羟基羧酸类的生产方法

摘要

以羟基乙酸为代表的羟基羧酸是有望作为聚合物原料或医药中间体的化合物。但是迄今为止所知的羟基羧酸的生产方法存在无法廉价地提供高纯度的羟基羧酸的问题。本发明的目的在于创造出在短时间内高产率地生产出杂质少的羟基羧酸的微生物、提供使用该微生物的以羟基乙酸为代表的羟基羧酸的制造方法。创造出赋予或增强了催化从乙二醇生成羟基乙醛的反应的酶活性的微生物，使用该微生物在短时间内高产率地生产杂质少的以羟基乙酸为代表的羟基羧酸。根据该生产方法，可以廉价地提供高纯度的羟基羧酸。

权利要求

1.一种以末端具有羟基的脂肪族多元醇类为基质的羟基羧酸类的生产方法，其特征在于，该生产方法利用具有下述特征的大肠杆菌，(1)编码乳醛还原酶的基因通过与甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子功能性地连接而表达该酶，(2)以质粒的形态导入编码乳醛还原酶的基因。

2.一种以末端具有羟基的脂肪族多元醇类为基质的羟基羧酸类的生产方法，其特征在于，该生产方法利用下述大肠杆菌，所述大肠杆菌通过以质粒的形态导入与甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子功能性地连接的、编码乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的基因而赋予或增强了所述2种酶的活性。

3.如权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，该生产方法利用特点为该大肠杆菌本来具有的羟基乙酸氧化酶活性失活或下降、且/或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活或下降的大肠杆菌。

4.如权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，羟基羧酸为具有光学活性的羟基羧酸。

5.如权利要求3所述的生产方法，其中，以乙二醇为基质，以95％以上的收率、2g/L/小时以上的生产速度得到羟基乙酸水溶液。

6.如权利要求1或2所述的生产方法，其中，所述大肠杆菌以质粒的形态导入来自大肠杆菌的编码乳醛还原酶的基因。

7.如权利要求2所述的生产方法，其中，所述大肠杆菌以质粒的形态导入来自大肠杆菌的编码乳醛脱氢酶的基因。

8.一种大肠杆菌，用于权利要求1所述的生产方法，所述大肠杆菌具有下述特征：(1)编码乳醛还原酶的基因通过与甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子功能性地连接而表达该酶，(2)以质粒的形态导入编码乳醛还原酶的基因。

9.一种大肠杆菌，用于权利要求2所述的生产方法，所述大肠杆菌通过以质粒的形态导入与甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子功能性地连接的、编码乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的基因而赋予或增强了所述2种酶的活性。

10.一种大肠杆菌，用于权利要求1所述的生产方法，所述大肠杆菌具有下述特征：(1)编码乳醛还原酶的基因通过与甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子功能性地连接而表达该酶，(2)以质粒的形态导入编码乳醛还原酶的基因；

所述大肠杆菌特点为该大肠杆菌本来具有的羟基乙酸氧化酶活性失活或下降、且/或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活或下降。

11.一种大肠杆菌，用于权利要求2所述的生产方法，所述大肠杆菌通过以质粒的形态导入与甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子功能性地连接的、编码乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的基因而赋予或增强了所述2种酶的活性；所述大肠杆菌特点为该大肠杆菌本来具有的羟基乙酸氧化酶活性失活或下降、且/或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活或下降。

12.一种大肠杆菌，用于权利要求1所述的生产方法，所述方法中所述羟基羧酸为具有光学活性的羟基羧酸，所述大肠杆菌具有下述特征：(1)编码乳醛还原酶的基因通过与甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子功能性地连接而表达该酶，(2)以质粒的形态导入编码乳醛还原酶的基因。

13.一种大肠杆菌，用于权利要求2所述的生产方法，所述方法中所述羟基羧酸为具有光学活性的羟基羧酸，所述大肠杆菌通过以质粒的形态导入与甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子功能性地连接的、编码乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的基因而赋予或增强了所述2种酶的活性。

说明书

羟基羧酸类的生产方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生产以羟基乙酸为代表的羟基羧酸的微生物及使用该微生物的以羟基乙酸为代表的羟基羧酸的生产方法。

背景技术

[0002] 羟基羧酸类作为聚合物原料或医药中间体有用，要求开发出有效的生产方法。

[0003] 作为其一例可以举出羟基乙酸(α-羟基乙酸)。羟基乙酸作为清洗剂、化妆品原料被利用，近年，作为气体隔离性聚合物或医疗用聚合物有用的聚羟基乙酸的原料而被关
注。作为气体隔离性材料被关注的原因是聚羟基乙酸层具有高氧气隔离性，具备作为在氧
气存在下用于包装易变质的食品或碳酸饮料的材料的性能。

[0004] 为了将来工业规模实际生产聚羟基乙酸，必须高纯度且廉价地提供其原料羟基乙酸。但是，很多现行市售的化学合成品的羟基乙酸含有杂质，作为聚合物原料存在纯度上的
问题。原因在于上述杂质不仅阻碍羟基乙酸的脱水缩合反应，杂质之一的甲氧基乙酸是具
有致癌可能性的化合物，不适合包含在食品或饮料的包装材料中。当然，技术上可以通过提
纯除去杂质，但实际上上述提纯品价格变高，作为廉价的包装材料原料是不现实的。

[0005] 为了避免化学合成品的羟基乙酸中可见的上述问题，正在尝试通过以乙二醇(以下称为EG)为原料的生物学方法制备羟基乙酸。特开平10-174593号公报及特开
平10-174594号公报公开了利用微生物得到羟基乙酸的生产方法，其特点在于，在含有
乙二醇的培养基中培养属于毕赤酵母(Pichia)属、红酵母(Rhodotorula)属、掷孢酵母
(Sporobolomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、球拟酵 母(Torulopsis)属的
酵母，属于诺卡氏菌(Nocardia)属的菌株，属于红球菌(Rhodococcus)属的菌株或大肠
杆菌B(Escherichia coli B)株，从培养液中分离·提取羟基乙酸。另外，关于大肠杆菌
K12(Escherichia coli K12)株公开了羟基乙酸收率低的问题。特开平10-174593号公
报及特开平10-174594号公报的实施例中记载的羟基乙酸的生产方法中，羟基乙酸蓄积
浓度最高的是使用长西氏毕赤酵母(Pichia naganishii)的方法，经过30小时的反应能
得到35.3g/L的羟基乙酸。文献(Kataoka，M.，et.al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，
Vol.65(10)，pp.2265-2270(2001))报导在使用长西氏毕赤酵母的羟基乙酸生产中进一步
改善反应条件，经过120小时的反应能够得到105g/L羟基乙酸。总之，使用长西氏毕赤酵
母的生产方法中，从乙二醇生成羟基乙酸的反应时间长达120小时，由于该情况会导致羟
基乙酸制造成本增加，故假定在工业规模的实际生产情况下必须进一步缩短反应时间。并
且还存在下述问题：在该生产方法中混入了所使用的微生物产生的副产物有机酸，阻碍之
后的提纯工序或脱水缩合反应。

