包含N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(LK-423)的耐胃酸的药物剂型转让专利
申请号 : CN200580016884.9
文献号 : CN1956707B
文献日 : 2010-12-29
发明人 : M·博加塔耶 , A·姆尔哈 , A·拉夫里克 , M·切尔内 , D·蒂鲍特 , A·斯塔利克 , U·乌尔莱波 , T·马泰奥维奇 , G·科夫 , J·柯克 , R·德勒 , 米田文士 , 村冈贱子
申请人 : 力奇制药公司
摘要 :
本发明涉及能将活性物质控制和/或靶向递送到所选择的人或动物的胃肠道区域的药物剂型。该药物剂型优选地包含活性物质N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(被称为LK 423)。本发明还公开了用本发明的药物剂型治疗人和/或动物的胃肠道的慢性炎性疾病的方法。
权利要求 :
1.一种包衣的药物剂型，其中所述的剂型适合用于将活性物质N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸控制和/或靶向递送到胃肠道的远端部分，所述药物剂型包含：-核芯，该核芯含有活性物质N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸和选自下列的多糖：酸形式或金属盐形式的果胶，以及助流剂，该核心是固体分散体；
-内包衣，该内包衣包含甲基丙烯酸酯共聚物Eudragit RS和/或Eudragit RL、助流剂和增塑剂；和-外包衣，该外包衣包含耐酸的聚合物、助流剂和增塑剂，该耐酸的聚合物选自甲基丙烯酸共聚物的衍生物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酞纤维素、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素或它们的组合，所述甲基丙烯酸共聚物的衍生物选自EudragitL、EudragitS、EudragitFS。
2.如权利要求1所述的包衣的药物剂型，其中所述的甲基丙烯酸共聚物的衍生物是EudragitL-55。
3.如权利要求1所述的包衣的药物剂型，其中所述核芯的多糖选自果胶和果胶钙。
4.如权利要求1所述的包衣的药物剂型，其中所述的核芯是N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸在形成果胶钙基质的果胶钙中的固体分散体。
5.如权利要求1所述的包衣的药物剂型，其中所述的核芯的助流剂选自硬脂酸镁、硬脂酸钙和二氧化硅气凝胶。
6.如权利要求1所述的包衣的药物剂型，其中所述的内包衣和外包衣的助流剂选自滑石粉、高岭土和甘油单硬脂酸酯。
7.如权利要求6所述的包衣的药物剂型，其中所述的助流剂是滑石粉。
8.如权利要求1所述的包衣的药物剂型，其中所述内包衣和外包衣的增塑剂选自柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸乙酰基三丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、三乙酸甘油酯、三醋精、聚乙二醇6000和聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯。
9.如权利要求8所述的包衣的药物剂型，其中所述的增塑剂是柠檬酸三乙酯。
10.一种包衣的药物剂型，其包含：
.核芯—包含硬脂酸镁的其中分散有N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸的果胶钙基质，和.内包衣—包含聚合物Eudragit RS和Eudragit RL、滑石粉和柠檬酸三乙酯，和.外包衣—包含聚合物Eudragit L-55、滑石粉和柠檬酸三乙酯。
11.如权利要求1所述的包衣的药物剂型，其中所述的剂型是微囊、包衣颗粒、包衣小丸、片剂或胶囊剂的形式。
12.如权利要求11所述的包衣的药物剂型，其中所述的包衣颗粒是包衣微粒。
13.如权利要求12所述的包衣的药物制剂，其中所述的包衣微粒是包衣微球。
14.如权利要求11所述的包衣的药物剂型，其中所述的剂型是微囊的形式。
15.如权利要求14所述的包衣的药物剂型，其中所述的微囊被进一步掺入到惰性片剂基质或惰性胶囊中。
16.包衣的药物剂型，该药物剂型包含权利要求1中所定义的含有N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸的核芯和权利要求1中所定义的内包衣，其中所述的剂型是微囊的形式，该微囊被包埋到.形成片剂的耐胃酸的片剂基质中，所述耐胃酸的片剂基质是与聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮混合物组合的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，或.形成片剂的随后用由耐胃酸和/或耐酸的聚合物形成的包衣进行包衣的惰性片剂基质中，或.由耐胃酸和/或耐酸的聚合物形成的胶囊中，或
.随后用由耐胃酸和/或耐酸的聚合物形成的包衣进行包衣的惰性胶囊中，所述的耐胃酸和/或耐酸的聚合物选自甲基丙烯酸共聚物的衍生物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酞纤维素、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素或它们的组合，所述甲基丙烯酸共聚物的衍生物选自EudragitL、EudragitS、EudragitFS。
17.如权利要求16所述的包衣的药物剂型，其中所述的甲基丙烯酸共聚物的衍生物是EudragitL-55。
18.如权利要求16所述的包衣的药物剂型，其中所述的剂型是包含被包埋到耐胃酸的片剂基质中的微囊的片剂，所述耐胃酸的片剂基质是与聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮混合物组合的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。
19.如权利要求1所述的包衣的药物剂型在制备用于治疗慢性炎性疾病的药物中的用途，其中所述的慢性炎性疾病选自结肠炎和局限性回肠炎。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述的结肠炎是非特异性溃疡性结肠炎。
说明书 :
技术领域
本发明涉及可用于将活性物质控制和/或靶向递送到所选择的人或动物的胃肠道区域的药物剂型。主要参考活性物质N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(被称为LK 423)来对本发明的药物剂型进行描述，但是本发明的药物剂型也适用于其它活性物质。
本发明的另一方面涉及用于获得所述药物剂型的方法和过程以及通过使用本发明的药物剂型来治疗人和/或动物的慢性炎性疾病的方法。
背景技术
在EP 477 912(US 5,514,654)中对N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(被称为LK 423)进行了描述。在WO 0135982和科学文献(Ochi C.等人，Arzneimittel-Forschung，(1999)49(1)：72-79；Moriguchi M.等人，Arzneimittel-Forschung(1999)49(2)：184-192)中对其调节细胞因子产生、抑制抗炎性细胞因子产生和刺激细胞因子、特别是IL-10产生的作用进行了描述。在WO 0135982中对LK 423在治疗各种炎性疾病、特别是溃疡性结肠炎和/或局限性回肠炎中的作用进行了描述。在WO 0135982中提及了制备用于口服和非口服施用活性物质LK 423的药物组合物的可能。但是，在所述的专利或科学文献中从来没有详细描述过包含LK 423的药物剂型。
对于用可容易地在胃肠道上段降解的活性成分治疗局部疾病(即溃疡性结肠炎和局限性回肠炎)和全身治疗而言，最合理的是使用可有效将活性物质递送到活性物质在其中被释放的所选择的胃肠道区域(例如结肠)的药 物剂型。因为，接近胃肠道的远端部分十分复杂和困难，所以用于将活性物质递送到这些部分的剂型十分复杂。尽管难以接近结肠，但是已经发现了多种可能的结肠定位药物递送的方法(Rubinstein A.，Crit Rev TherDrug Carrier Syst，12(2&3)，(1995)101-149)。在Friend D.R.，Adv DrugDeliv Rev，7，(1991)149-199中，在设计靶向于结肠的药物剂型时，有两个目标：
●将不带电的活性物质通过胃和小肠递送到结肠；
●以令人满意的可预测性和再现性在结肠中定位释放活性物质。
这些目标可用于将药物递送到人和动物的胃肠道的其它远端部分。
