农杆菌介导的杜仲转基因方法

摘要

本发明涉及一种农杆菌介导的杜仲转基因方法。一种农杆菌介导的杜仲转基因方法，包括下列步骤：a.将杜仲种子接种到MS培养基中，然后将胚剥出，再接种到附加赤霉素的MS培养基中；b.用1/2MS重悬培养基重悬离心收集的农杆菌菌体制得农杆菌菌液；c.将种胚胚轴外植体，接种到诱导培养基于黑暗中培养后，投入农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，转入共培养基上培养，然后转入筛选培养基中诱导不定芽的再生，最后将材料接种到生根培养基中诱导生根。本发明建立了农杆菌介导的杜仲遗传转化体系，为通过转基因技术深入研究并发掘杜仲的药用、胶用价值奠定了基础。采用本方法胚轴遗传转化率为2.8％左右。

权利要求

1.一种农杆菌介导的杜仲转基因方法，包括下列步骤：

a、杜仲种子经4℃冷处理至少3天，将处理过的杜仲种子接种到MS培养基中，待种胚突破种皮0.4-0.7cm左右时，将胚剥出，接种到附加1.0-2.0mg/L赤霉素的MS培养基中；

b、将含有pBin19重组质粒的农杆菌单菌落，用牙签挑取，加入到YEP液体培养基中培养震荡培养，直到OD值达到0.4～0.7，离心收集菌体，用1/2MS重悬培养基重悬制得农杆菌菌液，农杆菌菌液OD值为0.3-0.4，所述重组质粒中含有β-葡萄糖苷酸酶基因和重组酶基因flp；

c、将20天龄种胚胚轴切成0.4-0.7cm左右的外植体，接种到诱导培养基于黑暗中预培养后，投入步骤b制得的农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，转入共培养基上培养，然后转入筛选培养基1中诱导不定芽的再生，再在筛选培养基2中进行壮苗，最后将材料接种到生根培养基中诱导生根；所述外植体在诱导培养基和共培养基上的培养时间均为48-72小时；

所述的共培养基中含有50mg/L乙酰丁香酮及20g/L蔗糖，1/2MS重悬培养基中含有

20g/L蔗糖，

所述筛选培养基1中含有0.8mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、

100mg/L Tinmentine及30g/L蔗糖，筛选培养基2中含有1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及30g/L蔗糖，所述生根培养基中含有1.5mg/L吲哚丁酸、1g/L活性炭、50mg/L卡那霉素、100mg/LTinmentine及20g/L蔗糖。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的杜仲转基因方法，所述外植体在投入步骤b制得的农杆菌菌液之前，划出横向或纵向深至表皮的伤口。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的杜仲转基因方法，所述植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养条件为光照强度为2000 lx，每日光照16小时，培养温度26±2℃。

说明书

农杆菌介导的杜仲转基因方法

技术领域

[0001] 本发明所属的技术领域为生物技术领域，进一步，本发明涉及一种农杆菌介导的杜仲转基因方法。

背景技术

[0002] 杜仲Eucommia ulmoides Oliv.单种属，单属科，为我国特有树种，是杜仲科Eucommiaceae杜仲属仅存的孑遗植物，现已作为稀有植物被列入《中国植物红皮书——稀有濒危植物》第一卷。杜仲既是常用贵重中药之一，也是温带最有开发利用前景的胶源植物。严瑞芳等通过硫化杜仲胶技术，极大的拓宽了杜仲胶的应用范围。杜仲胶合成过程中的几个关键酶已被克隆，杜仲药用成分分离及相关基因克隆等方面的研究已成为的热点。利用转基因技术将外源功能基因遗传转化杜仲，从而进一步研究杜仲橡胶及其药用成分的生物合成机理，以及改良杜仲品质意义重大。

[0003] 杜仲是组织培养较为困难的一种木本植物。目前有关其再生体系的研究较少，且多为体细胞胚发生途径，直接器官发生的正式报道国内未见。由于组织培养较为困难，迄今尚未见到有关杜仲遗传转化方面的报道。

