生物催化制备(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法

摘要

生物催化制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法，属于生物不对称还原制备手性卤代羟基丁酸酯技术领域。本发明利用筛选并保藏的高对映体选择性羰基还原酶的产生菌葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)等，在优化条件下发酵产酶，湿菌体在单一水相体系中，以4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯为底物，并添加葡萄糖和大孔树脂，制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯。当底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯浓度为30g/L，转化6h，得到产物(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯浓度26.2g/L、光学纯度88.9％e.e、摩尔转化率87.3％，在整个反应过程中不需要添加辅酶。

权利要求

1.生物催化制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征是以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在单一水相体系中，以4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯为底物，在酶反应过程中补充添加底物，并添加葡萄糖和大孔树脂，制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯，步骤如下：(1)菌株：葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602、CICC 1023、CICC1328、CICC 1494、CICC 1445、CICC 1625，酿酒 酵母(Saccharomycescerevisiae)AS2.1429、AS2.23、AS2.146、AS2.240；

(2)湿菌体的培养：培养基组成以g/L计为：醋酸钠10～100，玉米浆10～100，磷酸二氢钾1～10，硫酸镁0.1～1，pH为4～9，温度20～40℃，培养1～5天，发酵液过滤获得湿菌体；

(3)配制反应体系：以4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯为底物，用0.1M，pH 5.0的柠檬酸缓冲液配制成反应体系，底物浓度以g/L计为10～500；

(4)酶转化反应：在反应体系中加入湿菌体，加湿菌体量为1～20g/g底物，酶反应温度为20～50℃，反应时间为1～20小时；在酶反应过程中补充添加底物，并添加葡萄糖和大孔树脂；

(5)转化液后处理：转化液过滤或离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再脱水，脱色，蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(R)-4，

4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述菌株采用葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述酶转化反应，底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯起始浓度为10g/L，在反应过程中补充添加底物至500g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述酶转化反应，在反应过程中添加葡萄糖，其浓度为10～70g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述酶转化反应，在反应过程中添加大孔树脂，树脂与底物的质量比为0.6～6∶1，大孔树脂为HPD300。

说明书

生物催化制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法

技术领域

[0001] 生物催化制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法，属于生物不对称还原制备手性卤代羟基丁酸酯技术领域。

[0002] 背景技术

[0003] (R)-4，4，4- 三 氟 -3- 羟 基 丁 酸 乙 酯 ((R)-Ethyl 4，4，4-trifluoro-3-hydroxybutanoate)是一种重要有机合成中间体，是合成抗抑郁剂单胺氧化酶-A抑制剂贝氟沙通(Befloxatone)的手性切块，还是生产L-三氟苏氨酸和D-三氟苏氨酸的前体。由于4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯是非常经济有效的制备途径，而且反应产物(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯不易为微生物代谢利用，用微生物活细胞催化方法制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯非常有利。

[0004] 目前所知的从4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯还原为手性醇的方法主要路径是微生物催化不对称还原法，即通过完整的微生物细胞(如面包酵母)的立体选择性生物催化来实现，但要筛选获得高立体选择性的优良微生物菌株比较困难；同时也需要添加辅酶，并不断供给能量物质，另外还有底物对菌体的毒性及在水溶液中的不稳定性问题。

[0005] 发明内容

[0006] 本发明的目的是提供了产高立体选择性羰基还原酶的微生物，提供了一种新的能有效催化不对称还原反应制备手性卤代羟基丁酸酯的方法，并利用该类微生物菌株催化4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯不对称还原，以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度的(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯。

[0007] 本发明的技术方案：以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在单一水相体系中，以4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯为底物，在酶反应过程中补充添加底物，并添加葡萄糖和大孔树脂，制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯，步骤如下：

[0008] (1)菌 株：葡 萄 汁 酵 母 (Saccharomyces uvarum)ATCC26602、CICC 1023、CICC1328、CICC 1494、CICC 1445、CICC 1625，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AS2.1429、AS2.23、AS2.146、AS2.240；

[0009] (2)湿菌体的培养：培养基组成以g/L计为：醋酸钠10～100，玉米浆10～100，磷酸二氢钾1～10，硫酸镁0.1～1，pH为4～9，温度20～40℃，培养1～ 5天，发酵液过滤获得湿菌体；

[0010] (3)配制反应体系：以4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯为底物，用0.1M，pH 5.0的柠檬酸缓冲液配制成反应体系，底物浓度以g/L计为10～500；

[0011] (4)酶转化反应：在反应体系中加入湿菌体，加湿菌体量为1～20g/g底物，酶反应温度为20～50℃，反应时间为1～20小时；在反应过程中补充添加底物，并添加葡萄糖和大孔树脂，所得的转化液进行手性气相色谱分析(GC)测定。

[0012] (5)转化液后处理：转化液过滤或离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再脱水，脱色，蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯。