在专利文献：EP 527942(WO 9116881、US 5525634和US 586661)；WO 9200732；EP 366621(US 5171580和WO 9004386)；EP 553392；EP636366(US 5286493和US 5580578)；EP 463877；EP 453001；WO 9116042；US 5840332；GB 1219026；WO 8300435；EP 40590；EP 225189；US2002/0051818(US 2001/0005716、US 2001/0024660)；EP 810857(US6228396；WO 9535100)和US 5350741中和在科技文献：Gruber P等人，AdDrug Del Rev(1987)1：1-18；Rao S和Ritschel WA，S.T.P.Pharma Sci 1995；5：19-29；Evans DF等人，Gut(1988)29：1035-1041；Lee VHL等人，Peptideand protein drug delivery，Lee VHL编辑，Marcel Dekker，纽约，(1990)712-720；Rubinstein A.Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，12(2&3)，(1995)101-149；Wilding IR等人，Pharmac Ther(1994)62：97-124；Peeters R和Kinget R，Int J Pharm(1993)94：125-134；Evans DF等人，Gut(1988)29：1035-1041；Ashford M等人，Int J Pharm(1993)91：241-245；Ashford M等人，Int J Pharm(1993)95：193-199；Follonier N和Doelker E，S.T.P.Pharma Sci(1992)2：141-158；Hwang SJ等人，Crit Rev Ther DrugCarrier Syst(1998)15：243-284；Coupe AJ等人，Pharm Res(1991)8：360-364；Mooter van den G和Kinget R，Drug Del(1995)2：81-93；WildingIR等人，Pharmac Ther(1994)62：97-124；Wilding IR等人，Int J Pharm(1994)111：99-102；Fukui E等人，Int J Pharm(2000)204：7-15；Gazzaniga A.等人，Pharma Sci，5(1)，(1995)83-88；Ishibashi T.等人，Int J Pharm，168，(1998)31-40；Ishibashi T.等人，J Control Release，57，(1999)45-53；Kraeling M.E.K.和Ritschel W.A.，Methods Find Exp Clin Pharmacol，14(3)，(1992)199-209；Ashford M.等人，J Controlled Release(1993)26：213-220；Ashford M.等人，J Controlled Release(1994)30：225-232；Rubinstein A等人，Pharm Res(1993)10：258-263；Sriamornsak，P.Int.J.Pharm.(1998)169：213-220；Sriamornsak，P.和Nunthanid，J.Int.J.Pharm.(1998)160：207-212；Sriamornsak，P.，Puttipipatkhachorn，S.，Prakongpan，S.，Int.J.Pharm.(1997)156：189-194；Sriamornsak，P.等人，J.Controlled Release(1997)47：221-232；Sriamornsak，P.，Int.J.Pharm.(1998)169：213-220；Wakerly，Z.等人，Pharm.Res.(1996)13：1210-1212；Macleod，G.S等人，J.Controlled Release(1999)58：303-310；Macleod，G.S.，等人，Int.J.Pharm.(1999)187：251-257；Munjeri，O.等人，J.ControlledRelease(1997)46：273-278中描述了将药物控制和/或选择和/或靶向递送到胃肠道的不同方法。
对于定位递送到胃肠道远端部分(例如结肠)的药物递送系统的研制而言，诸如pH值(使得可研制pH控制系统)、胃肠通过时间(使得可研制时间控制系统)和在结肠中可定位降解的聚合物例如可降解的多糖之类的参数是很重要的。
通过将活性物质定位递送到所选择的胃肠道部分，可以在受累部分获得高的活性物质浓度和低的全身负担，从而使得产生较少的副作用。与活性物质的全身递送相比，定位递送使得被破坏的活性物质更少、活性物质的吸收度更高、吸收性更好并且局部副作用更少。
在治疗炎性肠病的领域中，一直都需要使得可以将活性物质控制、靶向和有效施用和/或递送到患病区域、简单且可以在不需要医务人员帮助的情况下进行应用、同时经济、有效、安全、副作用最少并且对人或动物温和的药物剂型。
发明概述
本发明的目的是提供可用于将活性物质控制和/或靶向递送到人和动物的胃肠道、优选递送到所选择的胃肠道区域的新的药物剂型。本发明的药物剂型使得活性物质可以以预定浓度被控制释放到所选择的人或动物的胃肠道区域、尤其是胃肠道的远端部分。虽然本发明的剂型是针对活性物质N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(被称为LK 423)研制的，但是本发明的理念和本发明的药物剂型也可用于需要控制和/或靶向递送到所选择的胃肠道区域的其它活性物质。
本发明的药物剂型可用于治疗人和动物的慢性炎性疾病如炎性肠病。
本发明提供了包含活性物质的新药物剂型。本发明还提供了制备该药物剂型的方法和该药物剂型的用途。
对于用可容易地在胃肠道上段降解的活性成分治疗局部疾病(即溃疡性结肠炎和局限性回肠炎)和全身治疗而言，最合理的是使用可有效将活性物质递送到活性物质在其中被释放的所选择的胃肠道区域(例如结肠)的药 物剂型。因为，接近胃肠道的远端部分十分复杂和困难，所以用于将活性物质递送到这些部分的剂型十分复杂。尽管难以接近结肠，但是已经发现了多种可能的结肠定位药物递送的方法(Rubinstein A.，Crit Rev TherDrug Carrier Syst，12(2&3)，(1995)101-149)。在Friend D.R.，Adv DrugDeliv Rev，7，(1991)149-199中，在设计靶向于结肠的药物剂型时，有两个目标：
●将不带电的活性物质通过胃和小肠递送到结肠；
●以令人满意的可预测性和再现性在结肠中定位释放活性物质。
这些目标可用于将药物递送到人和动物的胃肠道的其它远端部分。
在专利文献：EP 527942(WO 9116881、US 5525634和US 586661)；WO 9200732；EP 366621(US 5171580和WO 9004386)；EP 553392；EP636366(US 5286493和US 5580578)；EP 463877；EP 453001；WO 9116042；US 5840332；GB 1219026；WO 8300435；EP 40590；EP 225189；US2002/0051818(US 2001/0005716、US 2001/0024660)；EP 810857(US6228396；WO 9535100)和US 5350741中和在科技文献：Gruber P等人，AdDrug Del Rev(1987)1：1-18；Rao S和Ritschel WA，S.T.P.Pharma Sci 1995；5：19-29；Evans DF等人，Gut(1988)29：1035-1041；Lee VHL等人，Peptideand protein drug delivery，Lee VHL编辑，Marcel Dekker，纽约，(1990)712-720；Rubinstein A.Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，12(2&3)，(1995)101-149；Wilding IR等人，Pharmac Ther(1994)62：97-124；Peeters R和Kinget R，Int J Pharm(1993)94：125-134；Evans DF等人，Gut(1988)29：1035-1041；Ashford M等人，Int J Pharm(1993)91：241-245；Ashford M等人，Int J Pharm(1993)95：193-199；Follonier N和Doelker E，S.T.P.Pharma Sci(1992)2：141-158；Hwang SJ等人，Crit Rev Ther DrugCarrier Syst(1998)15：243-284；Coupe AJ等人，Pharm Res(1991)8：360-364；Mooter van den G和Kinget R，Drug Del(1995)2：81-93；WildingIR等人，Pharmac Ther(1994)62：97-124；Wilding IR等人，Int J Pharm(1994)111：99-102；Fukui E等人，Int J Pharm(2000)204：7-15；Gazzaniga A.等人，Pharma Sci，5(1)，(1995)83-88；Ishibashi T.等人，Int J Pharm，168，(1998)31-40；Ishibashi T.等人，J Control Release，57，(1999)45-53；Kraeling M.E.K.和Ritschel W.A.，Methods Find Exp Clin Pharmacol，14(3)，(1992)199-209；Ashford M.等人，J Controlled Release(1993)26：213-220；Ashford M.等人，J Controlled Release(1994)30：225-232；Rubinstein A等人，Pharm Res(1993)10：258-263；Sriamornsak，P.Int.J.Pharm.(1998)169：213-220；Sriamornsak，P.和Nunthanid，J.Int.J.Pharm.(1998)160：207-212；Sriamornsak，P.，Puttipipatkhachorn，S.，Prakongpan，S.，Int.J.Pharm.(1997)156：189-194；Sriamornsak，P.等人，J.Controlled Release(1997)47：221-232；Sriamornsak，P.，Int.J.Pharm.(1998)169：213-220；Wakerly，Z.等人，Pharm.Res.(1996)13：1210-1212；Macleod，G.S等人，J.Controlled Release(1999)58：303-310；Macleod，G.S.，等人，Int.J.Pharm.(1999)187：251-257；Munjeri，O.等人，J.ControlledRelease(1997)46：273-278中描述了将药物控制和/或选择和/或靶向递送到胃肠道的不同方法。
