脂族二腈到氰基羧酸的立体选择性生物转化方法转让专利
申请号 : CN200580010928.7
文献号 : CN1942587B
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 迈克尔·保罗·伯恩斯 , 贾斯廷·凯尼·威维尔 , 约翰·文·王
申请人 : 辉瑞产品公司
摘要 :
本发明涉及将经选择的脂族二腈区域和立体选择性生物转化成相应氰基羧酸的方法。更具体地，本发明提供了一种将2-异丁基-丁二腈转化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法，所述(S)-3-氰基-5-甲基己酸在(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)的合成中是可用的中间体。pregabalin可用于治疗某些大脑疾病，例如，治疗和预防癫痫、疼痛和精神病。
权利要求 :
1.一种用于制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法：所述方法包括如下步骤：
(a)将外消旋的2-异丁基-丁二腈与具有腈水解酶活性的酶催化剂在反应介质中接触；
(b)从所述反应介质回收所述(S)-3-氰基-5-甲基己酸；并且，任选地，回收未变化的(R)-2-异丁基-丁二腈。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)的所述回收的未变化(R)-2-异丁基-丁二腈通过与碱在溶剂中进行加热被外消旋成外消旋2-异丁基-丁二腈。
3.如权利要求2所述的方法，其中，利用由步骤(b)的所述回收的未变化(R)-2-异丁基-丁二腈外消旋的外消旋2-异丁基-丁二腈重复步骤(a)。
4.用于制备(S)3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将2-异丁基-丁二腈与具有腈水解酶活性的酶催化剂在反应介质中接触；
(b)从所述反应介质回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸；
(c)将(S)-3-氰基-5-甲基己酸转化成酸盐；和(d)将所述酸盐氢化以形成(S)3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)。
5.如权利要求4所述的方法，其中，从步骤(a)的所述反应介质回收未变化的(R)-2-异丁基丁二腈。
6.如权利要求5所述的方法，其中，步骤(a)的所述未变化(R)-2-异丁基丁二腈通过与碱在有机溶剂的存在下进行加热被外消旋以形成外消旋2-异丁基-丁二腈，并且利用所述外消旋2-异丁基-丁二腈重复步骤(a)。
7.如权利要求4所述的方法，其中，所述酶催化剂是完整微生物细胞、透性化微生物细胞、微生物细胞萃取物、部分纯化的酶、纯化酶或固定在载体上的酶催化剂的形式的腈水解酶。
8.如权利要求4所述的方法，其中，所述酶催化剂选自由NIT-101、NIT-102、NIT-103和得自拟南芥的腈水解酶组成的组。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种用于将经选择的脂族二腈区域选择和立体选择性转化成相应的氰基羧酸的新型生物催化方法。更具体地，本发明提供了将2-异丁基-丁二腈转化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法，该(S)-3-氰基-5-甲基己酸在(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)的合成中是有用的中间体。Pregabalin可用于治疗某些大脑疾病，例如，治疗和预防癫痫、疼痛和精神病。因为pregabalin对改善大脑功能有效，因此，它也可用在老年病患者的治疗中。
背景技术
将有机腈酶水解成相应的羧酸和酰胺对多种有用化合物提供了一种重要的可替换合成方法。传统的腈到相应的羧酸和酰胺的化学水解通常使用强酸或强碱催化剂在高反应温度下实施，这使该合成与包含敏感官能团的化合物无法相容。而且，化学水解的差选择性可以导致不令人希望的副产物以及大量无机盐。与此相反，在温和条件下(中性pH，30℃)进行的酶腈水解为高度化学选择性、区域选择性和立体选择性提供了可能。作为附加的优点，避免了副产物无机盐的形成。
腈转化酶最著名的工业应用是利用得自紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1的腈水合酶制备丙烯酰胺(T.Nagasawa等，Tibtech.，1992，vol.10，402-408)和烟酰胺(T.Nagasawa等，Appl.Environ.Microbiol.，1998，vol 54，1766-1769)。近来一些综述(L.Martinková等，CurrentOrganic Chemistry，2003，vol.7，1279-1295和D.Cowan等，Extremophiles，1998，vol.2，207-216)描述了腈转化酶的生物化学应用和潜在的工业应用。
酶腈水解通过腈水解酶(将腈转化成相应的羧酸)和腈水合酶(将腈转化成相应的酰胺)进行催化。酰胺酶(将酰胺水解成相应的羧酸)可以与腈水合酶组合使用以将腈转化成羧酸。
WO 02/072856中公开了腈水解酶用于由腈制备相应的羧酸的用途。将酶结合到交联的聚合物基质中提供了具有改进的物理和生物化学完整性的催化剂。
U.S.专利5,814,508公开了采用生物催化剂由脂族∝、ω-二腈到ω-腈羧酸的区域选择性制备方法。例如，具有腈水解酶活性的催化剂用于将2-甲基戊二腈转化成4-氰基戊酸。
K.Yamamoto等的J.Ferment.Bioengineering，1992，vol.73，125-129描述了具有腈水合酶活性和酰胺酶活性的微生物细胞将反式-1，4-二氰基环己烷转化成反式-4-氰基环己烷羧酸的用途。
对于一系列脂族α，ω-二腈化合物，已经报道了利用具有脂族腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性组合的微生物细胞，将二腈区域选择性生物催化转化成经氰基取代的羧酸的方法(J.E.Gavagan等J.Org.Chem.，1998，vol.63，4792-4801)。
已经描述了腈的立体选择酶转化用于制备富集一种对映异构体的手性羧酸和酰胺(M Wieser等，Chapter in Stereoselective Biocatalysis，MarcelDekker Inc.；New York，2000，461-486)。得自粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ATCC 8750的立体选择性腈水解酶用于由外消旋扁桃腈制备(R)-扁桃酸(K.Yamamoto等，Appl.Environ.Microbiol.，1991，vol.57，3028-3032)。得自紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)NCIMB 11216的腈水解酶优先水解2-甲基己腈外消旋混合物中的(+)-2-甲基己腈，留下未反应的(-)-2-甲基己腈(M.Gradley等，Biotechnology Lett.，1994，vol.16，41-46)。U.S.专利5,593,871公开了利用包含立体选择性腈水合酶的微生物由腈制备富集一种对映异构体的2-烷酸酰胺的方法。对映异构纯的α-氨基酸和酰胺，利用包含立体选择性腈水合酶和立体选择酰胺酶的红球菌属(Rhodococcus sp)AJ270，由外消旋经α-芳基取代的和经α-烷基取代的甘氨酸腈制备(M.-C.Wang等，J.Org.Chem.，2002，vol.67，6542)。上述参考文献全文插入此处。
已经发现外消旋pregabalin的治疗价值(具体的是作为抗痉挛药物的疗效)主要归因于(S)-对映异构体。为了达到提供划算的pregabalin药品治疗的目的，已经研究了大量合成富集(S)-对映异构体化合物的路线。例如，将适当的经氰基取代的烯烃不对称氢化，接着将氰基还原成相应的酰胺，这提供了一种基本上富集(S)-对映异构体的pregabalin(美国专利申请公开2003/0212290)。
美国专利6,642,398，6,635,673和6,046,353公开了通过纯化学方法合成pregabalin、其衍生物和类似物的方法。
腈转化酶最著名的工业应用是利用得自紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1的腈水合酶制备丙烯酰胺(T.Nagasawa等，Tibtech.，1992，vol.10，402-408)和烟酰胺(T.Nagasawa等，Appl.Environ.Microbiol.，1998，vol 54，1766-1769)。近来一些综述(L.Martinková等，CurrentOrganic Chemistry，2003，vol.7，1279-1295和D.Cowan等，Extremophiles，1998，vol.2，207-216)描述了腈转化酶的生物化学应用和潜在的工业应用。
