指示剂分子的非共价固定

摘要

本发明涉及固定方法，特别是用于将指示剂分子固定在载体例如传感器上的固定方法，并涉及具有固定于它们表面的那些分子的传感器。公开了通过机械交织载体表面的互穿聚合物网络和通过指示剂分子的带电部分和载体表面上的离子基之间的离子键合，在那些载体上非共价固定大分子指示剂分子。

权利要求

1.一种用于将大分子指示剂非共价地连接在载体上的方法，其包括：(a)提供包含至少一种聚合物的载体表面；

(b)改变所述聚合物的整体性，以提供形成至少一个交织区的松散的聚合物链；

(c)提供至少一种大分子指示剂或其单体；

(d)使所述大分子指示剂与所述至少一个交织区交织，或使所述单体顺序聚合，以形成与所述至少一个交织区交织的聚合产物；以及(e)拉紧松散的聚合物链，以生成表面固定的指示剂分子。

2.权利要求1的方法，其中在(c)中的所述大分子指示剂分子是部分或完全聚合的指示剂分子。

3.权利要求1的方法，其中所述至少一种大分子指示剂分子的单体在(c)中提供，并在(d)中顺序聚合。

4.权利要求1的方法，其中所述载体表面是疏水性或亲水性的。

5.权利要求4的方法，其中所述载体表面是疏水性的，所述大分子指示剂是亲水性的。

6.权利要求1的方法，其中所述载体是传感器或光波导的表面。

7.权利要求1的方法，其中所述聚合物的整体性通过添加溶剂来改变。

8.权利要求7的方法，其中所述松散的聚合物链通过基本去除所述溶剂来拉紧。

9.权利要求8的方法，其中所述溶剂为乙醇、2-甲氧基乙醇、二甲基甲酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯或它们的混合物。

10.权利要求8的方法，其中所述溶剂为亲水性大分子指示剂的亲水性单体。

11.权利要求10的方法，其中所述亲水性单体与所述大分子指示剂分子的其它单体的聚合拉紧松散的聚合物链。

12.权利要求10的方法，其中所述亲水性单体为甲基丙烯酸-2-羟乙酯或甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵。

13.权利要求11的方法，其中所述大分子指示剂分子的其它单体包括双羧酸双硼酸蒽。

14.权利要求1的方法，其中所述大分子指示剂具有至少一个参比区。

15.权利要求14的方法，其中所述参比区为激基缔合物区。

16.权利要求15的方法，其中所述激基缔合物区为由初始大分子指示剂的三级结构产生的激基缔合物区。

17.权利要求14的方法，其中所述参比区包括至少一种参比分子。

18.权利要求1的方法，其中所述大分子指示剂通过一种或多种交联剂交联。

19.权利要求18的方法，其中所述一种或多种交联剂为二甲基丙烯酸乙二酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、对甲苯磺酸或它们的混合物。

20.权利要求18的方法，其中在所述至少一种大分子指示剂分子与至少一个交织区交织以后，使所述至少一种大分子指示剂交联到另一种大分子指示剂分子上。

21.权利要求18的方法，其中在所述至少一种大分子指示剂分子的单体的顺序聚合期间使所述至少一种大分子指示剂分子交联。

22.一种接枝物，其包括：

包含至少一种聚合物的表面，和

大分子指示剂分子，

其中所述大分子指示剂与载体的至少一种所述聚合物的至少一个链稳定地交织。

23.权利要求22的接枝物，其中接枝物一部分的所述大分子指示剂分子的性质与成为接枝物一部分之前的所述大分子指示剂分子的性质基本对应。

24.权利要求22的接枝物，其中所述表面是传感器的表面。

25.权利要求22的接枝物，其中所述接枝物是顺序IPN。

26.权利要求22的接枝物，其中所述接枝物是IPN。

27.一种用于测定介质中分析物的存在或浓度的基于光学的传感器，所述传感器包括：光学透射的传感器主体，所述传感器主体具有围绕所述传感器主体的外表面，其中所述外表面包含至少一种聚合物；

在所述传感器主体中的放射源，其在所述传感器主体内放射出辐射；

具有受分析物的存在或浓度影响的光学特征的大分子指示剂分子，所述大分子指示剂分子布置在所述传感器主体上，以接收从所述放射源传过来的辐射，并且传输辐射进入所述传感器主体中；

位于所述传感器主体中的感光元件，布置为接收传感器主体内的辐射，并且发射对从所述指示剂元件接收到的辐射做出响应的信号；其中所述大分子指示剂分子与所述传感器主体的所述表面的所述至少一种聚合物的至少一个链稳定地交织。

