抗CS1抗体的治疗用途转让专利
申请号 : CN200480043153.9
文献号 : CN1960750B
文献日 : 2011-06-29
发明人 : M·威廉姆斯 , J·Y·左 , N·F·兰多尔菲 , D·B·鲍尔斯 , R·B·杜布里奇 , D·劳 , 刘杲
申请人 : 艾伯特生物治疗学公司
摘要 :
本发明定向于结合并中和至少一个CS1生物活性的CS1拮抗剂。本发明也包括包含这样的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明也提供了预防或治疗需要它的研究对象包括自身免疫紊乱和癌症的疾病状态的方法，包含给予所述研究对象有效量这样的拮抗剂。
权利要求 :
1.抗CS1抗体或抗CS1抗原结合片段，其结合由SEQ ID NO：1编码的蛋白，且包含SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其是人源化的。
3.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其是IgG1。
4.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列和SEQ ID NO：68的氨基酸序列。
5.包含权利要求1-4中任一项的抗体或抗原结合片段的结合化合物，所述抗体或抗原结合片段连接至效应物部分和/或可检测标记。
6.权利要求5的结合化合物，其中所述抗体或抗原结合片段结合于可检测标记。
7.权利要求6的结合化合物，其中所述可检测标记是放射性化合物，荧光化合物，酶，底物，表位标签，或毒素。
8.权利要求5的结合化合物，其中所述效应物部分是毒素、化学治疗剂、免疫调节剂、或放射性同位素。
9.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项的抗体或抗原结合片段。
10.权利要求1-4中任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗多发性骨髓瘤的药物中用途。
11.药物组合物，其包含权利要求5的结合化合物。
12.权利要求5的结合化合物在制备用于治疗多发性骨髓瘤的药物中用途。
说明书 :
抗CS1抗体的治疗用途
发明领域
[0001] 本发明涉及疾病，包括涉及自身免疫和癌症的疾病治疗领域中的拮抗剂和抗体。本发明进一步涉及检测、鉴别和调节这些疾病的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 免疫球蛋白表达增加是许多疾病的特点。免疫球蛋白高水平的分泌造成各种紊乱，包括高粘滞综合征、导致疲劳的体虚紊乱(debilitatingdisorder)、头痛、呼吸短促、智力混乱、胸痛、肾损伤和衰竭、视觉问题以及雷诺氏现象(血循环差，特别是手指、脚趾、鼻子和耳朵)。冷凝激素病、混合冷球蛋白血症、高丙种球蛋白血症、干燥综合征、粘液水肿性苔藓、高歇氏症是与免疫球蛋白表达增加相关的疾病的实例。
[0004] 靶向自身蛋白的免疫球蛋白表达增加是自身免疫疾病的标志。自身免疫疾病是免疫系统不能识别自我的自身抗原。自身免疫疾病中，免疫系统错误地攻击自身，靶向细胞、组织和器官，最终导致生理系统的破环。自身免疫和自身免疫疾病的起源是多因素的，基因易感性、宿主因素(例如免疫调节控制无力、抑制T细胞缺陷或抵抗控制B细胞的多克隆刺激)、环境因素和抗原驱动机制都与自身免疫发展和抗自身抗原的自身抗体的产生相关。 [0005] 胃肠道紊乱和系统性红斑狼疮(SLE)是自身免疫疾病的两个实例。胃肠道紊乱的一个亚群炎性肠病(IBD)是一组无法治愈的紊乱，在全世界它影响了大约4百万人。目前不知道复发性炎性肠病的病因。理论包 括自身免疫介导的胃肠道细胞，包括淋巴细胞的破坏。之前已经证明了遗传性炎性肠病模型中的异常同型聚集，并且显示与自身免疫紊乱相关的基因NOD2的突变使患者易患局限性肠炎。Ni，J.等，具有遗传性炎性肠病的C3H/HeJ小鼠的免疫学异常(Immunological abnormality inC3H/HeJ mice with
heritable inflammatory bowel disease)，CellImmunol.169：7-15(1996)；Ogura，Y.等，NOD2移码突变与对局限性肠炎易感性相关(A frameshift mutation in NOD2 associated withsusceptibility to Crohn’s Disease)，Nature 411：603-606(2001)。
heritable inflammatory bowel disease)，CellImmunol.169：7-15(1996)；Ogura，Y.等，NOD2移码突变与对局限性肠炎易感性相关(A frameshift mutation in NOD2 associated withsusceptibility to Crohn’s Disease)，Nature 411：603-606(2001)。
[0006] 大多数IBD经常影响小肠和结肠，但是可能影响胃肠道的任何部分。仅美国有超过1百万人诊断为IBD，每年诊断有超过一万的新案例。由于对IBD患者生活质量有显著的影响，每年据称成千上万个小时的损失，相当于每年十亿美元的工作天数的丢失。
[0007] IBD产生一系列胃肠道和胃肠外症状，包括腹泻、直肠出血、腹痛、体重减轻、皮肤和眼睛紊乱、以及儿童生长延迟和性成熟延迟。IBD的两种类型是溃疡性结肠炎和局限性肠炎，它们共有相似症状和生理表现，但是它们影响消化道的方式不同。溃疡性结肠炎的特征在于所有或者部分结肠粘膜的溃疡性炎症，最常见的包括直肠。它的症状包括直肠流血和尿急、里急后重和腹泻。溃疡性结肠炎伴有严重的短和长期并发症。最严重的短期并发症是爆发性结肠炎、中毒性巨结肠和穿孔。严重的长期并发症包括骨质疏松和结肠直肠癌。 [0008] 局限性肠炎是慢性穿粘膜炎症，可能影响从口腔到肛门的胃肠道的任何部分。局限性肠炎是不连续的，有未受影响的区域散布在一个或多个受影响的区域之间。该疾病后期，粘膜发展为鹅卵石样，这是由很深的纵向溃疡与介于其间的正常粘膜相互交织造成的。 [0009] 大多数局限性肠炎患者呈现腹痛、压痛、慢性或夜晚腹泻、直肠流 血、体重减轻和发烧。局限性肠炎随着时间从原发性炎性疾病进展为两个临床模式之一：狭窄(stricturing)(梗阻)或穿孔(肠瘘)(fistulizing)。在狭窄形式，穿壁炎症引起肠壁中纤维肌肉性增生，之后是腔道的狭窄。当CD发展时，梗阻的症状变得常见。在穿孔形式，当炎症通道穿透整个肠壁并突破浆膜表面时就形成窦管，造瘘到相邻组织甚至穿透皮肤。 [0010] 一般使用临床、内窥镜和组织学标准诊断溃疡性结肠炎和局限性肠炎。然而，目前已经建立的传统诊断技术靠单个发现不能绝对地诊断溃疡性结肠炎或克隆氏病。此外，大约20％患者具有介于局限性肠炎和溃疡性结肠炎之间的临床现象。据说符合这个描述的患者具有不确定结肠炎。
[0011] IBD症状能很大地影响患者的安宁、生活质量和活动能力。炎性周期是拖延的和频发的，并且依赖于严重度和生命残疾。因为IBD是慢性的，一般在30岁之前开始，患者一般需要终身治疗。新的蛋白质和化合物在鉴别疾病状态中潜在靶点和诊断标记的作用的阐明对于改善炎性肠症患者目前的治疗是有价值的。
[0012] SLE的特征在于抗各种普遍存在的分子的自身抗体的产生，这些分子具有致病后果包括对许多器官和组织的损伤，包括皮肤、肾、脑和心脏。目前认可的SLE的治疗包括通过类固醇、免疫抑制药物、免疫调节剂和抗疟疾药物的非特异性免疫抑制和症状控制。然而，这些治疗方法导致肾毒性和早期死亡的危险。因而，开发特异性干扰淋巴细胞激活和自身抗体产生的新方法是期望的。
[0013] 免疫球蛋白表达增加和/或B细胞具有重要作用的其它自身免疫疾病包括自发性血小板减少症、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性溶血性贫血和重症肌无力。B细胞和/或免疫球蛋白增加的作用的证据来自用 类固醇、免疫抑制剂和/或抗CD20抗体(它靶向B细胞)治疗患者的研究。这些疾病症状的改善与B细胞和/或血清免疫球蛋白的减少相关联，强调了B细胞在各种自身免疫疾病中的中枢作用。
[0014] 恶性疾病中也能见到免疫球蛋白表达增加。象自身免疫紊乱一样，癌症的病因相似地是多因素起源的。在美国是第二主要死亡原因的癌症与造成细胞失控生长的DNA突变相关联。遗传易感性与例如吸烟和化学突变的环境因素相联合在许多癌症的发展中有巨大的作用。
[0015] 身体任何组织或器官中都能够发生癌症。浆细胞肿瘤包括多发性骨髓瘤、骨“孤独”骨髓瘤、髓外浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症(包括特发性巨球蛋白血症)、重链病、原发性淀粉样变性、未知意义的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)与免疫球蛋白表达增加相关。非浆细胞肿瘤慢性淋巴细胞性白血病(CLL)也与高水平的免疫球蛋白表达相关。 [0016] 浆细胞骨髓(Myelomasare)肿瘤源自单个克隆，它一般来自次级淋巴组织然后迁移并停留在骨髓组织。骨髓瘤通常影响骨髓和邻近骨结构，有骨痛和病理性骨折或损伤(溶骨性骨损伤)、异常流血、贫血和对感染易感性增加的原发症状。疾病晚期包括肾衰竭、骨骼畸形、脊柱压迫和高钙血症。骨髓瘤通过诱导破骨细胞对骨的再吸收因而毁坏骨结构并增加血浆中钙浓度而影响骨细胞。目前不知道骨髓瘤的病因。由于与放射性损伤的联系，假设了癌基因的突变、家族原因和异常的IL-6表达。
[0017] 多发性骨髓瘤是多个来源的浆细胞瘤。多发性骨髓瘤占几乎10％的所有浆细胞恶性肿瘤，是成人最常见的骨癌症，有每100,000人中3至4个案例的年发病率。在美国，多发性骨髓瘤是在非何杰金氏淋巴瘤之后第二最常见的血液恶性肿瘤，仅在美国就有大约50,000个案例，并且每年大约13,500个新报道案例。诊断有多发性骨髓瘤的患者的预后 前景是残酷的，对于疾病晚期的患者只有几个月至一年。
[0018] 骨髓瘤和多发性骨髓瘤(此后称为“骨髓瘤”)的传统治疗领域由化疗、放射治疗和手术组成。另外，对于另外有健康状况良好的患者推荐骨髓移植。患者的治愈率接近30％，并且是已知能够治疗骨髓瘤的唯一方法。然而，对于年长的或者不能忍受骨髓移植过程的人，化疗最合适。
[0019] 目前诊断过程包括X射线、骨髓穿刺、血和尿检验(以检测本周蛋白的存在)以及红细胞沉降率试验。也鉴别了骨髓瘤浆细胞可能的细胞表面标志，包括CD38、CD9、CD10、HLA-DR和CD20。Ruiz-Arugelles GJ和San Miguel JF，多发性骨髓瘤的细胞表面标志(Cell SurfaceMarkers in Multiple Myeloma)，Mayo Clin.Proc.69：684-90(1994)。
其它非B细胞系标志包括CD2、CD4、CD13、CD14、CD15、CD23、CD24、CD25、CD33、CD39、CDw40、CD41、CD45R、CD54、CD56和CD71以及非簇集抗原R1-3、PCA-1、PCA-2、PC1、62B1、
8A、8F6和MM4。Ruiz-Arugelles，同上；Leo R等，正常和恶性人浆细胞的多参数分析(Multiparameteranalysis of normal and malignant human plasma cells)，Ann.
Hematol.64：132-9(1992)。另外，已知为M蛋白的异常抗体的出现是多发性骨髓瘤的指标。M蛋白产生的增加与多发性骨髓瘤的高粘滞综合症相关联，导致体虚的副反应包括疲劳、头痛、呼吸短促、智力混乱、胸痛、肾损伤和衰竭、视力问题和雷诺氏现象(血循环差，尤其是手指、脚趾、鼻子和耳朵)。当血液中M蛋白寒冷条件下形成颗粒时就会发生冷球蛋白血症。这些颗粒能够阻塞小血管并在寒冷天气造成脚趾、手指和其它末端的疼痛和麻木。也对预后指标例如染色体缺失、β-2微球蛋白水平升高、血清肌酸酐水平和I gA分型(isotyping)进行了研究。Tricot G等，多发性骨髓瘤的不良预后(Poor prognosis in MultipleMyeloma)，Blood 86：4250-2(1995)。
其它非B细胞系标志包括CD2、CD4、CD13、CD14、CD15、CD23、CD24、CD25、CD33、CD39、CDw40、CD41、CD45R、CD54、CD56和CD71以及非簇集抗原R1-3、PCA-1、PCA-2、PC1、62B1、
8A、8F6和MM4。Ruiz-Arugelles，同上；Leo R等，正常和恶性人浆细胞的多参数分析(Multiparameteranalysis of normal and malignant human plasma cells)，Ann.
Hematol.64：132-9(1992)。另外，已知为M蛋白的异常抗体的出现是多发性骨髓瘤的指标。M蛋白产生的增加与多发性骨髓瘤的高粘滞综合症相关联，导致体虚的副反应包括疲劳、头痛、呼吸短促、智力混乱、胸痛、肾损伤和衰竭、视力问题和雷诺氏现象(血循环差，尤其是手指、脚趾、鼻子和耳朵)。当血液中M蛋白寒冷条件下形成颗粒时就会发生冷球蛋白血症。这些颗粒能够阻塞小血管并在寒冷天气造成脚趾、手指和其它末端的疼痛和麻木。也对预后指标例如染色体缺失、β-2微球蛋白水平升高、血清肌酸酐水平和I gA分型(isotyping)进行了研究。Tricot G等，多发性骨髓瘤的不良预后(Poor prognosis in MultipleMyeloma)，Blood 86：4250-2(1995)。
[0020] CS1(SLAMF7，19A；Genbank登录号NM_021181.3，参考文献Boles和Mathew(2001)Immunogenetics 52：302-307；Bouchon等，(2001)J.Immunol.167：5517-5521；Murphy等，(2002)Biochem.J.361：431-436)是免疫球蛋白超家族CD2亚族的一员。CD2家族的分子参与非常广泛的免疫调节功能，例如共激活、增殖分化和淋巴细胞的粘附以及免疫球蛋白分泌、细胞因子的产生和NK细胞的细胞毒性。CD2家族的一些成员例如CD2、CD58和CD150参与了或被认为参与了许多自身免疫和炎性疾病，例如牛皮癣、类风湿性关节炎和多发性硬化症。
[0021] Boles，K等分离和克隆了CS1(也已知为CRACC、19A、APEX-1和FOAP12)(见Immunogenetics 52：302-307(2001))。有报道CS1参与NK细胞介导的细胞毒性和淋巴细胞粘附(Bouchon，A.等，J.ofImmuno.5517-5521(2001)；Murphy，J.等，Biochem.J.361：
431-436(2002))。
431-436(2002))。
[0022] PCT申请PCT/US00/34963公开了抗APEX-1的单克隆抗体及其检测所产生的APEX-1重组细胞外结构域的用途。美国专利申请2003/0113332A1公开了抗天然杀伤细胞表面受体的肽的单克隆抗体，该受体结合于CS1并导致NK细胞的激活。此处完整引入这些申请作为参考。然而，上面参考的发表物中并未开发出和公开能够抑制B细胞产生免疫球蛋白和/或增殖和/或骨髓瘤发展的抗体。而且，上面参考的发表物中也没有开发或公开CS-1在自身免疫疾病或癌症中过度表达的证据。
[0023] 为了改善目前自身免疫和癌症患者包括受IBD、SLE、RA和骨髓瘤折磨的患者的治疗，新的蛋白和化合物在鉴别疾病状态可能的靶点和诊断标志中的作用的阐明是期望的。相应地，此处提供的是这些疾病治疗和诊断的分子靶点，特别是CS1。另外，此处提供的是结合并中和CS1的拮抗剂，包括例如抗CS1抗体的中和抗体。
[0024] 发明概述
[0025] 本发明提供了结合于可被Luc90识别的人CS1表位的抗体或抗原结合片段。Luc90和有相同表位的其它抗体，包括Luc34、Luc69和LucX，能够抑制免疫球蛋白分泌和杀死CS1表达的细胞。
[0026] 本发明也提供结合于可被Luc63识别的人CS1表位的抗体或抗原结合片段。Luc63和有相同表位的其它抗体，包括Luc4、Luc12、Luc23、Luc29、Luc32和Luc37，能够抑制免疫球蛋白分泌和杀死CS1表达的细胞。
[0027] 本发明还提供激发对表达CS1细胞的细胞毒作用或增强免疫细胞介导的细胞毒性的抗体或抗原结合片段，包括ADCC介导的表达CS1细胞的细胞毒性。
[0028] 本发明还提供杀死CS1表达细胞的方法，包含细胞与有效量的抗CS1抗体接触。CS1表达细胞包括例如多发性骨髓瘤的浆细胞癌细胞以及例如慢性淋巴细胞性白血病的非浆细胞癌细胞。CS1表达细胞还包括例如激活的B细胞或T细胞的白细胞以及患SLE和类
风湿性关节炎患者的白细胞。
风湿性关节炎患者的白细胞。
[0029] 本发明还提供治疗患浆细胞癌症、SLE、类风湿性关节炎或炎性肠病的个体的方法。
[0030] 附图简述
[0031] 图例
[0032] 图1A显示SCID-HuPBMC小鼠模型中抗CS1单克隆抗体体内对人IgG产生的抑制。 [0033] 图1B显示SCID-HuPBMC小鼠模型中抗CS1单克隆抗体Luc90和63体内对人IgG产生的抑制的比较。
[0034] 图1C显示SCID-HuPBMC小鼠模型中抗CS1单克隆抗体体内对人IgG产生的抑制的总结。
[0035] 图2显示与同工型对照抗体相比用抗CS1抗体Luc90和Luc63治疗的小鼠移植多发性骨髓瘤模型肿瘤体积减小。
[0036] 图3显示抗CS1抗体Luc63和人源化Luc63体内对OPM-2肿瘤生长的作用。
[0037] 发明详述
[0038] 本发明部分基于我们如下的发现，即血小板、红细胞、内皮细胞(HuVEC)、肾细胞、支气管细胞、小气管细胞、前列腺癌细胞、肝细胞或乳房细胞上未检测到显著的CS1蛋白表达。CS1表达是淋巴结特异性的，并且在患者的细胞可以检测到，包括多发性骨髓瘤和浆细胞白血病患者的浆细胞。表达仅在浆细胞上检测得到，骨髓样本的其它细胞类型中未检测到显著水平。相应地，本发明证明了抗CS1抗体用作癌症治疗的治疗剂的可行性，包括但不限于浆细胞肿瘤，包括骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨“孤独”骨髓瘤、髓外浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症(包括特发性巨球蛋白血症)、重链病、原发性淀粉样变性、未知 意义的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)。另外，与免疫球蛋白的表达增加相关的非浆细胞肿瘤包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)也将从抗CS1治疗中受益。
[0039] 另外，以前的研究没有揭示CS1蛋白在体外PWM(美洲商路有丝分裂原)激活的外+周血B细胞、记忆/效应细胞亚群而不是幼稚外周血B和T淋巴细胞或者在外周血CD14 单核细胞/巨噬细胞上的表达。以前的研究也没有揭示CS1在免疫球蛋白产生中的作用。结果，以前并未建立CS1和自身免疫疾病之间的相关性。本发明也部分基于我们如下的发现，即在负责自身抗体的产生并且相信在自身免疫疾病的发展中有重要作用的细胞亚群激活的外周血B细胞中CS1 RNA和蛋白质的表达显著上调。此外，本发明揭示与年龄配对的健康成人B细胞相比，SLE患者外周血B淋巴细胞以及患IBD的患者中CS1 RNA的表达增加。
本发明揭示CS-1表达于类风湿性关节炎(RA)滑膜中浸润的浆细胞上。本发明也揭示CS1参与抗体产生，以及抗CS1抗体降低了健康成人和狼疮患者B细胞分泌IgM和IgG。随后，本发明的数据提示CS1在自身免疫疾病尤其是SLE、IBD和RA的确定中有重要的作用。与免疫球蛋白、B细胞和/或B细胞产物的增加相关的其它疾病也将从抗CS1治疗中受益，包括冷凝集素病、免疫球蛋白疾病(包括大疱性类天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、线性IgA疾病和表皮溶解性大疱)、混合性冷沉淀球蛋白血症、高丙种球蛋白血症、干燥综合征、自身免疫贫血、哮喘、重症肌无力、多发性硬化症、心肌或心包炎、异位性皮炎、牛皮癣、粘液水肿性苔藓、高歇氏症。
本发明揭示CS-1表达于类风湿性关节炎(RA)滑膜中浸润的浆细胞上。本发明也揭示CS1参与抗体产生，以及抗CS1抗体降低了健康成人和狼疮患者B细胞分泌IgM和IgG。随后，本发明的数据提示CS1在自身免疫疾病尤其是SLE、IBD和RA的确定中有重要的作用。与免疫球蛋白、B细胞和/或B细胞产物的增加相关的其它疾病也将从抗CS1治疗中受益，包括冷凝集素病、免疫球蛋白疾病(包括大疱性类天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、线性IgA疾病和表皮溶解性大疱)、混合性冷沉淀球蛋白血症、高丙种球蛋白血症、干燥综合征、自身免疫贫血、哮喘、重症肌无力、多发性硬化症、心肌或心包炎、异位性皮炎、牛皮癣、粘液水肿性苔藓、高歇氏症。
[0040] 此外，以前没有进行研究以检测使用抗CS1抗体治疗自身免疫疾病和浆细胞癌症的可能性，包括骨髓瘤和浆细胞白血病。理想的治疗抗体应当主要结合于靶细胞。结合于其它细胞和组织能造成对那些细胞核组织的损伤和/或耗尽治疗抗体以至于为了达到期望治疗功效而将过量抗体递送到患者是必需的。更加重要地，结合于血小板的抗体具有副作用，例如，血小板激活(这能导致过度的凝血)或血小板耗竭(这能导致血 液不能凝集)。因此，如果抗体结合于多个细胞和组织特别是如果它结合于血小板，使用抗体作为治疗剂通常是不可行的。本发明部分基于我们如下的发现，即血小板、红细胞、HuVEC、肾细胞、支气管细胞、小气管细胞、前列腺细胞、肝细胞和乳房细胞上没有检测到CS1蛋白的显著表达。
相应地，本发明证明了使用抗CS1抗体作为治疗剂治疗自身免疫疾病和浆细胞癌症包括骨髓瘤和浆细胞白血病的可行性。
相应地，本发明证明了使用抗CS1抗体作为治疗剂治疗自身免疫疾病和浆细胞癌症包括骨髓瘤和浆细胞白血病的可行性。
[0041] 因此本发明涉及结合于CS1的拮抗剂。这种实施方案的示例性实施方案包括中和性抗CS1抗体和抗体片段。抗体中和CS1至少一个生物活性，其中所述抗体结合于CS1并且有下列至少一个活性：(a)抑制淋巴细胞分泌和/或产生免疫球蛋白；以及(b)诱导表达CS1的细胞的裂解。
[0042] 依照上面概述的目的，本发明提供了治疗各种疾病的新方法，例如自身免疫紊乱和各种确定的癌性疾病，包括各种形式的骨髓瘤。还提供的是诊断和预后评价这样的紊乱的方法以及筛选调节这样的疾病的组合物的方法。本发明也提供了监测这样的治疗的治疗功效，包括选择性表达于上述紊乱中的标记物的监测和筛选。
[0043] 特别是选择性表达于自身免疫紊乱例如SLE、RA和IBD以及癌性疾病例如骨髓瘤和浆细胞白血病中的标记物的鉴别允许那样的表达应用于诊断、预后或治疗方法。像这样，本发明定义了各种组合物，例如核酸、多肽、抗体和小分子激动剂/拮抗剂，这些对于选择性鉴别那些标记物是有用的。标记物对于疾病亚型的分子特征分析是有用的，所述亚型实际上需要非常不同的治疗。此外，标记物在与自身免疫紊乱相关的疾病、骨髓瘤和浆细胞白血病也是重要的，例如这些疾病影响这样的疾病中相似的组织或者具有诱导/维持的相似机制。例如，也可以靶向肿瘤过程或特征。诊断和预后用途可以用于例如分型相关但截然不同的疾病，区分自身免疫紊乱骨髓瘤或浆细胞白血病不同阶段或者确定这样疾 病的治疗策略。检测方法可以基于核酸，例如PCR或杂交技术，或者蛋白质，例如ELISA、成像、IHC等。诊断可以是定性或定量的，并可以检测表达水平的增加或降低。
[0044] 定义
[0045] 术语“CS1蛋白质”或“CS1多聚核苷酸”或“CS1相关转录物”指的是核酸和多肽多态性变异物、等位基因、突变体和种间类似物，它们(1)优选地在超过至少大约25、50、100、200、500、1000或更多个核苷酸的区域内，与CS1基因的或者CS1基因相关的核苷酸序列，具有高于大约60％核苷酸序列相同性，65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地大约92％、
94％、96％、97％、98％或99％或更高核苷酸序列相同性(表2)，CS1基因(表2)与结合伴侣及其保守性修饰的变异物的结合，例如抗包含CS1基因的或与CS1基因相关的核苷酸序列编码的氨基酸序列的免疫原的多克隆抗体；(3)在严格杂交条件下特异性杂交于CS1的核酸序列或其互补物(表2)及其保守修饰的变异物；或者(4)在优选地至少大约25、50、100、
200、500、1000或更多核苷酸的区域内，与CS1基因的或CS1基因相关的核苷酸序列编码的氨基酸序列(表2)具有高于大约60％氨基酸序列相同性、65％、70％、75％、80％、85％、优选地90％、91％、93％、95％、97％、98％或99％或更高核苷酸序列相同性的氨基酸序列。多聚核苷酸或多肽序列一般来自哺乳动物，包括但不限于灵长类例如人；啮齿类例如大鼠、小鼠、仓鼠；奶牛、马、绵羊或其它动物。“CS1多肽”和“CS1多聚核苷酸”包括天然存在或重组的形式。
94％、96％、97％、98％或99％或更高核苷酸序列相同性(表2)，CS1基因(表2)与结合伴侣及其保守性修饰的变异物的结合，例如抗包含CS1基因的或与CS1基因相关的核苷酸序列编码的氨基酸序列的免疫原的多克隆抗体；(3)在严格杂交条件下特异性杂交于CS1的核酸序列或其互补物(表2)及其保守修饰的变异物；或者(4)在优选地至少大约25、50、100、
200、500、1000或更多核苷酸的区域内，与CS1基因的或CS1基因相关的核苷酸序列编码的氨基酸序列(表2)具有高于大约60％氨基酸序列相同性、65％、70％、75％、80％、85％、优选地90％、91％、93％、95％、97％、98％或99％或更高核苷酸序列相同性的氨基酸序列。多聚核苷酸或多肽序列一般来自哺乳动物，包括但不限于灵长类例如人；啮齿类例如大鼠、小鼠、仓鼠；奶牛、马、绵羊或其它动物。“CS1多肽”和“CS1多聚核苷酸”包括天然存在或重组的形式。
[0046] 表2
[0047] SEQ ID NO：1
[0048] PDL primekey：433671 DNA序列
[0049] 核酸登录号：NM_021181
[0050] GI：19923571|ref|NM_021181.3|人SLAM家族成员7(SLAMF7)，mRNA
[0051] 1 cttccagaga gcaatatggc tggttcccca acatgcctca ccctcatcta tatcctttgg [0052] 61 cagctcacag ggtcagcagc ctctggaccc gtgaaagagc tggtcggttc cgttggtggg [0053] 121 gccgtgactt tccccctgaa gtccaaagta aagcaagttg actctattgt ctggaccttc [0054] 181 aacacaaccc ctcttgtcac catacagcca gaagggggca ctatcatagt gacccaaaat [0055] 241 cgtaataggg agagagtaga cttcccagat ggaggctact ccctgaagct cagcaaactg [0056] 301 aagaagaatg actcagggat ctactatgtg gggatataca gctcatcact ccagcagccc [0057] 361 tccacccagg agtacgtgct gcatgtctac gagcacctgt caaagcctaa agtcaccatg [0058] 421 ggtctgcaga gcaataagaa tggcacctgt gtgaccaatc tgacatgctg catggaacat [0059] 481 ggggaagagg atgtgattta tacctggaag gccctggggc aagcagccaa tgagtcccat [0060] 541 aatgggtcca tcctccccat ctcctggaga tggggagaaa gtgatatgac cttcatctgc [0061] 601 gttgccagga accctgtcag cagaaacttc tcaagcccca tccttgccag gaagctctgt [0062] 661 gaaggtgctg ctgatgaccc agattcctcc atggtcctcc tgtgtctcct gttggtgccc [0063] 721 ctcctgctca gtctctttgt actggggcta tttctttggt ttctgaagag agagagacaa [0064] 781 gaagagtaca ttgaagagaa gaagagagtg gacatttgtc gggaaactcc taacatatgc [0065] 841 ccccattctg gagagaacac agagtacgac acaatccctc acactaatag aacaatccta [0066] 901 aaggaagatc cagcaaatac ggtttactcc actgtggaaa taccgaaaaa gatggaaaat [0067] 961 ccccactcac tgctcacgat gccagacaca ccaaggctat ttgcctatga gaatgttatc [0068] 1021 tagacagcag tgcactcccc taagtctctg ctcaaaaaaa aaacaattct cggcccaaag [0069] 1081 aaaacaatca gaagaattca ctgatttgac tagaaacatc aaggaagaat gaagaacgtt [0070] 1141 gacttttttc caggataaat tatctctgat gcttctttag atttaagagt tcataattcc [0071] 1201 atccactgct gagaaatctc ctcaaaccca gaaggtttaa tcacttcatc ccaaaaatgg [0072] 1261 gattgtgaat gtcagcaaac cataaaaaaa gtgcttagaa gtattcctat agaaatgtaa [0073] 1321 atgcaaggtc acacatatta atgacagcct gttgtattaa tgatggctcc aggtcagtgt [0074] 1381 ctggagtttc attccatccc agggcttgga tgtaaggatt ataccaagag tcttgctacc [0075] 1441 aggagggcaa gaagaccaaa acagacagac aagtccagca gaagcagatg cacctgacaa [0076] 1501 aaatggatgt attaattggc tctataaact atgtgcccag cactatgctg agcttacact [0077] 1561 aattggtcag acgtgctgtc tgccctcatg aaattggctc caaatgaatg aactactttc [0078] 1621 atgagcagtt gtagcaggcc tgaccacaga ttcccagagg gccaggtgtg gatccacagg [0079] 1681 acttgaaggt caaagttcac aaagatgaag aatcagggta gctgaccatg tttggcagat [0080] 1741 actataatgg agacacagaa gtgtgcatgg cccaaggaca aggacctcca gccaggcttc [0081] 1801 atttatgcac ttgtgctgca aaagaaaagt ctaggtttta aggctgtgcc agaacccatc [0082] 1861 ccaataaaga gaccgagtct gaagtcacat tgtaaatcta gtgtaggaga cttggagtca [0083] 1921 ggcagtgaga ctggtggggc acggggggca gtgggtactt gtaaaccttt aaagatggtt [0084] 1981 aattcattca atagatattt attaagaacc tatgcggccc ggcatggtgg ctcacacctg [0085] 2041 taatcccagc actttgggag gccaaggtgg gtgggtcatc tgaggtcagg agttcaagac [0086] 2101 cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctactaaaga tacaaaaatt tgctgagcgt [0087] 2161 ggtggtgtgc acctgtaatc ccagctactc gagaggccaa ggcatgagaa tcgcttgaac [0088] 2221 ctgggaggtg gaggttgcag tgagctgaga tggcaccact gcactccggc ctaggcaacg [0089] 2281 agagcaaaac tccaatacaa acaaacaaac aaacacctgt gctaggtcag tctggcacgt [0090] 2341 aagatgaaca tccctaccaa cacagagctc accatctctt atacttaagt gaaaaacatg [0091] 2401 gggaagggga aaggggaatg gctgcttttg atatgttccc tgacacatat cttgaatgga [0092] 2461 gacctcccta ccaagtgatg aaagtgttga aaaacttaat aacaaatgct tgttgggcaa [0093] 2521 gaatgggatt gaggattatc ttctctcaga aaggcattgt gaaggaattg agccagatct [0094] 2581 ctctccctac tgcaaaaccc tattgtagta aaaaagtctt ctttactatc ttaataaaac [0095] 2641 agatattgtg agattcaaaa aaaaaaaaaa aa
[0096] SEQ ID NO：2
[0097] 氨基酸序列-CS1
[0098] GI：19923571|ref|NM_021181.3|人SLAM家族成员7(SLAMF7)
[0099] MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPLVTIQPEGG [0100] TIIVTQNRNRERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEYVLHVYEHLSKPKVTMG [0101] LQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAANESHNGSILPISWRWGESDMTFICVARNPVSRN [0102] FSSPILARKLCEGAADDPDSSMVLLCLLLVPLLLSLFVLGLFLWFLKRERQEEYIEEKKRVDICRETP [0103] NICPHSGENTEYDTIPHTNRTILKEDPANTVYSTVEIPKKMENPHSLLTMPDTPRLFAYENVI
[0104] “全长”CS1蛋白质或核酸指的是CS1多肽或多聚核苷酸序列或其变异物，它含有通常含有一个或多个天然存在的野生型CS1多聚核苷酸或多肽序列的元件。“全长”可以在翻译后处理或剪接包括可选择剪接的各个阶段之前或之后。
[0105] 如此处使用的“生物样本”是含有例如CS1蛋白质的核酸或多肽、多聚核苷酸或转录物的生物组织或液体的样品。这样的样品包括但不限于从灵长类例如人或啮齿类例如小鼠和大鼠分离的组织。生物样品也包括组织切片例如活检和尸检样品，为组织学目的采集的冰冻切片，归档样品、血液、血浆、血清、唾液、粪便、泪液、粘膜、头发、皮肤等。生物样品也包括源自患者组织的移植体和原发和/或转化细胞的培养物。生物样品一般得自真核生物，最优选地哺乳动物例如灵长类，例如 黑猩猩或人；奶牛；狗；猫；啮齿动物例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟；爬虫动物；或鱼。家畜和家养动物是兴趣所在。
[0106] “提供生物样品”指的是获得生物样品以用于本发明中描述的方法。最经常地，这将通过从动物获取细胞样品完成，也能通过使用以前分离的细胞完成(例如，通过另一个人在另外的时间和/或为了另一个目的分离的)或者通过体内进行本发明的方法。具有治疗或结果历史的归档组织或材料将特别有用。
[0107] 术语“相同的”或百分比“相同性”在两个或以上核酸或多肽序列的上下文中指的是如使用例如有下面描述的默认参数的BLAST或BLAST2.0序列比较运算或通过人工比对和目检测量地相同的或者具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同的两个或以上的序列(例如，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大一致性时，在特定区域大约70％相同性，优选地75％、80％、85％、90％、91％、93％、95％、97％、98％、99％或更高相同性)。这样的序列被称为“基本相同的”。该定义也指的是或者可以应用于测试序列的互补物。该定义也包括具有缺失和/或插入、替代的序列以及天然发生的例如多态或等位基因变异体和人造变异体。如下面描述地，优选的运算能计算缺口等等。优选地，相同性存在于长度至少大约25个氨基酸或核苷酸的区域或者更加优选地在长度大约50-100个氨基酸或核苷酸的区域。
[0108] 对于序列比较，一般第一个序列作为测试序列与之比较的参照序列。当时用序列比较运算时，将测试和参照序列输入计算机，如果需要，指定子序列相配物(subsequence coordinates)，并且指定序列运算程序参数。优选地，能使用默认程序参数，或者能指定可选的参数。然后序列比较运算基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列相同百分比。
[0109] 如此处使用地，“比较窗”包括涉及一般选自从大约20至600个，通常大约50至200个，更加通常地大约100至150个连续位置的片段，其中当两个序列最佳比对后，序列与相同数量连续位置的参考序列进行比较。为了比较序列比对的方法是已知的。为了比较能够进行序列的最佳比对，例如通过Smith和Waterman的局部同源性运算(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489，通过Needleman和Wunsch的同源比对运算(1970)J.Mol.Biol.48：
443-453，通过Pearson和Lipman的寻找相似法(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：
2444-2448，通过这些运算的计算机化实施(Winsconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者通过人工比对和目检(见，例如Ausubel等(1995年版以及附录)当代分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology Wiley))。
443-453，通过Pearson和Lipman的寻找相似法(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：
2444-2448，通过这些运算的计算机化实施(Winsconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者通过人工比对和目检(见，例如Ausubel等(1995年版以及附录)当代分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology Wiley))。
[0110] 适于测定序列相同和序列相似百分比的运算的优选实例包括BLAST和BLAST2.0运算，这在Altschul等(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中有描述。使用BLAST和BLAST2.0和此处描述的参数来测定本发明的核酸和蛋白质的序列相同百分比。通过国家生物工程信息中心可以公开使用进行BLAST分析的软件。该运算包括通过鉴别查询序列中W长度的短词首先鉴别高得分的序列配对(HSP)，它匹配或满足一些为正数的域值分数T。T指的是邻近词分数域值(Altschul等.，同上)。这些命中的最初邻近词(hits)作为种子开始搜索以发现含有它们的更长的HSP。命中的词沿着每个序列往两个方向延伸直到累计比对分数能够增加。例如对于核苷酸序列，使用参数M(一对配对残基的奖励分数；永远＞0)和N(未配对残基的惩罚分数；永远＜0)计算累计分数。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累计分数。当累计比对分数从其最大获得值降低X的数量时，当由于一个或多个负得分残基比对的积累累计分数为0或低于
0时，或当达到任一序列末端时，命中的词向每个方向的延伸就停止。BLAST运算的参数W、T和X确定了比对的敏感性和速度。(对于核苷酸 序列)BLASTN程序使用词长度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和双链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用词长度3、期望值(E)10，BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-919)使用比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和双链的比较作为默认值。
0时，或当达到任一序列末端时，命中的词向每个方向的延伸就停止。BLAST运算的参数W、T和X确定了比对的敏感性和速度。(对于核苷酸 序列)BLASTN程序使用词长度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和双链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用词长度3、期望值(E)10，BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-919)使用比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和双链的比较作为默认值。
[0111] BLAST运算也进行两个序列之间相似性的统计分析。见，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787。BLAST运算提供的一个相似性的测量是最小总和概率(P(N))，它提供了概率的指标，由此两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生。例如，如果测试核酸和参考核酸的比较中最小总和概率小于大约
0.2，更加优选地小于大约0.01，最有选的少于大约0.001，就认为核酸相似于参考序列。对数值可以是很大的负数，例如5、10、20、30、40、70、90、110、150、170等。
0.2，更加优选地小于大约0.01，最有选的少于大约0.001，就认为核酸相似于参考序列。对数值可以是很大的负数，例如5、10、20、30、40、70、90、110、150、170等。
[0112] 两个核酸序列基本相同的指标是第一个核酸编码的多肽与抗第二个核酸编码的多肽的抗体有免疫学交叉反应性。因而，例如当两个肽仅仅有保守取代的不同时，多肽一般基本上相同于第二个多肽。两个核酸序列基本上相同的另一个指标是两个分子或它们的互补物在严格条件下相互杂交。然而两个核酸序列基本上相同的另一个指标是相同的引物能用于扩增这些序列。
[0113] “宿主细胞”是含有表达载体并支持表达载体复制或表达的天然存在的细胞或转化细胞。宿主细胞可以是培养的细胞、移植体、细胞体内等等。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌，或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞例如CHO、HeLa、骨髓瘤等等(见，例如美国典型培养物保藏中心的目录或网站)。
[0114] 术语“分离的”“纯化的”或“生物纯的”指的是基本上或一般没 有在其天然状态下发现的通常伴随的组分。一般使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高相液相色谱确定纯度和均质性(homogeneity)。为制备物中存在的主要种类的蛋白质或核酸基本上是纯化的。特别是，分离的核酸从一些开放阅读框分离出来，这些开放阅读框天然地在基因两侧并编码除了所述基因编码的蛋白质以外的蛋白质。一些实施方案中的术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上给出一条条带。优选地，它指的是核酸或蛋白质至少大约85％是纯化的，更加优选地至少95％是纯化的以及最优选地至少99％是纯化的。其它实施方案中的“进行纯化”或“纯化”指的是从待纯化的组合物中去除至少一种杂质或者组分。这个意义上，纯化不能要求纯化的化合物是均质的，例如100％纯化的。
[0115] 此处交替使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指的是氨基酸残基的聚合物。术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物，它们含有修饰的残基和非天然存在的氨基酸聚合物。 [0116] 术语“氨基酸”指的是天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和与天然存在的氨基酸功能相似的氨基酸模仿物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然存在的氨基酸相同基本化学结构的化合物，例如结合于氢的α碳、羧基基团、氨基基团和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是与天然存在的氨基酸一样保留了一些基本化学结构。氨基酸模仿物指的是具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是与另一个氨基酸功能相似的化合物。
[0117] 此处氨基酸可以通过它们普遍已知的三个字母符号或通过IUPAC-IUB化学术语委员会推荐的一个字母符号来表示。同样核酸可以 通过它们普遍接受的一个字母代码来表示。
[0118] “保守修饰的变异物”应用于氨基酸和核酸序列。关于特别的核酸序列，保守修饰变异物指的是编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列时，指的是基本上相同或相关的序列，例如天然连续的序列。由于遗传密码的简并性，许许多多功能相同的核酸编码大多数蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU每一个都编码氨基酸丙氨酸。因而，在由密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子能够被改变成所述的另外一个相应的密码子而没有改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，它是一种类型的保守修饰变异。此处编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的沉默变异。在某些上下文中，能够修饰核酸中的每一个密码子(除了通常是蛋氨酸唯一密码子的AUG，以及通常是色氨酸唯一密码子的TGG)以得到功能相似的分子。相应地，就表达产物而没有必要就实际的探针序列而言，在所述序列中暗含了编码多肽的核酸的沉默变异。
[0119] 至于氨基酸序列，技术人员将认识到改变、添加或删除了编码序列中单个氨基酸或很小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列的每个替代、删除或添加是“保守修饰的变异体”，这里所述的改变导致了氨基酸被取代为化学相似氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代表是众所周知的。这样的保守修饰变异物是另外的，并不排除本发明的多态变异体、种间同源物和等位基因。一般保守取代包括彼此：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，撷氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(见，例如，Creighton(1984)蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structure and Molecular Properties)Freeman)。 [0120] 就各个水平的组织而言，能够描述大分子结构例如多肽结构。对于这个组织
的一般讨论，见例如Alberts等(2001年版)细胞的分子生物学(Molecular Biology
of the Cell)(第四版)Garland；以及Cantor和Schimmel(1980)生物物理化学第
一部分：生物大分子的构象(Biophysical Chemistry Part I：The Conformation of BiologicalMacromolecules)Freeman。“初级结构”指的是特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指的是多肽内局部有序的三维结构。这些结构普遍已知为结构域。结构域是多肽的一部分，通常形成多肽的紧密结构，一般25至大约500个氨基酸长。一般的结构域由更少组织的部分构成，例如β折叠和α-螺旋的伸展。“三级结构”指的是多肽单体完整的三维结构。“四级结构”指的是通常通过独立三级单位非共价联合形成的三维结构。各向异性术语也已知为能量术语。
的一般讨论，见例如Alberts等(2001年版)细胞的分子生物学(Molecular Biology
of the Cell)(第四版)Garland；以及Cantor和Schimmel(1980)生物物理化学第
一部分：生物大分子的构象(Biophysical Chemistry Part I：The Conformation of BiologicalMacromolecules)Freeman。“初级结构”指的是特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指的是多肽内局部有序的三维结构。这些结构普遍已知为结构域。结构域是多肽的一部分，通常形成多肽的紧密结构，一般25至大约500个氨基酸长。一般的结构域由更少组织的部分构成，例如β折叠和α-螺旋的伸展。“三级结构”指的是多肽单体完整的三维结构。“四级结构”指的是通常通过独立三级单位非共价联合形成的三维结构。各向异性术语也已知为能量术语。
[0121] 此处使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多聚核苷酸”或者语法等同物指的是至少两个核苷酸共价连接在一起。寡核苷酸长度一般大约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸，长度最多大约100个核苷酸。核酸和多聚核苷酸是任何长度的聚合物，包括更长的长度，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000个等。本发明的核酸将一般含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括具有至少一种不同连接例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酸酯连接的核酸类似物(见Eckstein(1992)寡核苷酸和类似物：实用方法(Oligonucleotides and Analogues：A PracticalApproach)牛津大学出版社)；以及肽核酸骨架和连接。其它类似核酸包括有正性骨架；非离子骨架和非核糖骨架的那些，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及Sanghvi和Cook(1994年版)碳水化合物修饰，反义研究ACS研讨会系列580(Carbohydrate Modifications
inAntisense Research ACS Symposium Series 580)中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义之内。为了各种原因可以进行核糖磷酸骨架的修饰，例如为了增加这样的分子在生理环境 下或者作为生物芯片上的探针的稳定性和半衰期。能够制成天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，制成不同核酸类似物的混合物以及天然存在的核酸和类似物的混合物。
inAntisense Research ACS Symposium Series 580)中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义之内。为了各种原因可以进行核糖磷酸骨架的修饰，例如为了增加这样的分子在生理环境 下或者作为生物芯片上的探针的稳定性和半衰期。能够制成天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，制成不同核酸类似物的混合物以及天然存在的核酸和类似物的混合物。
[0122] 各种参考文献中公开了这样的核酸类似物，包括例如氨基磷酸酯(Beaucage等(1993)Tetrahedron 49：1925-1963以及此处的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.