酶腈水解通过腈水解酶(将腈转化成相应的羧酸)和腈水合酶(将腈转化成相应的酰胺)进行催化。酰胺酶(将酰胺水解成相应的羧酸)可以与腈水合酶组合使用以将腈转化成羧酸。
WO 02/072856中公开了腈水解酶用于由腈制备相应的羧酸的用途。将酶结合到交联的聚合物基质中提供了具有改进的物理和生物化学完整性的催化剂。
U.S.专利5,814,508公开了采用生物催化剂由脂族∝、ω-二腈到ω-腈羧酸的区域选择性制备方法。例如，具有腈水解酶活性的催化剂用于将2-甲基戊二腈转化成4-氰基戊酸。
K.Yamamoto等的J.Ferment.Bioengineering，1992，vol.73，125-129描述了具有腈水合酶活性和酰胺酶活性的微生物细胞将反式-1，4-二氰基环己烷转化成反式-4-氰基环己烷羧酸的用途。
对于一系列脂族α，ω-二腈化合物，已经报道了利用具有脂族腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性组合的微生物细胞，将二腈区域选择性生物催化转化成经氰基取代的羧酸的方法(J.E.Gavagan等J.Org.Chem.，1998，vol.63，4792-4801)。
已经描述了腈的立体选择酶转化用于制备富集一种对映异构体的手性羧酸和酰胺(M Wieser等，Chapter in Stereoselective Biocatalysis，MarcelDekker Inc.；New York，2000，461-486)。得自粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ATCC 8750的立体选择性腈水解酶用于由外消旋扁桃腈制备(R)-扁桃酸(K.Yamamoto等，Appl.Environ.Microbiol.，1991，vol.57，3028-3032)。得自紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)NCIMB 11216的腈水解酶优先水解2-甲基己腈外消旋混合物中的(+)-2-甲基己腈，留下未反应的(-)-2-甲基己腈(M.Gradley等，Biotechnology Lett.，1994，vol.16，41-46)。U.S.专利5,593,871公开了利用包含立体选择性腈水合酶的微生物由腈制备富集一种对映异构体的2-烷酸酰胺的方法。对映异构纯的α-氨基酸和酰胺，利用包含立体选择性腈水合酶和立体选择酰胺酶的红球菌属(Rhodococcus sp)AJ270，由外消旋经α-芳基取代的和经α-烷基取代的甘氨酸腈制备(M.-C.Wang等，J.Org.Chem.，2002，vol.67，6542)。上述参考文献全文插入此处。
已经发现外消旋pregabalin的治疗价值(具体的是作为抗痉挛药物的疗效)主要归因于(S)-对映异构体。为了达到提供划算的pregabalin药品治疗的目的，已经研究了大量合成富集(S)-对映异构体化合物的路线。例如，将适当的经氰基取代的烯烃不对称氢化，接着将氰基还原成相应的酰胺，这提供了一种基本上富集(S)-对映异构体的pregabalin(美国专利申请公开2003/0212290)。
美国专利6,642,398，6,635,673和6,046,353公开了通过纯化学方法合成pregabalin、其衍生物和类似物的方法。
发明内容
在本发明的方法中，将脂族二腈区域和立体选择生物催化转化成氰基羧酸的方法利用具有腈水解酶活性的酶催化剂来实现。
本发明涉及用于制备式I化合物的(S)-对映异构体的新方法：
其中，C3具有(S)构型；
R1是氢、(C1-C6)烷基或苯基；和
R2是(C1-C8)烷基、(C2-C8)链烯基、(C3-C8)环烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2-CH2-O-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基-OH、-苯基-(C1-C6)烷基-OH、-苯基-O-(C1-C6)烷基、苯基或经取代的苯基；
条件是，当R2是甲基时，R1是氢、(C1-C6)烷基或苯基，
所述方法包括如下步骤：
(1a)将式II化合物与具有腈水解酶活性的酶催化剂在反应介质中接触；
(1b)从反应介质回收式I化合物的(S)-异构体；并且，任选地，回收未变化的化合物II的(R)-异构体。
式I化合物可用于合成具有药学活性的化合物(例如，pregabalin)。
在本发明的优选实施方式中，R1和R2独立的是C1-C3烷基。
在本发明的优选实施方式中，式II化合物是包括3R和3S异构体的外消旋混合物。
本发明的优选实施方式是如下方法，其中，外消旋2-异丁基丁二腈(式II化合物，其中，R1是H，R2是甲基)被转化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸(式I化合物，其中，R1是H，R2是甲基)，该方法包括以下步骤：
(2a)将外消旋的2-异丁基-丁二腈与具有腈水解酶活性的酶催化剂在反应介质中接触；并
(2b)从水性混合物回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸；并且，任选地，回收未变化的(R)-2-异丁基丁二腈。
优选地，反应介质是水性介质。
在本发明的优选实施方式中，将回收的和未变化的化合物II的(R)-异构体随后通过与弱碱在有机溶剂的存在下进行加热外消旋化。优选的碱是1，8-二氮杂双环[5.4.0.]十一碳-7-烯，优选的溶剂是甲苯。任选地，所得的II的外消旋物可以回收到以上所记载的方法的步骤(1a)中或回收到(2a)中。
在本发明的一个实施方式中，酶催化剂为完整微生物细胞、微生物细胞萃取物、部分纯化的酶、纯化酶或固定在载体上的酶催化剂的形式。
在本发明的另一实施方式中，酶催化剂是部分纯化的酶。部分纯化的酶的实例包括，但不限于，NIT-101、NIT-102、NIT-103(BioCatalyticsInc.，Pasadena，CA)和得自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的腈水解酶(Jülich Fine Chemicals，Jülich，Germany)。
在本发明的优选实施方式中，腈水解酶催化剂固定在载体上。被固定的腈水解酶催化剂的实例包括，但不限于，NIT-102C2(BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)、固定在Eupergit上的NIT-102(GmbH&Co.KG，Darmstadt，Germany)和固定在Eupergit上得自拟南芥的腈水解酶。在优选的实施方式中，被固定的腈水解酶催化剂是NIT-102C2。
在另一优选的实施方式中，反应介质由蒸馏水或缓冲水组成。优选地，缓冲水被缓冲到约5.0-约10.0的pH范围，最优选地，被缓冲到约6.0-约8.0的pH范围。
本发明还涉及用于制备(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将外消旋2-异丁基-丁二腈与具有腈水解酶活性的酶催化剂在反应介质中接触；
(b)从所述反应介质回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸；
(c)将(S)-3-氰基-5-甲基己酸转化成酸盐；和
(d)将所述酸盐氢化以形成(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)。
优选地，酸盐具有下式：
其中，M是Na、K、Li、NH4、NH2R6R7、NH3R1或NH(R6)2R7，其中，R6和R7各自独立的是(C1-C6)烷基。
为了方便，此处集合了在本说明书、实施例和所附权利要求书中所用的某些术语。除非另有声明，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常的理解相同的意义。
术语“烷基”，是1-8个碳原子的直链或支化基团，包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
此处所用术语“环烷基”，包括得自含3-7个环碳原子的环烃的部分，包括，被直链或支化烷基取代的环烃部分。
此处所用术语“烷氧基”，意指“烷基-O-”，其中，“烷基”如上定义。
术语“链烯基”，指包括直链或支化构型的烃链，该链包括一个或更多个可以存在于链的任何稳定点中的碳碳双键，例如，乙烯基和丙烯基。链烯基通常具有2-约12个碳原子，更典型的是具有2-约8个碳原子。
此处所用术语外消旋物，意指一对对映异构体的等摩尔混合物。当合成导致立体中心产生时，通常形成外消旋物。此处所用术语外消旋混合物，意指外消旋物。
此处所用术语对映异构体，指在分子水平上与镜像不能重合的化合物。对映异构体可以存在(R)或(S)构型。