28.一种用于将大分子指示剂非共价地连接在载体上的方法，其包括：(a)提供包含至少一种聚合物的载体表面；

(b)改变所述聚合物的整体性，以提供形成至少一个交织区的松散的聚合物链；

(c)提供至少一种大分子指示剂或其单体；以及(d)使所述大分子指示剂与所述至少一个交织区交织，或使所述单体顺序聚合，以形成与所述至少一个交织区交织的聚合产物。

29.权利要求28的方法，其中所述方法还包括拉紧松散的聚合物链以生成表面固定的指示剂分子的步骤(e)。

30.权利要求28的方法，其中在(c)中的所述大分子指示剂分子是部分或完全聚合的指示剂分子。

31.权利要求28的方法，其中所述至少一种大分子指示剂分子的单体在(c)中提供，并在(d)中顺序聚合。

32.权利要求28的方法，其中所述载体表面是疏水性或亲水性的。

说明书

指示剂分子的非共价固定

技术领域

[0001] 本发明涉及固定方法，特别地，本发明涉及用于向载体如光学传感器上固定指示剂分子的方法，并涉及在其表面上具有被固定的那些指示剂分子的传感器。

背景技术

[0002] 美国专利5,356,417描述了一种包括指示剂分子和感光元件如光电检测器的基于荧光的传感器。一般地说，在本发明领域的范围内，指示剂分子是其一种或多种光学特征受分析物的局部存在影响的分子。指示剂分子常用于测量广泛的分析物，例如葡萄糖、氧气、毒素、药物或其它药品、激素和其它代谢分析物。通常按照它们的活性所依据的化学要素对这些指示剂分子进行分类。举例来说，许多指示剂如其公开内容通过引用结合在此的美国专利6,344,360中所描述的一种指示剂的活性是基于发光、特备是荧光的要素。美国专利6,344,360描述了一种包含镧系金属螯合物的荧光指示剂分子，其荧光发射强度随某些糖的存在增加。其它种类的指示剂分子包括在分析物存在时改变其颜色的比色指示剂分子，以及在特定波长下改变吸光度的指示剂分子。

[0003] 指示剂分子在它们的化学组成和性质方面广泛变化。例如，指示剂分子可以是单体的或聚合物的，和/或亲水性的或疏水性的。

[0004] 通过将指示剂分子连接在载体的表面上，指示剂分子被固定在载体如传感器的表面上。在惰性聚合物基材上固定指示剂分子带来了特殊的挑战，因为不得不改变或选择那些基材，以产生或提供用于指示剂分子的连接点。

[0005] 可以用不同的方法将分子固定在基材上：固定通常基于基材和固定分子之间的共价链接。为了促进固定，一般避免采用惰性基材，因为那样需要进行预处理，例如用UV或用苛性酸(harsh acid)如硝酸进行处理，以获得基材的氧化，由此产生活性部位。这些预处理通常伴随着不理想的情况，例如产品固定的不稳定或苛性酸的处理。因此，通常选择更容易改良的载体如聚丙烯酰胺载体，以连接感兴趣的分子。聚丙烯酰胺载体可以通过例如连接活性胺基而方便地被改性，这使得可以连接包括半抗原、肽、糖类和低聚核苷酸的多种分子。

[0006] 在光学传感器上对诸如指示剂分子的分子进行固定带来了一些独特的挑战。例如，重要的是所述固定方法不妨碍光学传感器的功能。而且，某些固定方法可能导致载体变色，并因此而妨碍其功能，例如光波导。已知的固定方法还可以改变表面的光学性质，例如通过造成表面起泡或波纹而由此破坏传感器的光程，或对材料性质造成不利的影响。因此存在对于将指示剂分子固定在固定基材上的方法进行改进的不断需求。这种需求在向传感器主体、特别是向用作长期移植物的光学传感器主体上固定指示剂分子时尤其显著。

发明内容

[0007] 在第一方面，本发明涉及将大分子指示剂分子非共价地连接在载体上的方法。这种方法包括(a)提供包含至少一种聚合物的载体表面，(b)改变所述聚合物的整体性(integrity)，以便提供形成至少一个交织区(interlacing area)的松散的聚合物链，(c)提供至少一种大分子指示剂或其单体，(d)使所述大分子指示剂或其单体的聚合产物与所述交织区交织在一起，并且(e)拉紧松散的聚合物链，以生成表面固定的指示剂分子。在本发明的该第一方面，(c)中的所述大分子指示剂可以是部分或完全聚合的指示剂分子。或者，(c)中的至少一种大分子指示剂分子的单体可以在(d)中顺序聚合，形成顺序IPN(互穿聚合物网络)。

[0008] 可以通过溶剂，例如乙醇、2-甲氧基乙醇、二甲基甲酰胺、亲水性大分子指示剂的单体如HEMA或其混合物来松开聚合物链。还可以分别通过溶剂的去除或通过所述单体聚合进入亲水性大分子指示剂来拉紧聚合物链。在本发明的此方面，载体表面可以是疏水性的，大分子指示剂分子可以是亲水性的。所述载体可以是传感器或光波导的表面。大分子指示剂可以有一个或多个参比区。这些参比区可以是激基缔合物区，或可以包含或由至少一种参比分子组成。该大分子指示剂分子还可以包含一种或多种交联剂，所述交联剂其后使载体中的大分子指示剂分子交联。

[0009] 在第二方面，本发明涉及一种接枝物。该接枝物优选包括一种包含至少一种聚合物和大分子指示剂分子的表面。该接枝物的特征在于，所述大分子指示剂分子稳定交织于所述载体的至少一种聚合物的至少一个链之间。根据本发明的一个实施方案，所述接枝物中的大分子指示剂分子具有与不是接枝物一部分的相同大分子指示剂分子(初始分子)的性质基本一致的某些性质。这些性质可以包括但不限于与分析物或其参比区如激基缔合物区的分子亲和力，在所述初始分子中，该亲和力可以是分子的一级和/或三级结构的结果。所述接枝物的表面可以是传感器。

