵育30分钟从而形成肝癌干细胞-磁珠复合物；

[0013] (c)让步骤(b)获得的肝癌干细胞-磁珠复合物及未被标记的肝癌细胞系悬浮液一起加入安装在恒定磁场的分离柱，用含BSA的缓冲液反复洗涤数次，使未被磁珠标记的肝癌细胞流出分离柱，而被磁珠标记的肝癌细胞(即肝癌干细胞)被吸附在分离柱上；

[0014] (d)将吸附有肝癌干细胞的分离柱移出磁场，用分离柱芯打出分离柱，获得分离的肝癌干细胞。

[0015] 在另一优选例中，还提供了一种从肝癌细胞系中获得肝癌干细胞的分离方法，它包括步骤：

[0016] (a)将磁珠与肝癌细胞系混合，所述的磁珠上固定有AC133/CD133/1单克隆抗体，从而形成肝癌干细胞-磁珠复合物；

[0017] (b)分离步骤(a)中的肝癌干细胞-磁珠复合物；

[0018] (c)将肝癌干细胞从复合物上解离下来，获得分离的肝癌干细胞。

[0019] 在所述的分离方法中，所述的肝癌细胞系和肝癌干细胞来自人。

[0020] 更佳地，优选的肝癌细胞系为(a)SMMC7721，(b)BEL7402，(c)Huh-7，(d)Hep3B，(e)MHCC-LM3，(f)MHCC-97L。

[0021] 在本发明的另一个方面，提供了一种由上述的分离方法得到的肝癌干细胞，它是人肝癌干细胞；在体内或体外能分化为肝细胞；能形成肿瘤；它对肿瘤坏死因子诱发的细胞凋亡和细胞周期阻滞有抵抗作用。

[0022] 在本发明的另一个方面，提供了本发明提供的肝癌干细胞在筛选抗肿瘤药物中的应用。

[0023] 它对常用肿瘤化疗药物有抗药作用，其中优选(a)环磷酰胺(b)顺氯氨铂(c)氨甲喋呤(d)硫酸长春新碱(e)5-氟尿嘧啶(f)顺氯氨铂(g)阿霉素。

[0024] 在本发明的另一个方面，提供了本发明提供的肝癌干细胞在制备诊断和治疗肝癌干细胞特异性单克隆抗体中的应用。

[0025] 在本发明的另一个方面，提供了一种筛选抑制肝癌干细胞生长的抑制剂的方法，包括步骤：

[0026] (a)在测试组中，向肝癌干细胞培养物中添加待筛选的候选物，并检测肝癌干细胞的增殖情况；

[0027] (b)将步骤(a)测试组中肝癌干细胞的增殖情况与未添加候选物的对照组中肝癌干细胞的增殖情况进行比较，如果测试组中的肝癌干细胞的增殖在统计学上低于(优选明显低于)对照组，就表明该候选物是抑制肝癌干细胞生长的化合物。

[0028] 本发明提供的分离得到肝癌干细胞的方法可以富集肝癌干细胞；而且所分离得到+的CD133 肝癌干细胞可以用于筛选抗肿瘤药物、可以用于制备诊断和治疗肝癌干细胞特异性单克隆抗体、可以提供了筛选抑制肝癌干细胞生长的抑制剂的方法等。

附图说明

[0029] 图1肝癌细胞系中干细胞标志物CD133的表达

[0030] 图2人肝癌相关组织中的癌干细胞

[0031] 扩大倍数：(d，g，j，m)×100，(a-c，e，h，k，n)×400，(f，i，l)×630[0032] 图3CD133+肝癌干细胞的体外克隆形成

[0033] 扩大倍数：×200

[0034] 图4CD133+肝癌干细胞的体内分化特性

[0035] b扩大倍数：×400；c扩大倍数：×1000

[0036] 图5CD133+肝癌干细胞的体内成瘤性

[0037] 图6CD133+肝癌干细胞对抗癌药物的抵抗作用

[0038] 图7CD133+和CD133-SMMC-7721细胞对Vincristine的耐药曲线

[0039] 图8CD133+和CD133-SMMC-7721细胞对5’-Fluorouracil的耐药曲线[0040] 图9CD133+和CD133-SMMC-7721细胞对Cisplatin的耐药曲线