此处所用术语立体选择性合成，指由两种或更多种可能的立体异构体形成单一立体异构体或对映异构体富集的异构体混合物的化学反应。
此处所用术语区域选择性，指在两个或更多个可能的原子或原子团之中的单一原子或原子团上发生的反应。二腈的区域选择性水解导致单一腈基转化成羧基。
“℃”意指摄氏度。
此处所用术语“酶催化剂”，意指其特征为具有腈水解酶活性或腈水合酶活性和酰胺酶活性组合的催化剂。催化剂可以为完整微生物细胞、透性化微生物细胞、微生物细胞萃取物的一种或更多种细胞组分、部分纯化的酶或纯化酶的形式。
此处所用术语对映异构体过量，指在对映异构体混合物中主要对映异构体的摩尔分数(以百分率表示)。
术语“水性反应混合物”，意指底物和酶催化剂在大量水介质中的混合物。
术语“腈水解酶活性”，意指将腈基转化到羧酸基的酶活性。
此处所用术语“腈水合酶活性”，意指将腈基转化到酰胺基的酶活性。
术语“酰胺酶活性”，意指将酰胺基转化到羧酸基的酶活性。
ATCC是坐落于10801 University Boulevard，Manassas，Va.，20110-2209，U.S.A的American Type Culture Collection。BioCatalytics Inc.坐落于129N.Hill Avenue，Suite 103，Pasadena，CA，91106，U.S.A。Jülich Fine ChemicalsGmbH坐落于Rudolf-Schulten-Straβe 5，D-52428 Jülich，Germany。
本发明涉及用于制备式I化合物的(S)-对映异构体的新方法：
其中，C3具有(S)构型；
R1是氢、(C1-C6)烷基或苯基；和
R2是(C1-C8)烷基、(C2-C8)链烯基、(C3-C8)环烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2-CH2-O-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基-OH、-苯基-(C1-C6)烷基-OH、-苯基-O-(C1-C6)烷基、苯基或经取代的苯基；
条件是，当R2是甲基时，R1是氢、(C1-C6)烷基或苯基，
所述方法包括如下步骤：
(1a)将式II化合物与具有腈水解酶活性的酶催化剂在反应介质中接触；
(1b)从反应介质回收式I化合物的(S)-异构体；并且，任选地，回收未变化的化合物II的(R)-异构体。
式I化合物可用于合成具有药学活性的化合物(例如，pregabalin)。
在本发明的优选实施方式中，R1和R2独立的是C1-C3烷基。
在本发明的优选实施方式中，式II化合物是包括3R和3S异构体的外消旋混合物。
本发明的优选实施方式是如下方法，其中，外消旋2-异丁基丁二腈(式II化合物，其中，R1是H，R2是甲基)被转化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸(式I化合物，其中，R1是H，R2是甲基)，该方法包括以下步骤：
(2a)将外消旋的2-异丁基-丁二腈与具有腈水解酶活性的酶催化剂在反应介质中接触；并
(2b)从水性混合物回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸；并且，任选地，回收未变化的(R)-2-异丁基丁二腈。
优选地，反应介质是水性介质。
在本发明的优选实施方式中，将回收的和未变化的化合物II的(R)-异构体随后通过与弱碱在有机溶剂的存在下进行加热外消旋化。优选的碱是1，8-二氮杂双环[5.4.0.]十一碳-7-烯，优选的溶剂是甲苯。任选地，所得的II的外消旋物可以回收到以上所记载的方法的步骤(1a)中或回收到(2a)中。
在本发明的一个实施方式中，酶催化剂为完整微生物细胞、微生物细胞萃取物、部分纯化的酶、纯化酶或固定在载体上的酶催化剂的形式。
在本发明的另一实施方式中，酶催化剂是部分纯化的酶。部分纯化的酶的实例包括，但不限于，NIT-101、NIT-102、NIT-103(BioCatalyticsInc.，Pasadena，CA)和得自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的腈水解酶(Jülich Fine Chemicals，Jülich，Germany)。
在本发明的优选实施方式中，腈水解酶催化剂固定在载体上。被固定的腈水解酶催化剂的实例包括，但不限于，NIT-102C2(BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)、固定在Eupergit上的NIT-102(GmbH&Co.KG，Darmstadt，Germany)和固定在Eupergit上得自拟南芥的腈水解酶。在优选的实施方式中，被固定的腈水解酶催化剂是NIT-102C2。
在另一优选的实施方式中，反应介质由蒸馏水或缓冲水组成。优选地，缓冲水被缓冲到约5.0-约10.0的pH范围，最优选地，被缓冲到约6.0-约8.0的pH范围。
本发明还涉及用于制备(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将外消旋2-异丁基-丁二腈与具有腈水解酶活性的酶催化剂在反应介质中接触；
(b)从所述反应介质回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸；
(c)将(S)-3-氰基-5-甲基己酸转化成酸盐；和
(d)将所述酸盐氢化以形成(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)。
优选地，酸盐具有下式：
其中，M是Na、K、Li、NH4、NH2R6R7、NH3R1或NH(R6)2R7，其中，R6和R7各自独立的是(C1-C6)烷基。
为了方便，此处集合了在本说明书、实施例和所附权利要求书中所用的某些术语。除非另有声明，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常的理解相同的意义。
术语“烷基”，是1-8个碳原子的直链或支化基团，包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
此处所用术语“环烷基”，包括得自含3-7个环碳原子的环烃的部分，包括，被直链或支化烷基取代的环烃部分。
此处所用术语“烷氧基”，意指“烷基-O-”，其中，“烷基”如上定义。
术语“链烯基”，指包括直链或支化构型的烃链，该链包括一个或更多个可以存在于链的任何稳定点中的碳碳双键，例如，乙烯基和丙烯基。链烯基通常具有2-约12个碳原子，更典型的是具有2-约8个碳原子。
此处所用术语外消旋物，意指一对对映异构体的等摩尔混合物。当合成导致立体中心产生时，通常形成外消旋物。此处所用术语外消旋混合物，意指外消旋物。
此处所用术语对映异构体，指在分子水平上与镜像不能重合的化合物。对映异构体可以存在(R)或(S)构型。
此处所用术语立体选择性合成，指由两种或更多种可能的立体异构体形成单一立体异构体或对映异构体富集的异构体混合物的化学反应。
此处所用术语区域选择性，指在两个或更多个可能的原子或原子团之中的单一原子或原子团上发生的反应。二腈的区域选择性水解导致单一腈基转化成羧基。
“℃”意指摄氏度。
此处所用术语“酶催化剂”，意指其特征为具有腈水解酶活性或腈水合酶活性和酰胺酶活性组合的催化剂。催化剂可以为完整微生物细胞、透性化微生物细胞、微生物细胞萃取物的一种或更多种细胞组分、部分纯化的酶或纯化酶的形式。
此处所用术语对映异构体过量，指在对映异构体混合物中主要对映异构体的摩尔分数(以百分率表示)。
术语“水性反应混合物”，意指底物和酶催化剂在大量水介质中的混合物。
术语“腈水解酶活性”，意指将腈基转化到羧酸基的酶活性。
此处所用术语“腈水合酶活性”，意指将腈基转化到酰胺基的酶活性。
术语“酰胺酶活性”，意指将酰胺基转化到羧酸基的酶活性。
ATCC是坐落于10801 University Boulevard，Manassas，Va.，20110-2209，U.S.A的American Type Culture Collection。BioCatalytics Inc.坐落于129N.Hill Avenue，Suite 103，Pasadena，CA，91106，U.S.A。Jülich Fine ChemicalsGmbH坐落于Rudolf-Schulten-Straβe 5，D-52428 Jülich，Germany。
具体实施方式
本发明提供了由式II的二腈制备式I的脂族氰基羧酸的酶催化方法。通常用在本领域中的任意合适的方法可以用于制备二腈(II)原料。
示意图1指本发明的具体实施方式，其中，化学酶方法用于将2-异丁基-丁二腈(V)转化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)。如示意图2所示，化合物VI在pregabalin(VII)的合成中可用作中间体。示意图1的步骤3描述了副产物(R)-异构体(Va)的外消旋化并随后回收到步骤2中。