对于定位递送到胃肠道远端部分(例如结肠)的药物递送系统的研制而言，诸如pH值(使得可研制pH控制系统)、胃肠通过时间(使得可研制时间控制系统)和在结肠中可定位降解的聚合物例如可降解的多糖之类的参数是很重要的。
通过将活性物质定位递送到所选择的胃肠道部分，可以在受累部分获得高的活性物质浓度和低的全身负担，从而使得产生较少的副作用。与活性物质的全身递送相比，定位递送使得被破坏的活性物质更少、活性物质的吸收度更高、吸收性更好并且局部副作用更少。
在治疗炎性肠病的领域中，一直都需要使得可以将活性物质控制、靶向和有效施用和/或递送到患病区域、简单且可以在不需要医务人员帮助的情况下进行应用、同时经济、有效、安全、副作用最少并且对人或动物温和的药物剂型。
发明概述
本发明的目的是提供可用于将活性物质控制和/或靶向递送到人和动物的胃肠道、优选递送到所选择的胃肠道区域的新的药物剂型。本发明的药物剂型使得活性物质可以以预定浓度被控制释放到所选择的人或动物的胃肠道区域、尤其是胃肠道的远端部分。虽然本发明的剂型是针对活性物质N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(被称为LK 423)研制的，但是本发明的理念和本发明的药物剂型也可用于需要控制和/或靶向递送到所选择的胃肠道区域的其它活性物质。
本发明的药物剂型可用于治疗人和动物的慢性炎性疾病如炎性肠病。
本发明提供了包含活性物质的新药物剂型。本发明还提供了制备该药物剂型的方法和该药物剂型的用途。
附图说明
图1给出了本发明的一些药物剂型的图解结构。
图2给出了活性物质从实施例1的大小为1600-2000μm、用10％比例为1∶1的 RL混合物和30％ L-55包衣的微球中的释放曲线。
图3给出了活性物质从实施例2的大小为1250-2000μm、用3％比例为1∶1的 RL混合物和30％ L-55包衣的微球中的释放曲线。
图4给出了活性物质从实施例3的由单包衣微囊组成并用羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP) SR混合物压制成片剂的片剂中的释放曲线。
图5给出了没有用LK 423进行处理的具有DSS-诱导的凝固性坏死的肠粘膜。在坏死区域中表面上皮和腺上皮缺失。粘膜的固有层被炎性细胞浸润。在严重水肿的粘膜下层中，大出血围绕有炎性细胞。器官：结肠。染色-HE(苏木精-曙红)。放大率：40×。
图6给出了具有DSS(硫酸葡聚糖钠)-诱导的凝固性坏死的粘膜的坏死固有层，然后直接用纯化合物LK 423对其进行处理。该粘膜的固有层被包括许多成纤维细胞在内的炎性细胞浸润(活跃的炎性过程)。该粘膜的固有层表面被上皮所覆盖，该上皮的厚度不均匀并且与基底分离。在固有层中看不到腺上皮的更新。炎性细胞和成纤维细胞积聚在肌层下水肿的粘膜下层中。器官：结肠。染色-HE(苏木精-曙红)。放大率：40×。
图7给出了具有DSS-诱导的凝固性坏死的粘膜的坏死固有层，然后用位于本发明药物剂型中的包含化合物LK 423的微囊对其进行处理。肉芽组织位于粘膜和粘膜下层中的坏死区域中。粘膜中的肉芽组织被来自损害边缘的表面上皮所覆盖。重新形成具有正确结构的腺体和淋巴小结。不存在急性出血和急性炎性浸润。器官：结肠。染色-HE(苏木精-曙红)。放大率：40×。
发明描述
发现包含活性物质的本发明的药物剂型可用于将活性物质控制和/或靶向递送到所选择的人和动物的胃肠道区域，尤其是胃肠道的远端部分，即回肠、盲肠和结肠。本发明的药物剂型优选地包含活性物质N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(LK 423)。
本发明的药物剂型包含核芯、内包衣和任选的外包衣。
本文所用的术语‘核芯’指的是含有活性物质本身或含有被掺入到多糖基质中的活性物质的药物剂型的中心部分。所述的核芯可以为球形粒子的形式，所述的球形粒子选自微球、微粒、小丸、颗粒或其它相似和/或类似的形式。
本文所用的术语‘包衣’指的是围绕着所述核芯的层。
核芯位于本发明药物剂型的内部。所述的药物剂型可具有更多层包衣从而使得核芯位于内部，被一层内包衣和任选的一层外包衣围绕着。
本文所用的术语‘内包衣’指的是直接被涂敷到核芯上的包衣，其可以与术语阻滞(retard)包衣、阻滞型包衣、由阻滞聚合物形成的包衣和用于 持续释放的包衣互换使用。
本文所用的术语‘底衣(subcoat)’指的是被涂敷到内包衣下或外包衣下以便于将核芯与内包衣分离开和/或将内包衣与外包衣分离开的层。当核芯的组分与内包衣的组分之间和/或内包衣的组分与外包衣的组分之间可能不相容时可以使用底衣。
本文所用的术语‘外包衣’指的是被涂敷到内包衣上的层，其可以与术语耐胃酸的包衣、肠溶衣、耐酸的包衣、由耐胃酸和/或耐酸的聚合物形成的包衣互换使用。
在本发明的药物剂型中，核芯包含活性物质和多糖(形成多糖基质)，活性物质与多糖的比例为约4∶1至约1∶4(w/w)。优选地，所述的活性物质是LK 423并且LK 423与多糖的比例为约1∶1(w/w)。所述的多糖选自酸形式或金属盐形式的果胶或海藻酸、半乳甘露聚糖、共价交联的葡聚糖、直链淀粉、黄原胶、角叉菜胶和淀粉或具有相同的特定降解性的所述多糖或其盐的组合。所选择的多糖优选地是果胶，更优选地为其钙盐形式(果胶钙(calcium pectinate))。
优选地，核芯是活性物质LK 423在形成果胶钙基质的果胶钙中的固体分散体。所述的果胶钙基质可特定地被胃肠道远端部分的菌群所降解。在与水性介质接触时，其膨胀，形成凝胶，活性物质通过该凝胶进行释放。位于基质中的活性物质可以溶解、混悬或部分溶解和部分混悬。所述的固体分散体为球形珠的形式。
此外，核芯还优选地包含助流剂。这些助流剂可以在核芯的制备过程中增加混悬液的均匀性。当存在助流剂时，助流剂的比例为核芯重量的约15至约60％(w/w)。核芯中的助流剂选自硬脂酸镁、硬脂酸钙或二氧化硅气凝胶(aerosil)。所述的助流剂优选地是硬脂酸镁或二氧化硅气凝胶。
本发明的药物剂型的核芯直径为约100μm至约2800μm。
本发明的药物剂型的核芯被使得活性物质从核芯中持续释放的内包衣围绕着。所述的内包衣防止活性物质在小肠的近端部分释放并确保其在回肠、盲肠和结肠中释放。
内包衣包含在水中不可溶并且可以被水和水性溶液部分渗透的聚合物。所述聚合物选自甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯(PVAc)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的混合物和/或其组合。内包衣可以包含两种或更多种聚合物的组合。当内包衣包含两种聚合物的组合时，两种聚合物都是非pH-依赖性的并且在水性介质中不可溶。两种聚合物的组合选自甲基丙烯酸酯共聚物(具有低季铵基团含量的丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的共聚物的组合)(例如Eudragit RS，Eudragit RL)。优选地，内包衣包含甲基丙烯酸和丙烯酸的酯衍生物的组合，所述的衍生物是具有低季铵基含量的丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的共聚物，第一种聚合物中铵基与剩余的中性酯的摩尔比为1∶20，第二种聚合物中铵基与剩余的中性酯的摩尔比为1∶40。更优选地，第一种聚合物是USP/NF的季胺基甲基丙烯酸酯共聚物(ammonio methacrylatecopolymer)A型(例如EudragitRL)，第二种聚合物是USP/NF的季胺基甲基丙烯酸酯共聚物B型(例如EudragitRS)。共聚物优选地以分散体形式、更优选地以30％水性分散体的形式被涂敷在核芯上。
内包衣优选地还包含其它可药用的赋形剂。适宜的可药用的赋形剂选自助流剂、增塑剂、消泡剂和色素。内包衣的助流剂选自含水硅酸镁(滑石粉)、高岭土和甘油单硬脂酸酯。优选地，所选择的内包衣的助流剂是滑石粉。内包衣的适宜的增塑剂选自柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸乙酰基三丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、三乙酸甘油酯、三醋精、聚乙二醇6000和聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯。内包衣的增塑剂优选地是柠檬酸三乙酯。
在本发明的具有一个核芯和一个(内)包衣的药物剂型中，核芯的比例为该药物剂型总重量的约50％至约98％(w/w)，包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约50％(w/w)。优选地，核芯在所述剂型中的比例为该药物剂型总重量的约70至约97％重量，包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约30％重量。
在本发明的药物剂型中，可以在内包衣上涂敷外包衣。外包衣在低于5的酸性pH环境中不可溶，防止活性物质在胃的酸性介质中释放。外包衣 优选地包含在高于5.5的pH(即小肠液的pH)下可溶的聚合物。
外包衣可以包含任何耐酸的聚合物，所述聚合物选自甲基丙烯酸共聚物的衍生物(例如EudragitL、EudragitL-55、EudragitS、Eudragit FS)、HPMCP、羟乙基纤维素邻苯二甲酸酯(HECP)、醋酞纤维素(CAP)、聚邻苯二甲酸乙烯基乙酰基酯(polyvinyl acetyl phthalate)(PAP)、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(HPMC AS)或它们的组合。外包衣优选地包含以甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯为基础的阴离子共聚物。根据USP/NF，一种适宜的聚合物是分散体形式、更优选地为30％水性分散体形式的甲基丙烯酸共聚物C型(例如EudragitL-55)。
本发明的外包衣还可优选地包含其它选自助流剂、增塑剂、消泡剂和色素的可药用的赋形剂。优选地使用助流剂和增塑剂。
外包衣的助流剂选自滑石粉、高岭土和甘油单硬脂酸酯。外包衣的助流剂优选地是滑石粉。