Chem.35：3800-3803；Sprinzl等(1977)Eur.J.Biochem.81：579-589；Letsinger等(1986)Nucl.Acids Res.14：3487-499；Sawai 等 (1984)Chem.Lett.805，Letsinger 等 (1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470-4471以及Pauwels等(1986)ChemicaScripta 26：141-149)、硫代磷酸酯(Mag等(1991)Nucleic Acids Res.19：1437-441以及美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(Brill等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321-2322)、O-甲基亚磷酸酯连接(见Eckstein(1992)寡核苷酸和类似物：实用方法(Oligonucleotides andAnalogues：A Practical Approach)，牛津出版社)以及肽核酸骨架和连接(见Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895-1897；Meier 等 (1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008-1010；Nielsen(1993)Nature 365：566-568；Carlsson等(1996)Nature 380：207，所有这些引入作为参考)。其它类似核酸包括有正性骨架(Denpcy等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097-101；
非离子骨架(美国专利号5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141，和4,469,863；
Kiedrowski 等 (1991)Angew.Chem.Intl.Ed.English 30：423-426；Letsinger 等 (1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470-4471；Letsinger，等(1994)Nucleoside and Nucleotide 13：
1597；Sanghvi和Cook第2和3章(1994年版)碳水化合物修饰，反义研究ACS研讨会系
列580；Mesmaeker等(1994)Bioorganic and Medicinal Chem.Lett.4：395-398；Jeffs等(1994)J.Biomolecular NMR 34：17；Horn等(1996)Tetrahedron Lett.37：743))以及非核糖骨架，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及Sanghvi和Cook(1994年版)反义
研究 ACS研讨会系列580。含有一个或多个碳环糖类的核酸也包括在核酸的一个定义之内(见Jenkins，等(1995)Chem.Soc.Rev.pp 169-176).Rawls中描述了一些核酸类似物(35页，June2，1997)C&E News。
Chem.35：3800-3803；Sprinzl等(1977)Eur.J.Biochem.81：579-589；Letsinger等(1986)Nucl.Acids Res.14：3487-499；Sawai 等 (1984)Chem.Lett.805，Letsinger 等 (1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470-4471以及Pauwels等(1986)ChemicaScripta 26：141-149)、硫代磷酸酯(Mag等(1991)Nucleic Acids Res.19：1437-441以及美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(Brill等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321-2322)、O-甲基亚磷酸酯连接(见Eckstein(1992)寡核苷酸和类似物：实用方法(Oligonucleotides andAnalogues：A Practical Approach)，牛津出版社)以及肽核酸骨架和连接(见Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895-1897；Meier 等 (1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008-1010；Nielsen(1993)Nature 365：566-568；Carlsson等(1996)Nature 380：207，所有这些引入作为参考)。其它类似核酸包括有正性骨架(Denpcy等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097-101；
非离子骨架(美国专利号5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141，和4,469,863；
Kiedrowski 等 (1991)Angew.Chem.Intl.Ed.English 30：423-426；Letsinger 等 (1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470-4471；Letsinger，等(1994)Nucleoside and Nucleotide 13：
1597；Sanghvi和Cook第2和3章(1994年版)碳水化合物修饰，反义研究ACS研讨会系
列580；Mesmaeker等(1994)Bioorganic and Medicinal Chem.Lett.4：395-398；Jeffs等(1994)J.Biomolecular NMR 34：17；Horn等(1996)Tetrahedron Lett.37：743))以及非核糖骨架，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及Sanghvi和Cook(1994年版)反义
研究 ACS研讨会系列580。含有一个或多个碳环糖类的核酸也包括在核酸的一个定义之内(见Jenkins，等(1995)Chem.Soc.Rev.pp 169-176).Rawls中描述了一些核酸类似物(35页，June2，1997)C&E News。
[0123] 特别优选的是肽核酸(PNA)，包括肽核酸类似物。肽核酸具有肽键连接的重复N-(2-氨乙基)甘氨酸单位形成的骨架。不同的碱基(嘌呤和嘧啶)通过亚甲基羰基连接连接到骨架上。这些骨架在中性条件下基本上是非离子的，与天然存在的核酸带高电荷的磷酸二酯骨架相反。这至少有两个优点。RNA骨架展现了改善的杂交动力学，导致PNA/DNA链之间比PNA链和DNA链之间更强的结合。与完全配对的碱基对相比，对于错配碱基对PNA的融化温度(Tm)具有更大的变化。一般对于内部错配，DNA和RNA Tm下降2-4℃。对于非离子RNA骨架，下降更接近7-9℃。相似地，由于它们非离子性质，附着于这些骨架的碱基的杂交相对对盐浓度不敏感。另外，PNA不被细胞酶降解，因而更加稳定。
[0124] 如指定地，核酸可以是单链或双链，或者含有部分双链或单链序列。单链的叙述也定义了互补链的序列；因而此处描述的序列也提供了序列的互补物。核酸可以是基因组和cDNA的DNA、RNA或杂交体，这里核酸含有脱氧核糖和核糖核苷酸的联合，以及碱基的联合包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘧啶等等。“转录物”一般指的是天然存在的RNA，例如前mRNA、hnRNA或mRNA。如此处使用地，术语“核苷”包括核苷酸和核苷和核苷酸类似物，以及修饰的核苷例如氨基修饰的核苷。另外，“核苷”包括非天然存在的类似物结构。因而，每一个含有碱基的例如肽核酸的各个单位，此处被称为核苷。
[0125] “标记”或“可检测的基团”是通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、生理、化学或其它物理手段可检测的组合物。一般，标记分为三类：a)同位素标记，可以是放射性或重同位素；b)免疫标记，可以 是抗体、抗原或表位标签(epitope tag)；以及c)有颜色的或荧光染料。标记可以合并进CS1核酸、蛋白质和抗体。例如，标记应当能够直接或间接产生可3 14 32 35 125
检测的信号。可检测基团可以是放射性同位素，例如 H、 C、P、S或 I、电子致密试剂、荧光或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素，或者酶(例如如ELISA中普遍使用的)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原以及蛋白质或其它被制成可检测的基团例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。将抗体结合到标记的方法是已知的。见，例如Hunter等(1962)Nature144：945；David等(1974)Biochemistry 13：1014-1021；Pain等(1981)J.Immunol.Meth.40：219-230以及Nygren(1982)J.Histochem.and Cytochem.30：
407-412。
检测的信号。可检测基团可以是放射性同位素，例如 H、 C、P、S或 I、电子致密试剂、荧光或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素，或者酶(例如如ELISA中普遍使用的)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原以及蛋白质或其它被制成可检测的基团例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。将抗体结合到标记的方法是已知的。见，例如Hunter等(1962)Nature144：945；David等(1974)Biochemistry 13：1014-1021；Pain等(1981)J.Immunol.Meth.40：219-230以及Nygren(1982)J.Histochem.and Cytochem.30：
407-412。
[0126] “效应物”或“效应基团”或“效应组分”是通过连接子或化学键共价地或通过离子、范德华、静电或氢键非共价地结合于抗体的分子。“效应物”能够是各种分子，包括例如包括放射性化合物的检测基团、荧光化合物、酶或底物、例如表位标签的标签、毒素；可激活的基团、化学治疗剂；脂肪酶；抗生素；化学引诱基团、免疫调节剂(micA/B)或放射性同位素，例如放射“硬”β放射线、辐射。
[0127] “标记的核酸探针或寡核苷酸”是例如通过连接子或化学键共价地或者通过离子、范德华、静电或氢键非共价地结合于标记，使得探针的存在可以通过检测结合于探针的标记的存在进行检测。或者，使用高亲和相互作用的方法可以得到相同的结果，这里一对结合伴侣的一个结合于另一个，例如生物素、链霉抗生物素。
[0128] 如此处使用地，“核酸探针或寡核苷酸”是通过一个或多个类型的化学键，通常通过互补碱基配对，例如通过氢键的形成能够结合于靶核酸互补序列的核酸。如此处使用地，探针包括天然的(例如，A、G、C或T)或修饰的碱基(7-去氮杂鸟苷、次黄嘌呤核苷等等)。另外，探 针中的碱基可以通过除了磷酸二酯键以外的连接相连，优选功能上不干扰杂交的连接。因而，例如探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯连接相连。依赖于杂交条件的严格性，探针可以结合于与探针序列没有完全互补的靶序列。探针优选地是直接标记的，例如用同位素、发色团、发光团(lumiphores)、色原体(chromogens)标记的，或者例如用之后抗生物素蛋白链菌素可以结合的生物素间接标记的。通过测试探针的存在或不存在，能够检测选择的序列或亚序列的存在或不存在。诊断或预后可以基于基因组水平，或者在RNA或蛋白质表达水平。
[0129] 当指细胞或核酸、蛋白质或载体术语“重组的”表明细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过外源核酸或蛋白质的引入或者天然核酸或蛋白质的改变进行修饰，或者细胞来源于这样修饰的细胞。因而，例如重组的细胞表达在天然形式的(非重组)细胞中没有发现的基因，或表达天然的基因然而却异常表达、低表达或根本就不表达。此处通过术语“重组核酸”是指最初体外形成，一般例如使用聚合酶和核酸内切酶处理核酸而通常在自然界找不到的形式的核酸。以这样的方式，完成了不同序列有效地连接。因而，为了本发明的目的，线性形式的分离的核酸或通过连接通常没有连在一起的DNA分子而形成的表达载体都被认为是重组的。可以理解一旦制造了重组核酸并引入宿主细胞或生物体，它将例如使用宿主细胞体内的细胞机器而不是体外的操作进行非重组性地复制；然而，为了本发明的目的，这样的核酸一旦重组性地产生，虽然随后进行非重组性地复制，将仍然被认为是重组的。 [0130] 相似地，“重组蛋白质”是使用重组技术制造的蛋白质，例如通过上面描述的重组核酸的表达。重组蛋白质有至少一个或多个特征而与天然存在的蛋白质截然不同。蛋白质可以从通常在其野生宿主中相关的一些或多数蛋白质和化合物中分离或纯化，因而是基本纯化的。分离的蛋白质至少没有在其天然状态下通常相关的一些材料，优选地构成了至少 大约0.5％，更加优选地构成给定样本中至少大约5％给定样品中总蛋白质重量。基本纯化的蛋白质包含至少大约75％总蛋白质重量，至少大约80％是优选的，至少大约90％是特别优选的。这个定义包括一个生物体的CS1蛋白在不同的生物体或宿主细胞中的产生。或者，通过诱导性启动子或高表达启动子的使用可以制造显著高于正常可见的浓度的蛋白质，使得蛋白质制造的浓度水平增加。或者，蛋白质呈现通常在自然界没有发现的形式，比如如下面讨论的表位标签的添加或氨基酸的取代、插入和删除。
[0131] 当指核酸的部分时，术语“异源的”表示核酸包含两个或两个以上在自然界通常没有发现互相之间有相同关系的序列。例如，核酸一般是例如从非相关基因经安排制造出一个新的功能核酸而重组产生的，具有两个或两个以上的序列，例如一个来源的启动子和另一个来源的编码区域。相似的，异源蛋白质将通常指的是自然界没有发现互相之间有相同关系的两个或两个以上序列(例如，融合蛋白)。
[0132] “启动子”一般是指导核酸转录的核酸控制序列的排列(array)。如此处使用地，启动子包括接近转录起始位点的必需核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子的情况下TATA元件。启动子可选地也包括远端增强子或抑制子元件，它们能够位于远离转录起始位点几千个碱基对。“组成型”启动子是在多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子在环境或发育调节下是有活性的。术语“有效(operably)连接的”指的是核酸表达控制序列(例如启动子或转录因子结合位点的排列)和第二个核酸序列功能性的连接，例如其中表达控制序列指导相应于第二个序列的核酸的转录。
[0133] “表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，有允许宿主细胞中特定核酸转录的一系列指定核酸元件。表达载体是质粒、病毒或核酸片段的一部分。一般地，表达载体包括有效连接于启动子而被转录的核酸。
[0134] 短语“选择性(或特异性)杂交于”指的是当特定核苷酸序列存在于复合混合物(例如，总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子选择性地结合于该序列、与该序列形成双体或或杂交于该序列。
[0135] 短语“严格杂交条件”指的是探针将杂交于一般在核酸的复合混合物中的其靶序列而不是其它序列的条件。严格条件是序列依赖的，在不同环境下将不同。更长的序列在更高温度下特异性杂交。Tijssen(1993)核酸杂交(生物化学和分子生物学的实验室技术)(24卷)Elsevier中的“杂交原则概述和核酸试验策略”找到核酸杂交的详细指南。一般，在定义的离子强度pH选择严格杂交条件比特定序列的热融化点(Tm)低大约5-10℃。Tm是(在定义的离子强度、pH和核酸浓度)在平衡时50％互补于靶点的探针杂交于靶序列的温度(因为靶序列过量存在，在Tm，平衡时有50％探针被占据)。严格条件将是pH7.0至
8.3时盐浓度低于大约1.0M钠离子的那些，一般大约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例如大约10-50个核苷酸)温度是至少大约30℃，对于长探针(例如，长于大约50个核苷酸)。严格条件也可以通过去稳定剂例如甲酰胺的加入获得。对于选择性或特异性杂交，正性信号一般至少是背景的两倍，优选地10倍背景的杂交。实例性严格杂交条件如下：50％甲酰胺，5x SSC，和1％SDS，在42℃孵育，或者5x SSC，1％SDS，65℃孵育，用0.2x SSC清洗，和0.1％SDS在65℃孵育。对于PCR，对于低严格扩增大约36℃的温度是一般的，虽然高严格退火温度依赖于引物长度和特意性在大约32-48℃之间而有所不同。
对于高严格PCR扩增，大约62℃的温度是一般的，虽然高严格退火温度依赖于引物的长度和特异性范围可以从大约50-65℃。高和低严格扩增的一般循环条件都包括90-95℃的变性阶段30-120秒，退火阶段维持30-12-秒，大约72℃延伸阶段1-2分钟。例如Innis等
(1990)PCR试验方案：方法和应用指南，Academic Press，NY中提供了低和高严格扩增反应的试 验方案和指导方针。
8.3时盐浓度低于大约1.0M钠离子的那些，一般大约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例如大约10-50个核苷酸)温度是至少大约30℃，对于长探针(例如，长于大约50个核苷酸)。严格条件也可以通过去稳定剂例如甲酰胺的加入获得。对于选择性或特异性杂交，正性信号一般至少是背景的两倍，优选地10倍背景的杂交。实例性严格杂交条件如下：50％甲酰胺，5x SSC，和1％SDS，在42℃孵育，或者5x SSC，1％SDS，65℃孵育，用0.2x SSC清洗，和0.1％SDS在65℃孵育。对于PCR，对于低严格扩增大约36℃的温度是一般的，虽然高严格退火温度依赖于引物长度和特意性在大约32-48℃之间而有所不同。
对于高严格PCR扩增，大约62℃的温度是一般的，虽然高严格退火温度依赖于引物的长度和特异性范围可以从大约50-65℃。高和低严格扩增的一般循环条件都包括90-95℃的变性阶段30-120秒，退火阶段维持30-12-秒，大约72℃延伸阶段1-2分钟。例如Innis等
(1990)PCR试验方案：方法和应用指南，Academic Press，NY中提供了低和高严格扩增反应的试 验方案和指导方针。
[0136] 在严格条件下不相互杂交的核酸如果它们编码的多肽基本相同那么它们仍然基本相同。例如使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸的拷贝时这个可以发生。这样的情况下，核酸一般在适度严格杂交条件下杂交。实例性“适度严格杂交条件”包括40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液在37℃和1X SSC在45℃下清洗的杂交。阳性杂交一般至少是背景的两倍。或者使用提供相似严格性的杂交和清洗条件。很多参考文献中提供了确定杂交参数的额外的指导方针，例如Ausubel等(1991年版及附录)当代分子生物学实验方案(Current Protocols inMolecular Biology)Wiley。
[0137] 短语“细胞形态学的改变”或者“细胞特性的改变”指的是体外或体内细胞形态学或增殖特征的任何改变，例如细胞存活、细胞生长、生长或化学因子的分泌、细胞形态学改变、炎症特异性标志的获得或丢失、当注射进入合适的动物宿主时诱导或抑制炎症的能力、和/或合适宿主疾病状态的诱导，例如自身免疫紊乱和癌性状态。见，例如Freshney(1994)动物细胞的培养基本技术手册(Culture of Animal Cells aManual of Basic Technique)(第二版)231-241页，Wiley-Liss。
[0138] “疾病细胞”指的是不需要涉及新遗传物质的摄入之自发或诱导的表型改变。例如，尽管转化病毒的感染和新基因组DNA的引入或外源性DNA的摄入能够造成骨髓瘤的形成，它也能自发地或在暴露于试剂之后形成，因而诱导存在的基因的表达或改变。肿瘤生长与表型以及蛋白质表达的改变相关，例如形态学改变、异常的细胞生长和/或非形态学的改变。见，Freshney(2000)动物细胞的培养：基本技术手册(Cultureof Animal Cells：A Manual of Basic Technique)(第四版)Wiley-Liss。相似地，受自身免疫疾病过程影响的细胞也与表型以及蛋白质表达的改变相关。
[0139] “有效”量的分子或抗体或药物或药理活性试剂或药物制剂指的是足够量的分子、抗体、药物、试剂或制剂以提供期望作用。
[0140] 此处交替使用“研究对象”或“患者”，它指的是脊椎动物，优选地是哺乳动物，更加优选地是人类。
[0141] 如此处使用地，术语“抗体”或“免疫球蛋白”指的是由一个或多个基本上由免疫球蛋白质基因编码的多肽组成的蛋白质。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、αγ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变V区基因(如下面指出地，有H-重和L-轻链的V基因)。全长免疫球蛋白“轻链”(大约25Kd或214个氨基酸)由在NH2末端(大约110个氨基酸)的可变区基因、V-κ或V-λ以及分别地由COOH末端κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(大约50Kd或446个氨基酸)相似地
由可变区基因(大约116个氨基酸)和其它上述恒定区基因之一例如γ(编码大约330个
氨基酸)编码。
由可变区基因(大约116个氨基酸)和其它上述恒定区基因之一例如γ(编码大约330个
氨基酸)编码。
[0142] 一种形式的免疫球蛋白组成了抗体的基本结构单位。这个形式是四聚体并由两对相同的免疫球蛋白链组成，每对具有一个轻链和一个重链。每对中，轻和重链可变区一起负责与抗原的结合，恒定区负责抗体效应子功能。除了四聚体抗体，免疫球蛋白以各种其它形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab′)2以及双功能杂交抗体(例如，Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17，105(1987))和单链形式(例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等，Science，242，423-426(1988)，此处引入作用参考)。(见，一般Hood等，“免疫学”(″Immunology″)，Benjamin，N.Y.，第二版(1984)以及Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)，此处引入作用参考).