在示意图1的步骤1中，外消旋2-异丁基-丁二腈(V)由如下过程形成：将异戊醛(III)与氰基乙酸乙酯(IV)缩合，接着添加KCN。外消旋物由在V的C3碳原子上产生的立体中心而产生。
示意图1的步骤2描述了二腈V外消旋物的区域和立体选择性水解，该步骤得到了(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)和未变化的V的(R)-异构体。
2-异丁基-丁二腈(V)到(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)的经腈水解酶催化的水解是区域选择性的和立体选择性的。区域选择性是基于氰基到羧基的转化仅在C1碳原子上。该反应是立体选择性的，是因为转化主要涉及V的(S)-对映异构体，而留下基本上未变化的(R)-对映异构体。
如示意图2所示，将S-氰基酸(VI)的酸盐VIa在随后的步骤中氢化以得到(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)。该反应在氢化催化剂的存在下实施，优选的是Raney镍。可接受的酸盐包括式VIa化合物，其中，M是Na、K、Li、NH4、NH2R6R7、NH3R6或NH(R6)2R7，其中，R6和R7独立的是(C1-C6)烷基。
示意图1
示意图2
如示意图I所示，在外消旋物V到(S)-氰基酸VI的区域和立体选择转化中，腈水解酶主要与(S)对映异构体反应。因此，随着转化进行，反应混合物逐渐富集(R)对映异构体。
本发明的另一个目的在于通过回收或重复使用未变化的(R)-二腈Va来避免经济上浪费。因此，本发明提供了一种用于外消旋化(R)-二腈(步骤3，示意图1)和随后通过示意图1的步骤2回收的方法。
本发明具有腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性组合的各种酶可以通过筛选方案(例如，富集分离技术)找到，该技术首先根据微生物在含富集腈的介质中的生长能力来对其进行选择。富集分离技术通常包括使用补充有富集腈的碳受限或氮受限介质，该富集腈可以是希望生物转化的腈底物或结构上类似的腈化合物。可以首先根据具有腈水解酶活性的微生物在含富集腈的介质中的生长能力对其进行选择。Gavagan等(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)vol.52，654-659)使用富集技术，从土壤中，利用2-乙基丁二腈作为唯一氮源分离了革兰阴性杆菌敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W(ATCC 55746)。敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)被显示可用于2-甲基戊二腈到4-羟基戊酸的选择性转化。富集技术还可用于分离嗜热细菌Bacillus pallidus Dac521，该细菌催化3-羟基吡啶到烟酸的转化(Almatawah和Cowan，Enzyme Microb.Technol.(1999)vol.25，718-724)。通过将微生物细胞的悬浮液与腈化合物接触并利用分析方法(例如，高效液相色谱、气液相色谱或液相色谱质谱联用(LCMS))测试相应羧酸的存在，可以测试通过富集技术分离的微生物的腈水解活性。US专利5,814,508报道了用于测试敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解活性的技术。
一旦已经分离了具有腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性的微生物，就可以采用酶工程改进酶的各个方面。这些改进可用于本发明，包括增加酶的选择性、催化效率，对更高温度和更宽的pH范围的稳定性和使酶能在反应介质(包括水缓冲液和有机溶剂的混合物)中进行操作。
可以用在本发明中以生产酶催化剂(除了具有改进的适于特定生物转化工艺的产率、生产量和产品质量以外，还具有腈水解酶活性或腈水合酶和酰胺酶活性)的各种技术包括，但不限于，酶工程技术(例如，合理设计方法，该方法包括定点突变和利用无规突变的或DNA改组技术的定向进化技术)。
用于式II化合物到式I化合物的转化的合适酶催化剂为完整微生物细胞、透性化微生物细胞、微生物细胞萃取物、部分纯化的酶、纯化酶的形式，并且这些催化剂可以固定在载体上。
这个方法可以在单相中通过将2-异丁基-丁二腈与酶催化剂在蒸馏水或在缓冲水溶液中接触来实施，该缓冲水溶液将保持反应的初始pH为5.0-10.0，优选为6.0-8.0.合适的缓冲试剂包括磷酸钠和乙酸钙.随着反应的进行，反应混合物的pH可以由于二腈的相应腈官能团形成羧酸的铵盐而变化.进行该反应可以不需采用pH控制，或者合适的酸或碱可以在反应过程中加入以维持所希望的pH.然而，如上述，可以采用各种技术(例如，酶工程和定向进化技术)生产酶催化剂，该酶催化剂将在更宽的pH范围内有效操作.
这个方法可以在由两相组成的反应混合物中实施：水相(开始包含酶和被溶解的2-异丁基-丁二腈)和有机相(主要由外消旋2-异丁基-丁二腈组成)。该两相反应混合物通过如下步骤制备：将2-异丁基-丁二腈加到酶和缓冲试剂的水性溶液中，使得所添加的2-异丁基-丁二腈的量超过水溶解度极限。在50mM磷酸钾(30℃，pH 7.5)中2-异丁基-丁二腈的水溶解度极限为约0.06M。在反应过程中，(S)-3-氰基-5-甲基己酸铵盐形成，并且在水相中的浓度增加，同时有机相的体积减小并富集(R)-2-异丁基-丁二腈。可替换地，这个方法还可以在由三相组成的反应混合物中实施：水相(开始包含溶解的2-异丁基-丁二腈)、有机相(主要由外消旋2-异丁基-丁二腈组成)和固相(由固定在不溶载体上的酶组成)。除了用固定在不溶载体上的酶替代非固定酶以外，三相反应混合物通过对于两相反应混合物所描述的过程来制备。
任选地，酶可以固定在聚合物基质上或在不溶载体上。被固定的酶催化剂可以重复使用和在连续工艺中使用，并可以比未固定酶催化剂更易于从酶工艺的产品中分离。本领域技术人员已知在聚合物基质(例如，褐藻酸钙或聚丙烯酰铵)或在不溶载体(硅藻土)上固定酶的方法。固定在不溶载体上的腈水解酶NIT-102C2(BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)特别可用于II到III的转化，因为它可以在间歇或连续工艺中重复使用。选择用在反应中的NIT-102C2的浓度以得到所希望的反应速率，并且该浓度依赖于催化剂的具体活性和底物的浓度。通常，所用的NIT-102C2为0.001g-0.3g湿重/mL反应体积，优选的是0.01-0.15g湿重/mL反应体积。
另外，由微生物细胞制备并被命名为NIT-101、NIT-102、NIT-103(BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)和得自拟南芥的腈水解酶(FineChemicals，Germany)的数种经冻干的溶胞产物也可用于II到III的转化。将NIT-101、NIT-102、NIT-103和A.thaliana腈水解酶与I在水性反应混合物中接触形成II。利用NIT-101、NIT-102、NIT-103和得自拟南芥的腈水解酶的反应可以在两相反应混合物中，采用0.001-0.04g干重/ml反应体积，优选0.002-0.02g干重/ml反应体积的催化剂浓度来实施。
选择水解反应的温度以最优化反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度可以为仅高于悬浮液的凝固点(约0℃)-60℃，优选的反应温度为5℃ to 35℃。
式I化合物的(3S)异构体的回收和式II化合物的未变化的(3R)异构体的回收可以采用本领域技术人员所公知的合适的分离、离析和纯化技术实施。
在回收的优选方法中，式II化合物的未变化(3R)异构体通过采用有机溶剂(例如，乙酸乙酯)进行萃取从碱性水性反应混合物中分离。式I化合物的(3S)异构体的酸盐优选溶于水层中，并接着通过酸化并采用有机溶剂(例如，乙酸乙酯)萃取而离析。
式I化合物可以用于合成诸如pregabalin的化合物，该化合物可用于治疗如癫痫症、痉挛、焦虑、疼痛和神经退行性失调的失调症，包括，Alzeimer氏症、Huntington氏症和Parkinson氏症。
式I具体化合物的实例是如下化合物：
(S)-3-氰基-5-甲基-辛酸；
(S)-3-氰基-5-甲基-庚酸；
(S)-3-氰基-5-甲基-己酸；
(S)-3-氰基-5-甲基-壬酸；
(S)-3-氰基-5-乙氧基-己酸；
(S)-3-氰基-5-环己基-己酸；和
(S)-3-氰基-5-三氟甲基-己酸。
实施例1
制备2-异丁基-丁二腈
