具有改良的生长特性的植物及其制备方法

摘要

本发明涉及通过改变NAP1-样蛋白的编码核酸序列的表达来改良植物生长特性的方法。本发明也涉及具有改良生长特性的转基因植物，所述具有改良生长特性的转基因植物具有NAP1-样蛋白编码核酸的改变表达。

权利要求

1.相对于对应的野生型植物，增加植物产量的方法，其包括向所述植物中引入遗传修饰并在所述植物中筛选核酸序列的增加表达，所述核酸序列选自：(i)由SEQ ID NO：1表示的核酸或其互补链，(ii)编码SEQ ID NO：2的核酸，(iii)在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的核酸杂交的核酸，其编码包含NAP结构域和酸性C-末端并具有PP2a磷酸酶抑制活性的蛋白质，其中所述严格条件是在60℃，

0.1-1×SSC/0.1％ w/v SDS进行杂交1-3小时，以及(iv)作为遗传密码简并结果的根据以上(i)至(iii)的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述遗传修饰包括向植物中引入分离的核酸序列，其中所述核酸序列选自：(i)由SEQ ID NO：1表示的核酸或其互补链，(ii)编码SEQ ID NO：2的核酸，(iii)在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的核酸杂交的核酸，其编码包含NAP结构域和酸性C-末端并具有PP2a磷酸酶抑制活性的蛋白质，其中所述严格条件是在60℃，

0.1-1×SSC/0.1％ w/v SDS进行杂交1-3小时，以及(iv)作为遗传密码简并结果的根据以上(i)至(iii)的核酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸来自植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述植物是十字花科。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述植物是拟南芥。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述增加的产量是增加的种子产量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述增加的种子产量包括分别相对于对应的野生型植物的增加的饱满种子数、增加的种子总重量或增加的收获指数中的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸与组成型启动子有效连接。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述组成型启动子是GOS2启动子。

11.制备具有增加的产量的转基因植物的方法，所述方法包括：(i)向植物细胞中引入核酸序列，所述核酸序列选自：(a)由SEQ ID NO：1表示的核酸或其互补链，(b)编码SEQ ID NO：2的核酸，

(c)在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的核酸杂交的核酸，其编码包含NAP结构域和酸性C-末端并具有PP2a磷酸酶抑制活性的蛋白质，其中所述严格条件是在60℃，

0.1-1×SSC/0.1％ w/v SDS进行杂交1-3小时，以及(d)作为遗传密码简并结果的根据以上(a)至(c)的核酸序列；

(ii)从转基因植物细胞再生植物。

12.来自根据权利要求1所述的方法获得的产量增加的植物的植物细胞和可收获部分，以及直接来自所述植物的产物，其中所述可收获部分不是繁殖材料。

13.用在根据权利要求1或2的方法中的基因构建体，其包含：(i)核酸序列，其选自

(a)由SEQ ID NO：1表示的核酸或其互补链，(b)编码SEQ ID NO：2的核酸，

(c)在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的核酸杂交的核酸，其编码包含NAP结构域和酸性C-末端并具有PP2a磷酸酶抑制活性的蛋白质，其中所述严格条件是在60℃，

0.1-1×SSC/0.1％ w/v SDS进行杂交1-3小时，以及(d)作为遗传密码简并结果的根据以上(a)至(c)的核酸序列；

(ii)能驱动(i)的核酸序列在植物中表达的一种或多种控制序列。

14.根据权利要求13所述的构建体，其还包含转录终止序列。

15.根据权利要求13或14所述的构建体，其中所述控制序列包含至少一个组成型启动子。

16.根据权利要求15所述的构建体，其中所述组成型启动子是GOS2启动子。

17.根据权利要求13所述的构建体，其中所述核酸序列相对于所述控制序列定向为正义方向。

18.包含如SEQ ID NO：3所示的表达盒的构建体。

19.包含分离的核酸序列的转基因植物细胞，其特征在于所述细胞所 来源的植物被选择为具有增加的产量，其中所述核酸选自：(i)由SEQ ID NO：1表示的核酸或其互补链，(ii)编码SEQ ID NO：2的核酸，(iii)在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的核酸杂交的核酸，其编码包含NAP结构域和酸性C-末端并具有PP2a磷酸酶抑制活性的蛋白质，其中所述严格条件是在60℃，

0.1-1×SSC/0.1％ w/v SDS进行杂交1-3小时，以及(iv)作为遗传密码简并结果的根据以上(i)至(iii)的核酸序列。

20.根据权利要求19所述的转基因植物细胞，其选择为所述核酸表达增加。

21.根据权利要求19或20所述的转基因植物细胞，其中所述细胞所来源的植物为作物植物，其包括大豆、向日葵、芸苔、紫花苜蓿、油菜籽或棉花。

22.根据权利要求19或20的转基因植物细胞，其中所述细胞所来源的植物为单子叶植物。

23.根据权利要求22所述的转基因植物细胞，其中所述植物为甘蔗。

24.根据权利要求19或20所述的转基因植物细胞，其中所述细胞所来源的植物为谷物。

25.根据权利要求24所述的转基因植物细胞，其中所述植物为稻、玉米、小麦、粟、大麦、燕麦或高粱。

26.根据权利要求19或20所述的细胞所来源植物的可收获部分及直接来自所述植物的产物，其中所述可收获部分不是繁殖材料。

27.核酸序列用于增加植物产量的用途，其中所述核酸序列选自：(i)由SEQ ID NO：1表示的核酸或其互补链，(ii)编码SEQ ID NO：2的核酸，(iii)在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的核酸杂交的核酸，其编码包含NAP结构域和酸性C-末端并具有PP2a磷酸酶抑制活性的蛋白质，其中所述严格条件是在60℃，

0.1-1×SSC/0.1％ w/v SDS进行杂交1-3小时，以及(iv)作为遗传密码简并结果的根据以上(i)至(iii)的核酸序列。

28.蛋白质用于增加植物产量的用途，其中所述蛋白质由SEQ ID NO：2所示或者由下述核酸序列编码，所述核酸序列选自(i)由SEQ ID NO：1表示的核酸或其互补链，(ii)在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的核酸杂交的核酸，其编码包含NAP结构域和酸性C-末端并具有PP2a磷酸酶抑制活性的蛋白质，其中所述严格条件是在60℃，

0.1-1×SSC/0.1％ w/v SDS进行杂交1-3小时，以及(iii)作为遗传密码简并结果的根据以上(i)至(ii)的核酸序列。

29.权利要求27或28所述的用途，其中所述增加的产量是增加的种子产量。

30.权利要求29所述的用途，其中所述增加的种子产量包括种子总重量、饱满种子数和收获指数中的一种或多种。

31.一种增加植物产量的组合物，其包含核酸和/或由所述核酸编码的蛋白质，其中所述核酸选自 (i)由SEQ ID NO：1表示的核酸或其互补链，(ii)编码SEQ ID NO：2的核酸，(iii)在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的核酸杂交的核酸，其编码包含NAP结构域和酸性C-末端并具有PP2a磷酸酶抑制活性的蛋白质，其中所述严格条件是在60℃，

0.1-1×SSC/0.1％ w/v SDS进行杂交1-3小时，以及(iv)作为遗传密码简并结果的根据以上(i)至(iii)的核酸序列。

说明书

具有改良的生长特性的植物及其制备方法

[0001] 本发明涉及用于改良生长特性，特别是增加植物产量的方法。 更特别地，本发明涉及通过改变植物中编码核小体装配蛋白1(NAP1-样蛋白)同源蛋白质的核酸的表达来增加产量的方法。本发明也涉及NAP1-样蛋白编码核酸表达改变的植物，所述植物相对于对应的野生型植物具有增加的产量。

[0002] 由于世界人口不断增多及可用于农业的耕地面积越来越少，增加农业效率和增加园艺植物的多样性一直是主要目标。 农作物和园艺改良的常规手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。 然而，这种选育技术具有若干缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传互补的植物，这并非总是产生自亲本植物传递过来的期望性状。分子生物学的发展已经允许人类操作动物和植物的种质。 植物的遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)，随后把该遗传物质引入到植物中。此种技术导致具有多种改良的经济学、农艺学或园艺性状的植物的开发。 具有特殊经济利益的性状是生长性状，例如高产量。

[0003] NAP蛋白形成动物中已知的相关蛋白质家族并被报道参与染色质相关的活性。NAP蛋白家族的特征在于存在已知为NAP结构域的保守序列。 Pfam(登录号PF00956)和Interpro数据库(登录号IPR002164)中描述了该NAP结构域。 NAP是介导DNA包装到核小体中的多因子复合物的组分(Krude，T.和Keller，C.(2001)Cell.Mol.Life Sci.58，
665-672)。 在真核细胞分裂周期的S期中，新复制的DNA快速装配到染色质中。 该过程需要若干因素的协调作用。 在初期，CAF1(染色质装配因子1)结合组蛋白H3和H4，并通过结合PCNA将它们带到复制叉。 随后通过NAP1蛋白介导组蛋白H2A和
H2B的沉积。 NAP1首先描述于HeLA细胞中(vonLindern等人(1992)Mol.Cell.Biol.12，
3346-3355)，并且后来发现在所有真核生物中是保守的。此外，认为NAP蛋白改变基因转录并且可以影响细胞分化和生长。

[0004] SET蛋白与NAP蛋白高度相关并且在人的多种细胞过程中发挥作用。 在人细胞中，在细胞周期的改变中，诸如G2/M转换，SET已显示与多种CDK-细胞周期蛋白复合物相关。SET是参与许多信号途径的蛋白质磷酸酶2A(PP2A)的有效抑制剂。 SET的抑制活性可归因于酸性C-末端结构域(Canela等人(2003)J.Biol.Chem.278，1158-1164)。其他报道显示SET参与DNA修复和转录。 SET是具有通过染色质相关蛋白HMG2介导
的DNA结合和弯曲活性的复合物的部分。 HMG2通过使DNA弯曲和成环或通过使欠旋DNA稳定，促进核蛋白高级结构的装配。HMG2与SET共沉淀(Fan等人(2002)Mol.Cell. Biol.22，2810-2820)。 也有报道SET抑制活性DNA的脱甲基作用(Cervoni等人(2002)J.Biol.Chem.277，25026-25031)。涉及抑制组蛋白乙酰化的癌蛋白质Set/TAF-I也抑制异位甲基化DNA的脱甲基作用，导致基因沉默。 认为Set/TAF-I在基因调节中整合组蛋白和DNA的外遗状态起作用。

[0005] NAP1蛋白的活性部分通过磷酸化来调节。已指出NAP1在果蝇(Drosophila)中的亚细胞定位依赖其磷酸化状态，该磷酸化状态可通过酪蛋白激酶II来控制(Rodriguez等人(2000)J.Mol.Biol.298，225-238)。 据报道，哺乳动物具有几种NAP1蛋白，而酵母中仅仅有一种已知的NAP1蛋白。