[0006] 关于利用微生物的从乙二醇生成羟基乙酸的代谢反应，公开了Boronat等人利用大肠杆菌的研究结果(Boronat，A.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.153(1)，pp.134-139，
(1983))。即为从乙二醇生成羟基乙醛的反应和从羟基乙醛生成羟基乙酸的反应的两个阶
段的代谢途径。Boronat等人着眼于从1，2-丙二醇(以下称为PDO)生成乳醛的反应催
化酶丙二醇氧化还原酶(以下称为PDO氧化还原酶)也以乙二醇作为基质(Boronat，A.，
et.al.，Biochim.Biophys.Acta，Vol.672，pp.98-107，(1981))。在PDO氧化还原酶活性通
过突变增强的菌株中，分离出从羟基乙醛生成羟基乙酸的反应催化酶羟基乙醛脱氢酶(以
下称为GAL脱氢酶)的活性增强的菌株。需要说明的是，下表(表1)引用自Boronat等人
的论文。

[0007] 表1

[0008]能
化
同
GE 无 无 有

能 )
化 载
同 记
ODP 无 有 未(
)
质
白
蛋
gm/U
(
性
活
酶
氢
脱L 541 561 065
AG .0 .0 .0
)
质
白
蛋
gm
/U(
性
活
酶
原
还
化
氧ODP 500.0 031.0 514.0

)
株
象
对
(
株菌 株1G 株3G 株3GE

[0009] 对象株大肠杆菌G1株不能同化(assimilating)1，2-丙二醇和乙二醇中的任一种。与之相对，PDO氧化还原酶活性显著增强的突变株G3株虽然获得了PDO同化能却仍然
无法同化EG。基于该结果，Boronat等人推论G3株不能同化EG的原因是GAL脱氢酶活性
不足，无法进行从羟基乙醛生成羟基乙酸的反应。分离出GAL脱氢酶活性显著增强的突变
株EG3株，该菌株同化EG，从而验证了他们的推论。换言之，Boronat等人认为为了从EG生
成羟基乙酸，GAL脱氢酶活性必须充分存在。

[0010] 本说明书所公开的新知识是为了从EG生成羟基乙酸，未必增强GAL脱氢酶的活性，只增强PDO氧化还原酶的活性即可。产生上述差异的原因可以举出Boronat等人仅着
眼于在EG3株中GAL脱氢酶活性增强，没有注意到PDO氧化还原酶的活性也同时增强。基
于我们的知识，重新考察Boronat等人的试验结果，得出EG3株能获得EG3同化能力并非因
为GAL脱氢酶的活性增强，而是由于PDO氧化还原酶的活性增强的结论。

[0011] Boronat等人的报告还显示了EG3株中在基质EG与羟基乙酸同时存在的条件下中间体羟基乙醛发生蓄积。即表示通过使用大肠杆菌的生物学方法以EG为原料制备羟基乙
酸时，出现中间体羟基乙醛作为杂质蓄积之类不良情况。

[0012] 由此可知，过去的知识表明使用大肠杆菌从EG制备羟基乙酸时，GAL脱氢酶活性的增强是必不可少的、及制得的羟基乙酸中蓄积有中间体羟基乙醛。基于上述理由可知，即
便是本领域技术人员也无法容易地推测在不增强GAL脱氢酶活性的状态下可选择性地制
备羟基乙酸、并且可以不含有中间体羟基乙醛、高效地制备羟基乙酸。

[0013] 作为羟基乙酸之外的羟基羧酸的例子，也对甘油酸的各种制备方法进行了研究。其中，关于以廉价的甘油为原料制备甘油酸的方法，特开平5-331100号公报公开了使用Pt
催化剂的化学合成法，特开平1-168292号公报公开了利用葡糖杆菌(Gluconobacter)属微
生物的生物学方法。前者的使用Pt催化剂的方法中反应的选择率为80％左右，非常不充
分，生成相当量的副产物，且必须严密控制反应温度。后者的生物学方法中记载以甘油为原
料的D-甘油酸的制法，但是该制法存在菌体的调制及反应需要4天之久的时间的问题，而
且可以容易想象制得的甘油酸中混有相当量的来自使用的微生物的副产物有机酸。也未公
开关于L-甘油酸的制造方法。

[0014] 关于利用作为羟基羧酸之一例的羟基乙氧基乙酸的生物学方法的制备方法，特开昭59-85296号公报公开了在含有乙二醇的培养基中培养属于假丝酵母属(Candida)、球拟
酵母(Torulopsis)属、红酵母(Rhodotorula)属、汉逊酵母(Hansenula)属、德巴利酵母
(Debaryomyces)属、隐球酵母(Cryptococcus)属、毕赤酵母(Pichia)属的酵母，从培养基
中分离·提取羟基乙氧基乙酸的方法。该生产方法需要长时间培养，而且还副生成了相当
量的二羟乙酸，容易想象分离提纯羟基乙氧基乙酸需要大量的劳力。

[0015] 专利文献1：特开平10-174593号公报

[0016] 专利文献2：特开平10-174594号公报

[0017] 专利文献3：特开平5-331100号公报

[0018] 专利文献4：特开平1-168292号公报

[0019] 专利文献5：特开昭59-85296号公报

[0020] 非专利文献1：Kataoka，M.，et.al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，Vol.65(10)，pp.2265-2270，(2001)