将氰基乙酸乙酯(733g，6.48mol)，异戊醛(613.9g，7.13mol)、哌啶(5.5g，0.065mol)和己烷(0.5L)的混合物回流连续除水。当没有另外的水被收集到时，将混合物冷却并在真空下蒸馏以除去溶剂。将异丙醇(1L)加到剩余的油中，接着加入氰化钾(422g，6.48mol)的水(2L)溶液。在添加氰化钾溶液期间，将反应混合物保持在35℃以下，然后在约35℃下保持4小时。将反应混合物在大气压下蒸馏直到温度达到95℃，然后在这个温度下回流5小时。将反应混合物冷却，用水(0.5L)稀释并用1L甲基叔丁基醚(MTBE)萃取。将MTBE萃取液用水(0.5L)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到873.4g油状2-异丁基-丁二腈。通过真空蒸馏(90℃，在0.275mm Hg下)可以得到2-异丁基-丁二腈的纯化样品。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.93-0.99(m，6H)，1.43-1.50(m，1H)，1.71-1.78(m，1H)，1.81-1.91(m，1H)，2.69(d，2H，J＝6.5Hz)，2.90-2.97(m，1H)。
实施例2
采用NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥腈水解酶由2-异丁基-丁二腈 制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸
在三个8mL螺旋盖的玻璃试管的每个中装入2-异丁基-丁二腈(20mg)，1mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5，2mM二硫苏糖醇(DTT))和10mg选自NIT-101、NIT-102或NIT-103(Biocatalytics Inc.，Pasadena，CA)的腈水解酶。在一个8mL螺旋盖的玻璃试管中装入2-异丁基-丁二腈(20mg)和1mL拟南芥腈水解酶在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.8)(包含100mM乙二胺四乙酸(EDTA)和2mM DTT)中的溶液(Jülich FineChemicals，Jülich，Germany)。将四种反应混合物在30℃下采用磁力搅拌棒搅拌15小时，然后各自采用乙酸乙酯(2×6mL)萃取。在除去乙酸乙酯萃取液后，将水性部分用4N HCl(0.15mL)进行处理并用乙酸乙酯(3×6mL)萃取。将经酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液在真空下浓缩得到7.8mg(34.2％产率)，8.8mg(38.6％产率)，8.1mg(35.5％产率)和4.0mg(17.5％产率)(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)(分别采用NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥(A.thaliana)腈水解酶进行反应)。将由各个反应得到的(S)-3-氰基-5-甲基己酸样品采用过量的(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷进行处理以得到它们的甲酯衍生物并通过气相色谱(GC)在ChiraldexTM G-TA柱(30M×0.25mm ID，125微米膜厚)上分析以确定对映异构体的纯度。NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥腈水解酶反应产物的对映异构纯度分别是96.3％，91.1％，95.5％和98.5％e.e.。(e.e.意指“对映异构体过量”)
实施例3
采用NIT-102由2-异丁基-丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸
在被维持在30℃的125mL加套的反应器中装入2-异丁基-丁二腈(3.33g)，NIT-102(0.5g)和122mL的包含5mM DTT和1mM EDTA的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)(反应缓冲液)。在搅拌12.5h后，将产物混合物用乙酸乙酯(4×50mL)萃取。将乙酸乙酯萃取液除去并将水性部分用4M HCl调整到pH 2.5，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将经酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液合并，用无水MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩得到1.56g(S)-CMHA(41.1％)。将反应产物的样品采用(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷进行处理并通过实施例2所描述的GC分析，得到98.5％e.e.的对映异构纯度。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.93-0.97(m，6H)，1.30-1.37(m，1H)，1.61-1.68(m，1H)，1.82-1.89(m，1H)，2.57-2.63(m，1H)，2.72-2.78(m，1H)，2.98-3.06(m，1H)。
实施例4
采用NIT-102C2由2-异丁基-丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾
在两个被维持在30℃的125mL加套的反应器的每个中装入2-异丁基-丁二腈(6.81g)，NIT-102C2(1.70g)和118.2mL反应缓冲液。在搅拌24h后，将产物混合物轻轻倒出，在反应器中留下酶催化剂。将反应缓冲液(20mL)加到每个反应器中，搅拌约2分钟，然后倒出并加到反应混合物中。通过将2-异丁基-丁二腈(6.81g)和反应缓冲液(118.2mL)加到每个反应器中并将反应混合物搅拌24小时来重复反应。在各个容器中的四个反应完成(总共八个间歇反应)后，将产物混合物合并，并用MTBE(3×500mL)萃取。将MTBE萃取液除去，并将水性部分用磷酸调节到pH 2.1，并用MTBE(2×500mL)萃取。将经酸化的水性部分的MTBE萃取液在真空下浓缩得到油，将该油用水(100mL)和KOH(8.5g)进行处理。将所得溶液在真空下浓缩得到24.2g(31.3％)(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾。(S)-3-氰基-5-甲基己酸甲酯由(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾制备，并通过手性GC分析得到99.1％e.e.的对映异构纯度。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ0.75-0.78(m，6H)，1.18-1.25(m，1H)，1.43-1.50(m，1H)，1.53-1.68(m，1H)，2.28-2.38(d，2H，J＝6.5Hz)，2.86-2.93(m，1H)。
实施例5
采用NIT-102C2在氮气氛下由2-异丁基-丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸
在被维持在30℃的125mL加套的反应器中装入2-异丁基-丁二腈(6.53g)，NIT-102C2(2.61g)，120g反应缓冲液，并用氮气净化。将所得混合物搅拌24小时，然后倒入250mL玻璃瓶中，在反应器中留下催化剂。通过在包含用过的催化剂的反应器中再装入2-异丁基-丁二腈(6.53g)和120g反应缓冲液，用氮气净化，并将所得混合物搅拌24小时来重复反应。将反应样品(0.1mL)与0.4mL水∶甲醇∶三氟乙酸(60∶40∶0.09，v/v/v)混合，并通过HPLC在保持在30℃的SymmetryTMC8柱(150×3.9mm)上分析。该柱采用水∶甲醇∶三氟乙酸(60∶40∶0.09，v/v/v)洗脱，探测采用折光率检测器实施。
全部50个间歇反应采用催化剂再循环实施。将两个连续的间歇反应的产物混合物合并并用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。将水性部分用4MHCl调节到pH 2，并用乙酸乙酯(2×150mL)萃取.将经酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液合并，用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到(S)-CMHA.由50个间歇反应得到总共160.8g(43.2％产率)(S)-CMHA.对于第一个、第二十六个和第五十个反应，初始速率分别为14.8、17.4和15.1mM(S)-CMHA/h.由间歇反应39-50离析出的(S)-CMHA的甲酯衍生物的手性GC分析表明平均对映异构纯度为99.0％e.e.
