用于制备治疗脑神经胶质肿瘤药物的三萜类化合物转让专利
申请号 : CN200610123299.5
文献号 : CN1951952B
文献日 : 2011-01-05
发明人 : 黄新安 , 胡英杰 , 符林春 , 邓文娣
申请人 : 广州中医药大学热带医学研究所
摘要 :
本发明公开了一种制备抗脑神经胶质瘤的三萜类药物，该药物为仙客来亭A的衍生物，仙客来亭A又名仙客拉敏A，英文名cyclamiretin A。本发明首次公开了仙客来亭A的衍生物具有抗脑神经胶质瘤的优异特性，可制成治疗神经胶质瘤药物。
权利要求 :
1.一种三萜化合物ardisiacrispin A或ardicrenin在制备抗神经胶质瘤药物中的应用，ardisiacrispin A和ardicrenin的化学结构式如下：化合物ardisiacrispin A：
取代基A＝β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖；
化合物ardicrenin：
取代基A＝α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于是从报春花科植物Lysimachia patungensis、Lysimachia paridiformis、Primula den ticulata、Cyclamen coum var.coum、Cyclamenmirabila、Cyclamen neapolitanum、Cyclamen europaeum 和 Cyclamen graecum中提取的化合物；以及从紫金牛科植物Myrsine pellucida、Androsace saxifragifolia、Ardisia crispa、Myrsine australis、Myrsine pellucida、Ardisia pusilla、Ardisia crenata、Ardisiajaponica、Ardisia mamillata中提取的化合物，该化合物结构符合权利要求1所声明的化学结构式。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是用于制备抗脑神经胶质瘤药物。
4.一种包含如权利要求1所述的三萜类化合物的组合物在制备抗神经胶质瘤药物中的应用，其特征在于所述的药物可以是一种组合物，该组合物至少含有ardisiacrispin A或ardicrenin中的1种以上化合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的药物可以被制成药学上可接受的剂型。
说明书 :
用于制备治疗脑神经胶质肿瘤药物的三萜类化合物
技术领域
[0001] 本发明属于中药和植物药技术领域，特别是涉及到能抗神经胶质瘤的天然药物。脑神经胶质瘤呈浸润性生长，危害严重而又难治。当前临床一线应用的主要药物是烷化剂类抗癌药，如亚硝基脲类药物洛莫斯汀或者替莫唑胺，有包括致癌、致畸胎在内的毒副作用。即使手术、放射疗法与化疗药物相结合，治疗效果也难以令人满意。关键问题之一，是尚未发现高效低毒的化疗药物。
发明内容
[0002] 本发明提供了一类具有良好抗神经胶质瘤的三萜类药物。这类药物具有仙客来亭A，或者clamiretin A结构，具体地，是仙客来亭A的衍生物，具有如下结构通式所示的化学结构：
[0003]
[0004] 通式中A代表为糖链，由α-L-吡喃鼠李糖基、β-D-吡喃葡萄糖基、α-L-吡喃阿拉伯糖和β-D-吡喃木糖基中的一种或多种糖基构成，可为直链或分支糖链，包括，但不仅限于如下结构形式：
[0005] 化合物ardicrenin：取代基A＝α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖，
[0006] 化合物Ardipusilloside I：取代基A＝α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖，
[0007] 化合物ardipusilloside II：取代基A＝β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-[β-D-吡喃 木 糖 基-(1 → 2)]-β-D-吡 喃 葡 萄 糖 基 -(1 →4)-[β-D- 吡 喃 葡 萄 糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖，
[0008] 化合物ardisiacrispin A：取代基A＝β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖；
[0009] 化合物ardisiacrispin B：取代基A＝α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖，