[0021] 非专利文献2：Boronat，A.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.153(1)，pp.134-139，(1983)

[0022] 非 专 利 文 献 3：Boronat，A.，et.al.，Biochim.Biophys.Acta，Vol.672，pp.98-107，(1981)

发明内容

[0023] 如上所述，现有的以羟基乙酸为代表的各种羟基羧酸的生产方法的缺点总的说来是通过化学合成法得到的羟基羧酸含有大量的杂质，纯度低，通过生物学方法生产则反
应时间长，生产设备的每单位时间内的生产率降低，生产成本升高，并且混有副生成的有机
酸。鉴于以上几点，本发明所解决的问题为在短时间内廉价且大量提供以羟基乙酸为代表
的羟基羧酸类，并且使副产物减少提高纯度。

[0024] 作为用于解决上述问题的改善方法，本发明人等发现利用通过以质粒的形态导入编码催化从乙二醇生成羟基乙醛反应的酶的基因等方法改变的、仅充分增强了该酶活性的
微生物，代替通过现有生物学方法生产羟基乙酸时使用的从自然界筛选出的微生物，从乙
二醇生产羟基乙酸的方法能够实现本发明的目的。还发现通过利用以质粒的形态导入编码
催化乙二醇生成羟基乙醛的反应的酶和催化羟基乙醛生成羟基乙酸反应的酶这2种酶的
基因增强了上述二种酶的活性的微生物，与只增强催化乙二醇生成羟基乙醛反应的酶的微
生物相比，得到能减少菌体培养所需要的葡萄糖量之类意料之外的理想效果。关于上述微
生物，还发现通过降低催化羟基乙酸生成乙醛酸反应的酶及/或催化丙酮酸生成甲酸反应
的酶的活性，能够减少乙二酸或乙酸之类副生成的有机酸，生产更高纯度(副生成的有机
酸少)的羟基乙酸，具体原因不明，但上述两种酶活性降低使得细胞内的状况更适合生产
羟基乙酸，羟基乙酸的生产率显著提高。另外，上述微生物还可以用于生产羟基乙酸之外的
羟基羧酸的方法中。

[0025] 即，本发明涉及下述[1]～[9]所述发明。

[0026] 一种以末端具有羟基的脂肪族多元醇类为基质的羟基羧酸类的生产方法，其特征在于，利用赋予或增强了催化乙二醇生成羟基乙醛的反应的酶的活性的微生物。

[0027] 如[1]所述的生产方法，其特征在于，通过将编码[1]所述的酶的基因以质粒的形态导入而赋予或增强了微生物的该酶的活性。

[0028] 一种以末端具有羟基的脂肪族多元醇类为基质的羟基羧酸类的生产方法，其特征在于，利用通过将编码下述2种酶的基因以质粒的形态导入而赋予或增强了所述2种酶的
活性的微生物，所述2种酶为催化乙二醇生成羟基乙醛的反应的酶与催化羟基乙醛生成羟
基乙酸的酶。

[0029] 如[2]或[3]所述的生产方法，其特征在于，所述生产方法利用下述微生物，所述微生物通过功能性地连接使编码催化乙二醇生成羟基乙醛的反应的酶的基因及/或编码
催化羟基乙醛生成羟基乙酸的反应的酶的基因与负责和糖酵解体系、核酸生物合成体系或
氨基酸生物合成体系有关的蛋白质的表达的基因的启动子而表达该酶。

[0030] 如[1]～[4]中的任一项所述的生产方法，其中，催化乙二醇生成羟基乙醛的反应的酶为乳醛还原酶，催化羟基乙醛生成羟基乙酸的反应的酶为乳醛脱氢酶。

[0031] 如[1]～[5]中的任一项所述的生产方法，其特征在于，利用特征为该微生物本身具有的羟基乙酸氧化酶活性失活或下降、且/或丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate
formate-lyase)活性失活或下降的微生物。

[0032] 如[1]～[6]中的任一项所述的生产方法，其特征在于，羟基羧酸为具有光学活性的羟基羧酸。

[0033] 一种用于[1]～[7]中的任一项所述的生产方法的微生物。

[0034] 一种羟基乙酸水溶液，所述羟基乙酸水溶液为采用[6]中所述的方法，以乙二醇为基质，以95％以上的收率、2g/L/小时以上的生产速度得到的羟基乙酸水溶液。

[0035] 根据本发明，开发出以远远少于目前已知的时间高生产率地生产杂质少的羟基乙酸的微生物，可以廉价地以工业规模生产可用于聚合物原料用途的高纯度的羟基乙酸。另
外，也可以通过应用上述生产方法生产羟基乙酸之外的羟基羧酸。

[0036] 关于羟基乙酸的生产，由于与公知信息相反，应增强活性的目标酶仅为1种即可高生产率地生产羟基乙酸，因此可以减少增强酶活性所必须的劳力，同时，可以避免以由于
人为的增强多种酶活性所产生 的应激(stress)使得导入的基因脱落为代表的对宿主微
生物的不良影响。

[0037] 另外，本发明提供通过减少用于生产羟基羧酸类的微生物的培养所必需的葡萄糖而降低制备成本的方法。

附图说明

[0038] [图1]表示实施例3的反应液中的羟基乙酸蓄积量的经时变化图。图中，△表示大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株的结果，○表示大肠杆菌MG1655野生株的结果。

[0039] [图2]表示实施例4的反应液中的羟基乙酸蓄积量的经时变化图。图中，□表示大肠杆菌MG1655/pGAPfucO-aldA株的结果，○表示大肠杆菌MG1655野生株的结果。

具体实施方式

[0040] 以下详细说明本发明。

[0041] 本发明中催化乙二醇生成羟基乙醛的反应的酶只要是能够以乙二醇为反应基质生成羟基乙醛的酶即可，没有特别限定，上述酶全部包含在其定义中。作为上述酶，列举乳
醛还原酶。