[0013] 产物(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯提取的具体操作为：转化反应结束后，将反应液离心(8,000g×20min，4℃)，上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取三次，吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并乙酸乙酯萃取液和洗脱液，再向其中加入1～5％(w/v)的无水硫酸镁，搅匀后静置过夜，除去残余的水份。将有机相用滤纸过滤，收集有机相。70℃水浴旋转蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯。取(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5mL，用GC-MASS进行定性分析，样品与标准品(Sigma Co.)质谱图对照，确定为同一物质。

[0014] 菌株采用葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602，即SW-58，其转化效果较优。

[0015] 配制反应体系，或采用在湿菌体培养发酵液中直接添加以g/L计为10～500的4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯为底物。

[0016] 酶转化反应，底物起始浓度为10g/L，在反应过程中补充添加底物至500g/L。 [0017] 在反应过程中添加葡萄糖，其浓度为10-70g/L。

[0018] 在反应过程中添加大孔树脂，采用添加树脂是用来吸附底物、产物，以抑制底物、产物对菌体的毒性。树脂与底物的质量比为0.6-6∶1，大孔树脂为DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-II、X-5大孔吸附树脂，D201GF、D392、D315、D290、D280、D293大孔阴离子树脂，HD-2、D61、D001、HD-1、D001-CC、D113大孔阳离子树脂，所述大孔树脂的孔径为100～180 。上述树脂均为市兽，如上海华东理工大学华震科技开发公司、南开大学化工厂等产品。

[0019] 本发明筛选得到的能有效催化不对称还原反应制备手性卤代羟基丁酸酯的微生物菌株是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602(即SW-58，江南大学生物催化研究室的保藏编号)、CICC 1023、CICC1328、CICC 1494、CICC1445、CICC 1625，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.1429、AS2.23、AS2.146、AS2.240等，将此菌种移种到含1～10(g/L)，4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯 的麦芽汁琼脂培养基上，20～40℃培养3～7天，检出在含高浓度4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯培养基上生长的菌落。作为催化不对称还原反应制备手性卤代羟基丁酸酯的菌株。

[0020] 含4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯的麦芽汁琼脂培养基由麦芽粉配成10°Be′的麦芽汁加20g/L的琼脂制成。斜面培养：配制含麦芽粉浸汁50～300g/L，琼脂10～25g/L，pH6～9的培养基。100～121℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种，20～40℃培养2～7天。

[0021] 底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯与产物(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的气相色谱(GC)测定：反应结束后，用适量的乙酸乙酯萃取，无水MgSO4脱水，过滤，加入适量内标物(十六烷)，定容后用GC分析。使用VARIAN3900气相色谱仪，VARIAN CP WAX 52CB极性色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，色谱条件为：进样量：0.5μL，进样口：250℃，检测器：250℃，流量：2.0ml/min，采用程序升温：100℃保留2min，以5℃/min升温至180℃，保留
5min，载气H2流速：30mL/min，尾吹N2流速：25mL/min，燃烧气H2流速：30mL/min，空气流速：
300mL/min。

[0022] 产物(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯对映异构体过量值(e.e.)测定采用手性气相色谱法。手性色谱柱：CP-Chirasil Dex CB 25m×0.25mm×0.25μm；色谱条件为：10℃保留2min，以2℃/min升温至140℃保留2min；进样量0.2μL；柱流速2.0mL/min；载气H2流速30mL/min，燃烧气H2流速30mL/min，空气流速300mL/min，尾吹N2流速：25mL/min；进样口：250℃，检测器：250℃，分流比：50∶1。

[0023] 本发明的有益效果：本发明筛选获得了高对映体选择性的葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)等，在单一水相体系中催化不对称还原4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯生成的(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯对映体过量值达到89％e.e.，在反应体系中添加树脂，供给能量物质，添加高浓度底物，可以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度，更主要的是在整个反应过程中不需要添加辅酶。

[0024] 本发明微生物转化法相对于传统的化学不对称合成法、面包酵母氧化还原方法或+用添加辅酶NADH/NAD 的酶催化不对称还原方法具有以下优点：①生成的(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯对映体过量值高，达到89％e.e.；②生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉；③在反应体系中添加树脂，供给能量物质，添加高浓度底物，可以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度；④在整个反应过程中不需要添加辅酶；
⑤反应条件温和，环境友好。

[0025] 生物材料样品说明

[0026] 本发明所用的葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602(即SW-58)、 CICC 1023、CICC1328、CICC 1494、CICC 1445、CICC 1625，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.1429、AS2.23、AS2.146、AS2.240。其中ATCC编号菌种保存于美国模式菌种收集中心，CICC编号菌种保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，AS编号菌种保存中国微生物菌种保藏管理中心。

[0027] 具体实施方式

[0028] 实施例1产羰基还原酶微生物菌株的筛选

[0029] 斜面培养：培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g，pH 6.0，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为表1所示的各种微生物菌株，28℃培养2天，作为斜面活化种子。