[0006] 虽然已报道NAP1蛋白来自大豆(Yoon等人(1995)Mol.Gen.Genet.249，465-473)、拟南芥(Arabidopsis)、烟草、玉米和稻(Dong等人(2003)Planta 216，
561-570)，但是植物NAP1直向同系物在很大程度上仍然是未知的。 植物NAP1-样基因的系统分析显示有两个亚群，一个与NAP1相关，另一个与SET蛋白相关(图1)。
最可能地，由于两种拟南芥、两种玉米和两种烟草序列聚集在一起指向更近的基因重叠作用(duplication effect)，所以可以发生了随后的序列趋异。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组仅含有一个组合了NAP1和SET亚群功能性质的NAP-编码基因。 相似地，NAP1的同系物，模板激活因子1(TAF-I)组合了PP2a抑制活性(Saito等人，
Biochem.Biophys.Res.Comm.259，471-475，1999)和染色质重塑活性(Kawase等人，Genes Cells 1，1045-1056，1996)。 因此NAP/SET家族的植物蛋白质在功能上很大程度上可能是多余的，特别是在SET蛋白质群中，其与NAP群相比观察到SET蛋白质群有较低程度的趋异。 此外，因为NAP和SET蛋白共有其后是C-末端酸性区域的NAP结构
域，所以有它们属于同一家族的结构证据。

[0007] 虽然已提出NAP1-样蛋白在有丝分裂和胞质分裂中的作用，但对其在植物中的功能却所知不多(Dong等人2003)。 NAP1蛋白的植物直向同系物最可能与它们的动物对应物起不同作用。 基于它的核定位及与哺乳动物SET蛋白的序列相似性，可以预计植物蛋白质的染色质重塑作用。 此外，植物NAP/SET蛋白质群可以参与植物中PP2A的调节。 PP2A是植物中的一种主要磷酸酶，很大程度上作用于转录因子和蛋白激酶，并认为调节参与多种细胞过程的蛋白质的活性，所述细胞过程包括细胞周期(Ayaydin等人(2000)Plant J.23，85-96)、激素作用，诸如ABA介导的气孔运动、萌发(Kwak等人(2002)Plant Cell 14，2849-2861)或生长素转运和根发育(Garbers等人1996EMBO J.15，2115-2124)。 此外报道PP2A参与光合作用和光信号(Sheen(1993)EMBO J.12，3497-3505)和氮同化作用(Hirose和Yamaya(1999)Plant Physiology 121，805-812)。

[0008] 至今，没有记载植物中改变NAP1-样蛋白表达对农艺学性状的作用。 现在令人惊奇地发现在植物中改变NAP1-样蛋白的编码核酸的表达使植物与相应的野生型植物相比，具有改良的生长和发育，特别是增加的产量，更特别地是增加的种子产量。 因此本发明的第一个实施方案提供了用于改良植物生长和发育的方法，其包括在植物中引入遗传修饰并且选择该植株中NAP1-样蛋白的编码核酸的改变表达。 特别地，改良的生长和发育是植物产量的增加，更特别地是种子产量的增加；并且的改变表达是表达的增加。

[0009] 本文中所定义的术语NAP1-样蛋白，是指包含NAP结构域和酸性C-末端区域并且具有PP2a磷酸酶抑制活性的任何蛋白质。 本文中所用的术语“NAP结构域”是通过Pfam数据库中登录号PF00956所定义的(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/；Bateman等人，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002)，参见实施例表1)。 优选地，用于本发明的NAP1-样蛋白具有包含(T/S)FF(T/N/S/E/D)(W/F)(L/F)标签和/
或在SEQ IDNO：33中给出的保守氨基酸序列的NAP结构域。 更优选该NAP结构域由SEQ ID NO：32表示。 本文中所用的术语“酸性C-末端区域”或“酸性C-末端”是指蛋白质的羧基-末端，所述羧基-末端长为大约20至25个氨基酸，其中至少13个残基为谷氨酸和/或天冬氨酸。

[0010] 表1：包含NAP1结构域的拟南芥蛋白质的实例

[0011]基因ID Pfam图谱 位置 分值 e-值 SEQ ID NO：
at1g18800 PF00956 27-224 147.7 2e-40 20，21
at1g74560 PF00956 31-229 135.0 1.3e-36 1，2
at2g19480 PF00956 52-300 457.4 1.2e-133 26，27
at5g56950 PF00956 52-300 473.2 2.2e-138 28，29
at4g26110 PF00956 52-301 503.4 1.7e-147 24，25
at3g13782 PF00956 69-311 300.7 1.7e-86 30，31

[0012] 任选地，用于本发明方法的NAP1-样蛋白质除了是PP2a磷酸酶的抑制剂外，还具有染色质重塑活性。用于测定PP2a磷酸酶抑制作用的方法是本领域已知的，其包括，例如基于可商业获得的染料标记或荧光染料标记的底物的测定法，或用PP2a磷酸酶处理[32P]-标记的组蛋白H1后，基于测定TCA可溶性级分中的放射活性的测定法(Saito等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Comm.259，471-475)，或从标记的髓磷脂碱性蛋白释放的放射活性的测定法(Li等人，J.Biol.Chem.271，11059-11062，1996)。 实施例6中给出了基于Ulloa等人(FEBS Letters 330，85-89，1993)描述的用于测定NAP1-样蛋白活性的备选方法。 染色质重塑活性可以以多种方式测定，诸如在凝胶阻滞试验中测定DNA-结合活性(Fan等人，2002)或用ELISA测定组蛋白-结合活性(Rodriguez等人(1997)Genomics 44，253-265)。 在连接酶-介导的环化测定(Fan等人，2002)或在超螺旋测定(Fujii-Nakata等人(1992)J.Biol.Chem.267，20980-20986；Yoon等人(1995)，Mol.Gen.Gen.249，465-473)中可以确定DNA弯曲活性。

[0013] 优选地，包含如上所述的NAP结构域和酸性C-末端区域的NAP1-样蛋白为植物来源。NAP1-样蛋白优选来自双子叶植物，优选来自十字花科(Brassicaceae)，更优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，最优选NAP1-样蛋白为通过SEQ ID NO：2或表示的蛋白质或为其同系物、衍生物或活性片段，所述同系物、衍生物或活性片段包含如上所述的NAP结构域和酸性C-末端，并且所述同系物、衍生物或活性片段还具有PP2A抑制活性。 优选地，NAP1-样蛋白由SEQ ID NO：1表示的核酸或能与其杂交的核酸编码。

[0014] 术语“NAP1-样蛋白”包括与SEQ ID NO：2表示的蛋白质同源的蛋白质。 本发明的方法中使用的优选的同系物包含如上所述的NAP结构域和酸性C-末端。 优选同系物具有包含(T/S)FF(T/N/S/E/D)(W/F)(L/F)信号和/或SEQ ID NO：33的保守序列的NAP结构域和包含至少13个天冬氨酸和/或谷氨酸残基的20至25个残基的酸性
C-末端。 此外，NAP1同系物具有PP2a抑制活性并任选地也具有可如上所述测定的染色质重塑活性。

[0015] 在多种真核生物中可以发现SEQ ID NO：2的同系物。 最接近的同系物通常在植物界发现。 本发明的方法中合适的SEQ ID NO：2同系物包括两种烟草蛋白质(SEQ ID NO：7和9)、番茄蛋白质(SEQ ID NO：23)、苜蓿蛋白质(SEQ ID NO：11)、SEQ ID NO：21表示的拟南芥蛋白质。 合适进行本发明方法的其他同系物包括例如玉蜀(Zea mays)同系物nfa104(登录号AF384036，SEQ ID NO：13)和nfa103(登录号AF384035，SEQID NO：19)；或稻(Oryza sativa)同系物(SEQ ID NO：15和17)。

[0016] 用于搜索和鉴定NAP1-样同系物的方法在本领域技术人员熟知的范围内。此类方法包括用本领域公知的用于对比或比较序列的算法，诸如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48；443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in AppliedMathematics 2；482-489(1981)))、BLAST(Altschul，S.E.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215：
403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA
85：2444-2448(1988))，比较计算机可读形式的SEQ ID NO：1或2表示的序列与公共数据库诸如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中可得到的n序列。

[0017] 执行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(the NationalCentre for Biotechnology Information)可公开获得。 将上述同系物用blast默认参数(BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分为11和缺口延伸罚分为1)鉴定并且优选将全长序列用于分析。 备选地，由于NAP1结构域包含蛋白质的主要部分，所以仅仅这个结构域可用于比较。

[0018] NAP1-样蛋白的“同系物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入、且与其所衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。 为了产生这样的同系物，蛋白质的氨基酸可以被具有相似性能(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打断α-螺旋结构或β-片层结构的趋势)的其他氨基酸所取代。保守置换表是本领域熟知的(例如参见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。

[0019] 用于本发明方法的同系物与SEQ ID NO：2(GenBank登录号NP_177596)表示的蛋白质序列具有至少50％的序列同一性或相似性(功能同一性)，备选地与SEQ ID NO：2具有至少60％或70％的序列同一性或相似性。 一般地，该同系物与SEQ ID NO：2具有至少80％的序列同一性或相似性，优选至少85％的序列同一性或相似性，更优选至少
90％的序列同一性或相似性，最优选至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性或相似性。

[0020] 备选地，用于本发明方法的同系物与GenBank登录号NP_568844(SEQ ID NO：29)表示的蛋白质序列具有至少40％的序列同一性或相似性(功能同一性)，备选地与SEQ ID NO：29具有至少50％、60％或70％的序列同一性或相似性。一般地，该同系物与SEQ ID NO：29具有至少80％的序列同一性或相似性，优选至少85％的序列同一性或相似性，进一步优选至少90％的序列同一性或相似性，最优选至少95％、96％、97％、
98％或99％的序列同一性或相似性。

[0021] 用基于Needleman和Wunsch算法(诸如GAP)的比对程序，用BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分10和缺口延伸罚分0.5，从全长蛋白质序列或此种序列的某些(优选保守)区域，可以计算同一性的百分数。 例如，如SEQ ID NO：32给出的NAP结构域可以作为查询。 蛋白质序列中此类结构域的鉴定正在本领域技术人员所知的范围内并且涉及本发明方法中使用的核酸的计算机可读形式，比对软件程序的使用和蛋白质结构域、保守性基序和盒的公共可获得信息的使用。 用组合几种蛋白质家族、结构域和功能位点的数据库，诸如PRODOM(Servant等人，(2002)Briefingsin Bioinformatics 3，246-251，http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/2002.1/html/home.php)、PIR(Huang 等 人 (2003)Nucl.Acids Res.31，390-392，http://pir.georgetown.edu/)或Pfam(Bateman等 人(2002)Nucl.Acids Res.30，276-280，http://pfam.wustl.edu/)的INTERPRO数据库(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids Res.31，315-318，http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)可以进行完整的搜索。 设计用于基序搜索的序列分析程序可以用于鉴定如上所及的保守片段、区域和结构域。 合适的计算机程序包括例如MEME(Bailey和Elkan(1994)Proceedings of the Second InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology，第 28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，http://meme.sdsc.edu/meme/website/intro.html)。