[0042] 作为本发明中被赋予了某目标酶的活性的微生物是指通过某种方法使完全没有该酶活性的该微生物具有该酶活性的微生物，本发明中的增强了某目标酶活性的微生物指
与野生型的该微生物相比显著提高了该酶活性的微生物。上述微生物可以通过例如采用
基因重组技术向野生型微生物(或重组前的微生物)中导入编码该酶的基因等方法来得
到。作为向野生型微生物(或重组前微生物)中导入该基因的方法，可以举出将该基因以
质粒的形态导入微生物的方法。向微生物中导入基因时所用的染色体组DNA的调制、质
粒的调制、DNA的切断及连接、转化、PCR(polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核
苷酸的设计、合成等方法，可以采用本领域技术人员公知的常用方法进行。上述方法记载
在Sambrook，J.，et.al.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，ColdSpring Harbor LaboratoryPress，(1989)等中。

[0043] 本发明的微生物是不论是否原本拥有从末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸的能力，通过采用某种手段即可得到从末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸的
能力的微生物的总称。作为上述微生物，列举大肠杆菌。

[0044] 本发明中，作为末端具有羟基的脂肪族多元醇类，只要是碳链的末端具有羟基、且分子内具有2个以上羟基的脂肪族化合物即可，对其结构没有特别限定，作为上述化合物，
可以举出乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、甘油、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，
4-丁二醇、1，2，4-丁三醇等。

[0045] 本发明中的将编码某目标酶的基因导入微生物时的“以质粒的形态”指将该基因连接在载体上制作重组质粒，用转化等方法将其导入该微生物。另外，如本发明的实施例所
述，功能性地连接在微生物内恒久发挥作用的强启动子与目标基因时，通过利用因质粒具
有的复制子的性质而使得每个微生物细胞的拷贝数通常较少的质粒也能达到本发明的目
的。作为具有上述复制子的质粒，可以列举pACYC184(GenBank accession number X06403)
等。

[0046] 作为本发明中的催化由羟基乙醛生成羟基乙酸的反应的酶，只要是能够以羟基乙醛作为反应基质生成羟基乙酸的酶即可，没有特别限定，上述酶全部包含在其定义中。作为
上述酶，列举乳醛脱氢酶。

[0047] 本发明的表达与糖酵解体系、核酸生物合成体系或氨基酸生物合成体系相关的蛋白质的基因的启动子为在微生物内恒久地发挥作用的强启动子，且在葡萄糖存在下其表达
也难以被抑制的启动子，具体地可以列举甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下称为GAPDH)的启动
子或丝氨酸羟甲基转移酶的启动子。

[0048] 本发明的启动子是指具有σ因子的RNA聚合酶接合、开始转录的部位。例如，来自大肠杆菌的GAPDH启动子在GenBank accessionnumber X02662的碱基序列信息中标记
在397-440位。

[0049] 本发明中，基因与启动子功能性地连接指该基因与启动子接合，使该基因处于启动子的控制下，基因的表达受启动子的控制。

[0050] 本发明的乳醛还原酶是遵照国际生化学联合(I.U.B.)酶委员会报告分类为酶编号1.1.1.77、在作为辅酶的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下可逆地催化从1，2-丙
二醇生成乳醛的反应的酶的总称。

[0051] 本发明的乳醛脱氢酶是遵照国际生化学联合(I.U.B.)酶委员会报告分类为酶编号1.2.1.22、在作为辅酶的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下催化从乳醛生成乳酸
的反应的酶的总称，同时也指遵照国际生化学联合(I.U.B.)酶委员会报告分类为酶编号
1.2.1.21、在作为辅酶的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下催化从羟基乙醛生成羟基
乙酸的反应的酶羟基乙醛脱氢酶的总称。原因在于，在使用大肠菌的现有文献中报道了乳
醛脱氢酶与羟基乙醛脱氢酶为相同的酶(Caballero，E.，et.al.，J.Biol.Chem.，258(12)，
7788-7792(1983))。

[0052] 本发明的羟基乙酸氧化酶(以下称为glcDEF)是遵照国际生化学联合(I.U.B.)酶委员会报告分类为酶编号1.1.3.15、可逆地催化由羟基乙酸生成二羟乙酸的反应的酶的
总称。

[0053] 本发明的丙酮酸甲酸裂解酶(以下称为pflB)是遵照国际生化学联合(I.U.B.)酶委员会报告分类为酶编号2.3.1.54、可逆地催化由丙酮酸生成甲酸的反应的酶的总称。

[0054] 本发明的glcDEF或pflB的酶机能失活指该酶活性完全消失。本发明的glcDEF或pflB的酶机能的降低指该酶活性部分消失。为了使酶机能的失活或降低可以采用下述
方法：在编码该蛋白质的基因中引入变异或使其缺失；或添加特异地使该蛋白质失活的药
剂；照射紫外线等。具体地可以列举大肠杆菌MT-11023株因glcDEF基因与pflB基因被破
坏导致上述酶机能失活的微生物。

[0055] 由于大肠杆菌MT-11023株因基因破坏导致glcDEF、pflB失活，故使用该菌株能容易地实施本发明。该菌株的保藏编号为FERM BP-10293，基于国际承认用于专利程序的微生
物保藏的布达佩斯条约， 于平成17年3月10日保藏在茨城县筑波市东1条1番1号中央
第6独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。

[0056] 实施本发明的生产方法时，通常使用培养基培养赋予或增强了催化从乙二醇生成羟基乙醛的反应的酶活性的微生物，使其增殖，得到必要量的微生物菌体。

[0057] 本发明的培养所用的培养基，只要是含有碳源、氮源、无机离子及根据需要含有的其他有机微量成分的培养基即可，没有特别限定。作为碳源，可以适当地使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸，甲醇、乙醇、甘油等醇类及其他。作为氮源，可以适当使用有机铵盐、无机铵盐、氨气、氨水等无机氮源，及蛋白质水解产物等有机氮源
及其他。作为无机离子，可以根据需要适当使用镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子、锰离子及其他。作为有机微量成分，可以适当使用维生素、氨基酸等及含有上述维生素或氨基酸
的酵母提取液、蛋白胨、玉米浆、酪蛋白分解物及其他。

[0058] 需要说明的是，作为本发明培养中所使用的培养基，如果从用于工业生产的方面考虑则优选液体培养基。

[0059] 培养本发明的微生物时，培养条件没有特别限定，例如，在需氧条件下、pH6～8、温度为25℃～40℃的范围内边适当地控制pH与温度边培养时，培养所需要的时间为50小
时以内。