[0010] 在第三方面，本发明涉及将指示剂分子非共价地连接在传感器上的另一种方法。该方法包括(a)提供具有包含至少一种强离子基的表面的载体，(b)向所述表面添加至少一种包含至少一种具有与所述离子基的电荷相反电荷的带电残基的指示剂分子，(c)通过所述载体的离子基和所述至少一种带电残基之间的离子键合将所述指示剂分子固定在载体上。举例来说，该离子基可以是阴离子基，特别是磺酸盐基。所述至少一种带电残基，例如，可以是一种带正电荷的残基。所述离子基可以是，例如磺酸盐和甲基丙烯酸甲酯共聚物的一部分，该共聚物在所述载体的表面上形成涂层。

[0011] 在第四方面，本发明涉及一种用于测定介质中分析物的存在或浓度的传感器。所述传感器包括优选具有围绕传感器主体的聚合物外表面的传感器主体，以及大分子指示剂分子，该指示剂分子对所述介质中的分析物的存在做出响应而改变至少一个可测量特征。所述传感器还包括检测器，其检测来自指示剂分子的发射，并产生反映所述指示剂分子的至少一种特征变化的电信号，其表示被分析物的存在或浓度。在该传感器中，所述大分子指示剂分子可以稳定交织在所述传感器表面的至少一种聚合物链的至少一个链之间。所述传感器可以是一种适合于检测介质中的一种或多种感兴趣的分析物如葡萄糖的光学传感器。
在优选的实施方案中，所述传感器的表面可以由聚甲基丙烯酸甲酯制得。

附图说明

[0012] 这里所引入的和构成说明书一部分的附图举例说明了本发明的各种实施方案，并且与说明书一起，进一步用于解释本发明的原理，并使本领域的技术人员能够制造和利用本发明。在附图中，相同的参考数字表示功能相同或相似的元件。另外，参考数字最左边的阿拉伯数字表示参数数字第一次出现的图。

[0013] 图1A和1B所示为根据本发明的水溶性大分子指示剂分子的一级和三级结构的示意图。

[0014] 图2A和2B所示为根据本发明的一个实施方案的用于固定指示剂分子的固定载体。

[0015] 图3A至3C所示为通过添加溶剂的固定载体表面的交织区的产生。

[0016] 图4A和4B所示为聚合的大分子指示剂分子穿过交织区的扩散和拉紧该交织区的机理。

[0017] 图5A和5B所示为包含一个或多个带正电部分和激基缔合物区的大分子指示剂分子。

[0018] 图6A至6C所示为采用本发明一个方面的离子基的共聚物涂敷载体的机理。

[0019] 图6D所示为在图6A至6C所示机理中的最终产物。

[0020] 图7A至7C所示为携带分布在整个分子上的正电荷的大分子指示剂分子如何连接于在其表面上具有阴离子基的传感器主体上。

[0021] 图8A至8C所示为携带末端正电荷的大分子指示剂分子如何连接于在其表面上具有阴离子基的传感器主体上。

具体实施方式

[0022] 诸如传感器器件的指示剂分子的载体必须满足某些设计要求。就光学传感器外壳而言，通常需要的是半透明性和耐久性。因此，可以由可作为光波导材料制成的载体的表面常常具有完全不同于需要连接于所述表面的指示剂分子性质的一组性质。这组性质通常也不同于传感器的操作环境。例如，载体常常是非常疏水性的(例如为了保护传感器中的微电子体)，而指示剂分子可以是非常亲水性的。假如在水介质中检测到分析物，这就是特别理想的。本发明的某些实施方案旨在获得包括大分子指示剂分子的指示剂分子的有效固定，而不管载体和指示剂分子的不同性质，并且不会不利地影响所述指示剂分子的性能。本发明的某些实施方案事实上利用了这些差异，并增强了它们和/或甚至造成它们来完成固定。

[0023] 在本发明的范围内可以使用多种指示剂分子。本发明的指示剂分子是具有至少一种特征如荧光性受分析物的局部存在影响的分子。这种指示剂分子的活性可以基于任何一种的以下要素，其包括但不限于发光如荧光和磷光、吸光度或比色。本发明的指示剂分子包括单体分子以及大分子指示剂分子，例如水溶性的大分子指示剂分子。例如，在本发明范围内可以使用在美国专利申请10/187,903和美国专利公布2002/0127626或2003/0082663中所描述的化合物，其具有至少两个用于葡萄糖识别的部分。另外，在本发明范围内还可以使用在美国专利6,344,360中所描述的荧光镧系金属络合物或美国专利5,503,770中的荧光苯基硼化合物(phenylboronic compound)。这些专利和申请的公开内容通过引用结合在此。然而，作为本领域的技术人员可以理解，也可以使用任何其它合适的指示剂分子。

[0024] 本发明的指示剂分子通常可专用于一种或多种分析物。例如，在优选的实施方案中，所述指示剂分子可专用于葡萄糖。在其它的实施方案中，所述指示剂分子可专用于氧气、二氧化碳、氧化氮、毒素、pH、离子和单价或二价阳离子。然而，作为本领域的技术人员可以理解，本发明可以检测和/或测量各种其它的分析物。