[0010] 化合物cyclamin：取代基A＝β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖，
[0011] 化合物cyclaminorin：取代基A＝β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖，
[0012] 化合物deglucocyclamin II：取代基A＝β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃阿拉伯糖，
[0013] 化合物denticulatin：取代基A＝β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-{β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)}-α-L-吡喃阿拉伯糖。
[0014] 化合物Paridiformoside：取代基A＝α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖，
[0015] 化合物saxifragifolin D：取代基A＝β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖，
[0016] 化合物仙客来亭A-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷：取代基A＝L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖。
[0017] 具有结构通式所示的天然化合物，即可用作药物制剂的活性成分，或活性成分之一，用于制备抗神经胶质瘤的药物，可制成片剂、胶囊、颗粒剂、或者口服液。
[0018] 本发明所说的天然化合物，是指从植物中提取的，特别是指从报春花科植物Lysimachiapatungensis、Lysimachia paridiformis、Primula denticulata、Cyclamen coum var.coum、Cyclamen mirabila、Cyclamen neapolitanum、Cyclamen europaeum和Cyclamen graecum中提取的符合上述化学结构通式的化合物；以及从紫金牛科植物Myrsine pellucida、Androsace saxifragifolia、Ardisia crispa、Myrsine australis、Myrsine pellucida、Ardisia pusilla、Ardisia crenata、Ardisia japonica、Ardisia mamillata中提取的符合上述化学结构通式的化合物。
[0019] 本发明所说的从植物中提取，是本领域工作人员都能够掌握和采用的方法：用含水体积百分数为1％-90％的低级醇，如甲醇、乙醇、或丙醇，在室温条件下，或者是溶剂沸点温度以下，从植物，特别是指报春花科或紫金牛科植物中提取。
[0020] 本发明所说的符合上述化学结构通式的天然化合物，是指从上述提取物中，用本领域工作人员都能够掌握和采用的色谱柱层析方法(色谱柱的填料为硅胶，或辛烷基烷化硅胶，或十八烷基烷化硅胶，或大孔树脂，或葡聚糖凝胶)分离纯化，并经过波谱解析识别和确定了结构的天然来源的化合物。
[0021] 本发明所说的天然来源化合物的衍生物，是指具有仙客来亭A结构的三萜类衍生物。当取代基A＝β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖时的衍生物，即化合物ardisiacrispin A，当取代基A＝α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖时的衍生物，即化合物ardisiacrispin B。
[0022] 本发明的特点和突出进步在于：首次公开了具有仙客来亭A结构的三萜类化合物对脑神经胶质瘤的药物治疗作用。
[0023] 本发明首次公开了这类三萜类化合物具有显著的抗神经胶质瘤作用。例如，化合物ardicrenin和ardisiacrispin A对神经胶质瘤细胞SWO-38的半数毒性浓度TC50分别为3.4和4.2μg/ml。
[0024] 本发明公开的三萜类化合物抗神经胶质瘤药物，可以单独制成药物制剂，也可以与抗肿瘤药物制成复方制剂应用于临床。
具体实施方式
[0025] 以下用一些实施例进一步说明本发明的内容。但是这些实施例不得理解为对本发明权利要求的限制。
[0026] 实施例1 提取分离