[0060] 本发明的生产羟基羧酸的反应中所用的反应液为能添加(或含有)作为基质的末端具有羟基的脂肪族多元醇的液体即可，没有特别限定，可以列举磷酸钾缓冲液等缓冲液、
上述微生物的培养中使用的培养基及纯水。本发明中，使预先培养得到的微生物菌体接触
上述液体进行反应。对于微生物菌体，除了使用培养结束后的培养液本身之外，还可以举出
从培养液中仅回收菌体进行使用的方法。

[0061] 进行本发明的羟基羧酸类的生产方法中的反应时，反应条件没有特别限定，例如，优选在pH6～9、温度为20℃～40℃的范围内边适当控制pH及温度边进行反应。

[0062] 作为回收如上所述得到的反应液中蓄积的羟基羧酸的方法，没有 特别限定，例如利用离心分离等从反应液除去菌体后，可以采用使用合成吸附树脂的方法或使用沉淀剂的
方法、利用其他通常的提取分离方法分离羟基羧酸的方法。

[0063] 实施例1

[0064] 来自大肠杆菌的乳醛还原酶表达载体及该表达载体转化体的构建

[0065] 已报道了大肠杆菌的乳醛还原酶的氨基酸序列及基因(以下，省略为fucO)的碱基序列(GenBank accession number M31059)。为了取得fucO，使用大肠杆菌MG1655株的
染色体组DNA作为模板，按照CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG(序列号
1)、及GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(序列号2)采用PCR法进行扩增，用限制酶EcoRI
及HindIII消化所得的DNA片段，得到约1.2kbp的fucO片段。进一步为了取得甘油醛3-磷
酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)(GAPDH)启动子，使用大肠杆菌
MG1655株的染色体组DNA作为模板，按照AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列号3)、
及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号4)采用PCR法进行扩增，用限制酶EcoRI
消化所得的DNA片段，得到约100bp的编码GAPDH启动子的DNA片段。混合上述2个DNA
片段与用限制酶EcoRI及HindIII消化质粒pUC18所得的片段，使用连接酶接合后，转化至
大肠杆菌DH5株，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板中繁殖的转化体。将得
到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌
体中回收质粒pGAPfucO。该质粒pGAPfucO转化至大肠杆菌MG1655株，在含有50μg/mL氨
苄青霉素的LB琼脂平板中在37℃下培养一夜得到MG1655/pGAPfucO株。

[0066] 需要说明的是，大肠杆菌MG1655株、大肠杆菌DH5株均可从美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)购得。

[0067] 实施例2

[0068] 乳醛还原酶、乳醛脱氢酶同时表达载体及该表达载体转化体的构建

[0069] 已报道了大肠杆菌的乳醛还原酶的氨基酸序列及基因(以下，省略为fucO)的碱基序列(GenBank accession number M31059)。另外，也报道了大肠杆菌的乳醛脱氢酶的氨
基酸序列及基因(以下，省略为aldA)的碱基序列(GenBank accession number M64541)。
为了取得fucO，使用大肠杆菌MG1655株的染色体组DNA作为模板，按照GCTCTAGACGGAGA
AAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG(序列号5)、及GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(序
列号2)采用PCR法进行扩增，用限制酶XbaI及HindIII消化所得的DNA片段，得到
约1.2kbp的fucO片段。进一步为了取得aldA，使用大肠杆菌MG1655株的染色体组
DNA作为模板，按照CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAGTACCCGTTCAACATCC(序列号6)、及
GCTCTAGACTCTTTCACTCATTAAGACTG(序列号7)采用PCR法进行扩增，用限制酶EcoRI及XbaI
消化得到的DNA片段，得到约1.5kbp的aldA片段。再与实施例1相同地得到编码甘油醛
3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)(GAPDH)启动子的片段。混
合上述3个DNA片段与用限制酶EcoRI及HindIII消化质粒pUC18得到的片段，使用连接
酶接合后，转化至大肠杆菌DH5株，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板中繁殖
的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃下培养一
夜，从得到的菌体中回收质粒pGAPfucO-aldA。将该质粒pGAPfucO-aldA转化至大肠杆菌
MG1655株，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板中，在37℃下培养一夜得到MG1655/
pGAPfucO-aldA株。

[0070] 实施例3

[0071] 由大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株、大肠杆菌MG1655野生株生产羟基乙酸

[0072] 作为前培养将实施例1中得到的大肠杆菌MG1655/pGAPfucO 株、大肠杆菌MG1655野生株植入放在三角烧瓶中的25mL LB Broth，Miller培养液(Difco244620)中，在培养温
度为35℃、120rpm的条件下搅拌培养一夜。将各种前培养液全部移入装有475g如表2(表
2)所示组成的培养基的容积为1L的培养槽(ABLE社制培养装置BMJ-01)中，进行培养。培
养在大气压下、通气量为1vvm、搅拌速度为800rpm、培养温度为35℃、pH7.2(用氨水溶液调
节)下进行。离心分离(8000rpm、20分钟)培养开始24小时后的菌体，收集菌体，用pH7.2
的1mM磷酸钾缓冲液清洗后，用相同的缓冲液混悬，将最终溶液量定量为500ml。将悬浊液
移入ABLE社制培养装置BMJ-01培养槽中，以5g/小时的速度添加乙二醇，反应22小时。反
应在大气压下、通气量为1vvm、搅拌速度为800rpm、反应温度为35℃、pH7.2(用氨水溶液调
节)下进行。用HPLC根据定量法测定得到的反应液中的羟基乙酸蓄积量。结果如图1(图
1)所示。

[0073] 确认了在大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株中经22小时蓄积了106g/L羟基乙酸，未检出作为从乙二醇生成羟基乙酸的中间体的羟基乙醛。另一方面，野生株中即使在反应22
小时后也未检出羟基乙酸。

[0074] [表2]

[0075] 表2培养基组成

[0076]

[0077] (其余部分：水)

[0078] 实施例4

[0079] 由大肠杆菌MG1655/pGAPfucO-aldA株、大肠杆菌MG1655野生株生产羟基乙酸

[0080] 与实施例3相同地培养实施例2得到的大肠杆菌 MG1655/pGAPfucO-aldA株、大肠杆菌MG1655野生株。培养开始24小时后，直接在培养中的培养槽中以5g/小时的速度
经22小时添加乙二醇，进行反应。用HPLC根据定量法测定得到的培养液中的羟基乙酸蓄
积量。结果如图2(图2)所示。