发明内容

[0004] 针对上述领域中的空白，本发明提供一种农杆菌介导的杜仲转基因方法，为通过转基因技术深入研究并发掘杜仲的药用、胶用价值奠定了基础。

[0005] 一种农杆菌介导的杜仲转基因方法，包括下列步骤：

[0006] a、将杜仲种子接种到MS培养基中，待种胚突破种皮0.4-0.7cm左右时，将胚剥出，接种到附加1.0-2.0mg/L赤霉素的MS培养基中；

[0007] b、将农杆菌单菌落加入YEP液体培养基培养，直到OD值达到0.4～0.7，离心收集菌体，用1/2MS重悬培养基重悬制得农杆菌菌液；

[0008] c、将种胚胚轴切成0.4-0.7cm左右的外植体，接种到诱导培养基于黑暗中培养后，投入步骤b农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，转入共培养基上培养，然后转入筛选培养基1中诱导不定芽的再生，再在筛选培养基2中进行壮苗，最后将材料接种到生根培养基中诱导生根。

[0009] 所述的共培养基中含有50mg/L乙酰丁香酮及20g/L蔗糖，1/2MS重悬培养基中含有20g/L蔗糖。

[0010] 所述筛选培养基1中含有0.8mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Timentine及30g/L蔗糖，筛选培养基2中含有1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Timentine及30g/L蔗糖。

[0011] 所述生根培养基中含有1.5mg/L吲哚丁酸、1g/L活性炭、50mg/L卡那霉素、100mg/LTimentine及20g/L蔗糖。

[0012] 所述杜仲种子经4℃冷处理至少3天。

[0013] 所述农杆菌菌液OD值为0.3-0.4。

[0014] 所述步骤c种胚为20天龄。

[0015] 所述外植体在诱导培养基和共培养基上的培养时间均为48-72小时。

[0016] 所述外植体在投入农杆菌菌液之前，划出横向或/纵向深至表皮的伤口。

[0017] 植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养条件为光照强度为2000lx，每日光照16小时，培养温度(26士2)℃。

[0018] 实验中生根培养基及1/2MS重悬培养基为1/2MS培养基，其余培养基均为MS常规培养基。

[0019] 杜仲种胚含有较多的未分化及分化程度较浅的分生细胞，具有很强的再生活性，在合适的生长素及细胞分裂素浓度下，其伤口处皮层可分化形成芽原始体并高频直接再生不定芽。本实验选取杜仲种胚为外植体，通过分生细胞器官直接发生途径进行不定芽诱导，诱导情况见“图2”，具有诱导率高，稳定性高，变异低，利于进行农杆菌介导的遗传转化的优点。采用本方法胚轴遗传转化率为2.8％左右。

[0020] 由于缺少高效的杜仲组织培养再生体系，尚未见到有关杜仲遗传转化方面的报道。本研究采用杜仲胚轴为外植体，直接诱导不定芽发生，完善了杜仲不定芽诱导再生体系。在上述研究的基础上，筛选出较合理的遗传转化方案，建立了农杆菌介导的杜仲遗传转化体系，为通过转基因技术，深入研究并发掘杜仲的药用、胶用价值奠定了基础。

附图说明

[0021] 图1.筛选25d杜仲胚轴不定芽诱导情况(整皿)

[0022] 其中，a为转基因材料(整皿)，b为非转基因对照(整皿)。

[0023] 图2.通过分生细胞器官直接发生途径对杜仲胚轴进行不定芽诱导情况“a图”为筛选25d杜仲胚轴不定芽(此图为“图1，a”中单个外植体的放大图)，“b图”为筛选45d杜仲胚轴不定芽。

