糖生物芯片的制备方法

摘要

一种糖生物芯片的制备方法，采用环氧乙烷基团衍生化的固相载体，通过其表面所含环氧乙烷基团，与偶联剂的氨基共价偶联，偶联剂另一端的羟基与还原糖的还原末端发生羟醛缩合反应形成糖苷键，使还原糖以共价方式偶联在固相载体上，制备出糖芯片。或采用氨基基团衍生化的固相载体，通过其表面所含氨基基团，与偶联剂经N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺活化的酸基共价偶联，偶联剂另一端的羟基与还原糖的还原末端发生羟醛缩合反应形成糖苷键，使还原糖以共价的方式偶联在固相载体上，制备出糖芯片。本发明解决了背景技术中还原糖易脱落、制备方法复杂、成本高的技术问题。本发明简单、快速，糖芯片的生物活性稳定，易于规模化推广应用。

权利要求

1.一种糖生物芯片的制备方法，其特征在于，该方法的实现步骤如下：

1)取偶联剂溶于有机溶剂中，配制成10～50mol/L的溶液；所述的偶联剂是含有一个氨基和一个羟基的偶联剂；

2)将环氧乙烷基团衍生化的固相载体浸入其中，室温下孵育3小时；

3)用溶解偶联剂的有机溶剂和无水乙醇分别将固相载体清洗二次，每次2分钟；

4)将固相载体于室温离心干燥，保存于干燥容器中备用；

5)将还原糖用水溶解，调至所需的浓度；

6)加入相同体积、pH3～6的酸性点样缓冲液，对固相载体进行点样；

7)点样后的固相载体于25～60℃温育12小时即可。

2.根据权利要求1所述的糖生物芯片的制备方法，其特征在于：所述偶联剂是4-羟基苯甲酰胺或4-羟基丁酸肼。

3.根据权利要求1或2所述的糖生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺；所述的还原糖为单糖、寡糖或多糖；所述的固相载体为玻片、硝酸纤维素膜或瓷片。

4.根据权利要求3所述的糖生物芯片的制备方法，其特征在于：所述溶解还原糖的水为超纯水、双蒸水、去离子水或纯水；所述的点样是指手工点样和机器点样；所述的点样后固相载体的温育温度为37℃。

说明书

糖生物芯片的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种糖生物芯片的制备方法。具体涉及一种利用还原糖的还原末端，以糖苷键形式共价偶联到羟基衍生化的固相载体上的糖生物芯片的制备方法。

背景技术

[0002] 糖结合蛋白具有重要的生物学功能，其表现在细胞间的通讯和识别，细胞与病原微生物的相互作用，细胞内蛋白的运输，蛋白间的相互作用，蛋白与受体的特异性结合等方面。生物芯片技术的三个探索方向即是基因芯片、蛋白质生物芯片及糖生物芯片。糖生物芯片的优越性在于：其一，生物活性稳定。糖生物芯片可在室温条件下长期保存生物活性不变。其二，应用范围广泛。把糖生物芯片技术应用于医学临床上，可对多种传染性与非传染性疾病同时进行快速诊断。因为所有的细胞表面都有含糖物质，这些糖化分子在细胞分子的识别过程中起着重要的作用。例如，血型的测定，人体免疫细胞对微生物病原体和某些肿瘤的识别等。

[0003] 目前，对用于糖结合蛋白研究的糖芯片的研究，国际上仍处于探索阶段。主要障碍是缺乏高通量的技术和手段，特别是缺乏类似于DNA芯片和蛋白芯片的研究工具，需要解决实际芯片制造的技术难题，包括如何将含糖物质固定在芯片上、如何监测芯片上糖体的生物活性。