[0022] 同源蛋白质可以归类为“蛋白质家族”。 可以通过功能和序列相似性分析，诸如例如Clustal W来定义蛋白质家族。 通过Clustal W程序可以产生与NAP1-样同源蛋白质的相邻相接法树并给出其结构和始祖关系的良好概况。 在本发明的一个具体实施方案中，NAP1-样同系物与对应于SEQID NO：2的蛋白质属于同一蛋白质家族。

[0023] 在拟南芥基因组中，鉴定了两个NAP1-样蛋白质家族成员(NM_177596(SEQ ID NO：2)、NP_564063(SEQ ID NO：21))。 在其他植物诸如稻或其他单子叶植物中也可以鉴定NAP1-样蛋白质家族成员。 有利地，这些家族成员也用于本发明的方法中。

[0024] 同源性的两种具体形式，直向同源和侧向同源是用于描述基因遗传关系的进化概念。 术语“侧向同源”涉及物种基因组内一个或多个基因复制产生的同源基因。 术语“直向同源”涉及不同生物体中因遗传关系所致的同源基因。 文中所用的术语“同系物”也包含用于本发明方法的侧向同源和直向同源蛋白质。

[0025] 通过用目的查询基因(query gene)查询一种或多种基因数据库，例如BLAST程序，可以鉴定直向同源基因。 然后对搜索产生的最高等级主体基因(subject gene)进行BLAST分析，只有那些再次与查询基因匹配的主体基因成为真正的直向同源基因。 例如，为了找到拟南芥基因的稻正向基因，可以对稻数据库(例如(但不限于)在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可获得的稻(Oryza sativa)Nipponbare数据库或稻(印度(indica)品种或日本(japonica)品种)基因组序列)进行BLASTN或TBLASTX分析。下一步，利用拟南芥数据库，在反向BLAST分析中使用获得的稻序列。当所得的序列用Clustal W分析并在相邻相接树中显示时可以将该结果进一步改进。 这个方法可以用于鉴定来自多种不同物种的直向同系物。

[0026] NAP1-样蛋白的“同系物”涵盖相对于所述的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、插入和/或缺失的蛋白质。 蛋白质的“取代变体”是那些氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，而一个不同的残基插入到它的位置上的蛋白质。 氨基酸取代一般是单残基的，但是取决于对多肽构成的功能限制可以是成串的；插入通常是大约1到10个氨基酸残基的数量级，缺失为大约1到20个残基。 优选地，氨基酸取代包括保守氨基酸取代。蛋白质的“插入变体”是一个或多个氨基酸残基被引入到蛋白质中的预定位点的蛋白质。 插入可包括氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。
通常，氨基酸序列内的插入将小于氨基或羧基末端融合。 氨基或羧基末端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂合系统的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、 表位、lacZ、CMP(钙调蛋
白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。 蛋白质的“缺失变体”特征在于从蛋白质除去一个或多个氨基酸。 使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以很容易地制备蛋白质的氨基酸变体。 对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生取代突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。

[0027] 术语NAP1-样蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与NAP1-样蛋白天然存在形式(例如，SEQ ID NO：2表示的蛋白质)的氨基酸序列相比，其可以包括天然或非天然存在氨基酸残基的取代、缺失或添加。 蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，其可以包括改变的、糖基化的、酰化的天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。 与其衍生自的氨基酸序列相比，衍生物还可包括一个或多个非氨基酸取代基，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分子或其他配体，如结合以便于其检测的报道分子，以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言的非天然存在的氨基酸残基。

[0028] NAP1-样蛋白的“活性片段”与天然存在蛋白质相比，含有至少充分保持相似生物学和/或功能活性的氨基酸残基数量。 优选的NAP1-样蛋白质的活性片段包含如上所述的至少一个NAP结构域(Pfam 00956)和富含D和/或E残基的酸性C-末端结构域，更优选的活性片段还包含SEQ ID NO：33的保守序列。

[0029] 本文中定义的术语NAP1-样核酸/基因是指如上定义的NAP1-蛋白的任何编码核酸，或其互补核酸。假如核酸在植物中表达时，导致NAP1-样核酸/因的调节性表达或NAP1-样蛋白的活性和/或水平改变，该核酸可以衍生自任何来源(直接和间接(如果随后修饰))。 该核酸可以从真核生物来源，诸如酵母或真菌，植物(包括藻类)或动物(包括人)分离。 该核酸可以从其组成和/或基因组环境的天然形式，通过仔细的人操作进行实质性修饰。 该核酸序列优选为同源核酸序列，即与SEQ ID NO：2结构和/或功能相关的蛋白质的编码核酸序列，优选获得自植物，不论来自同一植物物种或不同植物物种。 优选地，该核酸由SEQ ID NO：1或其部分表示，或是能与其杂交的核酸序列，所述杂交序列编码具有如上所述的NAP1-样蛋白活性的蛋白质；或是SEQ ID NO：2表示的氨基酸的编码核酸或其同系物、衍生物或活性片段的编码核酸。由于遗传密码的简并性，该术语也包含NAP1-样蛋白的编码核酸变体、等位变体和NAP1-样蛋白的编码核酸的不同剪接变体，其包括通过一个或多个间插序列间断的变体。

[0030] 有利地，用如上定义的NAP1-样蛋白的编码核酸序列的部分，诸如SEQ ID NO：1编码的NAP1-样蛋白，或用与如上定义的NAP1-样蛋白的编码核酸序列(诸如SEQ ID NO：1)杂交的序列(优选在严格条件下杂交，所述杂交序列编码具有NAP1样活性的蛋白质)，或用NAP1-样蛋白(诸如SEQ ID NO：2表示的)的同系物、衍生物或活性片段的编码核酸也可以实施本发明的方法。

[0031] DNA序列的部分是指从最初(较大)DNA分子衍生或制备的一段DNA，所述DNA部分在植物中表达时，使植物具有改良的生长特性。 优选地，改良的生长特性为增加的产量，更优选为增加的种子产量，最优选为包含一种或多种增加的收获指数，增加的种子总重量和增加的饱满种子数的增加的种子产量。 该部分可以包含许多有或无额外控制元件的基因，或可以包含只含有间隔序列的基因。

[0032] 本发明也包含能与编码NAP1-样蛋白的核酸序列杂交的核酸序列，该核酸序列也可用于实施本发明的方法。 本文所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。 杂交过程可完全发生在溶液中，即互补的两种核酸都处于溶液中。 依赖这种方法的分子生物学工具包括聚合酶链式反应(PCR；以及基于此的所有方法)、扣除杂交、随机引物延伸、S1核酸酶作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNA差异显示和DNA测序。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁+珠、琼脂糖凝胶珠子或任何其他树脂上。 依赖这种方法的分子生物学工具包括poly(A)mRNA的分离。 此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。 依赖这种方法的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、集落杂交、噬菌斑杂交、原位杂交和微阵列杂交。
为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。 杂交的严格性受诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。

[0033] 对于需要高选择性的应用，一般希望利用相对严格的条件形成杂交体，例如将选择相对低的盐和/或高的温度条件，诸如在大约50℃至大约70℃的温度下提供大约0.02M至大约0.15M的NaCl。

[0034] 因此，用于杂交的高严格条件包括高温度和/或低盐浓度(盐包括NaCl和柠檬酸三钠)，但也受到杂交缓冲液中包括的甲酰胺和/或在杂交缓冲液中降低的化合物诸如SDS(十二烷基硫酸钠)的浓度，和/或从自杂交缓冲液中除去化合物，诸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子聚集)的影响。分离与如上定义的本发明方法中的DNA序列同源的核酸特别优选充分低严格杂交条件。 造成同源性的元素包括等位性、遗传密码的简并性和优选密码子使用的不同。 杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交体的形成；对于高达0.4M的钠浓度，这个作用是明显的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6至0.7℃，加入50％的甲酰胺虽然使杂交速率降低，但使杂交在30至45℃进行。 碱基错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。 一般对于大探针，每％碱基错配使Tm(在确定离子强度和pH下，所述温度时50％的靶序列与完全匹配的探针杂交)降低大约1℃.

[0035] 在诸如Southern杂交和Northern杂交的核酸杂交实验中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下不同。 例如，较长的序列在较高温度下特异杂交。特异性一般是杂交后洗涤的功能。 此类洗涤的临界因子包括最终洗涤溶液的离子强度和温度。

[0036] 一般而言，对于确定离子强度和pH的具体序列，选择严格条件低于热熔解点(Tm)大约50℃。 Tm依赖于溶液条件和探针的碱基组成，并且可用以下等式计算：

[0037] Tm ＝79.8 ℃ +(18.5×log[Na+])+(58.4 ℃× ％ [G+C])-(820×( 双 链 体 中-1#bp) )-(0.5x％甲酰胺)

[0038] 取决于杂交体类型的备选公式是本领域公知的，例如：

[0039] .DNA-DNA 杂 交 体 (Meinkoth 和 Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

[0040] Tm＝81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺[0041] .DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：

[0042] Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc

[0043] .寡-DNA或寡-RNAd杂交体：

[0044] 对于＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)

[0045] 对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)

[0046] a或对于其他一价阳离子，但是仅仅在0.01-0.4M的范围精确。

[0047] b仅仅对30％至75％范围的％GC精确。

[0048] cL＝双链体中碱基对的长度。

[0049] d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数目)+(A/T数目)。

[0050] 注解：对于每1％甲酰胺，Tm降低大约0.6至0.7℃，而6M尿素的存在降低Tm大约30℃。

[0051] 更优选的严格条件是温度低于Tm20℃，最优选的严格条件是为温度低于Tm10℃。 用许多已知技术例如，用含有蛋白质的溶液封闭膜、向杂交缓冲液中加入异源RNA、DNA和SDS，和用RNA酶处理中的任何一种可以控制非特异性结合。

[0052] 洗涤条件一般在杂交严格性或低于杂交严格性下进行。 一般而言，用于核酸杂交试验或基因扩增检测方法的合适的严格条件如上所述。 也可以选择更高或更低的严格条件。