[0143] 免疫球蛋白轻或重链可变区由被三个高度可变区间断的“框架”区组成，也称为互补决定区(CDR)。已经精确地定义了框架区域和CDR的范围(见“免疫学兴趣蛋白质的序列”(″Sequences of Proteins ofImmunological Interest，″)E.Kabat等，U.S.Department of Healthand Human Services，(1983)；此处引入作用参考)。不同轻或重链框架区域的序列在物种之内是相对保守的。如此处使用地，“人框架区域”是基本上与天然存在的人免疫球蛋白框架区域基本相同的(大约85％或更高，通常90-95％或更高)框架区域。为构成性轻和重链联合框架区域的抗体的框架区域起定位和排列(align)CDR的作用。CDR主要负责与抗原的表位结合。
[0144] 也存在这样的抗体，例如由多种肽酶消化产生的充分表征的片段。因而，例如，胃蛋白酶在链接区二硫键之下消化抗体而产生F(ab)′2，其本身是轻链的Fab二聚体通过二硫键与VH-CH1连接。在温和条件下可以减少F(ab)′2以破坏链接区的二硫键，从而将F(ab)′2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上是有部分链结区的Fab(见
Paul(1999年版)基础免疫学(Fundamental Immunology)(第四版)Raven)。虽然就完整
抗体的消化而言定义了各种抗体片段，技术人员将理解这样的片段可以用化学或通过使用重组DNA方法学重新合成。因而，如此处使用的术语抗体也包括通过全抗体的修饰产生的抗体片段或使用重组DNA方法学重新合成的那些(例如，单链Fv)或者用噬菌体陈列文库鉴别的那些(见，例如McCafferty等(1990)Nature 348：552-554)。
Paul(1999年版)基础免疫学(Fundamental Immunology)(第四版)Raven)。虽然就完整
抗体的消化而言定义了各种抗体片段，技术人员将理解这样的片段可以用化学或通过使用重组DNA方法学重新合成。因而，如此处使用的术语抗体也包括通过全抗体的修饰产生的抗体片段或使用重组DNA方法学重新合成的那些(例如，单链Fv)或者用噬菌体陈列文库鉴别的那些(见，例如McCafferty等(1990)Nature 348：552-554)。
[0145] “嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、取代或交换使得抗原结合位点(可变区)连接于不同或改变类型和/或种类的恒定区，或者连接于赋予嵌合抗体全新特性的完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物、效应子功能、化学引诱物、免疫调节剂等等；或者(b)可变区或其部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。
[0146] 术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”指的是包含人框架的免疫球蛋白，至少一个并且优选地全部互补决定区(CDR)来自非人抗体，其中存在的任何恒定区基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，即至少大约85-90％优选地至少95％相同。因此，除了可能的CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。见，例如Queen等，美国专利号5,5301,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370(这些和其它美国专利/专利申请完整引入作用参考)。
[0147] 对于抗体的制备，例如重组、单克隆或多克隆抗体，许多技术是已知的。见，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497；Kozbor等(1983)Immunology Today4：72；Reisfeld和Sell(1985)单克隆抗体和骨髓瘤治疗(Monoclonal Antibodies and Myeloma Therapy)Liss中Cole等(1985)77-96页；Coligan(1991)免疫学当代实验方案
(Current Protocols in Immunology)Lippincott；Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)CSH出版社；以及Goding(1986)单克隆抗体：
原则和实践(MonoclonalAntibodies：Principles and Practice)(第二版)学术出版社(AcademicPress)。生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)适应于产生抗本发明多
肽的抗体。而且，转基因小鼠或其它生物体例如其它哺乳动物可以用于表达人源性抗体。
或者，噬菌体陈列技术能用于鉴别特异性结合于所选择的抗原的抗体和异聚体Fab片段。
见，例如McCafferty等(1990)Nature 348：552-554；Marks等(1992)Biotechnology 10：
779-783。
(Current Protocols in Immunology)Lippincott；Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)CSH出版社；以及Goding(1986)单克隆抗体：
原则和实践(MonoclonalAntibodies：Principles and Practice)(第二版)学术出版社(AcademicPress)。生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)适应于产生抗本发明多
肽的抗体。而且，转基因小鼠或其它生物体例如其它哺乳动物可以用于表达人源性抗体。
或者，噬菌体陈列技术能用于鉴别特异性结合于所选择的抗原的抗体和异聚体Fab片段。
见，例如McCafferty等(1990)Nature 348：552-554；Marks等(1992)Biotechnology 10：
779-783。
[0148] 术语“表位”指的是能够引发免疫反应并特异性与抗体结合的蛋白的任何部分(决定簇)。表位决定簇通常由分子的活性表面集团(groupings)例如氨基酸或GAG侧链组成，并且通常具有特异三维结构特征以及特异荷质比特征。如果蛋白质中降低或消除一个抗体的结合 的氨基酸突变也降低或消除其它抗体的结合，以及/或者如果抗体竞争与蛋白质的结合，即一个抗体与蛋白质的结合降低或消除其它抗体的结合，那么认为两个抗体基本结合于蛋白质的相同表位(或蛋白质重叠的表位)。通过本领域中已知的方法，例如竞争试验完成两个抗体是否基本上结合于相同表位的测定。在进行对照抗体(例如，此处描述的一个抗CS1抗体)和任何测试抗体之间的抗体竞争研究中，可以先用可检测的标记例如生物素、酶、放射性标记或荧光标记标记对照抗体使得其后可被鉴别。基本上结合于与对照(标记)抗体相同的表位的测试(未标记)抗体应当能够阻断对照抗体的结合因而应
当降低对照抗体的结合。
当降低对照抗体的结合。
[0149] 实例性实施方案中，如果抗体基本上结合于Luc单克隆抗体(Luc单克隆抗体指的是本发明所产生的抗CS1单克隆抗体)相同的表位，抗体应当结合于与Luc单克隆抗体结合的CS1表位重叠的CS1的表位。重叠区域范围从一个氨基酸残基至几百个氨基酸残基。这个抗体然后应当竞争和/或阻断与Luc单克隆抗体与CS1的结合，从而降低Luc单克隆
抗体与CS1的结合，优选地竞争实验中至少降低大约50％。
抗体与CS1的结合，优选地竞争实验中至少降低大约50％。
[0150] 当抗原决定簇结合于抗体，有至少105M-1的结合亲和力，优选地106 至107M-1，更加8 9 -1 10 -1
优选地10 至10M ，甚至更加优选地10 M 或更强时，抗体识别抗原。
优选地10 至10M ，甚至更加优选地10 M 或更强时，抗体识别抗原。
[0151] 术语“源自”指的是“得自”或“产自”或“传自”。
[0152] CS1抗原和抗体
[0153] SEQ ID NO：2描述了全长野生型人CS1的氨基酸序列。“功能活性的”CS1片段或衍生物展现了一个或多个与全长、野生型CS1蛋白相关的功能活性，例如抗原或免疫原活性，结合天然细胞底物的能力等等。CS1蛋白、衍生物和片段的功能活性能够通过本领域技术人员已知的各种方法测定 (蛋白质科学当代实验方案(Current Protocols in Protein Science)，Coligan等，eds.，John Wiley&Sons，Inc.，Somerset，New Jersey(1998)。为了此处的目的，功能活性片段也包括包含一个或多个CS1多肽结构性结构域的那些片段，例如结合结构域。使用PFAM程序能鉴别蛋白质结构域(Bateman A.等，Nucleic Acids Res.27：260-2(1999))。
[0154] CS1多肽衍生物一般与SEQ ID NO：2或其片段共有一定程度的序列相同性或序列相似性。能够通过本领域已知的各种方法产生CS1衍生物。导致它们产生的这些操作能在基因或蛋白质水平发生。例如，用限制性内切核酸酶能在合适位点切割所克隆的CS1基因序列(例如SEQ IDNO：1)(Wells等，Philos.Trans.R.Sot.London SerA 317：415(1986))，之后是进一步的酶修饰，如果期望，然后分离并体外连接并且表达以产生期望的衍生物。或者，为了产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列或为了产生编码区域的变异和/或为了形成新限制内切核酸酶或破坏预先存在的限制性内切核酸酶能在体外或体内突变CS1基因以促进进一步的体外修饰。各种突变技术在本领域是已知的，例如化学突变、体外定向诱变(Carter等，Nucl.Acids Res.13：4331(1986))或TAB连接子的使用(得自Pfizer公司)。
[0155] 一方面，本发明的抗体中和至少一个或优选地所有CS1的生物活性。CS1的生物活性包括：1)其细胞底物的结合活性，例如其配体(例如，这些中和抗体应当能够竞争或完全阻断其至少一个，优选地所有的配体与CS1的结合)；2)信号传递转导活性；以及3)CS1诱导的细胞反应。
[0156] 本发明提供了杂交瘤细胞系：Luc2、Luc 3、Luc15、Luc22、Luc23、Luc29、Luc32、Luc34、Luc35、Luc37、Luc38、Luc39、Luc56、Luc60、Luc63、Luc69、LucX.1、LucX.2 或Luc90。杂交瘤细胞系Luc90已经保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，邮政信箱1549，Manassas，vA20108，保藏号PTA 5091。ATCC在2003年3月26日接受了这个杂交瘤细胞系的保存。杂交瘤细胞系Luc63也保存在上面列出地址的ATCC。ATCC在2004年5月6日接受了Luc63抗体的保存，保藏号PTA5950。
[0157] 本发明提供了杂交瘤细胞系Luc2、Luc3、Luc15、Luc22、Luc23、Luc29、Luc32、Luc34、Luc35、Luc37、Luc38、Luc39、Luc56、Luc60、Luc63、Luc69、LucX.1、LucX.2 或Luc90(ATCC保藏号PTA 5091)产生的单克隆抗体。此后这些单克隆抗体分别命名为抗体Luc2、Luc3、Luc15、Luc22、Luc23、Luc29、Luc32、Luc34、Luc35、Luc37、Luc38、Luc39、Luc56、Luc60、Luc63、Luc69、LucX.1、LucX.2和Luc90。
[0158] 本发明提供了基本上结合于与此处描述的任何一个Luc单克隆抗体相同表位的抗体，优选单克隆抗体。
[0159] 本发明提供了基本上不与一个或多个上面描述的Luc单克隆抗体相同表位结合的抗体，优选单克隆抗体。
[0160] 各种评价抗体竞争的免疫筛选试验能用于鉴别基本上结合于本发明抗体相同表位或者结合于与本发明抗体的表位不同的表位的抗体。
[0161] 在进行对照抗体和任何测试抗体(不管种类或分型)之间的抗体竞争研究中，可以先用可检测的标记例如生物素或酶性(或甚至是放射性)标记标记对照抗体使得其后可被鉴别。这种情况下，将未标记抗体与表达CS1蛋白的细胞预先混合或孵育。然后将标记抗体加到预孵育的细胞。测量结合标记的强度。如果标记抗体与未标记抗体竞争结合于重叠的表位，相对于阴性对照未标记抗体(不与CS1结合的已知抗体)的结合的强度将降低。 [0162] 试验可以是任何一个基于抗体竞争的免疫学试验，将通过检测它们的标记来检测对照抗体，例如在生物素化抗体的情况下通过使用链霉抗生物素或者通过使用显色底物联合酶性标记(例如3，3′5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物和过氧化物酶)或者通过简单地检测放射性标记或荧光标记。结合于与对照抗体相同的表位的抗体将能够有效地竞争结合因而将显著地降低(例如，至少50％)对照抗体的结合，如结合标记的降低所证明。 [0163] (标记的)对照抗体在没有完全无关的抗体存在下的反应性将是对照最高值。当竞争将会发生并降低标记抗体的结合时，将通过将未标记测试抗体与表达CS1的细胞孵育然后将细胞/抗体混合物与完全相同类型的标记的对照抗体孵育获得对照最低值。测试试验中，在测试抗体存在下标记抗体反应性的显著降低表示测试抗体识别基本上相同的表位。
[0164] 抗所有物种来源的CS1的抗体都包括在本发明内。非限制性实例性天然抗体包括源自人、鸡、羊和包括遗传设计的转基因啮齿动物的啮齿类(例如，大鼠、小鼠、仓鼠和兔)以生产人抗体(见，例如Lonberg等，WO93/12227；美国专利号5,545,806；以及
Kucherlapati等，WO91/10741；美国专利号6,150,584，此处完整引入作为参考)。天然抗体是宿主动物在用抗原免疫后产生的抗体，例如多肽，优选人多肽。在优选的实施方案中，本发明的抗体是结合和/或中和CS1的分离的天然抗体。
Kucherlapati等，WO91/10741；美国专利号6,150,584，此处完整引入作为参考)。天然抗体是宿主动物在用抗原免疫后产生的抗体，例如多肽，优选人多肽。在优选的实施方案中，本发明的抗体是结合和/或中和CS1的分离的天然抗体。
[0165] 遗传性改变的抗CS1抗体应当是上述天然抗体的功能等同物。提供改善的稳定性或/和治疗功效的修饰抗体是优选的。修饰抗体的实例包括由氨基酸残基保守性取代以及不显著损害性地改变抗原结合效用的氨基酸的一个或多个删除或添加的那些抗体。取代范围从改变或修饰一个或多个氨基酸残基至整个区域的完全重新设计，只要治疗效用得以保留。能够翻译后修饰(例如乙酰化和/或磷酸化)或者能够合成地修饰(例如标记基团的附着)本发明的抗体。优选地遗传性改变的抗体是嵌合抗体和人源化抗体。
[0166] 嵌合抗体是具有源自两个不同抗体的优选地源自不同物种的可变区和恒定区的抗体。优选地，嵌合抗体的可变区源自鼠并且恒定区源自人类。
[0167] 一个实施方案中，鼠可变区源自此处描述的任何一个单克隆抗体。为了产生嵌合抗体，源自两个不同物种的部分(例如，人恒定区和鼠可变或结合区)能通过传统技术以化学方法连接在一起或者能使用基因工程技术制备成单个连续(contiguous)蛋白质。编码嵌合抗体轻链和重链部分的蛋白质的DNA分子能表达为连续的蛋白质。美国专利号
5,677,427；美国专利号6,120,767；以及美国专利号6,329,508中公开了制造嵌合抗体的方法，每一个专利此处完整引入作用参考。
5,677,427；美国专利号6,120,767；以及美国专利号6,329,508中公开了制造嵌合抗体的方法，每一个专利此处完整引入作用参考。
[0168] 本发明使用的遗传性改变抗体包括结合并且中和CS1的人源化抗体。一个实施方案中，所述人源化抗体包含鼠供体免疫球蛋白的CDR以及人受体免疫球蛋白的重链和轻链框架和恒定区。一个实施例中，人源化抗体是任何一个上述抗体的人源化版本。美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370中公开了制造人源化抗体的方法，每一个专利此处完整引入作为参考。
[0169] 抗CS1完全人抗体也包括在本发明中。本发明优选实施方案中，所述完全人抗体是分离的人抗体，它中和此处描述的CS1的活性。
[0170] 通过各种技术产生抗CS1的完全人抗体。一个实施例是三源杂交瘤方法学。Oestberg等，Hybridoma 2：361-367(1983)；Oestberg，美 国 专 利 号4,634,664以 及Engleman等，美国专利号4,634,666描述了用于此方法中的基本方法和实例性细胞融合伴侣SPAZ-4。
[0171] 抗CS1的人抗体也能从具有编码至少人免疫球蛋白基因座片段的转 基因的非人转基因动物中产生。见，例如Lonberg等，WO93/12227；美国专利号5,545,806以及
Kucherlapati等，WO91/10741；美国专利号6,150,584详细描述了具有这些特性的动物的产生和特性，每一个此处完整引入作为参考。
Kucherlapati等，WO91/10741；美国专利号6,150,584详细描述了具有这些特性的动物的产生和特性，每一个此处完整引入作为参考。
[0172] 也可以采用各种重组抗体文库技术产生完全人抗体。例如，一个方法是根据Huse等，Science 246：1275-1281(1989)概述的一般试验方案从人B细胞筛选DNA文库。选择结合CS1或其片段的抗体。然后克隆和扩增编码这样抗体(或结合片段)的序列。Huse描述的试验方案赋予与噬菌体陈列技术联合后的更高的效率。见，例如Dower等，WO 91/17271和McCafferty等，WO 92/01047；美国专利号5,969,108(每一个完整引入作为参考)。这些方法中，产生噬菌体文库，其中成员在它们外表面陈列不同抗体。抗体通常陈列为Fv或Fab片段。通过亲和力强化(enrichment)选择对CS1或其片段有期望特异性的噬菌体陈列抗体。
[0173] 如 Coia G 等，J.Immunol.Methods 1：254(1-2)：191-7(2001)；Hanes J. 等，Nat.Biotechnol.18(12)：1287-92(2000)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(24)：14130-5(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(10)：4937-42(1997)描述地，真核核糖体也能用作陈列抗体文库并且通过抗靶抗原的筛选分离例如CS1的结合人抗体的手段，每个文献此处完整引入作用参考。
[0174] 酵母系统也适合用于筛选哺乳动物细胞表面或分泌蛋白，例如抗体。为了获得抗靶抗原的人抗体的目的，抗体文库可以陈列在酵母细胞的表面。Yeung等，Biotechnol.Prog.18(2)：212-20(2002)；Boeder，E.T.等，Nat.Biotechnol.15(6)：553-7(1997)描述了这个方法，每个文献此处完整引入作用参考。或者，人抗体文库可以细胞内表达或通过酵母双杂交系统筛选(WO0200729A2，此处完整引入作用参考)。
[0175] 保留对CS1结合特异性的抗CS1抗体的片段也包括在本发明内。这些抗原结合片段的实例包括但不限于此处描述的任何抗CS1抗体的部分或全部重链或轻链、可变区或CDR区域。
[0176] 本发明优选的实施方案中，抗体片段(抗原结合片段)是截短的链(在羧基端截短的)。优选地，这些截短链具有一个或多个免疫球蛋白活性(例如，补体结合活性)。截短链的实例包括但不限于Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成)；Fd片段(由VH和CH1结构域组成)；Fv片段(由抗体单链的VL和VH结构域组成)；dab片段(由VH结构域
组成)；分离的CDR区域；(Fab′)2片段、二价片段(包含两个通过链接区二硫键连接的Fab片段)。截短链能由传统生化技术产生，例如酶切或重组DNA技术，每一个都是本领域已知的。这些多肽片段可以通过如下产生，用本领域已知的方法通过完整抗体的水解切割，或者使用定向突变在载体内期望的位置插入中止密码子，例如在CH1之后插入以产生Fab片段或在链接区之后以产生(Fab′)2片段。用编码连接VL和VH蛋白片段的肽连接子的DNA
连接VL和VH编码区可以产生单链抗体。
组成)；分离的CDR区域；(Fab′)2片段、二价片段(包含两个通过链接区二硫键连接的Fab片段)。截短链能由传统生化技术产生，例如酶切或重组DNA技术，每一个都是本领域已知的。这些多肽片段可以通过如下产生，用本领域已知的方法通过完整抗体的水解切割，或者使用定向突变在载体内期望的位置插入中止密码子，例如在CH1之后插入以产生Fab片段或在链接区之后以产生(Fab′)2片段。用编码连接VL和VH蛋白片段的肽连接子的DNA
连接VL和VH编码区可以产生单链抗体。
[0177] 因为免疫球蛋白相关基因含有分开的功能区，每个具有一个或多个截然不同的生物活性，抗体片段的基因可以与其它基因(例如，酶，美国专利号5,004,692，此处完整引入作用参考)的功能区融合以产生融合蛋白(例如，免疫毒素)或具有新特性的结合物(conjugates)。
[0178] 本发明包含抗CS1抗体在免疫毒素中的用途。本领域广泛地描述了为免疫毒素的结合物包括抗体。毒素可以用传统偶联技术偶联于抗体，或者含有蛋白毒素部分的免疫毒素能够被产生为融合蛋白。本发明的结合物以相应的方式能够用于获得这样的免疫毒素。这样的免疫毒素的例证就是Byers，B.S.等，Seminars Cell Biol 2：59-70(1991)和Fanger，M.W.等，Immunol Today 12：51-54(1991)描述的那些。
[0179] 重组DNA技术能用于在任何表达系统包括原核和真核表达系统例如细菌、酵母、昆虫、植物细胞和哺乳动物细胞(例如，NSO细胞)中产生重组抗CS1抗体以及嵌合或人源化的抗CS1抗体或任何其它抗CS1遗传性改变的抗体和片段或其结合物。
[0180] 一旦产生，本发明的整个抗体、它们的二聚体、各个轻和重链或其它免疫球蛋白形式能够根据本领域的标准步骤进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、柱相色谱、凝胶电泳等等(一般见Scopes，R.，蛋白质的纯化(Protein Purification)(Springer-Verlag，N.Y.，1982)。为了药物用途，至少大约90至95％均质的基本纯化的免疫球蛋白是优选的，98至99％或更多的均质性是最优选的。一旦纯化，部分地或如期望的均质性，多肽然后可以用于治疗(包括体外地)或开发和进行试验过程、免疫荧光染色等等(一般见免疫学方法(Immunological Methods)，第一和二卷(Lefkovits和Pernis，eds.，Academic Press，NY，1979和1981年)。分离或纯化的抗CS1抗体还能筛选它们中和如实施例中描述的CS1生物活性的能力。
[0181] CS1的结构模型
[0182] 人CS1基因(SEQ ID NO.1)的开放阅读框编码335个氨基酸残基的多肽(SEQ ID NO.2)。预测的蛋白质序列具有推测的信号肽序列和大约225个氨基酸残基的细胞外结构域，之后是大约25个氨基酸残基的单个跨膜结构域和大约85个氨基酸残基的细胞外结构域。细胞外结构域含有七个推测的N连接的糖基化位点。CS1预测的蛋白质序列的同源性指出它是Ig超家族的一员。与其它CD2亚型受体相比，CS1蛋白质序列的比对指出相似的结构和许多保守残基。细胞质区域含有在2B4和SLAM中观察到的两个新酪氨酸基团。
[0183] 预测CS1细胞外结构域的结构模型由两个免疫球蛋白样结构域组 成。N末端结构域1(V结构域)是V亚型的一员，结构域2(C2结构域)是免疫球蛋白样结构域C2亚型的一员，象在CD2(PDB编码：1HNF)中的一样。细胞外结构域在其C末端连接于起始于大约氨基酸残基226的跨膜结构域。
[0184] V结构域(从大约氨基酸残基23至大约氨基酸残基122)中，结构域核心的Trp-53是保守的，紧接着的邻近区内所有残基与CD2的那些相同(Leu-90和Va1-105)或是保守取代的(CD2中Tyr-120取代为Phe)。如CD2中，V结构域中没有结构域内二硫键桥。C2
结构域(从大约氨基酸残基128至大约氨基酸残基225)中，两个结构域内二硫键是保守
的(Cys-151-Cys-195；Cys-145-Cys 215)，在结构域的核心，与前者紧接着的邻近区内所有残基与CD2的那些(Pro-131)相同或是保守取代的(CS1中Va1-133、Ile-161、Leu-180分别取代为CD2中的Ile、Leu和Ile)。CS1和CS2之间结构域间连接子区域(从大约
氨基酸残基123至大约氨基酸残基127)的长度也是相同的，显示一些保守性(CS1中的
Val-Tyr-Glu-His-Leu与CD2中的Ile-Gln-Glu-Arg-Val比)。
结构域(从大约氨基酸残基128至大约氨基酸残基225)中，两个结构域内二硫键是保守
的(Cys-151-Cys-195；Cys-145-Cys 215)，在结构域的核心，与前者紧接着的邻近区内所有残基与CD2的那些(Pro-131)相同或是保守取代的(CS1中Va1-133、Ile-161、Leu-180分别取代为CD2中的Ile、Leu和Ile)。CS1和CS2之间结构域间连接子区域(从大约
氨基酸残基123至大约氨基酸残基127)的长度也是相同的，显示一些保守性(CS1中的
Val-Tyr-Glu-His-Leu与CD2中的Ile-Gln-Glu-Arg-Val比)。
[0185] 有七个潜在的N连接的糖基化位点，两个在V结构域(Asn-56和Asn-98)，五个在C2结构域(Asn-142、Asn-148、Asn-172、Asn-176和Asn-204)。CS1和CD抗原定义的蛋白质之间序列和基团的上下文中结构的相似性暗示CS1蛋白可以是例如炎症、癌症和免疫紊乱的疾病的潜在靶点。抗CS1抗体例如Luc抗体的治疗用途包括免疫球蛋白产生的抑制、自身免疫疾病中和表达CS1蛋白的癌症中白细胞功能的抑制。
[0186] CS1核酸的用途
[0187] 如上面描述地，CS1序列最初是通过与表2CS1序列的基本核酸和/或氨基酸序列同源性或与CS1序列的连接鉴别出来的。这样的同源性能够基于总核酸或氨基酸序列，并且一般使用同源性程序或杂交条件进行 确定。一般地，在相同的分子上发现mRNA上的连接序列。
[0188] 使用例如BLAST的运算确定序列相同百分数。优选的方法采用WU-BLAST-2的BLASTN模式，设定默认参数，重叠跨距和重叠部分分别设置为1和0.125。比对包括在将要比对的序列中引入缺口。另外，对于含有比所述核酸的那些核苷酸有更多或更少核苷酸的序列，可以基于相对总核苷酸数的同源核苷酸数确定同源百分比。因而，例如，将使用更短序列中的核苷酸数确定比所鉴别的序列的那些短的序列的同源性。
[0189] 一个实施方案中，通过杂交研究确定核酸同源性。因而，例如，在高严格条件下杂交于所述核酸或其补体或者在天然存在的mRNA上也发现的核酸被认为是同源序列。另一个实施方案中，使用不太严格的杂交条件；例如，可以使用中度或低严格条件；见Ausubel同上和Tijssen同上。
[0190] 本发明的CS1核酸序列，例如表2中的序列是更大的基因的片段，例如，它们是核酸片段。该上下文中的“基因”包括编码区、非编码区以及编码和非编码区的混合物。相应地，使用此处提供的序列，使用众所周知的克隆更长序列或全长序列的技术能够获得CS1基因任一方向的延伸序列；见Ausubel等，同上。许多能够通过信息学完成并且许多序列能簇生以包括相应于单个基因的多个序列，例如例如UniGene的系统。
[0191] 本发明的CS1核酸用于多个途径。一个实施方案中，制造了CS1的核酸探针，它附着于生物芯片以用于如下面概述的筛选和诊断方法或用于给药，例如为了基因治疗、疫苗、RNAi和/或反义应用。或者，为了CS1蛋白的表达，包括CS1蛋白编码区域的CS1核酸能放于表达载体之中，仍然用于筛选目的或患者给药。
[0192] 另一个实施方案中，制造了CS1核酸的核酸探针(图中概述的核酸 的序列和/或其互补物)。将附着于生物芯片的核酸探针设计为基本互补于CS1核酸，例如靶核酸(样品的靶序列或互补于其它探针序列，例如，三明治试验中)，则靶序列和本发明的探针的杂交得以发生。如下面概述地，这个互补性不需要是理想的；可以有任何数量的将干扰靶序列和本发明的单链核酸之间杂交的碱基对错配。然而，如果突变数量太大以至于在最不严格的杂交条件下也没有杂交发生，序列就不是互补的靶序列。因而，如此处概述地，此处“基本互补的”指的是探针充分互补于靶序列而在正常反应条件下特别是高严格条件下杂交。 [0193] 核酸探针一般是单链但是能部分是单链部分是双链。靶序列的结构、组成和特性决定了探针的单双链。一般，核酸探针范围大约8-100个碱基长，大约10-80个碱基是优选的，大约30-50个碱基是特别优选的。就是说，一般不使用全部的基因。一些实施方案中，使用长很多的核酸，至多可达几百个碱基。
[0194] 另一个实施方案中，每个序列使用一种以上的探针，使用了重叠探针或靶点不同部分的探针。就是说，使用两、三、四个或更多探针，三个是优选的，对于特定靶点造成多余。探针能是重叠的(例如，具有一些相同的序列)或分开的。一些情况下，为了更高的敏感性可以使用PCR引物扩增信号。
[0195] 能通过各种各样途径将核酸附着或固定于固相支持物。此处“固定的”和语法等同物指的是核酸探针和固相支持物之间的联合或结合在如概述的结合、清洗、分析和去除条件下足够稳定。结合一般是共价的或非共价的。此处“非共价结合”和语法等同物指的是一个或多个静电、亲水和疏水相互作用。包括在非共价结合内的是例如抗生物素蛋白链菌素的分子共价附着于支持物和生物素化探针与抗生物素蛋白链菌素的非共价结合。此处“共价结合”和语法等同物质指的是通过至少一个键附着两个基团、固相支持物和探针，包括σ键、π键和配位键。共价键可 以探针和固相支持物之间直接形成或者通过交联子或通过在固相支持物或探针或两个分子上包含特异性反应基团形成。固定也可以涉及共价和非共价相互作用的联合。
[0196] 一般，用各种各样的途径将探针附着于生物芯片。如此处描述地，核酸能够是先合成，随后附着于生物芯片，或者能够是直接在生物芯片上合成。
[0197] 生物芯片包含合适的固相底物。此处“底物”或“固相支持物”或其它语法等同物指的是为了核酸探针的附着或联合可以被修饰的材料，并且至少一个检测方法可检测。通常，底物含有适合各个分隔(partitioning)和鉴别的不连续的各个位点。可能的底物数量非常大，包括但不限于玻璃和改良或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸酯类、聚苯乙烯和苯乙烯与其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯、TeflonJ等等)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、塑料等等。一般，底物允许光学检测并且不发一点荧光。见WO 0055627。
[0198] 一般底物是平面的，虽然也可以使用底物的其它构象。例如，为了流通样本分析，探针可以放在试管内表面使样本体积最小化。相似地，底物可以是可变通的，例如可变泡沫，包括特别塑料制成的闭室泡沫。
[0199] 一个实施方案中，为了其后将生物芯片的表面和探针附着用化学官能基对二者进行衍生化。因而，例如，生物芯片用化学官能基衍生化，包括但不限于氨基基团、羧基基团、含氧基团和巯基基团，氨基基团是特别优选的。使用这些官能基团，使用探针上的官能基团可以附着探针。例如，含有氨基基团的核酸能附着于包含氨基基团的表面，例如使用连接子；例如，同源或异源双功能连接子是众所周知的(见1994年Pierce化学公司目录，交联子的技术部分(technical section on cross-linkers)，155-200页)。另外，一些情况下，可以使用额外的连接子，例如烷基基团(包括取代和异烷基基团)。
[0200] 该实施方案中，合成寡核苷酸然后附着于固相支持物的表面。5’或3’末端可以附着于固相支持物，或者经由连接附着于内部核苷。另一个实施方案中，固相支持物上的固定可以非常强但仍然是非共价的。例如，能制造生物素化的寡核苷酸，它结合于共价包被抗生物素蛋白链菌素的表面，导致附着。
[0201] 或者，可在表面上合成寡核苷酸。例如，使用采用光聚合作用化合物和技术的光激活技术。另一个实施方案中，使用已知的光刻技术，例如WO 95/25116；WO 95/35505；美国专利号5,700,637和5,445,934以及内部引用的参考文献中描述的那些，能原位合成核酸，所有这些特别引入作为参考；这些附着的方法形成Affymetrix (DNA微点阵芯片)技术的基础。
[0202] 通常，进行基于扩增的试验以测量CS1相关序列的表达水平。这些试验一般与反转录联合进行。这样的试验中，CS1相关核酸序列在扩增反应中作为模板(例如，多聚酶链式反应，或PCR)。定量扩增中，扩增产物的量将与初始样本中的模板量呈比例。与合适的对照相比提供了CS1相关RNA的量的测量方法。定量扩增的方法是众所周知的。例如，Innis等(1990)PCR试验方案：方法和应用指南(PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications)Academic Press提供了定量PCR的详细试验方案。
[0203] 一些试验方案中，基于 (发荧光的寡核苷酸探针)的试验用于测量表达。基于 的试验使用了含有5’荧光染料和3’淬灭剂的发荧光的寡核苷酸探针。
探针杂交于PCR产物，但是由于3’末端的阻断剂其本身不能延伸。当PCR产物在其后的循环中扩增时，聚合酶 例如 (DNA聚合酶)的5’核酸酶活性导致了
探针的切割。这个切割分离了5’荧光染料和3’淬灭剂，从而导致了荧光的增加，作为扩增的函数(见，例如Perkin-Elmer提供的文献)。
探针杂交于PCR产物，但是由于3’末端的阻断剂其本身不能延伸。当PCR产物在其后的循环中扩增时，聚合酶 例如 (DNA聚合酶)的5’核酸酶活性导致了
探针的切割。这个切割分离了5’荧光染料和3’淬灭剂，从而导致了荧光的增加，作为扩增的函数(见，例如Perkin-Elmer提供的文献)。
[0204] 其他合适的扩增方法包括但不限于连接酶链反应(LCR)(见Wu和Wallace(1989)Genomics 4：560-569，Landegren等(1988)Science
[0205] 241：1077-1080以及Barringer等(1990)Gene 89：117-122)、转录扩增(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、自主序列复制(Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874-1878)、点PCR、连接接头PCR等。
[0206] CS1蛋白从核酸的表达
[0207] 一个实施方案中，例如编码CS1蛋白的CS1核酸用于制造各种表达载体以表达然后能用在下面描述的诊断试验显像剂中的CS1蛋白。表达蛋白质的表达载体和重组DNA技术是众所周知的(见，例如，Ausubel，同上和Fernandez和Hoeffler(1999年版)基因表达系统(GeneExpression Systems)Academic Press)。表达载体可以是自我复制的染色体外载体或整合进宿主基因组的载体。一般，这些表达载体包括转录和翻译调节核酸有效地连接于编码CS1蛋白的核酸。术语“对照序列”指的是用于特定宿主生物体中有效连接的编码序列表达的DNA序列。适合原核生物的对照序列例如包括启动子、可选的操纵子序列以及核糖结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
[0208] 当核酸与另一个核酸序列有功能性联系时，它是“有效连接的”。例如，如果多肽表达为参与多肽分泌的前蛋白时，前序列或分泌前导物的DNA有效连接于多肽的DNA；如果启动子或增强子影响了编码序列的转录，它有效连接于该序列；或者如果核糖体结合位点所在位置促进翻译，它有效连接于编码序列。一般，“有效连接的”指的是要连接的DNA 序列是连续的，并且在分泌先导物的情况下，是连续的并且在阅读相。然而，增强子不一定非要是连续的。一般在方便的限制性位点通过连接完成结合。如果这样的位点不存在，与常规实践一致地可以使用合成的寡核苷酸接头或连接子。一般转录和翻译调节核酸将适合宿主细胞表达CS1蛋白。很多类型合适的表达载体和合适的调节序列对于各种宿主细胞是已知的。
[0209] 一般，转录和翻译调节序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和中止序列、翻译起始和中止序列以及增强子或激活子序列。一个实施方案中，调节序列包括启动子和转录起始和中止序列。
[0210] 启动子序列可以是组成性或诱导性的启动子。启动子可以是天然存在的启动子或杂交启动子。联合了多于一个启动子的元件的杂交启动子也是已知的，并且在本发明中是有用的。
[0211] 表达载体可以包含额外的元件。例如，表达载体可有两套复制系统，因而允许它在两个生物体中存在，例如，为了表达在哺乳动物或昆虫细胞中，为了克隆和扩增在原核宿主中。此外，对于整合表达载体，表达载体通常含有至少一个同源于宿主细胞基因组的序列，优选地在表达构建体两侧的两个同源序列。通过选择合适的包含在载体中的同源序列，整合载体可被指向宿主细胞中的特异性基因座。整合载体的构建体是可以得到的。见，例如Fernandez和Hoeffler，同上；以及Kitamura等(1995)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 92：9146-9150。
[0212] 另外，另一个实施方案中，表达载体含有可选择的标记物基因允许转化宿主细胞的选择。选择基因是众所周知的，并且根据使用的宿主细胞将是不同的。
[0213] 本发明的CS1蛋白通常通过在诱导或导致CS1蛋白表达的合适的条件下培养用含有编码CS1蛋白的核酸的表达载体转化的宿主细胞来产生。适合CS1蛋白表达的条件将依据表达载体和宿主细胞的选择将不同，并且通过常规试验或优化很容易确定。例如，表达载体中组成启动子的使用将需要优化宿主细胞的生长和增殖，而诱导启动子的使用需要适合诱导的生长条件。另外，一些实施方案中，收集的时间是重要的。例如，用在昆虫细胞表达的杆状病毒系统是裂解病毒，因而收集时间的选择对于产量是至关重要的。
[0214] 合适的宿主细胞包括酵母、细菌、古细菌、真菌以及昆虫和动物细胞，包括哺乳动物细胞。特别有兴趣的是酿酒酵母和其它酵母、大肠杆菌、枯草杆菌、Sf9细胞、C129细胞、293细胞、脉孢菌、BHK、CHO、COS、HeLa细胞、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)、THP1细胞(巨噬细胞系)以及各种其它的人细胞和细胞系。
[0215] 一个实施方案中，CS1蛋白表达于哺乳动物细胞中。可以使用哺乳动物表达系统，包括逆转录病毒和腺病毒系统。一个表达载体系统是逆转录载体系统，例如一般如PCT/US97/01019和PCT/US97/01048描述的。特别用作哺乳动物启动子的是来自哺乳动物病毒基因的启动子，因为病毒基因常常高度表达并具有很广的宿主范围。实例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要后期启动子、单纯疱疹病毒启动子以及CMV启动子(见，例如Fernandez和Hoeffler，同上)。一般，哺乳动物细胞识别的转录中止和多腺苷酸序列是位于翻译中止密码子3’端的调节区域，因而，和启动子元件一起在编码序列的两侧。转录中止子和多腺苷酸信号的实例包括源自SV40的那些。
[0216] 将外源核酸引入哺乳动物宿主以及其它宿主的方法是可以获得的，并将随着使用的宿主细胞而不同。技术包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质融合、电穿孔、病毒转染、多肽封装 在脂质体内以及DNA直接微注射入核。
[0217] 另一个实施方案中，CS1蛋白表达于细菌系统中。也可以使用噬菌体的启动子。另外，合成启动子和杂交启动子也是有用的；例如，tac启动子是trp和lac启动子序列的杂交。此外，细菌启动子包括非细菌来源的天然存在的启动子，它具有结合细菌RNA聚合酶和起始转录的能力。除功能启动子序列外，有效率的核糖体结合位点是期望的。表达载体也包括提供细菌中CS1蛋白的分泌的信号肽序列。蛋白质分泌到生长培养基(革
兰阳性菌)或分泌到位于细胞内和外膜之间的周质空间(革兰阴性菌)。细菌表达载体
也包括合适的标记物基因而允许已经被转化的细菌株的选择。合适的选择基因包括赋予细菌对例如氨苄西林、氯霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素和四环霉素的药物的耐受性的基因。可选择的标记物也包括生物合成基因，例如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些。这些组分组合进表达载体。细菌的表达载体是众所周知的，包括例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌、乳脂链球菌(Streptococus cremoris)、变铅青链霉菌(Streptococcuslividans)的载体(例如，Fernandez和Hoeffler，同上)。使用例如氯化钙处理、电穿孔及其它的技术将细菌表达载体转化到细菌宿主细胞。
兰阳性菌)或分泌到位于细胞内和外膜之间的周质空间(革兰阴性菌)。细菌表达载体
也包括合适的标记物基因而允许已经被转化的细菌株的选择。合适的选择基因包括赋予细菌对例如氨苄西林、氯霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素和四环霉素的药物的耐受性的基因。可选择的标记物也包括生物合成基因，例如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些。这些组分组合进表达载体。细菌的表达载体是众所周知的，包括例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌、乳脂链球菌(Streptococus cremoris)、变铅青链霉菌(Streptococcuslividans)的载体(例如，Fernandez和Hoeffler，同上)。使用例如氯化钙处理、电穿孔及其它的技术将细菌表达载体转化到细菌宿主细胞。
[0218] 一个实施方案中，为了昆虫细胞的转化，使用例如表达载体特别是基于杆状病毒的表达载体在昆虫细胞中生产CS1蛋白。
[0219] 另一个实施方案中，酵母细胞中生产CS1蛋白。酵母表达系统是众所周知的，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)和麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、脆避克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、Pichia guillerimondii和
P.paston’s、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂 耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的表达载体。