[0004] 现有糖芯片的制备主要是以物理吸附为主，或是对还原糖进一步化学修饰，然后再把还原糖共价偶联到诸如硝酸纤维素膜或玻片等固相载体上。物理吸附法制备糖芯片，固定在固相载体上的还原糖在实验过程中易脱落，影响结果的准确性。对还原糖进一步化学修饰制备糖芯片，是把还原糖共价偶联到硝酸纤维素膜或玻片等固相载体上，其方法复杂，成本高，不易实施、推广。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种糖生物芯片的制备方法，其解决了背景技术中还原糖易脱落，结果的准确性差，制备方法复杂、成本高的技术问题。

[0006] 本发明的技术解决方案是：

[0007] 一种糖生物芯片的制备方法，其特殊之处在于：该方法的实现步骤如下[0008] 1)取偶联剂溶于有机溶剂中，配制成10～50mol/L的溶液；

[0009] 2)将环氧乙烷基团衍生化的固相载体浸入其中，室温下孵育3小时；

[0010] 3)用溶解偶联剂的有机溶剂和无水乙醇分别将固相载体清洗二次，每次2分钟；

[0011] 4)将固相载体于室温离心干燥，保存于干燥容器中备用；

[0012] 5)将还原糖用水溶解，调至所需的浓度；

[0013] 6)加入相同体积、pH3～6的酸性点样缓冲液，对固相载体进行点样；

[0014] 7)点样后的固相载体于25～60℃温育12小时即可。

[0015] 上述偶联剂是含有一个氨基和一个羟基的偶联剂。

[0016] 上述偶联剂具体可采用4-羟基苯甲酰胺或4-羟基丁酸肼等。

[0017] 上述有机溶剂可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺等；还原糖可采用单糖、寡糖或多糖等；固相载体可采用玻片、硝酸纤维素膜或瓷片等。

[0018] 上述溶解还原糖的水可采用超纯水、双蒸水、去离子水或纯水等；点样是指手工点样和机器点样；点样后固相载体的温育温度以37℃为佳。

[0019] 一种糖生物芯片的制备方法，其特殊之处在于：该方法的实现步骤如下[0020] 1)取偶联剂溶于有机溶剂中，配制成10～50mol/L的溶液；

[0021] 2)按溶质比例：

[0022] 偶联剂∶N-羟基琥珀酰亚胺∶二环己基碳二亚胺＝1∶2∶2～4，[0023] 加入N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，偶联剂被活化的酸基生成活泼酯衍生物；

[0024] 3)将氨基基团衍生化的固相载体浸泡其中，室温下孵育3小时；

[0025] 4)用溶解偶联剂的有机溶剂和无水乙醇分别将固相载体清洗二次，每次2分钟；

[0026] 5)将固相载体于室温离心干燥，保存于干燥容器中备用；

[0027] 6)将还原糖用水溶解，调至所需的浓度；

[0028] 7)加入相同体积、pH3～6的酸性点样缓冲液，对固相载体进行点样；

[0029] 8)点样后的固相载体于25～60℃温育12小时即可。

[0030] 上述偶联剂可采用含有一个羧基和一个羟基的偶联剂。

[0031] 上述偶联剂具体可采用4-羟基苯基戊酸或1 6-羟基十六羧酸等。

[0032] 上述有机溶剂可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺等；还原糖可采用单糖、寡糖或多糖等；固相载体可采用玻片、硝酸纤维素膜或瓷片等。

