无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂与应用

摘要

一种无致病性双核丝核菌、发酵方法及其制剂与应用，属于农业生物技术领域。无致病性双核丝核菌BNR-1，分类命名：立枯丝核菌，保藏号：CGMCC NO.1844，其固体发酵培养物的制备方法：斜面菌种培养3～4天，摇瓶菌种培养2～3天，固体菌种5～7天。固体发酵培养物与淀粉、葡萄糖和/或碳酸钙混合制成的颗粒剂，用于防治棉花立枯病和小麦纹枯病。

权利要求

1.一种无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂，其特征在于是由无致病性双核丝核菌BNR-1的固体发酵培养物与淀粉、葡萄糖和/或碳酸钙混合制成的颗粒剂，无致病性双核丝核菌BNR-1的固体发酵培养物与其他成分总量的重量比为1∶1～1.5；

所述的无致病性双核丝核菌BNR-1的固体发酵培养物是由以下方法制得的，各步骤中的百分比均为重量百分比：(1)斜面菌种：采用固体PDA培养基或水琼脂培养基，将无致病性双核丝核菌BNR-1CGMCC NO.1844接种在斜面试管上，25～28℃培养3～4天；

(2)摇瓶菌种：采用液体PDB培养基，将上述斜面菌种接种在液体摇瓶中，置于摇床上

28℃振荡培养2～3天；

(3)固体菌种：采用固体培养基，含水量为45～55％wt，120～121℃灭菌50～65分钟，将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为5～10％wt，接种完毕转移到固体培养室内培养；

(4)培养：浅层培养基厚度为4～6cm，料温控制在28±2℃，室温控制在23～32C，空气的相对含水量控制在45～85％wt，培养时间为5～7天。

2.权利要求1所述的无致病性双核丝核菌BNR-1农用制剂的应用，用于防治小麦纹枯病或棉花立枯病。

说明书

无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种无致病性双核丝核菌(Rhizoctonia solani)BNR-1(分类命名：立枯丝核菌)及其制剂制备与应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

[0002] 进入21世纪，随着经济的发展和人民生活水平的不断提高，人们的健康意识和环保意识大大加强，减少化学农药的使用，采用绿色生物农药防治病虫草害已成为农药发展的必然趋势，农业部和国家石化局也均对生物农业的发展出台了相应的支持政策。尽管生物农药有了一定的发展，但在研究开发和应用等方面仍存在一些突出问题，如目前我国生防菌剂的数量和品种较少，防治效果较低或不稳定。因此须扩大生防菌株的种质资源，其中无致病性双核丝核菌的研究开发利用缓解了这一不足。

[0003] 关于无致病性双核丝核菌的研究，国内外已有报道。自1984年以来，已分别从以色列，美国，加拿大，日本，澳大利亚等地分离出用于植物保护的无致病性双核丝核菌菌株(B.SNEH，E.YAMOAH and A.STEWART.HYPOVIRULENT RHIZOCTONIA SPP.ISOLATES FROM NEW ZEALAND SOILS PROTECT RADISH SEEDLINGS AGAINSTDAMPING-OFF CAUSED BYR.SOLANI.New Zealand Plant Protection，2004(57)：54～58.)(B.SNEH，E.YAMOAH and A.利用从新西兰土壤中分离的无致病性丝核菌防治由立枯丝核菌引起的萝卜幼苗腐烂病，新西兰植物保护，2004(57)：54～58)。某些无致病性双核丝核菌菌株在温室试验下可以诱导棉花的系统抗性，且效果比化学诱导剂苯并噻二唑显著(Suha Jabaji-Hare and Stephen M.Neate.Nonpathogenic Binucleate Rhizoctonia spp.andBenzothiadiazole Protect Cotton Seedlings Against Rhizoctonia Damping-Off and AlternariaLeaf Spot in Cotton.PHYTOPATHOLOGY，2005，95(9)：1031～1036)(苏哈，斯蒂芬.无致病性双核丝核菌和苯并噻二唑保护棉花幼苗抵抗由丝核菌引起的腐烂病和由链格饱菌引起的斑点病，植物病理学报，2005，95(9)：1031～1036)。少数菌株可促进植物生长，增加产量(Sneh，B.；Zeidan，M.；Ichielevich-Auster，M.et al.Increased growth responses induced by anon-pathogenic Rhizoctonia solani.Can.J.Bot.1986，64：2372～2378)(Sneh，B.；Zeidan，M.；Ichielevich-Auster，M.et al.无致病性立枯丝核菌的促生作用，加拿大，
1986，64：2372～2378)。