P.paston’s、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂 耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的表达载体。
[0220] 使用可得的技术，CS1蛋白也可以制成融合蛋白。因而，例如，为了单克隆抗体的创造，如果期望的表位很小，CS1蛋白可以与载体蛋白融合形成免疫原。或者，为了增加表达或为了其它原因，CS1蛋白可以制成融合蛋白。例如，当CS1蛋白是CS1肽时，为了表达的目的，编码肽的核酸可以与其它核酸连接。例如用FLAG、His6、myc、HA等能够完成与检测表位标签的融合。
[0221] 另一个实施方案中，表达之后纯化或分离CS1蛋白。根据有什么其它的成份存在于样品中以及对纯化产物的要求例如天然构象或变性的，可以用各种方法分离或纯化CS1蛋白。标准纯化方法包括硫酸铵沉淀、电泳、分子、免疫和色谱技术，包括离子交换、疏水、亲和以及反相HPLC色谱和色谱聚焦。例如，使用标准抗CS1蛋白抗体柱纯化CS1蛋白。超滤和透析过滤技术联合蛋白质浓缩也是有用的。见，例如Walsh(2002)蛋白质：生物化学和生物技术(Proteins：Biochemistry andBiotechnology)Wiley；Hardin等(2001年版)克隆、基因表达和蛋白质纯化(loning，Gene Expression and Protein Purification)牛津大学出版社；Wilson等(2000年版)分离科学百科全书(Encyclopedia of Separation Science)Academic Press；以及Scopes(1993)蛋白质纯化(Protein Purification)
Springer-Verlag。需要的纯化程度将以依赖于CS1蛋白的用途而不同。一些情况下将不需要纯化。
Springer-Verlag。需要的纯化程度将以依赖于CS1蛋白的用途而不同。一些情况下将不需要纯化。
[0222] 一旦表达和纯化，(如果需要)CS1蛋白和核酸在许多应用中是有用的。它们可以用作免疫选择剂、用作疫苗试剂、用作筛选试剂、治疗实体以生产抗体或用作转录或翻译的抑制剂等。
[0223] CS1蛋白的变异体
[0224] 也包括在CS1蛋白的一个实施方案中的是如此处测定的天然存在的序列的氨基酸变异体。优选地，变异体优选地与野生型序列有高于大约75％的同源性，更加优选地高于大约80％，甚至更加优选地高于大约85％，最优选地高于90％。一些实施方案中同源性将高达大约93-95％或98％。对于核酸，该上下文中的同源性指的是序列相似性或相同性，相同性是优选的。如上面概述的核酸同源性，将使用标准技术测定该同源性。
[0225] 本发明的CS1蛋白可以短于或长于野生型核酸序列。因而，一个实施方案中，包括在CS1蛋白的定义之内的是此处野生型序列的部分或片段。另外，如上面概述地，本发明的CS1核酸可以用于获得额外的编码区域以及因此额外的蛋白序列。
[0226] 一个实施方案中，与野生型序列相比CS1蛋白是衍生的或变异的CS1蛋白。就是说如下面更加完全概述地，衍生CS1肽将通常含有至少一个氨基酸取代、删除或插入，多个氨基酸取代是特别优选的。CS1肽之内许多残基部分可以发生氨基酸取代、插入或删除。 [0227] 也包括在本发明CS1蛋白的一个实施方案中的是氨基酸序列变异体。这些变异体一般是三个类型中的一个或多个：取代、插入或删除变异体。通常使用盒子或PCR突变或其它技术通过编码CS1蛋白的DNA中核苷酸定点突变制备这些变异体，以生产编码变异体的DNA，之后在如上概述的重组细胞培养物中表达DNA。然而，使用已建立的技术通过体外合成制备具有至多达大约100-150个残基的变异CS1蛋白片段。通过变异预定的性质对氨基酸序列变异体进行特征分析，这个特性将它们与CS 1蛋白氨基酸序列天然存在的等位或种间变异区分开来，虽然也能选择具有修饰特征的变异体。
[0228] 虽然引入氨基酸序列变异的位点或区域通常是预定的，突变本身不 需要是预定的。例如，为了优化给定位点的突变性能，可以在靶点密码子或区域进行随机诱变，为了期望活性的最佳组合而筛选表达的CS1变异体。在具有已知序列的DNA中的预定位点制造取代突变的技术是众所周知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。通常使用CS1蛋白活性试验完成突变体的筛选。
[0229] 氨基酸取代一般是单个残基；插入通常的数量级是大约1-20个氨基酸，虽然相对更大的插入是可以忍受的。删除一般范围大约1-20个残基，虽然在一些情况下删除可以更大些。
[0230] 可以使用取代、删除、插入或它们的组合获得最后的衍生物。一般这些改变在一些氨基酸上完成使得分子的改变最小。然而，在某些情况下更大的改变可以忍受。当CS1蛋白的特征很小的改变是期望的，一般根据所述的氨基酸取代关系进行取代。
[0231] 变异体一般展现基本上相同的定性的生物活性，将引发与天然存在的类似物相同的免疫反应，虽然也选择变异体以根据需要修饰CS1蛋白的特征。或者，可以设计变异体使得CS1蛋白的生物活性发生改变。例如，可以添加、改变或去除糖基化位点。
[0232] 有时通过选择比上述的那些有更低保守性的取代来完成功能或免疫活性相同性的基本改变。例如，可以完成更加显著性地影响如下的取代：改变区域的多肽骨架结构例如α-螺旋或β-折叠结构；靶点分子的电荷或疏水性；或侧链的大小。一般期待产生多肽特性最大改变的取代是如下的那些，其中(a)亲水残基例如丝氨酸或苏氨酸被疏水残基例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸被另一个残基取代；(c)具有正电性侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸被负电性残基例如谷氨酸或天冬氨酸取代；(d)具有庞大侧链的残基例如苯丙氨酸被没有侧链的一个残基例如甘氨酸取代； 或者(e)脯氨酸残基被引入或取代，这改变了肽键旋转自由的程度。
[0233] 变异体一般展现了相似性质的生物活性并将引发与天然存在的类似物相同的免疫反应，虽然也选择变异体按照需要修饰皮肤CS1蛋白的特征。或者，可以设计变异体使得CS1蛋白的生物活性被改变。例如，可以改变或去除糖基化位点。
[0234] CS1多肽的共价修饰也包括在本发明的领域之中。一个类型的共价修饰包括CS1多肽的靶向氨基酸残基与能与CS1多肽所选侧链或N或C末端残基反应的有机衍化剂的反应。如下面更加完全描述地，用双功能试剂的衍化是有用的，例如，在为了将CS1多肽与水溶性支持基质或表面交联以用于纯化抗CS1多肽抗体或筛选试验的方法中。通常使用的交联剂包括例如1，1-双(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，4-叠氮水杨酸的酯类、同型双功能亚胺酸酯，包括双琥珀酰亚胺酯例如3，3’-二硫基双(琥珀酰亚胺丙酸酯)、双功能马来酰亚胺酯例如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和例如甲基-3-((对-叠氮苯基)二硫代)丙酰亚胺酯的试剂。
[0235] 其它的修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基、脯氨酸和赖氨酸的羟化、丝氨酰、苏氨酰或酪氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的氨基的甲基化(例如，79-86页，Creighton(1992)蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structure and Molecular Properties)Freeman)、N-末端胺的乙酰化以及C-末端羧基的酰胺化。
[0236] 包括在本发明领域之内的CS1多肽另一个类型的共价修饰包含改变多肽天然糖基化模式。“改变天然糖基化模式”此处意在指删除一个或多个天然序列CS1多肽中发现的碳水化物部分和/或添加一个或多个天然序列CS1多肽中并不存在的糖基化位点。能用许多方法改变糖基化模 式。表达CS1相关序列的细胞类型不同能得到不同的糖基化模式。 [0237] 糖基化位点添加到CS1多肽也可以通过改变其氨基酸序列完成。改变例如可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加到天然序列CS1多肽(对于O-连接的糖基化位点)或将其取代来完成。CS1氨基酸序列可选地可以通过DNA水平的改变而改变，特别通过在预选碱基突变编码CS1多肽的DNA以至于产生将翻译成期望的氨基酸的密码子。
[0238] 增加CS1多肽上碳水化物部分的数量的其它手段是通过化学或酶将苷基与多肽偶联。见，例如WO 87/05330；Aplin和Wriston(1981)CRCCrit.Rev.Biochem259-306页。 [0239] 存在于CS1多肽上的碳水化物部分的去除可以用化学或酶方法或者通过取代编码作为糖基化靶点的氨基酸残基的密码子来完成。化学去糖基技术是适用的。见，例如 Sojar 和 Bahl(1987)Arch.Biochem.Biophys.259：52-57 以 及 Edge 等 (1981)Anal.Biochem.118：131-137。多肽上碳水化物的酶解能通过各种内或外切糖苷酶的使用来完成。
见，例如，Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.138：350-359。
见，例如，Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.138：350-359。
[0240] 另一类型的CS1多肽的共价修饰包含用美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中设置的方法将CS1多肽连接到例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧乙烯的各种非蛋白聚合物中的一个上。
[0241] 本发明的CS1多肽也可以用形成包含融合于另一个异源性多肽或氨基酸序列的CS1多肽的嵌合分子的方法进行修饰。一个实施方案中，这样的嵌合分子包含CS1多肽与标签多肽(tag polypeptide)的融合，该标签多肽提供了抗标记的抗体能选择性与其结合的表位。表位标签一般放在CS1多肽的氨基或羧基末端。能使用抗标签多肽的抗体检测这样 附加了表位的形式的CS1多肽的存在。并且，表位标签的提供使得S1多肽很容易通过使用抗标记抗体或与表位标签结合的另一类型亲和基质的亲和纯化进行纯化。可选的实施方案中，嵌合分子可以包含CS1多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合。对于二价形式的嵌合分子，这样的融合可以发生在IgG分子的Fc区域。
[0242] 各种标签多肽和它们各自的抗体是可以获得的。实例包括多组氨酸(多his)或多组氨酸-甘氨酸(多his-gly)标记；HIS6和金属螯合标记、流行性感冒HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等(1988)Mol.Cell.Biol.8：2159-2165)；c-myc标记和抗c-myc的
8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等(1985)Molecular and Cellular Biology5：
3610-3616)；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体(Paborsky等(1990)Protein Engineering 3(6)：547-553)。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp等(1988)BioTechnology
6：1204-1210)；KT3表位肽(Martin等(1992)Science 255：192-194)；微管蛋白表位
肽(Skinner等(1991)J.Biol.Chem.266：15163-15166)以及T7基因10蛋白肽标记
(Lutz-Freyermuth等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6393-6397)。
8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等(1985)Molecular and Cellular Biology5：
3610-3616)；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体(Paborsky等(1990)Protein Engineering 3(6)：547-553)。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp等(1988)BioTechnology
6：1204-1210)；KT3表位肽(Martin等(1992)Science 255：192-194)；微管蛋白表位
肽(Skinner等(1991)J.Biol.Chem.266：15163-15166)以及T7基因10蛋白肽标记
(Lutz-Freyermuth等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6393-6397)。
[0243] 也包括例如猩猩、cynos monkey和猕猴的其它生物体的CS1蛋白，按照下面描述地对它们进行克隆和表达。因而，探针或变性多聚酶链式反应(PCR)引物序列可以用于发现其它人或其它生物体的相关CS1蛋白。特别有用的探针和/或PCR引入序列包括CS1核酸序列的唯一区域。优选的PCR引物序列大约15-35个核苷酸长，大约20-30个是优选的，并且如果需要可以含有次黄嘌呤核苷。PCR反应的条件已有适当的描述(例如，Innis，PCR试验手册(PCR Protocols)，同上)。
[0244] 还包括的是被构建含有不同生物体氨基酸片段的嵌合CS1蛋白。例如，通过将人CS1的氨基酸1-67与小鼠CS1的氨基酸68-224融合或可 选地将人CS1的氨基酸1-151与小鼠CS1的氨基酸149-224融合或还可选地将人CS1的氨基酸1-169与小鼠CS1的氨基酸
167-224融合来构建嵌合CS1蛋白。相反，嵌合CS1蛋白也可以通过将小鼠CS1的氨基酸
1-67与人CS1的氨基酸68-227融合或可选地将小鼠CS1的氨基酸1-131与人CS1的氨基
酸135-227融合或还可选地将小鼠CS1的氨基酸1-166与人CS1的氨基酸170-227融合来
构建。
167-224融合来构建嵌合CS1蛋白。相反，嵌合CS1蛋白也可以通过将小鼠CS1的氨基酸
1-67与人CS1的氨基酸68-227融合或可选地将小鼠CS1的氨基酸1-131与人CS1的氨基
酸135-227融合或还可选地将小鼠CS1的氨基酸1-166与人CS1的氨基酸170-227融合来
构建。
[0245] 另外，能够制造比表2的核酸编码的那些长的CS1蛋白，例如，通过延伸序列的阐明、表位或纯化标记的添加、其他融合序列的添加等等。
[0246] CS1蛋白也可以鉴别为CS1核酸编码的。因而，如此处概述地，CS1由将杂交于序列列表的序列或它们的互补物的核酸编码。
[0247] CS1蛋白的结合伴侣
[0248] CS1抗体
[0249] 本发明CS1抗体特异性结合于CS1蛋白。此处“特异性结合”指的是抗体结合于蛋白质，有至少大约0.1mM的Kd，更加通常Kd在至少大约1μM，优选地至少大约0.1μM或更好，最优选地0.01μM或更好。结合于特异靶点而不是相关序列的选择性通常也是重要的。
[0250] 一个实施方案中，当CS1蛋白用于产生结合伴侣时，例如，用于免疫诊断的抗体，CS1蛋白应当与全长蛋白共有至少一个表位或决定簇。此处“表位”或“决定簇”在MHC的上下文中一般指的是将产生和/或结合抗体或T细胞受体的蛋白质的一部分。因而，多数情况下，针对更小CS1蛋白制造的抗体将能够结合于全长蛋白，特别是线性表位。另一个实施方案中，表位是唯一的；就是说针对唯一表位产生的抗体显示了很小的交叉反应性或没有。另一个实施方案中，表位选自表中列出的蛋 白质序列。
[0251] 制备多克隆抗体的方法是存在的(例如，Coligan，同上；以及Harlow和Lane，同上)。例如，通过一次或多次免疫剂如果期望的以及佐剂的注射能在哺乳动物中培养多克隆抗体。一般地，通过多次皮下或腹腔内注射给哺乳动物注射免疫剂和/或佐剂。免疫剂可以包括表2的核酸编码的蛋白质或其片段或其融合蛋白。将免疫剂与已知对要免疫的哺乳动物有免疫原性的蛋白的结合是有用的。这样的免疫原性蛋白质包括但不限于钥孔戚血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以采用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成海藻糖dicorynomycolate)。可以使用各种免疫接种的试验方案。
[0252] 或者，抗体可以是单克隆抗体。可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495描述的那些。杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物一般用免疫剂进行免疫以引发产生或能够产生将特异性结合于免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免疫淋巴细胞。免疫剂将一般包括表中核酸编码的多肽或其片段或其融合蛋白。一般，如果人来源的细胞是期望的就使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果非人的哺乳动物来源是期望的就使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(例如，Goding(1986)单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies：Principles andPractice)Academic Press中59-103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛或人来源的细胞。通常，采用大鼠或小鼠细胞系。杂交瘤细胞可以培养在合适的培养基中，培养基优选地含有一个或多个抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的物质。例如，如果母细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤培养基一般将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和脱氧胸腺嘧啶(“HAT 培养基”)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
[0253] 一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆的，优选地是人或人源化的，抗体具有对至少两个不同抗原的结合特异性或具有对相同抗原上两个表位的结合特异性。一个实施方案中，一个结合特异性是针对表中核酸编码的蛋白质或其片段，另一个结合特异性是针对另一个抗原，优选地针对细胞表面蛋白或受体或受体亚基，优选地一个是CS1特异性的。或者四聚体型技术可以产生多价试剂。
[0254] 另一个实施方案中，抗体具有低水平的岩藻糖或缺乏岩藻糖。缺乏岩藻糖的抗体与ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性增强相关，尤其在低剂量的抗体。Shields，R.L.等，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Shinkawa，T.等，(2003)，J.Biol.Chem.278：3466。制备更少岩藻糖的抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中的生长。
YB2/0细胞表达低水平的FUT8mRNA，它编码多肽岩藻糖基化必需的酶(1，6-墨角藻糖基转移酶)。
YB2/0细胞表达低水平的FUT8mRNA，它编码多肽岩藻糖基化必需的酶(1，6-墨角藻糖基转移酶)。
[0255] 增加ADDC活性可选的方法包括CS1抗体Fc部分的突变，特别是增加对Fc R受体的抗体亲和力的突变。使用靶向细胞毒性基于细胞的试验证实了Fc R结合的增加与突变的Fc之间的相关性。Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem 276：6591-6604；Presta等(2002)，BiochemSoc.Trans.30：487-490。通过特异性Fc区域突变增加ADCC活性的方法包括在选自如下的位点包含至少一个氨基酸取代的Fc变异体：234，235，239，240，241，243，244，245，247，262，263，264，265，266，267，269，296，297，298，299，313，325，327，328，329，
330和332，其中Fc区域中残基的编号是Kabat中EU索引的编号。优选的实施方案中，所述Fc变异体包含至少一个选自如下的取代：L234D，
330和332，其中Fc区域中残基的编号是Kabat中EU索引的编号。优选的实施方案中，所述Fc变异体包含至少一个选自如下的取代：L234D，
[0256] L234E，L234N，L234Q，L234T，L234H，L234Y，L234I，L234V，L234F，L235D，L235S， [0257] L235N，L235Q，L235T，L235H，L235Y，L235I，L235V，L235F，S239D，S239E，S239N， [0258] S239Q，S239F，S239T，S239H，S239Y，V240I，V240A，V240T，V240M，F241W，F241L， [0259] F241Y，F241E，F241R，F243W，F243L，F243Y，F243R，F243Q，P244H，P245A，P247V， [0260] P247G，V262I，V262A，V262T，V262E，V263I，V263A，V263T，V263M，V264L，V264I， [0261] V264W，V264T，V264R，V264F，V264M，V264Y，V264E，D265G，D265N，D265Q，D265Y， [0262] D265F，D265V，D265I，D265L，D265H，D265T，V266I，V266A，V266T，V266M，S267Q， [0263] S267L，E269H，E269Y，E269F，E269R，Y296E，Y296Q，Y296D，Y296N，Y296S，Y296T， [0264] Y296L，Y296I，Y296H，N297S，N297D，N297E，A298H，T299I，T299L，T299A，T299S， [0265] T299V，T299H，T299F，T299E，W313F，N325Q，N325L，N325I，N325D，N325E，N325A， [0266] N325T，N325V，N325H，A327N，A327L，L328M，L328D，L328E，L328N，L328Q，L328F， [0267] L328I，L328V，L328T，L328H，L328A，P329F，A330L，A330Y，A330V，A330I，A330F， [0268] A330R，A330H，I332D，I332E，I332N，I332Q，I332T，I332H，I332Y和I332A， [0269] 其中Fc区域中残基的编号是Kabat中EU索引的编号。Fc变异体也可以选自如下：
[0270] V264L，V264I，F241W，F241L，F243W，
[0271] F243L，F241L/F243L/V262I/V264I，F241W/F243W，F241W/F243W/V262A/V264A， [0272] F241L/V262I，F243L/V264I，F243L/V262I/V264W，F241Y/F243Y/V262T/V264T， [0273] F241E/F243R/V262E/V264R，F241E/F243Q/V262T/V264E，F241R/F243Q/V262T/V264R， [0274] F241E/F243Y/V262T/V264R，L328M，L328E，L328F，I332E，L3238M/I332E，P244H， [0275] P245A，P247V，W313F，P244H/P245A/P247V，P247G，V264I/I332E，
[0276] F241E/F243R/V262E/V264R/I332E，F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E，
[0277] F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E，F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E，S298A/I332E， [0278] S239E/I332E，S239Q/I332E，S239E，D265G，D265N，S239E/D265G，S239E/D265N， [0279] S239E/D265Q，Y296E，Y296Q，T299I，A327N，S267Q/A327S，S267L/A327S，A327L， [0280] P329F，A330L，A330Y，1332D，N297S，N297D，N297S/I332E，N297D/I332E，N297E/I332E， [0281] D265Y/N297D/I332E，D265Y/N297D/T299L/I332E，D265F/N297E/I332E，
[0282] L328I/I332E，L328Q/I332E，I332N，I332Q，V264T，V264F，V240I，V263I，V266I，T299A， [0283] T299S，T299V，N325Q，N325L，N325I，S239D，S239N，S239F，S239D/I332D，S239D/I332E， [0284] S239D/I332N，S239D/I332Q，S239E/I332D，S239E/I332N，S239E/I332Q，S239N/I332D， [0285] S239N/I332E，S239N/I332N，S239N/I332Q，S239Q/I332D，S239Q/I332N，S239Q/I332Q， [0286] Y296D，Y296N，F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E，A330Y/I332E，
[0287] V264I/A330Y/I332E，A330L/I332E，V264I/A330L/I332E，L234D，L234E，L234N，L234Q， [0288] L234T，L234H，L234Y，L234I，L234V，L234F，L235D，L235S，L235N，L235Q，L235T， [0289] L235H，L235Y，L235I，L235V，L235F，S239T，S239H，S239Y，V240A，V240T，V240M， [0290] V263A，V263T，V263M，V264M，V264Y，V266A，V266T，V266M，E269H，E269Y，E269F， [0291] E269R，Y296S，Y296T，Y296L，Y296I，A298H，T299H，A330V，A330I，A330F，A330R， [0292] A330H，N325D，N325E，N325A，N325T，N325V，N325H，L328D/I332E，L328E/I332E， [0293] L328N/I332E，L328Q/I332E，L328V/I332E，L328T/I332E，L328H/I332E，L328I/I332E， [0294] L328A，I332T，I332H，I332Y，I332A，S239E/V264I/I332E，S239Q/V264I/I332E， [0295] S239E/V264I/A330Y/I332E，S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E，S239D/N297D/I332E， [0296] S239E/N297D/I332E，S239D/D265V/N297D/I332E，S239D/D265I/N297D/I332E， [0297] S239D/D265L/N297D/I332E，S239D/D265F/N297D/I332E，S239D/D265Y/N297D/I332E， [0298] S239D/D265H/N297D/I332E，S239D/D265T/N297D/I332E，V264E/N297D/I332E， [0299] Y296D/N297D/I332E，Y296E/N297D/I332E，Y296N/N297D/I332E，Y296Q/N297D/I332E， [0300] Y296H/N297D/I332E，Y296T/N297D/I332E，N297D/T299V/I332E，N297D/T299I/I332E， [0301] N297D/T299L/I332E，N297D/T299F/I332E，N297D/T299H/I332E，N297D/T299E/I332E， [0302] N297D/A330Y/I332E，N297D/S298A/A330Y/I332E，
[0303] S239D/A330Y/I332E，S239N/A330Y/I332E，S239D/A330L/I332E，S239N/A330L/I332E， [0304] V264I/S298A/I332E，S239D/S298A/I332E，S239N/S298A/I332E，S239D/V264I/I332E， [0305] S239D/V264I/S298A/I332E，和S239D/264I/A330L/I332E，
[0306] 其中Fc区域中残基的编号是Kaba t中EU索引的编号。也见PCT WO 2004/029207，2004年4月8日，此处引入作用参考。
[0307] 通过上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放的测量能监测和定量分析抗体相关ADCC活性，受损伤时LDH很快地释放到浆膜。
[0308] 用抗体处理促进细胞毒性其它可选的实施方案包括导致抗体结合细胞细胞死亡的抗体介导的信号极联的刺激。另外(例如通过NK细胞)抗体介导的先天免疫系统的刺激也可以导致肿瘤细胞或病毒感染细胞的死亡。
[0309] 为了诊断应用CS1序列的检测
[0310] 一方面，测定自身免疫紊乱或癌性例如骨髓瘤表型中不同细胞状态的基因RNA表达水平。为了提供表达谱，评价了正常组织(例如，没有发生紊乱)中和患病组织(以及一些情况下，如下面概述地，对于与预后相关的紊乱的各种严重程度)中基因的表达水平。特定细胞状态或发育点的基因表达谱基本上是细胞状态的“指纹”。虽然两个状态具有相似表达的特定基因，许多基因的评价同时允许了反映细胞状态的基因表达谱的产生。通过比较不同状态中细胞的表达谱，获得了关于每一个这些状态中什么基因是重要的(包括基因的上调和下调)的信息。然后，可以进行或确认诊断以确定组织样品中是否具有正常或患病组织的基因表达谱。这将提供相关状态的分子诊断。
[0311] 此处使用的“差异表达”或语法等同物指的是细胞和组织之内和之中暂时的和/或细胞的基因表达模式中性质或数量差别。因而，差异表达基因能在数量上有表达的改变，包括例如正常与患病组织相比其中的 激活或失活。相对于另一个状态的特定状态下基因可以打开或关上因而允许两个或更多状态的比较。性质上调节的基因将展现通过标准技术可检测的状态或细胞类型之内的表达模式。一些基因将在一个状态或细
胞类型中表达，而不是在两个之中都表达。或者，表达的差异是定量的，例如，那个表达增加或降低；例如，基因表达上调导致转录物的量增加，或下调导致转录物的量减少。表达不同的程度只需要大到可以经由如下面概述的标准特征分析技术进行定量分析，例如通过Affymetrix (DNA微芯片矩阵)表达矩阵的使用。见，Lockhart(1996)
Nature Biotechnology 14：1675-1680。其它的技术包括但不限于定量逆转录酶PCR、北方分析和RNase保护。如上面概述地，优选地表达的改变(例如，上调或上调)是至少大约50％的，更加优选地至少大约100％，更加优选地至少大约150％，更加优选地至少大约
200％，从300至至少1000％是特别优选的。
胞类型中表达，而不是在两个之中都表达。或者，表达的差异是定量的，例如，那个表达增加或降低；例如，基因表达上调导致转录物的量增加，或下调导致转录物的量减少。表达不同的程度只需要大到可以经由如下面概述的标准特征分析技术进行定量分析，例如通过Affymetrix (DNA微芯片矩阵)表达矩阵的使用。见，Lockhart(1996)
Nature Biotechnology 14：1675-1680。其它的技术包括但不限于定量逆转录酶PCR、北方分析和RNase保护。如上面概述地，优选地表达的改变(例如，上调或上调)是至少大约50％的，更加优选地至少大约100％，更加优选地至少大约150％，更加优选地至少大约
200％，从300至至少1000％是特别优选的。
[0312] 评价可以在基因转录物或蛋白质的水平。使用针对基因转录物的RNA或DNA等同物的核酸探针可以监测基因表达的量，基因表达水平的定量或可选地最终基因产物本身能够用例如，抗CS1蛋白抗体和标准免疫试验(ELISA等)或其它技术，包括质谱分析试验、2D凝胶电泳试验等等进行监测。在疾病诊断测试中能够评价相应于CS1的蛋白，例如疾病表型中鉴别为重要的那些。另一个实施方案中，同时在许多基因上进行基因表达的监测。也能进行多个蛋白质表达的监测。
[0313] 这个实施方案中，为了特定细胞中CS1序列的检测和定量，如此处概述地CS1核酸探针附着于生物芯片。下面实例中还描述了试验。能使用PCR技术提供更高的敏感性。 [0314] 一个实施方案中检测了编码CS1的核酸。虽然可以检测编码CS1蛋白的DNA或RNA，特别感兴趣的是其中检测编码CS1的mRNA的方法。检测mRNA的探针是互补并杂交于mRNA的核苷酸/脱氧核苷酸探针，包括 但不限于寡核苷酸、cDNA或RNA。如此处定义地，探针也应当含有可检测的标记。一个方法中在将待检查的核酸固定在例如尼龙膜的固相支持物上并且探针与样品杂交之后检测mRNA。清洗去除非特异性结合的探针之后，检测所述标记。另一个方法中，原位进行mRNA的检测。这个方法中通透处理的细胞或组织样品与可检测的标记的核酸探针接触足够长时间以允许探针与靶mRNA杂交。清洗去除非特异性结合探针之后，检测所述标记。例如通过地高辛(digoxygenin)与抗地高辛的第二抗体检测互补于编码骨髓瘤蛋白的mRNA的地高辛标记的核糖探针(RNA探针)，并且用硝基四唑蓝和
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸显色。
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸显色。
[0315] 另一个实施方案中，诊断试验中使用此处描述的三个类型蛋白质(分泌的、跨膜的或细胞内蛋白质)的各种蛋白。诊断试验中使用CS 1蛋白、抗体、核酸、修饰蛋白和含有CS1序列的细胞。这个能在各个基因或相应多肽的水平进行。一个实施方案中，使用表达谱，优选地联合高通量筛选技术以允许监测表达谱基因和/或相应的多肽。
[0316] 如此处描述和定义地，发现了CS1蛋白作为自身免疫紊乱疾病标记物的用途，例如SLE、RA和IBD以及例如骨髓瘤和浆细胞白血病的癌性状态。另外，发现了CS1作为预后或诊断目的的标记物的用途。推测患病组织中这些蛋白的检测允许了这样的状态的检测、预后或诊断以及治疗策略的选择。一个实施方案中，使用抗体检测CS1。优选的方法通过凝胶上的电泳(一般地变性和还原蛋白凝胶，但是可以是另一个类型的凝胶，包括等电位聚焦电泳等等)将蛋白质从样品中分离。蛋白质分离之后，CS1例如通过用抗CS1抗体的免疫印记进行检测。
[0317] 另一个方法中，发现了CS1抗体在原位成像技术例如组织学中的用途。见，例如，Asai等(1993年版)细胞生物学中的方法：细胞生物学中的抗体(Methods in Cell Biology：Antibodies in Cell Biology)(第37卷)Academic Press。这个方法中，细胞与一至多个抗骨髓瘤 蛋白抗体接触。清洗去除非特异性抗体的结合之后，检测抗体或多个抗体的存在。一个实施方案中抗体通过与含有可检测标记的第二抗体孵育进行检测。另一个方法中CS1的第一抗体含有可检测的标记，例如能作用于底物的酶标记物。另一个实施方案中多个第一抗体每一个都含有不同的和可检测的标记。发现了这个方法在同时筛选CS1和前述状态其它标记物的特别用途。本发明也提供了许多其它地组织学成像技术。
[0318] 一个实施方案中在荧光计中检测标记物，所述荧光计具有检测和分辨不同波长的发射光。另外，方法中能使用荧光激活细胞分拣器(FACS)。
[0319] 另一个实施方案中，发现了抗体从血液、血清、血浆、粪便及其它样品诊断自身免疫紊乱，例如SLE、RA和IBD以及例如骨髓瘤和浆细胞白血病的癌症的用途。这样的样品因而作为将用探针检测或测试CS1的存在的样品是有用的。通过前面描述的免疫试验技术包括ELISA、免疫印记(西方印记)、免疫沉淀、BIACORE技术等等，抗体能用于检测CS1。相反地，抗体的存在指出了抗内源性CS1蛋白的免疫反应。
[0320] 另一个实施方案中，完成了标记CS1核酸探针与组织矩阵的原位杂交。例如，制造了包括患病组织和/或正常组织的组织样品的矩阵。然后进行原位杂交(见，例如Ausubel，同上)。当比较个体和标准之间的指纹，诊断、预后或预测可以基于这些发现。还可理解指示诊断的基因与指示预后的那些不同，细胞状态的分子谱导致反应的或难治的状态之间的差别或者可以预言结果。
[0321] 一个实施方案中，预后试验中使用了CS1蛋白、抗体、核酸、修饰蛋白和含有CS1序列的细胞。如上，就长期预后而言，能产生与疾病状态、临床、病理或其它信息相关联的基因表达谱。此外，这个使用优选的基因可以在蛋白或基因水平上完成。一个或多个基因在各种联合中是有用的。如上，为了组织或患者中CS1序列的检测和定量，CS1探针可 以附着于生物芯片。如上概述地进行诊断的试验。PCR方法可以提供更加敏感和准确的定量。 [0322] 预后试验中有用的基因是根据患者疾病阶段差异表达的基因。一个实施方案中，基因根据患者的阶段可以唯一表达。另一个实施方案中，基因根据患者的阶段可以不同水平表达。例如，骨髓瘤中，根据疾病的程度和位置患者有三个不同的阶段：I、II和III期。I期中，症状是轻微的到不存在的，有许多患者没有显示骨髓瘤的症状。阳性诊断是肿瘤细胞的存在；然而，红血细胞的数量是正常的或稍微低于正常范围，没有检测到血钙的升高，血或尿中有非常低水平的M蛋白，X射线没有检测到骨损伤。II期中，癌细胞占优势，有更高数量。肾功能受影响，这使得多数患者的预后性诊断变得更坏。III期发生了贫血、高血钙、晚期骨损伤以及血和尿中高水平的M蛋白。蛋白质表达与自身免疫紊乱不同阶段的相关性也被证实对于确定这样的紊乱的预后是有用的。表达在不同阶段的基因的相关性，根据阶段不管是唯一表达或具有差异表达水平，都可以用于确定诱导患者缓和的能力。这将在疾病的较早阶段特别有用，该阶段骨髓瘤患者展现了很少的症状。另外，其表达指出了长期并发症开始的基因例如β-2微球蛋白(肾损伤的指标)以及高水平的血清白蛋白和乳
酸脱氢酶也可用作预后工具。
酸脱氢酶也可用作预后工具。
[0323] 使用本发明公开的治疗法，可以监测不同阶段表达的基因的相关性以确定治疗的效力，该基因根据疾病阶段唯一表达或具有差异表达水平。例如，通过监测标记物包括例如CS1或CS1与紊乱特异性标记物联合，可以监测用本发明的拮抗剂治疗的患者所述拮抗剂的治疗效力(例如，对于骨髓瘤治疗M蛋白的监测)。这些特异性标记物的监测对于确定治疗性发明的效力以及确定本发明不同适应症治疗考虑的剂量和方法是重要的。
[0324] 疾病紊乱的诱导作为体内模型系统
[0325] 炎性肠病
[0326] 为了调查炎性肠病的病理过程发展了实验性体内模型。Sartor RB，Aliment.Pharmacol.Ther.11：89-96(1997)。例如，能够制造敲除转基因小鼠，其中炎性肠病基因被破坏或其中插入炎性肠病基因。通过将标记物基因或其它异源性基因经由同源重组插入到小鼠基因组内源性炎性肠病基因位点能够制造敲除转基因小鼠。也能通过用突变版本的炎性肠病基因替代内源性炎性肠病基因，或通过例如暴露于致癌物来突变内源性炎性肠病基因也可以制造这样的小鼠。
[0327] 将DNA构建体引入胚胎干细胞的核内。将含有新设计的遗传损坏的细胞注射到宿主小鼠胚胎，将它重新种植到受体雌性小鼠。这些胚胎中的一些发展为拥有部分源于突变细胞系的生殖细胞的嵌合小鼠。因此，通过繁殖嵌合小鼠，获得含有所引入的遗传损伤的新系小鼠是可能的(见，例如，Capecchi等(1989)Science 244：1288-1292)。根据Hogan等(1988)处理小鼠胚胎：实验室手册(Manipulating the Mouse Embryo：ALaboratory Manual)CSH Press以及Robertson(1987年版)畸胎癌和胚胎干细胞：实践方法(Teratocarcinomas and Embryonic StemCells：A Practical Approach)IRL Press，Washington，D.C.能够派生出嵌合靶向小鼠。
[0328] 使用非遗传处理的动物模型能够构建其它的模型。特别是一个模型已经广泛用于小分子的筛选。这个模型通过半抗原2，4-三硝基苯基磺酸(TNBS)溶液单个克隆
内激发诱导大鼠或小鼠大肠炎。Morris GP等，Gastroenterology 96：795-803(1989)；
Boughton-Smith NK，Br.J.Pharmacol.94：65-72(1988)。TNBS处理产生了强烈的局部炎症应答，2至3天后应答达其最低点，并且根据激发的严重程度能够持续至多达21天。
内激发诱导大鼠或小鼠大肠炎。Morris GP等，Gastroenterology 96：795-803(1989)；
Boughton-Smith NK，Br.J.Pharmacol.94：65-72(1988)。TNBS处理产生了强烈的局部炎症应答，2至3天后应答达其最低点，并且根据激发的严重程度能够持续至多达21天。
[0329] TNBS处理产生的炎症应答被认为再现了局限性肠炎的许多肉眼可见的、组织学和免疫学标志。Grisham MB等，Gastroenterology101：540-547(1991)；Yamada Y等，Gastroenterology 102：524-534(1992)；Torres MI等，Dig.Dis.Sci 44：2523-29(1999)；NeruathM，Fuss I，Strober W，Int.Rev.Immunol.19：51-62(2000)。观察到了开放性溃疡以及透壁炎症和肠壁的增厚。组织学特性包括变形的小囊结构、小囊萎缩、肉芽肿、巨细胞、基底集合淋巴结和炎性浸润的存在。
[0330] 这个模型用于研究和验证结肠炎症，阐明炎性肠病的各方面。Hoffman P等，Gut 41：195-202(1997)；Jacobson K，McHugh K，CollinsSM，Gastroenterology 112：156-62(1997)。