[0025] 在本发明的某些实施方案中，例如在上面所提到的专利和申请中所描述的那些单体分子通过在膨胀基材聚合物存在下的聚合，或通过连接到聚合物上而可以转变成包括水溶性大分子指示剂分子的大分子指示剂分子。本发明的“大分子指示剂分子”或“大分子指示剂”是作为指示剂分子的分子，并且是例如部分或完全聚合形成的，例如，与一种或多种其它类型的分子共聚合形成的大分子。本发明范围内的聚合物包括单体、复合物或简单复合物及低聚物的任何聚合产物。本发明的“水溶性大分子指示剂分子”(WSMIM)是所有基本上亲水性的大分子指示剂分子。为了获得WSMIM，可以将合适的识别单体与亲水性单体共聚合。合适的亲水性单体包括但不限于甲基丙烯酰胺、某些甲基丙烯酸盐、乙烯基化合物、多糖、聚酰胺、聚氨基酸、亲水性硅烷或硅氧烷、HEMA(甲基丙烯酸羟乙酯)或其它普通的水凝胶组分、以及两种或多种不同单体的混合物。通过引用结合在此的美国专利公布2003/0013204、2003/0013202、2003/0008408、2003/0003592、2002/0039793和美国专利申请10/187,903中描述了通过单体指示剂分子与亲水性单体共聚生成的大分子指示剂分子的实例。

[0026] 合适的亲水性单体的特性和比率可以根据例如在专利公布2003/0013204中所描述的许多因素改变。在一个优选的实施方案中，水溶性大分子指示剂分子是甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)和双羧酸双硼酸蒽(bis-carboxylate bis-boronate-anthracene)的共聚物。在又另一个优选的实施方案中，水溶性大分子指示剂分子是甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵(MAPTAC)和双羧酸双硼酸蒽以约5∶1至80∶1的比例的共聚物。

[0027] 在一个优选的实施方案中，本发明的大分子指示剂分子具有参比区如激基缔合物区，其也被称作激基缔合物发射区。本发明的“激基缔合物区”是指提供激基缔合物作用的大分子指示剂分子的区域。顺序特殊的激基缔合物区作为分子的一级结构的直接结果存在。然而，它的三级结构(3-D构型)的采用可以引起分子中额外的激基缔合物区。本发明范围内的“激基缔合物作用”是指具有激基缔合物区的分子所特有的较长波长的发射。例如，通过引用结合在此的美国公开2003/0013204中描述了激基缔合物作用的分子基础。

[0028] 正如其中所描述的，激基缔合物区对分析物的浓度变化没有响应，但是对被分析系统的其它方面如激发强度、温度和pH有响应。因此，具有激基缔合物区的指示剂分子既用作指示剂又用作内标。例如，指示剂波长(即受分析物影响的波长)的发射强度可以通过选择带通滤波器而在光学上与以激基缔合物波长发射的强度分离开。所得数值校正影响荧光发射性质的干扰因素，例如由于氧气、漂移、光致退色、劣化和pH错误而导致的荧光熄灭等。当在任何的长期活体中的应用环境条件必须经常变化时，具有激基缔合物区的指示剂分子对涉及长期移植的应用特别有用。因此，具有激基缔合物区的分子是本发明优选实施方案的一部分。通过引用结合在此的美国专利公开2003/0013204、2003/0013202、2003/0008408、2003/0003592和2002/0039793描述了这种分子的实例。

[0029] 在本发明的另一个实施方案中，大分子指示剂分子包含一种或多种参比分子。所述参比分子是例如荧光分子，其以不同于各自指示剂分子的波长发射，并且对被分析物浓度的变化没有响应，但是对被分析系统的其它方面，例如激发强度、温度和pH有响应。

[0030] 图1A和1B所示分别为本发明的代表性WSMIM 100的一级结构和三级结构。这种分子的三级结构通常由最低的能量构型支配，该构型可以在水性环境中获得。在所显示的实施方案中，所述分子具有激基缔合物发射区101，其中一些是通过分子102的折叠产生的。在这些激基缔合物的发射区中，芳烃结构的两个平面分子(例如荧光团)是以共面构型取向的，并且具有重叠的π电子轨道。这导致以不同于原始物种103典型波长的一种或多种波长的发射。例如，与比非耦合物种在基本上更低的能量波长上的非耦合物种的发射相比较，荧光平面物种发生了特征的低磁场发射。如上所述，这种特征发射可用于补偿易变的环境条件。

[0031] 在本发明的某些实施方案中，在适当的pH下具有至少一个带强正电荷或负电荷部分的指示剂分子为优选。使得所述部分能够携带强的负电荷或正电荷的所述pH直接取决于所述部分的特性。在优选的实施方案中，可以根据使用指示剂分子的环境选择所述部分。因此，在优选的实施方案中，“合适的pH”可以是环境选择中的主导pH。由此，在优选的实施方案中，对于浸没在主要为中性的身体流体中的活体内的传感器应用而言，中性pH下为强离子的指示剂分子为优选。例如，在pH值接近中性时，胺部分是带强正电的，并且可以与在该pH下带强负电的磺酸盐形成强的离子键。

[0032] 所述指示剂分子可以是在合适的pH下固有地包含带强正电荷或负电荷部分的指示剂分子，或是已经被改性为包含这种部分的指示剂分子，例如，通过将它们连接到包含一种或多种带强正电荷或负电荷部分的分子，例如MAPTAC或2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵上。