[0053] 为了定义严格水平，可以方便地参考Sambrook等人(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，纽约或参考Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)。 低严格条件的实例为37-45℃，4-6×SSC/0.1-0.5％w/v SDS进行2-3小时。 取决于杂交中涉及的核酸的来源和浓度，可以用备选的严格条件，诸如中等严格条件。 中等严格条件的实例包括≥45℃，1-4×SSC/0.25％w/v SDS进行2-3小时。 高严格条件的实例包括60℃，
0.1-1×SSC/0.1％w/v SDS进行1-3小时。 本领域技术人员认识到在杂交和洗涤中可以改变多种参数，并且所述变化将保持或改变严格条件。 例如，另一严格杂交条件为在65℃，4×SSC杂交，接着在65℃的0.1×SSC中洗涤大约1小时。 严格杂交条件的
备选实例为42℃，50％甲酰胺，4×SSC。 严格条件的又一实例包括在62℃，6×SSC，
0.05×BLOTTO中杂交和在62℃，2×SSC，0.1％w/v SDS中洗涤。

[0054] NAP1-样蛋白的编码核酸的可选择剪接变体也可用于实施本发明的方法。 本文所用的术语“可选择的剪接变体”涵盖这样的核酸序列变体，即其中选定的内含子和/或外显子已经切除、置换或添加。 这样的变体是其中蛋白质的生物学活性保持未受影响的那些变体，其可以通过选择性的保留蛋白质的功能片段来获得。 这样的剪接变体可以是天然发现的或可以是人造的。 用于产生这种剪接变体的方法是本领域熟知的。因此，，本发明的另一方面提供了用于改良植物的生长特性的方法，其包含改变植物中NAP1-样蛋白的编码核酸序列的可选择剪接变体的表达和/或通过可选择剪接变体改变编码的NAP1-样蛋白的活性和/或水平。 优选地，剪接变体为由SEQID NO：1表示的序列的剪接变体。 改良的生长特性优选为增加的产量，更优选为增加的种子产量，最优选为增加种子产量，其包含增加收获指数、增加饱满种子数和/或增加种子总重量。

[0055] 有利地，本发明的方法也可以用NAP1-样蛋白的编码核酸序列的等位变体，优选为过SEQ ID NO：1表示的序列的等位变体进行。 等位变体天然存在，且囊括在本发明的方法之内的是这些天然等位基因的用途。 等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)，以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。 在大多数生物体天然存在的多态性品种中，SNP和INDEL是最大的NAP1-样序列变体。 它们有助于对基因作图和发现基因和基因功能。 它们还有助于鉴定基因座，例如涉及确定如生长速率、植株大小和植株产量、植株活力、疾病抗性、应激耐受力等等的植物基因。

[0056] NAP1-样蛋白或其同系物的活性可以通过引入遗传修饰(优选在NAP1-样基因的基因座中)来改变。 本文中所定义的基因的基因座表示包括目的基因及该编码区上游或下游10KB的基因组区域。 术语“遗传修饰”是指与野生型细胞相比，细胞中的遗传含量经人干涉的变化并且包括如遗传工程、育种或诱变的技术。 遗传含量变化包含基因组的修饰并且包括植物细胞染色体以及附加体中遗传材料的插入、缺失和取代。 该术语也包含向植物细胞加入染色体外遗传信息。优选地，该遗传修饰产生NAP1-样核酸表达的改变，更优选为增加NAP1-样核酸的表达。

[0057] 例如，遗传修饰可以通过以下的任何一种(或多种)方法引入：TDNA激活、TILLING、定点诱变、同源重组，或如上文所述的，通过在植物细胞中引入和表达编码NAP1-样蛋白或其同系物的核酸。引入遗传修饰后，接着为选择NAP1-样蛋白活性改变的步骤。优选的NAP1-样蛋白活性的改变是增加活性，所述活性的增加使植物具有改良的生长特性，如增加的种子产量。 选择步骤可基于监测存在或不存在改良的生长特性，或基于监测存在或不存在与引入的目的核酸连接的可选择或可筛选标记基因。

[0058] T-DNA激活标签(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括T-DNA的插入，其通常在目的基因的基因组区域或基因编码区的上游或下游10KB处中含有如此构造的启动子(也可能是翻译增强子或内含子)，从而该启动子能指导靶基因的表达。一般地，破坏靶基因天然启动子对其的表达调控，而使该基因处于新引入的启动子的控制之下。 启动子一般嵌入到T-DNA中。 例如，T-DNA通过土壤农杆菌(Agrobacterium)感染随机插入到植物基因组中，并导致靠近该插入的T-DNA的基因过量表达。由于接近引入的启动子的基因过量表达，所得的转基因植物显示出显性表型。 待引入的启动子可以是能指导基因在所需的生物体(在本案为植物)中表达的任何启动子。 例如，组成型、组织偏好的、细胞类型偏好的以及诱导型启动子都适合用于T-DNA激活。

[0059] 也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部突变技术)，把遗传修饰引入到编码NAP1-样基因的基因座中。这是一种诱变技术，可用于产生和/或鉴定、并最终分离能显示NAP1-样生物学活性的多肽的NAP1-样编码核酸的诱变变体。TILLING还能够选择携带这类突变变体的植物。 这些突变变体甚至可表现出比该基因的天然形式所表现的更高的NAP1-样活性。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链；(e)DHPLC，其中库中异源双链的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变PCR产物的测序。 TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum Nat Biotechnol.2000Apr；18(4)：455-7，由Stemple 2004(TILLING-a high-throughputharvest for functional genomics.Nat Rev Genet.2004年2月；5(2)：145-50.)综述)。

[0060] 可利用定点诱变产生NAP1-样核酸的变体或其部分。 若干方法可用来实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley编http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。

[0061] T-DNA激活、TILLING、定点诱变和直接进化是能产生新的等位基因和NAP1-样变体的技术的实例。

[0062] 同源重组能够在基因组的规定选择位置处引入选定的核酸。 同源重组是生物学中通常使用的标准技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓physcomitrella。 用于在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990年10月；9(10)：3077-84)，而且在禾谷类作物例如稻中描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Efficient gene targetingby homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.Iida 和 Terada：A tale of two integrations，transgene and T-DNA：gene targeting byhomologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004年4月；15(2)：132-8)。 例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定义的NAP1-样核酸或其变体)不需靶向到NAP1-样基因的基因座中，但是可以被引入到高表达的区域。 待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替换内源基因，或附加地引入到内源基因中。

[0063] NAP1-样蛋白具有典型的结构域结构，其包含其后为酸性C-末端区域的NAP结构域。因此，可以设想在保持或改变NAP1-样蛋白活性的方式中改进NAP1-样蛋白的结构域可用于进行本发明的方法。假设所得的NAP1-样蛋白包含NAP结构域及包含至少13个谷氨酸和/或天冬氨酸残基的20至25个氨基酸的酸性C-末端区域，变体的优选类型包括通过结构域缺失、堆积或DNA改组(参见例如He等人，Science 288，2360-2363，2000，或美国专利5,811,238和6,395,547)的变体。也可以用直接进化来产生NAP1-样蛋白的编码核酸变体。这包含反复DNA改组，接着进行适当的筛选和/或选择来产生编码具有修饰的生物学活性的NAP1-样多肽或其同系物或部分的NAP1-样核酸或其部分的变体(Castle等人，(2004)Science304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

[0064] 因此，作为本发明的另一方面，提供与对应的野生型植物相比，改良植物生长和发育的方法，优选用于增加植物产量，更优选增加植物的种子产量，其包括改变表达，优选增加植物中NAP1-样蛋白的编码核酸序列的表达和/或改变植物中NAP1-样蛋白的活性和/或水平的方法，优选增加NAP1-样蛋白的活性和/或水平的方法，其中核酸序列和蛋白质包括选自以下的变体：

[0065] (i)NAP1-样蛋白的编码核酸，其中NAP1-样蛋白优选由SEQ ID NO：1表示或编码如由SEQ ID NO：2表示的NAP1-样蛋白；

[0066] (ii)NAP1-样蛋白的编码核酸序列的可选择剪接变体或其中所述NAP1-样蛋白由剪接变体编码；

[0067] (iii)NAP1-样蛋白的编码核酸序列的等位变体，或其中所述NAP1-样蛋白通过等位变体编码；

[0068] (iv)优选在严格条件下能与NAP1-样编码核酸杂交的序列；

[0069] (v)NAP1-样蛋白

[0070] (vi)由SEQ ID NO：2表示的NAP1-样蛋白

[0071] (vii)NAP1-样蛋白的同系物或衍生物，优选SEQ ID NO：2表示的NAP1-样蛋白

[0072] 及其中所述NAP1-样蛋白包含NAP结构域和酸性C-末端，并且具有PP2a磷酸酶抑制活性。

[0073] 优选地，增加的种子产量包括一种或多种增加的收获指数，增加的饱满种子的数目和/或增加的种子总重量。

[0074] 在本发明的方法中，可以设想核酸的的改变表达，特别是增加表达。 改变NAP1-样蛋白的编码核酸的表达(增加或降低表达)或改变NAP1-样蛋白本身的活性和/或水平包括在特定细胞或组织中改变基因的表达和/或改变基因产物，即多肽的活性和/或水平。 例如通过化学方法和/或重组方法可以影响基因的改变(增加或降低)表达和/或改变(增加或降低)的基因产物的活性和/或水平。 直接通过改变NAP1-样编码基因和/或直接通过改变NAP1-样蛋白的活性和/或水平，可以影响基因的改变表达和/或基因产物水平和/或改变基因产物的活性。 该的改变表达可以产生自内源性NAP1-样基因的改变表达水平和或可以产生自之前引入植物中的NAP1-样编码核酸的改变表达。同样地，NAP1-样蛋白水平和/或活性的改变可以是内源性NAP1-样基因表达水平改变的结果和/或可以由之前引入植物中的NAP1-样编码核酸表达改变产生。额外地或备选地，如上所述的表达改变以非直接方式实现，例如它可以作为降低或增加因子的水平和/或活性的结果实现，所述因子控制NAP1-样基因的表达，或影响NAP1-样蛋白的活性和/或水平。

[0075] 根据本发明优选的实施方案，NAP1-样蛋白的编码核酸表达的改变和/或NAP1-样蛋白本身活性和/或水平的改变通过重组方法实现。 此类重组方法可包括改变核酸表达和/或改变蛋白质活性和/或水平的直接和或间接方法。

[0076] 改变NAP1-样基因表达或改变NAP1-样蛋白的活性和/或水平的直接和优选方法，包括将分离的NAP1-样蛋白或其同系物、衍生物或活性片段的编码核酸序列引入植物中。可以通过如转化将该核酸引入植物中。 因此，本发明的优选的方面提供了用于改良植物生长和发育的方法，特别是用于增加植物产量的方法，其包括植物的遗传修饰，所述遗传修饰包括向植物中引入NAP1-样编码核酸。 增加的植物产量优选是增加的种子产量，更优选包括一种或多种增加的收获指数，增加的饱满种子数或增加的种子总重量。