[0331] 其它动物模型包括HLA-B27转基因大鼠(Hammer RE等，表达HLA-B27和人b2M的转基因大鼠自发炎性疾病：HLA-B27相关的人类紊乱的动物模型(Spontaneous
inflammatory disease in transgenicrats expressing HLA-B27and Human b2M：An animal model of HLA-B27associated human disorders)，Cell 63：1088-1112(1990))、转基因IL-2缺失小鼠(Baumgart DC等，白细胞介素2缺失小鼠肠上皮细胞损伤和大肠炎的机制(Mechansisms of intestinal epithelial cellinjury and colitis in interleuk in
2 deficient mice)，Cell Immunol.187：52-66(1998))、mdrla缺失小鼠(Panwala CM等，炎性肠病的新模型：缺失多药耐药基因mdrla的小鼠自发性地形成大肠炎(A NovelModel of Inflammatory Bowel Disease：Mice deficient for themultiple drug resistance gene，mdrla，spontaneously developcolitis)，J.Immunol.161：5733-44(1998)) 以 及IL10缺失小鼠(Freeman HJ，对大肠炎动物模型白细胞介素-10的研究(Studies onthe interleukin-10 gene in animal models of colitis)，CanadianGastroenterology(200
3))。
inflammatory disease in transgenicrats expressing HLA-B27and Human b2M：An animal model of HLA-B27associated human disorders)，Cell 63：1088-1112(1990))、转基因IL-2缺失小鼠(Baumgart DC等，白细胞介素2缺失小鼠肠上皮细胞损伤和大肠炎的机制(Mechansisms of intestinal epithelial cellinjury and colitis in interleuk in
2 deficient mice)，Cell Immunol.187：52-66(1998))、mdrla缺失小鼠(Panwala CM等，炎性肠病的新模型：缺失多药耐药基因mdrla的小鼠自发性地形成大肠炎(A NovelModel of Inflammatory Bowel Disease：Mice deficient for themultiple drug resistance gene，mdrla，spontaneously developcolitis)，J.Immunol.161：5733-44(1998)) 以 及IL10缺失小鼠(Freeman HJ，对大肠炎动物模型白细胞介素-10的研究(Studies onthe interleukin-10 gene in animal models of colitis)，CanadianGastroenterology(200
3))。
[0332] 骨髓瘤
[0333] 为了调查骨髓瘤的病理过程，开发了实验性体内模型。Sartor RB，Aliment.Pharmacol.Ther.11：89-96(1997)。例如，能够制造敲除转基因小鼠，其中骨髓瘤基因被破坏或其中插入了骨髓瘤基因。通过将标记物基因或其它异源性基因经由同源重组插入到小鼠基因组内内源性骨髓瘤基因位点能够制造敲除转基因小鼠。也能通过用突变版本的骨髓瘤基因取代内源性骨髓瘤基因或例如通过暴露于致癌物来突变内源骨髓瘤基因制造这样的小鼠。
[0334] 将DNA构建体引入胚胎干细胞的核内。将含有新设计的遗传损伤的细胞注射到宿主小鼠胚胎，将它重新种植到受体雌性小鼠。这些胚胎中的一些发展为拥有部分源自突变细胞系的生殖细胞的嵌合小鼠。因此，通过繁殖嵌合小鼠，获得含有所引入的遗传损伤的新系小鼠是可能的(见，例如Capecchi等(1989)Science 244：1288-1292)。根据Hogan等(1988)处理小鼠胚胎：实验室手册CSH Press；以及Robertson(1987年版)畸胎癌和胚胎干细胞：实践方法IRL Press，Washington，D.C.，能够派生嵌合靶向小鼠。
[0335] 使用动物模型的非遗传处理能构建其它模型。例如，将B细胞瘤(例如LLC细胞)注射到C57BL/6J小鼠能够诱导肺转移。其它动物模型采用SCID小鼠并注射B细胞瘤系(例如HsSultan细胞(ATCC)或多发性骨髓瘤系(例如但不限于L363、LP-1、OPM-2或RPMI
8226)以诱导骨髓瘤样特征。然而其它的动物模型包括通过NOD/SCID小鼠皮下位点接种人胚胎骨(FB)产生的人多发性骨髓瘤的NOD/SCID小鼠模型，之后将得自有多发性骨髓瘤患者的原发性骨髓单核细胞接种到FB。见Shang-Yi H.等，Amer.J.Inyest.Pathol.164：
747-756(2004)。也可以使用通过异十八烷油(2，6，10，12-四甲基戊烷)处理诱导形成的小鼠原生细胞模型。也可以使用鼠原生细胞模型，它的形成是通过异十八 烷油(2，6，10，
12-四甲基戊烷)处理诱导的。另外，也可以使用骨髓瘤细胞直接注射到SCID、SCID/beige或NOD/SCID小鼠(正位注射模型)的骨髓内的小鼠模型。
8226)以诱导骨髓瘤样特征。然而其它的动物模型包括通过NOD/SCID小鼠皮下位点接种人胚胎骨(FB)产生的人多发性骨髓瘤的NOD/SCID小鼠模型，之后将得自有多发性骨髓瘤患者的原发性骨髓单核细胞接种到FB。见Shang-Yi H.等，Amer.J.Inyest.Pathol.164：
747-756(2004)。也可以使用通过异十八烷油(2，6，10，12-四甲基戊烷)处理诱导形成的小鼠原生细胞模型。也可以使用鼠原生细胞模型，它的形成是通过异十八 烷油(2，6，10，
12-四甲基戊烷)处理诱导的。另外，也可以使用骨髓瘤细胞直接注射到SCID、SCID/beige或NOD/SCID小鼠(正位注射模型)的骨髓内的小鼠模型。
[0336] 进行了如骨髓瘤细胞中的转化的细胞释放比它们正常的复本增加量的某些因子(以上“骨髓瘤特异性标记物)。例如，CD38、CD9、CD10、HLA-DR和CD20在骨髓瘤细胞中表达增加。Ruiz-Arugelles GJ和SanMiguelJF，多发性骨髓瘤中的细胞表面标记物(Cell Surface Markersin Multiple Myeloma)，Mayo Clin.Proc.69：684-90(1994)。
[0337] Freshney(1998)，同上中描述了测量这些因子的释放的各种技术。也见，Unkeless等 (1974)J.Biol.Chem.249：4295-4305；Strickland 和 Beers(1976)J.Biol.Chem.251：5694-5702；′Whur等(1980)Br.J.Cancer 42：305-312；Gullino“血管生成、肿瘤血管化以及肿瘤生长可能的干扰(″Angiogenesis，tumor vascularization，andpotential interference with tumor growth″)178-184页，Mihich(1985年)癌症充满(plenum)
的生物反应(Biological Responses inCancer Plenum)；Freshney(1985)Cancer Res.5：
111-130。
的生物反应(Biological Responses inCancer Plenum)；Freshney(1985)Cancer Res.5：
111-130。
[0338] 治疗方法
[0339] 自身免疫疾病治疗
[0340] 一方面，本法明涉及降低白细胞增生、粘附、分化、激活和/或共激活的方法，包含白细胞与此处描述的CS1拮抗剂接触。
[0341] 另一方面，本法明涉及降低淋巴细胞(例如B细胞)免疫球蛋白的分泌(或产生)的方法，包含淋巴细胞与此处描述的CS1拮抗剂的接触。本发明的拮抗剂能至少降低免疫球蛋白(例如，IgM、IgG、IgD、IgA 和IgE)产生的5％、10％、20％、30％、40％或50％。通过第一次抗体给予之前的免疫球蛋白浓度减去给药后(第X天)免疫球蛋白浓度然后除于第一次给予前免疫球蛋白浓度(第0天)并乘以100来计算改变百分比，例如[(第X天-第0天)/第0天]X100。
[0342] 另一方面，本发明涉及诱导表达CS1细胞凋亡或细胞溶解的方法，包含细胞与抗此处描述的CS1的抗体接触。优选的实施方案中，经由抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)获得诱导。一般，本发明的抗体在效应细胞(例如天然杀伤细胞或巨噬细胞)的存在下与靶细胞(表达CS1的细胞)表面上的抗原结合。效应细胞上Fc受体识别结合的抗体。Fc受体的交联给效应细胞发信号以通过细胞溶解或凋亡杀死靶细胞。经由标记或乳酸脱氢酶丛裂解细胞中释放的检测或靶细胞存活降低的检测(例如膜联蛋白试验)能够检测细胞溶解。末端脱氧核苷酸转移酶介导的洋地黄毒苷-11-dUTP缺口末端标记(TUNEL)试验(Lazebnik等，Nature：371，346(1994))可以进行凋亡的测定。细胞毒性也可以通过本领域已知的检测试剂盒直接检测，例如Roche Applied Science(Indianapolis，IN)的细胞毒性检测试剂盒。优选地，本发明的抗体诱导了靶细胞至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或80％的细胞毒性。用实例中公开的方法计算百分比。
[0343] 拮抗剂体外(例如，通过将拮抗剂加到培养白细胞的细胞培养环境中)、离体或体内(例如，通过给予研究对象拮抗剂)能与白细胞接触。
[0344] 优选的实施方案中，白细胞是a)激活的淋巴细胞，例如B细胞和/或T细胞，优选+ + +地CD19B细胞和/或CD3T细胞；b)CD14 激活的和/或幼稚细胞；c)激活的和/或未激活
+
的树状突细胞；和/或c)CD56NK和/或NKT细胞。
+
的树状突细胞；和/或c)CD56NK和/或NKT细胞。
[0345] 在优选方面，本发明提供了降低需要它的研究对象中B细胞免疫球 蛋白的分泌的方法，包含给予所述研究对象有效量的CS1的拮抗剂。
[0346] 在另一个优选方面，本发明提供了诱导需要它的研究对象中表达CS1的细胞的细胞毒性、细胞溶解和/或凋亡的方法，包含给予所述研究对象有效量的CS1的抗体。
[0347] 拮抗剂(优选地本发明的抗体)能够用于自身免疫疾病的预防或治疗，所述疾病包括但不限于阿狄森综合征、耳自身免疫疾病、例如葡萄膜炎的眼睛自身免疫疾病、自身免疫肝炎、克隆氏病、糖尿病(I型)、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯氏病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、重症肌无力、寻常天疱疮、牛皮癣、类风湿性关节炎(RA)、肉状瘤病、硬皮病、牛皮癣、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病、甲状腺炎、溃疡性结肠炎和/或血管炎。
[0348] 优选的实施方案中，能用本发明的方法预防和/或治疗的自身免疫疾病是SLE、RA或IBD。已经呈现了SLE、RA或IBD症状的研究对象给药后，抗CS1抗体应当能够降低症状的严重程度。或者，在研究对象呈现SLE、RA或IBD任何临床表现之前给予研究对象抗CS1抗体。这样的抗体的预防给药应当完全阻止研究对象呈现任何SLE、RA或IBD症状或者至少阻止了研究对象呈现象没有用抗体治疗的状态一样严重的症状。通过本领域已知的SLE、RA或IBD标准临床试验能够测量SLE、RA或IBD症状的严重程度，例如抗DNA抗体的血清水平、蛋白尿和患者的死亡率。
[0349] 治疗方法通常应用于人类患者但是也可以应用于其它哺乳动物。
[0350] 癌症治疗
[0351] 降低骨髓瘤细胞增生的治疗方法也包括在内，包含将骨髓瘤细胞与骨髓瘤蛋白的拮抗剂接触，优选地抗体或其它拮抗剂，例如此处描述的 CS1抗体。例如，抗体能与骨髓瘤细胞体外(例如，通过将拮抗剂加到培养骨髓瘤细胞的细胞培养环境中)、离体或体内(例如，通过将拮抗剂给予研究对象)接触。另一方面，本发明提供了降低骨髓瘤细胞增生的方法，包含给予所述研究对象有效量的骨髓瘤蛋白的拮抗剂。
[0352] 一方面，拮抗剂优选的本发明的抗体能用于骨髓瘤的预防或治疗。给予已经呈现了骨髓瘤症状的研究对象抗体或拮抗剂后，应当能够降低症状的严重度。或者，本发明的抗体能在研究对象呈现任何骨髓瘤临床表现之前给予研究对象。通过本领域已知的骨髓瘤标准临床测试能够测量骨髓瘤症状的严重程度，例如骨密度X射线分析、β-2-微球蛋白水平或高钙血症。治疗方法通常应用于人类患者但是也可以应用于其它的哺乳动物。
[0353] 另一方面，本发明涉及诱导表达CS1的细胞的凋亡或细胞溶解的方法，包含细胞与此处描述的抗CS1抗体接触。优选的实施方案中，经由抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)获得诱导。一般，本发明的抗体在效应细胞存在下(例如天然杀伤细胞或巨噬细胞)与靶细胞(表达CS1的细胞)表面上的抗原结合。效应细胞上的Fc受体识别结合的抗体。Fc受体的交联给效应细胞发信号以通过细胞溶解或凋亡杀死靶细胞。经由标记或乳酸脱氢酶从裂解细胞中释放的检测或靶细胞存活降低的检测(例如膜联蛋白试验)能够检测细胞溶解。末端脱氧核苷酸转移酶介导的洋地黄毒苷-11-dUTP缺口末端标记(TUNEL)试验(Lazebnik等，Nature：371，346(1994))可以进行凋亡的测试。细胞毒性也可以通过本领域已知的检测试剂盒直接检测，例如Roche Applied Science(Indianapolis，IN)的细胞毒性检测试剂盒。优选地，本发明的抗体诱导了靶细胞至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或
80％的细胞毒性。通过实例中公开的方法计算百分比。
80％的细胞毒性。通过实例中公开的方法计算百分比。
[0354] 拮抗剂也能与白细胞体外(例如，通过将拮抗剂加到培养白细胞的 细胞培养环境中)、离体或体内(例如，通过将拮抗剂给予研究对象)接触。
[0355] 优选的实施方案中，白细胞是a)激活的淋巴细胞，例如B细胞和/或T细胞，优选+ + +地CD19B细胞和/或CD3T细胞；b)CD14 激活的和/或幼稚细胞；c)激活的和/或未激活
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的树状突细胞；和/或c)CD56NK和/或NKT细胞。
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的树状突细胞；和/或c)CD56NK和/或NKT细胞。
[0356] 在优选方面，本发明提供了降低需要它的研究对象中B细胞免疫球蛋白的分泌的方法，包含给予所述研究对象有效量的CS1的拮抗剂。B细胞这样的免疫球蛋白分泌的降低也帮助缓解骨髓瘤的并发症，包括高粘性综合征。
[0357] 另一优选方面，本发明提供了诱导需要它的研究对象中表达CS1的细胞的细胞毒性、细胞溶解和/或凋亡，包含给予所述研究对象有效量的CS1的抗体。
[0358] 治疗剂的给予
[0359] 有各种给予拮抗剂例如本发明抗体的方法。非胃肠道给药是优选的。抗体可以一次性或通过一段时间的连续输注由静脉或通过肌肉内、皮下、腹膜内或脑脊髓内途径给予患者。口腔、局部、吸入途径或本领域技术人员已知的其它给药方法也包括在本发明中。 [0360] 本发明的药物组合物通常包含拮抗剂(例如，抗体)的溶液或其溶于可接受载体优选地水相载体的混合物(鸡尾酒)。能使用各种水相载体，例如，注射用水(WFI)或用磷酸盐、枸橼酸盐、乙酸盐等等缓冲的pH一般在5.0至8.0最通常地6.0至7.0的水和/或含有例如氯化钠、氯化钾等等盐使其等渗的水。载体也能含有保护活性蛋白的例如人血清白蛋白、聚山梨醇酯80、糖或氨基酸的赋形剂。这些制剂中拮抗剂(例 如，抗体)的浓度非常不同，从大约0.1至100mg/ml，但是通常在1至10mg/ml的范围。按配方制造的单克隆抗体特别适合于非胃肠道给药，并且能静脉输注或通过皮下、肌肉内、静脉内注射给予。
制备非胃肠道给予的组合物的实际方法是已知的或对于本领域技术人员是明显的，在例如Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，
1980)中有更详细地描述，此处引入作为参考。本发明提供了包含此处描述的任何一个抗体的药物组合物。
制备非胃肠道给予的组合物的实际方法是已知的或对于本领域技术人员是明显的，在例如Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，
1980)中有更详细地描述，此处引入作为参考。本发明提供了包含此处描述的任何一个抗体的药物组合物。
[0361] 为了预防性和/或治疗性疗法能够给予组合物，包含抑制CS1及其细胞底物之间的相互作用、抑制患病细胞的粘附或者阻止和/或降低上述紊乱的临床症状。足够达到这些期望效果中任何一个的量定义为“有效量”。抗体能单次或多次给药递送给患者。 [0362] 为了疾病治疗的目的，拮抗剂(例如，抗体)的合适剂量将依赖于疾病的严重程度和病程、患者临床病史和反应、抗体的毒性以及主治医师的判定。拮抗剂适当地可一次性或通过一连串的治疗给予患者。可以给予患者最初候选剂量。通过使用本领域技术人员已知的常规技术监测治疗的进展能够确立合适的剂量和治疗方案。
[0363] 另外，拮抗剂(例如，抗体)能以基本纯化形式单独地或与本领技术人员已知的自身免疫疾病的治疗剂一起应用。可以与用抗体的治疗联合使用的其它的疗法包括抗反义核酸分子或生物制品的给予，例如另外的治疗抗体。因而，本发明的治疗以允许其连续或与另一个自身免疫疾病的治疗剂联合的方式制成制剂。为了治疗自身免疫紊乱和骨髓瘤，抗体将通常在一个或多个其它免疫抑制药物和免疫调节剂之后或与其联合给予。
[0364] 诊断和/或预后应用用途的试剂盒
[0365] 为了用于上面建议的诊断和研究应用，本发明也提供了试剂盒。诊 断和研究的应用中，这样的试剂盒可以包括至少下面中的一个：试验试剂、缓冲剂、CS1特异性核酸或抗体、杂交探针和/或引物、反义多核苷酸、核酶、显性负相CS1多肽或多核苷酸、CS1相关序列的小分子抑制剂等。
[0366] 另外，试剂盒可以包括含有执行本发明的方法的技术说明书的指导性材料(例如，试验方案)。虽然指导材料一般包含书面的或打印的材料，它们并不限于这些。本发明考虑了能够储存这样的技术说明书并与最终用户交流的媒介。这样的媒介包括但不限于电子储存媒介(例如，磁碟、磁带、盒式磁带、芯片)、光学媒介(例如，CD ROM)等等。这样的媒介也包括提供这样的指导性材料的互联网地址。
[0367] 本发明也提供了筛选CS1相关序列的调节剂的试剂盒。从很容易获得的材料和试剂能够制备这样的试剂盒。例如，这样的试剂盒能包含一个或多个下列材料：CS1相关多肽或多核苷酸、反应试管和测试CS1相关活性的技术说明书。可选地，试剂盒含有生物活性CS1蛋白。根据本发明，依赖于试剂盒预期的用户和用户的特定需要能制备各种各样的试剂盒和组分。诊断将一般地包括多个基因或产物的评价。一般将基于与从历史或结果数据中鉴别的疾病中重要参数的相关性来选择基因。
[0368] 实施例
[0369] 实施例1：CS1的分离和鉴别
[0370] CS1从正常健康成人外周血的B细胞亚群(幼稚与记忆+浆B细胞)的cDNA差减文库(subtraction library)中鉴别。CS1优选地在记忆和浆B细胞中表达。遵循下面描述的试验方案产生差减文库：
[0371] B细胞亚群的分离：
[0372] 用标准聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)梯度从九个健康成人供者分离外周血单核细胞(PBMC)。遵循标准的负选择试验方案从PBMC中分离B细胞。PBMC与纯化的小鼠抗人CD2、CD3、CD4、CD14、CD16、CD56、CD66和血型糖蛋白A的抗体鸡尾酒孵育。孵育和清洗后，加入羊抗小鼠磁性Dynal珠，每个细胞7-10个小珠。随后，用标准Dynal磁性支架分离抗体结合的细胞而将富集的B细胞留在上清中。然后用RPMI+10％胎牛血清(FBS)清洗所收集的上清。
[0373] B细胞亚群(幼稚与记忆+浆B细胞)的分拣：
[0374] 遵循标准的染色试验方案用IgD-FITC、CD38-cychrome、CD19-APC和CD27-PE染色Dynal富集的B细胞。在MoFlo高性能流式细胞仪-MLS上分拣幼稚B细胞
+ + int/- - - + int/+ +
(IgDCD19CD38 CD27)和记忆和浆B细胞(IgDCD19CD38 CD27)两个分开的细胞群，
细胞仪装备了光谱物理空气冷却氩激光器(488nm)和635nm二极管激光器和用于FITC在
530/40nm、PE在580/30nm、APC在670/20nm以及cychrome(PE-Cy5)在670/30nm的检测的滤片。在MoFlo细胞仪上分析分拣的B细胞的纯度并且发现97％(记忆和浆B细胞)和
98％(幼稚B细胞)的纯度。分拣的细胞置于Trizol中并储存在-70℃。
+ + int/- - - + int/+ +
(IgDCD19CD38 CD27)和记忆和浆B细胞(IgDCD19CD38 CD27)两个分开的细胞群，
细胞仪装备了光谱物理空气冷却氩激光器(488nm)和635nm二极管激光器和用于FITC在
530/40nm、PE在580/30nm、APC在670/20nm以及cychrome(PE-Cy5)在670/30nm的检测的滤片。在MoFlo细胞仪上分析分拣的B细胞的纯度并且发现97％(记忆和浆B细胞)和
98％(幼稚B细胞)的纯度。分拣的细胞置于Trizol中并储存在-70℃。
[0375] cDNA文库的产生：
[0376] 使用标准表象差异分析减除杂交试验方案从分拣的B细胞亚群制造cDNA差减文库。差减文库包括两次减去幼稚cDNA的记忆+浆B细胞cDNA文库和两次减去记忆+浆cDNA的幼稚B细胞cDNA文库。用标准分子生物学技术，将cDNA差减文库连接到标准质粒载体并转化到电感受态大肠杆菌(DH-10B)细胞中。转化的大肠杆菌细胞接种到有选择抗生素存在的LB琼脂平板上。使用标准克隆PCR扩增每一个代表一个特异性插入的单个细菌克隆。
[0377] 筛选并证实差异表达：
[0378] 变性cDNA差减文库插入物并点到2个相同的尼龙网上并分别于两个不同标记的变性探针杂交(记忆+浆)-幼稚cDNA(两次减去)和幼稚-(记忆+浆)cDNA(两次减去)。如果插入物选择性地优先杂交于两个探针中的一个就认为差减文库cDNA插入物是阳性。
CS1的cDNA克隆优选地杂交于(记忆+浆)-幼稚cDNA探针(两次减去)。
CS1的cDNA克隆优选地杂交于(记忆+浆)-幼稚cDNA探针(两次减去)。
[0379] CS1的鉴别：
[0380] 生长用阳性克隆转化的细菌细胞，用 Mini-Prep试剂盒(体外诊断制品)遵循厂商的实验方案(Qiagen，Valencia，California)分离DNA。纯化的质粒进行测序，搜索NCBI数据库确定DNA序列的身份。
[0381] CS1基因表达的特征分析和证实：斑点印记分析证实了所选的阳性克隆包括CS1的优先表达。从分拣的幼稚与记忆+浆B细胞分离的等量的(未减去的)cDNA(20ng)点样到尼龙网上并为了阳性克隆与标记的cDNA插入物杂交。对于这些试验，从得自2个分离分捡物(n＝9个健康成人和n＝10个健康成人，纯度分别＞97％和＞98％)的外周血B细
胞亚群合成cDNA。清洗尼龙网并通过放射自显影法检测来自杂交探针的信号。如果cDNA在两套分拣的幼稚与记忆+浆B细胞中优选地杂交于记忆+浆B细胞cDNA，就考虑克隆是
阳性的。数据指出CS1主要表达于浆和记忆B细胞。
胞亚群合成cDNA。清洗尼龙网并通过放射自显影法检测来自杂交探针的信号。如果cDNA在两套分拣的幼稚与记忆+浆B细胞中优选地杂交于记忆+浆B细胞cDNA，就考虑克隆是
阳性的。数据指出CS1主要表达于浆和记忆B细胞。
[0382] CS1主要表达在淋巴组织：
[0383] 从由多腺苷酸RNA合成的cDNA制备斑点印迹，这从Clontech(PaloAlto，California)购买并从下列组织中制成：脾、淋巴结、骨髓、小 肠、脑、肺、骨骼肌、心脏、肾和肝。遵循厂商的推荐(Boehringer-Mannheim DIG试剂盒)用地高辛(DIG)标记的CS1DNA探针检测斑点印迹并通过化学发光(碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体和CDP-星)显色。结果指出CS1主要表达于淋巴组织(脾、淋巴结、骨髓和小肠一一可能由于派尔淋巴结(Peyer’s patches)中残留的淋巴细胞)，并且在其它非淋巴器官(脑、肺、骨骼肌、心脏、肾和肝)不存在或很低。
[0384] 实施例2：CS1的差异表达
[0385] 人细胞：
[0386] 从标准聚蔗糖-泛影葡胺梯度的分离获得外周血单核细胞(PBMC)。然后将分离6
的PBMC悬浮于新鲜培养基，2x10 个细胞/ml。用在3μg/ml浓度的植物凝血素(PHA)刺
激PBMC 3天或用在10μg/ml浓度的美洲商陆有丝分裂原(PWN)刺激8天。未刺激的对照
PBMC是不用任何刺激制备的。细胞在37℃7％CO2培养于有10％FBS、青霉素、链霉素和葡萄糖添加剂的RPMI培养基中。
的PBMC悬浮于新鲜培养基，2x10 个细胞/ml。用在3μg/ml浓度的植物凝血素(PHA)刺
激PBMC 3天或用在10μg/ml浓度的美洲商陆有丝分裂原(PWN)刺激8天。未刺激的对照
PBMC是不用任何刺激制备的。细胞在37℃7％CO2培养于有10％FBS、青霉素、链霉素和葡萄糖添加剂的RPMI培养基中。
[0387] 小鼠细胞：
[0388] 从两个Balb/c小鼠获得脾。将脾放在100微米滤网上。分解细胞并用PBS清洗，1,500rpm离心10分钟。用2ml裂解液在37℃裂解红细胞2分钟。清洗细胞两次，悬浮于
10ml培养基中并计数。直接冷冻一部分未刺激的细胞。剩余细胞用在5μg/ml浓度的刀豆球蛋白A刺激3天，或用在1μg/ml浓度的LPS刺激3天。细胞培养于有10％FBS、抗生素
和葡萄糖添加剂的DMEM培养基中。
10ml培养基中并计数。直接冷冻一部分未刺激的细胞。剩余细胞用在5μg/ml浓度的刀豆球蛋白A刺激3天，或用在1μg/ml浓度的LPS刺激3天。细胞培养于有10％FBS、抗生素
和葡萄糖添加剂的DMEM培养基中。
[0389] 狼疮患者B淋巴细胞与年龄相当的健康成人相比：
[0390] 通过用FITC标记的抗人CD19抗体的染色，从狼疮患者和健康个体的外周血单核细胞中分拣B细胞。如实施例1中描述地在MoFLo高性能 流式细胞仪-MLS上分拣细胞。细胞收集到无菌培养基中以进行RNA分析。
[0391] 总RNA的分离以进行即时PCR：
[0392] 清洗细胞一次并放置于TrizolTM(Life Technologies，Gaithersburg，Maryland)中，遵循厂商试验方案分离总RNA。用无RNase的DNase(GenHunter，Nashville，Tennessee)处理总RNA。苯酚/氯仿提取DNase消化的RNA并用乙醇沉淀过夜。75％乙醇清洗RNA并溶于无核酸酶的水中。定量分离的RNA并在琼脂糖凝胶上分析其完整性。
[0393] 即时PCR：
[0394] 通 过 使 用 标 准Taqman反 转 录 试 剂 (Applied Biosystems，FosterCity，California)在100μl反应混合物中反转录狼疮患者与健康个人的分捡的B淋巴细胞的总RNA(2μg)。使用Applied Biosystems的SYBR绿PCR基本混合物设立PCR反应。CS1
引物引入到混合物中以检查狼疮患者和健康个体cDNA中CS1的表达水平。从发表的序列(Genbank注册号XM_001635，AF390894)设计CS1的引物。β-Actin和18S rRNA引物用作标准化的对照。使用购自Applied Biosystems的引物快递软件设计引物。对于CS1的引物PCR扩增产物是85bp，β-Actin的引物是84bp，18S Rrna的引物是61bp。在Applied Biosystems的GeneAmp5700SDS系统中使用推荐的试验方案进行即时PCR。
引物引入到混合物中以检查狼疮患者和健康个体cDNA中CS1的表达水平。从发表的序列(Genbank注册号XM_001635，AF390894)设计CS1的引物。β-Actin和18S rRNA引物用作标准化的对照。使用购自Applied Biosystems的引物快递软件设计引物。对于CS1的引物PCR扩增产物是85bp，β-Actin的引物是84bp，18S Rrna的引物是61bp。在Applied Biosystems的GeneAmp5700SDS系统中使用推荐的试验方案进行即时PCR。
[0395] 小鼠新型Ly9的即时PCR：
[0396] 使用标准Taqman反转录试剂(Applied Biosystems)在100μl反应混合物中反转录刀豆球蛋白A、LPS和未刺激样品的总RNA(2μg)。使用Applied Biosystems的SYBR绿PCR基本混合物设立PCR反应。从发表的序列(Genbank注册号AF467909)设计小鼠新型Ly9的特异性引物并引入到混合物中以检查刺激与未刺激的cDNA样品中的表达水平。18S rRNA引物用于标准化。使用购自Applied Biosystems的引物快递 软件设计引物。对于小鼠Ly9的引物PCR扩增产物是65bp，18S rRNA的引物是61bp。在Applied Biosystems的
GeneAmp5700SDS系统中使用推荐的试验方案进行即时PCR。
GeneAmp5700SDS系统中使用推荐的试验方案进行即时PCR。
[0397] 微矩阵试验：样品制备、标记微芯片和指纹谱
[0398] 使用基因芯片确定和分析激活的和未激活的白细胞群的表达谱。定制的Affymetrix 寡核苷酸微矩阵允许大约35,000个唯一的mRNA转录物的询
问(interrogation)。
问(interrogation)。
[0399] 分离RNA并如所述进行基因芯片的分析(见Henshall等(2003)Cancer Research63：4196-4203；Henshall等 (2003)Oncogene22：6005-12；Glynne 等 (2000)Nature 403：
672-676；Zhao，等(2000)Genes Dev.14：981-993，此处完整引入)。
672-676；Zhao，等(2000)Genes Dev.14：981-993，此处完整引入)。
[0400] ●从总RNA中纯化多腺苷酸mRNA或用Qiagen的 (多腺苷酸mRNA从总RNA的纯化)试剂盒净化总RNA
[0401] 将Oligotex悬浮液加热到37℃并在加入RNA之前立即混合。洗脱缓冲液在70℃孵育。注意如果缓冲液中有沉淀物，2x结合缓冲液可以加热到65℃。根据Oligotex手册第16页上表2将总RNA与DEPC处理的水、2x结合缓冲液和Oligotex混合。混合物在65℃孵育3分钟，然后在室温孵育10分钟。
[0402] 试管在14,000至18,000g离心2分钟。注意如果离心机有“温和设定”，就应当使用。去除上清但不要碰到Oligotex沉淀物。可以留下少量的溶液以降低Oligotex的损失。应当保存上清直到确定满意的结合和多腺苷酸mRNA的洗脱发生。
[0403] 将沉淀物轻轻地悬浮于清洗缓冲液OW2中并用移液管加入到旋转 柱。全速(如果可能温和设定)离心旋转柱1分钟。离心之后，旋转柱转移到新的收集管并且轻轻地悬浮于清洗缓冲液OW2中并如此处描述地再次离心。
[0404] 将旋转柱转移到新试管并用20至100μl预热的(70℃)洗脱缓冲液洗脱。通过移液管来回温和地悬浮Oligotex树脂，然后如上离心。用新鲜的洗脱缓冲液重复洗脱过程。否则如果低洗脱量是必需的，那就只使用第一洗脱液。
[0405] 使用稀释的洗脱缓冲液作为空白，阅读吸光度。
[0406] ●乙醇沉淀
[0407] 进行cDNA合成之前，沉淀mRNA。
[0408] 一些残留的或Oligotex纯化过程的洗脱缓冲液中的组分将抑制mRNA的下游酶反应。
[0409] 0.4体积的7.5M NH4OAc+2.5体积的冷100％乙醇加入到洗脱物中。溶液在-20℃沉淀1小时至过夜(或者-70℃20-30分钟)。沉淀的溶液14,000-16,000xg 4℃离心30分钟。用0.5ml 80％乙醇(-20℃)清洗沉淀物，然后在室温14,000-16,000xg离心5分钟。
80％乙醇清洗重复1次。沉淀物在通风橱中干燥(不用加速真空)。沉淀物悬浮于DEPC
H2O，浓度为1μg/μl。
80％乙醇清洗重复1次。沉淀物在通风橱中干燥(不用加速真空)。沉淀物悬浮于DEPC
H2O，浓度为1μg/μl。
[0410] ●使用Qiagen的RNeasy试剂盒净化总RNA
[0411] 低于100μg的RNA应当加入到RNeasy柱。用无RNase的水将样品体积调节到100μl，350μl缓冲液RLT然后是250μl乙醇(100％)加入到样品中。通过移液管混合
溶液(不要离心)，然后样品加到RNeasy迷你旋转柱。迷你旋转柱在＞10,000rpm离心15秒。如果关注产量，流 出物能再加到柱上再次离心。
溶液(不要离心)，然后样品加到RNeasy迷你旋转柱。迷你旋转柱在＞10,000rpm离心15秒。如果关注产量，流 出物能再加到柱上再次离心。
[0412] 将柱转移到新的2ml收集管，加入500μl缓冲液RPE，＞10,000rpm离心15秒。丢弃流出物。500μl缓冲液RPE再次加入到迷你旋转柱，＞10,000rpm离心15秒。再次
丢弃流出物，然后最大速离心2分钟以干燥柱膜。将柱转移到新的1.5ml收集管，30-50μl无RNase水直接加入到柱膜上。柱在＞10,000rpm离心1分钟，重复洗脱。
丢弃流出物，然后最大速离心2分钟以干燥柱膜。将柱转移到新的1.5ml收集管，30-50μl无RNase水直接加入到柱膜上。柱在＞10,000rpm离心1分钟，重复洗脱。
[0413] 收集吸光度读数。如果需要，洗脱物可以用乙酸铵和2.5x体积的100％乙醇沉淀。 [0414] 使用Gibco的“用于cDNA合成 选择系统”试剂盒制造cDNA
[0415] ●第一链cDNA合成
[0416] 使用5μg总RNA或1μg多腺苷酸mRNA作为起始材料。对于总RNA，使用2μl的 RT(有用于cDNA合成的反转录酶的试剂盒)(对于多腺苷酸mRNA，使用1μl的 RT)。第一链合成混合物的终体积应当是20μl。RNA在体积上
必须小于10μl。RNA与1μl的100pmol T7-T24寡核苷酸在70℃孵育10分钟。在冰上，
加入4μl 5X第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT和1μl 10mM dNTP混合物共7μl。混合物在
37℃孵育2分钟，然后加入 RT。
必须小于10μl。RNA与1μl的100pmol T7-T24寡核苷酸在70℃孵育10分钟。在冰上，
加入4μl 5X第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT和1μl 10mM dNTP混合物共7μl。混合物在
37℃孵育2分钟，然后加入 RT。
[0417] 混合物在37℃孵育1小时。
[0418] ●第二链合成
[0419] 第一链反应物放置于冰上。
[0420] 往混合物中加入
[0421] 91μl DEPC H2O
[0422] 30μl 5X第二链缓冲液
[0423] 3μl 10mM dNTP mix
[0424] 1μl 10U/μl大肠杆菌DNA连接酶
[0425] 4μl 10U/μl大肠杆菌DNA多聚酶
[0426] 1μl 2U/l RNase H
[0427] 如果多于2个样品，上面的试剂应当制成混合物。加入的混合物在16℃孵育2小时。
[0428] 加入2μl T4DNA多聚酶并再在16℃孵育5分钟。加入10μl 0.5MEDTA终止反应。
[0429] ●净化cDNA
[0430] 使用苯酚∶氯仿∶异戊基乙醇(25∶24∶1)纯化在胶化试管中净化cDNA：
[0431] PLG(相位固定凝胶)(phase lock gel)试管最大速离心30秒，转移到新的PLG管。加入等体积的苯酚：氯仿：异戊基乙醇并且剧烈震摇(不要用漩涡振荡器)。试管最大速离心5分钟。最上面水层溶液转移到新试管。通过加入7.5倍体积的5M NH40ac和2.5
倍体积的100％乙醇对水相溶液乙醇沉淀。室温下立即最大速离心试管20分钟。去除上清，沉淀物用冰冷的80％乙醇清洗2次。尽可能去除清洗的乙醇然后风干沉淀物。沉淀物悬浮在3μl无RNase水中。
倍体积的100％乙醇对水相溶液乙醇沉淀。室温下立即最大速离心试管20分钟。去除上清，沉淀物用冰冷的80％乙醇清洗2次。尽可能去除清洗的乙醇然后风干沉淀物。沉淀物悬浮在3μl无RNase水中。
[0432] ●体外转录(IVT)和用生物素标记
[0433] 用移液管将1.5μl cDNA移入薄壁PCR管。室温下将NTP标记混合物加入到PCR管。
[0434] NTP标记混合物：
[0435] 2μl T710xATP(75mM)(Ambion)
[0436] 2μl T710xGTP(75mM)(Ambion)
[0437] 1.5μl T710xCTP(75mM)(Ambion)
[0438] 1.5μl T710xUTP(75mM)(Ambion)
[0439] 3.75μl 10mM Bio-11-CTP
[0440] 0.75μl 10mM Bio-16-UTP
[0441] 2μl 10x T7转录缓冲液(Ambion)
[0442] 2μl 10x T7酶混合物(Ambion)
[0443] 总反应的终体积是20μl。试管在PCR仪上37℃孵育6小时。
[0444] RNeasy净化IVT产物
[0445] 程序见上。
[0446] 乙醇沉淀标记的cRNA，并悬浮在与片段分析步骤相同的体积之中。
[0447] 片段化分析
[0448] 使用下面技术将大约15ug标记的RNA片段化。片段化反应体积最小化到大约10μl的体积，但是由于杂交缓冲液的镁沉淀问题不超过20μl。
[0449] RNA在1x片段化缓冲液中94℃孵育35分钟。
[0450] 5x片段化缓冲液：
[0451] 200mM Tris-乙酸盐，pH8.1
[0452] 500mM KOAc
[0453] 150mM MgOAc
[0454] 片段化之前和之后分析标记的RNA转录物。样品加热到65℃15分钟，在1％琼脂糖/TBE凝胶上电泳以大概知道转录物的大小范围。
[0455] ●微芯片矩阵
[0456] 所有试验中使用的EOS HuO3微芯片矩阵是定制的Affymetrix 寡核苷酸矩阵，包含59,680个探针组，代表46,000个唯一的序列，包括基于第一稿人基因组的已知的和FGENESH预言的外显子。Hu03探针组只由完全配对的探针组成，多数探针组有6或7个探针。
[0457] ●微芯片矩阵上的杂交
[0458] 用移液管将200μl(10ug cRNA)的杂交混合物移到芯片上。如果要进行多个杂交(例如通过5个芯片组的循环)，那么推荐制造300μl或更多的初始杂交混合物。
[0459] 杂交混合物：
[0460] 片段化标记RNA(50ng/μl终浓度)
[0461] 50pM 948-b对照寡核苷酸
[0462] 1.5pM BioB
[0463] 5pM BioC
[0464] 25pM BioD
[0465] 100pM CRE
[0466] 0.1mg/ml鲱鱼精子DNA
[0467] 0.5mg/ml乙酰化BSA
[0468] lx MES杂交缓冲液至300μl
[0469] 杂交信号使用结合藻红蛋白的抗生物素蛋白链菌素显色。
[0470] ●基因表达数据的标准化
[0471] 使用逆函数将强度的经验累积分布拟定(map)为期望的分布，基因表达数据通过将每个矩阵探针水平的强度数据拟合为固定的分布进行标准化。这个程序除了更加严格外，与其它每个芯片的标准化程序是相似的，例如每个芯片的平均值和SD固定为标准值，其严格之处 在于它固定了强度的整个分布而不是一或两个参数。每个芯片标准化的目的是为了去除芯片之间的变异，假设它归因于非生物因子，例如技术噪音。选择分布的比例参数而获得绝对平均值为300的分布，选择形状参数0.81以重现好的样品中可见的经验分布的典型(typical)形状。
[0472] 使用构成探针强度的Tukey’s trimean计算每个探针组单个测量的平均强度。Trimean是抗极端值影响的集中趋势的测量。最后，每个平均强度测量减去背景以纠正非特异性杂交。从芯片上所有其它探针组减去由491个有杂乱序列的探针组组成的“无效”探针组的平均强度测量。
[0473] 此处完整引入此处使用的产物的指导手册。
[0474] 此处提供的标记试验方案
[0475] 杂交反应：
[0476] 由(RNeasy柱纯化的)非生物素标记的IVT开始
[0477] (见实施例1从组织到IVT的步骤)
[0478] IVT反义RNA；4μg：μl
[0479] 随机六聚物(1μg/μl)：4μl
[0480] H2O：μl
[0481] 总体积：14μl
[0482] 70℃孵育10分钟。置于冰上。
[0483] 逆转录：
[0484] 5X第一链(BRL)缓冲液：6μl
[0485] 0.1M DTT：3μl
[0486] 50X dNTP混合物：0.6μl
[0487] H2O：2.4μl
[0488] Cy3或Cy5 dUTP(1mM)：3μl
[0489] SS RT II(BRL)：1μl
[0490] 总体积：16μl
[0491] -加入到杂交反应中
[0492] -42℃孵育30分钟
[0493] -加入1μl SSII并再放置1小时
[0494] 置于冰上
[0495] -50X dNTP混合物(25mM冰冷的dATP、dCTP和dGTP，10mM dTTP：100mM dATP、dCTP和dGTP每个25μl；10μl 100mM dTTP加入到15μl H2O)
[0496] RNA降解：
[0497] -加入1.5μl 1M NaOH/2mM EDTA，65℃孵育10分钟。
[0498] H2O 86μl
[0499] 10N NaOH 10μl
[0500] 50mM EDTA 4μl
[0501] U-Con 30
[0502] 500μl TE/样品7000g离心10分钟，收集流出物用以纯化。
[0503] Qiagen纯化：
[0504] -u-con复原的物质悬浮于500μl缓冲液PB
[0505] -进行标准的Qiagen试验方案
[0506] DNAse消化：
[0507] -加入1μl/100稀释的DNAse/30μl Rx并在37℃孵育15分钟
[0508] -5min 95℃使酶变性
[0509] 样品的制备：
[0510] -加入：
[0511] Cot-1 DNA： 10μl
[0512] 50X dNTPs： 1μl
[0513] 20X SSC： 2.3μl
[0514] 焦磷酸钠： 7.5μl
[0515] 10mg/ml鲱鱼精子DNA 1μl 1/10稀释
[0516] 终体积： 21.8μl
[0517] -加速真空中干燥
[0518] -悬浮于15μl H20.