[0024] 图3.杜仲转基因材料的壮芽，及获得的生根试管苗

[0025] 图4.转基因植株的GUS染色检测结果

[0026] 其中，a为转基因植株叶片染色情况，b为非转基因对照植株叶片染色情况。

[0027] 图5.转基因杜仲PCR检测结果

[0028] 其中，第1道为Marker(λDNA经BamH I，HindIII双酶切得到)，第2道为非转基因对照，第3道为阳性质粒，第4、5、6道为杜仲转基因材料。

具体实施方式

[0029] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0030] 培养基及培养条件：共培养基中含有50mg/L乙酰丁香酮，及20g/L蔗糖，1/2MS重悬培养基中含有20g/L蔗糖，筛选培养基1中含有0.8mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及30g/L蔗糖，筛选培养基2中含有1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及30g/L蔗糖，生根培养基中含有1.5mg/L吲哚丁酸、1g/L活性炭、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及20g/L蔗糖，实验中生根培养基及1/2MS重悬培养基为1/2MS培养基，其余培养基均为MS常规培养基。植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养条件为光照强度为2000lx，每日光照16小时，培养温度(26士2)℃。其中1L MS培养基中包含：硝酸钾(KNO3)1900毫克，硝酸铵(NH4NO3)1650毫克，氯化钙(CaCl2·2H2O)440毫克，硫酸镁(MgSO4·7H2O)370毫克，磷酸二氢钾(KH2PO4)170毫克，硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3毫克，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6毫克，硼酸(H2BO3)6.2毫克，碘化钾(KI)0.83毫克，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克，乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)37.25毫克，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8毫克，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025毫克，氯化钴(COCl2·6H2O)0.025毫克，肌醇100毫克，烟酸0.5毫克，盐酸硫胺素(维B1)0.1毫克，盐酸吡哆素(维B6)0.5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5.80。1LYEP培养集中包含：5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl，PH值7.20。

[0031] 1、杜仲胚轴抗生素敏感性实验

[0032] 本实验中用于杜仲遗传转化的构建中含有卡那霉素抗性基因，因此采用卡那霉素对转基因植株进行筛选，另外本实验采用Tinmentine作为杜仲材料在组培过程当中的农杆菌抑制剂。在杜仲诱导培养基中，分别附加0mg/L卡那霉素，0mg/L卡那霉素、100mg/LTinmentine，25mg/L卡那霉素，50mg/L卡那霉素和100mg/L卡那霉素。将0.5cm左右的胚轴切段，接种到上述培养基中，25d后统计材料的分化及存活情况。结果表明，100mg/L的Tinmentine对杜仲胚轴及子叶的分化影响不大，故在筛选时我们采用100mg/L的Tinmentine抑菌。杜仲胚轴对转基因材料比较敏感，当卡那霉素浓度为25mg/L时，外植体死亡率为45.3％，个别材料出现芽苗分化，但产生的芽严重玻璃化，不能正常生长；当卡那霉素浓度为50mg/L时，外植体黄化、玻璃化严重，死亡率65.6％，没有不定芽的分化；当卡那霉素浓度达到100mg/L时，绝大多数外植体死亡率。我们选择的筛选压为卡那霉素50mg/L，并附加100mg/L Tinmentine抑制农杆菌的生长。

[0033] 2、农杆菌介导的外源基因遗传转化杜仲胚轴

[0034] 2.1材料及培养条件：取杜仲种子(采自贵州大学花溪南校区校园)，剥去外皮，置于4℃冰箱冷处理至少3天中待用。光照强度为2000lx，每日光照16h，培养温度(26士2)℃。

[0035] 2.2材料消毒方法：取4℃保存的种子，用自来水冲洗30min，在超净工作台中，用无菌水浸泡15min，再用75％酒精消毒60s后转入0.1％升汞水中浸泡30min，无菌水漂洗5次，浸泡过夜。将消毒后的种子接种到MS培养基中。