[0077] 根据本发明的一个优选方面，可设想核酸表达的增强或增加。 本领域已经充分报道了获得增强的或增加的基因或基因产物表达的方法，例如，其包括由合适(优选强)启动子驱动的过表达，转录增强子或翻译增强子的使用。 本文中所用的术语过表达表示相对于初始野生型，表达水平增加的任何表达形式。 优选地待引入植物的核酸和/或将在植物中过表达的核酸相对于可操纵连接的启动子为正义方向。 优选地，待过表达的核酸编码NAP1-样蛋白，还优选NAP1-样蛋白的编码核酸序列从双子叶植物，优选从十字花科分离，还优选该序列从拟南芥分离，最优选该核酸序列为SEQID NO：1或其部分表示的，或编码SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段。 备选地，NAP1-样蛋白的编码核酸序列如SEQID NO：20(GenBank登录号NM_101738)表示或为其部分，或编码如SEQ ID NO：21(GenBank登录号NP_564063)表示的氨基酸序列或编码其同系物、衍生物或活性片段。 应当注意本发明的应用不只在于SEQ IDNO：1表示的核酸的用途，也不只在于编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核酸序列，而在于编码SEQ ID NO：2的同系物、衍生物或活性片段的其他核酸序列，或SEQ ID NO：1的部分，或与SEQ ID NO：1杂交的序列可用于本发明的方法。 特别是，来自其他物种如烟草(SEQ ID NO：7或9)、玉米(SEQ ID NO：13或19)、紫苜蓿(Medicago sativa)(SEQ ID NO：11)、番茄(SEQ ID NO：23)或稻(SEQ ID NO：15或17)的同系物也用于本发明的方法中。

[0078] 本发明涉及改良植物生长特性的方法或涉及产生具有改良生长特性的植物的方法，其中生长特性包括增加的产量，其包括以下任何一种或多种：增加分蘖的数目，增加第一圆锥花序(最高的圆锥花序及垂直排列时与最高圆锥化学重叠的所有圆锥花序)的数目，增加第二圆锥花序的数目，增加种子的总数，增加饱满种子数、增加每株植物总种子重量、增加收获指数、增加千籽粒重。 本发明也提供了改良上述生长特性中的一种，而不对其他生长特性产生不利作用的方法，例如保持每个圆锥花序的小穗数目相同时，增加饱满种子数。

[0079] 术语“增加产量”包括相对于野生型植物的一个或多个部分，对应的一个或多个部分的生物量增加。 该术语包括包括分别相对于对应的野生型植物，种子的生物量(种子重量)和/或(饱满)种子数目增加和/或种子的大小增加和/或种子体积增加的重量产量增加。 取决于禾谷类作物，所讨论的植物部分可以是地上生物量(例如，用作青贮饲料的玉米、甘蔗)、根(例如甜菜)、果实(例如番茄)、棉花纤维，或具有经济价值的植物的任何其他部分。 以稻为例，产量增加可以通过增加一种或多种以下来表示：每株植物圆锥花序的数目、每个圆锥花序的小穗的数目、每个圆锥花序的花的数目、增加种子饱满率、增加千籽粒重等。 对于玉米，种子产量增加可以反映为例如增加每个谷穗(种子)的排数和/或增加每排籽粒的数目。 增加种子大小和/或体积也可以影响种子的组成。种子产量增加可以是由于花的数目和/或大小增加。 产量的增加也可以增加收获指数，其表示为产量与收获部分的比率，诸如种子与总生物量的比率；或与千籽粒重的比率。 增加产量也包括较高密度(每公顷或每英亩的数目)种植的能力。

[0080] 改变的细胞分裂也可以促成产量增加。 术语“改变的细胞分裂”包括细胞分裂的增加或降低或异常细胞分裂/胞质分裂，改变的分裂平面、改变的细胞极性、改变的细胞分化。 该术语也包括诸如核内有丝分裂、acytokinesis、多倍性、多线性和核内再复制的现象。

[0081] 可以设想与对应的野生型植物相比，具有增加的产量植物也显示改良的生长速率。 本文中所用的术语“改良的生长速率”包括但不限于，在植物的一个或多个部分(包括包括种子)、植物的生活周期的一个或多个阶段中生长速率较快。 具有改良生长的植物可显示改良的生长曲线及其Tmid或T90值(分别为相对于对应的野生型植物，达到其最大大小的一半或90％需要的时间)。 术语“改良的生长”包括增强活力，早期开花、改良生活周期。

[0082] 根据本发明的一个优选的特性，实施本发明的方法产生具有增加产量的植物，特别是具有增加种子产量的植物。 优选地，增加种子产量包括分别相对于对照植物，至少增加饱满种子数、总种子重量和收获指数中的任何一种或多种。 因此，根据本发明，提供了增加植物产量的方法，所述方法包括改变NAP1-样蛋白的编码核酸序列的表达和/或改变植物中NAP1-样蛋白本身的活性，优选其中NAP1-样蛋白由SEQ ID NO：1表示的核酸序列或其部分或能与其杂交的序列编码，或其中NAP1-样蛋白由SEQ IDNO：2表示或为其同系物、衍生物或活性片段。 备选地，NAP1-样蛋白可为SEQ ID NO：
20(GenBank登录号NM_101738)、SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18或22表示的核酸序列，或其部分或能与其杂交的序列编码，或NAP1-样蛋白可以是如SEQ ID NO：
21(GenBank登录号NP_564063)，SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、23表示的或可以为其任何同系物、衍生物或活性片段。

[0083] 因为本发明的方法是用于增加总种子重量、饱满种子数和植物的收获指数中的一种或多种，所以本发明的方法有利于用于作物。 因此，本发明的方法特别有用于栽培种子的作物，诸如谷物、向日葵、大豆、豌豆、亚麻、羽扇豆、芸苔。 因此，本发明的一个具体实施方案涉及增加谷物种子产量(增加总种子重量、增加饱满种子数和/或增加收获指数)的方法。

[0084] 根据本发明的又一实施方案，提供了遗传构建体和载体，其有助于引入和/或表达可用于本发明方法的核酸序列。 因此，本发明的第二个实施方案提供了在植物中表达的基因构建体，其包含：

[0085] (i)NAP1-样蛋白的编码核酸序列；

[0086] (ii)能驱动(i)中的核酸序列在植物中表达的一种或多种控制序列；及任选的[0087] (iii)转录终止序列。

[0088] 可用于本发明方法的构建体可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建。 基因构建体可插入到载体中，该载体可以是商购的，适于转化到植物中，并适于在转化的细胞中表达目的基因。 该遗传构建体可以是表达载体，其中核酸序列与一种或多种可在原核和/或真核宿主细胞中表达的控制序列有效地连接。

[0089] 根据本发明的优选实施方案，该遗传构建体是设计来过表达核酸序列的表达载体。 能改变NAP1-样蛋白编码核酸表达和/或NAP1-样蛋白本身活性的核酸序列可以是NAP1-样蛋白的编码核酸序列或其同系物、衍生物或活性片段，诸如上文描述的任何核酸序列。优选的核酸序列是由SEQ IDNO：1表示的序列或其部分，或能与其杂交的序列，或由SEQ ID NO：2表示的蛋白质的编码核酸序列或其同系物、衍生物或活性片段。优选地，将该核酸以相对于与其有效连接的控制序列的正义方向克隆。

[0090] 植物用包含目的序列(即如上文所定义的能改变NAP1-样蛋白编码核酸表达的核酸序列)的基因构建体转化。 目的序列与一个或多个控制序列(至少与一个启动子)有效地连接。 术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中都可以互换使用，且应当取其广义，是指能对与它们连接的序列的表达起作用的调控核酸序列。 上述术语涵盖来源于经典真核生物基因组基因(包括精确转录起始所需的TATA盒，带或不带CCAAT盒序列)的转录调节序列，以及根据发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调控元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)的转录调控序列。 该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在这种情况下，它可能包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。 术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能够、在细胞、组织或器官中表达，激活或增强这种表达。 本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，以便启动子序列能启动目的基因的转录。

[0091] 有利地，取决于需要的结果，可以用任何类型的启动子驱动该核酸序列的表达。 优选地，NAP1-样蛋白的编码核酸序列与组成型启动子有效连接。 本文中所定义的术语“组成型”指该启动子在不止一种组织或器官中优势表达，而且在植物生活周期的任何阶段都优势表达。 优选地，组成型启动子在整株植物中优势表达。优选地，组成型启动子是来自稻的GOS2启动子，或相似强度的启动子和/或具有相似表达模式的启动子。 备选地，可以用组织特异性启动子。例如，对于设想增加种子产量的情况，可以考虑用种子优选的、花优选的、分生组织优选的启动子或分裂细胞中有活性的启动子。 例如通过将启动子与报道基因偶联并在植物的多种组织中测定报道基因的表达，可以分析启动子强度和/或表达模式。 本领域技术人员公知的一个合适的报道基因是β-葡糖醛酸酶。

[0092] 表2中列出了备选的启动子的实例及其各自的表达模式，并且这些启动子或其衍生物可以用于本发明的方法。

[0093] 表2：用于实施本发明的启动子的实例

[0094]基因来源 表达模式 参考文献
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玉米ESR基因 胚乳 Plant J 12：235-46，1997
家族
高梁γ-高梁醇溶 胚乳 PMB 32：1029-35，1996
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LEAFY 茎分生组织 Weigel等人.，Cell 69：843-859，1992.
拟南芥knat1 茎分生组织 登录号AJ131822
苹果kn1 茎分生组织 登录号Z71981
CLAVATA1 茎分生组织 登录号AF049870
烟草细胞周期 分裂的细胞 Trehin等人.1997 Plant Mol.Biol.35，
蛋白B1；1 /分生组织 667-672.
长春花 分裂的细胞 Ito等人.1997Plant J.11，983-992
(Catharanthu /分生组织
s roseus)有丝分
裂细胞周期蛋
白CYS(A-型)
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拟南芥cyc1At 分裂的细胞 Shaul等人.1996Proc.Natl.Acad.Sci.美国
(＝cyc B1；1)和 /分生组织 93，4868-4872.
cyc3aAt(A-型)
拟南芥tef1启 分裂的细胞 Regad等人.1995 Mol.Gen.Genet.248，

动子盒 /分生组织 703-711.
长春花cyc07 分裂的细胞 Ito等人.1994Plant Mol.Biol.24，863-878.
/分生组织

[0095] 任选地，一个或多个终止子序列也可用于被引入植物中的构建体中。 术语“终止子”涵盖控制序列，其是位于转录单元末端的DNA序列，传递3’加工和初级转录物聚腺苷酸化以及转录终止的信号。 另外的调控元件也可以包括转录增强子以及翻译增强子。 本领域技术人员知晓适合用于实施本发明的终止子与增强子。 这样的序列是已知的，或本领域技术人员可以很容易地获得。

[0096] 本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制原点序列。 一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为染色体外遗传元件(例如，质粒或粘粒分子)维持的情况。 优选的复制原点包括但不局限于：fl-ori和colE1。