[0004] 到目前为止，所有国际、国内上已经登记注册的植物病害生物杀菌剂主要有细菌和真菌两大类，但还没有一种以非致病性双核丝核菌(Rhizoctonia solani)为生防菌株的菌剂。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种新型生防菌，并利用该生防菌研制一种农用制剂，以扩大生防菌种类，有效防治植物病害。

[0006] 本发明的目的之一是提供一种具有生物防治功能的无致病性双核丝核菌(Rhizoctoniasolani)BNR-1，分类命名：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。

[0007] 本发明的目的之二是提供一种无致病性双核丝核菌BNR-1的固体发酵方法。

[0008] 本发明的目的之三是提供一种无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂。

[0009] 本发明的目的之四是提供无致病性双核丝核菌BNR-1农用制剂的应用。

[0010] 下面对本发明的技术方案分别进行说明。

[0011] 1、无致病性双核丝核菌BNR-1。

[0012] 无致病性双核丝核菌BNR-1(Rhizoctonia solani)，分类命名：立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，保藏号：CGMCC NO.1844。

[0013] 该菌株的特征描述如下：

[0014] 菌丝呈树枝状分支，较稀疏，浅褐色，在分支处略缢缩，离此不远处形成隔膜，菌丝呈近直角分枝。菌核从菌丝出发，颗粒扁平，生长于基质表面，内外颜色一致，菌核表面细胞稍小，与内部无明显界限，每个细胞内含有2个细胞核。

[0015] 该菌株分离自植物根际，对植物无致病性，可在植物根际迅速定殖，通过与病原菌竞争营养及诱导植物对病原菌的系统抗性来达到防治病害作用。

[0016] 2、无致病性双核丝核菌BNR-1CGMCC NO.1844的固体发酵培养物的制备。

[0017] 一种无致病性双核丝核菌BNR-1CGMCC NO.1844的固体发酵方法，按以下步骤进行，均为重量百分比：

[0018] (1)斜面菌种：采用固体PDA培养基或水琼脂培养基，将无致病性双核丝核菌BNR-1分类命名：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)CGMCC NO.1844接种在斜面试管上，25～28℃培养3～4天。

[0019] (2)摇瓶菌种：采用液体PDB培养基，将上述斜面菌种接种在液体摇瓶中，置于摇床上28℃振荡培养2～3天。

[0020] (3)固体菌种：采用固体培养基，含水量为45～55％wt，120～121℃灭菌50～65分钟，将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为5～10％wt，接种完毕转移到固体培养室内培养。

[0021] (4)培养：浅层培养基厚度为4～6cm，料温控制在28±2℃，室温控制在23～32℃，空气的相对含水量控制在45～85％wt，培养时间为5～7天，菌核产生的越多越好。

[0022] 3、无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂。

[0023] 一种无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂，由无致病性双核丝核菌BNR-1的固体发酵培养物与淀粉、葡萄糖和/或碳酸钙混合制成颗粒剂。无致病性双核丝核菌BNR-1的固体发酵培养物与其他成分总量的重量比为1∶1～1.5。

[0024] 无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂制备方法为：将上述2、(4)制备的固体发酵培养物自然风干，加入淀粉，葡萄糖和/或轻质碳酸钙混合均匀，在转动盘上喷雾造粒。颗粒剂的直径为1～2mm。