[0041] 图10CD133+和CD133-SMMC-7721细胞对Adriamycin的耐药曲线

[0042] 图11CD133+肝癌干细胞对肿瘤坏死因子(TNFα)诱发细胞凋亡和细胞周期阻滞的抵抗作用

具体实施方式

[0043] CD133是胚胎干细胞、骨髓干细胞和部分组织的成体干细胞的特异性标记物，我们通过对目前比较公认的干细胞标志物如CD117/c-kit，AC133/CD133/1，CD34，Dlk/Pref-1，CD45，CD90，CD28等通过一系列实验严格筛选，最终选中CD133作为肝癌干细胞标记物，其它抗原的缺陷主要表现在(a)分选效率低(如CD117/c-kit，发明人曾用6个不同厂家的抗体未得到好的分选结果)提供了一种筛选抑制肝癌干细胞生长的抑制剂的方法(b)代表性差(如Dlk/Pref-1是胚胎干细胞标志，在包括肿瘤干细胞在内的成体干细胞与非干细胞表达均很低而且差异不明显)，(c)分选的细胞分化能力低(如CD34，CD45，CD28抗体分选的肝癌细胞分化能力较低)。用特异性的AC133/CD133/1单克隆抗体和磁珠分选系统从肝癌细胞系中成功富集、分离肝癌干细胞。

[0044] 本发明所称的肝癌细胞系是人肝癌细胞系，其中优选(a)SMMC7721，(b)BEL7402，(c)Huh-7，(d)Hep3B，(e)MHCC-LM3，(f)MHCC-97L。除正常肝组织外，肝癌、癌旁肝、肝硬化组织中具有为数不多的CD133阳性细胞。

[0045] 本发明所称的AC133/CD133/1单克隆抗体(monoclonal anti-CD133/1 IgG1，pure)，购自德国Miltenyi Biotec公司。本发明所称的磁珠分选系统是本领域技术人员所熟知的，包括步骤：

[0046] (a)将AC133/CD133/1单克隆抗体(mouse IgG1)与肝癌细胞系混合孵育，使其与表达CD133抗原的细胞(肝癌干细胞)结合；

[0047] (b)将磁珠与步骤(a)的肝癌细胞系混合，所述的磁珠上固定有抗小鼠IgG1的特异性抗体，从而形成肝癌干细胞-磁珠复合物；

[0048] (c)用磁式分选器分离步骤(b)中的肝癌干细胞-磁珠复合物；

[0049] (d)将吸附步骤(c)肝癌干细胞-磁珠复合物的分离柱移开磁场，用磁式分离柱芯将步骤(c)的细胞打出，获得分离的肝癌干细胞。

[0050] 本发明分离得到的CD133+肝癌干细胞可以在无饲养细胞的条件下(在软琼脂培养基中)体外形成克隆，其方法为用42℃下配制的含10％胎牛血清的0.6％低熔点琼3
脂-干细胞培养基铺6-well细胞培养板(底层)，待其在37℃下固化后，分别用含5×10+ -
个CD133 或CD133SMMC7721-GFP单细胞-软琼脂悬液覆盖底层胶，37℃下使其固化，最后在各孔中加入2ml干细胞培养基，每5天更换一次新鲜培养基，即得。