[0097] 遗传构建体任选地可包含选择标记基因。 本文所用的术语“选择标记基因”包括赋予表达该基因的细胞表型以便于鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的任何基因。 合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的新陈代谢性状或允许视觉选择。 选择标记基因的实例包括能赋予抗生素抗性(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或使潮霉素磷酸化的hpt)、除草剂抗性(例如提供对Basta的抗性的bar；提供对草甘膦的抗性的aroA或gox)的基因，或提供新陈代谢性状的基因(如允许植物利用甘露糖作为唯一碳源的manA)。 可视标记基因导致颜色形成(例如β-葡糖醛酸酶，GUS)、发光(如荧光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。

[0098] 在优选的实施方案中，上述遗传构建体包含以正义方向与启动子(优选组成型启动子，诸如稻GOS2启动子)偶联的NAP1-样基因。 因此，本发明的另一方面是载体构建体，所述载体构建体携带与SEQ ID NO：3基本相似的表达盒，其包含稻GOS2启动子、拟南芥NAP1-样基因和T-玉米醇溶蛋白+T-核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶δGA转录终止序列。与SEQID NO：3基本相似的序列包含SEQ ID NO：2同源的蛋白质的编码核酸或与SEQ ID NO：1杂交的核酸，所述核酸与稻GOS2启动子或有相似表达模式的启动子有效连接，和/或所述核酸与转录终止序列连接。

[0099] 因此根据本发明的另一方面，提供了包含表达盒的基因构建体，NAP1-样蛋白的编码核酸序列位于所述表达盒中，所述基因构建体选自以下：

[0100] (i)由SEQ ID NO：1表示的核酸序列或其互补链

[0101] (ii)SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段的编码核酸序列；

[0102] (iii)能与以上(i)或(ii)的核酸序列(优选在严格条件下)杂交的核酸序列，所述杂交序列优选编码具有NAP1-样蛋白活性的蛋白质；

[0103] (iv)以上(i)至(iii)的核酸序列遗传密码简并的结果；

[0104] (v)根据(i)至(iii)的核酸序列的等位变体的核酸序列；

[0105] (vi)根据(i)至(iii)的核酸序列的可选择剪接变体的核酸序列；

[0106] 本发明也包括可通过本发明的方法获得的植物。 因此本发明提供了可通过本发明的方法获得的植物，所述植物具有增加的产量且所述植物具有改变的NAP1-样蛋白活性和/或水平，和/或改变的NAP1-样蛋白的编码核酸的表达。 优选地，植物为包含分离的NAP1-样蛋白的编码核酸序列的转基因植物，其特征在于转基因植物选择为具有增加的产量。又优选地，转基因植物选择为NAP1-样蛋白的编码核酸的表达是改变的。进一步优选地，转基因植物选择为SEQ ID NO：2表示的NAP1-样蛋白的编码核酸表达是改变的。

[0107] 根据本发明的第三个实施方案，提供了制备具有改良生长特性的转基因植物，其包括在植物中引入和表达上述NAP1-样蛋白的编码核酸。 优选地，改良的生长特性包括增加产量，更优选为增加的种子产量，最优选为包括增加的饱满种子数量、增加的收获指数或增加的种子总重量的一种或多种。

[0108] 更特别地，本发明提供制备具有增加产量的转基因植物的方法，所述方法包括[0109] (i)将NAP1-样蛋白的编码核酸序列引入植物细胞中；

[0110] (ii)从转基因植物细胞再生和/或生长植物。

[0111] 可以将NAP1-样蛋白本身和/或NAP1-样核酸自身直接引入植物细胞或直接引入植物本身(包括引入植物的组织、器官或任何其他部分)。根据本发明优选的特性，优选通过转化将该核酸引入植物中。 该核酸优选由SEQ ID NO：1或其部分或能与其杂交的序列表示，或为SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列或其同系物、衍生物或活性片段的编码核酸。备选地，该核酸序列由SEQ ID NO：20(GenBank登录号NM_101738)、SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、22或其片段表示的核酸序列或能与任何上述序列杂交的序列。 该氨基酸序列可以备选为SEQ ID NO：21(GenBank登录号NP_564063)，SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、23表示的序列或其同系物、衍生物或活性片段。

[0112] 本文所提及的术语“转化”涵盖把外源多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不管转移的方法如何。 能够随后无性繁殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用本发明的遗传构建体进行转化，并从其再生完整植物。 选择的特定组织将视可用于且最适于转化的特定物种的无性繁殖体系而改变。 示例性的靶组织包括叶圆盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋生的芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地被引入到宿主细胞中，并可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择地，它可以整合到宿主基因组中。 所得的转化植物细胞然后可用于以本领域技术人员所知的方法再生为转化植物。

[0113] 植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。 有利地，任何转化方法都可用于引入目的基因到合适的祖代细胞中。 转化方法包括使用脂质体、电穿孔、能增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪颗粒轰击、使用病毒或花粉进行转化以及显微注射。 方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA涂层颗粒轰击(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。 表达NAP1-样基因的转基因稻植物优选使用任何用于稻转化的熟知方法，通过土壤农杆菌(Agrobacterium)介导的转化产生，例如在任何以下文献中描述的方法：公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入文中作为参考。 至于谷物转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)：745-50)或Frame等(PlantPhysiol.2002 May；129(1)：
13-22)中所述，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入文中作为参考。

[0114] 通常在转化以后，选择植物细胞或细胞群中与目的基因共转移的植物可表达基因所编码的一个或多个标记，接着将转化的材料再生成完整植株。

[0115] DNA转移和再生之后，可评价推断转化植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组结构，例如使用Southern分析。可选择地或另外地，新引入DNA的表达水平可使用Northern和/或Western分析进行监控，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。

[0116] 产生的转化植物可通过多种方法进行繁殖，如通过无性繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花授精以产生纯合的第二代(或T2)转化株，而T2植物可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。

[0117] 产生的转化生物体可以是各种形式的。 例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有的细胞都被转化以含有表达盒)；转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，转化的根状茎被嫁接到未转化的接穗中)。

[0118] 本发明显然延及由文中描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。 本发明还延及囊括由任何上述的方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的要求是该后代显示与由本发明的方法在亲代中产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。 本发明也包括含有分离的核酸分子的宿主细胞，所述分离的核酸分子编码能改变NAP1-样蛋白的水平和/或活性的蛋白质，优选其中的蛋白质为NAP1-样蛋白。 根据本发明的宿主细胞优选为植物细胞。 因此，本发明也包括具有改变的生长特性的宿主细胞或转基因植物，其特征在于该宿主细胞或转基因植物具有改变的NAP1-样蛋白的编码核酸序列的表达和/或改变的NAP1-样蛋白的活性和/或水平。 优选地，改变的生长特性包括增加产量，更优选增加种子产量。

[0119] 本发明也涵盖植物的可收获部分，包括但不限于，种子、叶、果实、花、茎或茎培养物、根状茎、根、块茎和鳞茎。 本发明还涉及直接来自这种植物的可收获部分的产物，诸如干颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

[0120] 文中所用的术语“植物”包括整个植物、植物和部分植物的祖先和子后代、植物细胞、组织和器官。 因此术语“植物” 也包括悬浮培养物、胚、分生组织的区域、胼胝体组织、叶、花、果实、种子、根(包括根状茎和块茎)、茎干、鳞茎、茎、配子体、孢子体、花粉和小孢子。 尤其可用于本发明方法的植物包括藻类、蕨类和属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物，观赏植物，粮食作物，选自如下物种的乔木或灌木：秋葵属物种(Abelmoschusspp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、冰草属物种(Agropyron spp.)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthusspp.)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apiumgraveolens)、拟南芥、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、 燕 麦 (Avena sativa)、 阳 桃 (Averrhoa carambola)、 冬 瓜 (Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)、Cadabafarinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、红花(Carthamus tinctorius)、山核桃属物种(Carya spp.)、栗属物种(Castanea spp.)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、Cola spp.、芋(Colocasia esculenta)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegusspp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蟥属物种(Desmodiumspp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusinecoracana)、枇杷(Eriobotrya japonica)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficuscarica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)、甘薯(Ipomoea batatas )、核桃属物种(Juglansspp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、浮萍属物种(Lemna spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、硬皮豆属物种(Macrotylomaspp.)、西印度樱桃(Malpighia emarginata)、苹果属物种(Malus spp.)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、稷(Panicum miliaceum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属物种(Perseaspp.)、香芹(Petroselinum crispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poaspp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanussativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、Sesamum spp.、茄属物种(Solanum spp.)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Triticosecalerimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphusspp.)等。

[0121] 根据本发明的优选特性，植物为包括大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽或棉花的作物。 进一步优选地，本发明的植物为单子叶植物诸如甘蔗，最优选地为谷物，诸如稻、玉米、小麦、粟、大麦、燕麦、高梁。

[0122] 本发明也包括NAP1-样蛋白、其部分或变体的编码核酸的用途和NAP1-样多肽、其同系物或衍生物的用途。

[0123] 这种用途之一涉及改良植物的生长特性，特别是增加产量，特别是种子产量。种子产量可以包括以下的一种或多种：增加种子数目、增加饱满种子的数目、增加种子总重量、增加收获指数、增加千籽粒重、种子饱满率等。 优选地，NAP1-样蛋白或NAP1-样蛋白的编码核酸为植物来源，更优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，最优选地，NAP1-样蛋白由SEQ ID NO：1编码或由SEQ ID NO：2表示。

[0124] NAP1-样核酸或其变体，或NAP1-样多肽或其同系物可以在育种过程中找到用途，在所述育种过程中鉴定了可以与NAP1-样基因或其变体遗传性连接的DNA标记。可以用NAP1-样基因或其变体，或NAP1-样蛋白或其同系物来确定分子标记。然后可以在育种过程中用这个DNA或蛋白质标记来选择具有改良生长特性的植物。例如，NAP1-样基因或其变体为由SEQ ID NO：1表示的核酸，或上述任何同系物的编码核酸。

[0125] 编码NAP1-样蛋白的基因的等位变体也用于标记辅助的育种过程。 此类育种过程有时需要用植物诱变处理(例如EMS诱变)来引入等位基因变异；备选地，该程序可以由收集无意引起的所谓“天然”来源的等位变体开始。 然后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。 接着是筛选步骤，用于选择所讨论序列的优良等位变体，其在植物中产生改良的生长特性，例如增加种子产量。 一般通过监控含有所讨论序列的不同等位变体(例如，SEQ ID NO：1的不同等位变体)的植物的生长特性来进行筛选。监控生长特性可以在温室或野外进行。 此外任选的步骤包括使植物与另一种植物杂交，其中所述植物中鉴定了产生增加的种子产量的优良等位变体。 例如，这可用于产生组合的目的表型特征。