[0036] 2.3接种：待种胚突破种皮0.5cm左右时，取长势较好的材料将胚剥出，用常规无菌操作方法，接种到附加1.0-2.0mg/L赤霉素的MS培养基中，使其快速伸长。3周左右种胚可伸长至3cm左右(由于去除了种皮的束缚，材料的生长较为一致)

[0037] 2.4农杆菌的准备：用接种针蘸取-80℃冻存的含有pBin19重组质粒(重组质粒中含有β-葡萄糖苷酸酶基因和重组酶基因flp)的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，28℃恒温培养24h左右，直到长出合适大小的菌斑。用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，200rpm 28℃震荡培养24h，于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基中，200rpm28℃震荡培养，直到OD值达到0.4～0.7。将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体。用1/2MS重悬培养基重悬离心收集的农杆菌，调节菌液OD值在0.3～0.4之间。

[0038] 2.5植物材料的农杆菌侵染：取20d龄种胚，将胚轴切成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72d，在预培养的外植体上划出几条横向、纵向伤口(深度至表皮)以扩大受伤面积，投入预先准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6～8min后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上，培养48h-72h。立刻转入筛选培养基1中诱导不定芽的再生。转基因植物与对照的筛选，及不定芽直接诱导情况分别见图1和图2。在含有50mg/L卡那霉素的筛选培养基中，由于导入了卡那霉素抗性基因，因此转基因材料能够分解培养基中的卡那霉素，故能够存活；而非转基因对照材料死亡。

[0039] 2.6分化及壮苗：材料转入筛选培养基1后4-5周可见小芽萌发(接种25天后转基因材料、及非转基因对照材料胚轴的不定芽诱导情况见图1)，诱导出的不定芽在筛选培养基2中进继代2次，约4-5周，小苗可长至3-4公分高。(见图2，b)

[0040] 2.7完整植株的获得：将小苗转至生根培养基中诱导生根。2周后材料下端长出白色小根，继续培养即获得杜仲转基因植株试管苗。(见图3)

[0041] 3、转基因植株的GUS及PCR检测

[0042] (1)GUS基因的活性检测：本实验中用于杜仲遗传转化的构建中含有β-葡萄糖苷酸酶基因，可进行GUS染色。取待检测材料的叶片清洗后抽真空，于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸染色液(X-Gluc 0.5mg/mL，100mmol/L磷酸缓冲液ph＝7.0，0.1％Triton X100，1mmol/L铁氰化钾，1mmol/L亚铁氰化钾)中于37℃下保温过夜，然后分别用10％，25％，50％，75％，95％的乙醇脱色，每种浓度的乙醇分别脱色5min，最后组织继续放在95％的乙醇溶液中浸泡，直到绿色退去。

[0043] 检测结果见“图4”。经过GUS染色，转基植株的叶片因呈蓝色，而对照植株的叶片没有着色，呈白色。

[0044] (2)转基因杜仲植株的PCR检测：本实验中用于杜仲遗传转化的构建中含有flp基因，因此采用flp引物对转基因植株进行PCR检测。CTAB法提取杜仲基因组DNA，以基因组DNA为模版利用flp引物进行PCR扩增，待扩增片段长度为1270bp。

[0045] (25ul)PCR扩增体系：2.5ul 10X PCR buffer，1.0ul 25mmol MgCL2，0.5ul 10mmol dNTP，1.0ulDNA模版，各1.0ul 20mmol flp引物，0.5ul 5u/ul tag酶)，反应条件为：94℃7min，(94℃30s，63℃1min，72℃1min)35cycle，72℃7min。

[0046] flp引物序列：flp-Ks-F，5’ggg gta ccc aag tcg acc aat gcc aca att tgg tat att atg 3’

[0047] flp-x-R，5’ccg atc gag tta tat gcg tct att tat gta gg 3’[0048] 检测结果见“图5”。第4、5、6道的杜仲转基因材料扩增出了1270bp的带，结果与阳性质粒一致，而非转基因对照材料没有扩增出带。