[0033] 上述溶解还原糖的水可采用超纯水、双蒸水、去离子水或纯水等；点样是指手工点样和机器点样；点样后固相载体的温育温度以37℃为佳。

[0034] 本发明具有以下优点：

[0035] 1.固定还原糖的连接方式简单、快速，且成本较低。

[0036] 2.糖芯片的生物活性稳定，可在室温条件下长期保存而生物活性不变。

[0037] 3.实用范围广，易于规模化推广、使用。

附图说明

[0038] 图1是本发明实施方法一的原理示意图。图2是本发明实施方法二的原理示意图。

[0039] 图3a、b是本发明用地衣酚的硫酸溶液作为显色试剂检验糖在固相载体上偶联效果的示意图。

[0040] 图4a、b是本发明将CyDye荧光染料直接标记的凝集素刀豆素用于糖芯片的效果示意图。

具体实施方式

[0041] 本发明主要是以还原糖为模型，使还原糖的还原末端即半缩醛(ROH)以糖苷键的形式共价偶联到羟基(-OH)衍生化的固相载体上制备糖芯片。

[0042] 本发明实现方法一的原理：环氧乙烷基团衍生化的固相载体，因其表面含有一层环氧乙烷基团，可与偶联剂的氨基共价偶联。偶联剂另一端的羟基(-OH)与还原糖的还原末端即1位醛基发生羟醛缩合反应形成糖苷键，使还原糖以共价的方式偶联在固相载体上，制备出糖芯片。

[0043] 本方法中，还原糖可采用单糖、寡糖或多糖等。固相载体可采用玻片、硝酸纤维素膜或瓷片等。偶联剂可采用含有一个氨基和一个羟基的偶联剂，如4-羟基苯甲酰胺或4-羟基丁酸肼等。

[0044] 本发明实施例一的实现步骤：

[0045] 1.取偶联剂4-羟基苯甲酰胺或4-羟基丁酸肼溶于有机溶剂二甲基甲酰胺(DMF)中，配制成50mL、20mol/L的溶液。

[0046] 2.将环氧乙烷基团衍生化的玻片浸入其中，室温下孵育3小时左右。

[0047] 3.用二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醇分别清洗玻片二次，每次2分钟左右。

[0048] 4.将玻片于室温离心干燥，保存于4℃干燥容器中备用。

[0049] 5.将还原糖用超纯水溶解，调至所需的浓度。

[0050] 6.加入相同体积、pH3～6的酸性点样缓冲液，对玻片进行手工点样和机器点样。

[0051] 7.于37℃温育12小时左右即可。

[0052] 本发明实现方法二的原理：氨基基团衍生化的固相载体，因其表面含有一层氨基基团，可与偶联剂的经N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)活化的酸基共价偶联。偶联剂的另一端的羟基(-OH)可以与还原糖的还原末端即1位醛基发生羟醛缩合反应形成糖苷键，使还原糖以共价的方式偶联在固相载体上，制备出糖芯片。本方法中，还原糖可采用单糖、寡糖、多糖等。固相载体可采用玻片、硝酸纤维素膜、瓷片等。偶联剂可采用含有一个羧基和一个羟基，如4-羟基苯基戊酸、16-羟基十六羧酸等。

[0053] 本发明实施例二的实现步骤：

[0054] 1.取偶联剂4-羟基苯基戊酸或16-羟基十六羧酸溶于有机溶剂乙酸乙酯中，配制成50mL、20mol/L的溶液。

[0055] 2.加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)，偶联剂被活化的酸基生成活泼酯衍生物。

[0056] 3.将氨基基团衍生化的玻片浸泡其中，室温下孵育3小时左右。

[0057] 4.用二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醇分别清洗玻片二次，每次2分钟左右。

[0058] 5.将玻片于室温离心干燥，保存于4℃干燥容器中备用。

[0059] 6.将还原糖用超纯水溶解，调至所需的浓度。

[0060] 7.加入相同体积的、pH3～6的酸性点样缓冲液，对玻片进行手工点样和机器点样。

[0061] 8.于37℃温育12小时左右即可。

[0062] 点上还原糖的玻片经封闭缓冲液处理，超纯水清洗，室温离心干燥。在点样区滴加地衣酚的硫酸溶液，然后对此区域加热。可见地衣酚的硫酸溶液由无色逐渐变成黄色。图3a、3b分别是用本发明方法一、二制备出糖芯片的效果图。

[0063] 以D-甘露糖为模型，用本发明方法一、二制备出糖芯片，将CyDye荧光染料直接标记的凝集素刀豆素A(Concanavalin A，Con A)用于此糖芯片，结果见图4a、4b。