[0081] 确认了在大肠杆菌MG1655/pGAPfucO-aldA株中开始添加乙二醇22小时后蓄积了110g/L羟基乙酸，未检出作为从乙二醇生成羟基乙酸的中间体的羟基乙醛。另一方面，野生
株中即使开始添加乙二醇22小时后也未检出羟基乙酸。

[0082] 实施例5

[0083] 制作大肠杆菌MG1655aldA缺失株

[0084] 已报道了大肠杆菌的染色体组DNA的全部碱基序列(GenBankaccession numberU00096)。也已报道了大肠杆菌的乳醛脱氢酶的氨基酸序列及基因(以下省略为aldA)的
碱基序列(GenBank accessionnumber M64541)。使用基于大肠杆菌MG1655株的染色体
组DNA的aldA附近区域的基因信息制得的TACTGCAGTGATCCTTGCAGGCAATGC(序列号8)及
GGTCTAGAATCATCAGAGAGACGGAATCG(序列号9)、GGTCTAGAATGAGTGAAAGAGGCGGAG(序列号10)
及AAGGTACCGATGCTGGTGCGAAGAAGG(序列号11)进行PCR。分别用限制酶PstI与XbaI、
XbaI与KpnI消化得到的DNA片段，分别得到约800bp、700bp的片段。混合该DNA片段与
用PstI、KpnI消化温度感受性克隆载体pTH18cs1(GenBank accession numberAB019610)
[Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)]得到的片段，使用连接酶连接后，在
30℃下转化至DH5株，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中繁殖的转化体。将得
到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，从得到的菌体中
回收质粒。

[0085] 在30℃下将该质粒转化至大肠杆菌MG1655株，将其在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种在含有10μg/ml氯霉
素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。然后涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂
平板上以得到上述培养菌体，得到在42℃下繁殖的菌落。将得到的菌落在不含有药剂的LB
液体培养基中在30℃下培养一夜，进一步涂布在不含有药剂的LB琼脂平板上，得到在42℃
下繁殖的菌落。

[0086] 从出现的菌落中随机选取100菌落，使其分别在不含有药剂的LB琼脂平板与含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中繁殖，选择仅在不含有药剂的LB琼脂平板中繁殖的氯霉
素感受性克隆。进一步从上述目标克隆的染色体DNA通过PCR扩增含有aldA的约3.2kb
的断片，选出aldA缺失株，将得到的株命名为MG1655aldA缺失株(以下省略为ΔaldA)。

[0087] 实施例6

[0088] ΔaldA/pGAPfucO株的构建

[0089] 将实施例1得到的质粒pGAPfucO转化至实施例5得到的ΔaldA株，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板中在37℃下培养一夜，得到ΔaldA/pGAPfucO株。

[0090] 实施例7

[0091] 由ΔaldA/pGAPfucO株生产羟基乙酸

[0092] 与实施例3相同地分别培养ΔaldA/pGAPfucO株、MG1655/pGAPfucO株，收集菌体、清洗后，与实施例3相同地向得到的菌体中添加乙二醇，反应10小时。确认了通过反应在
ΔaldA/pGAPfucO株中蓄积了64.8g羟基乙酸，在MG1655/pGAPfucO株中蓄积了64.2g羟基
乙酸。显示了在羟基乙酸的生产中未必需要乳醛脱氢酶。

[0093] 实施例8

[0094] 大肠杆菌MG1655/pGAPfucO-aldA株与大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株的菌体增殖比较

[0095] 与实施例3相同地培养实施例2得到的大肠杆菌MG1655/pGAPfucO-aldA株、实施例1得到的大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株。其中，将表1(表1)所示的培养基组成中的葡
萄糖量改为70g/L进行培养。培养24小时后，通过离心分离全部培养液收集菌体，测定得
到的湿菌体重量。另外，根据定量法测定培养基中残留的葡萄糖量，计算菌体增殖所需要的
葡萄糖量。结果如表3(表3)所示。

[0096] 表明尽管2种菌株之间得到的菌体重量大致相同，但此时所需的葡萄糖量在MG1655/pGAPfucO-aldA株中减少了2成以上。实施例7中显示生产羟基乙酸未必需要乳
醛脱氢酶，但是确认其通过增强该酶活性具有减少在羟基乙酸生产中所需的葡萄糖量的效
果。

[0097] [表3]

[0098] 表3

[0099]MG1655/pGAPfucO株 MG1655/pGAPfucO-aldA株
湿菌体重量(g) 45.3 45.5
消耗葡萄糖量(g) 31.6 24.5

[0100] 实施例9

[0101] 将大肠杆菌MG1655株染色体组上的fucO启动子置换成GAPDH启动子

[0102] 大肠杆菌的染色体组DNA的全部碱基序列(GenBank accessionnumberU00096)已公知，也报道了大肠杆菌fucO的碱基序列(GenBank accession number
M31059)。使用基于大肠杆菌MG1655株的fucO的5’附近区域的基因信息制得的
GCTCTAGACCTTCTCCTTGTTGCTTTACG(序列号12)与AACTGCAGAGAGAGGTAGCTAATGGAACG(序列
号13)，以大肠杆菌染色体组DNA为模板进行PCR，扩增约650bp的DNA片段。

[0103] 另外，基于大肠杆菌MG1655株的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子的序列信息制得的GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCG(序列号14)与基于大肠杆菌MG1655株的fucO
的序列信息制得的CAGGTACCATCCTTATCACCAGCAACC(序列号15)，以实施例1制作的表达载
体pGAPfucO为模板进行PCR，得到由GAPDH启动子与fucO的起始密码子附近区域构成的约
730bp的DNA片段。

[0104] 分别使用限制酶PstI与XbaI、XbaI与KpnI消化上述得到的片段， 混合该片段与使用PstI和KpnI消化温度感受性质粒pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)
[Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)]得到的片段，使用连接酶连接后，在
30℃下转化至DH5株，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中繁殖的转化体。将得
到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，从得到的菌体中
回收质粒。在30℃下将该质粒转化至大肠杆菌MG1655株，在30℃下在含有10μg/ml氯霉
素的LB琼脂平板中培养一夜，得到转化体。将该得到的转化体接种在含有10μg/ml氯霉
素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。然后涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂
平板上以得到上述培养菌体，得到在42℃下繁殖的菌落。将得到的菌落在不含有药剂的LB
液体培养基中在30℃下培养一夜，再涂布在不含有药剂的LB琼脂平板上，得到在42℃下繁
殖的菌落。