外包衣的增塑剂选自柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸乙酰基三丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、三乙酸甘油酯、三醋精、聚乙二醇6000和聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯。外包衣的增塑剂优选地是柠檬酸三乙酯。
在本发明的具有核芯、内包衣和外包衣的药物剂型中，核芯的比例为该药物剂型总重量的约30％至约90％(w/w)，内包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约50％(w/w)，外包衣的比例为该药物剂型总重量的约6％至约50％(w/w)。优选地，核芯在所述剂型中的比例为所述药物剂型总重量的约55％至约90％(w/w)，内包衣的比例为其约2％至约30％(w/w)，外包衣的比例为其约6％至约32％(w/w)。
可以根据核芯的大小、活性物质的含量和内包衣的厚度及组成以及外包衣的厚度及组成来调节活性物质从本发明的药物剂型中释放的部位和动力学。就此而言，可以使用不同直径的核芯和不同厚度及组成的内包衣和外包衣的组合。如果内包衣和/或外包衣的厚度增加，则活性物质的释放受到阻滞。
在本发明的最优选的方面，适于将活性物质控制和/或靶向递送到胃肠道远端部分的药物剂型包含
●核芯-包含作为助流剂的硬脂酸镁、其中分散有LK 423的果胶钙基质，和
●内包衣-包含聚合物Eudragit RS和Eudragit RL、作为助流剂的滑石粉和作为增塑剂的柠檬酸三乙酯，和
●外包衣-包含聚合物Eudragit L-55、作为助流剂的滑石粉和作为增塑剂的柠檬酸三乙酯。
本发明的药物剂型可以为微囊、包衣微粒、包衣微球、包衣颗粒、包衣小丸、片剂、胶囊剂等形式。本发明的药物剂型优选地为可以被掺入到惰性片剂基质中或惰性胶囊中以确保其应用和精确给药的微囊形式。所述的惰性片剂基质或惰性胶囊必须不影响药物释放。
本文所用的术语‘微囊’指的是包含核芯和至少一层包衣的大小为1μm至3000μm的球形颗粒。微囊可以被掺入到不同的剂型：混悬剂、胶囊剂或片剂中，它们还可以以粉末的形式被应用。
本文所用的术语‘微球’指的是包含活性物质、多糖(形成多糖基质)和一种或多种赋形剂的1μm至3000μm的球形颗粒。
本发明的另一个实施方案涉及其中没有涂敷外包衣的药物剂型。该药物剂型优选地为包含核芯和内包衣的微囊形式。不涂敷外包衣，将更多微囊包埋到：
●形成片剂的耐胃酸的片剂基质中，或
●形成片剂的随后用由耐胃酸和/或耐酸聚合物形成的包衣进行包衣的惰性片剂基质中，或
● 由耐胃酸和/或耐酸聚合物形成的胶囊中，或
●随后用由耐胃酸和/或耐酸聚合物形成的包衣进行包衣的惰性胶囊中。
所述药物剂型的耐胃酸和/或耐酸的聚合物在高于5.5的pH(肠液的pH)下可溶，选自任何选自甲基丙烯酸共聚物衍生物(例如EudragitL，EudragitL-55，EudragitS，EudragitFS)、HPMCP、羟乙基纤维素邻苯 二甲酸酯(HECP)、醋酞纤维素(CAP)、聚邻苯二甲酸乙烯基乙酰基酯(PAP)、HPMC AS或它们的组合的耐酸的聚合物。
可以加入其它物质来改变药物释放和/或帮助进行片剂或胶囊剂的制备。例如，当用HPMCP作为耐胃酸的聚合物时，可以加入PVAc和PVP的混合物(例如KollidonSR)来改变药物释放。
最优选地，本发明的这一实施方案的药物剂型是包含被包埋到片剂基质中的微囊(具有核芯和内包衣)的片剂，所述的片剂基质优选地是与PVAc和PVP的混合物(例如KollidonSR)组合的HPMCP。
在这一实施方案的药物剂型中，核芯的比例为该药物剂型总重量的约10％至约90％(w/w)。内包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约50％重量，片剂基质的比例为该药物剂型总重量的约6％至约90％。优选地，核芯在所述剂型中的比例为该药物剂型总重量的约10％至约80％(w/w)。内包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约30％(w/w)，片剂基质的比例为该药物剂型总重量的约6％至约90％。
本发明的药物剂型以约10mg至约1000mg LK 423的量以单剂量或多个分剂量的形式被施用于人或哺乳动物。
本发明的主题还涉及制备用于控制和/或靶向递送活性物质(例如LK423)的药物剂型的方法。
本发明的微囊可以用不同的方法来进行制备。对于核芯的制备而言，任何能够制备活性物质在以小珠形式形成多糖基质的多糖中的固体分散体的方法都是适用的，特别是以多糖小滴在离子溶液中的快速固化为基础的离子凝胶法(ionotropic gelation)，多糖与所述离子形成不溶性盐。适宜的方法还有喷雾干燥、溶剂萃取和蒸发以及流化床法。对于这些方法中的一些方法而言，可能需要使用另外的赋形剂。
对核芯和微囊进行包衣可以通过使用流化床技术或任何适于形成薄膜的其它技术来进行。供选择的方法还有溶剂萃取或蒸发法。
本发明的主题还涉及通过使用或施用任何本发明的药物剂型来控制和/或靶向递送活性物质(例如LK 423)的方法。此外，本发明的主题还涉及用 于将活性物质控制和/或靶向递送到胃肠道的所有远端部分的方法。
本发明的主题还涉及通过任何本发明的药物剂型的递送来治疗人或动物的慢性炎性疾病的方法。所述的慢性炎性疾病选自人或动物的炎性肠病，主要是结肠炎、非特异性溃疡性结肠炎和/或局限性回肠炎。
在使用治疗慢性炎性疾病的方法时，活性物质以每天约10mg至约1000mg的量以单剂量或多个分剂量的形式被施用于人或动物。
除了所述的治疗方法外，本发明的主题还有活性物质在制备任何本发明的用于治疗人或动物的慢性炎性疾病的药物剂型中的用途。所述的慢性炎性疾病选自人或动物的炎性肠病，主要是结肠炎、非特异性溃疡性结肠炎和/或局限性回肠炎。
在用活性物质制备任何本发明的用于治疗慢性炎性疾病的药物剂型时，活性物质以每天约10mg至约1000mg的量以单剂量或多个分剂量的形式被施用于人或动物。
实施例1
用于将LK 423递送到大鼠结肠的微囊的制备
核芯的制备
核芯是用离子胶凝法制备的，所述方法是以多糖溶液小滴在多糖与其形成不溶性盐的离子的溶液中的快速固化为基础的。
为了制备LMA果胶溶液(LM-104 AS-Z型Genu果胶，Hercules，荷兰)，将果胶在室温下溶解于软化水中至少12小时。将LK 423和硬脂酸镁混悬于该果胶溶液中并将所得的分散体在磁力搅拌器上搅拌3小时。然后，通过滴加将该分散体手动倾入0.25M CaCl2溶液中。使所得的核芯在CaCl2 中固化30分钟，过滤，用软化水洗涤并将其在室温和大气压下干燥24小时。此外，在进行包衣操作前即刻，将核芯在Wurster室中进行干燥。
用于制备核芯的分散体的组成如表1所示。
表1：用于制备核芯的分散体的组成
在进一步操作中将干燥的核芯过筛，仅用粒度为1250-1600μm的级分制备微囊。
包衣过程
包衣过程是在Apparatus Niro-Aeromatic STREA-1中用流化床技术进行的。
用于对核芯进行包衣的分散体的组成如表2所述。
表2：用于对核芯进行包衣的分散体的组成
给出的是制备100g分散体所用的各成分的重量。
对于内包衣而言，使用下面的条件：
-入口热气流：第5档，
-入口空气温度：40℃，
-喷雾压力：2bar，
-包衣混悬液流速：1.3g/min。
内包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的10％。
将用内包衣进行了包衣的核芯在40℃下处理24小时，然后在下面的条件下涂敷外包衣：
-入口热空气流：第5档
-入口空气温度：40℃，
-喷雾压力：1.5bar，
-包衣混悬液流速：1.9g/min。
外包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的30％。
在涂敷外包衣后，全部试验进行了至少24小时。这时，在室温下将微囊铺在托盘上进行储存。
在可以获得少量样品时，用1-2g核芯或具有内包衣的核芯进行包衣过程，加入适宜量的在颜色上明显不同的彩色安慰剂小丸达40g。用这种方法制得的微囊的大小为1600-2000μm。微囊中的LK 423含量为14.5％(w/w)。
体外释放试验
LK 423的体外释放试验是用上述微囊根据USP XXVI在装置2中进行的，该试验按照下面的次序在不同的介质中进行12小时：前3小时在pH 3.3的HCl溶液中进行，在pH 7.1的磷酸盐缓冲液中进行3小时，在pH 7.6的磷酸盐缓冲液中进行1小时，在pH 7.1的磷酸盐缓冲液中进行5小时。这些条件模拟了大鼠胃肠道中的条件。LK 423的释放曲线如图2所示。LK 423的释放曲线表明在前7个小时，掺入的药物低于20％被释放，然后在接下来的4个小时中，至少另外50％的药物被释放。
实施例2
用于将LK 423递送到人结肠的微囊的制备
核芯是用实施例1中所述的方法制备的；选择大小为1000-1600μm的核芯，然后进行包衣。内包衣中的聚合物(表2)占未包衣核芯重量的3％。外包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的30％。包衣条件如实施例1中所述。
微囊的大小为1250-2000μm。活性物质的含量为10.8％(w/w)。
体外释放试验
体外释放试验是用上述微囊根据USP XXVI在装置2中进行的，前2小时在pH 1.2的HCl溶液中进行，然后，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中释放2小时，其后，将微囊放到pH 7.5的磷酸盐缓冲液中1小时，最后，放在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中4小时。这些条件模拟了人胃肠道中的条件。LK 423的释放曲线如图3所示。LK 423的释放曲线表明在该试验的前3个小时，低于15％的药物被释放，在接下来的4个小时中，至少另外60％的药物被释放。
实施例3
用于递送LK 423的微囊的制备
核芯是用实施例1中所述的方法制备的。为了制备LMA果胶溶液(LM-104 AS-Z型Genu果胶，Hercules，荷兰)，将果胶在室温下溶解于软化水中至少12小时。将LK 423和二氧化硅气凝胶200(Degussa)混悬于该果胶溶液中并将所得的分散体在磁力搅拌器上搅拌1至2小时。然后，借助输注泵通过滴加将分散体倾入冰冷的0.272M的CaCl2溶液中。对于约2.4g分散体而言，使用100mL CaCl2。将所得的核芯在CaCl2中固化5分钟，过滤，用软化水洗涤并将其在室温下和大气压下干燥24小时。此外，在进行包衣过程前即刻，将这些核芯在Wurster室中进行干燥。所用物质的量如表1所示。