[0051] 本发明分离得到的CD133+肝癌干细胞既有干细胞特性又具有肝癌细胞和肝脏来源特性；在体内和体外均具有分化为成熟肝细胞性肝癌细胞及具有正常干细胞表型的细胞+的特性。另一方面本发明分离得到的CD133 肝癌干细胞具有在体内形成肿瘤的能力，500+
个细胞6周内可在免疫缺陷小鼠体内形成明显肿瘤。本发明分离得到的CD133 肝癌干细胞对几十种常用肿瘤化疗药物有抗药作用，其中对于对抗癌药物(a)环磷酰胺(b)顺氯氨铂(c)氨甲喋呤(d)硫酸长春新碱(e)5-氟尿嘧啶(f)顺氯氨铂(g)阿霉素具有明显的抵+
抗作用。另外，本发明分离得到的CD133 肝癌干细胞对肿瘤坏死因子(TNFα)诱发的细胞+
凋亡和细胞周期阻滞有抵抗作用，CD133 肝癌干细胞的细胞周期几乎不受TNFα的影响，而-
CD133 细胞主要阻滞于G1期。

[0052] 根据以上所述显示本发明分离得到的CD133+肝癌干细胞可以用于筛选抗肿瘤药物；可以用于制备肝癌干细胞特异性单克隆抗体以诊断和治疗肿瘤；可以用以获得一种筛选抑制肝癌干细胞生长的抑制剂的方法，包括步骤：(a)在测试组中，向肝癌干细胞培养物中添加待筛选的候选物，并检测肝癌干细胞的增殖情况；(b)将步骤(a)测试组中肝癌干细胞的增殖情况与未添加候选物的对照组中肝癌干细胞的增殖情况进行比较，如果测试组中的肝癌干细胞的增殖在统计学上低于(优选明显低于)对照组，就表明该候选物是抑制肝癌干细胞生长的化合物。

[0053] 本发明的主要优点在于：

[0054] 1、可以富集肝癌干细胞；

[0055] 2、所分离得到的CD133+肝癌干细胞用途广泛。

[0056] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0057] 实施例1

[0058] 肝癌细胞系中癌干细胞的分离、鉴定

[0059] 特异性的AC133/CD133/1单克隆抗体和磁珠分选系统从肝癌细胞系中富集、分离干细胞：

[0060] (1)肝癌细胞系中干细胞标志物CD133的表达：图1a-f均为人肝癌细胞系，其中(a)SMMC7721，(b)BEL7402，(c)Huh-7，(d)Hep3B，(e)MHCC-LM3，(f)MHCC-97L，免疫细胞化学检测结果显示上述细胞系中均有少量CD133+细胞(箭头)；

[0061] (2)磁珠分选所高效富集的CD133+细胞，其中(g)分选前细胞CD133+阳性细胞比+例低，(h)分选后CD133 阳性比例大大提高<黄棕色>。

[0062] 蛋白印迹(i)结果也证实了这-点，其中“+”表示分选后CD133+为阳性细胞，“-”-表示分选后CD133 为阴性细胞，β-actin为内参。

[0063] 实施例2

[0064] 人肝癌相关组织中癌干细胞的识别、鉴定

[0065] 石蜡包埋肝癌、癌旁肝、肝硬化、正常肝组织切片中干细胞标志物CD133的表达(免疫组化检测)：图2a-c为肝癌组织，d-i为癌旁肝组织，j-1为肝硬化组织，m，n为正常肝组织。

[0066] 从图2可以看出，除正常肝组织外，肝癌、癌旁肝、肝硬化组织中具有为数不多的CD133阳性细胞(黄棕色)，白色箭头标示类Hering’s canal结构。