[0105] 从出现的菌落中随机选取100个菌落，使其分别在不含有药剂的LB琼脂平板与含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中繁殖，选择氯霉素感受性克隆。进一步从上述目标克
隆的染色体DNA通过PCR扩增含有GAPDH启动子与fucO部分序列的约730bp的断片，选出
fucO启动子区域被置换成GAPDH启动子的菌株，将满足上述条件的克隆命名为MG1655fucO
缺失GAPpfucO染色体组插入株。

[0106] 实施例10

[0107] 由MG1655fucO缺失GAPpfucO染色体组插入株生产羟基乙酸

[0108] 与实施例3相同地培养大肠杆菌MG1655fucO缺失GAPpfucO染色体组插入株，收集菌体、清洗后，与实施例3相同地向得到的菌体中添加乙二醇，反应24小时。未确认蓄积
羟基乙酸。

[0109] 实施例11

[0110] 使用低拷贝载体构建fucO表达载体

[0111] 使用基于大肠杆菌MG1655株的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子的序列信息制得的AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列号3)与基于大肠杆菌MG1655株的fucO序
列信 息制得的GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(序列号2)，以实施例1中制作的表达载
体pGAPfucO为模板进行PCR，得到由GAPDH启动子与fucO构成的约1300bp的DNA片段。

[0112] 混合该DNA片段与用限制酶HincII消化质粒pACYC184(GenBank accessionnumber X06403)得到的片段，使用接合酶连接后，转化至大肠杆菌DH5株，得到在含有
20μg/mL氯霉素的LB琼脂平板中繁殖的转化体。将得到的菌落在含有20μg/mL氯霉素
的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pACYCfucO。将该质粒
pACYCfucO转化至大肠杆菌MG1655株，在含有20μg/mL氯霉素的LB琼脂平板中，在37℃
下培养一夜，得到MG1655/pACYCfucO株。

[0113] 实施例12

[0114] 由MG1655/pACYCfucO株生产羟基乙酸

[0115] 与实施例3相同地培养大肠杆菌MG1655/pACYCfucO株，收集菌体、清洗后，与实施例3相同地向得到的菌体中添加乙二醇，反应9小时。通过反应蓄积了28g羟基乙酸。

[0116] 实施例13

[0117] 测定MG1655野生株、MG1655fucO缺失GAPpfucO染色体组插入株、MG1655/pACYCfucO株、MG1655/pGAPfucO株的乳醛还原酶的活性。

[0118] 与实施例3相同地培养各菌株。收集培养后的菌体并清洗后，混悬在pH7.4的50mM磷酸钾缓冲液中，进行超声波破碎。离心分离破碎后的菌体提取液，将上清液用于乳醛还原
酶的活性测定。使用乙二醇作为基质，通过用分光光度计测定反应生成的还原型烟酰胺腺
嘌呤二核苷酸的增加实施活性测定。计算每单位重量用于反应的可溶性蛋白质在1分钟内
的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生成量，MG1655野生株的值为1时的结果如表4(表4)
所示。

[0119] 显示了MG1655fucO缺失GAPpfucO染色体组插入株中，乳醛还原酶活性显著上升为MG1655野生株的18倍，但是，对羟基乙酸的 生产而言其活性增强并不充分，至少通过导
入低拷贝载体而增强活性时将活性增强1700倍左右对利用乳醛还原酶单独增强生产羟基
乙酸而言是必要的。

[0120] [表4]

[0121] 表4

[0122]MG1655野生 株 MG1655fucO缺失GAPpfucO 染色体组插入株 MG1655/pAC YCfucO株 MG1655/pGA PfucO株
乳醛还原酶 相对活性 1 18.3 1783.7 3724.1

[0123] 实施例14

[0124] 由大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株、大肠杆菌MG1655野生株生产L-甘油酸

[0125] 与实施例3相同地培养大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株及大肠杆菌MG1655野生株，收集菌体、清洗后，向得到的菌体中一次性添加甘油至浓度为150g/L代替在实施例3中添
加乙二醇，最终液体量为500ml，反应24小时。使用光学异构体分离用柱经HPLC根据定量
法测定得到的培养液中的L-甘油酸的蓄积量。确认了在大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株中
经24小时蓄积了67g/L的L-甘油酸。未确认在大肠杆菌MG1655野生株中蓄积有L-甘油
酸。

[0126] 实施例15

[0127] 利用大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株、大肠杆菌MG1655野生株生产羟基乙氧基乙酸

[0128] 与实施例3相同地培养大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株及大肠杆菌MG1655野生株。通过离心分离(8000rpm、20分钟)收集培养开始24小时后的菌体，用pH7.2的1mM磷酸钾
缓冲液清洗。用相同缓冲液混悬清洗后的约300mg菌体，在最终浓度为100mM的二甘醇的
存在下，以4ml最终溶液量反应18小时。在大气压下、反应温度为37℃下通过磁力搅拌器
边搅拌边进行反应。利用HPLC根据定量法测定得到的反应液中的羟基乙氧基乙酸。确认
了在大肠杆菌MG1655/pGAPfucO株中蓄积有1g/L的羟基乙氧基乙酸。未检出以二 甘醇酸
为代表的来自二甘醇的副产物。另外，未确认在大肠杆菌MG1655野生株中蓄积羟基乙氧基
乙酸。