实施例6
采用NIT-102C2在大气氛中由2-异丁基-丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸
除了该反应在大气氛下实施而不是在氮气氛下实施以外，采用NIT-102C2的2-异丁基-丁二腈到(S)-CMHA的转化的一系列间歇反应如实施例5所述地实施。如实施例5所述，反应样品通过HPLC分析。
全部50个间歇反应在大气下采用催化剂再循环实施。对于第一个、第二十六个和第五十个反应，由在4个小时时取出的样品测定的初始反应速率分别为14.2、13.2和9.3mM(S)-CMHA/h。
实施例7
制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁铵
将由2-异丁基-丁二腈到(S)-CMHA的转化(实施例6，反应37-44)的产物混合物合并，并用乙酸乙酯(2×250mL)萃取。将乙酸乙酯萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到油(32.5g，62.2％产率)，该油主要是(R)-异丁基-丁二腈。水性部分用4M HCl调节到pH 2，并用乙酸乙酯(2×250mL)萃取。将乙酸乙酯萃取液浓缩到体积为470mL，然后在滴加叔丁胺(15.9mL，151.5mmol)的同时搅拌。将形成的白色晶体盐通过过滤收集，并空气干燥整夜得到30.0g(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁铵。(S)-3-氰基-5-甲基己酸甲酯由(S)-3-氰基-5-己基己酸叔丁铵制备并通过手性GC分析表明对映异构纯度为99.5％e.e。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.90-0.94(m，6H)，1.26-1.32(m，10H)，1.54-1.61(m，1H)，1.78-1.88(m，1H)，2.30-2.35(m.1H)，2.43-2.50(m，1H)，2.96-3.04(m，1H)。
实施例8
由(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾制备(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸
将(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾(20g，103.5mmol)，水(50mL)，45％KOH(12g)异丙醇(12g)和Raney镍的混合物在50psi氢气下在Parr Shaker中摇动整夜。将混合物过滤，加热至约50℃，用乙酸(6.5mL)进行处理并在室温下搅拌整夜。然后，将混合物用45％KOH调节到略高于pH 7并在真空下浓缩以除去大部分异丙醇。将异丙醇(20mL)加到混合物中，该混合物然后用乙酸酸化，在室温下搅拌整夜并过滤得到4.3g白色结晶固体状(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸。通过利用Marfey试剂(Nα-(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺)制备(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸衍生物并通过HPLC在BDS Hypersil C18柱(250×4.6mm，5μ)上，采用乙腈∶1％三乙胺(pH 3)(38∶62，v/v)洗脱来分析确定对映异构纯度为100％e.e。
实施例9
由(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁铵制备(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸
将(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁铵(26g，113.9mmol)，水(48.8mL)，乙醇(35.8mL)，KOH(7.2g，91％薄片)和Sponge NickelTM(A-7000，16.3g湿重，Activated Metals&Chemicals，Inc.，Sevierville，TN)的混合物在50psi氢气下Parr Shaker中摇动整夜.将混合物过滤(硅藻土)，并将滤饼用水(10mL)和乙醇(5mL)洗涤.将乙酸(9.4mL)加到滤液中，并将所得混合物在4℃搅拌整夜.将产物过滤，用10mL异丙醇冲洗并在真空下干燥得到11.1g(61％)白色固体.将这个材料的一部分(10.0g)由1∶1的异丙醇和水混合物结晶得到8.8g 100％ee的(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸。
实施例10
利用DBU外消旋化(R)-2-异丁基-丁二腈
(R)-2-异丁基-丁二腈的外消旋化在由外消旋2-异丁基-丁二腈的生物转化(采用NIT-102 C2)回收的材料中实施。将(R)-2-异丁基-丁二腈(1.36g，10mmol，69％ee)，甲苯(5mL)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，0.076g，5mmol)的混合物回流2小时。将水(10mL)加到反应中，并将所得混合物用乙酸乙酯(2×10mL)萃取，将合并的有机萃取液依次采用5％HCl(20mL)和饱和氯化钠水溶液(20mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到外消旋2-异丁基-丁二腈(1.14g，84％)。通过GC，利用ChiraldexTM G-TA柱(30M×0.25mmID，125微米膜厚)确定对映异构纯度。
实施例11
利用 IRA-400外消旋化(R)-2-异丁基-丁二腈
将IRA-400树脂(1g湿重，Rohm&Haas，Philadelphia，PA)用5％NaOH(10mL)搅拌10分钟并用水洗涤直到洗涤物为中性。将乙醇(25mL)和(R)-2-异丁基-丁二腈(69％ee)加到树脂中，并将所得混合物回流2小时。将反应混合物过滤并在真空下浓缩。将残余物用乙酸乙酯(25mL)吸收并用水(3×100mL)洗涤。将有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到外消旋2-异丁基-丁二腈(0.81g，81％)。
示意图1指本发明的具体实施方式，其中，化学酶方法用于将2-异丁基-丁二腈(V)转化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)。如示意图2所示，化合物VI在pregabalin(VII)的合成中可用作中间体。示意图1的步骤3描述了副产物(R)-异构体(Va)的外消旋化并随后回收到步骤2中。
在示意图1的步骤1中，外消旋2-异丁基-丁二腈(V)由如下过程形成：将异戊醛(III)与氰基乙酸乙酯(IV)缩合，接着添加KCN。外消旋物由在V的C3碳原子上产生的立体中心而产生。
示意图1的步骤2描述了二腈V外消旋物的区域和立体选择性水解，该步骤得到了(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)和未变化的V的(R)-异构体。
2-异丁基-丁二腈(V)到(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)的经腈水解酶催化的水解是区域选择性的和立体选择性的。区域选择性是基于氰基到羧基的转化仅在C1碳原子上。该反应是立体选择性的，是因为转化主要涉及V的(S)-对映异构体，而留下基本上未变化的(R)-对映异构体。
如示意图2所示，将S-氰基酸(VI)的酸盐VIa在随后的步骤中氢化以得到(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)。该反应在氢化催化剂的存在下实施，优选的是Raney镍。可接受的酸盐包括式VIa化合物，其中，M是Na、K、Li、NH4、NH2R6R7、NH3R6或NH(R6)2R7，其中，R6和R7独立的是(C1-C6)烷基。
示意图1
示意图2
如示意图I所示，在外消旋物V到(S)-氰基酸VI的区域和立体选择转化中，腈水解酶主要与(S)对映异构体反应。因此，随着转化进行，反应混合物逐渐富集(R)对映异构体。
本发明的另一个目的在于通过回收或重复使用未变化的(R)-二腈Va来避免经济上浪费。因此，本发明提供了一种用于外消旋化(R)-二腈(步骤3，示意图1)和随后通过示意图1的步骤2回收的方法。
本发明具有腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性组合的各种酶可以通过筛选方案(例如，富集分离技术)找到，该技术首先根据微生物在含富集腈的介质中的生长能力来对其进行选择。富集分离技术通常包括使用补充有富集腈的碳受限或氮受限介质，该富集腈可以是希望生物转化的腈底物或结构上类似的腈化合物。可以首先根据具有腈水解酶活性的微生物在含富集腈的介质中的生长能力对其进行选择。Gavagan等(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)vol.52，654-659)使用富集技术，从土壤中，利用2-乙基丁二腈作为唯一氮源分离了革兰阴性杆菌敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W(ATCC 55746)。敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)被显示可用于2-甲基戊二腈到4-羟基戊酸的选择性转化。富集技术还可用于分离嗜热细菌Bacillus pallidus Dac521，该细菌催化3-羟基吡啶到烟酸的转化(Almatawah和Cowan，Enzyme Microb.Technol.(1999)vol.25，718-724)。通过将微生物细胞的悬浮液与腈化合物接触并利用分析方法(例如，高效液相色谱、气液相色谱或液相色谱质谱联用(LCMS))测试相应羧酸的存在，可以测试通过富集技术分离的微生物的腈水解活性。US专利5,814,508报道了用于测试敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解活性的技术。
一旦已经分离了具有腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性的微生物，就可以采用酶工程改进酶的各个方面。这些改进可用于本发明，包括增加酶的选择性、催化效率，对更高温度和更宽的pH范围的稳定性和使酶能在反应介质(包括水缓冲液和有机溶剂的混合物)中进行操作。
可以用在本发明中以生产酶催化剂(除了具有改进的适于特定生物转化工艺的产率、生产量和产品质量以外，还具有腈水解酶活性或腈水合酶和酰胺酶活性)的各种技术包括，但不限于，酶工程技术(例如，合理设计方法，该方法包括定点突变和利用无规突变的或DNA改组技术的定向进化技术)。
用于式II化合物到式I化合物的转化的合适酶催化剂为完整微生物细胞、透性化微生物细胞、微生物细胞萃取物、部分纯化的酶、纯化酶的形式，并且这些催化剂可以固定在载体上。
这个方法可以在单相中通过将2-异丁基-丁二腈与酶催化剂在蒸馏水或在缓冲水溶液中接触来实施，该缓冲水溶液将保持反应的初始pH为5.0-10.0，优选为6.0-8.0.合适的缓冲试剂包括磷酸钠和乙酸钙.随着反应的进行，反应混合物的pH可以由于二腈的相应腈官能团形成羧酸的铵盐而变化.进行该反应可以不需采用pH控制，或者合适的酸或碱可以在反应过程中加入以维持所希望的pH.然而，如上述，可以采用各种技术(例如，酶工程和定向进化技术)生产酶催化剂，该酶催化剂将在更宽的pH范围内有效操作.