[0067] 实施例3

[0068] CD133+肝癌干细胞的体外克隆形成能力检测

[0069] 用软琼脂克隆形成实验(Colony formation assay)检测CD133+肝癌干细胞在软琼脂中的克隆形成能力，具体操作步骤为：

[0070] (1)用42℃下配制的含10％胎牛血清的0.6％低熔点琼脂-干细胞培养基铺6-well细胞培养板(底层)；

[0071] (2)37℃下固化后，分别用含5×103个CD133+或CD133-SMMC7721-GFP单细胞-软琼脂悬液覆盖底层胶；

[0072] (3)37℃下固化，在各孔中加入2ml干细胞培养基，每5天更换一次新鲜培养基；

[0073] (4)3周后对15个细胞以上的克隆在倒置荧光显微镜下进行计数、拍照，数据统计分析。

[0074] 结果见图3：棒状图(a)显示克隆形成数，表示为平均数±s.d.(n＝12低倍视野)；棒状图(b)显示克隆直径，表示为平均数±s.d.(μm)；(c)为代表性图片.[0075] 结果显示CD133+肝癌细胞不论从形成克隆的数量，还是从形成克隆的大小均比-CD133 细胞高，均具有显著差异：**，p＜0.001[其中克隆数：p＝5.43416E-11；克隆直径：
p＝5.1314E-07]

[0076] 实施例4

[0077] CD133+肝癌干细胞的体内分化特性检测

[0078] 1、GFP和人白蛋白免疫共定位

[0079] 该实验检测了CD133+肝癌干细胞在用免疫缺陷NOD/SCID小鼠复制的2-AAF/PHx和DMSO/PHx模型鼠体内的分化能力，具体操作步骤为：

[0080] (1)6-7周龄的SPF雌性NOD/SCID复制的2-AAF/PHx和DMSO/PHx模型各组均为94 +
只，每只鼠经尾静脉接种1×10CD133-SMMC7721-GFP细胞；

[0081] (2)接种1、2、3周后每组分别无痛苦处死3只小鼠，取其肝脏制作冰冻切片；

[0082] (3)荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞(绿色)并进行人白蛋白(Albumin)的荧光免疫细胞化学检测(红色)和共定位，DAPI复染核(蓝色)，分别采集同视野图像，最后叠加(三色)。

[0083] 结果：图4a显示AAF/PHx组，有些细胞GFP绿色荧光和人Albumin红色荧光重叠出现中间叠加色(黄色荧光)，说明分泌人白蛋白的“肝细胞”由GFP阳性的肝癌干细胞分化而来，而DMSO/PHx组为观察到类似现象，说明AAF缺乏使得小鼠肝细胞本身的再生和分裂功能没有被抑制，外源性肝癌干细胞的分裂分化功能未能被动员。

[0084] 2、Alu序列的原位PCR(in situ PCR)检测

[0085] 为了验证上述肝癌干细胞的可靠性我们还进行了上述肝组织连续切片的原位PCR+检测，结果如图4b所示的AAF/PHx组的CD133-SMMC-7721-GFP接种鼠肝脏内发现Alu序列阳性的散在或簇状分布肝细胞，而在接种同样细胞的DMSO/PHx组小鼠中未检测到Alu阳性细胞。

[0086] 说明这些阳性细胞就是来源于人肝癌干细胞的分化细胞。

[0087] 3、Y染色体荧光原位杂交(FISH)检测

[0088] 为了进一步确认人肝癌干细胞在小鼠体内的分化，我们用雌性免疫缺陷小鼠复制的AAF/PHx和DMSO/PHx模型进行了Y染色体FISH，具体操作步骤为：

[0089] (1)6-7周龄的SPF雌性NOD/SCID复制的2-AAF/PHx和DMSO/PHx模型各组均为94 +
只，每只鼠经尾静脉接种1×10 CD133-SMMC-7721细胞；

[0090] (2)接种1、2、3周后每组分别无痛苦处死3只小鼠，取其肝脏制作冰冻切片；

[0091] (3)用Y-染色体直接荧光探针按其探针制备厂家推荐的操作程序稍加修改，进行杂交(绿色)，DAPI复染核(蓝色)，分别采集同视野图像，最后叠加(双色)。

[0092] 结果在如图4c所示的AAF/PHx组的CD133+-SMMC-7721接种鼠肝脏内发现Y染色体阳性的散在分布肝细胞，而在接种同样细胞的DMSO/PHx组小鼠中未检测到Y染色体阳性细胞。

[0093] 说明这些阳性肝细胞就是由人肝癌干细胞分化而来。

[0094] 4、Western blot(图4d)