[0033] 图5A和5B所示为包含一个或多个带强正电荷部分的代表性的阳离子大分子指示剂分子。特别地，图5A举例说明了包含多个带强正电荷部分511的阳离子大分子指示剂分子510。图5B举例说明了包含一个带强正电荷部分522的阳离子大分子指示剂分子520。图5A的分子带正电荷是由于许多带正电荷部分如胺部分分布在整个分子510上。与此相反，图5B的分子仅包含例如以胺部分形式存在的末端正电荷522。正如在两个图中用字母“n”所表示的，所述分子基本上可以比在这些图中所描述的更长。举例说明的指示剂分子还具有在所述分子的一级结构中存在的激基缔合物发射区101。使用具有这种区域的指示剂分子的优点已经在上面有了描述。

[0034] 在优选的实施方案中，其上固定有指示剂分子的载体(下文称作“固定载体”)为传感器。合适的传感器的实例描述于其公开内容通过引用结合在此的美国专利5,517,313；5,910,661；5,894,351中。合适的可移植传感器的实例公开在美国专利6,330,464；
6,011,984；6,304,766；6,400,974和美国专利申请公开2002/0026108中，其公开内容通过引用结合在此。然而，本领域的技术人员可以理解，可以使用其它的传感器。

[0035] 在优选的实施方案中，固定载体可以由光学透射的聚合物材料制备。优选的聚合物材料包括但不限于丙烯酸系聚合物，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚苯乙烯和例如以商品名LEXAN出售的那些聚碳酸酯。最优选的材料是PMMA。

[0036] 根据本发明，可以在多个领域内使用具有指示剂分子与它们相连接的传感器和载体。例如，它们可以用来检测在生理缓冲剂或流体如血液、血浆、血清、间质液、脑脊髓液、尿、唾液、眼内流体、淋巴液、眼泪或汗中的低含量或高含量的葡萄糖，这样为诊断或监测如糖尿病和肾上腺功能不全这样的疾病提供有价值的信息。其它用途已经在别处描述，例如在美国专利申请2003/0082663中。然而，根据本发明，具有指示剂分子与它们相连的传感器和载体特别可用于长期在活体内使用，例如作为长期的移植物。

[0037] 图2A和2B举例说明了在本发明范围内可以使用的典型的固定载体。特别地，图2A和2B所示为包含代表性光电感应器件的微电子体205的聚合物包装物204。该微电子体205可以包括微电子元件如放射源202和检测器201。在一个优选的实施方案中，放射源
202为LED，但可以使用其它的放射源。还有，在一个优选的实施方案中，检测器201是光敏元件(例如光电检测器)，虽然可以使用其它的检测器。可以包含在代表性的光电传感器中的微电子体描述在美国专利6,330,464中，其公开内容通过引用结合在此。

[0038] 如图2B中更详细地显示的，固定载体的表面206包括聚合物结构207，例如被交织和缠绕的PMMA链。在本发明的一个实施方案中，这种聚合物结构给它的周围提供了坚固的、结实的、疏水性的边界，并且这种聚合物结构对反应是惰性的。

[0039] 在本发明的某些方面，大分子指示剂分子与载体相互交织，并且基本上不影响其性质，特别是它与分析物和/或其参比区如激基缔合物区的亲和力，该亲和力在初始分子中是所述分子的一级或三级结构的结果。维持指示剂分子的性质可以确保指示剂分子的检测能力不会受到不利的影响。在另一个优选的实施方案中，所述大分子指示剂分子通过采用使其分析物粘合区很容易被接近的方法连接到载体上。

[0040] 在一个优选的实施方案中，本体载体材料特性在固定后也基本上被保持。这样就可以确保所述载体的初级功能例如作为微电子体包装物不受固定的负面作用。在优选的实施方案中，这个目标是通过依靠用于固定的非共价机械交错而获得的。

[0041] 在另一个优选的实施方案中，以可以以将分析物的扩散距离保持在相当低的方法将指示剂分子与载体联结。例如，将分析物的扩散距离保持在约200微米或以下，优选在150微米或以下，更优选在125微米或以下，或可以将分析物的扩散距离保持在约80微米或以下，更优选小于约50微米，在某些情况下，可低至约1微米。保持扩散距离相对较低可以保持传感器对被连接的指示剂分子的响应时间相对较短。例如，响应时间可以是低于约
8分钟，优选低于约6分钟，更优选低于约5分钟。在一个用于水介质中的葡萄糖检测的非限制性实施方案中，约100微米或更小的扩散距离和约5分钟或更短的响应时间可以是理想的。在另一个用于氧气的检测的非限制性实施方案中，约50微米的扩散距离和约50毫秒的响应时间可以是理想的。维持指示剂分子的响应时间相对较低可以使得例如在传感器的情况下能够接近于实时监控特定分析物的浓度和/或存在。

[0042] 在本发明的一个方面，待固定在载体上的大分子指示剂分子可以是亲水性的。在本发明该方面的一个优选实施方案中，当固定在载体上后基本上保持所述大分子指示剂分子的亲水性。在另一个优选的实施方案中，以维持大分子指示剂具有足够亲水性的微环境，优选允许以具有自由及饱和的扩散通道进入整个大分子指示剂大部分的足够大的亲水性的方法，使所述大分子指示剂与载体联结。在本发明该方面的又一个优选的实施方案中，以最小化疏水性载体材料对分析物的扩散距离所施加的任何疏水性影响的方法使所述大分子指示剂与载体材料联结。在还另一个优选的实施方案中，在固定以后使大分子指示剂向外面取向进入周围的水介质中。上面的实施方案将确保所述载体-指示剂结构可以完好地适合于检测水性环境中的分析物。