[0025] 4、无致病性双核丝核菌BNR-1农用制剂的应用。

[0026] 无致病性双核丝核菌BNR-1农用制剂的应用，用于防治棉花立枯病或小麦纹枯病。

[0027] 无致病性双核丝核菌BNR-1农用制剂的应用效果如下：

[0028] (1)材料与方法：供试植物病原真菌为棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani)和小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)，经纯化后接种小米培养基，25℃培养4～5天至病原真菌长满小米粒。供试小麦品种为良星99，棉花品种为鲁9154，用0.1％升汞水表面消毒1min，无菌水冲洗，30℃条件下催芽至露白。种子分别采用井冈霉素(80μg/mL)、三唑酮(80μg/mL)、清水浸种处理30min，农用制剂BNR-1颗粒剂处理组种子催芽后直接用于以下试验。

[0029] 每盆内分别接入上述不同处理的种子20粒，布满病原真菌的小米2粒，供试农用制剂处理组另加入本发明无致病性双核丝核菌BNR-1颗粒剂2粒(直径为1～2mm)。每处理设3个重复，随机区组排列，温室培养，温度为18～25℃，湿度为40～70％，定期定量浇水，试验期为30天。

[0030] 棉花立枯病病情调查与防治效果计算：

[0031] 0级：无病；1：茎基部有小病斑，占茎围的1/4以下；2级：茎基部病斑较大，约占茎围的1/4-1/2；3级：茎基部病斑占茎围的1/2以上，但尚未破坏整个茎围；4级：茎基部病斑占据全部茎围，植株死亡。

[0032] 小麦纹枯病病情调查与防治效果计算：

[0033] 0级：叶鞘、茎秆均未被侵染；1级：病斑只限制在叶鞘上，茎秆上无病斑；2级：茎秆上虽有病斑，但病斑横长达不到茎秆周长有1/3；3级：病斑横长达到茎秆周长的1/3，但达不到茎秆周长的2/3；4级：病斑横长达到茎秆周长的2/3，直至病斑环绕茎秆。

[0034] 病株率％＝每个处理的病株数×100％/每个处理的总株数

[0035] 病情指数％＝∑(各病级×各级株数)×100％/(最高病级×总调查株数)[0036] 防治效果％＝(对照病情指数-处理病情指数)×100％/对照病情指数[0037] (2)结果：本发明农用制剂BNR-1颗粒剂在温室条件下对供试两种植物病原真菌均有不同程度的防治作用，与对照相比在0.05水平上差异显著，防治效果均好于对照药剂(表1)。

[0038] 表1本发明农用制剂BNR-1颗粒剂对两种作物病害的温室防治效果[0039]

[0040] (注：数据为三次重复的平均值，采用SPSS10.0统计软件中的Duncan方法。不同小写字母标记间表示在0.05水平上差异显著。)

[0041] 无致病性双核丝核菌BNR-1(Rhizoctonia solani)，分类命名：立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)。保藏时间：2006年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏号：CGMCC NO.1844。

附图说明

[0042] 图1是双核丝核菌BNR-1(立枯丝核菌)(Rhizoctonia solani)CGMCC NO.1844的细胞核染色(番红-O)图片。

具体实施方式

[0043] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。

[0044] 实施例所用菌株为：无致病性双核丝核菌BNR-1(Rhizoctonia solani)，分类命名：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，保藏时间：2006年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏号：CGMCC NO.1844。