[0126] NAP1-样核酸或其变体还可用作探针，以对基因进行遗传和物理作图，这些基因是与之连锁的性状的一部分和标志。 这些信息可用于植物育种，以开发具有所需表型的种系。NAP1-样核酸或其变体的这种应用，仅仅需要长度为至少10个核苷酸的核酸序列。NAP1-样核酸或其变体可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。 限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹可使用NAP1-样核酸或其变体进行探测。 然后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)对所得的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。 此外，该核酸可用于探测Southern印迹，该Southern印迹含有代表亲本和明确的遗传杂交后代的一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA。记录到DNA多态性的分离，并用于计算NAP1样编码核酸在前面使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

[0127] 植物基因来源的探针的制备和在遗传作图中的用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。 众多出版物描述过使用上面所述的方法或其变通形式对特定的cDNA克隆进行遗传作图。 例如，F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系及其他的个体组可用于作图。 这类方法是本领域技术人员熟知的。

[0128] 核酸探针也可用于物理作图(即，把序列置于物理图上；参见Hoheisel等：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press1996，第319-346页，以及其中引用的参考文献)。

[0129] 在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。虽然目前的FISH作图方法偏向于使用大的克隆(几个到几百KB；参见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏度的增加允许使用较短的探针进行FISH作图。

[0130] 许多用于遗传和物理作图的各种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸实施。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。 为实施这些方法，使用核酸序列设计和制备引物对，以用于扩增反应或引物延伸反应。 这类引物的设计是本领域技术人员所熟知的。 在采用基于PCR遗传作图的方法中，可能有必要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲代之间DNA序列的差异。 然而，这对作图方法通常不是必要的。

[0131] 在这种方式中，可以进行改良植物的产生、鉴定和/或分离，其具有改变样活性，显示改良的生长特性。

[0132] NAP1-样核酸或其变体或NAP1-样多肽或其同系物发现也可以用作生长调节剂。 因为这些分子显示可用于改良植物的生长特性，所以它们也是有用的生长调节剂，诸如除草剂或生长刺激剂。因此本发明提供了一种组合物，其包含NAP1-样核酸或其变体，或NAP1-样多肽或其同系物以及合适的载体、稀释剂或赋形剂，用作生长调节剂，优选作为生长促进剂，更优选用于增加产量。

[0133] 本发明的方法产生具有改良生长特性的植物，如上所述。 这些改良的生长特性也可与其他经济学上有利的性状结合，如进一步增产性状、对各种应激的耐受性、修饰各种结构特征和/或生化和/或生理学特征的性状。 因此，本发明的方法也可用于所谓的“基因堆积”方法。

附图说明

[0134] 现在参考下图，将对本发明进行描述，其中：

[0135] 图1为表示来自酵母、人和植物的NAP和SET蛋白质之间关系的系统树。该系统树通过VNTI Suite 5.5的AlignX程序(Informax，http://www.informaxinc.com/)建立。用于产生多比对的矩阵是Blosum62，比对参数为：缺口开放罚分为10；缺口延伸罚分为
0.5；缺口分离罚分范围为8；比对同一性延迟％为40。 用Saitou和Nei的相邻相接法建立系统树。 在比对中所用的(对于拟南芥)序列的GenBank和MIPS登录号在树中标明。 At：拟南芥，Gm：大豆(Glycine max)，Nt：烟草(Nicotianatabacum)(序列来自WO 03/085115)，Os：稻(Oryza sativa)，Ps：豌豆(Pisum sativum)，Zm：玉蜀黍(Zea mays)，Hs：人类(Homo sapiens)，Sc：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

[0136] 图2图示了进入克隆p68，其 克隆进入pDONR201主链的AttL1和AttL2位点中含有CDS0406。CDS0406是用于拟南芥NAP1-样编码序列的内部代码。该载体也含有细菌卡那霉素抗性盒和细菌复制起点。

[0137] 图3显示了二元载体，用于在稻中表达处于Gos2启动子(PRO0129)控制下(PRO0129)的拟南芥NAP1-样基因(CDS0406)。 该载体含有来自左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界(RB重复，RB Ti C58))受限制的Ti质粒的T-DNA。 从左边界到右边界，该T-DNA含有：选择转化植物的抗生素盒、可视筛选转化植物的选择标记和用于表达拟南芥NAP1-样基因的PRO0129-CDS0406-玉米醇溶蛋白和rbcS-δGA双终止子盒。
该载体含有用于细菌复制的来自pBR322的复制起点，及用壮观霉素和链霉素进行细菌选择的选择标记(Spe/SmeR)。

[0138] 图4是在大肠杆菌(E.coli)中表达并从细胞粗提取物通过6×HIS-标记的亲和层析纯化的苜蓿(Medicago)NAP1-样蛋白。 通过使用抗-6×HIS抗体(Sigma，St Louis，美国)的Western印迹可见从镍-琼脂糖树脂上用不同咪唑浓度洗脱下来的34kD蛋白质。

[0139] 图5用Needleman和Wunsch算法进行的拟南芥NAP1-样蛋白(AtNAP1-样)和紫苜蓿NAP1-样蛋白(MsNAP1-样)的比对。 将缺口开放罚分设定为10，缺口延伸罚分设定为0.5。 使用这些设定，序列同一性为71.2％，序列同源性为84.5％。

[0140] 图6NAP1-样蛋白在植物中的核定位。A)通过用抗纯化蛋白质的间接免疫荧光显示苜蓿NAP1-样蛋白位于培养的紫花苜蓿的细胞核内(A行的左图)。 为了证实该核定位，将细胞核用荧光染料DAPI平行染色(A行的右图)。 插入的箭头指向细胞分裂中期的细胞。微弱的荧光表示在无核区室的中期细胞染色体周围的低丰度NAP1-样蛋白。B)基因构建体通过PEG-介导的摄取进入原生质体后，瞬时表达的与GFP融合的拟南芥NAP1-样蛋白位于拟南芥细胞核内。

[0141] 图7虽然纯化的苜蓿NAP1-样蛋白体外抑制PP2A(从兔骨骼肌纯化)的磷酸组蛋白H2B的脱磷酸活性，但是此酶对糖原磷酸化酶的脱磷酸作用没有影响。

[0142] 图8用于进行本发明的方法的序列的实例。

[0143] 实施例

[0144] 本发明现在将参考以下实施例进行描述，其仅仅是为了例证说明。

[0145] DNA操作：除非另有说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，纽约)或Ausubel等人(Current Protocols inMolecular Biology.纽约：John Wiley and Sons，1998，第1和2卷)中描述的标准方案进行。 用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.DCroy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。

[0146] 实施例1：基因克隆

[0147] 使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，英国)作为模板，PCR扩增拟南芥NAP1-样基因(内参CDS0406)。 对从幼苗提取的RNA进行反转录以后，把cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中。 基因库的平均插入大小为1.5kb，而且克隆的原始数目为
7 11 5
1.59×10cfu。 第一轮扩增6×10 cfu/ml后，确定最初滴度为9.6×10cfu/ml。 质粒提取以后，200ng的模板用于50μl PCR混合物。 包括用于Gateway重组的AttB位点的引物prm1505(SEQ ID NO：4)和prm1506(SEQ ID NO：5)用于PCR扩增。 使用Hifi Tag DNA聚合酶，在标准条件下进行PCR。扩增得到771bp的PCR片段，并同样使用标准方法进行纯化。然后进行Gateway方法的第一步，即BP反应，在此期间，PCR片段在体内与pDONR201质粒重组，根据Gateway术语，以产生“进入克隆(entry clone)”p68(图
2)。 质粒pDONR201购自Invitrogen，作为 technology的一部分。

[0148] 实施例2：载体构建

[0149] 进入克隆p68接着与p0640进行LR反应，p0640是用于稻转化的目的载体。 该载体包含位于T-DNA边界内的以下部分作为功能性元件：植物选择标记；可视筛选标记；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行体内重组的LR的Gateway表达盒。 用于组成型表达的稻GOS2启动子(PRO0129)位于该Gateway表达盒的上游。 LR重组步骤之后，得到的表达载体p73(图3)被转化到土壤农杆菌菌株LBA4404中，其随后被转化到稻植株中。

[0150] 实施例3：稻的转化

[0151] 将日本品种的稻的成熟干燥种子脱壳。 将种子在70％的乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％HgCl2中孵育30分钟并用无菌蒸馏水洗涤6次，每次15分钟进行灭菌。然后将无菌种子在含有2，4-D的培养基(胼胝体诱导培养基)中萌发。 在黑暗中孵育4周后，将胚胎发生、盾片衍生的胼胝体切断并在相同培养基上繁殖。2周后，在相同培养基上将胼胝体增殖或通过传代培养繁殖另外2周。 共培养前3天，将胚胎发生胼胝体在新鲜培养基上传代培养来增强细胞分裂活性。 将带有二元载体p73的土壤农杆菌菌株LBA4404共培养。 将土壤农杆菌菌株在含有适当抗生素的AB培养基上28℃培养3天。 然后收集细菌并在液体共培养培养基中悬浮为OD600大约为1。将悬浮液转移到培养皿并将胼胝体在悬浮液中浸渍15分钟。接着，将胼胝体组织在滤纸上吸干，转移至固化共培养培养基，并在黑暗中25℃培养3天。 然后，在有合适浓度的选择试剂的条件下，将共培养胼胝体28℃下在含有2，4-D的培养基上黑暗生长4周。在此期间，产生快速生长的抗性胼胝体岛。 将该材料转移到再生培养基上并在光下孵育，胚胎发生潜力得到释放并在随后的4至5周萌发。 将芽从胼胝体切下并在含有生长素的培养基上培养2至3周，从该培养基上将它们转移到土壤。 变硬的芽在温室的高湿度和短日照下生长。 最后在移植后3至5个月收获种子。 该方法产生50％以上比率的单基因座转化体(Aldemita和Hodges，Planta 199，612-617，1996；Chan等人，Plant Mol.Biol.22(3)，491-506，1993；Hiei等人，Plant J.6(2)，271-282，1994)。

[0152] 实施例4：转化体的评估：营养生长测定

[0153] 大约产生了15到20个独立的T0转化株。 一代转化株从组织培养室转移到温室中生长，并收获T1种子。 5个事件得以保留，其中T1后代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。 对于这些事件中的每一个，通过监控可视标记的表达，选择了10株包含转基因的T1幼苗(异型和同型接合子)，和10株缺乏转基因的T1幼苗(无效接合子)。
将选择的T1植株转移到温室。各植株拥有独有的条形码标记，其与对应植物明确的表型数据相应。

[0154] 选择的T1植物在直径为10cm的盆的土壤中，在以下环境设定条件下生长：光周期＝11.5小时，日光强度＝30,000lux或以上，日间温度＝28℃或更高，夜间温度＝22℃，相对湿度＝60-70％。 转基因植物和对应的无效接合子在随机位置上相邻生长。
从播种阶段到成熟阶段将植物数次通过数字图像箱。 在各时间点从至少6各不同角度取得每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万色)。