[0027] 将1.2Kg阴干的巴东过路黄碎成粉末，用95％的乙醇浸渍3次，每次24小时，合并浸渍液，减压浓缩除去乙醇，得浸膏，用温水悬浮，悬浮液用乙酸乙酯萃取3次，萃取后的水层用正丁醇萃取3次。正丁醇部位上硅胶柱，以氯仿-甲醇系统为洗脱剂进行梯度洗脱，对氯仿-甲醇(80∶20，v/v)洗脱部分进行反复硅胶柱色谱，得化合物1和2。
[0028] 实施例2 化合物1的结构鉴定
[0029] 化合物1：无色晶体，mp 239-240℃，高分辩率质谱(HRESIMS)测得分子式为C53H86O22(C53H86O22Na的测试值m/z：1097.5480，理论值：1097.5503)。正离子ESI-MS m/+ + +z：1097.6[M+Na]，951.5[M+Na-rha]，789.4[M+Na-rha-glucose] ；负 离 子 ESI-MS m/+ + + +
z：1072.8[M-H]，927.0[M-H-rha]，910.3[M-H-glucose]，764.8[M-H-rha-glucose]。
1D NMR谱表明，化合物1为多个糖基三萜皂苷，用4mol/L盐酸-50％甲醇溶液加热回流4小时，反应液冷却、中和后，在高效硅胶薄层板上检出D-葡萄糖(Glc)、L-阿拉伯+ +
糖(Ara)和L-鼠李糖(Rha)。正离子ESI-MS m/z：1097.6[M+Na]，951.5[M+Na-rha]，+ + +
789.4[M+Na-rha-glucose] 和 负 离 子 ESI-MS m/z：1072.8[M-H]，927.0[M-H-rha]，+ +
910.3[M-H-glucose]，764.8[M-H-rha-glucose] 表明糖链具有分支结构，其中D-葡萄
1
糖和L-鼠李糖处在链端。氢谱 H NMR(C5D5N，500MHz)δ：0.81(3H，s，H-25)，1.00(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-29)，1.15(3H，s，H-23)，1.27(3H，s，H-26)，1.53(3H，s，H-27)，
1.81(3H，d，J ＝ 6.0，Rha-6 ″ ′ )，4.95(1H，bs，Ara-1 ′ )，5.25(1H，d，J ＝ 7.0，Glcinner-1″″)，5.38(1H，d，J＝7.6，Glcterminal-1″)，6.42(1H，bs，Rha-1″′)，9.63(1H，
13
s，H-30)；碳 谱 C NMR(C5D5N，125MHz)：39.2(C-1)，26.5(C-2)，89.2(C-3)，39.6(C-4)，
55.7(C-5)，17.9(C-6)，34.4(C-7)，42.6(C-8)，50.4(C-9)，36.9(C-10)，19.2(C-11)，
33.4(C-12)，86.4(C-13)，44.6(C-14)，36.8(C-15)，77.4(C-16)，44.1(C-17)，53.3(C-18)，
32.7(C-19)，48.3(C-20)，30.5(C-21)，32.4(C-22)，28.1(C-23)，16.5(C-24)，16.4(C-25)，
18.6(C-26)，19.8(C-27)，77.7(C-28)，24.1(C-29)，207.6(C-30)，104.1(Ara-1 ′ )，
80.7(C-2 ′ )，71.9(C-3 ′ )，78.4(C-4 ′ )，63.6(C-5 ′ )，105.1(Glcinner-1 ″ )，
74.7(C-2 ″ )，79.2(C-3 ″ )，78.0(C-4 ″ )，77.7(C-5 ″ )，62.6(C-6 ″ )，
101.3(Rha-1″′)，72.4(C-2″′)，72.7(C-3″′)，74.7(C-4″′)，69.5(C-5″′)，
18.6(C-6 ″ ′ )，102.8(Glcterminal-1 ″ ″ )，76.9(C-2 ″ ″ )，78.0(C-3 ″ ″ )，
71.8(C-4″″)，78.0(C-5″″)，62.7(C-6″″)。化合物1被鉴定为ardicrenin。
z：1072.8[M-H]，927.0[M-H-rha]，910.3[M-H-glucose]，764.8[M-H-rha-glucose]。
1D NMR谱表明，化合物1为多个糖基三萜皂苷，用4mol/L盐酸-50％甲醇溶液加热回流4小时，反应液冷却、中和后，在高效硅胶薄层板上检出D-葡萄糖(Glc)、L-阿拉伯+ +
糖(Ara)和L-鼠李糖(Rha)。正离子ESI-MS m/z：1097.6[M+Na]，951.5[M+Na-rha]，+ + +
789.4[M+Na-rha-glucose] 和 负 离 子 ESI-MS m/z：1072.8[M-H]，927.0[M-H-rha]，+ +
910.3[M-H-glucose]，764.8[M-H-rha-glucose] 表明糖链具有分支结构，其中D-葡萄
1