[0043] 在光学感应器件中，通常理想的是具有清晰的光程和能够使传感器曝光于宽范围的波长中。因此，本发明的一个实施方案包括在不引入光学杂质下在传感器上固定指示剂分子的方法。在本发明的另一个实施方案中，固定的指示剂分子对于将曝露的任何波长的光的降解有耐受性。

[0044] 有关固定指示剂分子的高产量生产，通常理想的是生产方法可以是有效率并可以放大的，并且该固定的指示剂可以承受生产压力。因此，在本发明的一个实施方案中，就放大下的指示剂使用(固定反应产率)而言，所述固定方法是高效的。在本发明的另一个实施方案中，固定方法可以容易地放大，并且所述载体-指示剂构造可以在高的生产率下制造。在本发明的又一个实施方案中，所述载体-指示剂构造可以抵挡生产操作过程中将要接触的杀菌方法和洗涤循环。

[0045] 在高度敏感的应用例如在用于活体内应用的传感器中，通常理想的是产品质量是始终如一的。因此，在本发明的一个实施方案中，所述固定方法使得具有高度的“一致性”，以确保器件与器件在标定和信号处理方面的一致性。

[0046] 尤其是在长期应用如传感器移植物中，重要的是指示剂不会负面影响其环境或不因主要的环境条件而失去活性。因此，在本发明的一个方面，固定的指示剂分子与传感器包装物/波导的固体表面呈现密切直接的联系中，以防止指示剂显著地浸出并进入局部环境中。在另一优选实施方案中，固定的指示剂分子基本上耐受活体内的降解。在还另一个本发明的优选实施方案中，载体-指示剂分子构造具有足够的机械整体性，可以抵挡其在计划使用的环境中的预期的力。

[0047] 在本发明的一个方面，可以通过将大分子指示剂与载体上的聚合物结构交织形成接枝物而将大分子指示剂分子连接到载体上。在本发明的范围内，“接枝物”是一种IPN(互穿聚合物网络)，其可以通过至少一种大分子指示剂分子和至少一部分优选位于接近载体网络的表面的聚合物链形成。在本发明的范围内，IPN是两种或多种聚合物的结合，其中至少一种是在它们之间没有任何共价键的其它直接存在下合成和/或交联的。如下面更详细描述的，在优选的实施方案中，本发明的IPN可以通过导致顺序IPN的顺序聚合而制得。在另一个优选的实施方案中，本发明的IPN通过将部分或完全聚合的大分子指示剂分子与载体的聚合物结构交织而制得，从而导致在本发明范围内的互穿聚合物网络(“IPN”)。

[0048] 在生产接枝物中的第一步是在载体表面上产生交织区。本发明的“交织区”可以是接近载体表面的区域，其中载体的聚合物链已经被松开，并可以与部分的或完全聚合的大分子指示剂分子相互交织或进行顺序互穿聚合。

[0049] 可以用不同的方法制备交织区和接枝物。例如，在一个实施方案中，松开载体表面上的聚合物链，通过还作为载体材料溶剂的大分子指示剂分子的单体组分，优选亲水性单体组分如HEMA(甲基丙烯酸2-羟乙酯)以形成交织区。在本发明该方面的一个优选实施方案中，通过使导致聚合物链在载体表面上松开的大分子指示剂分子的亲水性单体组分聚合而形成接枝物，同时其剩余的组分最后形成大分子指示剂分子。通过使聚合穿过交织区形成顺序IPN而得到交织。所述聚合在载体和聚合的大分子指示剂分子之间产生机械连锁。大分子指示剂分子组分的聚合还导致松散的聚合物链之间的相互连锁。根据一个实施方案，可以例如结合图4A和4B中所描述的拉紧聚合物链。例如，可以通过溶剂的去除、干燥或其它手段，获得聚合物链的拉紧。

[0050] 在本发明的优选实施方案中，聚合反应包括自由基引发剂，例如，VA-044(WAKO Chemical Co.，日本)。在又另一个优选的实施方案中，可以将一种或多种交联剂，例如，EGDMA(二甲基丙烯酸乙二醇酯)、TMPTMA(三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯)或对甲苯磺酸添加到聚合反应混合物中，以交联载体内的大分子指示剂分子。在优选的实施方案中，大分子指示剂分子的交联形成环，同时松散的载体材料形成另一个环，其与大分子指示剂分子(们)的环互相连锁。

[0051] 接枝物内的大分子指示剂分子的交联目的在于获得较高全面可靠性的指示剂分子的连接。在又另一个优选的实施方案中，聚合反应可以在模具如DELRIN 模具中进行，其类似于图6A至6D中所示。

[0052] 在举例说明于图3和4中的本发明的另一个实施方案中，接枝物通过首先用溶剂松开载体材料，并使部分或完全聚合的大分子指示剂分子与载体材料上的单体混合物的交织区相互交织形成。在一个实施方案中，交联剂被添加到溶剂和大分子指示剂分子的混合物中，并使大分子指示剂分子彼此连接。同时该交联可以在交织之前发生，在某些实施方案中，该过程将在交织已经发生后继续进行，由此提供额外的稳定性。