这个方法可以在由两相组成的反应混合物中实施：水相(开始包含酶和被溶解的2-异丁基-丁二腈)和有机相(主要由外消旋2-异丁基-丁二腈组成)。该两相反应混合物通过如下步骤制备：将2-异丁基-丁二腈加到酶和缓冲试剂的水性溶液中，使得所添加的2-异丁基-丁二腈的量超过水溶解度极限。在50mM磷酸钾(30℃，pH 7.5)中2-异丁基-丁二腈的水溶解度极限为约0.06M。在反应过程中，(S)-3-氰基-5-甲基己酸铵盐形成，并且在水相中的浓度增加，同时有机相的体积减小并富集(R)-2-异丁基-丁二腈。可替换地，这个方法还可以在由三相组成的反应混合物中实施：水相(开始包含溶解的2-异丁基-丁二腈)、有机相(主要由外消旋2-异丁基-丁二腈组成)和固相(由固定在不溶载体上的酶组成)。除了用固定在不溶载体上的酶替代非固定酶以外，三相反应混合物通过对于两相反应混合物所描述的过程来制备。
任选地，酶可以固定在聚合物基质上或在不溶载体上。被固定的酶催化剂可以重复使用和在连续工艺中使用，并可以比未固定酶催化剂更易于从酶工艺的产品中分离。本领域技术人员已知在聚合物基质(例如，褐藻酸钙或聚丙烯酰铵)或在不溶载体(硅藻土)上固定酶的方法。固定在不溶载体上的腈水解酶NIT-102C2(BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)特别可用于II到III的转化，因为它可以在间歇或连续工艺中重复使用。选择用在反应中的NIT-102C2的浓度以得到所希望的反应速率，并且该浓度依赖于催化剂的具体活性和底物的浓度。通常，所用的NIT-102C2为0.001g-0.3g湿重/mL反应体积，优选的是0.01-0.15g湿重/mL反应体积。
另外，由微生物细胞制备并被命名为NIT-101、NIT-102、NIT-103(BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)和得自拟南芥的腈水解酶(FineChemicals，Germany)的数种经冻干的溶胞产物也可用于II到III的转化。将NIT-101、NIT-102、NIT-103和A.thaliana腈水解酶与I在水性反应混合物中接触形成II。利用NIT-101、NIT-102、NIT-103和得自拟南芥的腈水解酶的反应可以在两相反应混合物中，采用0.001-0.04g干重/ml反应体积，优选0.002-0.02g干重/ml反应体积的催化剂浓度来实施。
选择水解反应的温度以最优化反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度可以为仅高于悬浮液的凝固点(约0℃)-60℃，优选的反应温度为5℃ to 35℃。
式I化合物的(3S)异构体的回收和式II化合物的未变化的(3R)异构体的回收可以采用本领域技术人员所公知的合适的分离、离析和纯化技术实施。
在回收的优选方法中，式II化合物的未变化(3R)异构体通过采用有机溶剂(例如，乙酸乙酯)进行萃取从碱性水性反应混合物中分离。式I化合物的(3S)异构体的酸盐优选溶于水层中，并接着通过酸化并采用有机溶剂(例如，乙酸乙酯)萃取而离析。
式I化合物可以用于合成诸如pregabalin的化合物，该化合物可用于治疗如癫痫症、痉挛、焦虑、疼痛和神经退行性失调的失调症，包括，Alzeimer氏症、Huntington氏症和Parkinson氏症。
式I具体化合物的实例是如下化合物：
(S)-3-氰基-5-甲基-辛酸；
(S)-3-氰基-5-甲基-庚酸；
(S)-3-氰基-5-甲基-己酸；
(S)-3-氰基-5-甲基-壬酸；
(S)-3-氰基-5-乙氧基-己酸；
(S)-3-氰基-5-环己基-己酸；和
(S)-3-氰基-5-三氟甲基-己酸。
实施例1
制备2-异丁基-丁二腈
将氰基乙酸乙酯(733g，6.48mol)，异戊醛(613.9g，7.13mol)、哌啶(5.5g，0.065mol)和己烷(0.5L)的混合物回流连续除水。当没有另外的水被收集到时，将混合物冷却并在真空下蒸馏以除去溶剂。将异丙醇(1L)加到剩余的油中，接着加入氰化钾(422g，6.48mol)的水(2L)溶液。在添加氰化钾溶液期间，将反应混合物保持在35℃以下，然后在约35℃下保持4小时。将反应混合物在大气压下蒸馏直到温度达到95℃，然后在这个温度下回流5小时。将反应混合物冷却，用水(0.5L)稀释并用1L甲基叔丁基醚(MTBE)萃取。将MTBE萃取液用水(0.5L)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到873.4g油状2-异丁基-丁二腈。通过真空蒸馏(90℃，在0.275mm Hg下)可以得到2-异丁基-丁二腈的纯化样品。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.93-0.99(m，6H)，1.43-1.50(m，1H)，1.71-1.78(m，1H)，1.81-1.91(m，1H)，2.69(d，2H，J＝6.5Hz)，2.90-2.97(m，1H)。
实施例2
采用NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥腈水解酶由2-异丁基-丁二腈 制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸
在三个8mL螺旋盖的玻璃试管的每个中装入2-异丁基-丁二腈(20mg)，1mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5，2mM二硫苏糖醇(DTT))和10mg选自NIT-101、NIT-102或NIT-103(Biocatalytics Inc.，Pasadena，CA)的腈水解酶。在一个8mL螺旋盖的玻璃试管中装入2-异丁基-丁二腈(20mg)和1mL拟南芥腈水解酶在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.8)(包含100mM乙二胺四乙酸(EDTA)和2mM DTT)中的溶液(Jülich FineChemicals，Jülich，Germany)。将四种反应混合物在30℃下采用磁力搅拌棒搅拌15小时，然后各自采用乙酸乙酯(2×6mL)萃取。在除去乙酸乙酯萃取液后，将水性部分用4N HCl(0.15mL)进行处理并用乙酸乙酯(3×6mL)萃取。将经酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液在真空下浓缩得到7.8mg(34.2％产率)，8.8mg(38.6％产率)，8.1mg(35.5％产率)和4.0mg(17.5％产率)(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)(分别采用NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥(A.thaliana)腈水解酶进行反应)。将由各个反应得到的(S)-3-氰基-5-甲基己酸样品采用过量的(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷进行处理以得到它们的甲酯衍生物并通过气相色谱(GC)在ChiraldexTM G-TA柱(30M×0.25mm ID，125微米膜厚)上分析以确定对映异构体的纯度。NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥腈水解酶反应产物的对映异构纯度分别是96.3％，91.1％，95.5％和98.5％e.e.。(e.e.意指“对映异构体过量”)
实施例3
采用NIT-102由2-异丁基-丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸
在被维持在30℃的125mL加套的反应器中装入2-异丁基-丁二腈(3.33g)，NIT-102(0.5g)和122mL的包含5mM DTT和1mM EDTA的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)(反应缓冲液)。在搅拌12.5h后，将产物混合物用乙酸乙酯(4×50mL)萃取。将乙酸乙酯萃取液除去并将水性部分用4M HCl调整到pH 2.5，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将经酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液合并，用无水MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩得到1.56g(S)-CMHA(41.1％)。将反应产物的样品采用(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷进行处理并通过实施例2所描述的GC分析，得到98.5％e.e.的对映异构纯度。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.93-0.97(m，6H)，1.30-1.37(m，1H)，1.61-1.68(m，1H)，1.82-1.89(m，1H)，2.57-2.63(m，1H)，2.72-2.78(m，1H)，2.98-3.06(m，1H)。
实施例4
采用NIT-102C2由2-异丁基-丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾
在两个被维持在30℃的125mL加套的反应器的每个中装入2-异丁基-丁二腈(6.81g)，NIT-102C2(1.70g)和118.2mL反应缓冲液。在搅拌24h后，将产物混合物轻轻倒出，在反应器中留下酶催化剂。将反应缓冲液(20mL)加到每个反应器中，搅拌约2分钟，然后倒出并加到反应混合物中。通过将2-异丁基-丁二腈(6.81g)和反应缓冲液(118.2mL)加到每个反应器中并将反应混合物搅拌24小时来重复反应。在各个容器中的四个反应完成(总共八个间歇反应)后，将产物混合物合并，并用MTBE(3×500mL)萃取。将MTBE萃取液除去，并将水性部分用磷酸调节到pH 2.1，并用MTBE(2×500mL)萃取。将经酸化的水性部分的MTBE萃取液在真空下浓缩得到油，将该油用水(100mL)和KOH(8.5g)进行处理。将所得溶液在真空下浓缩得到24.2g(31.3％)(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾。(S)-3-氰基-5-甲基己酸甲酯由(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾制备，并通过手性GC分析得到99.1％e.e.的对映异构纯度。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ0.75-0.78(m，6H)，1.18-1.25(m，1H)，1.43-1.50(m，1H)，1.53-1.68(m，1H)，2.28-2.38(d，2H，J＝6.5Hz)，2.86-2.93(m，1H)。
实施例5
采用NIT-102C2在氮气氛下由2-异丁基-丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸
在被维持在30℃的125mL加套的反应器中装入2-异丁基-丁二腈(6.53g)，NIT-102C2(2.61g)，120g反应缓冲液，并用氮气净化。将所得混合物搅拌24小时，然后倒入250mL玻璃瓶中，在反应器中留下催化剂。通过在包含用过的催化剂的反应器中再装入2-异丁基-丁二腈(6.53g)和120g反应缓冲液，用氮气净化，并将所得混合物搅拌24小时来重复反应。将反应样品(0.1mL)与0.4mL水∶甲醇∶三氟乙酸(60∶40∶0.09，v/v/v)混合，并通过HPLC在保持在30℃的SymmetryTMC8柱(150×3.9mm)上分析。该柱采用水∶甲醇∶三氟乙酸(60∶40∶0.09，v/v/v)洗脱，探测采用折光率检测器实施。
全部50个间歇反应采用催化剂再循环实施。将两个连续的间歇反应的产物混合物合并并用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。将水性部分用4MHCl调节到pH 2，并用乙酸乙酯(2×150mL)萃取.将经酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液合并，用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到(S)-CMHA.由50个间歇反应得到总共160.8g(43.2％产率)(S)-CMHA.对于第一个、第二十六个和第五十个反应，初始速率分别为14.8、17.4和15.1mM(S)-CMHA/h.由间歇反应39-50离析出的(S)-CMHA的甲酯衍生物的手性GC分析表明平均对映异构纯度为99.0％e.e.
实施例6
采用NIT-102C2在大气氛中由2-异丁基-丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸
除了该反应在大气氛下实施而不是在氮气氛下实施以外，采用NIT-102C2的2-异丁基-丁二腈到(S)-CMHA的转化的一系列间歇反应如实施例5所述地实施。如实施例5所述，反应样品通过HPLC分析。
全部50个间歇反应在大气下采用催化剂再循环实施。对于第一个、第二十六个和第五十个反应，由在4个小时时取出的样品测定的初始反应速率分别为14.2、13.2和9.3mM(S)-CMHA/h。
实施例7
制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁铵
将由2-异丁基-丁二腈到(S)-CMHA的转化(实施例6，反应37-44)的产物混合物合并，并用乙酸乙酯(2×250mL)萃取。将乙酸乙酯萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到油(32.5g，62.2％产率)，该油主要是(R)-异丁基-丁二腈。水性部分用4M HCl调节到pH 2，并用乙酸乙酯(2×250mL)萃取。将乙酸乙酯萃取液浓缩到体积为470mL，然后在滴加叔丁胺(15.9mL，151.5mmol)的同时搅拌。将形成的白色晶体盐通过过滤收集，并空气干燥整夜得到30.0g(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁铵。(S)-3-氰基-5-甲基己酸甲酯由(S)-3-氰基-5-己基己酸叔丁铵制备并通过手性GC分析表明对映异构纯度为99.5％e.e。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.90-0.94(m，6H)，1.26-1.32(m，10H)，1.54-1.61(m，1H)，1.78-1.88(m，1H)，2.30-2.35(m.1H)，2.43-2.50(m，1H)，2.96-3.04(m，1H)。
实施例8
由(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾制备(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸
将(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾(20g，103.5mmol)，水(50mL)，45％KOH(12g)异丙醇(12g)和Raney镍的混合物在50psi氢气下在Parr Shaker中摇动整夜。将混合物过滤，加热至约50℃，用乙酸(6.5mL)进行处理并在室温下搅拌整夜。然后，将混合物用45％KOH调节到略高于pH 7并在真空下浓缩以除去大部分异丙醇。将异丙醇(20mL)加到混合物中，该混合物然后用乙酸酸化，在室温下搅拌整夜并过滤得到4.3g白色结晶固体状(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸。通过利用Marfey试剂(Nα-(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺)制备(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸衍生物并通过HPLC在BDS Hypersil C18柱(250×4.6mm，5μ)上，采用乙腈∶1％三乙胺(pH 3)(38∶62，v/v)洗脱来分析确定对映异构纯度为100％e.e。
实施例9
由(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁铵制备(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸
将(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁铵(26g，113.9mmol)，水(48.8mL)，乙醇(35.8mL)，KOH(7.2g，91％薄片)和Sponge NickelTM(A-7000，16.3g湿重，Activated Metals&Chemicals，Inc.，Sevierville，TN)的混合物在50psi氢气下Parr Shaker中摇动整夜.将混合物过滤(硅藻土)，并将滤饼用水(10mL)和乙醇(5mL)洗涤.将乙酸(9.4mL)加到滤液中，并将所得混合物在4℃搅拌整夜.将产物过滤，用10mL异丙醇冲洗并在真空下干燥得到11.1g(61％)白色固体.将这个材料的一部分(10.0g)由1∶1的异丙醇和水混合物结晶得到8.8g 100％ee的(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸。
实施例10
利用DBU外消旋化(R)-2-异丁基-丁二腈
(R)-2-异丁基-丁二腈的外消旋化在由外消旋2-异丁基-丁二腈的生物转化(采用NIT-102 C2)回收的材料中实施。将(R)-2-异丁基-丁二腈(1.36g，10mmol，69％ee)，甲苯(5mL)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，0.076g，5mmol)的混合物回流2小时。将水(10mL)加到反应中，并将所得混合物用乙酸乙酯(2×10mL)萃取，将合并的有机萃取液依次采用5％HCl(20mL)和饱和氯化钠水溶液(20mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到外消旋2-异丁基-丁二腈(1.14g，84％)。通过GC，利用ChiraldexTM G-TA柱(30M×0.25mmID，125微米膜厚)确定对映异构纯度。
实施例11
利用 IRA-400外消旋化(R)-2-异丁基-丁二腈
将IRA-400树脂(1g湿重，Rohm&Haas，Philadelphia，PA)用5％NaOH(10mL)搅拌10分钟并用水洗涤直到洗涤物为中性。将乙醇(25mL)和(R)-2-异丁基-丁二腈(69％ee)加到树脂中，并将所得混合物回流2小时。将反应混合物过滤并在真空下浓缩。将残余物用乙酸乙酯(25mL)吸收并用水(3×100mL)洗涤。将有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩得到外消旋2-异丁基-丁二腈(0.81g，81％)。