表3：用于制备核芯的分散体的组成
在进一步操作中，将干燥的核芯过筛，仅用粒度为1600-2000μm的级 分制备微囊。
包衣条件如实施例1所述，只是内包衣中的聚合物Eudragit RS：Eudragit RL的比例为7∶3。内包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的15％。外包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的30％。
微囊的大小为1600-2000μm。活性物质的含量为14.11％。
体外释放试验
LK 423的体外释放试验是用上述微囊根据USP XXVI在装置2中进行的，该试验是按照下面的次序在不同的介质中进行的：前2小时在pH 1.2的含2g/L NaCl的HCl溶液中进行，最后在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中进行。LK 423的释放曲线表明在前5个小时，掺入的药物低于25％被释放，然后在接下来的4个小时中，至少另外55％的药物被释放。
实施例4
用于将LK 423递送到人结肠的片剂的制备
核芯包含用EudragitRS聚合物进行了包衣的LK 423在果胶钙(形成果胶钙基质)中的固体分散体。将所得的微囊包埋到片剂基质(其是HPMCP和KollidonSR的组合)中。这些微囊完全被所述两种聚合物的组合所包覆。
核芯的制备
核芯是用离子胶凝法制备的。该过程是如实施例1所述的那样进行的，只是不使用硬脂酸镁。在最初的分散体中，果胶LMA(GENU果胶LMA，Hercules)与LK 423的比例为1∶3(w/w)。在最初的分散体中每克果胶的水量为25-30g。
包衣过程
内包衣是通过溶剂蒸发法在具有适宜比例6mL/80mL的丙酮/液体石蜡系统中被涂敷的。将0.5g核芯混悬于其中已经溶解了EudragitRS(3.0g)并混悬有硬脂酸镁(0.2g)的丙酮中。在40℃下于搅拌期间蒸发掉丙酮，将所得的微囊在室温和减压下干燥过夜。不涂敷外包衣。在压片过程中使用 1250-1600μm的级分。微囊中的LK 423含量为62％(w/w)。
压片过程
片剂是在压片机上压制的。将微囊放到HPMCP(HP-55，Shin-Etsu)和KollidonSR(BASF)的物理混合物的层上并向其上再放置一层HPMCP和KollidonSR混合物。这些聚合物的混合物也被应用到片剂的两个侧面上以防止微囊与环境直接接触。对于一片150mg(2×75mg)的HPMCP片剂而言，使用20mg(2×10mg)KollidonSR和32mg微囊。LK 423的含量为每片20mg，即9.9％(w/w)。
体外释放试验
LK 423的体外释放试验是用上述片剂根据USP XXVI在装置2中进行的，该试验是按照下面的次序在不同的介质中进行的：前2小时在pH 1.2的含2g/L NaCl的HCl溶液中进行，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中进行3小时，最后在pH 6.0的加有果胶酶(Pectinec Ultra SP-L，Novo Nordisk)的Sorensen磷酸盐缓冲液中进行。这些条件模拟了人胃肠道的条件。LK 423的释放曲线如图4所示。LK 423的释放曲线表明在前3个小时，掺入的药物低于15％被释放，然后在接下来的4个小时，至少另外60％的药物被释放。
实施例5
含有LK 423的微囊的体内抗溃疡作用的证明
通过饮用含有2％硫酸葡聚糖钠(DSS)的水而在5天内在大鼠的回肠、盲肠和结肠内产生溃疡性变化。
DSS是一种以水溶液形式被口服施用后在动物的回肠、盲肠和结肠粘膜中诱导炎性和溃疡性变化的化合物。
形成了两个大鼠对照组和两个大鼠实验组(A和B)，各组具有相同数量的雄性和雌性大鼠。这些动物被随机分到各组。在第5天的下午7点之前，使动物自由进食，其后，仅使其在12a.m.至6p.m.期间进食；其间，动物不进食。
从实验第6天开始，动物饮用含有1％DSS的水。A组的动物以75mg/kg的剂量接受纯化合物LK 423。纯化合物LK 423被制备成位于1％明胶(Gelatin GE0020，Scharlau)中的混悬液形式并且通过管以1ml的体积被口服给予。B组的动物以75mg/kg的剂量接受包含LK 423的微囊(其制备如实施例1所述)。这些包含LK 423的微囊通过管被口服给予，分散在1.5至2ml 1％的明胶中。
在基线时，大鼠的体重为220-250g。在实验期间，任何组中存活下来的动物的体重都没有显著变化。在基线和在第6和第12天时，记录体重。为了测定血液学参数，在基线时和实验的第5天从眶周窦(periorbital sinus)取1.5ml血样，在第12天从腹主动脉取1.5ml血样。在the Institute forHealth Protection of Ruminants，Faculty of Veterinary Science的临床实验室中进行红细胞计数以及血红蛋白值和血细胞比容值测定。在实验的第1天，各组中的红细胞值范围为6.93-7.87×10×E12/l，血红蛋白值为139-149.7g/l，血细胞比容值为41.81-42.5％。在整个实验期间，还观察动物的存活率、腹泻和粪便中是否带血或出血强度。在第12天，在深度乙醚麻醉下将动物处死并进行尸体剖检。对回肠、盲肠和结肠中的肉眼检查变化以及出血强度进行观察。
在尸体剖检时，从动物体上取下一些肠的片段并将其在10％甲醛中固定；制备石蜡组织切片并用苏木精和曙红染色。然后，进行病理组织学诊断。
DSS-诱导的变化包括小肠粘膜的凝固性坏死。在所有组(对照组、A组和B组)(表3)中，对组织损害和损害周围组织的反应(再生水平)以及伴随的粘膜中出血范围的参数、具有腺性增生的粘膜肥大以及损害表面的上皮形成程度进行评估。标准如下：
根据组织和在40-倍放大下的视野直径(4mm)判断的急性出血范围：
●没有出血-0
●在固有层和粘膜下层少量出血，直径小于视野直径的一半-1
●在固有层和粘膜下层中度出血，直径达到视野直径的一半-2
●在固有层和粘膜下层十分广泛的出血，直径大于视野直径的一半-3
●在固有层、粘膜下层、肌层血管周围、浆膜和支持组织中十分广泛的出血-4
消退过程-具有组织防御反应的损害：
●没有细胞响应(没有反应)或者消退过程不再活跃-0
●在粘膜和粘膜下层存在具有核裂(karyorrhesis)和核固缩的中度细胞浸润(单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、组织细胞)-1
●在粘膜和粘膜下层存在具有核裂和核固缩的严重的弥散性细胞浸润(单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、组织细胞)-2
●在损伤周围的分界线中存在细胞浸润(单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、组织细胞)-3
再生过程/组织形成：
●没有组织响应-0
●初期(具有纤维蛋白、吞噬细胞、单核细胞、网状间充质细胞、内皮细胞的组织浸润)-1
●肉芽组织(成纤维细胞、组织细胞、淋巴细胞、单核细胞)-2
●具有新形成的腺上皮基底细胞、淋巴细胞、胶原纤维的成熟肉芽组织-3
●损害被修复-4
粘膜肥大以及腺体和杯形细胞的增生：
●无-0
●在损害周围为中度的-1
●再生性的-2
●过度的-3
损害的上皮形成：
●无-0
●初期的-1
●再生性的-2
●过度的-3
在表3中列出了对对照组的粘膜的损害和修复水平以及出血范围的评估。在两个对照组中，所诱导的组织坏死都伴有炎性细胞浸润。在新的损害中，细胞浸润被扩散；就细胞本身而言，可以看到核裂。在较旧的损害中，细胞浸润被组织到将组织的损害部分与新形成的肉芽组织划分开的分界线处。在损害的边缘可以看到粘膜肥大；损害表面的上皮形成尚未开始(图5)。在对照组中，组织坏死和对损害的限制被最大程度地表现出来。没有看到再生过程。
在A组中，DSS-诱导的组织坏死伴有细胞浸润、肉芽结缔组织生长并且同时还伴有显著的再生过程。限制损害的过程仍然活跃。粘膜的功能性修复过程表现为腺上皮和表面上皮的过度生长。尽管周围组织严重增生，但是观察到了仅被成熟结缔组织更新的部位(表3，图6)。在该组中，再生过程/损害水平的比为1.35∶1。
在B组中，DSS-诱导的组织坏死伴有中度细胞浸润。在治疗后，损害的组织被新形成的具有肠粘膜所有组织组分(表面上皮和腺上皮、淋巴小结和血管)的不成熟结缔组织所替代。再生过程表现在组织水平上(表3，图7)。再生过程/损害水平的比为3.22∶1。
表3还给出了粪便带血、在各肠部分具有出血的动物比例以及粘膜和粘膜下层出血的水平。还给出了各组从基线到实验结束时的血液学参数的降低以及死亡率。
表3：纯化合物LK 423(A组)和包含LK 423的微囊(B组)对回肠、盲肠和结肠的溃疡性变化的影响
*+痕量血，++中度出血，+++严重出血
#从0至3进行了描述；关于各水平，见实施例
从表3和图5-7可以得出结论，将LK 423掺入微囊中在本质上改善了LK 423的口服治疗作用。这种改善作用表现在减少了肠不同部分的出血、提高了动物的存活率，使肠粘膜的生理学更新更迅速且更多。与对照组或 A组(使用纯化合物LK 423)相比，在B组(含有LK 423的微囊)中，更迅速的组织更新使得血液学参数的变化很小。
在接受纯化合物LK 423或包含LK 423的微囊的动物中，都观察到了比两个对照组更迅速的肠粘膜损害的再生。在接受纯化合物LK 423的动物中，再生不在所有组织部分中均匀发生。覆盖其中炎性过程仍然活跃的固有层的肠上皮层被迅速修复(更新)。在损害组织周围且独立于损害的腺上皮表现出增生迹象，其超过了接受本发明的包含LK 423的微囊的组(B组)中所达到的水平。在接受纯化合物LK 423的组(A组)中，在粘膜和粘膜下层更深处观察到了淋巴小结的强烈反应(增生)。在接受本发明的包含LK 423的微囊的动物中，粘膜损害的再生更均匀且协调，从而导致了肠粘膜的生理学再生，粘膜中的炎性过程被限制和消除。肠上皮层对肉芽组织区域的覆盖开始于损害的边缘。沿损害的边缘进行的表皮增生在生理学限度内。在接受本发明的微囊的动物中，所诱导的肠粘膜损害的再生比接受纯化合物LK 423的组中的再生生理性更强，并且其均匀地涉及粘膜的所有组织组分并且不存在过度生长。