[0053] 图3A举例说明了具有用于作为固定载体的微电子体205的聚合物包装物的传感器204。图3B是这种聚合物包装物的表面206的分解图。在此实施方案中，所述表面包括紧密交织和缠绕的长链聚合物例如PMMA。从图3B至图3C的箭头指示显示了包装物材料的表面从紧密交织结构到多环结构的转变。在优选的实施方案中，环308构造了交织区。这种转变通过用溶剂处理表面来完成，该溶剂可以是但不限于乙醇、2-甲氧基乙醇、DMF(二甲基甲酰胺)、HEMA或其混合物。然而，根据所选择的载体材料，本领域的技术人员可以理解，可以使用任何其它的可以处理载体表面以形成交织区的材料。

[0054] 图4A所示为具有交织区308的载体206的表面，交织区可以用例如在图3A至3C中所显示的方法产生。图4A还显示了例如大分子指示剂分子100的大分子。在交织区形成物质的同时，或在适当的交织区形成物已经在载体上产生了交织区后，将大分子添加到包含这种载体的反应容器中。通过例如简单的扩散，大分子100与交织区308交织。为了使大分子指示剂分子基本均匀地交织在载体的整个表面如在美国专利6,330,464中所描述的豆形传感器器件上，使扩散能够进行下去。在优选的实施方案中，大分子指示剂和载体在交织区形成物中都是至少部分可溶的。在一个实施方案中，大分子指示剂分子在与交织区相互作用的时候被部分聚合。

[0055] 在另一个实施方案中，大分子指示剂分子在与交织区相互作用的时候被完全聚合。在图4A和4B之间的箭头显示了随着载体材料207基本上回复到其原始的拉紧构造时大分子100在载体表面上的牢固固定。在此过程中，如图4B所示，大分子100被捕获并因此而牢固地固定在载体材料的表面上。在优选的实施方案中，通过积极地除去交织区产生物来完成这个过程。

[0056] 在本发明的另一个实施方案中，在整个时间内蒸发交织区产生物。在还另一个实施方案中，在氧的存在下干燥载体以减慢聚合反应，聚合反应被氧气阻聚，并因此而促进大分子指示剂分子穿过交织区的扩散。

[0057] 在本发明的另一个方面，可以通过离子键将指示剂分子固定在载体上。离子键基于离子的静电引力。

[0058] 具有离子电荷的合适指示剂分子已经在上面描述了。那些指示剂分子可以是单体的或聚合物的。图5A举例说明了合适的大分子指示剂分子510，其具有分布于整个指示剂分子上的电荷511。由于大量的带正电荷的部分511如胺部分分布于整个分子上，所以所述分子是带正电的。与此相反，图5B举例说明的分子520仅包含末端正电荷522。然而，如上所述，在本发明的范围内可以使用在合适的pH范围内携带正电荷或负电荷的任何指示剂分子。在优选的实施方案中，在约为中性的pH下携带强正电或负电的指示剂分子为优选。

[0059] 根据本发明，以上已描述了用于通过离子键合固定指示剂分子的合适的载体材料，其包括例如PMMA。然而，可以使用在合适的pH范围内为离子的任何载体材料。这样的载体材料通常不是在此pH范围下具有固有离子性的，但可以是在此pH范围下具有固有离子性的。一般地，可以将载体材料改性成为离子性的。例如，可以将载体材料改性成为在确定的pH范围内携带与被连接到其上面的适当指示剂分子电荷相反的电荷。在一个实施方案中，已与甲基丙烯酸甲酯(MMA)共聚合的磺酸盐类通过离子交换树脂领域的已知方法被共价地连接到非离子载体上。在本发明的范围内还可以使用不同于磺酸盐基类的离子基。例如，在本发明的范围内可以使用其它合适的强阴离子基，例如但不限于甲基磺酸盐基、磺酸基、磺基异丁基和磺基乙基。在本发明的范围内可以使用强阳离子基，例如但不限于季铵、季胺、三甲铵甲基和二甲基乙醇胺。在优选的实施方案中，在约中性的pH下所述基团是离子性的。在以上所描述的优选实施方案中，尽管离子基可以共价地连接到载体上，但可以通过用磺酸盐和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的共聚物涂覆载体提供离子基，或者在某些实施方案中，通过玻璃或像玻璃的涂层。然而，在本发明的范围内可以使用其它的聚合物，如丙烯酸酯共聚物。

[0060] 图6A至6D举例说明了根据本发明一个实施方案的涂覆载体的方法。图6A举例说明了豆形传感器600和具有内表面612的模具611，其尺寸可以近似于匹配传感器600的形状。如图6B中所示，当将传感器600插入模具611中时，小缝隙613余留在传感器表面606和模具的内表面612之间。图6C显示了包含离子交换剂基团的涂料614如MMA-磺酸盐共聚物如何被添加到模具中以填充该缝隙。然后例如通过加热固化该涂料，以产生经涂敷的传感器器件615，如图6D中所示。图6D所示为具有强阴离子涂料614的传感器器件
615。如上面所讨论的，涂料的阴离子基可以与指示剂分子的阳离子基如胺基形成离子键，然而，本领域的技术人员可以理解，可以用各种方法涂敷该涂料，其包括但不限于浸渍或喷涂。