糖和L-鼠李糖处在链端。氢谱 H NMR(C5D5N，500MHz)δ：0.81(3H，s，H-25)，1.00(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-29)，1.15(3H，s，H-23)，1.27(3H，s，H-26)，1.53(3H，s，H-27)，
1.81(3H，d，J ＝ 6.0，Rha-6 ″ ′ )，4.95(1H，bs，Ara-1 ′ )，5.25(1H，d，J ＝ 7.0，Glcinner-1″″)，5.38(1H，d，J＝7.6，Glcterminal-1″)，6.42(1H，bs，Rha-1″′)，9.63(1H，
13
s，H-30)；碳 谱 C NMR(C5D5N，125MHz)：39.2(C-1)，26.5(C-2)，89.2(C-3)，39.6(C-4)，
55.7(C-5)，17.9(C-6)，34.4(C-7)，42.6(C-8)，50.4(C-9)，36.9(C-10)，19.2(C-11)，
33.4(C-12)，86.4(C-13)，44.6(C-14)，36.8(C-15)，77.4(C-16)，44.1(C-17)，53.3(C-18)，
32.7(C-19)，48.3(C-20)，30.5(C-21)，32.4(C-22)，28.1(C-23)，16.5(C-24)，16.4(C-25)，
18.6(C-26)，19.8(C-27)，77.7(C-28)，24.1(C-29)，207.6(C-30)，104.1(Ara-1 ′ )，
80.7(C-2 ′ )，71.9(C-3 ′ )，78.4(C-4 ′ )，63.6(C-5 ′ )，105.1(Glcinner-1 ″ )，
74.7(C-2 ″ )，79.2(C-3 ″ )，78.0(C-4 ″ )，77.7(C-5 ″ )，62.6(C-6 ″ )，
101.3(Rha-1″′)，72.4(C-2″′)，72.7(C-3″′)，74.7(C-4″′)，69.5(C-5″′)，
18.6(C-6 ″ ′ )，102.8(Glcterminal-1 ″ ″ )，76.9(C-2 ″ ″ )，78.0(C-3 ″ ″ )，
71.8(C-4″″)，78.0(C-5″″)，62.7(C-6″″)。化合物1被鉴定为ardicrenin。
[0030] 实施例3 化合物2的结构鉴定
[0031] 无 色 晶 体，mp 238-239 ℃，C52H84O22，正 离 子 ESI-MS m/z：1097.6[M+K]+，+ + +1083.6[M+Na] ，951.5[M+Na-xylose] ，789.4[M+Na-xylose-glucose] ； 负 离+ + +
子 ESI-MS m/z ：1058.6[M-H] ，926.5[M-H-xylose] ，896.5[M-H-glucose] ，+ 1
764.4[M-H-xylose-glucose]。H NMR(DMSO-d6，400MHz)：0.72(3H，s，H-24)，0.79(3H，s，H-25)，0.90(3H，s，H-29)，0.94(3H，s，H-23)，1.05(3H，s，H-26)，1.16(3H，s，H-27)，
4.38(1H，d，J＝7.4，Glcinner-1″)，4.40(1H，d，J＝7.6，Glcterminal-1″″)，4.44(1H，d，J
13
＝7.6，Ara-1′)，5.00(1H，dd，J＝7.6，Xyl-1″′)，9.38(1H，s，H-30)；C NMR(DMSO-d6，
100MHz)：38.5(C-1)，25.7(C-2)，88.1(C-3)，38.8(C-4)，54.8(C-5)，17.8(C-6)，
33.5(C-7)，43.6(C-8)，49.4(C-9)，36.1(C-10)，18.2(C-11)，31.8(C-12)，85.4(C-13)，
41.6(C-14)，35.6(C-15)，77.5(C-16)，42.9(C-17)，52.3(C-18)，32.4(C-19)，47.4(C-20)，
29.5(C-21)，31.3(C-22)，27.4(C-23)，15.9(C-24)，15.9(C-25)，17.9(C-26)，19.0(C-27)，
76.6(C-28)，23.7(C-29)，207.7(C-30)，102.5(Ara-1′ )，78.2(C-2′ )，72.4(C-3′ )，
74.4(C-4 ′ )，65.8(C-5 ′ )，103.1(Glcinner-1 ″ )，83.8(C-2 ″ )，76.7(C-3 ″ )，
69.6(C-4″)，76.6(C-5″)，61.1(C-6″)，103.2(Glcterminal-1″′)，76.6(C-2″′)，