[0129] 实施例16

[0130] 制作大肠杆菌MG1655glcDEF基因缺失株

[0131] 大肠杆菌的染色体组DNA的全部碱基序列(GenBank accessionnumberU00096)已公知，也已报导了大肠杆菌的glcDEF基因的碱基序列(GenBank accession
number L43490)。使 用 基于 大肠 杆 菌MG1655株的 染 色体 组DNA的glcDEF 基
因附近区域 的基因信息 制得的TTGGTACCGTTCTGCCAGCAACTGACG(序列号16)与
TGTCTAGAGTACCTCTGTGCGTCACTGG(序列号17)、GCTCTAGACGCTTTGTTGTGTTGTGTGG(序列号
18)与AACTGCAGGATCGGTCAATGATTGCAGC(序列号19)进行PCR。使用限制酶KpnI与XbaI、
XbaI与PstI消化所得的DNA片段，分别得到约670bp、790bp的片段。混合该DNA片段和使
用KpnI、PstI消化温度感受性克隆载体pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)
[Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)]得到的片段，使用连接酶连接后，在
30℃下转化至DH5株，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中繁殖的转化体。将得
到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，从得到的菌体中
回收质粒。将该质粒命名为pTHΔglcDEF。

[0132] 在30℃下将该质粒pTHΔglcDEF转化至大肠杆菌MG1655株，在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种在含有
10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。然后涂布在含有10μg/ml氯霉
素的LB琼脂平板上以得到上述培养菌体，得到在42℃下繁殖的菌落。将得到的菌落在不
含有药剂的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，进一步涂布在不含有药剂的LB琼脂平板
中，得到在42℃下繁殖的菌落。

[0133] 从出现的菌落中随机地选取100个菌落，使其分别在不含有药剂的LB琼脂平板与含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中繁殖，选择 仅在不含有药剂的LB琼脂平板中
繁殖的氯霉素感受性克隆。进一步从上述目标克隆的染色体DNA通过PCR使其扩增含有
glcDEF基因的约3.8kb的断片，选出glcDEF基因区域缺失的菌株，将得到的菌株命名为
MG1655glcDEF基因缺失株(以下省略为ΔglcDEF株)。

[0134] 实施例17

[0135] 制作大肠杆菌MG1655pflB基因缺失株

[0136] 已报道了大肠杆菌的pflB基因的碱基序列(GenBank accessionnumberX08035)。使用基于MG1655株的染色体DNA的pflB基因附近区域的基因信息制得的
GCACGAAAGCTTTGATTACG(序列号20)与TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(序列号21)、
TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(序列号22)与AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(序列号23)
进行PCR。分别使用限制酶HindIII与SphI、SphI与PstI消化得到的DNA片段，分别得
到约1770bp、约1340bp的片段。混合该DNA片段与使用HindIII、PstI消化温度感受性
克隆载体pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)[Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，
241，185-191(2000)]得到的片段，使用连接酶连接后，在30℃下转化至DH5株，得到在含有
10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中繁殖的转化体。将得到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的
LB液体培养基中在30℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。在30℃下该质粒转化至
大肠杆菌MG1655株，在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中培养一夜，得到转
化体。将得到的转化体接种在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，将其在30℃下培
养一夜。然后涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上以得到上述培养菌体，得到在
42℃下繁殖的菌落。将得到的菌落在不含有药剂的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，进
一步涂布在不含有药剂的LB琼脂平板中，得到在42℃下繁殖的菌落。

[0137] 从出现的菌落中随机地选取100个菌落，使其分别在不含有药剂的LB琼脂平板与含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板中繁殖，选择仅在不含有药剂的LB琼脂平板中繁殖的
氯霉素感受性克隆。进一步从上述目标克隆的染色体DNA通过PCR使其扩增含有pflB基
因的约2.0kb的断片，选出pflB基因区域缺失的菌株，将得到的菌株命名为MG1655pflB基
因缺失株(以下省略为ΔpflB株)。

[0138] 实施例18

[0139] 制作大肠杆菌MG1655pflB&glcDEF基因缺失株

[0140] 将 实 施 例16 得 到 的 质 粒 pTHΔglcDEF转 化 至 ΔpflB株，最 终 得 到MG1655pflB&glcDEF基因缺失株(以下省略为ΔpflBΔglcDEF株)。详细的方法遵照实施
例16所述的方法。

[0141] 实施例19

[0142] 构建ΔglcDEF/pGAPfucO株、ΔpflB/pGAPfucO株、ΔpflBΔglcDEF/pGAPfucO株

[0143] 将实施例1得到的质粒pGAPfucO转化至实施例16得到的ΔglcDEF株、实施例17得到的ΔpflB株及实施例18得到的ΔpflBΔglcDEF株，通过在含有50μg/mL氨苄青
霉素的LB琼脂平板中，在37℃下培养一夜，得到ΔglcDEF/pGAPfucO株、ΔpflB/pGAPfucO
株、ΔpflBΔglcDEF/pGAPfucO株。

[0144] 实施例20

[0145] 由ΔglcDEF/pGAPfucO株、ΔpflB/pGAPfucO株、ΔpflBΔglcDEF/pGAPfucO株生产羟基乙酸

[0146] 与实施例3相同地培养实施例3得到的MG1655/pGAPfucO株、实施例19得到的ΔglcDEF/pGAPfucO株、ΔpflB/pGAPfucO株、ΔpflBΔglcDEF/pGAPfucO株。通过离心分
离(8000rpm、20分钟)收集培养24小时后的菌体，用蒸馏水清洗。称量75g清洗后的集菌
体，将其与150g乙二醇一同混悬在蒸馏水中，最终溶液量为1500ml。将混悬液移入ABLE社
制培养装置DPC-2的培养槽中，反应22小时。反应在大气压下、通气量为0.7vvm、搅拌速
度为800rpm、反应温度为35℃、pH7.2(用氨水调节)下进行。用HPLC根据定量法测定得
到的反应液中的羟基乙酸及乙二酸、乙酸的蓄积量、乙二醇的残留量。结果如表5(表5)所
示。glcDEF基因及/或pflB基因的缺失可使乙 二酸、乙酸之类副生成的有机酸减少，且提
高乙二醇的转化率，显著提高羟基乙酸的生产率。

[0147] [表5]

[0148] 表5

[0149]MG1655/pGA PfucO株 ΔglcDEF/pGAPf ucO株 ΔpflB/pGAPfucO 株 ΔpflBΔglcDEF/ pGAPfucO株
羟基乙酸(g) 102.0 180.2 176.7 179.4
乙二醇(g) 60.5 (未检出) 0.5 (未检出)
乙二酸(g) 4.06 1.11 2.88 1.23
乙酸(g) 0.13 0.18 0.10 0.10