[0519] -加入0.38μl 10％SDS.
[0520] -加热到95℃，2分钟
[0521] -室温下缓慢冷却20分钟
[0522] 放于切片上并在64℃杂交过夜
[0523] 杂交后清洗：
[0524] 3X SSC/0.03％SDS：2分钟 250ml水中37.5 ml 20X SSC+0.75mls 10％SDS [0525] 1X SSC：5分钟 250ml水中12.5ml 20X SSC
[0526] 0.2X SSC：5分钟 250ml水中2.5ml 20X SSC
[0527] 1000RPM1分钟离心，干燥切片。
[0528] 在合适的光电倍增管设置和荧光通道扫描。
[0529] CS1在白细胞而不在各种非淋巴组织中过度表达
[0530] 为了评价CS1的表达谱，即时PCR分析从白细胞和其它组织分离的mRNA。结果指出白细胞中mRNA表达水平远远高于多数其它正常成人组织。没有显示高于基线水平的CS1表达的其它正常成人组织包括脂肪、肾上腺、主动脉、主动脉瓣、盲肠、冠状动脉、膀胱、骨、骨髓、乳腺、支气管、子宫颈、大脑、脊髓、隔膜、子宫内膜、附睾、食管、胆囊、神经节、心脏、喉、唇、肝、肺、肌肉、子宫肌层、交感神经、网膜、口腔粘膜、卵巢、胰腺、甲状旁腺、咽粘膜、胎盘、前列腺、视网膜、唾液腺、皮肤、胃、滑膜、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、气管、脐带、输尿管、子宫、阴道或静脉。CS1 mRNA在所选的结肠(2/11)、肾(1/20)、小肠(1/3)、脾和扁桃体(2/4)样品中表达。结果指出CS1主要表达于白细胞并且应当是自身免疫疾病的好靶点。
[0531] 多个激活的白细胞群中CS1的表达增加
[0532] 为了评价CS1表达和白细胞激活之间的相关性，分析了多个激活的和非激活的白细胞群的CS1mRNA表达。结果指出与其相应的非激活对照群相比，激活的B细胞、成熟DC细胞、激活的CD3细胞(低到中度增加)、激活的CD4细胞(低水平增加)以及激活的CD8细胞(低到中度增加，依赖于供者)中CS1表达增加。这些结果指出CS1过度表达与一些
白细胞亚群的激活相关。
白细胞亚群的激活相关。
[0533] 实施例3：用于产生抗CS1单克隆抗体的抗原的生产
[0534] 克隆：
[0535] 使用CS1细胞外结构域(CS1 ECD)两侧的引物从Raji细胞中分离人CS1细胞外结构域(ECD)。凝胶纯化PCR产物并连接到编码IgG3恒定区(人Fc-γ3)的载体中。大规
模纯化含有CS1 ECD-Fcγ3的质粒并且用DNA测序证实。
模纯化含有CS1 ECD-Fcγ3的质粒并且用DNA测序证实。
[0536] CS1 ECD-Fc γ3稳定转染：
[0537] 用Fsp1酶将50μg CS1 ECD-Fcγ3质体线性化，DNA在乙醇中沉淀、清洗并悬浮于7 7
500μl无菌PBS。NSO细胞在冰冷PBS中清洗两次并悬浮于PBS，每ml 2×10 个。1×10
个细胞的量用于转染。
500μl无菌PBS。NSO细胞在冰冷PBS中清洗两次并悬浮于PBS，每ml 2×10 个。1×10
个细胞的量用于转染。
[0538] 500μl NSO细胞与500μl PBS中的DNA混合。细胞用BioRad基因脉冲仪在1.5V和3μF电泳。细胞加到100ml DMEM完全培养基中并接种到十个96孔板。转染24小时后加入1μg/ml的霉酚酸选择培养基。10天后筛选阳性转染细胞并在48和24孔板中扩增。
重新选择阳性转染细胞，为了蛋白质的纯化扩增高产细胞。
重新选择阳性转染细胞，为了蛋白质的纯化扩增高产细胞。
[0539] CS1 ECD-Fcγ3蛋白的纯化：
[0540] 表达CS1-ECD Fcγ3融合蛋白的稳定转染细胞扩增到600ml有葡萄糖添加剂的DMEM完全培养基中5天。蛋白G琼脂糖凝胶柱上纯化融合蛋 白并用1x PBS透析。考马斯分析简化(reduced)和非简化(non-reduced)形式的CS1 ECD-Fcγ3。也使用抗人IgG的
Western blot分析CS1 ECD Fcγ3，并通过N-末端测序证实。纯化的CS1-Fc-γ3融合蛋白用于免疫小鼠。
Western blot分析CS1 ECD Fcγ3，并通过N-末端测序证实。纯化的CS1-Fc-γ3融合蛋白用于免疫小鼠。
[0541] CS1 ECD-myc-GPI融合蛋白的产生：
[0542] 使用CS1细胞外结构域(ECD)两侧的引物从Raji细胞中分离人CS1细胞外结构域。凝胶纯化PCR产物并为了细胞表面表达的连接于表达myc标记和糖基磷脂酰肌醇连接的载体(myc-GPI载体)中。大规模纯化含有CS1 ECD-myc-GPI的质粒并用DNA测序证实。 [0543] CS1 ECD-myc-GPI稳定转染：
[0544] 用Fspl酶将50μg CS1 ECD-myc-GPI质粒线性化，乙醇沉淀DNA、清洗并悬浮于8 8
500μl的无菌PBS。NSO细胞在冰冷PBS中清洗两次并悬浮于PBS，每ml 2×10 个。1×10
个细胞的量用于转染。
500μl的无菌PBS。NSO细胞在冰冷PBS中清洗两次并悬浮于PBS，每ml 2×10 个。1×10
个细胞的量用于转染。
[0545] 500μl NSO细胞与500μl PBS中的DNA混合。细胞用BioRad基因脉冲仪在1.5V和3μF电泳。细胞在37℃5％CO2下生长于1μg/ml霉酚酸选择培养基，之后亚克隆到96孔板。用抗myc抗体筛选阳性转染细胞。为了体外试验，选择并扩增高产CS1 ECD-myc-GPI的转染细胞。
[0546] 实施例3：抗CS1单克隆抗体的生产
[0547] 人CS1的免疫原：
[0548] 纯化的重组人CS1 ECD-γ3融合蛋白用于经足垫免疫Balb/c小鼠(CS1ECD指的是上述CS1的细胞外结构域)。简要地，用10μg蛋白和等体积的Ribi佐剂总体积25μl
经后足垫免疫小鼠。每隔4或5天进行足垫免疫，共4次。
经后足垫免疫小鼠。每隔4或5天进行足垫免疫，共4次。
[0549] a.细胞融合：
[0550] 处死两只用CS1 ECD-γ3免疫的小鼠。取出小鼠的股骨弯和骶骨淋巴结。从组织中分离淋巴细胞，并用标准程序产生杂交瘤。简要地，通 过聚乙二醇(PEG)1500介导的淋巴细胞和鼠骨髓瘤细胞系(NSO细胞)之间的融合产生杂交瘤。融合的细胞接种于96孔板，密度为每板107个细胞。使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)培养基完成融合细胞的选择。
[0551] b.杂交瘤的筛选
[0552] 通过基于流式细胞仪(FACS)结合CS1表达细胞的试验测定杂交瘤分泌抗体的特异性。使用标准试验方案进行FACS试验。表达表面CS1细胞外结构域的NSO稳定转染细胞5
(2×10 个)悬浮于50μl冰冷PBS，与50μl杂交瘤培养上清置于冰上1小时。彻底清洗
后，细胞与结合藻红蛋白的羊抗小鼠IgG特异性抗体冰上孵育1小时。再次清洗细胞，使用Becton Dickinson FACScan通过FACS检测细胞表面结合的抗体。如表1所示，抗体Luc2，Luc3，Luc15，Luc20，Luc22，Luc23，Luc29，Luc32，Luc34，Luc35，Luc37，Luc38，Luc39，Luc56，Luc60，Luc63或Luc90与转染了CS1的NSO-CS1细胞的结合很强，但不结合于NSO-FcRn。
抗人CS1抗体结合于K562和Daudi细胞(已知它们表达天然CS1)，但是不结合于阴性对
照Jurkat细胞。数据显示所产生的抗CS1抗体能特异性结合于CS1。表中还显示(通过
ELISA)分析Luc抗体与CS1-γ3融合蛋白相对于阴性对照AR-G3(γ3融合蛋白)的结合的
结果。Luc抗体特异性结合于CS1-γ3并不结合于阴性对照AR-γ3融合蛋白。
(2×10 个)悬浮于50μl冰冷PBS，与50μl杂交瘤培养上清置于冰上1小时。彻底清洗
后，细胞与结合藻红蛋白的羊抗小鼠IgG特异性抗体冰上孵育1小时。再次清洗细胞，使用Becton Dickinson FACScan通过FACS检测细胞表面结合的抗体。如表1所示，抗体Luc2，Luc3，Luc15，Luc20，Luc22，Luc23，Luc29，Luc32，Luc34，Luc35，Luc37，Luc38，Luc39，Luc56，Luc60，Luc63或Luc90与转染了CS1的NSO-CS1细胞的结合很强，但不结合于NSO-FcRn。
抗人CS1抗体结合于K562和Daudi细胞(已知它们表达天然CS1)，但是不结合于阴性对
照Jurkat细胞。数据显示所产生的抗CS1抗体能特异性结合于CS1。表中还显示(通过
ELISA)分析Luc抗体与CS1-γ3融合蛋白相对于阴性对照AR-G3(γ3融合蛋白)的结合的
结果。Luc抗体特异性结合于CS1-γ3并不结合于阴性对照AR-γ3融合蛋白。
[0553] 表1产生自融合342的抗人CS1 MAB
[0554]
[0555] 所产生的抗CS1单克隆抗体的氨基酸序列
[0556] 使用标准技术克隆抗体重和轻链可变区。简要地，使用SMART RACEcDNA扩增试剂6
盒(BD Biosciences Clontech)用1-5×10 个细胞的总RNA制备cDNA，使用互补于小鼠重和轻链恒定区的基因特异性引物PCR扩增可变区。
盒(BD Biosciences Clontech)用1-5×10 个细胞的总RNA制备cDNA，使用互补于小鼠重和轻链恒定区的基因特异性引物PCR扩增可变区。
[0557] 表4中显示了抗体Luc90、Luc63和Luc34成熟重链和成熟轻链的氨基酸序列，表4提供了Luc90的重链可变区(SEQ ID NO：3)和轻链可变区(SEQ ID NO：4)的氨基酸序
列；Luc63的重量可变区(SEQ ID NO：5)和轻链可变区(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列；以及Luc34的重量可变区(SEQ ID NO：7)和轻链可变区(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列。SEQ ID NOS：9、10和11分别描述了Luc90重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：
12、13和14分别描述了Luc90轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：15、16和17分别描述了Luc63重链CDR1、 CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：18、19和20分别描述了Luc63轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：21，22和23分别描述了Luc34重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：24，25和26分别描述了Luc34轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
列；Luc63的重量可变区(SEQ ID NO：5)和轻链可变区(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列；以及Luc34的重量可变区(SEQ ID NO：7)和轻链可变区(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列。SEQ ID NOS：9、10和11分别描述了Luc90重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：
12、13和14分别描述了Luc90轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：15、16和17分别描述了Luc63重链CDR1、 CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：18、19和20分别描述了Luc63轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：21，22和23分别描述了Luc34重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：24，25和26分别描述了Luc34轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
[0558] 表4：CS1抗体的氨基酸序列
[0559] Luc-90 VH-SEQ ID NO：3
[0560] QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQ
[0561] SEQID NO：9 SEQ ID NO：10
[0562] KFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVSS
[0563] SEQ ID NO：11
[0564] Luc-90 VL-SEQ ID NO：4
[0565] DIVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRF
[0566] SEQ ID NO：12 SEQID NO：13
[0567] TGSGSGTDFTFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
[0568] SEQID NO：14
[0569] Luc-63 VH-SEQ ID NO：5
[0570] EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTP
[0571] SEQ ID NO：15 SEQID NO：16
[0572] SLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPDGNYWYFDVWGAGTTVTVSS
[0573] SEQID NO：17
[0574] Luc-63 VL-SEQ ID NO：6
[0575] DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGIAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRF
[0576] SEQID NO：18 SEQ ID NO：19
[0577] TGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK
[0578] SEQ ID NO：20
[0579] Luc-34 VH-SEQ ID NO：7
[0580] QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQ
[0581] SEQ ID NO：21 SEQ ID NO：22
[0582] KFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARGKVYYGSNPFAYWGQGTLVTVSA
[0583] SEQ ID NO：23
[0584] Luc-34 VL-SEQ ID NO：8
[0585] DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRF
[0586] SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25
[0587] SGSGSGKDYTLS ITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK
[0588] SEQ ID NO：26
[0589] 实施例4：CS1抗体的特征分析
[0590] 流式细胞仪竞争试验用于测定15个不同抗CS1单克隆抗体的表位特异性。表达表5
面CS1的NSO稳定转染细胞(2×10 个)冰上与50μl抗CS1抗体孵育1小时，包括Luc23，
Luc29 Luc34，Luc35，Luc37，Luc38，Luc63和Luc90的配对联合。平行地，同型对照抗体(AIP-13)用作阴性对照。生物素化的抗CS1单克隆抗体(Luc23，Luc34，Luc37，Luc38，Luc63和Luc90)1μg/ml冰上与细胞/抗体混合物再孵育30分钟。彻底清洗后，细胞与结合藻红蛋白的抗生物素蛋白链菌素冰上孵育1小时。清洗细胞，使用Becton Dickinson FACScan通过FACS检测细胞表面结合的生物素化抗体。
面CS1的NSO稳定转染细胞(2×10 个)冰上与50μl抗CS1抗体孵育1小时，包括Luc23，
Luc29 Luc34，Luc35，Luc37，Luc38，Luc63和Luc90的配对联合。平行地，同型对照抗体(AIP-13)用作阴性对照。生物素化的抗CS1单克隆抗体(Luc23，Luc34，Luc37，Luc38，Luc63和Luc90)1μg/ml冰上与细胞/抗体混合物再孵育30分钟。彻底清洗后，细胞与结合藻红蛋白的抗生物素蛋白链菌素冰上孵育1小时。清洗细胞，使用Becton Dickinson FACScan通过FACS检测细胞表面结合的生物素化抗体。
[0591] 检测未标记抗体Luc23，Luc34，Luc37，Luc38，Luc63和Luc90在15μg/ml、3μg/ml和0.6μg/ml的浓度互相竞争的能力，加入1μg/ml的竞争或阻断抗体。AIP-13用作阴性对照，因为这个抗体不结合于CS1或不与任何Luc抗体竞争。MFI显著的降低指出，与对照抗体的MFI相比，生物素化抗CS1单克隆抗体相比非标记抗CS1单克隆抗体对细胞表面CS1至少50％的竞争。
[0592] 竞争试验指出一些Luc抗体与截然不同的表位接触。Luc38接触的表位不同于Luc37、23、90和63的表位。Luc63接触与Luc37、23、90 和63的表位不同的分开的非重叠表位。Luc90接触不同的非重叠表位，不同于Luc37、23、63和38的表位。Luc23接触另一个非重叠表位，不同于Luc90、63和38的表位。Luc37接触另外的非重叠表位，不同于Luc90、
63和38接触的表位。Luc63接触与Luc34重叠的表位，而Luc90接触与Luc34重叠的表位。
Luc37接触与Luc23的表位重叠的表位。Luc34阻断或显著降低所有Luc抗体的结合，并且可以接触宽广的暴露的表位或可以对CS1有更高的亲和力。Luc37、Luc23和Luc38不能阻断Luc34抗体与CS1的结合。Luc37、Luc23和Luc38的表位可以“埋”在CS1二级结构之
中，或者CS1的亲和力低于Luc34抗体的亲和力。
63和38接触的表位。Luc63接触与Luc34重叠的表位，而Luc90接触与Luc34重叠的表位。
Luc37接触与Luc23的表位重叠的表位。Luc34阻断或显著降低所有Luc抗体的结合，并且可以接触宽广的暴露的表位或可以对CS1有更高的亲和力。Luc37、Luc23和Luc38不能阻断Luc34抗体与CS1的结合。Luc37、Luc23和Luc38的表位可以“埋”在CS1二级结构之
中，或者CS1的亲和力低于Luc34抗体的亲和力。
[0593] Biacore分 析 也 测 试 了 三 个 单 克 隆 抗 体 的 相 对 亲 和 力。 使 用BIAcore2000(BIAcore，Sweden)，通过人CS1-Fc融合蛋白和抗人CS1单克隆小鼠抗体Luc34.1、63.2和90H1之间的SPRKinetics测量进行CS1单克隆抗体的动力学分析。通过如下建立再生(regeneration)条件，将每个抗体多于10000RU固定于不同的流动细胞上并将CS1-Fc注射到表面，之后测试一系列不同的缓冲液直到找到最好的一个以优化CS1-Fc从每个抗体的清除。发现10mM甘氨酸，pH2.0的缓冲液是最佳再生缓冲液，并且立即检测超过10个循环CS1-Fc注射和缓冲液再生的它的再现性(reproducibility)。发现缓冲液适合重复性地再生抗体表面。因此，10mM甘氨酸，pH2.0被指定为CS1-Fc和抗体BIAcore试验的再生缓冲液。
[0594] 有范围从99.4RU至133.7RU的低反应单位(RU)的内部生产的CS1抗体通过BIAcore胺偶联剂(N-乙基-N’-二甲基氨丙基碳化二亚胺，EDC；N-羟基琥珀酰亚胺酯，NHS；以及盐酸氨基乙醇，pH8.5)固定在科研级CM5感受芯片上。室温下在30ul/min的流速进行试验。CS1-Fc三分钟联合相之后是10分钟电泳缓冲液(10mM Hepes，300mM氯化钠，3mM EDTA，0.05％P-20，pH7.4)的注射以监测每个结合循环的分离，每个循环有不同的CS1-Fc浓度。用10mM甘氨酸，pH2.0进行再生表面的再生。使用BIAevaluate程序，从二复样十二个不同浓度(1024nM，512nM， 256nM，128nM，64nM，32nM，16nM，8nM，4nM，2nM，1nM，0.5nM)收集的senorgram数据的总体分析计算CS1-Fc每个CS1-Fc和抗体对的结合动力学。在每个分析中应用双重参考从参考表面和只有缓冲液的对照去除背景反应。使用BIAevaluate软件的二价分析物模型通过同时拟合分析物浓度系列的sensorgram的结合和分离相来获得结合的亲和力(KD)。实验进行三次以研究数据的标准差。
[0595] 下面总结了Luc90.H1、Luc63.2和Luc34.1的结合亲和力。这三个抗体中Luc90.H1具有最高的结合亲和力。Luc90.H1的结合亲和力比Luc63.2高5.5倍，比Luc34.1高28倍。
[0596]Ka(1/Ms) Kd (1/s) KD (M)
Luc 90.H1 4.56e4 2.81e-4 6.29e-9+/- 2.06e-9
Luc63.2 8.71e3 3.01e-4 3.46e-8+/- 8.86e-9
Luc 34.1 7.48e 3 1.27e-3 1.73e-7+/- 3.46e-8
Luc 90.H1 4.56e4 2.81e-4 6.29e-9+/- 2.06e-9
Luc63.2 8.71e3 3.01e-4 3.46e-8+/- 8.86e-9
Luc 34.1 7.48e 3 1.27e-3 1.73e-7+/- 3.46e-8
[0597] 抗CS1抗体的免疫组织学染色：
[0598] 用抗CS1抗体的免疫组织学染色也检测了转染CS1的细胞。10μg/ml量的第一单克隆抗CS1抗体加入到转染了CS1的细胞。然后细胞用血清封闭，并与生物素抗小鼠Ig孵育。然后卵白素-过氧化物酶与细胞混合，用AEC(标准过氧化物酶试剂)显色。红色的AEC指出阳性染色，而测试细胞的核用苏木精(蓝色)反染色。数据指出转染CS1的细胞
确实能用抗CS1抗体Luc23、Luc38和Luc63染色，显示所产生的抗CS1抗体能与表达于细胞表面的CS1结合。因而，抗CS1抗体不仅适合用于检测溶液中外周血细胞表面上的表达，也用于免疫组织化学(IHC)的检测，这一般用于分析组织切片(例如，患者淋巴结或组织活检)。
确实能用抗CS1抗体Luc23、Luc38和Luc63染色，显示所产生的抗CS1抗体能与表达于细胞表面的CS1结合。因而，抗CS1抗体不仅适合用于检测溶液中外周血细胞表面上的表达，也用于免疫组织化学(IHC)的检测，这一般用于分析组织切片(例如，患者淋巴结或组织活检)。
[0599] 用两个抗CS1抗体Luc90和Luc63证实了发炎扁桃体的免疫组织学染色。CD138的染色染色了浆细胞和上皮细胞。从染色的重叠模式，很明显CS1抗体染色发炎扁桃体的浆细胞。
[0600] 用抗CS1的Luc63证明了患类风湿性关节炎的患者关节的滑膜组织的免疫组织学染色。如用CD138染色可见地，浆细胞已经浸润了滑膜。从染色的重叠模式，很明显抗CS1抗体染色患类风湿性关节炎患者关节中的浆细胞。
[0601] 这些结果指出表达CS1的浆细胞存在于发炎扁桃体和患类风湿性关节炎患者的关节，提示抗CS1抗体在这些疾病的治疗中的显著用途。
[0602] CS1蛋白表达模试：
[0603] 还用所产生的Luc抗体通过FACS分析检查CS1蛋白的表达。通过标准聚蔗糖泛影葡胺梯度离心程序从健康个体和从狼疮患者分离PBMC。
[0604] 遵循标准程序如所指地用抗体染色PBMC。为了PBMC美洲商路分裂素(PWM)的激活，将1∶100稀释的PWM加入到PBMC，之后37℃7％CO2下放置8天。收集PWM刺激的细胞，抗体染色前清洗。此处使用的小鼠抗CS1抗体是Luc90(IgG2b)、Luc63、Luc38以及其它所产生的抗CS1Luc抗体。同型对照抗体是同型配对的小鼠IgG抗体。
[0605] 结果指出CS1在激活的B细胞、CD8+T细胞(激活的和幼稚的)、NK细胞(CD3-CD56+)、NKT细胞(CD56+CD3+)、CD14+/1o白细胞(单核细胞和/或巨噬细胞)以及CD4+T细胞(体外激活的细胞上低水平)上阳性表达。CS1在健康成人和狼疮患者的这些细胞群上表达。健康成人非激活的CD4+T细胞、血小板、HuVECs、肾细胞、支气管细胞、小气道细 胞、前列腺细胞、干细胞和乳腺细胞上未检测到显著的CS1蛋白表达。
[0606] PWM激活的PBMC的染色显示了激活B细胞的染色，而同型对照染色和非激活的PBMC显示为背景荧光。CS1表达模式是明显的，因为治疗抗体理想地主要结合于靶细胞并且不结合于其它细胞和组织，尤其是血小板。数据提示抗CS1抗体是合适的候选治疗抗体。 [0607] 实施例5：CS1抗体的人源化
[0608] 这个实例描述了鼠抗CS1单克隆抗体Luc63(MuLuc63)的人源化。基本根据Queen，C.等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989))的程序进行MuLuc63的人源化。首先，分别鉴别与MuLuc63VH和VL氨基酸序列有高度同源性的人VH和VL片段。接着，CDR序列和对于维持CDR结构很重要的框架氨基酸一起嫁接进所选的人框架序列。得到的人源化单克隆抗体(HuLuc63)表达于小鼠骨髓瘤细胞系NSO。ELISA试验中人源化HuLuc63抗
体结合于重组人CS1，EC50值为70.1ng/ml，与相同试验中MuLuc63测定的EC5066.1ng/ml相似，指出HuLuc63保留了对人CS1很高的结合亲和力。
体结合于重组人CS1，EC50值为70.1ng/ml，与相同试验中MuLuc63测定的EC5066.1ng/ml相似，指出HuLuc63保留了对人CS1很高的结合亲和力。
[0609] MuLuc63可变区cDNA的克隆和测序
[0610] 使用TRIzol试剂(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)从大约5×107个产MuLuc63的杂交瘤细胞提取总RNA。使用SMART RACEcDNA扩增试剂盒(BD
Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)遵循供应商的试验方案合成双链cDNA。使
用分别与小鼠γ和κ链C区退火的3’引物和SMART RACE cDNA扩增试剂盒中提供
的5’通用引物多聚酶链式反应(PCR)扩增重和轻链的可变区cDNA。对于VH PCR，
3’引物具有序列5’-AGCTGGGAAGGTGTGCACAC-3’。对于VH PCR，3’引物具有序列
5’-TTCACTGCCATCAATCTTCC-3’。为了序列的测定，VH和VL cDNA亚克隆进pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen Corporation，Carlsbad， CA)。根据厂商的技术说明书通过PCR循环测序反应用荧光双脱氧链终止剂(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行DNA测序。 [0611] 对四个质粒克隆每一个重和轻链进行测序。鉴别了与一般小鼠重和轻链可变区同源的唯一序列。表5和6显示了MuLuc63重和轻链V区的cDNA序列和推测的氨基酸序列。 [0612] 表5提供了Luc63的重链可变区(SEQ ID NO：27)和轻链可变区(SEQID NO：28)氨基酸序列，包括各自的信号肽序列(SEQ ID NOS：29和34)。SEQ ID NOS：30-32和35-37分别描述了重链和轻链可变区的CDR。SEQ ID
Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)遵循供应商的试验方案合成双链cDNA。使
用分别与小鼠γ和κ链C区退火的3’引物和SMART RACE cDNA扩增试剂盒中提供
的5’通用引物多聚酶链式反应(PCR)扩增重和轻链的可变区cDNA。对于VH PCR，
3’引物具有序列5’-AGCTGGGAAGGTGTGCACAC-3’。对于VH PCR，3’引物具有序列
5’-TTCACTGCCATCAATCTTCC-3’。为了序列的测定，VH和VL cDNA亚克隆进pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen Corporation，Carlsbad， CA)。根据厂商的技术说明书通过PCR循环测序反应用荧光双脱氧链终止剂(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行DNA测序。 [0611] 对四个质粒克隆每一个重和轻链进行测序。鉴别了与一般小鼠重和轻链可变区同源的唯一序列。表5和6显示了MuLuc63重和轻链V区的cDNA序列和推测的氨基酸序列。 [0612] 表5提供了Luc63的重链可变区(SEQ ID NO：27)和轻链可变区(SEQID NO：28)氨基酸序列，包括各自的信号肽序列(SEQ ID NOS：29和34)。SEQ ID NOS：30-32和35-37分别描述了重链和轻链可变区的CDR。SEQ ID
[0613] NO：33描述了Luc63重链可变区CDR2中的单个氨基酸突变，从NYT变为NYA(斜体的)。
[0614] 表5：抗CS1Luc63可变重链区推测的糖基化位点
[0615] Luc-63VH(SEQ ID NO：27)
[0616] MDFGLI FFIVALLKGVQCEVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKG
[0617] SEQ ID NO：29 SEQ ID NO：30
[0618] LEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPDGNYWYF
[0619] SEQ ID NO：31 SEQ ID NO：32
[0620] DVWGAGTTVTVSS ↓
[0621] NYA(SEQ ID NO：33)
[0622] Luc-63VL(SEQ ID NO：28)
[0623] METHSQVFVYMLLWLSGVEGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGIAV
[0624] SEQID NO：34 SEQID NO：35
[0625] AWYQQKPGQS PKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYF
[0626] SEQ ID NO：36
[0627] CQQYSSYPYTFGGGTKLEIK
[0628] SEQ ID NO：37
[0629] 表6提供了小鼠Luc63重链可变区(SEQ ID NO：38)、人重链可变区框架序列(SEQ ID NO：39)、人JH1 cDNA(SEQ ID NO：40)和人源化Luc63重链可变区(SEQ ID NO：41)的氨基酸序列。也提供了小鼠轻链可变区(SEQ ID NO：42)、人轻链可变区框架(SEQ ID NO：43)和人源化Luc63轻链可变区(SEQ ID NO：44)的氨基酸序列。
[0630] 表6：Luc 63(NYA)的人源化
[0631] MuLuc-63VH EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS RYWMS
[0632] HumanVH cDNA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFS
[0633] HuLuc-63VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFS RYWMS
[0634] MuLuc-63VH WVRQAPGKGLEWIG EINPDSSTINYTPSLKD
[0635] HumanVH cDNA WVRQAPGKGLEWVA
[0636] HuLuc-63VH WVRQAPGKGLEWIG EINPDSSTINYAPSLKD
[0637] MuLuc-63VH KFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCAR
[0638] Human JH1 cDNARFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
[0639] HuLuc-63VH KFIISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
[0640] MuLuC-63VH PDGNYWYFDV WGAGTTVTVSS
[0641] Human JH1 cDNA
[0642] HuLuc-63VH PDGNYWYFDV WGQGTLVTVSS
[0643] MuLuc-63VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVGIAVA
[0644] HumanVL cDNA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
[0645] HuLuc-63VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQDVGIAVA
[0646] MuLuc-63VL WYQQKPGQSPKLLIY WASTRHT
[0647] HumanVL cDNA WYQQKPGKVPKLLIY
[0648] HuLuc-63VL WYQQKPGKVPKLLIY WASTRHT
[0649] MuLuc-63VL GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFC
[0650] HumanVL cDNA GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC
[0651] HuLuc-63VL GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC
[0652] MuLuc-63VL QQYSSYPYT FGGGTKLEIK
[0653] HumanVL cDNA FGQGTKVEIK
[0654] HuLuc-63VL QQYSSYPYT FGQGTKVEIK
[0655] HuLuc63V区的设计
[0656] 如Queen，C.等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989))概述地进行抗体V区的人源化。首先，在计算机程序ABMOD和ENCAD的帮助下构建MuLuc63可变区的分子模型(Levitt，M.，J.Mol.Biol.168：595-620(1983))。接着，基于人抗体cDNA序列同源性的搜索，选择人VH序列E553-14(Cuisinier等，Eur.J.Imm.23：110-118(1993))和J片段JH1(Ravetch，J.V.等，Cell 27：583-591(1981))来提供HuLuc63重链可变区的框架。
对于HuLuc63轻链可变区，使用cDNAVL序列III-2R(Manheimer-Lory等，J.Exp.Med.174：
1639-1652(1991))。MuLuc63VH和受体人框架之间框架氨基酸的相同性为81.6％(71/87)，而MuLuc63VL和人受体框架之间相同性为76.3％(61/80)。表7和表8分别显示了MuLuc63、HuLuc63以及人受体氨基酸序列VH和VL的比对。表7提供了VH区氨基酸序列的比对。
MuLuc63和HuLuc63VH区的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：45和47)和人E55 3-14和
JH1片段(SEQ ID NO：46)显示为单个字母的密码子。CDR序列基于Kabat的定义(免疫兴趣蛋白质的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))，MuLuc63VH序列中加下划线的；编号也根据Kabat。图中省略了人VH片段的CDR序列。HuLuc63VH序列中的单个下划线的氨基酸被预言与CDR序列接触因此被相应小鼠残基取代。双下划线指出CDR2中制造的苏氨酸(T)突
变为丙氨酸(A)以去除可能的N连接的糖基化位点(NYT)。表8提供了VL区氨基酸序列的
比对。MuLuc63和HuLuc63VL区的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：48和50)和人III-2R
序列(SEQ ID NO：49)显示为单个字母的密码子。MuLuc63VH序列中基于Kabat的定义(免疫兴趣蛋白质的序列，第5版，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))的CDR序列是加下划线的；编号也根据Kabat。图中省略了人VH片段的CDR序列。HuLuc63VH序列中的单个下划线的氨基酸被预言与CDR序列接触因此被相应小鼠残 基取代。
对于HuLuc63轻链可变区，使用cDNAVL序列III-2R(Manheimer-Lory等，J.Exp.Med.174：
1639-1652(1991))。MuLuc63VH和受体人框架之间框架氨基酸的相同性为81.6％(71/87)，而MuLuc63VL和人受体框架之间相同性为76.3％(61/80)。表7和表8分别显示了MuLuc63、HuLuc63以及人受体氨基酸序列VH和VL的比对。表7提供了VH区氨基酸序列的比对。
MuLuc63和HuLuc63VH区的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：45和47)和人E55 3-14和
JH1片段(SEQ ID NO：46)显示为单个字母的密码子。CDR序列基于Kabat的定义(免疫兴趣蛋白质的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))，MuLuc63VH序列中加下划线的；编号也根据Kabat。图中省略了人VH片段的CDR序列。HuLuc63VH序列中的单个下划线的氨基酸被预言与CDR序列接触因此被相应小鼠残基取代。双下划线指出CDR2中制造的苏氨酸(T)突
变为丙氨酸(A)以去除可能的N连接的糖基化位点(NYT)。表8提供了VL区氨基酸序列的
比对。MuLuc63和HuLuc63VL区的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：48和50)和人III-2R