77.5(C-3″′)，70.3(C-4″′)，76.3(C-5″′)，60.7(C-6″′)，105.8(Xyl-1″″)，
74.3(C-2″″)，76.4(C-3″″)，69.2(C-4″″)，65.8(C-5″″)。化合物2被鉴定为ardisiacrispin A。
子 ESI-MS m/z ：1058.6[M-H] ，926.5[M-H-xylose] ，896.5[M-H-glucose] ，+ 1
764.4[M-H-xylose-glucose]。H NMR(DMSO-d6，400MHz)：0.72(3H，s，H-24)，0.79(3H，s，H-25)，0.90(3H，s，H-29)，0.94(3H，s，H-23)，1.05(3H，s，H-26)，1.16(3H，s，H-27)，
4.38(1H，d，J＝7.4，Glcinner-1″)，4.40(1H，d，J＝7.6，Glcterminal-1″″)，4.44(1H，d，J
13
＝7.6，Ara-1′)，5.00(1H，dd，J＝7.6，Xyl-1″′)，9.38(1H，s，H-30)；C NMR(DMSO-d6，
100MHz)：38.5(C-1)，25.7(C-2)，88.1(C-3)，38.8(C-4)，54.8(C-5)，17.8(C-6)，
33.5(C-7)，43.6(C-8)，49.4(C-9)，36.1(C-10)，18.2(C-11)，31.8(C-12)，85.4(C-13)，
41.6(C-14)，35.6(C-15)，77.5(C-16)，42.9(C-17)，52.3(C-18)，32.4(C-19)，47.4(C-20)，
29.5(C-21)，31.3(C-22)，27.4(C-23)，15.9(C-24)，15.9(C-25)，17.9(C-26)，19.0(C-27)，
76.6(C-28)，23.7(C-29)，207.7(C-30)，102.5(Ara-1′ )，78.2(C-2′ )，72.4(C-3′ )，
74.4(C-4 ′ )，65.8(C-5 ′ )，103.1(Glcinner-1 ″ )，83.8(C-2 ″ )，76.7(C-3 ″ )，
69.6(C-4″)，76.6(C-5″)，61.1(C-6″)，103.2(Glcterminal-1″′)，76.6(C-2″′)，
77.5(C-3″′)，70.3(C-4″′)，76.3(C-5″′)，60.7(C-6″′)，105.8(Xyl-1″″)，
74.3(C-2″″)，76.4(C-3″″)，69.2(C-4″″)，65.8(C-5″″)。化合物2被鉴定为ardisiacrispin A。
[0032] 实施例4化合物1和2的抗肿瘤活性
[0033] 将生长良好的指数生长期SWO-38细胞用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA复合消化5
液消化；将细胞轻轻吹打制成2.5×10/ml的单细胞悬液，种于96孔培养板，100μl/孔，置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱培养至指数生长期，弃上清，将不同浓度的待测样品药液加入到培养孔中，100μl/孔，每浓度药液设三个复孔，另设细胞对照孔及空白对照孔。加药后再培养24小时，向每孔加活细胞计数(cell counting)试剂CCK-8 10μl，继续培养2小时，用酶标仪于450nm波长处测定吸光值A。
液消化；将细胞轻轻吹打制成2.5×10/ml的单细胞悬液，种于96孔培养板，100μl/孔，置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱培养至指数生长期，弃上清，将不同浓度的待测样品药液加入到培养孔中，100μl/孔，每浓度药液设三个复孔，另设细胞对照孔及空白对照孔。加药后再培养24小时，向每孔加活细胞计数(cell counting)试剂CCK-8 10μl，继续培养2小时，用酶标仪于450nm波长处测定吸光值A。
[0034] 计算公式：
[0035] 细胞破坏率(％)＝(细胞对照组A值-给药组A值)/(细胞对照组A值-空白对照组A值)×100％；
[0036] 半数毒性浓度(TC50)＝
[0037] Anti log[B+(50-小于50％时的细胞破坏率％)/(大于50％时的细胞破坏率％-小于50％时的细胞破坏率％)×C]
[0038] 式中A＝log(细胞破坏率大于50％时的药物浓度)，B＝log(细胞破坏率小于50％时的药物浓度)，C＝A-B。
[0039] 根据所测得的平均吸光值，依照细胞破坏率计算公式，求出不同浓度的化合物1和2对脑神经胶质瘤细胞SWO-38的杀伤作用。结果如表1和表2所示。
[0040] 表1：化合物1对SWO-38细胞生长的影响
[0041]