[0155] 收获成熟的初级穗，装袋，进行条型码标记，然后在烘箱于37℃干燥3天。 然后对穗脱粒，收集所有的种子。使用鼓气装置，把饱满的谷壳从空谷壳中分离开。 分离后，用市售计数器对两批种子计数。丢弃空谷壳。 饱满的谷壳在分析天平上称重并用数字成像测定种子的横截面面积。 该方法产生如下所述的种子相关参数组。

[0156] 使用图像分析软件，从数字图像以自动方式得到这些参数，并进行统计学分析。 校正不平衡的两因子的ANOVA(可变性分析)用作统计模型，用于植物表型特征的综合评价。 对用那个基因转化的所有事件的所有植株的所有测量参数进行F-检验。 进行F-检验以-检验基因对所有转化事件的作用，并验证基因的总效应，亦称之为整体基因效应。 如果F检验值显示该数据是显著的，那么得出有“基因”作用的结论，表示不仅仅是基因的存在或基因的位置引起该作用。 对于F检验，用于真正总体基因作用的显著性的界限设定为5％概率水平。

[0157] 为验证事件中基因的作用，即种系特异性作用，用来自转基因植物和对应的无效植物的数据集在各事件中进行t-检验。 “无效植物”或“无效分离体”或“无效杂合体”是与转基因植物以相同方式处理，但转基因从其分离出来的植物。 无效植物也可以描述为纯合体阴性转化植物。 用于t-检验的显著性的阈值设定为10％概率水平。 一些事件的结果可以在这个界限以上或以下。 这基于基因可能仅仅在基因组的某些位置有作用，且该位置依赖作用不常发生的假设。 这种基因的作用文中也称为“基因的种系作用”。 通过比较t-值与t-分布，或备选地，通过比较F-值与F-分布获得p-值。 然后p-值给出无效假设(即，无转基因作用)正确的概率。

[0158] 根据上述方法测定了营养生长和种子产量。 发明人令人惊奇地发现当与没有NAP1-样基因的对照植物相比时，转化NAP1-样基因的稻植物中种子总重量、饱满种子数和收获指数增加。

[0159] 在第一次实验中获得的数据在用T2植株的第二次实验中得到证实。 选择了具有正确表达模式的四个种系用于进一步分析。 通过监测标记表达，筛选了来自阳性植物(杂合体和纯合体)的种子批次。 然后对于选择的事件，保留杂合体种子批次用于T2评估。 在各种子批次中相等数目的阳性和阴性植物在温室中生长用于评估。

[0160] 在T2代中对总数为160株的NAP1-样转基因植物进行了评估，即每个事件的40株植物，其中20株为转基因阳性，20株为阴性。

[0161] 实施例5：转化体的评估：种子相关参数的测量

[0162] 如上分析种子后，发明人发现与缺乏NAP1-样转基因的植物相比，转化NAP1-样基因构建体的植物具有较高数目的饱满种子、较高种子总重量和增加的收获指数。在T1代植株中获得的阳性结果又在T2代中获得。不仅仅个别转基因种系的分数比对应的无效接合子对照种系显著，当测量所有检测的T2事件的所有植物时，也有显著的阳性总体作用，其强烈暗示总体基因作用。 表3给出了总数据。

[0163] 表3

[0164]

[0165] 增加％表示对所有检测事件的平均增加。 p-值代表来自F-检验的p-值。

[0166] 饱满种子数

[0167] 通过计数分离步骤后保留的饱满壳的数目来确定饱满的种子数目。 5种检测的种系中的4种表现饱满种子数的增加，高达37％。 相对于对应的无效分离体，通过转基因植物产生的饱满种子数总体增加17％，该增加是统计学显著的(p-值0.0352)。 在T2代，所有检测种系均增加，范围在14和46％之间。 对于T2系，平均增加28％，该平均增加也是统计学显著的(p-值0.0013)。 T1和T2数据的联合分析也证实总体基因作用是高度显著的(p-值0.0003)。

[0168] 种子总产量

[0169] 通过对从植株收获的全部饱满的谷壳进行称重，来测定每株植物的种子总产量(种子总重量)。 所有转基因T1系显示种子总重量增加，所述总重量增加在8和43％之间。 平均起来，种子产量增加24％，且存在转基因对种子产量的该总体作用是显著的，如通过对于F-检验的P-值为0.0076证实。该结果在T2代中也观察到。4种检测种系具有14和48％之间的产量增加，平均为28％。这表示增加是统计学显著的(p-值0.0013)，并且T1和T2植株的联合分析也显示有总体基因作用(p-值0.0006)。

[0170] 收获指数

[0171] 本发明中的收获指数定义为种子总产量和地上面积(mm2)的比率，再乘以系数6
10。5个检测种系中的4个显示增加的收获指数，范围为9和48％之间。对收获指数(总增加15％)有显著的总基因作用(与转基因存在相关的作用)，F检验的p-值为0.085，是统计学显著的。 对于T2植物获得相似的结果。 各个种系收获指数增加12至34％，显著性平均数为17％(p-值为0.0025)。T1和T2数据的联合分析在此也显示总体基因作用(p-值为0.003)。

[0172] 本领域技术人员知道植物中转基因的表达及此类转基因表达的表型作用在独立获得的不同转基因系和其子代中不同。 在独立获得的不同转基因植物中存在的转基因的染色体插入基因座、插入的那个基因座的转基因拷贝数及那个基因座中那些转基因拷贝的构型互不相同。 表达水平的差异也归因于来自转基因染色体背景(所谓的位置作用)或来自通过某些转基因构型引发的沉默机制(例如，转基因串连插入物的内面易于在转录或转录后水平沉默)的影响。 虽然有这些可能导致的变化，但是数据显示分别对应于非转基因植物，表达NAP1-样基因的转基因植物一直给出较高的饱满种子数、较高的种子总重量以及增加的收获指数。 在T1和T2代观察到的增加均是显著的，如通过联合分析的p-值证实地，是对于总体基因作用的强有力证明。

[0173] 实施例6：紫苜蓿NAP1-样蛋白的特性

[0174] 材料和方法

[0175] 推定苜蓿PP2A-抑制剂的全长cDNA克隆的分离

[0176] 用如生产商(Stratagene)描述的标准筛选方法，分离的部分编码紫苜蓿(Medicago sativa)推定NAP1-样蛋白的cDNA片段用于从紫花苜蓿根瘤λ-ZAP噬菌体cDNA文库分离全长克隆(Savoure等人.Plant Mol.Biol.27，1059-1070；1995)。 筛选
400000个噬菌斑，保留了20个克隆，其中18个在第二次杂交筛选中为阳性。 这些克隆中的8个进行选择用于进一步工作，并从个别噬菌体转换为噬菌粒。4个克隆进行测序，它们中的2个证实为推定NAP1-样蛋白的全长cDNA克隆。 此克隆中的一个(Ms10.1)用于进一步工作(SEQ ID NO：10，编码SEQ ID NO：11的蛋白质)。

[0177] 苜蓿NAP1-样蛋白的产生和纯化

[0178] 将编码紫苜蓿NAP1-样蛋白的cDNA序列插入到pENTRY4 载体(Invitrogen)的NcoI/XhoI位点，随后引入pDEST17细菌表达载体中。 该pDEST17载体允许NAP1-样蛋白在BL21大肠杆菌细胞中表达为6×HIS-标记的蛋白质。 用镍琼脂糖树脂(Sigma)的亲和层析对34kDa NAP1-样蛋白进行纯化(图4)。

[0179] 磷酸酶活性测定

[0180] 根据Ulloa等人(1993)，32P-同位素-标记的糖原磷酸化酶和组蛋白H2A蛋白质作为底物，从兔骨骼肌纯化的蛋白质磷酸酶2A(PP2A)催化亚单位上，对紫苜蓿NAP1-样蛋白的潜在磷酸酶抑制活性进行体外检测。

[0181] MsNAP1-样和AtNAP1-样蛋白的胞内定位

[0182] 用标准免疫方法，在兔中制备抗纯化的6×HIS-标记蛋白质的多克隆抗-MsNAP1-样抗体。

[0183] 原生质体从悬浮培养的紫苜蓿(Medicago sativa)细胞分离并通过6％的甲醛固定。然后将细胞附着在聚-L-赖氨酸涂敷的载玻片上并暴露于抗-MsNAP1-样抗血清(在PBS中200×稀释)，洗涤并暴露于FITC-缀合的山羊抗-兔第二抗体(SIGMA，100×稀释)。细胞核用DAPI(0.02mg/ml)平行染色并用Nikon TE300荧光显微镜和SPOT II彩色CCD照相机照相。

[0184] 将紫苜蓿NAP1-样蛋白(SEQ ID NO：1)的拟南芥直向同系物的编码区与绿色荧光蛋白(GFP)插入到 -相容植物表达载体(pK7WGF2)的框中。 用标准方法分离原生质体并用纯化的质粒DNA转染。 转染1或2天后用荧光显微镜记录瞬时表达。

[0185] 结果

[0186] 拟南芥和苜蓿NAP1-样蛋白定位在细胞核中

[0187] 紫苜蓿的NAP1-样蛋白与拟南芥NAP1-样蛋白高度同源：序列同一性为71.2％和序列相似性为84.5％(图5)。 用抗-MsNAP1-样抗体的间接免疫荧光显示抗体识别位于悬浮培养的紫花苜蓿细胞的细胞核的蛋白质。 这个定位通过细胞核染色(DAPI)得到证实。 微弱的荧光与细胞分裂中期细胞中的染色体相关(图6.A，插入物)。

[0188] GFP-标记的拟南芥NAP1-样蛋白也唯一定位于悬浮培养的拟南芥细胞的细胞核中(图6.B)。

[0189] 2)在磷酸组蛋白底物上紫花苜蓿NAP1-样蛋白体外抑制PP2A磷酸酶活性

[0190] 将多种浓度的纯化紫花苜蓿NAP1-样蛋白加入到含有兔骨骼肌PP2A的催化亚单位及磷酸化组蛋白H2A，或糖原磷酸化酶作为底物的反应混合物中。观察到NAP1-样蛋白甚至在500mM的浓度对糖原磷酸化酶的脱磷酸作用没有影响，但是2.5mM浓度的NAP1-样蛋白已经有效地抑制了PP2A对磷酸组蛋白H2A底物的活性(活性降低50％)。

[0191] 结论

[0192] 紫苜蓿和拟南芥NAP1-样蛋白显示结构和功能的相似性。 植物NAP1-样蛋白体外抑制组蛋白底物上的磷酸酶(PP2A)活性，表明可能对染色质结构和基因转录有体内作用。