序列(SEQ ID NO：49)显示为单个字母的密码子。MuLuc63VH序列中基于Kabat的定义(免疫兴趣蛋白质的序列，第5版，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))的CDR序列是加下划线的；编号也根据Kabat。图中省略了人VH片段的CDR序列。HuLuc63VH序列中的单个下划线的氨基酸被预言与CDR序列接触因此被相应小鼠残 基取代。
[0657] 表7：MuLuc63(SEQ ID NO：45)、E55 3-14(SEQ ID NO：46)、HuLuc63(SEQ ID NO：47)VH区域的比对
[0658] 1 2 3 4
[0659] 0 0 0 0
[0660] MuLuc 63 EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPG
[0661] E55 3-14 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS-----WVRQAPG
[0662] HuLuc 63 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPG
[0663] 5 6 7 8
[0664] 0 a 0 0 0 a
[0665] MuLuc-63 KGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMS
[0666] E55 3-14 KGLEWVA-----------------RFTISRDNAKNSLYLQMN
[0667] HuLuc-63 KGLEWIGEINPDSSTINY PSLKDKFIISRDNAKNsLYLQMN
[0668] 1 1
[0669] 9 0 1
[0670] bc 0 0ab 0
[0671] MULUC-63 KVRSEDTALYYCARPDGNYWYFDVWGAGTTVTVSS
[0672] E55 3-14/JH1 SLRAEDTAVYYCAR----------WGQGTLVTVSS
[0673] HuLuc-63 SLRAEDTAVYYCARPDGNYWYFDVWGQGTLVTVSS
[0674] 表8：MuLuc63(SEQ ID NO：48)，III-2R(SEQ ID NO：49)和HuLuc63(SEQ ID NO：50)VL区的比对
[0675] 1 2 3 4
[0676] 0 0 0 0
[0677] MuLuc63 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGIAVAWYQQKPGQ
[0678] III-2R DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC-----------WYQQKPGK
[0679] HuLuc63 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGIAVAWYQQKPGK
[0680] 5 6 7 8
[0681] 0 0 0 0
[0682] MULUC63 SPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLA
[0683] III-2R VPKLLIY-------GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVA
[0684] HuLuc63 VPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVA
[0685] 1
[0686] 9 0
[0687] 0 0
[0688] MULUC63 DYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK
[0689] III-2R TYYC---------FGQGTKVEIK
[0690] HuLuc63 TYYCQQYSSYPYTFGQGTKVEIK
[0691] 在计算机模式建议地与CDR显著接触的的框架位点，MuLuc63 V区的氨基酸被原先人框架氨基酸取代。这个在重链残基28、48、49、66和68(表7)完成。对于轻链，在残基60进行取代(表8)。注意此处使用的编号系统是Kabat的编号系统(免疫兴趣蛋白质的
序列，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。
序列，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。
[0692] 另外，对MuLuc63氨基酸序列的检查揭示VH区CDR2中可能的N连接糖基化位点。这样的N连接糖基化位点具有普遍序列N-X-T/S(这里 N＝天冬酰胺，X＝任何氨基酸，以及S/T＝丝氨酸或苏氨酸)。因为可变结构域中N-连接糖基化的存在在将HuLuc63开发为治疗抗体的过程中会有非期望的影响，人源化设计中通过用丙氨酸突变取代苏氨酸(N-Y-A)去除CDR2中可能的糖基化位点(N-Y-T)。
[0693] HuLuc63 VH和VL基因的构建
[0694] 编码每一个HuLuc63 VH和VL的基因设计为迷你外显子，包括信号肽、拼接供点(splice donor)信号和其后克隆进哺乳动物表达载体的合适的限制性内切酶。VH和VL迷你外显子中的拼接供点信号分别源自相应的人种系JH6和JK4序列。HuLuc63 VH和VL迷你外显子中的信号肽序列分别源自相应的MuLuc63 VH和VL序列。表5和6显示了Luc63
VH和VL基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。
VH和VL基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。
[0695] 通过长度范围从33至43个碱基的重叠合成寡核苷酸的延伸和PCR扩增来构建HuLuc63 VH和VL基因。.(Stemmer等，Gene 164：49-53(1995))。用Qiaquick PCR
纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR扩增的片段并用MluI和XbaI消化。HuLuc63 VH基因亚
克隆进pHuHCgl.D以建造质粒pHuHCgl.D-HuLuc63。HuLuc63 VL基因亚克隆进κ轻链
表达载体pOKT3.Vk.rg的衍生物pHuCkappa.rgpt.De(Cole，M.S.等，J.Immunol.159：
3613-3621(1997))以建造质粒pHuCkappa.rgpt.dE-HuLuc63。
纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR扩增的片段并用MluI和XbaI消化。HuLuc63 VH基因亚
克隆进pHuHCgl.D以建造质粒pHuHCgl.D-HuLuc63。HuLuc63 VL基因亚克隆进κ轻链
表达载体pOKT3.Vk.rg的衍生物pHuCkappa.rgpt.De(Cole，M.S.等，J.Immunol.159：
3613-3621(1997))以建造质粒pHuCkappa.rgpt.dE-HuLuc63。
[0696] HuLuc63的表达
[0697] 组织培养细胞瞬时转染生产HuLuc63 IgGl/抗体。人胚胎肾细胞系293-H(Invitrogen，Carlsbad，CA)培养在含有10％FBS(HyClone，Logan，UT)和非必须氨基酸(Invitrogen)的DMEM中(BioWhittaker，Walkersville，MD)。转染前一天使用常规培
6
养基将293-H细胞接种于6孔板中，每孔1×10 个细胞，体积2.5ml。转染当天，每孔4μg质粒DNA稀释于250μl的杂交瘤-SFM(H-SFM，Invitrogen)。每孔10μl lipofectamine
2000试剂(LF2000，Invitrogen)稀释在250μl H-SFM。稀释的DNA与稀释的LF2000联合并孵育20分钟以允许DNA-LF2000复合物的形成。每孔加入500μl DNA-LF2000复合物，并通过来回倾斜平板混合。收集上清进行分析之前细胞孵育5天。
6
养基将293-H细胞接种于6孔板中，每孔1×10 个细胞，体积2.5ml。转染当天，每孔4μg质粒DNA稀释于250μl的杂交瘤-SFM(H-SFM，Invitrogen)。每孔10μl lipofectamine
2000试剂(LF2000，Invitrogen)稀释在250μl H-SFM。稀释的DNA与稀释的LF2000联合并孵育20分钟以允许DNA-LF2000复合物的形成。每孔加入500μl DNA-LF2000复合物，并通过来回倾斜平板混合。收集上清进行分析之前细胞孵育5天。
[0698] 夹心ELISA测定HuLuc63的表达。用稀释于0.2M碳酸盐-重碳酸盐缓冲液pH9.4的1.8μg/ml羊抗人IgG Fcγ链特异性多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch
Laboratories，Inc.，West Grove，PA)100μl/孔包被Immulon 4HBX平板过夜，清洗缓冲液(含0.1％Tween 20的PBS)清洗，并用稀释于TBS的超级封闭封闭缓冲液(Pierce
ChemicalCompany，Rockford，IL)150μl/孔室温封闭30分钟。清洗缓冲液清洗后，含有HuLuc63的样品合适地稀释于ELISA缓冲液(含有1％BSA和0.1％Tween 20的
PBS)，100μl/孔应用于ELISA平板。作为标准，使用人源化抗CD33 IgGl/κ单克隆抗体HuM195(Co，M.S.等，J.Immunol.，148：1149-1154(1992))。室温孵育平板1小时并用清洗缓冲液清洗后，使用1∶1000稀释的连接HRP的羊抗人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)100μl/孔检测结合抗体。室温孵育1小时和清洗缓冲液清洗后，加入
100μl/孔ABTS底物(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)显色。加入100μl/孔2％草酸终止显色。使用VersaMax酶标仪(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)在415nm阅读吸光度。
Laboratories，Inc.，West Grove，PA)100μl/孔包被Immulon 4HBX平板过夜，清洗缓冲液(含0.1％Tween 20的PBS)清洗，并用稀释于TBS的超级封闭封闭缓冲液(Pierce
ChemicalCompany，Rockford，IL)150μl/孔室温封闭30分钟。清洗缓冲液清洗后，含有HuLuc63的样品合适地稀释于ELISA缓冲液(含有1％BSA和0.1％Tween 20的
PBS)，100μl/孔应用于ELISA平板。作为标准，使用人源化抗CD33 IgGl/κ单克隆抗体HuM195(Co，M.S.等，J.Immunol.，148：1149-1154(1992))。室温孵育平板1小时并用清洗缓冲液清洗后，使用1∶1000稀释的连接HRP的羊抗人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)100μl/孔检测结合抗体。室温孵育1小时和清洗缓冲液清洗后，加入
100μl/孔ABTS底物(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)显色。加入100μl/孔2％草酸终止显色。使用VersaMax酶标仪(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)在415nm阅读吸光度。
[0699] MuLuc63和HuLuc63的结合特性
[0700] 用直接结合ELISA分析MuLuc63和HuLuc63对人CS-1的亲和力。96孔ELISA平板(Immulon 4HBX平板，Thermo Labsystems，Franklin，MA)的孔用100μl溶于PBS的1μg/ml可溶性人CS1-人Fc 3融合蛋白室温下包被。清洗缓冲液清洗后，室温下孔用150μl超级封闭封闭缓冲液封闭30分钟。瞬时表达的HuLuc63抗体或纯化的MuLuc63抗体适当
地稀释于ELISA缓冲液中并加到ELISA平板(每孔100μl)。ELISA 平板室温下孵育1小
时，用清洗缓冲液清洗孔。然后100μl 1∶1000稀释于ELISA缓冲液的连接HRP的羊抗
人C 抗体或连接HRP的羊抗小鼠C 抗体(都来自Southern Biotech)分别加到HuLuC63
和MuLuc63平板的每个孔中并室温下孵育1小时。用清洗缓冲液清洗后，每孔加入100μl ABTS底物(KPL)。每孔加入100μl 2％草酸终止显色。使用VERSAmax酶标仪在415nm阅
读吸光度。ELISA结合试验的结果显示MuLuc63和HuLuc63以浓度依赖性的方式结合于人CS-1-Fc 3。使用计算机软件GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)获得的HuLuc63的EC50值是70.1ng/ml。这个与muLuc63获得的EC50值66.1ng/ml相似，
指出小鼠抗CS1单克隆抗体MuLuc63的人源化是成功的：HuLuc63保留了对人CS1很高的
结合亲和力。
地稀释于ELISA缓冲液中并加到ELISA平板(每孔100μl)。ELISA 平板室温下孵育1小
时，用清洗缓冲液清洗孔。然后100μl 1∶1000稀释于ELISA缓冲液的连接HRP的羊抗
人C 抗体或连接HRP的羊抗小鼠C 抗体(都来自Southern Biotech)分别加到HuLuC63
和MuLuc63平板的每个孔中并室温下孵育1小时。用清洗缓冲液清洗后，每孔加入100μl ABTS底物(KPL)。每孔加入100μl 2％草酸终止显色。使用VERSAmax酶标仪在415nm阅
读吸光度。ELISA结合试验的结果显示MuLuc63和HuLuc63以浓度依赖性的方式结合于人CS-1-Fc 3。使用计算机软件GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)获得的HuLuc63的EC50值是70.1ng/ml。这个与muLuc63获得的EC50值66.1ng/ml相似，
指出小鼠抗CS1单克隆抗体MuLuc63的人源化是成功的：HuLuc63保留了对人CS1很高的
结合亲和力。
[0701] 实施例6：CS1在自身免疫紊乱的作用
[0702] 与未刺激的细胞相比，CS1高度表达于刺激的T和B细胞：
[0703] 为了测定CS1的表达，建立体外试验使用美洲商路有丝分裂原(PWM)和植物凝血素(PHA)刺激外周血B和T淋巴细胞。平行地制备没有刺激的未刺激对照外周血单核细胞。分离多腺苷酸mRNA，使用标准技术从这些样品中合成cDNA。使用CS1特异性寡聚核苷酸引物(见上)通过PCR扩增CS1基因，使用Biorad Gel Doc 2000定量分析表达。用对照人
β-肌动蛋白对信号强度进行标准化。即时PCR分析指出与未刺激细胞相比，CS1在激活的外周血B细胞中显示了大约23倍的上调，激活的外周血T淋巴细胞中大约30倍的上调。 [0704] 与年龄配对的健康成人相比，狼疮患者外周血B淋巴细胞中CS1上调：
β-肌动蛋白对信号强度进行标准化。即时PCR分析指出与未刺激细胞相比，CS1在激活的外周血B细胞中显示了大约23倍的上调，激活的外周血T淋巴细胞中大约30倍的上调。 [0704] 与年龄配对的健康成人相比，狼疮患者外周血B淋巴细胞中CS1上调：
[0705] 为了评价与健康个人相比CS1在狼疮患者中的表达，通过从狼疮患 者和一群健+康成人CD19 细胞的细胞分捡分离外周血B淋巴细胞。分离多腺苷酸mRNA并使用标准技
术合成cDNA。使用CS1特异性寡核苷酸引物通过即时PCR评价CS1的表达。即时PCR数据
指出与健康个人相比狼疮患者的B淋巴细胞中CS1上调。用β-肌动蛋白标准化后，与健康个人cDNA相比狼疮患者B淋巴细胞cDNA中CS1基因增加2.3倍。当用18SrRNA引物标
准化后，各自的cDNA样品中CS1增加了1.8倍。
术合成cDNA。使用CS1特异性寡核苷酸引物通过即时PCR评价CS1的表达。即时PCR数据
指出与健康个人相比狼疮患者的B淋巴细胞中CS1上调。用β-肌动蛋白标准化后，与健康个人cDNA相比狼疮患者B淋巴细胞cDNA中CS1基因增加2.3倍。当用18SrRNA引物标
准化后，各自的cDNA样品中CS1增加了1.8倍。
[0706] 激活B和激活T细胞中小鼠新型Ly9的上调：
[0707] 小鼠新型Ly9是提出的人CS1的同源基因(Tovar等，Immunogenetics 54：394-402(2002))。用即时PCR检查了激活B和激活T细胞中小鼠新型Ly9的表达。数据显
示激活B和激活T细胞中小鼠新型Ly9是上调的。
示激活B和激活T细胞中小鼠新型Ly9是上调的。
[0708] 用ABI GeneAmp 5700序列检测系统分析小鼠新型Ly9表达(见实施例2)。用18S rRNA引物标准化后，与未刺激的脾cDNA相比，conA刺激的cDNA中Ly9基因增加了3倍，LPS刺激的cDNA中上调了6倍。
[0709] 炎性肠病组织中CS1的上调
[0710] 如上所述地在微芯片矩阵上测定IBD组织(克隆氏疾病和溃疡结肠炎)与正常组织相比IBD调节蛋白的表达。用来源于多个组织的cDNA检验(interrogate)寡核苷酸微矩阵。更加特异性地，体外转录实验(IVT)从九个IBD和九个配对的邻近正常肠样本和24个结肠上皮样品产生cDNA。用与基因表达水平直接成比例的平均荧光强度(AI)测量cDNA与寡核苷酸微矩阵的杂交。
[0711] 通过比较IBD和非病理成人组织和器官中基因的表达水平分析数据。鉴别出来在炎性肠病与正常组织相比基因表达显著增加的一个基因 是CS1。微矩阵分析显示与正常成人结肠上皮细胞相比CS1基因的表达在溃疡性结肠炎和克隆氏病中是增加的。
[0712] 为了进一步评价与正常个人相比CS1在炎性肠病中的表达，分解、清洗2个克隆氏疾病患者和3个溃疡性结肠炎患者的患病大肠切片与3个健康成人的正常大肠样品并置于 。遵循生产厂商试验方案分离总RNA。用无Rnase的Dnase(GenHunter)处理总RNA。用苯酚/氯仿提取Dnase消化的RNA，乙醇过夜沉淀。75％乙醇清洗RNA，溶于无核酸酶的水中。定量RNA，在琼脂糖凝胶上分析RNA的完整性。即时PCR数据指出与健康个人混合的正常肠(n＝3)相比，CS1在克隆氏病患者患病大肠(n＝2)中上调7倍和6倍，在溃
疡结肠炎患者患病大肠(n＝3)13倍、14倍和46倍。
疡结肠炎患者患病大肠(n＝3)13倍、14倍和46倍。
[0713] 实施例7：癌细胞上CS1表达
[0714] CS1蛋白表达模式：
[0715] 进一步用所产生Luc抗体通过FACS分析检查CS1蛋白表达。细胞系与抗CS1Luc90.H1抗体或小鼠IgG2b同型对照抗体冰上孵育30分钟。PBS清洗细胞，连接藻红蛋白(PE)的抗小鼠Ig加入到细胞并在冰上孵育30分钟。清洗细胞并在FACS Caliber(Becton Dickinson)上通过流式细胞仪进行分析。这些数据显示CS1表达于ARH-77白血病细胞系、CESS和IM9B类淋巴母细胞系和L363、LP1和OPM2骨髓瘤细胞系。
[0716] 多发性骨髓瘤患者(n＝21个骨髓样品)、MGUS(未知意义的单克隆免疫球蛋白病；患者(n＝1)、浆细胞白血病患者(n＝1)、骨髓动员CD34+干细胞(n＝5)、正常骨髓细胞(n＝3)、正常淋巴结组织(n＝1)、慢性成淋巴细胞白血病患者(CLL；n＝15)、急性骨髓性白血病患者(AML；n＝11)、非何杰金淋巴瘤患者(NHL；n＝1)和何杰金淋巴瘤患者(n＝1) 的样品与连接FITC的CS1抗体(Luc90或Luc63)、CD45-PerCP、CD38-PE和/或
CD138-PE孵育，并如上详述地对骨髓瘤细胞的FACS分析进行处理。此处使用的小鼠抗CS1抗体是Luc90(IgG2b)、Luc63(IgG2a)、Luc38(IgG2b)和其它产生的抗CS1 Luc抗体。同型对照抗体是同型配对小鼠IgG抗体。
CD138-PE孵育，并如上详述地对骨髓瘤细胞的FACS分析进行处理。此处使用的小鼠抗CS1抗体是Luc90(IgG2b)、Luc63(IgG2a)、Luc38(IgG2b)和其它产生的抗CS1 Luc抗体。同型对照抗体是同型配对小鼠IgG抗体。
[0717] 从Cleveland诊所多发性骨髓瘤患者获得骨髓抽吸物。骨髓瘤细胞系(LP1，L363，OPM2，NCI-H929，RPMI8226和U266B1)、白血病细胞系ARH-77、B类淋巴母细胞系(IM9、CESS)和骨髓细胞用抗CS1单克隆抗体和同型对照抗体(Becton Dickinson)遵循标准染色试验方案进行染色。清洗细胞，放置于染色缓冲液(对于人细胞RPMI，10％FBS或DMEM，10％FBS)中，加入抗CS1或同型对照抗体，0.1ml终体积每百万细胞0.5-1ug抗体。对于患者样品，裂解红细胞，离心收集细胞并悬浮于染色缓冲液。对于不直接连接于FITC的抗体，加入第二阶段抗体，0.1ml终体积每百万细胞0.5-1ug。清洗细胞，为了在Becton Dickinson FACSCaliber上使用CellQuest软件进行FACS分析，细胞悬浮于染色缓冲液。为了区别浆细胞，用抗CD45、抗多配体蛋白聚糖-1(CD138)和抗CD38单克隆抗体染色多发性骨髓瘤骨髓细胞。抗多配体蛋白聚糖-1(CD138)特异性染色浆细胞而不染其它粒细胞。
[0718] 结果显示CS1高度表达于十个多发性骨髓瘤患者的浆细胞和浆细胞白血病患者的浆细胞以及一些骨髓瘤细胞系(L363，LP1和OPM2)上。通过流式细胞仪分析总共21个多发性骨髓瘤患者的不同骨髓样品，对于所有的21个样品，基本上所有的骨髓浆细胞表达CS1。CS1也表达于ARH-77白血病细胞和B类淋巴母细胞系(IM9和CESS)。
[0719] 实施例8-CS1在骨髓瘤患者浆细胞上的表达
[0720] 用CD138-PE、CD45PerCP、Luc90-FITC和/或IgG2b-FITC(同型对 照抗体)染色多发性骨髓瘤患者的骨髓样品，如上面详述地(见实施例5)通过FACS进行分析。选择(gate)细胞而含有淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红系细胞、浆细胞和胚细胞。数据显示CS1表达于多发性骨髓瘤患者的浆细胞(例如CD138+细胞)上。
[0721] 实施例9：抗CS1单克隆抗体降低激活外周血B细胞的IgM的分泌
[0722] 标准聚蔗糖梯度分离正常成人外周血单核细胞，与10μg/ml美洲商路有丝分裂原(GIBCO/BRL，England，英国)孵育，接种于24孔板，总体积1ml。100μg/ml或10μg/ml的单克隆抗体(小鼠抗人CS1(Luc63)或小鼠IgG同型对照)加入到样品孔中。细胞和抗体在37℃7％CO2孵育8天。分离培养液的上清，如上述用ELISA分析IgM。结果显示与
100μg/ml或10μg/ml同型对照或没有抗体孵育的细胞的IgM的分泌相比，100μg/ml或
10μg/ml抗体Luc63降低外周血单核细胞IgM的分泌。
100μg/ml或10μg/ml同型对照或没有抗体孵育的细胞的IgM的分泌相比，100μg/ml或
10μg/ml抗体Luc63降低外周血单核细胞IgM的分泌。
[0723] 抗CS1单克隆抗体降低自身免疫疾病患者激活的外周血B细胞IgM的分泌：
[0724] 如上面详述地分离外周血单核细胞细胞培养物的上清并用ELISA进行分析。Immulon-1平板用100μl稀释于PBS的1μg/ml小鼠抗人IgM单克隆抗体(目录号
05-4900，Zymed实验室，Inc.，South SanFrancisco，California)包被。用ELISA缓冲液(‘EB’＝PBS+0.1％BSA+0.05％Tween20)封闭平板1小时。加入各种稀释度(稀释于EB)的培养上清，100μl/孔。上清与标准人IgM(目录号009-000-012，Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)室温下孵育1-2小时。用羊抗人IgM-HRP多克隆抗体(目录号2020-05，Southern BiotechAssociation，Birmingham，Alabama)和HRP底物遵循生产厂商试验方案显色捕获的人IgM。分光光度法在标准ELISA平板阅读仪上(405nm OD)观察结合的IgM。
数据显示狼疮患者PBMC分泌的IgM的量从用同种对照 抗体处理时的0.18ug/ml降低到抗CS1抗体(Luc90H1)处理的0.10ug/ml。分泌0.12ug/ml的IgM的阳性对照抗CD2抗体显
示抗CS1在降低IgM产生比抗CD2抗体甚至更加有效。
05-4900，Zymed实验室，Inc.，South SanFrancisco，California)包被。用ELISA缓冲液(‘EB’＝PBS+0.1％BSA+0.05％Tween20)封闭平板1小时。加入各种稀释度(稀释于EB)的培养上清，100μl/孔。上清与标准人IgM(目录号009-000-012，Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)室温下孵育1-2小时。用羊抗人IgM-HRP多克隆抗体(目录号2020-05，Southern BiotechAssociation，Birmingham，Alabama)和HRP底物遵循生产厂商试验方案显色捕获的人IgM。分光光度法在标准ELISA平板阅读仪上(405nm OD)观察结合的IgM。
数据显示狼疮患者PBMC分泌的IgM的量从用同种对照 抗体处理时的0.18ug/ml降低到抗CS1抗体(Luc90H1)处理的0.10ug/ml。分泌0.12ug/ml的IgM的阳性对照抗CD2抗体显
示抗CS1在降低IgM产生比抗CD2抗体甚至更加有效。
[0725] 抗CS1单克隆抗体降低健康成人和自身免疫疾病患者外周血B细胞IgM的产生
[0726] 用分析IgM产生的同样的方式分析了健康成人和自身免疫疾病(狼疮)患者外周血B细胞IgG的产生。结果显示抗CS1抗体(Luc 90H.1)处理9天后与IgG2b同型对照相比，健康成人外周血单核细胞IgG的总产量降低了大约23％。抗CS1抗体处理9天后狼疮患者外周血单核细胞IgG的总产量与IgG2b同型对照相比降低了大约56％。表3A和B概
括了许多产生的抗CS1抗体对IgG产生的抑制。如表3A所示，Luc90.H1降低了用脂多糖或美洲商陆有丝分裂原激活的PBMC大约40％的IgM的产生。Luc34.1降低了用美洲商陆分
裂原激活的PBMC大约38％的IgG的产生。如表3B所示，Luc90.H1降低了健康成人PBMC
和成熟B细胞系(IM9细胞)大约48％的IgG的产生。Luc 34.1降低了健康成人PBMC大
约53％的IgG的产生。Luc 63.2降低了PBMC和IM9细胞大约47％的IgG的产生。根据这
些实验，很明显Luc 90H.1、Luc34.1和Luc 63.2是最好的功能抗体。根据表位定位，Luc90和Luc63没有重叠的表位。
括了许多产生的抗CS1抗体对IgG产生的抑制。如表3A所示，Luc90.H1降低了用脂多糖或美洲商陆有丝分裂原激活的PBMC大约40％的IgM的产生。Luc34.1降低了用美洲商陆分
裂原激活的PBMC大约38％的IgG的产生。如表3B所示，Luc90.H1降低了健康成人PBMC
和成熟B细胞系(IM9细胞)大约48％的IgG的产生。Luc 34.1降低了健康成人PBMC大
约53％的IgG的产生。Luc 63.2降低了PBMC和IM9细胞大约47％的IgG的产生。根据这
些实验，很明显Luc 90H.1、Luc34.1和Luc 63.2是最好的功能抗体。根据表位定位，Luc90和Luc63没有重叠的表位。
[0727] 表3A.抗CS-1降低了体外激活B细胞的IG的产生
[0728] 与同型对照相比降低的平均百分比
[0729]体外激活的PBMC 抗CS-1单克隆抗体 降低平均％ HuIgG±SE
脂多糖 Luc 90.H1 41％±8％(n＝3)
美洲商陆有丝分裂原 Luc 90.H1 39％±9％(n＝4)
美洲商陆有丝分裂原 Luc 34.1 38％±7％(n＝4)
脂多糖 Luc 90.H1 41％±8％(n＝3)
美洲商陆有丝分裂原 Luc 90.H1 39％±9％(n＝4)
美洲商陆有丝分裂原 Luc 34.1 38％±7％(n＝4)
[0730] 表3B.抗CS-1抗体组Ig产生试验的总结
[0731] 与同型对照相比IG改变百分比
[0732]gI n
i eg
nahC
％
egar ％ ％ ％ ％ ％ ％
evA 84- 41- ％4- 74- 35- 92- 73-
9MI ％34- ％11- ％6+ ％63- ％54- ％12- ％52-
507
ron
oD
CBMP ％65- ％34- ％4- ％15- ％94- ％44- ％44-
55
ron
oD
CBMP ％44- ％11+ ％31- ％55- ％46- ％22- ％34-
ba
M 1 1
SC-I .H09 73 32 2.36 1.43 1.83 6D92
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[0733]32
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[0734] 实验结果指出体外抗CS1抗体降低了外周血B细胞IgG和IgM的产生。
[0735] 实施例10：SCID-HuPBMC小鼠模型体内CS1单克隆抗体对IgG的降低。
[0736] SCID-HuPBMC 小鼠模型
[0737] 标准淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque)(Amersham Biosciences)密度梯度分离7
人外周血单核细胞(PBMC)，悬浮于磷酸盐缓冲溶液(PBS)，2×10 个PBMCs/ml。悬浮的
PBMC(lml)腹腔注射(i.p.)到C.B-17SCID 小鼠。PBMC注射两至三周后，从小鼠取血清样品，ELISA分析人IgG。接种小鼠(血清中产＞1μg/ml人IgG)随机分入各治疗组，然后用小鼠抗人CS-1单克隆抗体(Luc90.H1或Luc 63.2.22)、小鼠同型对照抗体(分别是IgG2b或IgG2a)或PBS治疗。给予小鼠500μl PBS，其中有200ug抗体，每3-4天3或4个剂量
的抗体。使用标准试验方案ELISA分析小鼠血清人IgG。
人外周血单核细胞(PBMC)，悬浮于磷酸盐缓冲溶液(PBS)，2×10 个PBMCs/ml。悬浮的
PBMC(lml)腹腔注射(i.p.)到C.B-17SCID 小鼠。PBMC注射两至三周后，从小鼠取血清样品，ELISA分析人IgG。接种小鼠(血清中产＞1μg/ml人IgG)随机分入各治疗组，然后用小鼠抗人CS-1单克隆抗体(Luc90.H1或Luc 63.2.22)、小鼠同型对照抗体(分别是IgG2b或IgG2a)或PBS治疗。给予小鼠500μl PBS，其中有200ug抗体，每3-4天3或4个剂量
的抗体。使用标准试验方案ELISA分析小鼠血清人IgG。
[0738] 通过从(第X天)给药后人IgG浓度减去第一次给予抗体(第0天)前人IgG浓度，除以第一次给予抗体(第0天)前人IgM浓度并乘以100，例如[(第x天-第0天)/
第0天]×100，计算每只小鼠血清人IgG的改变百分比。数据显示为每组小鼠的平均变化百分比和标准误。人IgG浓度是每组小鼠的平均浓度和标准误。Welch2样本t检验用于比较治疗组之间人IgG的变化百分比。
第0天]×100，计算每只小鼠血清人IgG的改变百分比。数据显示为每组小鼠的平均变化百分比和标准误。人IgG浓度是每组小鼠的平均浓度和标准误。Welch2样本t检验用于比较治疗组之间人IgG的变化百分比。
[0739] 体内抗CS1抗体降低人IgG的产生
[0740] 数据显示本发明的抗CS1抗体基本降低了SCID-HuPBMC转移模型中人免疫球蛋白的产生。如图1A所示，Luc90.H1早在第4天(第一次给予抗体的治疗4天后)就抑制了PBS和同型对照中IgG产生的增加。在整个7周(32天)的测试期间这个降低一直持续。
例如，第18天，IgG2b同型对照人IgG的产生增加了225％，PBS对照181％，而Luc90H.1治疗使人IgG的产生降低了14％。Luc90H.1不仅取消了对照组人IgG产生181-225％的增
加，还使IgG产生降低了14％。第25天，Luc90H.1不仅取消了对照组中人IgG产生3倍的增加，也使人IgG产生降低了24％。
例如，第18天，IgG2b同型对照人IgG的产生增加了225％，PBS对照181％，而Luc90H.1治疗使人IgG的产生降低了14％。Luc90H.1不仅取消了对照组人IgG产生181-225％的增
加，还使IgG产生降低了14％。第25天，Luc90H.1不仅取消了对照组中人IgG产生3倍的增加，也使人IgG产生降低了24％。
[0741] 体内Luc63.2也有效地降低了IgG的产生。如图1B所示，Luc63.2取消了对照组(PBS和IgG2a同型对照)中人IgG产生的37-46％的增加并导致IgG产生的59％的额外的降低。相同研究中，Luc90.H1与Luc63.2相比，Luc90.H1取消了对照组(PBS和IgG2b同型对照)中37-114％的 增加并导致接种人外周血单核细胞(PBMC)的小鼠IgG产生的14％
的额外的降低。
的额外的降低。
[0742] 图1C进一步概括了SCIDHuPBMC模型中Luc90和Luc63治疗对IgG产生的降低。取消同型和PBS对照治疗的小鼠中IgG产生的增加时，Luc90造成了IgG产生的14％，22％，
24％和39％的额外的降低，Luc63有40％和59％的额外的降低。因而，我们能够推断对接种了人PBMC(SCID-HuPBMC)SCID小鼠的抗Luc的治疗不仅完全取消了这些动物的血清中观察到的人免疫球蛋白的增加，也导致了与治疗前水平相比有额外的降低。
24％和39％的额外的降低，Luc63有40％和59％的额外的降低。因而，我们能够推断对接种了人PBMC(SCID-HuPBMC)SCID小鼠的抗Luc的治疗不仅完全取消了这些动物的血清中观察到的人免疫球蛋白的增加，也导致了与治疗前水平相比有额外的降低。
[0743] 实施例11：抗CS1抗体的ADCC活性
[0744] 效应细胞的制备：
[0745] 使用标准密度淋巴细胞分离液(Amersham Biosciences)梯度从全血分离人外周血单核细胞(PBMC)。清洗细胞并悬浮于补充了1％牛血清白蛋白(BSA)的RPMI培养基中。 [0746] 靶细胞的制备：
[0747] 清洗表达细胞表面CS-1的稳定转染细胞(靶细胞)，并悬浮于补充了1％BSA的RPMI培养基。细胞接种于平板，每孔100,000个细胞，总体积50μl。不同浓度的小鼠抗人CS-1单克隆抗体(Luc90.H1或Luc63.2.22)或同型对照抗体(分别是小鼠IgG2b或IgG2a)
加入到靶细胞，终体积100μl，室温下孵育30分钟。
加入到靶细胞，终体积100μl，室温下孵育30分钟。
[0748] 孵育后，100μl效应PBMC以20∶1的比例加入到靶细胞，终体积200μl。靶和效应细胞37℃孵育5小时或过夜。细胞350Xg离心5分钟，收集100μl/孔的上清并转移到光学澄清的96孔平底微孔滴定板。
[0749] 乳酸脱氢酶试验；
[0750] 为了测定上清中含有的乳酸脱氢酶(LDH)活性，每孔中加入细胞毒性检测试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)的100μl反应混合物，样品在15-25℃孵育共30分钟。这个孵育期间，微量滴定板避光。使用ELISA酶标仪测量样品490nm的吸光度。
[0751] 为了测定细胞介导的细胞毒性百分比，计算样品的平均吸光度并使用下面的公式减去背景对照：
[0752]
[0753] SR：自发释放
[0754] MR：最大释放
[0755] 实验对照是靶细胞自身或效应细胞自身的自发释放。2％Triton-X100(1∶1)溶液中分析靶细胞。
[0756] 抗CS-1抗体诱导抗体衍生的细胞毒性(ADCC)
[0757] 实验显示在PBMC(效应细胞)存在下抗CS1抗体Luc63.2和Luc90诱导表达CS1的细胞的抗体衍生细胞毒性(ADCC)。结果显示Luc90剂量以依赖性的方式诱导了细胞毒性。
Luc9050μg/m l的量诱导了几乎50％的靶细胞的细胞毒性。Luc63.2一般在10-50μg/ml的剂量范围诱导了60-80％靶细胞的细胞毒性。对两个额外的供者进行的试验获得了相似的结果。
Luc9050μg/m l的量诱导了几乎50％的靶细胞的细胞毒性。Luc63.2一般在10-50μg/ml的剂量范围诱导了60-80％靶细胞的细胞毒性。对两个额外的供者进行的试验获得了相似的结果。
[0758] 实施例12：低岩藻糖CS1抗体的ADCC活性
[0759] Luc90可变区cDNA的克隆
[0760] 用标准方法从Luc90杂交瘤细胞系克隆鼠可变区(序列号#3和#4)。简要地，提取总RNA，遵循供应商的实验方案使用SMART 5’-RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)合成双链cDNA。为了序列的测定，将可变区cDNA的PCR片段克隆进pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。对一些质粒克隆测序每一个重和轻链。鉴别了与一般的小鼠重和轻链可变区同源的唯一序列。
[0761] 嵌合Luc90VH和VL表达载体的构建
[0762] 将编码每个Luc90VH和VL的基因设计成迷你外显子，包括信号肽、左拼接剪接信号、Kozak起始序列和其后克隆进哺乳动物表达载体的适当的限制性酶切位点。从含有VH或VL基因的TOPO载体设计引物以含有为了PCR的合适的限制性位点和互补性。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR扩增的片段并用MluI和XbaI消化。
Luc90VH基因亚克隆进pHuHCgl.D(野生型)或pHuHCgl.D.AA(BS突变体)以分别产生
质粒pChiHuHCgl.D-MuLuc90VH和pChiHuHCgl.D.AA-MuLuc90VH。BS突变体在IgGl CH2
区含有两个氨基酸的改变(L234A/L235A)，使得与Fc受体的结合被取消(Xu等，(2000)
CellImmunol.200：16-26)。Luc90VL基因亚克隆进pVk以产生质粒pChiVk-MuLuc90VL。制造单个质粒表达载体而能从单个质粒表达重和轻链基因。用EcoRI消化重链载体以去除全部重链区并亚克隆进轻链载体的单个EcoRI位点。BS突变体重链与pChiVk-MuLuc90VL载体片段联合以产生质粒pChiLuc90-BSK，而野生型重链亚克隆进pChiVk-MuLuc90VL载体以产生质粒pChiLuc90-glK。
Luc90VH基因亚克隆进pHuHCgl.D(野生型)或pHuHCgl.D.AA(BS突变体)以分别产生
质粒pChiHuHCgl.D-MuLuc90VH和pChiHuHCgl.D.AA-MuLuc90VH。BS突变体在IgGl CH2