结果表明其中活性物质LK 423被掺入用两层包衣进行了包衣的果胶钙核芯中的本发明的微囊由于存在外包衣而防止了LK 423在胃中的释放。然而，内包衣提供了LK 423沿小肠的持续、延迟和控制释放，并且引发了LK 423在小肠远端部分、优选在大肠中的释放。在进入大肠(其中肠细菌降解了多糖核芯)后，LK 423的释放加速，然后LK 423被迅速释放。
本发明的控制释放药物剂型的结构使得可以以适当的动力学将适宜浓度的活性物质LK 423递送到患病部位。这些特点使得本发明的药物剂型具有最佳作用。
图2给出了活性物质从实施例1的大小为1600-2000μm、用10％比例为1∶1的 RL混合物和30％ L-55包衣的微球中的释放曲线。
图3给出了活性物质从实施例2的大小为1250-2000μm、用3％比例为1∶1的 RL混合物和30％ L-55包衣的微球中的释放曲线。
图4给出了活性物质从实施例3的由单包衣微囊组成并用羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP) SR混合物压制成片剂的片剂中的释放曲线。
图5给出了没有用LK 423进行处理的具有DSS-诱导的凝固性坏死的肠粘膜。在坏死区域中表面上皮和腺上皮缺失。粘膜的固有层被炎性细胞浸润。在严重水肿的粘膜下层中，大出血围绕有炎性细胞。器官：结肠。染色-HE(苏木精-曙红)。放大率：40×。
图6给出了具有DSS(硫酸葡聚糖钠)-诱导的凝固性坏死的粘膜的坏死固有层，然后直接用纯化合物LK 423对其进行处理。该粘膜的固有层被包括许多成纤维细胞在内的炎性细胞浸润(活跃的炎性过程)。该粘膜的固有层表面被上皮所覆盖，该上皮的厚度不均匀并且与基底分离。在固有层中看不到腺上皮的更新。炎性细胞和成纤维细胞积聚在肌层下水肿的粘膜下层中。器官：结肠。染色-HE(苏木精-曙红)。放大率：40×。
图7给出了具有DSS-诱导的凝固性坏死的粘膜的坏死固有层，然后用位于本发明药物剂型中的包含化合物LK 423的微囊对其进行处理。肉芽组织位于粘膜和粘膜下层中的坏死区域中。粘膜中的肉芽组织被来自损害边缘的表面上皮所覆盖。重新形成具有正确结构的腺体和淋巴小结。不存在急性出血和急性炎性浸润。器官：结肠。染色-HE(苏木精-曙红)。放大率：40×。
发明描述
发现包含活性物质的本发明的药物剂型可用于将活性物质控制和/或靶向递送到所选择的人和动物的胃肠道区域，尤其是胃肠道的远端部分，即回肠、盲肠和结肠。本发明的药物剂型优选地包含活性物质N-(2-(2-苯二酰亚氨基乙氧基)-乙酰基)-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(LK 423)。
本发明的药物剂型包含核芯、内包衣和任选的外包衣。
本文所用的术语‘核芯’指的是含有活性物质本身或含有被掺入到多糖基质中的活性物质的药物剂型的中心部分。所述的核芯可以为球形粒子的形式，所述的球形粒子选自微球、微粒、小丸、颗粒或其它相似和/或类似的形式。
本文所用的术语‘包衣’指的是围绕着所述核芯的层。
核芯位于本发明药物剂型的内部。所述的药物剂型可具有更多层包衣从而使得核芯位于内部，被一层内包衣和任选的一层外包衣围绕着。
本文所用的术语‘内包衣’指的是直接被涂敷到核芯上的包衣，其可以与术语阻滞(retard)包衣、阻滞型包衣、由阻滞聚合物形成的包衣和用于 持续释放的包衣互换使用。
本文所用的术语‘底衣(subcoat)’指的是被涂敷到内包衣下或外包衣下以便于将核芯与内包衣分离开和/或将内包衣与外包衣分离开的层。当核芯的组分与内包衣的组分之间和/或内包衣的组分与外包衣的组分之间可能不相容时可以使用底衣。
本文所用的术语‘外包衣’指的是被涂敷到内包衣上的层，其可以与术语耐胃酸的包衣、肠溶衣、耐酸的包衣、由耐胃酸和/或耐酸的聚合物形成的包衣互换使用。
在本发明的药物剂型中，核芯包含活性物质和多糖(形成多糖基质)，活性物质与多糖的比例为约4∶1至约1∶4(w/w)。优选地，所述的活性物质是LK 423并且LK 423与多糖的比例为约1∶1(w/w)。所述的多糖选自酸形式或金属盐形式的果胶或海藻酸、半乳甘露聚糖、共价交联的葡聚糖、直链淀粉、黄原胶、角叉菜胶和淀粉或具有相同的特定降解性的所述多糖或其盐的组合。所选择的多糖优选地是果胶，更优选地为其钙盐形式(果胶钙(calcium pectinate))。
优选地，核芯是活性物质LK 423在形成果胶钙基质的果胶钙中的固体分散体。所述的果胶钙基质可特定地被胃肠道远端部分的菌群所降解。在与水性介质接触时，其膨胀，形成凝胶，活性物质通过该凝胶进行释放。位于基质中的活性物质可以溶解、混悬或部分溶解和部分混悬。所述的固体分散体为球形珠的形式。
此外，核芯还优选地包含助流剂。这些助流剂可以在核芯的制备过程中增加混悬液的均匀性。当存在助流剂时，助流剂的比例为核芯重量的约15至约60％(w/w)。核芯中的助流剂选自硬脂酸镁、硬脂酸钙或二氧化硅气凝胶(aerosil)。所述的助流剂优选地是硬脂酸镁或二氧化硅气凝胶。
本发明的药物剂型的核芯直径为约100μm至约2800μm。
本发明的药物剂型的核芯被使得活性物质从核芯中持续释放的内包衣围绕着。所述的内包衣防止活性物质在小肠的近端部分释放并确保其在回肠、盲肠和结肠中释放。
内包衣包含在水中不可溶并且可以被水和水性溶液部分渗透的聚合物。所述聚合物选自甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯(PVAc)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的混合物和/或其组合。内包衣可以包含两种或更多种聚合物的组合。当内包衣包含两种聚合物的组合时，两种聚合物都是非pH-依赖性的并且在水性介质中不可溶。两种聚合物的组合选自甲基丙烯酸酯共聚物(具有低季铵基团含量的丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的共聚物的组合)(例如Eudragit RS，Eudragit RL)。优选地，内包衣包含甲基丙烯酸和丙烯酸的酯衍生物的组合，所述的衍生物是具有低季铵基含量的丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的共聚物，第一种聚合物中铵基与剩余的中性酯的摩尔比为1∶20，第二种聚合物中铵基与剩余的中性酯的摩尔比为1∶40。更优选地，第一种聚合物是USP/NF的季胺基甲基丙烯酸酯共聚物(ammonio methacrylatecopolymer)A型(例如EudragitRL)，第二种聚合物是USP/NF的季胺基甲基丙烯酸酯共聚物B型(例如EudragitRS)。共聚物优选地以分散体形式、更优选地以30％水性分散体的形式被涂敷在核芯上。
内包衣优选地还包含其它可药用的赋形剂。适宜的可药用的赋形剂选自助流剂、增塑剂、消泡剂和色素。内包衣的助流剂选自含水硅酸镁(滑石粉)、高岭土和甘油单硬脂酸酯。优选地，所选择的内包衣的助流剂是滑石粉。内包衣的适宜的增塑剂选自柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸乙酰基三丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、三乙酸甘油酯、三醋精、聚乙二醇6000和聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯。内包衣的增塑剂优选地是柠檬酸三乙酯。
在本发明的具有一个核芯和一个(内)包衣的药物剂型中，核芯的比例为该药物剂型总重量的约50％至约98％(w/w)，包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约50％(w/w)。优选地，核芯在所述剂型中的比例为该药物剂型总重量的约70至约97％重量，包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约30％重量。
在本发明的药物剂型中，可以在内包衣上涂敷外包衣。外包衣在低于5的酸性pH环境中不可溶，防止活性物质在胃的酸性介质中释放。外包衣 优选地包含在高于5.5的pH(即小肠液的pH)下可溶的聚合物。
外包衣可以包含任何耐酸的聚合物，所述聚合物选自甲基丙烯酸共聚物的衍生物(例如EudragitL、EudragitL-55、EudragitS、Eudragit FS)、HPMCP、羟乙基纤维素邻苯二甲酸酯(HECP)、醋酞纤维素(CAP)、聚邻苯二甲酸乙烯基乙酰基酯(polyvinyl acetyl phthalate)(PAP)、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(HPMC AS)或它们的组合。外包衣优选地包含以甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯为基础的阴离子共聚物。根据USP/NF，一种适宜的聚合物是分散体形式、更优选地为30％水性分散体形式的甲基丙烯酸共聚物C型(例如EudragitL-55)。
本发明的外包衣还可优选地包含其它选自助流剂、增塑剂、消泡剂和色素的可药用的赋形剂。优选地使用助流剂和增塑剂。
外包衣的助流剂选自滑石粉、高岭土和甘油单硬脂酸酯。外包衣的助流剂优选地是滑石粉。
外包衣的增塑剂选自柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸乙酰基三丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、三乙酸甘油酯、三醋精、聚乙二醇6000和聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯。外包衣的增塑剂优选地是柠檬酸三乙酯。
在本发明的具有核芯、内包衣和外包衣的药物剂型中，核芯的比例为该药物剂型总重量的约30％至约90％(w/w)，内包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约50％(w/w)，外包衣的比例为该药物剂型总重量的约6％至约50％(w/w)。优选地，核芯在所述剂型中的比例为所述药物剂型总重量的约55％至约90％(w/w)，内包衣的比例为其约2％至约30％(w/w)，外包衣的比例为其约6％至约32％(w/w)。