[0045] 实施例所用培养基如下，固体培养基各成分的比例均为重量比：

[0046] PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂15g，自来水1000mL。

[0047] 水琼脂培养基：琼脂15g，自来水1000mL。

[0048] 固体培养基1：麸皮∶稻壳∶玉米粉∶几丁质粉＝7∶1∶1.5∶0.5。

[0049] 固体培养基2：麸皮∶棉子壳∶玉米粉∶几丁质粉＝7∶1∶1.5∶0.5。

[0050] 固体培养基3：麸皮∶棉子壳∶淀粉＝7∶1∶2。

[0051] 固体培养基4：麸皮∶棉子壳＝8∶2。

[0052] 实施例1：无致病性双核丝核菌BNR-1。

[0053] 无致病性双核丝核菌BNR-1(Rhizoctonia solani)，分类命名：立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，保藏时间：2006年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏号：CGMCC NO.1844。该菌株分离自植物根际，对植物无致病性，可在植物根际迅速定殖，通过与病原菌竞争营养及诱导植物对病原菌的系统抗性来达到防治病害作用。该菌株菌丝呈树枝状，较稀疏，浅褐色，在分支处略缢缩，离此不远处形成隔膜，菌丝呈近直角分枝。菌核从菌丝出发，颗粒扁平，生长于基质表面，内外颜色一致，菌核表面细胞稍小，与内部无明显界限。每个细胞内含有2个细胞核(如图1所示)。

[0054] 实施例2：无致病性双核丝核菌BNR-1CGMCC NO.1844的固体发酵培养物的制备。

[0055] (1)斜 面 菌 种：采 用 固 体 PDA培 养 基，将 无 致 病 性 双 核 丝 核 菌BNR-1CGMCCNO.1844(分类命名：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))接种在试管培养基上，28℃培养3天。

[0056] (2)茄瓶菌种：采用液体PDA培养基，将试管菌种接种在液体茄瓶中，置于摇床上28℃振荡培养2天。

[0057] (3)固体菌种：采用固体培养基1，麸皮∶稻壳∶玉米粉∶几丁质粉＝7∶1∶1.5∶0.5，含水量为50％wt，121℃灭菌60分钟，将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为6％wt，接种完毕转移到固体培养室内培养。

[0058] (4)培养：培养基厚度为5cm，料温控制在28±2℃，室温控制在25～30℃，空气的相对含水量控制在45～85％wt，培养时间为7天。得无致病性双核丝核菌BNR-1的固体发酵培养物。

[0059] 实施例3：无致病性双核丝核菌BNR-1CGMCC NO.1844的固体发酵培养物的制备。如实施例1所述，所不同的是步骤(3)采用固体培养基2，麸皮∶棉子壳∶玉米粉∶几丁质粉＝7∶1∶1.5∶0.5。

[0060] 实施例4：无致病性双核丝核菌BNR-1CGMCC NO.1844的固体发酵培养物的制备。

[0061] 如实施例1所述，所不同的是步骤(3)采用固体培养基3，麸皮∶棉子壳∶淀粉＝7∶1∶2。

[0062] 实施例5：无致病性双核丝核菌BNR-1CGMCC NO.1844的固体发酵培养物的制备。

[0063] 如实施例1所述，所不同的是步骤(3)采用固体培养基4，麸皮∶棉子壳＝8∶2。

[0064] 实施例6：无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂，组份如下：

[0065] 双核丝核菌BNR-1固体发酵培养物(风干) 60g

[0066] 淀粉 30g

[0067] 葡萄糖 10g

[0068] 轻质碳酸钙 30g

[0069] 制备方法：将实施例1的产物(双核丝核菌BNR-1固体发酵培养物)自然风干，加入淀粉、葡萄糖、轻质碳酸钙混合均匀，在转动盘上喷雾造粒，颗粒剂的直径为1～2mm。

[0070] 实施例7：无致病性双核丝核菌BNR-1的农用制剂，组份如下：

[0071] 双核丝核菌BNR-1固体发酵培养物(风干) 60g

[0072] 淀粉 30g

[0073] 轻质碳酸钙 30g

[0074] 制备方法为将实施例4的产物(双核丝核菌BNR-1固体发酵培养物)自然风干，加入淀粉和轻质碳酸钙混合均匀，在转动盘上喷雾造粒，颗粒剂的直径为1～2mm。