[0095] 验证了尾静脉接种CD133+-SMMC7721-GFP细胞的AAF/PHx小鼠肝组织中有很强的特异性GFP，CK19，CK8/18条带而在DMSO/PHx小鼠肝组织中其相应蛋白几乎检测不到，Beta-actin为内参。

[0096] 实施例5

[0097] CD133+肝癌干细胞的体内成瘤

[0098] 体内成瘤实验(in vivo tumor formation assay)检测CD133+肝癌干细胞在免疫缺陷NBX小鼠皮下形成肿瘤能力，具体操作步骤为：

[0099] (1)每只试验BNX小鼠皮下分别接种500个CD133+-SMMC7721-GFP细胞和5 -
1×10CD133SMMC-7721饲养细胞；

[0100] (2)每只对照BNX小鼠皮下分别接种500个CD133--SMMC7721-GFP细胞和5 -
1×10CD133SMMC-7721饲养细胞；

[0101] (3)4周后无痛苦处死所有动物，拍照、取其肿瘤称重。

[0102] 结果如图5。

[0103] a显示试验鼠成瘤明显大于对照鼠

[0104] b棒状图显示瘤重平均数±s.d.(n＝6)，p＝7.91912E-05

[0105] c Western blot

[0106] 结果显示接种CD133+细胞的成瘤组织CD133表达要远远高于CD133-细胞的成瘤组织。

[0107] 实施例6

[0108] CD133+肝癌干细胞对抗癌药物的抵抗作用

[0109] (1)96-well细胞培养板中每孔分别接种2×103CD133+和CD133-SMMC-7721细胞；

[0110] (2)分别以抗癌药物125μg/ml环磷酰胺，25μg/ml顺氯氨铂顺氯氨铂，5μg/ml氨甲喋呤，(d)0.25ng/ml硫酸长春新碱(e)5μg/ml 5-氟尿嘧啶，(f)5μg/ml顺氯氨铂，(g)2.5ng/ml阿霉素处理细胞；

[0111] (3)常规MTT试验(490nm)在0h，12h，24h，36h和48h时间点分别检测其吸光度，设3个重复孔，不加抗癌药孔作为空白对照。

[0112] 结果如图6-10显示CD133+细胞对抗癌药物(a)环磷酰胺，(b)顺氯氨铂(DDP)，-(c)氨甲喋呤，(d)硫酸长春新碱，(e)5-氟尿嘧啶，(f)顺氯氨铂，(g)阿霉素与CD133 细胞均具有明显的抵抗作用(在48小时治疗点：a，p＝1.42E-07；b，p＝4.39E-05；c，p＝+
7.70E-07)(*，p＜0.01；**，p＜0.001).在CD133 细胞含药和不含药组之间没有统计学上的差异(在48小时治疗点：a，p＝0.788；b，p＝0.489；c，p＝0.745).

[0113] 实施例7

[0114] CD133+肝癌干细胞对肿瘤坏死因子(TNFα)诱发细胞凋亡和细胞周期阻滞的抵抗作用

[0115] (1)10ng/ml TNFα 分 别 处 理 分 选 的 CD133+-SMMC7721-GFP 和-CD133-SMMC7721-GFP细胞；

[0116] (2)24小时后，按流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的常规方法分别收集细胞、保存、送检。

[0117] 结果如图7显示，分选的CD133-(a上)细胞与CD133+(a下)细胞相比对肿瘤坏+死因子(TNFα)的细胞周期阻滞作用敏感，CD133 细胞的细胞周期几乎不受TNFα影响，-
CD133 细胞主要阻滞于G1期。

[0118] 同上处理的细胞用PI的核DNA染色，通过DNA含量分析检测细胞凋亡率，结果显- +示分选的CD133(b上)细胞与CD133(b下)细胞相比对肿瘤坏死因子(TNFα)引起的细+
胞凋亡作用较敏感，而CD133 细胞对TNFα诱导凋亡有约11％的抵抗作用。

[0119] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。