可以根据核芯的大小、活性物质的含量和内包衣的厚度及组成以及外包衣的厚度及组成来调节活性物质从本发明的药物剂型中释放的部位和动力学。就此而言，可以使用不同直径的核芯和不同厚度及组成的内包衣和外包衣的组合。如果内包衣和/或外包衣的厚度增加，则活性物质的释放受到阻滞。
在本发明的最优选的方面，适于将活性物质控制和/或靶向递送到胃肠道远端部分的药物剂型包含
●核芯-包含作为助流剂的硬脂酸镁、其中分散有LK 423的果胶钙基质，和
●内包衣-包含聚合物Eudragit RS和Eudragit RL、作为助流剂的滑石粉和作为增塑剂的柠檬酸三乙酯，和
●外包衣-包含聚合物Eudragit L-55、作为助流剂的滑石粉和作为增塑剂的柠檬酸三乙酯。
本发明的药物剂型可以为微囊、包衣微粒、包衣微球、包衣颗粒、包衣小丸、片剂、胶囊剂等形式。本发明的药物剂型优选地为可以被掺入到惰性片剂基质中或惰性胶囊中以确保其应用和精确给药的微囊形式。所述的惰性片剂基质或惰性胶囊必须不影响药物释放。
本文所用的术语‘微囊’指的是包含核芯和至少一层包衣的大小为1μm至3000μm的球形颗粒。微囊可以被掺入到不同的剂型：混悬剂、胶囊剂或片剂中，它们还可以以粉末的形式被应用。
本文所用的术语‘微球’指的是包含活性物质、多糖(形成多糖基质)和一种或多种赋形剂的1μm至3000μm的球形颗粒。
本发明的另一个实施方案涉及其中没有涂敷外包衣的药物剂型。该药物剂型优选地为包含核芯和内包衣的微囊形式。不涂敷外包衣，将更多微囊包埋到：
●形成片剂的耐胃酸的片剂基质中，或
●形成片剂的随后用由耐胃酸和/或耐酸聚合物形成的包衣进行包衣的惰性片剂基质中，或
● 由耐胃酸和/或耐酸聚合物形成的胶囊中，或
●随后用由耐胃酸和/或耐酸聚合物形成的包衣进行包衣的惰性胶囊中。
所述药物剂型的耐胃酸和/或耐酸的聚合物在高于5.5的pH(肠液的pH)下可溶，选自任何选自甲基丙烯酸共聚物衍生物(例如EudragitL，EudragitL-55，EudragitS，EudragitFS)、HPMCP、羟乙基纤维素邻苯 二甲酸酯(HECP)、醋酞纤维素(CAP)、聚邻苯二甲酸乙烯基乙酰基酯(PAP)、HPMC AS或它们的组合的耐酸的聚合物。
可以加入其它物质来改变药物释放和/或帮助进行片剂或胶囊剂的制备。例如，当用HPMCP作为耐胃酸的聚合物时，可以加入PVAc和PVP的混合物(例如KollidonSR)来改变药物释放。
最优选地，本发明的这一实施方案的药物剂型是包含被包埋到片剂基质中的微囊(具有核芯和内包衣)的片剂，所述的片剂基质优选地是与PVAc和PVP的混合物(例如KollidonSR)组合的HPMCP。
在这一实施方案的药物剂型中，核芯的比例为该药物剂型总重量的约10％至约90％(w/w)。内包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约50％重量，片剂基质的比例为该药物剂型总重量的约6％至约90％。优选地，核芯在所述剂型中的比例为该药物剂型总重量的约10％至约80％(w/w)。内包衣的比例为该药物剂型总重量的约2％至约30％(w/w)，片剂基质的比例为该药物剂型总重量的约6％至约90％。
本发明的药物剂型以约10mg至约1000mg LK 423的量以单剂量或多个分剂量的形式被施用于人或哺乳动物。
本发明的主题还涉及制备用于控制和/或靶向递送活性物质(例如LK423)的药物剂型的方法。
本发明的微囊可以用不同的方法来进行制备。对于核芯的制备而言，任何能够制备活性物质在以小珠形式形成多糖基质的多糖中的固体分散体的方法都是适用的，特别是以多糖小滴在离子溶液中的快速固化为基础的离子凝胶法(ionotropic gelation)，多糖与所述离子形成不溶性盐。适宜的方法还有喷雾干燥、溶剂萃取和蒸发以及流化床法。对于这些方法中的一些方法而言，可能需要使用另外的赋形剂。
对核芯和微囊进行包衣可以通过使用流化床技术或任何适于形成薄膜的其它技术来进行。供选择的方法还有溶剂萃取或蒸发法。
本发明的主题还涉及通过使用或施用任何本发明的药物剂型来控制和/或靶向递送活性物质(例如LK 423)的方法。此外，本发明的主题还涉及用 于将活性物质控制和/或靶向递送到胃肠道的所有远端部分的方法。
本发明的主题还涉及通过任何本发明的药物剂型的递送来治疗人或动物的慢性炎性疾病的方法。所述的慢性炎性疾病选自人或动物的炎性肠病，主要是结肠炎、非特异性溃疡性结肠炎和/或局限性回肠炎。
在使用治疗慢性炎性疾病的方法时，活性物质以每天约10mg至约1000mg的量以单剂量或多个分剂量的形式被施用于人或动物。
除了所述的治疗方法外，本发明的主题还有活性物质在制备任何本发明的用于治疗人或动物的慢性炎性疾病的药物剂型中的用途。所述的慢性炎性疾病选自人或动物的炎性肠病，主要是结肠炎、非特异性溃疡性结肠炎和/或局限性回肠炎。
在用活性物质制备任何本发明的用于治疗慢性炎性疾病的药物剂型时，活性物质以每天约10mg至约1000mg的量以单剂量或多个分剂量的形式被施用于人或动物。
实施例1
用于将LK 423递送到大鼠结肠的微囊的制备
核芯的制备
核芯是用离子胶凝法制备的，所述方法是以多糖溶液小滴在多糖与其形成不溶性盐的离子的溶液中的快速固化为基础的。
为了制备LMA果胶溶液(LM-104 AS-Z型Genu果胶，Hercules，荷兰)，将果胶在室温下溶解于软化水中至少12小时。将LK 423和硬脂酸镁混悬于该果胶溶液中并将所得的分散体在磁力搅拌器上搅拌3小时。然后，通过滴加将该分散体手动倾入0.25M CaCl2溶液中。使所得的核芯在CaCl2 中固化30分钟，过滤，用软化水洗涤并将其在室温和大气压下干燥24小时。此外，在进行包衣操作前即刻，将核芯在Wurster室中进行干燥。
用于制备核芯的分散体的组成如表1所示。
表1：用于制备核芯的分散体的组成
在进一步操作中将干燥的核芯过筛，仅用粒度为1250-1600μm的级分制备微囊。
包衣过程
包衣过程是在Apparatus Niro-Aeromatic STREA-1中用流化床技术进行的。
用于对核芯进行包衣的分散体的组成如表2所述。
表2：用于对核芯进行包衣的分散体的组成
给出的是制备100g分散体所用的各成分的重量。
对于内包衣而言，使用下面的条件：
-入口热气流：第5档，
-入口空气温度：40℃，
-喷雾压力：2bar，
-包衣混悬液流速：1.3g/min。
内包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的10％。
将用内包衣进行了包衣的核芯在40℃下处理24小时，然后在下面的条件下涂敷外包衣：
-入口热空气流：第5档
-入口空气温度：40℃，
-喷雾压力：1.5bar，
-包衣混悬液流速：1.9g/min。
外包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的30％。
在涂敷外包衣后，全部试验进行了至少24小时。这时，在室温下将微囊铺在托盘上进行储存。
在可以获得少量样品时，用1-2g核芯或具有内包衣的核芯进行包衣过程，加入适宜量的在颜色上明显不同的彩色安慰剂小丸达40g。用这种方法制得的微囊的大小为1600-2000μm。微囊中的LK 423含量为14.5％(w/w)。
体外释放试验
LK 423的体外释放试验是用上述微囊根据USP XXVI在装置2中进行的，该试验按照下面的次序在不同的介质中进行12小时：前3小时在pH 3.3的HCl溶液中进行，在pH 7.1的磷酸盐缓冲液中进行3小时，在pH 7.6的磷酸盐缓冲液中进行1小时，在pH 7.1的磷酸盐缓冲液中进行5小时。这些条件模拟了大鼠胃肠道中的条件。LK 423的释放曲线如图2所示。LK 423的释放曲线表明在前7个小时，掺入的药物低于20％被释放，然后在接下来的4个小时中，至少另外50％的药物被释放。
实施例2
用于将LK 423递送到人结肠的微囊的制备
核芯是用实施例1中所述的方法制备的；选择大小为1000-1600μm的核芯，然后进行包衣。内包衣中的聚合物(表2)占未包衣核芯重量的3％。外包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的30％。包衣条件如实施例1中所述。
微囊的大小为1250-2000μm。活性物质的含量为10.8％(w/w)。
体外释放试验
体外释放试验是用上述微囊根据USP XXVI在装置2中进行的，前2小时在pH 1.2的HCl溶液中进行，然后，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中释放2小时，其后，将微囊放到pH 7.5的磷酸盐缓冲液中1小时，最后，放在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中4小时。这些条件模拟了人胃肠道中的条件。LK 423的释放曲线如图3所示。LK 423的释放曲线表明在该试验的前3个小时，低于15％的药物被释放，在接下来的4个小时中，至少另外60％的药物被释放。
实施例3
用于递送LK 423的微囊的制备
核芯是用实施例1中所述的方法制备的。为了制备LMA果胶溶液(LM-104 AS-Z型Genu果胶，Hercules，荷兰)，将果胶在室温下溶解于软化水中至少12小时。将LK 423和二氧化硅气凝胶200(Degussa)混悬于该果胶溶液中并将所得的分散体在磁力搅拌器上搅拌1至2小时。然后，借助输注泵通过滴加将分散体倾入冰冷的0.272M的CaCl2溶液中。对于约2.4g分散体而言，使用100mL CaCl2。将所得的核芯在CaCl2中固化5分钟，过滤，用软化水洗涤并将其在室温下和大气压下干燥24小时。此外，在进行包衣过程前即刻，将这些核芯在Wurster室中进行干燥。所用物质的量如表1所示。
表3：用于制备核芯的分散体的组成
在进一步操作中，将干燥的核芯过筛，仅用粒度为1600-2000μm的级 分制备微囊。
包衣条件如实施例1所述，只是内包衣中的聚合物Eudragit RS：Eudragit RL的比例为7∶3。内包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的15％。外包衣中的聚合物占未包衣核芯重量的30％。