[0061] 图7A至7C举例说明离子键的形成及所导致的带正电荷的大分子指示剂分子在传感器主体表面上的固定。特别地，图7A显示了具有均匀地分布于其表面上的阴离子基616的涂料614的器件615。图7B描述了具有均匀地分布于分子上的正电荷511的大分子指示剂分子510。一方面，在传感器载体上的负电荷616以及在大分子指示剂分子510上的正电荷511的引力以简单的离子交换反应使大分子指示剂分子固定在载体的表面上。这样，通过使大分子指示剂分子与具有维持载体的强阴离子电荷和指示剂分子的强阳离子电荷的pH值溶液中的载体接触，所述大分子指示剂分子可以如图7C中所示被固定在载体上。因为大分子指示剂分子具有分布于分子主体上的正电荷，所以这些正电荷可以与载体717上的多个负电荷形成键合。

[0062] 图8A至8C所示为类似于图7A至7C中所示的固定过程。然而，大分子指示剂分子520仅携带一个与图7B中所示分子的分子整个主体上的正电荷相对应的末端正电荷522。
因此，当经过离子交换反应将图8B的大分子指示剂分子连接到阴离子基材615上时，通过每个指示剂分子中的末端正电荷与载体上各个带负电的基团之间的离子键，所述指示剂分子被连接到基材末尾的818上。

[0063] 实施例I

[0064] 下面描述了根据本发明的一个实施方案制备接枝物的方案的实施例：

[0065] 提供包括HEMA(95.8％)、作为交联剂的EGDMA(二甲基丙烯酸乙二醇酯)(0.2％)和丙烯酸(4％)的溶液A。将荧光单体指示剂分子如双羧酸双硼酸蒽以14mg/ml(至多约28mg/ml)添加到溶液A中，以产生“溶液1”。然后将300μl溶液1添加到700μl蒸馏过的去离子水中，以产生“溶液2”(白色凝胶)。将33.6μl的10％(100mg/ml)的VA-044(Wako Chemical Co.，日本)(水溶性自由基引发剂分子)溶液添加到“溶液2”中得到“溶液3”。

[0066] 在此同时，在UVOCS(T0606型臭氧室)中将在此情况下为PMMA芯体的固定基材曝露于臭氧中30分钟，以在它的表面产生羟基以促进润湿。向两部分的DELRIN 模具的界面涂敷薄层的旋塞润滑脂。将模具的两半合起来，并用三个软管夹(9-22.2mm)锁在一起，模具的底孔用橡胶隔膜塞紧。用200μl的溶液3装填该模具。选择传感器模具的内部尺寸，在此情况下为0.203″ID模具，以确保接枝物为约100微米厚。将臭氧处理过的PMMA芯体插入模具中，以便传感器的外圆角首先进入模具，传感器光学器件面对模具的壁并垂直于模具接缝，同时避免气泡的形成。然后密封该模具。在约50℃下加热约1至24小时，优选3至16小时，产生白色的凝胶聚合物接枝物。在50℃下延长一段时间如3小时内的加热过程中，HEMA单体具有渗透PMMA的时间，并可以发生与PMMA聚合物交织以产生IPN(互穿聚合物网络)。随后将该PMMA芯体从该模具中取出，并放置在PBS(磷酸盐缓冲盐水)存储中。

[0067] 实施例II

[0068] 下面描述了根据本发明的另一个实施方案制备接枝物方案的实施例：

[0069] 将500mg的单体指示剂分子，例如双羧酸双硼酸蒽添加到5g包含HEMA和丙烯酸(90∶10；w/w)的溶液中以产生“溶液1”。然而，可以改变单体的相对摩尔比率以获得不同的总亲水性，并控制激基缔合物区的存在。单体指示剂分子和亲水性单体的相对浓度可以是例如750mg-250mg指示剂与5g溶液A。以1重量％添加催化大分子指示剂分子聚合的自由基引发剂AIBN(2，2′-偶氮基二异丁腈，98％)至“溶液1”中以产生“溶液2”。以1∶10的重量比混合“溶液2”与包含乙醇和2-甲氧基乙醇(70∶30，w/w)的溶液，以产生“溶液3”。添加包含乙醇和2-甲氧基乙醇的溶液以使聚合反应发生，并最后通过处理使PMMA的表面产生交织区。在氮气下(以驱散阻聚预聚合反应的氧气)在约56℃下加热“溶液3”约24小时，活化AIBN引发剂并导致单体聚合产生聚合物。所得到的“溶液4”通常包含不同长度的聚合物以及未反应的单体。将“溶液4”与交联剂对甲苯磺酸(0.333％w/w)混合。在黑暗中将该混合物放置2小时以产生“溶液5”。将PMMA芯体浸在“溶液5”中，然后在曝露于空气下的黑暗中放置24小时。在100至110℃下固化PMMA芯体3小时以除掉剩余的溶剂。在洗涤和修整步骤中洗掉过量的还没有机械固定在表面上的反应物。

[0070] 尽管上面已经描述了本发明的各种实施方案/变化，应当理解的是它们仅是作为非限制性实例而提出的。因此，本发明的外延和范围不应为上面所描述的任何示范性的实施方案所限制，而仅可以根据以下的权利要求和它们的等同物来限定。