区含有两个氨基酸的改变(L234A/L235A)，使得与Fc受体的结合被取消(Xu等，(2000)
CellImmunol.200：16-26)。Luc90VL基因亚克隆进pVk以产生质粒pChiVk-MuLuc90VL。制造单个质粒表达载体而能从单个质粒表达重和轻链基因。用EcoRI消化重链载体以去除全部重链区并亚克隆进轻链载体的单个EcoRI位点。BS突变体重链与pChiVk-MuLuc90VL载体片段联合以产生质粒pChiLuc90-BSK，而野生型重链亚克隆进pChiVk-MuLuc90VL载体以产生质粒pChiLuc90-glK。
[0763] 嵌合Luc90的表达
[0764] 分别用pChiLuc90-glK和pChiLuc90-BSK载体稳定转染Sp2/0细胞 产生嵌合Luc90IgGl/野生型和BS抗体。pChiLuc90-glK载体稳定转染YB2/0细胞产生低岩藻糖抗
体。用酶酚酸培养基挑选阳性克隆并通过ELISA筛选。挑选高表达的野生型克隆AH4、BS突变体HG12和低岩藻糖克隆5E4，适应于Gibco杂交瘤有2％低Ig胎牛血清的无血清培养基。为了纯化，两升培养物生长于滚动瓶。通过标准蛋白G亲合柱色谱纯化抗体。
体。用酶酚酸培养基挑选阳性克隆并通过ELISA筛选。挑选高表达的野生型克隆AH4、BS突变体HG12和低岩藻糖克隆5E4，适应于Gibco杂交瘤有2％低Ig胎牛血清的无血清培养基。为了纯化，两升培养物生长于滚动瓶。通过标准蛋白G亲合柱色谱纯化抗体。
[0765] 结果显示在表达人CS1的稳定细胞系和两个人骨髓瘤细胞系OPM2和L363中抗CS1 Luc90嵌合抗体刺激了表达CS1细胞的抗体依赖性细胞的细胞毒性。每个情况下，具有低水平海藻糖的抗体(通过上面详述的YB2/0细胞中的生长)显著增强了细胞毒性。
[0766] 实施例13：抗CS1抗体对骨髓瘤的治疗
[0767] 体内在骨髓瘤小鼠肿瘤模型上通过腹腔内注射抗CS1抗体到受试研究对象进行抗体的治疗。如图2所示，与同型对照治疗的动物相比，抗CS1抗体治疗(Luc63和Luc90)7
降低肿瘤的体积。该研究中，1×10 个骨髓瘤细胞(L363骨髓瘤细胞系)腹腔注射到
CB.17SCID小鼠。两个星期后，当肿瘤体积到达～80mm3，小鼠随机分成4组，每组8只小鼠。用抗CS1抗体(Luc63或Luc90)或同型对照抗体(小鼠IgG2a或小鼠IgG2b)治疗小
鼠。给予小鼠200μg抗体/小鼠的剂量，每周给予3次共8次。结果显示抗CS1抗体治疗
的小鼠与同型对照抗体治疗的小鼠相比具有显著降低的肿瘤体积。研究的第25天(5次给
3
药后)，与IgG2a同型对照抗体治疗的小鼠(平均肿瘤体积～800mm)相比，Luc63治疗的
3
小鼠显示平均肿瘤体积～100mm。与IgG2b同型对照抗体治疗小鼠(它们具有平均肿瘤体
3 3
积～950mm)Luc90治疗小鼠显示了平均肿瘤体积～400mm。抗CS1的Luc63治疗的小鼠
直到治疗后2.5周没有可以测量的肿瘤，指出抗体在消灭致瘤细胞惊人的功效。
降低肿瘤的体积。该研究中，1×10 个骨髓瘤细胞(L363骨髓瘤细胞系)腹腔注射到
CB.17SCID小鼠。两个星期后，当肿瘤体积到达～80mm3，小鼠随机分成4组，每组8只小鼠。用抗CS1抗体(Luc63或Luc90)或同型对照抗体(小鼠IgG2a或小鼠IgG2b)治疗小
鼠。给予小鼠200μg抗体/小鼠的剂量，每周给予3次共8次。结果显示抗CS1抗体治疗
的小鼠与同型对照抗体治疗的小鼠相比具有显著降低的肿瘤体积。研究的第25天(5次给
3
药后)，与IgG2a同型对照抗体治疗的小鼠(平均肿瘤体积～800mm)相比，Luc63治疗的
3
小鼠显示平均肿瘤体积～100mm。与IgG2b同型对照抗体治疗小鼠(它们具有平均肿瘤体
3 3
积～950mm)Luc90治疗小鼠显示了平均肿瘤体积～400mm。抗CS1的Luc63治疗的小鼠
直到治疗后2.5周没有可以测量的肿瘤，指出抗体在消灭致瘤细胞惊人的功效。
[0768] 骨髓瘤另外的模型系统包括将荧光标记或未标记的骨髓瘤或成熟B细胞系例如ARH77、CESS、IM9、L363、LP1和OPM2通过静脉(i.v.)、 腹腔(i.p.)接种或直接注射到骨头(常位)(orthotopically)的SCID小鼠。这些细胞系将用于测试骨髓瘤动物模型系统中拮抗剂治疗的效果。这些细胞系表达抗人CS1抗体识别的表位。动物随机分组并进行用抗人CS1抗体或对照抗体(例如，同型对照抗体)的治疗方案。在几个剂量水平给予抗体，例如1-10mg/kg的剂量，每3-4天腹腔给予，总共9-10次。每周两次测量每个治疗组的肿瘤体积共35-40天。记下骨髓瘤的临床表现。记录每只小鼠的死亡日期。也将开始动物研究以测定抗CS1抗体治疗和化疗之间可能的协同作用。允许接种肿瘤生长直到它们体积达
3
到大约50-100mm，并且对于i.v.、i.p.或常位注射的小鼠，癌细胞可以接种到动物体内。
在那个时候，动物随机分组，并进行抗人CS1抗体或对照抗体(例如，同型对照抗体)的治疗方案。或者，对动物进行抗人CS1抗体或对照抗体(例如，同型对照抗体)联合标准化疗试剂的治疗方案，化疗试剂包括脱氢可的松和美法兰或其它烷化剂(例如环磷酸胺或苯丁酸氮芥)的联合，或长春新碱、阿霉素和高剂量地塞米松(VAD)的治疗或其它本领技术人员已知的化疗方案。在一些剂量水平给予抗体，例如1-10mg/kg的剂量共9-10次，每3-4天腹腔给予。每3-4天腹腔给予有效浓度的化疗，例如1mg/kg或本领域技术人员已知的其它有效剂量。每周两次测量每个治疗组的肿瘤体积共35-40天。记下骨髓瘤临床表现，包括注射了分泌人免疫球蛋白的细胞系(IM9、CESS、ARH-77和LP-1)的小鼠中的血清免疫球蛋白。记录每只小鼠的死亡日期。将评价在化疗存在和不存在时抗体治疗的功效。
3
到大约50-100mm，并且对于i.v.、i.p.或常位注射的小鼠，癌细胞可以接种到动物体内。
在那个时候，动物随机分组，并进行抗人CS1抗体或对照抗体(例如，同型对照抗体)的治疗方案。或者，对动物进行抗人CS1抗体或对照抗体(例如，同型对照抗体)联合标准化疗试剂的治疗方案，化疗试剂包括脱氢可的松和美法兰或其它烷化剂(例如环磷酸胺或苯丁酸氮芥)的联合，或长春新碱、阿霉素和高剂量地塞米松(VAD)的治疗或其它本领技术人员已知的化疗方案。在一些剂量水平给予抗体，例如1-10mg/kg的剂量共9-10次，每3-4天腹腔给予。每3-4天腹腔给予有效浓度的化疗，例如1mg/kg或本领域技术人员已知的其它有效剂量。每周两次测量每个治疗组的肿瘤体积共35-40天。记下骨髓瘤临床表现，包括注射了分泌人免疫球蛋白的细胞系(IM9、CESS、ARH-77和LP-1)的小鼠中的血清免疫球蛋白。记录每只小鼠的死亡日期。将评价在化疗存在和不存在时抗体治疗的功效。
[0769] 实施例14：人源化抗CS1抗体对多发性骨髓瘤的治疗
[0770] 体内在多发性骨髓瘤小鼠肿瘤模型上通过腹腔注射人源化抗CS1抗体到受试研究对象进行抗体的治疗，相似于实施例13中所述的实例。雌性ICR/SCID小鼠皮下(侧腹)接种多发性骨髓瘤系OPM-2(1千万个细胞/动物)。允许肿瘤确立，一旦肿瘤达到平均体积3 3
100mm 小鼠随机分成8组(8组每组8只小鼠，平均肿瘤体积mm)。
100mm 小鼠随机分成8组(8组每组8只小鼠，平均肿瘤体积mm)。
[0771] 然后用下面的抗体治疗小鼠，腹腔每周给予3次。
[0772] 第1组磷酸盐缓冲盐水对照(PBS)
[0773] 第2组10mg/kg鼠Luc63抗体(MULuc63)
[0774] 第3组10mg/kg无关人源化IgGl抗体作为对照(cHUIgGl)
[0775] 第4组10mg/kg人源化Luc63(HULuc63)
[0776] 第5组3mg/kg人源化Luc63(HULuc63)
[0777] 第6组10mg/kg在残基234和235有丙氨酸突变的人源化Luc63(HuLuc63a，a)-已知这个突变影响IgGlFc对FcR的结合，因而影响抗体传递Fc依赖性功能的能力，包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
[0778] 图3中显示了这个实验的结果。如前面观察地，10mg/kg MULuc63抗体体内降低肿瘤生长是有效的。在第46天(9次抗体给予最后一次5天之后)5/8只动物没有可以测量的肿瘤。虽然HULuc63在3mg/kg和10mg/kg降低肿瘤生长是有效的，人源化抗体在小鼠中不如鼠抗体有效。令人有兴趣的是在这个模型中在残基234和235突变的人源化Luc63抗体没有证明任何功效。确实，像两个对照组，PBS和人源化IgGl(cHUI gGl)、HULuc63a，a突变体治疗的动物在第39天不得不处死(给予第8次抗体的那天)，因为肿瘤太大了(并
且根据IACUC规定，动物必须处死)。HULuc63a，a突变体得到的数据指出抗体的Fc部分在这个模型是重要的，提示Luc63抗体(及其人源化版本)工作的一个机制是通过引入的Fc介导的效应子功能例如ADCC(或可能是受体的交联)。
且根据IACUC规定，动物必须处死)。HULuc63a，a突变体得到的数据指出抗体的Fc部分在这个模型是重要的，提示Luc63抗体(及其人源化版本)工作的一个机制是通过引入的Fc介导的效应子功能例如ADCC(或可能是受体的交联)。
[0779] 结果提示能够通过增加抗体ADCC活性增强CS1抗体在人类治疗中的功效。增加ADCC活性的方法包括提供实施例12的低岩藻糖抗体并且在CS1抗体Fc部分中产生突变，特别是如美国专利号6,737,056B1和 美国专利申请2004/0132101A1提供地增加抗体对Fc R受体的亲和力的突变，每个此处完整引物作为参考。
[0780] 患者也可以用抗人CS1抗体联合标准化疗试剂进行治疗，包括泼尼松和美法兰或其它烷化剂(例如环磷酰胺或苯丁酸氮芥)的联合，或长春新碱、阿霉素和高剂量的地塞米松(VAD)的治疗、沙利度胺、velcade或本领域技术人员已知的其它化疗方案。
[0781] 实施例15：体内SCID-HuPBMC小鼠模型中人源化抗CS1抗体对IgG的降低
[0782] SCID-HuPBMC小鼠模型
[0783] 标准淋巴细胞分离液(Amersham Biosciences)密度梯度分离人外周血单核细7
胞(PBMC)，并悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中，2×10 个PBMCs/ml。悬浮的PBMC(1ml)腹
腔(i.p.)注射到C.B-17SCID小鼠。PBMC注射后两至三周，从小鼠取血清样品，ELISA分析人Igλ。接种的小鼠(血清中产＞1μg/ml人Igλ随机分入各治疗组，然后用人源
化Luc63(HuLuc63)或人IgGl同型对照抗体治疗。每3-4天小鼠给予500μlPBS，其中含
200μg抗体，共4个剂量的抗体。使用标准试验方案通过ELISA分析小鼠血清人Igλ。通过人Igλ的检测，我们测量了所注射的人B细胞产生的免疫球蛋白，与用于治疗小鼠的人源化和对照人抗体相反，因为人源化抗体具有κ轻链而没有λ轻链。
胞(PBMC)，并悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中，2×10 个PBMCs/ml。悬浮的PBMC(1ml)腹
腔(i.p.)注射到C.B-17SCID小鼠。PBMC注射后两至三周，从小鼠取血清样品，ELISA分析人Igλ。接种的小鼠(血清中产＞1μg/ml人Igλ随机分入各治疗组，然后用人源
化Luc63(HuLuc63)或人IgGl同型对照抗体治疗。每3-4天小鼠给予500μlPBS，其中含
200μg抗体，共4个剂量的抗体。使用标准试验方案通过ELISA分析小鼠血清人Igλ。通过人Igλ的检测，我们测量了所注射的人B细胞产生的免疫球蛋白，与用于治疗小鼠的人源化和对照人抗体相反，因为人源化抗体具有κ轻链而没有λ轻链。
[0784] 通过从给予抗体后(第x天)人Igλ浓度减去第一次给予(第0天)前人Igλ浓度，除以第一次给予抗体前(第0天)人Igλ浓度并乘以100，例如[(第x天-第0天)/
第0天]×100，计算每只小鼠血清人Igλ的改变百分比。数据显示为比较研究的第0天和第14天每组小鼠的平均变化百分比和标准误。
第0天]×100，计算每只小鼠血清人Igλ的改变百分比。数据显示为比较研究的第0天和第14天每组小鼠的平均变化百分比和标准误。
[0785] 体内人源化抗CS1抗体降低人免疫球蛋白的产生
[0786] 数据显示本发明的抗CS1抗体基本上降低了SCID-HuPBMC转移模型中人免疫球蛋白的产生。模型中，有如同型对照治疗小鼠中见到的模型内在性免疫球蛋白的产生～300％的增加。HuLuc63取消了免疫球蛋白～300％的增加，并导致免疫球蛋白额外的2％的降低。因而，我们能推断，与用小鼠抗人CS1的治疗相似，用人源化抗CS1 Luc63抗体对接种了人PBMC的SCID小鼠(SCID-HuPBMC)的治疗不仅完全取消了通常在这些动物血清中观察到的人免疫球蛋白的增加，而且与治疗前水平相比还导致了额外的降低。因此，人源化抗CS1抗体将给患人免疫球蛋白产生相关疾病的病人提供有用的治疗剂。
[0787] 实施例16：额外的抗CS1和人源化抗CS1单克隆抗体
[0788] 使用标准技术克隆抗体重和轻链可变区。简要地，使用SMART RACEcDNA扩增试剂6
盒(BD Biosciences Clontech)使用1-5x10 个细胞的总RNA制备cDNA，使用互补于小鼠重和轻链恒定区的基因特异性引物PCR扩增可变区。
盒(BD Biosciences Clontech)使用1-5x10 个细胞的总RNA制备cDNA，使用互补于小鼠重和轻链恒定区的基因特异性引物PCR扩增可变区。
[0789] 表9显示抗体Luc69、LucX.1和LucX.2成熟重链和成熟轻链的氨基酸序列，它提供了Luc69重链可变区(SEQ ID NO：51)和轻链可变区(SEQ IDNO：52)的氨基酸序列；
LucX.1重链可变区(SEQ ID NO：59)和轻链可变区(SEQ ID NO：60)的氨基酸序列；LucX.2重链可变区(SEQ ID NO：67)和轻链可变区(SEQ ID NO：68)的氨基酸序列。SEQ ID NOS：
53、54和55分别描述了Luc69重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：56、
57和58分别描述了Luc69轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQID NOS：61、62和
63分别描述了LucX1重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：64、65和66分别描述了LucX.1轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：69、70和71分别描述了LucX.2重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：72、73和74分别描述了LucX.2轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
LucX.1重链可变区(SEQ ID NO：59)和轻链可变区(SEQ ID NO：60)的氨基酸序列；LucX.2重链可变区(SEQ ID NO：67)和轻链可变区(SEQ ID NO：68)的氨基酸序列。SEQ ID NOS：
53、54和55分别描述了Luc69重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：56、
57和58分别描述了Luc69轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQID NOS：61、62和
63分别描述了LucX1重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：64、65和66分别描述了LucX.1轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：69、70和71分别描述了LucX.2重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOS：72、73和74分别描述了LucX.2轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
[0790] 表9 CS1抗体Luc69和LucX的氨基酸序列
[0791] Luc69 VH-SEQ ID NO：51
[0792] QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSNSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKSNG
[0793] KF
[0794] SEQ ID NO：53 SEQ ID NO：
[0795] 54
[0796] KGKATLTADKSSRAAYMQLSSLTSVDSAVYFCARSTMIMTGAMDYWGQGTSVTVSS
[0797] SEQ ID NO：55
[0798] Luc69 VL-SEQ ID NO：52
[0799] DIVMTQSHKFMSTSVGDRVIITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASFRYTGVPDRF
[0800] TG
[0801] SEQ ID NO：56 SEQ ID NO：57
[0802] SGSGTDFTFTVSSVQAEDLAVYYCQQHYSTPPYTFGGGTKLEIK
[0803] SEQ ID NO：58
[0804] LucX.1 VH-SEQ ID NO：59
[0805] QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKYNG
[0806] KF
[0807] SEQ ID NO：61 SEQ ID NO：
[0808] 62
[0809] KGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARSTMIATGAMDYWGQGTSVTVSS
[0810] SEQ ID NO：63
[0811] LucX.1 VL-SEQ ID NO：60
[0812] ETTVTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRF
[0813] SS
[0814] SEQ ID NO：64 SEQ ID NO：65
[0815] SGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPLTFGGGTKLEIK
[0816] SEQ ID NO：66
[0817] LucX.2 VH-SEQ ID NO：67
[0818] QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKYNG
[0819] KF
[0820] SEQ ID NO：69 SEQ ID NO：
[0821] 70
[0822] KGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARSTMIATGAMDYWGQGTSVTVSS
[0823] SEQ ID NO：71
[0824] LucX.2 VL-SEQ ID NO：68
[0825] DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRF
[0826] TG
[0827] SEQ ID NO：72 SEQ ID NO：73
[0828] SGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPPYTFGGGTKLEIK
[0829] SEQ ID NO：74
[0830] 表9中的抗体Luc69、LucX.1和LucX.2和表4中的Luc90和Luc34将根据Queen等，美国专利号5,5301,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370教授的方法被人源化。
[0831] 简要地，方法涉及提供一个或多个供体(小鼠)免疫球蛋白的互补决定区域(CDR)和人免疫球蛋白的框架区域。优选的方法包含首先将供体免疫球蛋白的框架或可变区氨基酸序列与人免疫球蛋白链收集的相应序列进行比较，并从收集选择一个更加同源的序列作为人免疫球蛋白。人免疫球蛋白或受体免疫球蛋白序列一般选自至少10至20个或更多的免疫球蛋白可变区序列的收集，将通常与收集中任何序列的供体免疫球蛋白序列有最高同源性。人免疫球蛋白框架序列一般将与供体免疫球蛋白框架序列有大约65至70％或更高的同源性。供体免疫球蛋白可以是重链或者轻链，人的收集将含有相同种类的链。人源化轻和重链能用于形成完整的人源化免疫球蛋白或抗体，具有两个轻/重链对，有或没有部分或全长人恒定区。
[0832] 为了形成人源化可变区，人受体序列中的氨基酸将被供体序列的相应氨基酸替代，如果它们是如下种类：(1)氨基酸在CDR中。联合上面的比较步骤或各自地，受体免疫球蛋白链中额外的氨基酸可以被CDR供体免疫球蛋白链的氨基酸取代。更加特异性地，受体免疫球蛋白的人框架氨基酸还选择性地被供体免疫球蛋白的相应氨基酸取代将在一个或多个如下种类的位置进行：(2)对于那个位置，受体免疫球蛋白人框架区域中的氨基酸是罕见的，并且对于人免疫球蛋白序列中的那个位置供体免疫球蛋白中相应的氨基酸是常见的；或者(3)氨基酸紧邻着一个CDR；或者(4)预言氨基酸能够与抗原或者供体或人源化免疫球蛋白的CDR相互作用。另外，如果(5)对于那个位置受体免疫球蛋白中的氨基酸是罕见的并且相对于其它人序列氨基酸供体免疫球蛋白中相应的氨基酸也是罕见的，那么在那个位置受体序列中的氨基酸可选地被人序列特有的(typical)氨基酸取代。
[0833] 当联合进完整抗体中时，人源化轻和重链在人类将一般是非免疫原性的，并且基本保留与供体免疫球蛋白相同的对CS1的亲和力。
[0834] 一旦设计了，免疫球蛋白，包括结合片段和其他免疫球蛋白形式通过各种重组DNA或其它技术可以很容易地产生。优选地，合成地产生编码期望氨基酸序列的多核苷酸并且通过连接合适的核酸序列而最终在转染细胞中表达。如详述中详细描述地，人源化抗CS1单克隆抗体对于治疗对单克隆抗体治疗敏感的人类紊乱将特别有用。
[0835] 实施例17：其它灵长类的CS1序列。
[0836] 测定一些包括cynos、黑猩猩和猕猴的非人灵长类CS1细胞外结构域的氨基酸序列，并与人序列比较。测定猕猴激活的PBMC样品的猕猴序列。测定之前用OKT3刺激的PBMC样品的黑猩猩序列。测定cynosmonkey激活的PBMC样品的cynos序列。
[0837] 利用Trizol LS试剂(Invitrogen)/氯仿提取从组织样品中制备RNA，之后是RNAeasy微量试剂盒(Qiagen)的净化。
[0838] 使用SMARTRACE(Clontech)制备第一链cDNA。用按照每个种类发表的序列所设计的引物，或如果没有特异性种类的序列使用人序列进行PCR，以分离覆盖兴趣区域的片段。这些片段克隆进TOPO克隆系统(Invitrogen)，在AB 3100遗传分析仪上测序。
[0839] 一旦确定了种类特异性序列，用含有表达载体必需的限制性位点的克隆引物PCR所需的片段。每个种类的细胞外结构域亚克隆进NEF39HAPPFc、NEF39Fc或NIF Fc载体以及全长ORF亚克隆进NEF39 HA ICD4载体。从核酸序列的翻译确定氨基酸序列。表10(SEQ ID NOS：75、76、 77和78)分别显示了cynos、猕猴、人和黑猩猩的每个序列的比对。从蛋氨酸开始比对序列并且包括各自的信号肽。物种之间的同源氨基酸序列用*号表示。
[0840] 表10灵长类CS1序列(SEQ ID NO：75-78)的比对
[0841] cynos MAGSPTCFTFIYILWQLTGSTASGSVKELVGSIGGAVTFPLKSEVKQVDSIVWTFNTTTL 60 [0842] 猕猴 MAGSPTCLTFIYILWQLTGSTASGSVKELVGSIGGAVTFPLKSEVKQVDSIVWTFNTTTL 60 [0843] 人 MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPL 60 [0844] 黑猩猩 MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVRELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPL 60 [0845] ******:＊:＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊:＊＊＊.＊:＊＊＊＊＊:＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊:＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊.＊
[0846] cynos VTIQPEGGPMIVTQNRNKERVHFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYNVEIYSSSLQDPFTRKY 120 [0847] 猕猴 VTIQPEGGPMIVTQNRNKERVHFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYNVEIYSSSLQDPFTRKY 120 [0848] 人 VTIQPEGGTIIVTQNRNRERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEY 120 [0849] 黑猩猩 VTIQPEGGTIIVTQNRNKERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQKY 120 [0850] ＊＊＊＊＊＊＊＊.:＊＊＊＊＊＊＊:＊＊＊.＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ ＊ ＊＊＊＊＊＊＊:＊ ＊::＊
[0851] cynos VLRVYEHLSKPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAVNESHNGSIL 180 [0852] 猕猴 VLRVYEHLSKPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCHMEHGEEDVIYTWKALGQAVNESHNGSIL 180 [0853] 人 VLHVYEHLSKPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAANESHNGSIL 180 [0854] 黑猩猩 VLHVYEHLSKPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAANESHNGSIL 180 [0855] ＊＊:＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊.＊＊＊＊＊＊＊＊＊
[0856] cynos PISWRWGESDMTFICTVRNPVSSNSSSPILARKLCEGAADDSDSSMV
[0857] 猕猴 PISWRWGESDMTFICTVRNPVSSNSSSPILARKLCEGAADDSDSSMV
[0858] 人 PISWRWGESDMTFICVARNPVSRNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMV
[0859] 黑猩猩 PISWRWGESDMTFICVARNPVSSNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMV
[0860] ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ ＊＊＊＊＊ ＊ ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊.＊＊＊＊＊
[0861] 实施例18：CS1抗体表位的定位
[0862] 构建人、小鼠或人-小鼠嵌合CS1-Fc蛋白以使用三明治ELISA评价它们结合不同抗CS1抗体的能力。抗CS1抗体的图显示与人CS1蛋白结合但不是小鼠CS1蛋白。
[0863] CS1表达载体
[0864] 人CS1细胞外结构域(氨基酸1-227)亚克隆进NIF Fc载体，小鼠CS1细胞外结构域(氨基酸1-224)亚克隆进NEF39 Fc载体。这些载体产生了克隆在人γ1免疫球蛋白
重链基因的上游和框架内的CS1细胞外结构域的融合蛋白。这个产生了含CS1细胞外结构域和C末端人Fc“标记”的分泌蛋白。
重链基因的上游和框架内的CS1细胞外结构域的融合蛋白。这个产生了含CS1细胞外结构域和C末端人Fc“标记”的分泌蛋白。
[0865] PCR和测序
[0866] 使用跨越人和小鼠序列必需接点的嵌合引物和之前克隆的cDNA作为来源通过PCR产生CS1细胞外结构域的人/小鼠嵌合体。这些片段用于缝纫PCR以将片段和表达载
体必需的限制性位点缝合起来。这些嵌合片段克隆进TOPO克隆系统(Invitrogen)或直接克隆进表达载体NIF Fc以在AB3100遗传分析仪上进行测序。将证实序列的片段亚克隆进表达载体NIF Fc。
体必需的限制性位点缝合起来。这些嵌合片段克隆进TOPO克隆系统(Invitrogen)或直接克隆进表达载体NIF Fc以在AB3100遗传分析仪上进行测序。将证实序列的片段亚克隆进表达载体NIF Fc。
[0867] 嵌合构建体如下，含有表明的人和小鼠CS1的氨基酸。表11提供了序列。
[0868] hu25/mu75：人CS1的氨基酸1-67与小鼠CS1的氨基酸68-224融合(SEQ ID NO：79)； [0869] mu25/hu75：小鼠CS1的氨基酸1-67与人CS1的氨基酸68-227融合(SEQ ID NO：80)； [0870] hu50/mu50：人CS1的氨基酸1-151与小鼠CS1的氨基酸149-224融合(SEQ ID NO：81)； [0871] mu50/hu50：小鼠CS1的氨基酸1-131与人CS1的氨基酸135-227融合(SEQ ID NO：82)； [0872] hu75/mu25：人CS1的氨基酸1-169与小鼠CS1的氨基酸167-224融合(SEQ ID NO：83)； [0873] mu75/hu25：小鼠CS1的氨基酸1-166与人CS1的氨基酸170-227融合(SEQ ID NO：84)。 [0874] 表11嵌合CS1蛋白的氨基酸序列
[0875] hu25％/mu75％_(SEQ ID NO：79)
[0876] MAGS PTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPL
[0877] VTIQPEGVTSQSSNKERIVFPDGLYSMKLSQLKKNDSGAYRAEIYSTSSQASLIQEYVLH
[0878] VYKHLSRPKVTIDRQSNKNGTCVINLTCSTDQDGENVTYSWKAVGQGDNQFHDGATLSIA
[0879] WRSGEKDQALTCMARNPVSNS FSTPVFPQKLCEDAATDLTSLRG
[0880] mu25％/hu75％_(SEQ ID NO：80)
[0881] MARFSTYIIFTSVLCQLTVTAASGTLKKVAGALDGSVTFTLNITEIKVDYVWTFNTFFL
[0882] AMVKKDGGTIIVTQNRNRERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEY
[0883] VLHVYEHLSKPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAANESHNGSIL
[0884] PISWRWGESDMTFICVARNPVSRNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMV
[0885] hu50％/mu50％_(SEQID NO：81)
[0886] MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPL
[0887] VTIQPEGGTIIVTQNRNRERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEY
[0888] VLHVYEHLSKPKVTIDRQSNKNGTCVINLTCSTDQDGENVTYSWKAVGQGDNQFHDGATL
[0889] SIAWRSGEKDQALTCMARNPVSNSFSTPVFPQKLCEDAATDLTSLRG
[0890] mu50％/hu50％_(SEQID NO：82)
[0891] MARFSTYIIFTSVLCQLTVTAASGTLKKVAGALDGSVTFTLNITEIKVDYVVWTFNTFFL
[0892] AMVKKDGVTSQSSNKERIVFPDGLYSMKLSQLKKNDSGAYRAEIYSTSSQASLIQEYVLH
[0893] VYKHLSRPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAANESHNGSILPIS
[0894] WRWGESDMTFICVARNPVSRNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMV
[0895] hu75％/mu25％_(SEQ ID NO：83)
[0896] MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPL
[0897] VTIQPEGGTIIVTQNRNRERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEY
[0898] VLHVYEHLSKPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQGDNQFHDGATL
[0899] SIAWRSGEKDQALTCMARNPVSNSFSTPVFPQKLCEDAATDLTSLRG
[0900] mu75％/hu25％(SEQ ID NO：84)
[0901] MARFSTYIIFTSVLCQLTVTAASGTLKKVAGALDGSVTFTLNITEIKVDYVVWTFNTFFL
[0902] AMVKKDGVTSQSSNKERIVFPDGLYSMKLSQLKKNDSGAYRAEIYSTSSQASLIQEYVLH
[0903] VYKHLSRPKVTIDRQSNKNGTCVINLTCSTDQDGENVTYSWKAVGQAANESHNGSILPIS
[0904] WRWGESDMTFICVARNPVSRNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMV
[0905] 瞬时转染
[0906] 293/T细胞接种于6孔板，每孔2×105个细胞。24小时后，根据生产商说明书0.15pmol DNA与FuGene6(Roche)混合并加入到细胞。24小时后，细胞转移到含有12ml培养基和超低IgG血清(Invitrogen)的T75培养瓶。3天后收集上清，通过ELISA检测Fc标
记证实并定量CS1-Fc融合蛋白的存在。
记证实并定量CS1-Fc融合蛋白的存在。
[0907] 表位定位ELISA
[0908] 使用三明治ELISA评价人、小鼠或人-小鼠嵌合CS1-Fc蛋白它们结合不同抗CS1抗体的能力。捕获抗体抗人γ(Jackson Immunological)在碳酸盐缓冲液中1.8ug/ml过夜结合于ELISA平板(Immulon 4 HBX-ThermoLabSystems)。封闭后，100ul转染了CS1构建体的293/T细胞的 上清37C孵育1小时，之后与2ug/ml抗CS1抗体孵育。然后与0.5ug/ml连接辣根过氧化物酶的抗小鼠抗体孵育，其后用3，3’，5，5’四甲基联苯胺(Sigma)检测。
每个试验至少进行两次，两次不同的转染。
每个试验至少进行两次，两次不同的转染。
[0909] 之前确定了CS1抗体结合人CS1但不结合于小鼠CS1。然而，两个物种的CS1细胞外结构域足够相似而使人和小鼠CS1嵌合物的产生得以实现，以将蛋白质的区域集中在抗体结合的地方。将含有人和小鼠CS1细胞外结构域嵌合体的表达构建体转染进293/T细胞，并评价它们结合CS1抗体的能力。如期待地，CS1抗体结合人CS1但不结合于小鼠CS1，并且发现落在3个不同的表位组(表12)。
[0910] 表12.CS1抗体的表位的定位
[0911]
[0912] CS1抗体Luc34、LucX、Luc69和Luc90结合含有人CS1最初的151个氨基酸和小鼠CS1第二部分的hu50/mu50。因此，这些抗体结合在人CS1细胞外结构域的第一部分。然而，没有抗体结合于含有人CS1最初67个氨基酸的hu75/mu75或含有人CS1氨基酸68-227的mu25/hu75。因此，这些抗体的表位在这两个区域重叠并且很可能位于这些构建体的接点，在氨基酸67-68。CS1抗体Luc5和Luc38结合于含有人CS1最初151个氨基酸的hu50/
mu50和含有人CS1氨基酸68-227的mu25/hu75。因此，这些抗体结合人CS1氨基酸68-151。
测试的Luc4、Luc12、Luc23、Luc29、Luc32、Luc37和Luc63结合的人CS1最小区域是mu75/hu25。因此，这些抗体结合人CS1细胞外结构域C末端的58个氨基酸。
mu50和含有人CS1氨基酸68-227的mu25/hu75。因此，这些抗体结合人CS1氨基酸68-151。
测试的Luc4、Luc12、Luc23、Luc29、Luc32、Luc37和Luc63结合的人CS1最小区域是mu75/hu25。因此，这些抗体结合人CS1细胞外结构域C末端的58个氨基酸。
[0913] 本研究将CS1抗体结合位点分成3个表位簇群：
[0914] (1)结合于hu50/mu50(SEQ ID NO：81)的Luc90定义的表位。这个表位覆盖人CS1从大约氨基酸残基23至大约氨基酸残基151。这个表位位于细胞外结构域的结构域1(V结构域)之内。这个表位也可被Luc34、LucX(包括LucX.1和LucX.2)和Luc69识别。
[0915] (2)结合于mu25/hu75(SEQ ID NO：80)和hu50/mu50(SEQ IDNO：81)的Luc38定义的表位。这个表位很可能覆盖人CS1从大约氨基酸残基68至大约氨基酸残基151。这个表位也被Luc5识别。
[0916] (3)结合于mu75/hu25(SEQ ID NO：84)的Luc63定义的表位。这个表位覆盖人CS1从大约氨基酸残基170至大约氨基酸残基227。这个表位位于人CS1的结构域2(C2结构域)。这个表位也被Luc4、Luc12、Luc23、Luc29、Luc32和Luc37识别。
[0917] 将理解上面描述的实施例绝非限制本发明的真实范围，更正确地是为了说明的目的而呈现出来。这个详述中引用的所有的发表物、登陆号序列和专利申请此处引入作为参考，似乎每一个发表物、登陆号或专利申请明确并各自指出引入作为参考。