微囊的大小为1600-2000μm。活性物质的含量为14.11％。
体外释放试验
LK 423的体外释放试验是用上述微囊根据USP XXVI在装置2中进行的，该试验是按照下面的次序在不同的介质中进行的：前2小时在pH 1.2的含2g/L NaCl的HCl溶液中进行，最后在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中进行。LK 423的释放曲线表明在前5个小时，掺入的药物低于25％被释放，然后在接下来的4个小时中，至少另外55％的药物被释放。
实施例4
用于将LK 423递送到人结肠的片剂的制备
核芯包含用EudragitRS聚合物进行了包衣的LK 423在果胶钙(形成果胶钙基质)中的固体分散体。将所得的微囊包埋到片剂基质(其是HPMCP和KollidonSR的组合)中。这些微囊完全被所述两种聚合物的组合所包覆。
核芯的制备
核芯是用离子胶凝法制备的。该过程是如实施例1所述的那样进行的，只是不使用硬脂酸镁。在最初的分散体中，果胶LMA(GENU果胶LMA，Hercules)与LK 423的比例为1∶3(w/w)。在最初的分散体中每克果胶的水量为25-30g。
包衣过程
内包衣是通过溶剂蒸发法在具有适宜比例6mL/80mL的丙酮/液体石蜡系统中被涂敷的。将0.5g核芯混悬于其中已经溶解了EudragitRS(3.0g)并混悬有硬脂酸镁(0.2g)的丙酮中。在40℃下于搅拌期间蒸发掉丙酮，将所得的微囊在室温和减压下干燥过夜。不涂敷外包衣。在压片过程中使用 1250-1600μm的级分。微囊中的LK 423含量为62％(w/w)。
压片过程
片剂是在压片机上压制的。将微囊放到HPMCP(HP-55，Shin-Etsu)和KollidonSR(BASF)的物理混合物的层上并向其上再放置一层HPMCP和KollidonSR混合物。这些聚合物的混合物也被应用到片剂的两个侧面上以防止微囊与环境直接接触。对于一片150mg(2×75mg)的HPMCP片剂而言，使用20mg(2×10mg)KollidonSR和32mg微囊。LK 423的含量为每片20mg，即9.9％(w/w)。
体外释放试验
LK 423的体外释放试验是用上述片剂根据USP XXVI在装置2中进行的，该试验是按照下面的次序在不同的介质中进行的：前2小时在pH 1.2的含2g/L NaCl的HCl溶液中进行，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中进行3小时，最后在pH 6.0的加有果胶酶(Pectinec Ultra SP-L，Novo Nordisk)的Sorensen磷酸盐缓冲液中进行。这些条件模拟了人胃肠道的条件。LK 423的释放曲线如图4所示。LK 423的释放曲线表明在前3个小时，掺入的药物低于15％被释放，然后在接下来的4个小时，至少另外60％的药物被释放。
实施例5
含有LK 423的微囊的体内抗溃疡作用的证明
通过饮用含有2％硫酸葡聚糖钠(DSS)的水而在5天内在大鼠的回肠、盲肠和结肠内产生溃疡性变化。
DSS是一种以水溶液形式被口服施用后在动物的回肠、盲肠和结肠粘膜中诱导炎性和溃疡性变化的化合物。
形成了两个大鼠对照组和两个大鼠实验组(A和B)，各组具有相同数量的雄性和雌性大鼠。这些动物被随机分到各组。在第5天的下午7点之前，使动物自由进食，其后，仅使其在12a.m.至6p.m.期间进食；其间，动物不进食。
从实验第6天开始，动物饮用含有1％DSS的水。A组的动物以75mg/kg的剂量接受纯化合物LK 423。纯化合物LK 423被制备成位于1％明胶(Gelatin GE0020，Scharlau)中的混悬液形式并且通过管以1ml的体积被口服给予。B组的动物以75mg/kg的剂量接受包含LK 423的微囊(其制备如实施例1所述)。这些包含LK 423的微囊通过管被口服给予，分散在1.5至2ml 1％的明胶中。
在基线时，大鼠的体重为220-250g。在实验期间，任何组中存活下来的动物的体重都没有显著变化。在基线和在第6和第12天时，记录体重。为了测定血液学参数，在基线时和实验的第5天从眶周窦(periorbital sinus)取1.5ml血样，在第12天从腹主动脉取1.5ml血样。在the Institute forHealth Protection of Ruminants，Faculty of Veterinary Science的临床实验室中进行红细胞计数以及血红蛋白值和血细胞比容值测定。在实验的第1天，各组中的红细胞值范围为6.93-7.87×10×E12/l，血红蛋白值为139-149.7g/l，血细胞比容值为41.81-42.5％。在整个实验期间，还观察动物的存活率、腹泻和粪便中是否带血或出血强度。在第12天，在深度乙醚麻醉下将动物处死并进行尸体剖检。对回肠、盲肠和结肠中的肉眼检查变化以及出血强度进行观察。
在尸体剖检时，从动物体上取下一些肠的片段并将其在10％甲醛中固定；制备石蜡组织切片并用苏木精和曙红染色。然后，进行病理组织学诊断。
DSS-诱导的变化包括小肠粘膜的凝固性坏死。在所有组(对照组、A组和B组)(表3)中，对组织损害和损害周围组织的反应(再生水平)以及伴随的粘膜中出血范围的参数、具有腺性增生的粘膜肥大以及损害表面的上皮形成程度进行评估。标准如下：
根据组织和在40-倍放大下的视野直径(4mm)判断的急性出血范围：
●没有出血-0
●在固有层和粘膜下层少量出血，直径小于视野直径的一半-1
●在固有层和粘膜下层中度出血，直径达到视野直径的一半-2
●在固有层和粘膜下层十分广泛的出血，直径大于视野直径的一半-3
●在固有层、粘膜下层、肌层血管周围、浆膜和支持组织中十分广泛的出血-4
消退过程-具有组织防御反应的损害：
●没有细胞响应(没有反应)或者消退过程不再活跃-0
●在粘膜和粘膜下层存在具有核裂(karyorrhesis)和核固缩的中度细胞浸润(单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、组织细胞)-1
●在粘膜和粘膜下层存在具有核裂和核固缩的严重的弥散性细胞浸润(单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、组织细胞)-2
●在损伤周围的分界线中存在细胞浸润(单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、组织细胞)-3
再生过程/组织形成：
●没有组织响应-0
●初期(具有纤维蛋白、吞噬细胞、单核细胞、网状间充质细胞、内皮细胞的组织浸润)-1
●肉芽组织(成纤维细胞、组织细胞、淋巴细胞、单核细胞)-2
●具有新形成的腺上皮基底细胞、淋巴细胞、胶原纤维的成熟肉芽组织-3
●损害被修复-4
粘膜肥大以及腺体和杯形细胞的增生：
●无-0
●在损害周围为中度的-1
●再生性的-2
●过度的-3
损害的上皮形成：
●无-0
●初期的-1
●再生性的-2
●过度的-3
在表3中列出了对对照组的粘膜的损害和修复水平以及出血范围的评估。在两个对照组中，所诱导的组织坏死都伴有炎性细胞浸润。在新的损害中，细胞浸润被扩散；就细胞本身而言，可以看到核裂。在较旧的损害中，细胞浸润被组织到将组织的损害部分与新形成的肉芽组织划分开的分界线处。在损害的边缘可以看到粘膜肥大；损害表面的上皮形成尚未开始(图5)。在对照组中，组织坏死和对损害的限制被最大程度地表现出来。没有看到再生过程。
在A组中，DSS-诱导的组织坏死伴有细胞浸润、肉芽结缔组织生长并且同时还伴有显著的再生过程。限制损害的过程仍然活跃。粘膜的功能性修复过程表现为腺上皮和表面上皮的过度生长。尽管周围组织严重增生，但是观察到了仅被成熟结缔组织更新的部位(表3，图6)。在该组中，再生过程/损害水平的比为1.35∶1。
在B组中，DSS-诱导的组织坏死伴有中度细胞浸润。在治疗后，损害的组织被新形成的具有肠粘膜所有组织组分(表面上皮和腺上皮、淋巴小结和血管)的不成熟结缔组织所替代。再生过程表现在组织水平上(表3，图7)。再生过程/损害水平的比为3.22∶1。
表3还给出了粪便带血、在各肠部分具有出血的动物比例以及粘膜和粘膜下层出血的水平。还给出了各组从基线到实验结束时的血液学参数的降低以及死亡率。
表3：纯化合物LK 423(A组)和包含LK 423的微囊(B组)对回肠、盲肠和结肠的溃疡性变化的影响
*+痕量血，++中度出血，+++严重出血
#从0至3进行了描述；关于各水平，见实施例
从表3和图5-7可以得出结论，将LK 423掺入微囊中在本质上改善了LK 423的口服治疗作用。这种改善作用表现在减少了肠不同部分的出血、提高了动物的存活率，使肠粘膜的生理学更新更迅速且更多。与对照组或 A组(使用纯化合物LK 423)相比，在B组(含有LK 423的微囊)中，更迅速的组织更新使得血液学参数的变化很小。
在接受纯化合物LK 423或包含LK 423的微囊的动物中，都观察到了比两个对照组更迅速的肠粘膜损害的再生。在接受纯化合物LK 423的动物中，再生不在所有组织部分中均匀发生。覆盖其中炎性过程仍然活跃的固有层的肠上皮层被迅速修复(更新)。在损害组织周围且独立于损害的腺上皮表现出增生迹象，其超过了接受本发明的包含LK 423的微囊的组(B组)中所达到的水平。在接受纯化合物LK 423的组(A组)中，在粘膜和粘膜下层更深处观察到了淋巴小结的强烈反应(增生)。在接受本发明的包含LK 423的微囊的动物中，粘膜损害的再生更均匀且协调，从而导致了肠粘膜的生理学再生，粘膜中的炎性过程被限制和消除。肠上皮层对肉芽组织区域的覆盖开始于损害的边缘。沿损害的边缘进行的表皮增生在生理学限度内。在接受本发明的微囊的动物中，所诱导的肠粘膜损害的再生比接受纯化合物LK 423的组中的再生生理性更强，并且其均匀地涉及粘膜的所有组织组分并且不存在过度生长。
结果表明其中活性物质LK 423被掺入用两层包衣进行了包衣的果胶钙核芯中的本发明的微囊由于存在外包衣而防止了LK 423在胃中的释放。然而，内包衣提供了LK 423沿小肠的持续、延迟和控制释放，并且引发了LK 423在小肠远端部分、优选在大肠中的释放。在进入大肠(其中肠细菌降解了多糖核芯)后，LK 423的释放加速，然后LK 423被迅速释放。
本发明的控制释放药物剂型的结构使得可以以适当的动力学将适宜浓度的活性物质LK 423递送到患病部位。这些特点使得本发明的药物剂型具有最佳作用。