[0030] 种子培养和发酵：醋酸钠60g/L，玉米浆30g/L，KH2PO4 6g/L，MgSO4·7H2O1g/L，pH6.0，装液量为250mL三角瓶装液50mL，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，160r/min的摇床，28℃培养36小时，作为种子或发酵酶液。

[0031] 发酵酶液中湿菌体量为2.5g/100mL，离心10分钟(8,000转/分钟)收集菌体，用柠檬酸缓冲液(0.1M，pH 5.0)清洗两次，将菌体转入25mL含葡萄糖的相同的缓冲液中，使菌体浓度为发酵液中的两倍，同时加入0.25g底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯，于30℃，160r/min下反应。反应6小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgSO4干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表1。

[0032] 表1：产羰基还原酶微生物菌株的筛选

[0033]

[0034] 实施例2添加不同葡萄糖浓度对转化的影响

[0035] 葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602(SW-58)，按实施例1方法产酶培养36小时后，称取2g湿菌体加于250mL三角瓶装50mL 0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液中，含底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯量为0.5g/瓶，分别添加不同浓度的葡萄糖，质量浓度为0g/L，10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L，60g/L，70g/L，于30℃，160r/min下进行转化反应，反应
6小时后结束，测定其产物量及对映体过量值。反应液离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgSO4干燥，过滤后进行气相色谱分析(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表2。

[0036] 表2：添加不同葡萄糖浓度对转化的影响

[0037]

[0038] 由表2可以看出，添加葡萄糖并不影响产物的对映体过量值，而其产率则随葡萄糖浓度的增加有所增加。

[0039] 实施例3不同的菌体量对转化的影响

[0040] 葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按实施例1方法产酶培养36 小时后，发酵酶液中湿菌体量为1.5g/100mL，称取0.25～2.0g湿菌体加于250mL三角瓶装0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液25mL，起始底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯量为0.25g/瓶，于
30℃，160r/min下进行转化反应。6小时后反应结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgSO4干燥，过滤后进行气相色谱分析(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表3。

[0041] 表3：不同的菌体量对转化的影响

[0042]

[0043] 由表3可以看出，随着菌体量的增加，反应的转化率逐渐上升，而对映体过量值基本没有变化。

[0044] 实施例4不同底物浓度对转化的影响

[0045] 葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按实施例1方法产酶培养36小时后，发酵酶液中湿菌体量为1.5g/100mL，称取2.0g湿菌体加于250mL三角瓶装0.1M，pH 5.0柠檬酸缓冲液25mL，起始底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯量为0.13～1.13g/瓶(5～45g/L)，于30℃，160r/min下进行转化反应。6小时后反应结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgSO4 干燥，过滤后进行气相色谱分析(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表4。

[0046] 表4不同底物浓度对转化的影响

[0047]

[0048] 由表4可知，反应的转化率随底物浓度的增加而降低，底物浓度超过30g/L以后，反应的转化率和对映体过量值均有明显的下降。

[0049] 实施例5转化时间曲线

[0050] 葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按实施例1方法发酵产酶，按实施例2方法进行转化反应，25mL反应体系中含底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯量为0.6g(24g/L)。
于反应不同时间取样，进行气相色谱分析(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯含量并计算转化产率，结果如表5。

[0051] 表5：转化时间曲线

[0052]

[0053] 由表5可知，转化时间为6h产物浓度最高，对映体过量值不随转化时间的增加而变化。

[0054] 实施例6添加树脂对转化的影响

[0055] 葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按实施例1方法产酶培养36小时后，发酵酶液中湿菌体量为1.5g/100mL，称取2.0g湿菌体加于250mL三角瓶装0.1M，pH 5.0柠檬酸缓冲液25mL，起始底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯量为0.75g/瓶(30g/L)，反应体系中添加树脂HPD300，添加量按说明书所述范围，于30℃，160r/min下进行转化反应。6小时后反应结束，滤纸过滤，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，适量无水MgSO4干燥，过滤后进行气相色谱分析(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯含量与对映体过量值，结果如表6。

[0056] 表6添加树脂对转化的影响

[0057]

[0058] 由表6可知，通过在反应体系中添加树脂HPD300后，转化后产物浓度有了明显的提高，并且对映体过量值也有一定的上升。

[0059] 实施例7

[0060] 用葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按实施例1方法发酵产酶，按实施例5方法进行转化，起始底物4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯浓度30g/L，转化6h反应结束后，将反应液离心(5,000rpm，20min，4℃)，得均一透明的淡黄色上清液300mL，测定(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的浓度为15.01g/L，上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，再向其中加入1～3％(w/v)的无水硫酸镁，搅拌后静置过夜，除去残余的水份。将所得有机相用滤纸过滤，收集有机相。80℃水浴旋转蒸干溶剂，得无色稠状产物粗品6.31g，GC分析其纯度为71.55％。

[0061] 粗产品6.31g用硅油浴进行减压蒸馏，在5～7mmHg条件下，在80～83℃时收